Иммунотерапевтическая активность фрагментов альфа7-субъединицы ацетилхолинового рецептора и прионного белка в экспериментальных моделях болезни Альцгеймера

Камынина, Анна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммунотерапевтическая активность фрагментов альфа7-субъединицы ацетилхолинового рецептора и прионного белка в экспериментальных моделях болезни Альцгеймера
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммунотерапевтическая активность фрагментов альфа7-субъединицы ацетилхолинового рецептора и прионного белка в экспериментальных моделях болезни Альцгеймера"

005055678

на правах рукописи

Камынина Анна Владимировна

ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ФРАГМЕНТОВ АЛБФА7-СУБЪЕДИНИЦЫ АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА И ПРИОННОГО БЕЛКА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЯХ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2012

005055678

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки РАН

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Вольпина О.М. кандидат биологических наук Бобкова Н.В.

Официальные оппоненты:

Зинченко Валерий Петрович, доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Институт биофизики клетки РАН, заведующий лабораторией внутриклеточной сигнализации

Ярилин Александр Александрович, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, заведующий отдело\ клеточной иммунологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка РАН

Защита диссертации состоится «27» сентября 2012 г. в 15.30 на заседание диссертационного совета Д.002.038.01 по защите докторских и кандидатски? диссертаций при ИБК РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН.

Автореферат разослан « -¡С'»^х^&ГЛ-' 2012 г. Ученый секретарь /

диссертационного совета, к.б.н. ^^¡(лллУ! Т.И.Смолихина

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Болезнь Альцгеймера (БА) - тяжелое нейродегенеративное заболевание, характеризующееся прогрессирующим снижением интеллекта и расстройством памяти. На лечение болезни тратятся огромные средства, при этом существующие лекарственные препараты оказывают лишь симптоматическое действие. В настоящее время не достигнуто полное понимание причин и механизмов развития БА, и поэтому не разработаны методы радикальной терапии заболевания. Таким образом, актуальным остается поиск новых подходов к лечению БА.

Один из предполагаемых механизмов развития БА заключается в связывании патогенного пептида бета-амилоида с каким-либо белком на поверхности нейронов и других клеток мозга, что вызывает ряд процессов, приводящих к их гибели. В литературе описан ряд белков, являющихся мишенями для действия бета-амилоида, в том числе а7-тип ацетилхолинового рецептора (АХР) [Wang et al., 2000] и прионный белок [Lauren et al., 2009]. В настоящей работе предложен новый подход к терапии БА, основанный на индукции специфических антител к мишеням бета-амилоида. Мы предположили, что антитела к а7-типу АХР или к прионному белку будут препятствовать связыванию этих белков с бета-амилоидом и гибели нейронов и, таким образом, оказывать иммунопротективное действие на модели БА. Для индукции специфических антител были использованы синтетические фрагменты а7-субъединицы АХР и прионного белка.

Цель работы. Цель диссертационной работы состояла в исследовании активности синтетических фрагментов альфа7-субъединицы ацетилхолинового рецептора и прионного белка, а также антител к ним, на моделях БА в опытах in vivo и in vitro. В соответствии с поставленной целью задачами исследования являлись:

1. Выбор потенциально активных фрагментов а7-субъединицы АХР и прионного белка и изучение их иммунотерапевтической активности на животных с экспериментально индуцированной формой БА.

2. Выявление наиболее активных фрагментов а7-субъединицы АХР и прионного белка и получение аффинноочищенных антител к ним.

3. Исследование протективного действия аффинноочищенных антител к выбранным фрагментам а7-субъединицы АХР и прионного белка на животных с экспериментально индуцированной формой БА.

4. Исследование действия аффинноочищенных антител к выбранным фрагментам а7-субъединицы АХР и прионного белка на клеточной модели БА, а также изучение механизма их протективного действия.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе выявлены ранее не описанные пептиды - фрагмент 173-193 а7-субъединицы АХР и фрагмент 95-123 прионного белка, иммунизация которыми оказывала иммунотерапевтическое действие на животных с экспериментально индуцированной формой БА. Впервые показано, что пассивная иммунизация аффинноочищенными антителами к фрагменту 173-193 а7-субъединицы или к фрагменту 95-123 прионного белка предотвращает потерю пространственной памяти мышей с экспериментально индуцированной формой БА. Было также

впервые продемонстрировано, что аффинноочищенные антитела к фрагменту 173193 а7-субъединицы или к фрагменту 95-123 прионного белка препятствуют индуцированной бета-амилоидом гибели клеток в первичной культуре нейронов и астроцитов, понижают скорость продукции активных форм кислорода, а также ингибируют вызванную действием бета-амилоида активацию каспазы 3. Апробация работы и публикации. Результаты настоящей работы были представлены на VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006), VIII и IX и X международной конференции «Болезнь Альцгеймреа и Паркинсона» (Австрия, 2007; Чехия, 2009, Испания, 2011), III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), 50-ой и 51-ой научной конференции МФТИ (Москва, 2007, 2008), XX зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008), Международной конференции «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), на 34ом конгрессе FEBS (Чехия, 2009), на международной конференции «Молекулярные механизмы нейрологических и психических заболеваний (Словакия, 2009), на X международном конгрессе по нейроиммунологии (Испания, 2010), V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011), на международной конференции «Биология - наука 21 века» (Москва, 2012).

Материалы диссертационной работы изложены в 3 статьях в рецензируемых научных журналах.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 138 страницах с использованием 35 рисунков, 10 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 247 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПЕПТИДЫ. В работе были использованы фрагменты альфа7-субъединицы ацетилхолинового рецептора (1-23), (159-168)-(179-188), (173-188) и (173-193), фрагменты прионного белка (95-123) и (213-229), а также контрольные пептиды: аналог фрагмента 171-199 белка ОМР1 из Neisseria meningitides и фрагмент (197213) белка VP1 вируса ящура. Пептиды были синтезированы в Лаборатории синтетических вакцин ИБХ РАН. Нумерация аминокислотных остатков пептидов приведена в соответствии с последовательностью альфа7-субъединицы АХР человека (номер Q5W554 в базе данных UniProtKB/Swiss-Prot) и прионного белка человека (номер Р04156 в базе данных UniProtKB/Swiss-Prot).

ПОЛУЧЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ ПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ С ГЕМОЦИАНИНОМ УЛИТКИ. К 0,94 мл раствора гемоцианина улитки в PBS, рН 7,4 (5,3 мг/мл) добавляли 1 мг пептида, перемешивали в течение 30 мин., а затем по каплям добавляли 50 мкл 0,25%-ого раствора глутарового альдегида и инкубировали 16 часов. Далее проводили диализ против PBS в течение 18 часов с трехкратной сменой буфера.

ИММУНИЗАЦИЯ ЖИВОТНЫХ. Растворы пептидов в PBS эмульгировали с равным объемом полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) (для первой иммунизации)

или неполного адъюванта Фрейнда (НАФ) (для последующей иммунизации). Животных иммунизировали два раза: кроликов - подкожно вдоль позвоночника в четыре точки в дозе 1 мг пептида на животное, мышей - по 100 мкг подкожно в основании хвоста.

Пассивную иммунизацию мышей аффинноочищенными антителами проводили четыре раза внутрибрюшинно в объеме 200 мкл.

Отбор крови у кроликов производили из ушной вены перед первой иммунизацией (преиммунные сыворотки) и через 10 дней после второй иммунизации (иммунные сыворотки). Кровь мышей отбирали после окончания тестирования памяти тотально. Из образцов крови готовили сыворотки. Для приготовления пулов равные объемы индивидуальных сывороток объединяли. Отбор спинномозговых жидкостей у мышей производили сотрудники Лаборатории клеточных механизмов патологии памяти ИБК РАН г.Пущино из cisterna magna. Все образцы хранили при -20°С.

ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ. В лунки 96-луночного планшета вносили раствор пептида в 0.05 М натрий-бикарбонатном буфере, рН 9.5 в концентрации 20 мкг/мл. В лунки добавляли образцы сывороток крови, спинномозговых жидкостей или аффинноочищенных антител в последовательных двукратных разведениях. Проводили инкубацию с антителами против иммуноглобулинов мыши или кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена. Для визуализации в лунки добавляли раствор субстрата (0.05% перекиси водорода и 0.05% о-фенилендиамина в цитратном буфере, рН 5). Реакцию останавливали добавлением 10%-ной серной кислоты. Оптическое поглощение измеряли при 492 нм. Титр антител соответствует наименьшему значению разведения антител, дающему поглощение более 0.1 оптической единицы и превышающему уровень, полученный при добавлении сыворотки неиммунизированных животных, более чем в два раза.

ОБУЧЕНИЕ И ТЕСТИРОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ПАМЯТИ мышей проводили совместно с сотрудниками Лаборатории клеточных механизмов патологии памяти ИБК РАН г.Пущино с использованием водного лабиринта Морриса, который представляет собой бассейн, заполненный водой. Площадь бассейна условно делили на четыре равных сектора, в одном из которых (секторе обучения №3) находилась спасательная платформа, погруженная в воду. Вода забелялась молоком, и мышей в течение 5 дней обучали находить платформу. Через 24 часа после окончания обучения у животных тестировали уровень пространственной памяти в отсутствие спасательной платформы, оценивая способность животного выделять сектор обучения №3 по времени нахождения и числу заходов. Статистическую обработку результатов проводили сотрудники Лаборатории клеточных механизмов патологии памяти ИБК РАН г.Пущино.

АФФИННАЯ ОЧИСТКА АНТИТЕЛ. Для приготовления аффинного носителя 0,45 г CNBr-активированной сефарозы 4В суспендировали в 3 мл 1 мМ НС1 и инкубировали 15 мин. до образования прозрачного геля и промывали 1 мМ НС1. 5

мг пептида растворяли в 5 мл натрий-карбонатного буфера pH 8,3. К гелю добавляли раствор пептида и перемешивали в течение 1,5 часа. Для блокирования оставшихся реакционноспособных групп гель инкубировали в глициновом буфере, доведенном до pH 8 NaOH. Для удаления несвязавшегося пептида носитель промывали 5 раз буферами с контрастными значениями pH: натрий-ацетатным pH 4,0 и натрий-боратным pH, 8,1.

Аффинный носитель помещали в колонку и промывали PBS pH 7,4. Наносили сыворотки крови и инкубировали 1 час. Несвязавшиеся антитела удаляли, промывая колонку PBS. Связавшиеся антитела десорбировали глициновым буфером, pH 2,5. Концентрацию элюированных антител определяли спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность при 280 нм. Для работ на клеточных культурах кроличьи аффинноочищенные антитела перед использованием диализовали в течение 24 часов против PBS с двукратной сменой буфера.

ПОЛУЧЕНИЕ СМЕШАННОЙ КУЛЬТУРЫ НЕЙРОНОВ И АСТРОЦИТОВ ГИППОКАМПА ИЛИ КОРЫ МОЗГА КРЫС. Смешанные культуры нейронов и глиальных клеток коры или гиппокампа были приготовлены из мозга новорожденных крысят. Ткани были измельчены и подвергнуты действию 0,25% трипсина в течение 5 мин. при 37°С. Суспензию клеток центрифуцировали при 2000 об./мин. и промывали средой DMEM, содержащей 15% активированную бычью сыворотку и 1% смесь антибиотиков пеницилина и стрептомицина. Затем клетки были ресуспендированы и помещены на предварительно обработанные поли-0-лизином стекла. На следующий день среду DMEM меняли на нейробазальную среду, содержащую 1% смесь антибиотиков пеницилина и стрептомицина, 1% глутамакс и 2% синтетический заменитель сыворотки В-27. Клетки выдерживали в атмосфере с 5% содержанием СОг 14 дней.

КЛЕТОЧНАЯ ГИБЕЛЬ. Клетки были обработаны в течение 30 мин. 10 мкМ раствором пропидиума иодида и 4,5 мкМ Hoechst 33342. На флуоресцентном микроскопе с каждого стекла было сделано 5 снимков при длине волны 530 нм (свечение пропидиума иодида), 380 нм (свечение Hoechst 33342) и в области видимого света (контрастное изображение). Количество живых и мертвых клеток было посчитано с помощью программы Volocity 3D Image Analysis Software (PerkinElmer, США). В связи с морфологическими изменениями клеток после инкубации с бета-амилоидом нейроны были неотличимы от глиальных клеток.

ИЗМЕРЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО СА2+ проводили с использованием Са2+-чувствительного зонда fiira-2. Свободная форма красителя возбуждается при длине волны 380 нм, связанная с Са2+ - при 340 нм. Отношение 340/380 показывает реальные изменения внутриклеточной концентрации Са2+.

Клетки инкубировали с 5 мкМ fiira-2 и 0.005% Pluronic F-127 (поверхностное активное вещество, облегчающее дифузию fiira-2 через мембраны клеток) в буфере HBSS в течение 30 мин. в темноте. Клетки отмывали от красителя HBSS. Для визуализации нейронов в конце эксперимента добавляли 50 мкМ KCl,

вызывающего активацию потенциал зависимых Са2+-каналов в нейрональных клетках.

ИЗМЕРЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА. Для измерения активных форм кислорода использовали флуоресцентный краситель дигидроэтидиум (Het). Дигидроэтидиум - витальный краситель, проникающий внутрь живых клеток в восстановленной форме и окисляющийся за счет реакции с активными формами кислорода (с супероксидным радикалом О2*). Скорость производства активных форм кислорода в клетках определяли по соотношению окисленной формы красителя (поглощение при 530 нм, излучение при 605 нм) к его восстановленной форме (поглощение при 380 нм, излучение при 455 нм). Под микроскопом нейроны были легко отличимы от глиальных клеток.

ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВАЦИИ КАСПАЗЫ 3 ПОД ДЕЙСТВИЕМ БЕТА-АМИЛОИДА. Смешанная культура нейронов и астроцитов коры мозга была обработана 10 мкМ субстрата каспазы 3 NucView 488 в HBSS в течение 15 мин. Субстрат NucView 488 проникает сквозь клеточные мембраны, попадая в цитоплазму, где расщепляется каспазой 3 и превращается в краситель (длина волны возбуждения 488 нм). После инкубации клетки отмывали от красителя HBSS. Под микроскопом нейроны были легко отличимы от глиальных клеток.

МИКРОСКОПИЯ. Исследования Са2+ -сигнала и измерение активных форм кислорода были проведены на флуоресцентном микроскопе Olympus (Япония) с флуоритовым объективом. Источником света являлась ксеноновая дуговая лампа, длину волны возбуждения определяли с помощью монохроматора (Cairn Research, Великобритания). Флуоресценцию регистрировали в цифровой камере (Retiga, Qlmaging, Канада) с интервалом в 10 сек. и анализировали с использованием программы Andor iQ Software (Andor Technologies, Великобритания). Для предотвращения фототоксичности клетки облучали светом только в момент фиксации изображения.

Исследования активации каспазы 3 были проведены на конфокальном лазерном микроскопе 710 Zeiss. Источником света являлась аргоновая лампа. Длина волны регистрации возбуждения составляла 510 нм. Изображение регистрировали с интервалом 10 сек. Анализ полученных изображений производили с помощью программы Zen 2009.

Статистический анализ данных опытов in vitro производили с использованием программ Origin 8.5 и Microsoft Excel 2010. Достоверность результатов оценивали с использованием двухстороннего критерия Стьюдента. Результаты, приведенные на всех диаграммах, представлены как среднее значение ± SEM.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование иммунотерапевтической активности фрагментов а7-субъединицы АХР на животных с экспериментально индуцированной формой БА

Для выработки специфических антител к а7-типу АХР, препятствующих связыванию рецептора с бета-амилоидом, в качестве иммуногенов было предложено использовать синтетические фрагменты ЛГ-концевого экстрацеллюлярного домена а7-субъединицы АХР, аминокислотные последовательности которых приведены в Таблице 1. На первом этапе исследований были выбраны 2 фрагмента: пептид последовательности 1-23 (АХР-I), соответствующий Ы-концевому а-спиральному экспонированному участку молекулы а7-субъединицы АХР, и пептид последовательности (159-168)-(179-188) (АХР-П), объединяющий два гидрофильных экспонированных участка 159-168 и 179-188. В качестве контрольного соединения был выбран пептид, соответствующий фрагменту 197-213 белка УР1 вируса ящура (К1). Для получения у животных стабильно высокого уровня антител пептиды были конъюгированы с высокомолекулярным носителем - гемоцианином улитки (КЬН), который усиливает продукцию антител.

Таблица 1. Аминокислотные последовательности фрагментов а7-субъединицы АХР.

Выделены подчеркиванием теоретически расчитанные Т-хелперные эпитопы.

Пептид Аминокислотная последовательность

АХР-1 'СЕРОККЬУКЕЬУЮЛТЧРЬЕКРУА23'

АХР-П |590М0ЕАП180У1б8-1791РСКК8ЕКРУ188

АХР-Ш 173Е\\ТЭЬУС1РСКК.8ЕЮТ188

АХР-1У '"ЕтИЛ'ОПЮКК.ЗЕЮТЕССКЕ193

К1 '"зсзоинкокпАРАкдьь213

К2 171К31УТЬЯУУТОКгаШ1ЛХУРАУУСКРС3199

Чтобы исследовать терапевтический эффект иммунизации фрагментами а7-субъединицы АХР, в качестве животной модели БА были использованы мыши линии NN/1111, которым проводили операцию ольфакторной бульбэктомии. Бульбэктомированные (БЭ) мыши демонстрируют признаки, схожие с проявлениями спорадической формы БА, а именно у БЭ мышей происходит нарушение пространственной памяти, повышение уровня бета-амилоида в мозгу и развитие других признаков БА [Бобкова и соавт., 2001]. В качестве контроля были использованы ложнооперированные (ЛО) мыши, которым проводили все те же манипуляции, что и БЭ мышам, но не удаляли обонятельные луковицы. Схема иммунизации БЭ мышей была разработана таким образом, чтобы на момент развития признаков БА и на момент исследования эффекта иммунизации выбранными фрагментами у мышей был наивысший уровень антител. Мыши были иммунизированы препаратами АХР-1-КЬН, АХР-П-КЬН или К1-КЬН дважды. Между первой и второй иммунизациями проводили операцию бульбэктомии. Через

месяц после операции животных обучали пространственному навыку в водном лабиринте Морриса и тестировали память.

Результаты проведенных исследований показали, что неиммунизированные ЛО животные статистически достоверно выделяли 3-ий сектор обучения (рис.1). БЭ неиммунизированные мыши, или БЭ мыши, иммунизированные К1-КШ, не выделяли 3-ий сектор обучения, что свидетельствовало о нарушении памяти. Иммунизация АХР-Н-КЬН приводила к сохранению памяти БЭ животных: мыши статистически достоверно выделяли 3-ий сектор по числу заходов и по времени нахождения в нем. БЭ мыши, иммунизированные АХР-1-КЬН, статистически достоверно выделяли 3-ий сектор только по одному показателю - числу заходов.

Рис.1. Результаты тестирования памяти БЭ мышей, иммунизированных КЬН-конъюгатами фрагментов АХР-1 и АХР-П.

ЛО

? 35

а с 30

9 25

Я 20

о 15

X 10

БЭ

■л. 30 к

В»

С 10

БЭ

1234 1234 1234 1234 1234 Неиммунизи- Неиммунизированные рованные

К1-К1.Н АХР-1-К1.Н АХР-И-КШ

1234 1234 1234

Неиммунизи- Неиммунизированные рованныв

2 3 4 1 2 3 4 К1-К1.Н АХР+К1.Н АХР-Н-КЬН

Здесь и далее 1-4 - сектора водного лабиринта, 3 - сектор обучения.

*, ** и *** доверительная вероятность/><0,05, р<0,01 и/><0,001, соответственно.

По результатам тестирования сывороток крови было выявлено, что у всех иммунизированных БЭ животных наблюдался высокий уровень противопептидных антител (титры в индивидуальных образцах сывороток крови варьировали от 3,7 до 5,7; титр антител выражен в максимального разведения сыворотки). В Лаборатории клеточных механизмов патологии памяти ИБК РАН г.Пущино был определен уровень бета-амилоида в образцах гиппокампа и коры мозга БЭ и ЛО животных, иммунизированных конъюгатми пептидов. Было показано, что операция бульбэктомии приводит к шестикратному увеличению уровня бета-амилоида (рис.2). Иммунизация КХН-конъюгатом фрагмента АХР-1 и АХР-И предотвращала рост уровня бета-амилоида в объединенных образцах мозга БЭ мышей, причем в группе, иммунизированной АХР-П-КХ.Н, уровень бета-амилоида был ниже, чем в группе, иммунизированной АХР-1-КЬН. Иммунизация данными фрагментами не изменяла уровень бета-амилоида в мозгу контрольных ЛО животных.

Рис.2. Уровень бета-амилоида в мозгу БЭ и JIO мышей, иммунизированных KLH-конъюгатами AXP-I и AXP-II.

—н БЭ ЛО ф *

1 1 п . .

о ---1—~-,---,-,-'-'—,—-—,—--

Нвиммунши- AXP-I- AXP-II- Нвиммуниэи- ДХР-1- AXP-II-

ро ванные кш KLH рованные кш KLH

Таким образом, наибольшую иммунопротективную активность проявил фрагмент последовательности (159-168)-(179-188), иммунизация которым в конъюгированном с KLH виде приводила к улучшению показателей состояния пространственной памяти, а также к торможению роста уровня бета-амилоида в мозгу БЭ мышей.

Для разработки подходов к иммунотерапии БА наиболее перспективным является использование свободных иммуногенов, не конъюгированных с белком-носителем. Существенное преимущество свободных пептидов перед конъюгатами состоит в их способности индуцировать образование антител строгой направленности. В связи с этим была исследована способность пептидных фрагментов а7-субъединицы АХР в свободном виде, без конъюгации с белком-носителем, индуцировать выработку специфических антител и оказывать иммунотерапевтическое действие на животных с экспериментально индуцированной формой БА. Были выбраны два изученных ранее фрагмента: AXP-I и AXP-II. Поскольку предыдущие испытания показали, что наибольшей терапевтической активностью обладал KLH-конъюгат пептида AXP-II, для дальнейших исследований были выбраны еще два пептида AXP-III (173-188) и AXP-IV (173-193), являющиеся удлиненными аналогами участка (179-188) пептида AXP-II (Табл.1). В качестве контрольного соединения был выбран аналог фрагмента 171-199 белка ОМР1 из Neisseria meningitides (К2). Все выбранные фрагменты содержали расчетные Т-хелперные эпитопы, необходимые для стимуляции иммунного ответа у животных. Для расчета Т-хелперных эпитопов был использован алгоритм, согласно которому потенциально иммуногенные пептиды должны содержать девятичленный фрагмент, в первом положении которого находится гидрофобный, а в девятом - положительно заряженный аминокислотный остаток [Вольпина и соавт., 2002]. Для исследования способности пептидов индуцировать образование антител мыши были дважды иммунизированы выбранными фрагментами. Анализ сывороток крови показал, что иммуногенными в свободном виде оказались только фрагменты AXP-I (титр пула сывороток составил 2.8) и AXP-IV (титр пула составил 3,7), а также контрольный пептид К2 (титр пула составил 3,4). Дальнейшие испытания по

выявлению иммунотерапевтической активности в животной модели БА были проведены только с АХР-1, АХР-1У и с К2.

БЭ мышей иммунизировали иммуноактивными пептидами по схеме, разработанной для иммунизации КЬН-конъюгатами. Тестирование пространственной памяти животных показало, что иммунизация фрагментом АХР-IV приводила к сохранению памяти у БЭ мышей (рис.3): они статистически достоверно выделяли 3-ий сектор обучения по времени нахождения в нем. В то же время иммунизация фрагментом АХР-1 и контрольным пептидом К2 не оказывала эффекта на состояние памяти БЭ животных - мыши не выделяли отсек обучения ни по времени пребывания, ни по числу заходов.

Таким образом, был выявлен фрагмент АХР-1У, иммунизация которым приводила к статистически достоверному сохранению памяти мышей с экспериментально индуцированной формой БА.

Рис.3. Результаты тестирования памяти БЭ мышей, иммунизированных

* и **р<0,01 ир<0,001 соответственно.

Мишенью для выработанных антител является а7-тип АХР, который находится в мозгу, поэтому важно было показать, что антитела проникают через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). В связи с этим было проведено исследование спинномозговой жидкости (смж) иммунизированных БЭ и ЛО мышей на наличие противопептидных антител. У БЭ мышей, иммунизированных АХР-1У и К2, противопептидные антитела были обнаружены в смж (титр пула составил 2,5 и 1,9 соответственно), а у БЭ животных, иммунизированных АХР-1, — нет (титр был ниже 1,6). У иммунизированных АХР-1, АХР-1У и контрольным фрагментом ЛО мышей антитела не были обнаружены в смж. Таким образом, было показано, что антитела проходили ГЭБ только у БЭ мышей, иммунизированных АХР-1У и контрольным пептидом, при этом терапевтической активностью на память БЭ животных обладал только фрагмент АХР-1У.

В рамках совместной работы в Лаборатории клеточных механизмов патологии памяти ИБК РАН г.Пущино было показано, что иммунизация фрагментом АХР-1У снижает уровень бета-амилоида в объединенной пробе гиппокампа и коры мозга БЭ мышей в 4 раза по сравнению с неиммунизированными БЭ животными (рис.4).

Уровень бета-амилоида ЛО мышей, иммунизированных фрагментом АХР-1У, был немного выше уровня бета-амилоида контрольных ЛО животных. Для объяснения полученных результатов на ЛО животных требуется проведение дополнительных исследований.

Рис.4. Уровень бета-амилоида в мозгу БЭ и ЛО мышей, иммунизированных АХР-IV.

800 ^ 700 £ 600

5 500 Н * ¿><0,05.

| 400 ¡£ 300 £ zoo

ID 100

1БЭ ЛО

. . Í ._. п , ■ , I,

Неиммуниэиро- щ АХР-1\/ Нвиммунизиро- ^ АХР-IV ванные ванные

Известно, что у пациентов с БА наблюдается снижение уровня а7-типа АХР в мозгу [Вапецее е1 а1., 2000]. В связи с этим в Лаборатории рецепции нейропептидов ИБХ РАН был исследован уровень экспрессии а7-типа АХР в коре мозга неиммунизированных БЭ мышей и БЭ животных после иммунизации фрагментом АХР-1У. Было показано, что операция бульбэктомии приводила к значительному снижению уровня рецептора. Иммунизация фрагментом АХР-1У приводила к восстановлению уровня рецептора БЭ мышей до уровня здоровых животных. Таким образом, было показано, что иммунизация БЭ мышей фрагментом а7-субъединицы АХР последовательности 173-193 приводила к сохранению пространственной памяти и количества а7-типа АХР в коре мозга, а также к торможению роста уровня бета-амилоида. Индуцированные антитела к фрагменту 173-193 проходили ГЭБ.

2. Исследование действия антител к фрагменту 173-193 а7-субъединицы АХР на животных с экспериментально индуцированной формой БА

Мы предположили, что наблюдаемый протективный эффект активной иммунизации фрагментом АХР-1У в значительной степени обусловлен действием именно антител к а7-типу АХР. Чтобы доказать это, было изучено действие пассивного введения антител к фрагменту АХР-1У на состояние памяти мышей с экспериментально индуцированной формой БА. Для этого были получены мышиные аффинноочищенные моноспецифические антитела, направленные к фрагменту АХР-ГУ (АХРат), которые вводили БЭ мышам после проведения операции бульбэктомии, а затем тестировали пространственную память в водном лабиринте Морриса. Были использованы 2 дозы антител - 2,5 и 5 мкг на животное. Показано, что мыши, получившие наименьшую дозу - 2,5 мкг, статистически достоверно больше времени проводили в 3-ем секторе обучения (рис.5). В группе

БЭ мышей, получавших 5 мкг АХРат, не наблюдалась достоверного выделения отсека обучения.

Рис.5. Результаты тестирования памяти БЭ мышей, пассивно иммунизированных мышиными аффинноочищенными антителами к пептиду АХР-1У.

БЭ

АХРат 2,5 и 5 мкг - дозы мышинных аффинноочищенных антител к фрагменту АХР-1У. * и ** р<0,01 и /?<0,001 соответственно.

Неиммунизиро- Неиммунизиро-ванные ванные

АХРат 2,6 мкг

АХРат 5 мкг

В результате проведенных исследований выявлено, что пассивная иммунизация аффинноочищенными антителами к фрагменту последовательности 173-193 а7-субъединицы АХР оказывала иммунотерапевтическое действие на животных с экспериментально индуцированной формой БА.

3. Исследование иммунотерапевтической активности фрагментов прионного белка на животных с экспериментально индуцированной формой БА

Для выработки специфических антител к прионному белку, препятствующих связыванию белка с бета-амилоидом, были выбраны два фрагмента последовательности 95-123 (РгР-1) и 203-229 (РгР-П) (Табл.4). Ранее было показано, что антитела к данным фрагментам способны связываться с рекомбинантным прионным белком, а также с нормальной изоформой природного приона [ОЬогпауа й а1., 2007]. Последовательность РгР-1 находится в Ы-коицевой части молекулы приона, последовательность РгР-П является частью третьей а-цепи (200-223) прионного белка. В качестве контроля был использован К1 (Табл.1). Для исследования иммунотерапевтического эффекта все пептиды были конъюгированы с КЬН ввиду их низкой иммуногенной активности в свободном виде.

Таблица 4. Аминокислотные последовательности фрагментов прионного белка.

Аминокислотные последовательности фрагментов соответствуют последовательности РгР быка, которая

отличается от РгР мыши на два аминокислотных остатка в пептиде 95-123 и на пять аминокислотных остатка и две вставки - в последовательности 203-229. Ранее было показано, что эти замены не влияют на связывание антител к выбранным фрагментам с мышиным рекомбинантным прионным белком [ОЬогпауа е1 а1., 2007].

РгР фрагмент Аминокислотная последовательность

РгР-1 (95-123)-КШ THGQWNKPSKPKTNMKHVAGAAAAGAVVG

РгР-Н (203-229)-КЬН 1кммЕ11УУЕдмс1Т(2¥д11Е5дАУ¥(21ш

Для исследования влияния иммунизации прионными фрагментами на память животных с экспериментально индуцированной формой БА БЭ мыши были иммунизированы РгР-1-КЪН и РгР-И-КЬН, а также контрольным соединением К1-КЬН по схеме, разработанной для АХР. Было показано, что иммунизация БЭ мышей только РгР-1-КЬН приводила к сохранению пространственной памяти по обоим показателям - числу заходов и времени нахождения в отсеке обучения, в то время как иммунизация РгР-П-КЪН не предотвращала ухудшение памяти у БЭ мышей (рис.6). Контрольные БЭ мыши, иммунизированные К1-КЫ1, не выделяли сектор обучения ни по времени пребывания, ни по числу заходов. Таким образом, было показано, что иммунизация только РгР-1-КЬН сохраняла память мышей с экспериментально индуцированной формой БА.

Рис.6. Результаты тестирования памяти БЭ мышей, иммунизированных КЬН-конъюгатами фрагментов РгР-1 и РгР-П.

*р<0,001.

Было изучено наличие противопептидных антител в сыворотке крови и смж БЭ и ЛО мышей. Высокие титры антител были выявлены в сыворотках крови всех животных (титр варьировал от 3,3 до 4,6). Интересно, что в смж противопептидные антитела были выявлены как у БЭ мышей, так и у ЛО животных (титр варьировал от 1,9 до 2,5). По-видимому, иммунизация конъюгированными с высокомолекулярным белком-носителем фрагментами приводила к нарушениям в проницаемости ГЭБ у здоровых ЛО мышей, в результате чего антитела проникали в смж.

В Лаборатории клеточных механизмов патологии памяти ИБК РАН г.Пущино был определен уровень бета-амилоида в объединенных образцах гиппокампа и коры мозга и исследовано морфо-функциональное состояние нейронов гиппокампа (СА1 и САЗ зоны) и коры мозга ЛО и БЭ мышей, иммунизированных препаратами РгР-1-КЬН и РгР-Н-КЬН. Было показано, что у иммунизированных обоими фрагментами прионного белка БЭ мышей уровень бета-амилоида снижен практически в два раза по сравнению с контрольными БЭ животными, иммунизированными КЬН (рис.7).

Рис.7. Уровень бета-амилоида в мозгу БЭ и ЛО мышей, иммунизированных КЬН-конъюгатами РгР-1 и РгР-И.

ЛО

<■ /¡<0,05.

. I I

Нвиммунизи- КШ РгР-1-Ю.Н РгР-|1-КШ рованные

Нвиммунизи- КШ РгР-1-КШ РгР-Н-КШ рованные

По результатам изучения морфофункционального состояния нейронов было показано, что иммунизация только фрагментом РгР-1-К1Л I достоверно предохраняла нейроны от патологических изменений, вызванных операцией бульбэктомии, и не вызывала изменений в нейронах ЛО мышей. Таким образом, установлено, что наибольшую иммунопротективную активность проявил прионный фрагмент последовательности 95-123, иммунизация которым в конъюгированном с КЬН виде приводила к улучшению показателей состояния пространственной памяти, к торможению роста уровня мозгового бета-амилоида, а также к восстановлению морфофункционального состояния нейронов БЭ мышей.

4. Исследование действия антител к фрагменту 95-123 прионного белка на животных с экспериментально индуцированной формой БА

Для исследования протективного эффекта аффинноочищенных антител к РгР-1 были проведены опыты по пассивной защите БЭ мышей. Для этого были получены мышиные моноспецифические аффинноочищенные антитела (РгРат), которые вводили БЭ и ЛО мышам, и затем тестировали пространственную память экспериментальных животных. Были использованы 3 дозы (0,8, 2,5 и 7,5 мкг) аффинноочищенных антител. Выявлено, что БЭ мыши, пассивно иммунизированные РгРат в различных дозах, демонстрировали сохранение памяти (рис.8). Следует отметить, что достоверно выделяли сектор обучения по обоим показателям только группы БЭ животных, получивших 0,8 и 7,5 мкг РгРат.

Рис.8. Результаты тестирования памяти БЭ мышей, пассивно иммунизированных аффинноочищенными антителами к фрагменту РгР-1.

рованныв рованныв 0.8икг 2.5мкг 7.5мкг рованныв ровашыв 0.8мкг 2.5мкг 7.5мкг

*, ** и *** р<0,05,/><0,01 и/><0,001 соответственно.

В Лаборатории клеточных механизмов патологии памяти ИБК РАН г.Пущино был определен уровень бета-амилоида БЭ мышей, пассивно иммунизированных РгРат. Проведенные исследования показали, что введение аффинноочищенных антител в трех дозах приводило к статистически достоверному блокированию роста уровня бета-амилоида в объединенных образцах гиппокампа и коры мозга БЭ животных (рис.9). Пассивная иммунизация ЛО мышей тремя дозами мышиных РгРат не вызывала изменений уровня мозгового бета-амилоида.

Рис.9. Уровень бета-амилоида в мозгу БЭ и ЛО мышей, пассивно иммунизированных тремя дозами антител к фрагменту РгР-1.

ЛО

РгРат 0,8, 2,5 и 7,5 мкг - дозы мышинных аффинноочищенных антител к фрагменту РгР-1.

. I ^ Д ^ И ^ И ^ *р<0'05 ■

Неиммунизи- рграт РгРат РгРвт рованныв о д мкг 2,5 Мкг 7,5 МКГ

Таким образом, пассивная иммунизация мышиными аффинноочищенными антителами к фрагменту прионного белка последовательности 95-123 оказывала иммунотерапевтическое действие на животных с экспериментально индуцированной формой БА.

Неиммунизи- рграт РгРат РгРат рованныв 0,8мкг2<5нкг7л5лякг

5. Исследование действия антител к фрагменту 173-193 а7-субъединицы АХР и к фрагменту 95-123 прионного белка в клеточной модели БА

Результаты терапевтической активности антител к фрагменту 173-193 а7-субъединицы АХР и к фрагменту 95-123 прионного белка в животной модели БА необходимо было подтвердить на модели БА в опытах in vitro. Данная часть работы была проведена на смешанной первичной культуре нейронов и астроцитов гиппокампа или коры мозга новорожденных крыс. Для проведения этого этапа работ были получены кроличьи моноспецифические аффинноочищенные антитела против фрагментов AXP-IV или РгР-1 (АХРат или РгРат соответственно).

Исследование действия аффинноочищенных кроличьих антител к фрагментам 173-193 а7-субъединицы АХР и 95-123 прионного белка на клеточную гибель, вызванную бета-амилоидом

Исследование токсического действия бета-амилоида на смешанной культуре нейронов и астроцитов гиппокампа показало, что 24-часовая обработка культуры бета-амилоидом 25-35 приводила к усилению гибели клеток по сравнению с контрольными не обработанными бета-амилоидом культурами до 30% (рис.10). Предварительная обработка клеток АХРат или РгРат в концентрации 20 мкг/мл приводила к значительному снижению гибели клеток, обработанных бета-амилоидом 25-35, до 15 и 18% соответственно. Таким образом, было установлено, что АХРат и РгРат обладают ярко выраженным защитным эффектом против действия бета-амилоида в первичных культурах клеток.

Рис.10. Защитное действие аффинноочищенных антител к AXP-IV и к РгР-1 на проявления бета-амилоидной токсичности в смешанной культуре нейронов и астроцитов гиппокампа крыс.

35 -

_ т Ар 25-35 - бета-амилоид

~зэ" ^ 25-35.

Контроль - не

обработанные бета-

Р амилоидом культуры нейронов и астроцитов. * ¿кО,05.

За 100% принято

| 23 -&

l!5-

§ 5

суммарное количество клеток на каждом стекле.

Контроль A(J 25-35 АХРаг+А|3 25-35 РгРат+АР 25-35

Исследование действия аффиноочшценных кроличьих антител к фрагменту 173193 а7-субъединицы АХР и к фрагменту 95-123 прионного белка на Са2+-сигнал в астроцитах и нейронах

Токсическое действие бета-амилоида на клетки мозга сопряжено с изменениями во внутриклеточной концентрации Са2+. Было сделано предположение, что

протективный эффект антител, направленных к а7-типу АХР или к прионному белку, может быть вызван блокированием индуцированных бета-амилоидом изменений внутриклеточной концентрации кальция (Са2+-сигнала) в клетках мозга. Были проведены эксперименты по выявлению влияния АХРат или РгРат на индуцированный бета-амилоидом Са2+-сигнал в смешанной культуре нейронов и астроцитов коры мозга крыс.

Показано, что обработка культуры нейронов и астроцитов 50 цМ бета-амилоида 25-35 приводила к значительному повышению внутриклеточной концентрации Са2+ в астроцитах, но не в нейрональных клетках (рис.11). Астроциты, в свою очередь, отвечали на добавление бета-амилоида по-разному: индивидуальные кривые изменения внутриклеточной концентрации Са2+ не имели постоянной формы и могли быть охарактеризованы как одиночные пики, осциляции или высокий сигнал, переходящий в плато.

Ар 25-35, 10 мкМ

Рис.11. Действие бета-амилоида 25-35 на уровень цитозольного Са2+ в астроцитах.

Здесь и далее время воздействия бета-амилоида или других соединений указано горизонтальной чертой. Здесь и далее кривые описывают сигнал флуоресценции в индивидуальных клетках.

Время (мин)

Преикубация клеток с 20 мкг/мл АХРат (рис. 12,А) или РгРат (рис. 12,Б) не влияла на способность бета-амилоида 25-35 индуцировать Са2+-сигнал в астроцитах, при этом форма и величина бета-амилоид индуцированного Са2+-сигнала изменялась незначительно.

Рис.12. Действие антител к фрагменту АХР-1У (А) и к фрагменту РгР-1 (Б) на Са2 сигнал, индуцированный бета-амилоидом 25-35. А Б

АХРат, 20 мкг/мл

А|3 25-35, 50 мкМ

Время (мин)

1.8 1

со 1,6"

3 1,4

СчТ

1 1.2

и.

I 1'°

8 О.»

0.6

РгРат, 20 мкг/мл

Ар 25-35, 50 мкМ

Время (мин)

Следует отметить, что добавление АХРат к нейронам и астроцитам индуцировало небольшой Са2+-сигнал (рис.13,А), что позволяет сделать предположение, что антитела действуют подобно агонисту данных рецепторов. Чтобы подтвердить это

предположение, мы провели серию экспериментов по изучению Са2+-сигнала на клетках, обработанных ацетилхолином. Было показано, что добавление ацетилхолина клеткам вызывало повышение внутриклеточной концентрации Са2+ в астроцитах (рис. 13,Б). Предварительная обработка АХРат не блокировала стимулированный ацетилхолином Са2+-сигнал в культуре клеток (рис. 13,В). Следовательно, АХРат действуют на Са2+-сигнал астроцитов, как агонисты рецептора.

Рис.13. Влияние антител к фрагменту АХР-1У на индуцированный ацетилхолином Са2+-сигнал астроцитов. А Б

О 1,6

АХРат, 20 мкг/мл

Ах, 10 мкМ

АХРат, 20 мкг/мл

8 30 о

^ 2.5

Ах, 10 мкМ

10 12 14 16

Время (мин)

А - действие антител к АХР-1У на Са -сигнал в астроцитах. Б - действие ацетилхолина (Ах) на Са2+-сигнал в астроцитах. В - действие антител к АХР-1У на индуцированный ацетилхолином Са2+-сигнал в астроцитах.

Чтобы выяснить, участвует ли АХР а7-типа в индуцируемом бета-амилоидом Са2+-ответе, был проведен эксперимент по изучению изменений внутриклеточной концентрации Са2+ под действием бета-амилоида после добавления специфического антагониста а7-типа АХР - а-бунгаротоксина. Было показано, что предварительная обработка смешанной культуры а-бунгаротоксином не блокировала Са2+-сигнап, индуцированный бета-амилоидом 25-35 в астроцитах (рис.14). Следует отметить, что в некоторых клетках, предварительно обработанных а-бунгаротоксином, наблюдалась задержка индуцированного бета-амилоидом Са2+-ответа по сравнению с клетками, обработанными только бета-амилоидом 25-35. Можно предположить, что наблюдаемый Са2+-ответ астроцитов на добавление бета-амилоида опосредован не только связыванием бета-амилоида с АХР а7-типа, но в основном реализацией других путей, таких как связывание бета-амилоида с другими типами АХР или встраивание бета-амилоида в мембраны астроцитов и образование Са2+-каналов [Петиго й а1., 2011].

Рис.14. Действие антагониста а7-типа АХР на индуцированный бета-амилоидом 25-35 Са2+-сигнал в кортикальных астроцитах.

a-Bgtx, 0,5 мкМ

А^ 25-35, 50 м«М

a-Bgtx - a-бунгаротоксин.

Время (мин)

Таким образом, предварительная обработка нейронов и астроцитов антителами к а7-типу АХР и к прионному белку не блокировала Са2+-сигнал в астроцитах, стимулированный бета-амилоидом 25-35. Изучение Са2+-ответа показало, что защитное действие АХРат или РгРат не связано напрямую с изменениями Са2+-сигнала, а, возможно, обусловлено реализацией других протекторных механизмов в клетке в ответ на токсическое действие бета-амилоида.

Исследование действия аффиноочищенных кроличьих антител к фрагменту 173193 а7-субъединицы АХР и к фрагменту 95-123 прионного белка на скорость производства активных форм кислорода в астроцитах и нейронах Известно, что токсическое действие бета-амилоида на клетки мозга сопровождается продукцией активных форм кислорода (АФК) в астроцитах посредством активации мембранного фермента НАДФН-оксидазы. Мы предположили, что защитное действие антител к а7-типу АХР и прионному белку на клетки реализуется за счет ингибирования активируемой бета-амилоидом продукции свободных радикалов в астроцитах. Было показано, что бета-амилоид 25-35 увеличивал скорость образования АФК в кортикальных астроцитах, но не в нейронах в 8 раз (рис.15). Преинкубация культуры клеток с ингибитором НАДФН-оксидазы AEBSF (4-(2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride) приводила к практически полному блокированию индуцированной бета-амилоидом 25-35 продукции АФК. Предварительная обработка смешанной культуры нейронов и астроцитов АХРат или РгРат приводила к снижению скорости образования АФК в астроцитах в 4 и 8 раз соответственно. Таким образом, мы показали, что протективный эффект антител к а7-типу АХР и к прионному белку на клетки, обработанные бета-амилоидом, может быть реализован за счет снижения скорости образования АФК в астроцитах.

Рис.15. Средние значения скорости образования АФК в астроцитах, обработанных бета-амилоидом 25-35. до и после добавления блокатора НАДФН-оксидазы и антител к АХР-1У и к РгР-1.

яоои

200*

За 100% принята средняя скорость образования АФК в астроцитах, не обработанных бета-амилоидом 25-35.

* р<0,05.

<-> Скорость АЭ 25-35 АЕВБРьАЭ АХРэг+АЭ РгРат+АЭ

до 25-35 25-35 25-35

обработки

Было проведено детальное исследование механизма регуляции производства АФК с участием а7-типа АХР. Представляло интерес выяснить, как будут влиять на продукцию АФК агонист и антагонист этого рецептора. Было показано, что при добавлении ацетилхолина значительно снижается скорость образования АФК, индуцированных бета-амилоидом 25-35 (рис.16). Следует заметить, что блокатор а7-типа АХР а-бунгаротоксин также снижал активируемую бета-амилоидом скорость образования АФК.

Рис.16. Средние значения скорости образования АФК в астроцитах. обработанных бета-амилоидом 25-35. до и после добавления агониста и антагониста АХР а7-типа.

— 1000».

I— —I— —I— —

Скорость до Ар 25-35 Ах+АЭ 25-35 a-Bgtx+Ap обработки 25-35

Полученные результаты свидетельствуют об участии а7-типа АХР в регуляции производства АФК. Для изучения механизма действия АХРат на НАДФН-оксидазу и на индуцируемое бета-амилоидом производство АФК, была проведена серия экспериментов с использованием классического активатора НАДФН-оксидазы 2 типа (N0X2) - форболового эфира (phorbol 12-myristate 13-acetate, или PMA). Было показано, что добавление форболового эфира к кортикальным астроцитам приводило к резкому увеличению продукции АФК (рис.17). Добавление блокатора НАДФН-оксидазы AEBSF приводило к понижению скорости образования АФК в

клетках, обработанных PMA. Преинкубация клеток с ацетилхолином или с а-бунгаротоксином, так же как предварительная обработка клеток АХРат приводила к частичному иншбированию продукции АФК под действием РМА.

Рис.17. Средние значения скорости образования АФК в астроцитах, обработанных форболовым эфиром, до и после добавления антител к АХР-1У. ацетилхолина и а-бунгаротоксина.

Таким образом, было показано, что обработка культур кортикальных клеток АХРат или РгРат приводит к снижению индуцированного бета-амилоидом образования АФК в астроцитах. Возможно, именно по этому пути реализуется протективное действие антител на клетки, обработанные бета-амилоидом. Ацетилхолин и а-бунгаротоксин также снижают скорость образования АФК под действием бета-амилоида 25-35 и форболового эфира, благодаря чему можно предположить, что воздействие на а7-тип АХР регулирует работу этого комплекса и, как следствие, продукцию АФК.

Исследование действия аффиноочищенных кроличьих антител к фрагменту 173193 а7-субъединицы АХР и к фрагменту 95-123 прионного белка на индуцированную бета-амилоидом активацию каспазы 3

Известно, что активация каспазы 3 приводит к запуску механизма клеточной смерти. Мы предположили, что протективное действие АХРат или РгРат реализуется за счет блокирования бета-амилоид опосредованой активации каспазы 3. Было показано, что обработка кортикальной культуры нейронов и астроцитов бета-амилоидом 25-35 приводила к быстрой активации каспазы 3 в нейронах и астроцитах (рис.18). Преинкубация клеток с АХРат или к РгРат значительно замедляла время начала активации каспазы 3. Так, АХРат замедляли сигнал в 8 раз, а РгРат - в 10 раз. Ингибитор а7-типа АХР а-бунгаротоксин также значительно замедлял активацию каспазы 3 в клетках.

Скорость PMA AEBSF+PMA до

обработки

АХРат+РМА AxtPMA а-

BgtxfPMA

Рис.18. Среднее время начала активации каспазы 3 в нейронах и астроцитах под действием бета-амилоида 25-35 после добавления антител к АХР-1У и к РгР-1, а также а-бунгаротоксина.

* р< 0,05.

125-35 АХРат+АР а-Вб1х+АР РгРат+Ар 25-35 25-35 25-35

Таким образом, было показано, что АХРат и РгРат предохраняют нейроны и астроциты от индуцированной бета-амилоидом гибели. Было установлено, что наблюдаемый протективный эффект антител на клетках не зависел от изменений внутриклеточной концентрации Са2н под действием бета-амилоида. Выявлено, что АХРат и РгРат понижают продукцию АФК, индуцированную бета-амилоидом в астроцитах, а также замедляют активацию каспазы 3 в нейронах и астроцитах. В случае с а7-типом АХР было проведено более детальное исследование с использованием ацетилхолина и а-бунгаротоксина и показано, что этот тип рецептора регулирует работу комплекса НАДФН-оксидазы в астроцитах.

Выводы

1. Изучена иммунотерапевтичеекая активность синтетических фрагментов а7-субъединицы ацетилхолинового рецептора на животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера и выявлен фрагмент 173-193, иммунизация которым в свободном виде оказывала иммунотерапевтическое действие на животных.

2. Установлено, что пассивная иммунизация аффинноочищенными антителами к фрагменту 173-193 предотвращает ухудшение пространственной памяти мышей с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера.

3. Изучена иммунотерапевтичеекая активность синтетических фрагментов прионного белка на животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера и выявлен фрагмент 95-123, иммунизация которым в конъюгированном с белком-носителем виде оказывала иммунотерапевтическое действие на животных.

4. Установлено, что пассивная иммунизация аффинноочищенными антителами к фрагменту 95-123 прионного белка оказывала иммунотерапевтическое действие на животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера.

5. Показано, что аффинноочищенные антитела к фрагменту 173-193 а7-субъединицы и к фрагменту 95-123 прионного белка предотвращают индуцированную бета-амилоидом гибель клеток в первичной культуре нейронов и астроцитов гиппокампа крыс.

6. Установлено, что аффинноочищенные антитела к фрагменту 173-193 а7-субъединицы и к фрагменту 95-123 прионного белка понижают индуцированную бета-амилоидом скорость продукции активных форм кислорода в астроцитах и ингибируют вызванную действием бета-амилоида активацию каспазы 3 в первичной культуре нейронов и астроцитов коры мозга крыс.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах:

1. О. М. Вольпина, Т. Д. Волкова, М. А. Титова, Ю. Г. Гершович, Н. И. Медвинская, А. Н. Самохин, А. В. Камынина. В. С. Шалгунов, Д. О. Короев, М. П. Филатова, М. Б. Обозная, Н. В. Бобкова. Новые подходы к иммунотерапии болезни Альцгеймера с использованием синтетических фрагментов а7-субъединицы ацетилхолинового рецептора. Биоорг. Химия. 2008. Т.34(1). С.50-55.

2. Камынина А.В.. Шалгунов B.C., Волкова Т.Д., Короев Д.О., Обозная М.Б., Медвинская Н.И., Самохин А.Н., Бобкова Н.В., Вольпина О.М. Подход к терапии болезни Альцгеймера с помощью индукции антител, направленных к а7-субъединице ацетилхолинового рецептора. Труды МФТИ. 2008. T.l. С.46-51.

3. Kamynina А.У.. Volpina О.М., Medvinskaya N.I., Aleksandrova I.J., Volkova T.D., Koroev D.O., Samokhin A.N., Nesterova I.V., Shelukhina I.V., Kryukova E.V., Tsetlin V.I., Ivanov V.T., Bobkova N.V. Vaccination with Peptide 173-193 of Acetylcholine Receptor alpha7-Subunit Prevents Memory Loss in Olfactory Bulbectomized Mice. J. Alzheimers Dis. 2010. V.21. P.249-261.

Тезисы докладов:

1. Камынина A.B.. Шалгунов B.C., Титова М.А., Волкова Т.Д., Короев Д.О., Обозная М.Б., Гершович Ю.Г., Бобкова Н.В., Цетлин В.И., Вольпина О.М. Изучение подходов к иммунотерапии болезни Альцгеймера с помощью синтетических фрагментов альфа-7 субъединицы ацетилхолинового рецептора. VIII чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова. «Биоорганика-2006», Москва. 2006. №1.49. С.112.

2. Камынина А.В.. Шалгунов B.C., Титова М.А., Волкова Т.Д., Короев Д.О., Обозная М.Б., Гершович Ю.Г., Медвинская Н.И., Самохин А.Н., Бобкова Н.В., Вольпина О.М. Влияние иммунизации синтетическими фрагментами альфа7-субъединицы ацетилхолинового рецептора на состояние пространственной памяти мышей в экспериментальной модели болезни Альцгеймера. III российский симпозиум «Белки и пептиды», Пущино. 2007. С.38.

3. Камынина А.В. «Альфа7-субъединица ацетилхолинового рецептора как эндогенная мишень для терапии болезни Альцгеймера. Международная конференция «Ломоносов-2008». Москва. 2008. С.35-36.

4. Камынина А.В.. Вольпина О.М., Медвинская Н.И., Александрова И.Ю., Шалгунов B.C., Волкова Т.Д., Короев Д.О., Самохин А.Н., Валеева О.А., Бобкова Н.В. Разработка нового подхода к иммунотерапии болезни Альцгеймера. 2-ая Московская международная конференция «Иммунофизиология: естественный аутоиммунитет в норме и патологии». Москва. 2008. С.97-99.

5. Kamynina A.. Volpina О., Medvinskaya N., Aleksandrova I., Shalgunov V., Volkova Т., Koroev D., Samokhin A., Valeeva O., Bobkova N. Immunization with a synthetic fragment of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor causes therapeutic effect in

mice with experimentally induced Alzheimer's disease. 34th FEBS congress, Prague, Czech Republic. 2009. V.276. P.371.

6. Kamvnina A.V.. Volpina O.M., Medvinskaya N.I., Aleksandrova I.Ju., Shelukhina I.V., Krukova E.A., Volkova T.D., Koroev D.O., Samokhin A.N., Tsetlin V.I., Bobkova N.V. A new method of Alzheimer's Disease therapy using antibodies to protein receptors of beta-amyloid. International Conference «Molecular Mechanisms of Neurological and Psychiatric Disorders». Martin, Slovakia. 2009. P.59.

7. Kamvnina A.V.. Medvinskaya N.I., Aleksandrova I.Ju., Volkova T.D., Koroev D.O., Bobkova N.V., Volpina O.M. Synthetic fragments of the neuronal receptors of beta-amyloid provide immunetherapeutic effect in mice with experimentally induced Alzheimer's disease. 10th International Congress of Neuroimmunology. Sitges, Barcelona, Spain. 2010. J. Neuroimmunol. 2010. V.228. P.97-98.

8. Kamvnina A.V.. Medvinskaya N.I., Aleksandrova I.Y., Samokhin A.N. , Volkova T.D., Koroev D.O., Bobkova N.V. Therapeutic effect of immunization with prion synthetic fragment 95-123 in bulbectomized mice with Alzheimer's type degeneration. 10th International Conference "Alzheimer's and Parkinson's Diseases 2011: Neurodegenerative diseases". Barcelona, Spain. 201 l.V.8(l).

9. Камынина A.B.. Бобкова H.B., Медвинская Н.И., Александрова И.Ю., Короев Д.О., Волкова Т.Д., Вольпина О.М. Иммунотерапевтическое действие пептидных фрагментов альфа7-субъединицы ацетилхолинового рецептора и прионного белка в экспериментальной модели болезни Альцгеймера. V Российский симпозиум «Белки и пептиды», Петрозаводск. 2011. С. 145.

Ю.Камынина А.В.. Короев Д.О., Вольпина О.М., Абрамов А.Ю. Механизм протективного действия антител к синтетическим фрагментам альфа7-субъединицы ацетилхолинового рецептора и прионного белка против бета-амилоидной токсичности. Международная конференция «Биология - наука 21 века», Москва. 2012. С.342.

Заказ № 12-А/08/2012 Подписано в печать 07.08.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

/¡ЙГ'л^ ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

1 v J) www. cfr. ru; e-mail:zak@cfr. ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Камынина, Анна Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ «Генез болезни Альцгеймера и подходы к ее терапии»

1. Биохимические маркеры болезни Альцгеймера.

2. Роль бета-амилоида в патогенезе болезни Альцгеймера

2.1. Образование бета-амилоида.

2.2. Агрегация бета-амилоида.

2.3. Механизмы реализации токсического действия бета-амилоида.

3. Участие нейрональных мембранных белков в патогенезе болезни Альцгеймера.

3.1. Участие глутаматэргической системы в патогенезе болезни Альцгеймера.

3.2. Участие холинэргической системы в патогенезе болезни Альцгеймера.

3.3. Участие прионного белка в патогенезе болезни

Альцгеймера.

4. Существующие лекарственные средства, применяемые в медицине для терапии болезни Альцгеймера.

5. Разрабатываемые подходы к терапии болезни Альцгеймера

5.1. Анти-амилоидная терапия болезни Альцгеймера

5.1.1. Препараты, препятствующие агрегации бета-амилоида.

5.1.2. Препараты, действующие на процессы образования бета-амилоида.

5.1.3. Анти-амилоидная иммунотерапия болезни Альцгеймера

5.1.3.1. Активная иммунизация.

5.1.3.2. Оптимизация структуры экзогенного бета-амилоида как способ совершенствования вакцины против болезни Альцгеймера.

5.1.3.3. Пассивная иммунизация.

5.1.3.4. Гипотезы иммунотерапевтического действия антител к бета-амилоиду.

5.2. Нейрональные мембранные белки как мишени для разработки новых подходов к терапии болезни Альцгеймера.

6. Экспериментальные модели болезни Альцгеймера.

II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Исследование иммунотерапевтической активности фрагментов а7-субъединицы

АХР на животных с экспериментально индуцированной формой БА.

1.1. Исследование действия иммунизации конъюгированными с белком-носителем фрагментами а7-субъединицы АХР на животных с экспериментально индуцированной формой БА

1.1.1. Выбор фрагментов а7-субъединицы АХР.

1.1.2. Действие иммунизации конъюгированными с белком-носителем фрагментами а7-субъединицы АХР на память БЭ мышей.

1.1.3. Действие иммунизации конъюгированными с белком-носителем фрагментами а7-субъединицы АХР на уровень бета-амилоида в мозгу БЭ мышей.

1.2. Исследование иммуногенной активности свободных фрагментов а7-субъединицы АХР на мышах.

1.3. Исследование действия иммунизации свободными фрагментами а7-субъединицы АХР на животных с экспериментально индуцированной формой БА

1.3.1. Действие иммунизации фрагментами а7-субъединицы АХР на память БЭ животных.

1.3.2. Определение содержания антител к фрагментам а7-субъединицы АХР в сыворотке крови и спинномозговой жидкости БЭ мышей.

1.3.3. Эффект иммунизации фрагментом 173-193 а7-субъединицы АХР на уровень бета-амилоида в мозгу БЭ мышей.

1.3.4. Влияние иммунизации фрагментом 173-193 а7-субъединицы АХР на уровень а7-типа АХР в мозгу БЭ мышей.

1.4. Исследование действия антител к фрагменту 173-193 а7-субъединицы АХР на животных с экспериментально индуцированной формой БА

1.4.1. Исследование влияния пассивного введения сыворотки, содержащей антитела к фрагменту 173-193 а7-субъединицы АХР, на память БЭ мышей.

1.4.2. Получение аффинноочищенных мышиных антител к фрагменту 173-193 а7-субъединицы АХР.

1.4.3. Исследование влияния пассивного введения антител к фрагменту 173193 на память БЭ мышей.

2. Исследование иммунотерапевтической активности фрагментов прионного белка а7-субъединицы АХР на животных с экспериментально индуцированной формой

2.1. Выбор фрагментов прионного белка.

2.2. Исследование действия иммунизации конъюгированными с белком-носителем фрагментами прионного белка на животных с экспериментально индуцированной формой БА

2.2.1. Влияние иммунизации фрагментами прионного белка на память БЭ мышей.

2.2.2. Определение содержания антител к прионным фрагментам в сыворотке крови и спинномозговой жидкости БЭ мышей.

2.2.3. Влияние иммунизации фрагментами прионного белка на уровень бета-амилоида в мозгу БЭ мышей.

2.2.4. Влияние иммунизации фрагментами прионного белка на морфологическое состояние нейронов гиппокампа и коры мозга БЭ мышей.

2.3. Исследование действия антител к фрагменту 95-123 прионного белка на животных с экспериментально индуцированной формой БА

2.3.1. Получение аффинноочищенных мышиных антител к фрагменту 95-123 прионного белка.

2.3.2. Исследование влияния пассивного введения антител к фрагменту 95-123 прионного белка на память БЭ мышей.

2.3.3. Исследование влияния пассивного введения антител к фрагменту 95-123 прионного белка на уровень бета-амилоида в мозгу БЭ мышей.

3. Исследование действия антител к фрагменту 173-193 а7-субъединицы АХР и к фрагменту 95-123 прионного белка в клеточной модели Б А.

3.1. Получение аффинноочищенных кроличьих антител к фрагменту 173-193 а7-субъединицы АХР и к фрагменту 95-123 прионного белка.

3.2. Исследование отсутствия связывания аффинноочищенных кроличьих антител к фрагментам 173-193 а7-субъединицы АХР и 95-123 прионного белка с Р-амилоидом 1-42.

3.3. Исследование действия аффинноочищенных кроличьих антител к фрагментам 173-193 а7-субъединицы АХР и 95-123 прионного белка на клеточную гибель, вызванную бета-амилоидом.

3.4. Исследование действия аффиноочшценных кроличьих антител к фрагменту 173-193 а7-субъединицы АХР и к фрагменту 95-123 прионного белка на Са2+сигнал в астроцитах и нейронах.

3.5. Исследование действия аффиноочшценных кроличьих антител к фрагменту 173-193 а7-субъединицы АХР и к фрагменту 95-123 прионного белка на скорость образования активных форм кислорода в астроцитах и нейронах.

3.6. Исследование действия аффиноочшценных кроличьих антител к фрагменту 173-193 а7-субъединицы АХР и к фрагменту 95-123 прионного белка на скорость активации каспазы 3.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Химические реагенты и биологические препараты.

2. Оборудование и расходные материалы.

3. Животные.

4. Культуры клеток.

5. Состав буферов.

6. Получение конъюгатов прионных фрагментов с KLH.

7. Схемы экспериментов.

8. Иммунизация животных

8.1. Иммунизация кроликов.

8.2. Активная иммунизация мышей.

8.3. Пассивная иммунизация мышей.

9. Получение сывороток крови и спинномозговой жидкости

9.1. Отбор крови.

9.2. Отбор спинномозговой жидкости.

10. Твердофазный иммуноферментный анализ.

11. Аффинная очистка антител

11.1. Приготовление аффинного носителя.

11.2. Получение аффинноочищенных антител.

12. Моделирование спорадической формы болезни Альцгеймера на основе бульбэктомии.

13. Обучение мышей и тестирование пространственной памяти.

14. Получение смешанной культуры нейронов и астроцитов гиппокампа или коры мозга крыс

14.1. Обработка покровных стекол для посадки первичных культур.

14.2. Выделение и посадка смешанной культуры нейронов и астроцитов гиппокампа или коры мозга крыс.

15. Исследования на культурах клеток

15.1. Клеточная гибель.

15.2. Измерение внутриклеточного Са2+.

15.3. Измерение количества активных форм кислорода в смешанной культуре нейронов и астроцитов.

15.4. Исследование активации каспазы 3 под действием бета-амилоида.

15.5. Обработка клеток.

15.6. Микроскопия.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунотерапевтическая активность фрагментов альфа7-субъединицы ацетилхолинового рецептора и прионного белка в экспериментальных моделях болезни Альцгеймера"

Болезнь Альцгеймера - тяжелое нейродегенеративное заболевание центральной нервной системы, характеризующееся прогрессирующим снижением интеллекта, расстройством когнитивных функций и памяти и изменением поведения. Болезнь Альцгеймера с каждым годом «молодеет» и является социально значимой проблемой современности. На лечение болезни тратятся огромные средства, при этом существующие лекарственные средства оказывают лишь симптоматическое действие. В связи с тем, что остается неясным механизм развития болезни Альцгеймера, не разработана и радикальная терапия заболевания, а при отсутствии лечения болезнь неуклонно прогрессирует и приводит к разрушению всех психических функций. В связи с этим актуальным остается поиск новых подходов к лечению болезни Альцгеймера.

Основными характеристиками болезни Альцгеймера считается наличие фибриллярных клубков, сформированных накоплением фосфорилированной формы 1аи-белка, сенильных бляшек, образованных агрегированной формой бета-амилоидного пептида, а также гипофункция холинэргической системы, связанная с низким содержанием ацетилхолина и уменьшением количества ацетилхолиновых рецепторов. В настоящее время выдвигается ряд гипотез развития болезни Альцгеймера, основанных на доказательствах токсического действия бета-амилоида на нейроны мозга. Один из наиболее распространенных предполагаемых механизмов патогенеза болезни Альцгеймера заключается в связывании патогенного бета-амилоида с каким-либо мембранным белком на поверхности клеток мозга, что приводит к их гибели.

Особый интерес в настоящее время уделяется подходам к терапии болезни Альцгеймера, которые опираются на представления о молекулярных механизмах развития болезни, и позволяют направленно создавать препараты, сочетающие в себе когнитивно-стимулирующие и нейропротекторные свойства. В частности, основным направлением в этой области является создание препаратов, снижающих уровень бета-амилоида в мозгу пациентов за счет индукции антител к этому патогенному пептиду. Работы, проведенные в этом направлении, показывают принципиальную возможность использования как вакцинации бета-амилоидными пептидами, так и пассивного введения антител к бета-амилоиду для терапии болезни Альцгеймера. Тем не менее, в данном виде лечения заболевания обнаружен ряд недостатков, которые препятствуют внедрению этих средств в клиническую практику. В связи с этим остается актуальным поиск новых подходов к терапии болезни Альцгеймера.

В настоящей работе предложен новый подход к терапии болезни Альцгеймера, основанный не на снижении уровня бета-амилоида, а на разобщении связывания этого патогенного пептида с мембранными белками на поверхности нейрональной клетки с помощью специфических антител, направленных к мембранным белкам. В частности, было показано, что бета-амилоид связывается с а7-типом ацетилхолинового рецептора и прионным белком на поверхности клеток мозга, что приводит к их гибели и к запуску нейродегенаривных процессов. Мы предположили, что антитела, направленные к этим белкам, будут препятствовать связыванию бета-амилоида и развитию дальнейших процессов болезни Альцгеймера. Для индукции антител, направленных к выбранным белкам, мы использовали синтетические фрагменты этих белков. В работе изучена иммунотерапевтическая активность фрагментов а7-субъединицы ацетилхолинового рецептора и прионного белка, а также протективное действие антител к ним в in vivo и in vitro моделях болезни Альцгеймера.

I. Обзор литературы «Генез болезни Альцгеймера и подходы к ее терапии»

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Камынина, Анна Владимировна

Выводы

1. Изучена иммунотерапевтнческая активность синтетических фрагментов а7-субъединицы ацетилхолинового рецептора на животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера и выявлен фрагмент 173-193, иммунизация которым в свободном виде оказывала иммунотерапевтическое действие на животных.

2. Установлено, что пассивная иммунизация аффинноочищенными антителами к фрагменту 173-193 оказывала иммунотерапевтическое действие на животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера.

3. Изучена иммунотерапевтнческая активность синтетических фрагментов прионного белка на животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера и выявлен фрагмент 95-123, иммунизация которым в конъюгированном с белком-носителем виде оказывала иммунотерапевтическое действие на животных.

6. Установлено, что аффинноочищенные антитела к фрагменту 173-193 0.1-субъединицы и к фрагменту 95-123 прионного белка понижают индуцированную бета-амилоидом скорость продукции активных форм кислорода в астроцитах и ингибируют вызванную действием бета-амилоида активацию каспазы 3 в первичной культуре нейронов и астроцитов коры мозга крыс.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Камынина, Анна Владимировна, Пущино

1. Terry R.D., Katzman R. Senile dementia of the Alzheimer type.// Ann. Neurol. 1983.1. V.14. P.497-506.

2. Whitehouse P.J. Genesis of Alzheimer's disease.// Neurology. 1997. V.48 (7). S2-7.

3. Brookmeyer R., Gray S., Kawas C. Projections of Alzheimer's disease in the United

4. States and the public health impact of delaying disease onset.// Am. J. Public Health. 1998. V.88(9). P.1337-1342.

5. Woodard J.S. Alzheimer's disease in late adult life.// Am. J. Pathol. 1966. V.49(6).1. P.l 157-1169.

6. Sadowski M., Wisniewski T. Disease modifying approaches for Alzheimer's pathology.//

7. Curr. Pharm. Des. 2007. V. 13(19). P. 1943-1954.

8. Goedert M. Tau protein and the neurofibrillary pathology of Alzheimer's disease.//

9. Annals of the New York Academy of Sciences. 1996. (777). P.121-131.

10. Braak H., Braak E. Neuropathological staging of Alzheimer-related changes.// Acta.

11. Neuropathol. 1991. V.82. P.239-259.

12. Hardy J. Amyloid, the presenilins and Alzheimer's disease.// Trends Neurosci. 1997.1. V.20. P.l54-159.

13. Levy-Lahad E., Wasco W., Poorkaj P., Romano D.M., Oshima J., Pettingell W.H., Yu

14. C.E., Jondro P.D., Schmidt S.D., Wang K., et al. Candidate gene for the chromosome 1 familial Alzheimer's disease locus.// Science. 1995. V.269. P.973-977.

15. Sherrington R., Rogaev E.I., Liang Y., Rogaeva E.A., Levesque G., Ikeda M., Chi H., Lin

16. C., Li G., Holman K., Tsuda Т., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.//Nature. 1995. V.375. P.754-760.

17. Roses A.D. A model for susceptibility polymorphisms for complex diseases: apolipoprotein E and Alzheimer disease.//Neurogenetics. 1997.(1). P.3-11.

18. Goedert M., Spillantini M.G., Jakes R., Rutherford D., Crowther R.A. Multiple isoformsof human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease.//Neuron. 1989. V.3(4). P.519-526.

19. Lee V.M. Disruption of the cytoskeleton in Alzheimer's disease.// Current Opinion in Neurobiology. 1995. V.5(5). P.663-668.

20. Selkoe D.J. Amyloid beta-protein and the genetics of Alzheimer's disease.// J. Biol.

21. Chem. 1996. V.271(31).P.18295-18298. 15.Esch F.S., Keim P.S., Beattie E.C., Blacher R.W., Culwell A.R., Oltersdorf Т., McClure

22. Walter J., Kaether C., Steiner H., Haass C. The cell biology of Alzheimer's disease:uncovering the secrets of secretases.// Curr. Opin. Neurobiol. 2001. V. 11. P.585-590.

23. Busciglio J., Gabuzda D.H., Matsudaira P., Yankner B.A. Generation of beta-amyloid in the secretory pathway in neuronal and nonneuronal cells.// Proc. Natl. Acad. Sci. U S

24. A. 1993. V.90(5). P.2092-2096.

25. Golde T.E., Estus S., Younkin L.H., Selkoe D.J., Younkin S.G. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives.// Science. 1992. V.255(5045). P.728-730.

26. Haass, C., Schlossmacher M.G., Hung, A.Y., Vigo-Pelfrey C., Mellon A., Ostaszewski

27. B.L., Lieberburg I., Koo E.H., Schenk D., Teplow D.B. Amyloid beta-peptide is produced by cultured cells during normal metabolism.// Nature 1992. V.359. P.322-325.

28. Mawuenyega K.G., Sigurdson W., Ovod V., Munsell L., Kasten T., Morris J.C., Yarasheski K.E., Bateman R.J. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease.// Science. 2010. V.330(6012). P.1774.

29. Barrow C.J., Yasuda A., Kenny P.T., Zagorski M.G. Solution conformations and aggregational properties of synthetic amyloid beta-peptides of Alzheimer's disease.// Analysis of circular dichroism spectra. J. Mol. Biol. 1992. V.225(4). P. 1075-1093.

30. Price D.L., Tanzi R.E., Borchelt D.R., Sisodia S.S. Alzheimer's disease: genetic studies and transgenic models.// Annu. Rev. Genet. 1998. V.32. P.461-493.

31. Selkoe D.J. Alzheimer's disease: genes, proteins and therapy.// Physiological Reviews. 2001. V. 81(2). P.741-766.

32. Clippingdale A.B., Wade J.D., Barrow C.J. The amyloid-beta peptide and its role in Alzheimer's disease.// Journal of peptide science. 2001. V.7(5). P.227-249.

33. Pike C.J., Burdick D., Walencewicz A.J., Glabe C.G., Cotman C.W. Neurodegeneration induced by fi-amyloid peptides in vitro: The role of peptide assembly state.// J. Neurosci. 1993.V. 13. P. 1676-1687.

34. Soto C., Branes M.C., Alvarez J., Inestrosa N.C. Structural determinants of the

35. Alzheimer's amyloid beta-peptide.// J. Neurochem. 1994. V.63. P.l 191-1198.

36. Teplow, D.B. Structural and kinetic features of amyloid betaprotein fibrillogenesis. Amyloid.// 1998. V.5. P.121-142.

37. Jarrett J.T., Berger E.P., Lansbury P.T. The carboxy terminus of the beta amyloid proteinis critical for the seeding of amyloid formation: implications for the pathogenesis of Alzheimer's disease.// Biochemistry. 1993. V.32. P.4693-4697.

38. Hilbich C., Kisters-Woike B., Reed J., Masters C.L., Beyreuther K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease beta A4 peptides. J. Mol. Biol. 1992. V.228. P.460-473.

39. Dickson D.W., Yen S.H. Beta-amyloid deposition and paired helical filament formation: which histopathological feature is more significant in Alzheimer's disease?// Neurobiol. Aging. 1989. V.10(5). P.402-404.

40. Estrada L.D., Soto С. Disrupting (3-Amyloid Aggregation for Alzheimer Disease Treatment. Curr. Top. Med. Chem. 2007. V.7(l). P.l 15-126.

41. Casley C.S., Land J.M., Sharpe M.A., Clark J.B., Duchen M.R., Canevari L. Beta-amyloid fragment 25-35 causes mitochondrial dysfunction in primary cortical neurons.//Neurobiol. Dis. 2002. V. 10(3). P.258-267.

42. Behl C., Davis J.B., Lesley R., Schubert D. Hydrogen peroxide mediates amyloid beta protein toxicity.// Cell. 1994. V.77(6). P.817-827.

43. Mattson M.P., Rydel R.E. beta-Amyloid precursor protein and Alzheimer's disease: the peptide plot thickens.//Neurobiol. Aging. 1992. V.13(5). P.617-621.

44. Stix В., Reiser G. Beta-amyloid peptide 25-35 regulates basal and hormone-stimulated Ca2+ levels in cultured rat astrocytes.//Neurosci. Lett. 1998. V.243(l-3). P.121-124.

45. De la Monte S.M., Luong Т., Neely T.R., Robinson D., Wands J.R. Mitochondrial DNA damage as a mechanism of cell loss in Alzheimer's disease.// Lab. Invest. 2000. V.80(8). P.1323-1335.

46. Grant S.M., Shankar S.L., Chalmers-Redman R.M., Tatton W.G., Szyf M., Cuello A.C. Mitochondrial abnormalities in neuroectodermal cells stably expressing human amyloid precursor protein (hAPP751).//Neuroreport. 1999. V.10(l). P.41-46.

47. Pereira C., Santos M.S., Oliveira C. Mitochondrial function impairment induced by amyloid beta-peptide on PC12 cells.//Neuroreport. 1998. V.9(8). P.1749-1755.

48. Canevari L., Clark J.В., Bates Т.Е. Beta-Amyloid fragment 25-35 selectively decreases complex IV activity in isolated mitochondria.// FEBS Lett. 1999. V.457(l). P.131-134.

49. Cardoso S.M., Santos S., Swerdlow R.H., Oliveira C.R. Functional mitochondria are required for amyloid beta-mediated neurotoxicity.// FASEB J. 2001. V.15(8). P.l 4391441.

50. Gabuzda D., Busciglio J., Chen L.B., Matsudaira P., Yankner B.A. Inhibition of energy metabolism alters the processing of amyloid precursor protein and induces a potentially amyloidogenic derivative.// J. Biol. Chem. 1994. V.269(18). P. 1362313628.

51. Varadarajan S., Yatin S., Aksenova M., Butterfield D.A. Review: Alzheimer's amyloid beta-peptide-associated free radical oxidative stress and neurotoxicity.// J. Struct. Biol. 2000. V. 130(2-3). P. 184-208.

52. Canevari L., Abramov A.Y., Duchen M.R. Toxicity of amyloid beta peptide: tales of calcium, mitochondria, and oxidative stress.//Neurochem. Res. 2004. V.29(3). P.637-650.

53. Ho R., Ortiz D., Shea T.B. Amyloid-beta promotes calcium influx and neurodegeneration via stimulation of L voltage-sensitive calcium channels rather than NMDA channels in cultured neurons.// J. Alzheimers Dis. 2001. V.3(5). P.479-483.

54. Rovira C., Arbez N., Mariani J. Abeta(25-35) and Abeta(l-40) act on different calcium channels in CA1 hippocampal neurons.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V.296(5). P.1317-1321.

55. Arispe N., Pollard H.B., Rojas E. Giant multilevel cation channels formed by Alzheimer disease amyloid beta-protein A beta P-(l-40). in bilayer membranes.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.90(22). P.10573-10577.

56. Rhee S.K., Quist A.P., Lai R. Amyloid beta protein-(l-42) forms calcium-permeable, Zn2+-sensitive channel.// J Biol Chem. 1998. V.273(22). P.13379-13382.

57. Arispe N., Pollard H.B., Rojas E. Zn interaction with Alzheimer amyloid beta protein calcium channels.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V.93(4). P.1710-1715.

58. Pericak-Vance M.A., Bebout J.L., Gaskell P.C. Linkage studies in familial Alzheimer disease: evidence for chromosome 19 linkage.// Am. J. Hum. Genet. 1991. V.48(6). P.1034-1050.

59. Hardy J., Selkoe D.J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics.// Science. 2002. V.297. P.353-356.

60. Tanzi R.E., Bertram L. Twenty years of the Alzheimer's disease amyloid hypothesis: a genetic perspective.// Cell. 2005. V.120. P.545-555.

61. Kusumi A., Suzuki K. Toward understanding the dynamics of membrane raft-based molecular interactions.//Biochim. Biophys. Acta. 2005. V.1746. P.234-251.

62. Williamson R., Sutherland C. Neuronal Membranes are Key to the Pathogenesis of Alzheimer's Disease: The Role of Both Raft and Non-Raft Membrane Domains.// Curr. Alzheimer Res. 2011. V.8(2). P.213-221.

63. Levy M.L., Cummings J.L., Kahn-Rose R. Neuropsychiatry symptoms and cholinergic therapy for Alzheimer's disease.// Gerontology. 1999. V.45(l). P.15-22.

64. Selkoe D.J. Images in neuroscience. Alzheimer's disease: from genes to pathogenesis.// Science. 1997. V. 154(9). P. 1198.

65. Greenamyre J.T., Maragos W.F., Albin R.L., Penney J.B., Young A.B. Glutamate transmission and toxicity in Alzheimer's disease.// Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 1988. V.12(4). P.421-430.

66. Francis P.T., Palmer A.M., Snape M., Wilcock G.K. The cholinergic hypothesis of Alzheimer's disease: a review progress.// J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 1999. V.66. P.137-147.

67. Guan Z.-Z., Zhang X., Ravid R., Nordberg A. Decreased Protein levels of nicotinic receptor subunits in the hippocampus and temporal cortex of patients with Alzheimer's disease.// J.Neurochem. 2000. V. 74(1). P.237-243.

68. Court J., Martin-Ruiz C., Piggott M., Spurden D., Griffiths M., Perry E. Nicotinic receptor abnormalities in Alzheimer's disease.// Biol. Psychiatry. 2001. V.49(3). P.175-184.

69. Seguela P., Wadiche J., Dineley-Miller K., Dani J.A., Patrick J.W. Molecular cloning, functional properties, and distribution of rat brain alpha 7: a nicotinic cation channel highly permeable to calcium.// J. Neurosci. 1993. V.13(2). P.596-604.

70. Berger F., Gage F.H., Vijayaraghavan S. Nicotinic receptor-induced apoptotic cell death of hippocampal progenitor cells.// J. Neurosci. 1998. V. 18(17). P.6871-6881.

71. Messi M.L., Renganathan M., Grigorenko E., Delbono O. Activation of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor promotes survival of spinal cord motoneurons.// FEBS Lett. 1997. V.411(1). P.32-38.

72. Vijayaraghavan S., Huang B., Blumenthal E.M., Berg D.K. Arachidonic acid as a possible negative feedback inhibitor of nicotinic acetylcholine receptors on neurons.// J Neurosci. 1995. V.5(l). P.3679-3687.

73. Middleton R.E., Cohen J.B. Mapping of the acetylcholine binding site of the nicotinic acetylcholine receptor: 3H.nicotine as an agonist photoaffmity label.// Biochemistry. 1991. V.30(28). P.6987-6997.

74. Fairclough R.H., Twaddle G.M., Gudipati E., Lin M.Y., Richman D.P. Differential surface accessibility of alpha(187-199) in the Torpedo acetylcholine receptor alpha subunits.//J. Mol. Biol. 1998. V.282(2). P.317-330.

75. Feher A, Juhasz A, Rimanoczy A, Csibri E, Kalman J, Janka Z. Association between a genetic variant of the alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor subunit and four types of dementia.// Dement. Geriatr. Cogn. Disord. 2009. V.28(l). P.56-62.

76. Liu Q., Kawai H., Berg D.K. beta -Amyloid peptide blocks the response of alpha 7-containing nicotinic receptors on hippocampal neurons.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2001. V.98(8). P.4734-4739.

77. Dineley K.T., Bell K.A., Bui D., Sweatt J.D. beta -Amyloid peptide activates alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors expressed in Xenopus oocytes.// J. Biol. Chem.2002. V.277(28). P.25056-25061.

78. Grassi F., Palma E., Tonini R., Amici M., Ballivet M., Eusebi F. Amyloid beta(l-42) peptide alters the gating of human and mouse alpha-bungarotoxin-sensitive nicotinic receptors.//J. Physiol. 2003. V.547(l). P.147-157.

79. D'Andrea M.R., Nagele R.G., Wang H.Y., Peterson P.A., Lee D.H. Evidence for neuronal origin of amyloid plaques in Alzheimer's disease.// Histopathology 2001. V.38(2). P.120-134.

80. D'Andrea M.R., Nagele R.G. MAP-2 immunolabeling can distinguish diffuse from dense-core amyiloid plaques in Alzheimer's disease brains.// Biotech. Histochem. 2002. V.77(2). P.95-103.

81. Lilja A.M., Porras O., Storelli E., Nordberg A., Marutle A. Functional interactions of fibrillar and oligomeric amyloid-P with alpha7 nicotinic receptors in Alzheimer's disease.// J. Alzheimers Dis. 2011. V.23(2). P.335-347.

82. Wang H.Y., Bakshi K., Shen C., Frankfurt M., Trocme-Thibierge C., Morain P. S 24795 limits beta-amyloid-alpha7 nicotinic receptor interaction and reduces Alzheimer's disease-like pathologies.// Biol. Psychiatry. 2010. V.67(6). P.522-530.

83. Wilkinson D. Drugs for treatment of Alzheimer's disease.// Int. J. Clin. Pract. 2001.1. V.55(2). P.129-134.

84. Kelly B.L., Ferreira S. P Amyloid-induced dynamin 1 degradation is mediated by N-methyl-d-aspartate receptors in hippocampal neurons.// J. Biol. Chem. 2006. V.281. P.28079-28089.

85. Manev H., Favaron M., Guidotti A., Costa E. Delayed increase of Ca2+ influx elicited by glutamate: role in neuronal death.// Mol. Pharmacol. 1989. V.36(l). P.106-112.

86. Qiu Z., Gruol D.L. Interleukin-6, beta-amyloid peptide and NMDA interactions in rat cortical neurons.// J. Neuroimmunol. 2003. V.139(1-2). P.51-57.

87. Hynd M.R., Scott H.L., Dodd P.R. Glutamate-mediated excitotoxicity and neurodegeneration in Alzheimer's disease.//Neurochem. Int. 2004. V.45. P. 583-595.

88. Waxman E.A., Lynch D.R. N-Methyl-d-aspartate receptor subtypes: multiple roles in excitotoxicity and neurological disease.// Neuroscientist. 2005. V.ll. P. 37-49.

89. Kabogo K., Rauw G., Amritraj A., Baker G., Kar S. P-Amyloid-related peptides potentiate K+-evoked glutamate release from adult rat hippocampal slices, Neurobiol. Aging. 2010. V.31. P. 1164-1172.

90. Texido L., Martin-Satue M., Alberdi E., Solsona C., Matute C. Amyloid P peptide oligomers directly activate NMDA receptors.// Cell Calcium. 2011. V.49(3). P.184-190.

91. Blanchard B.J., Konopka G., Russell M., Ingram V.M. Mechanism and prevention of neurotoxicity caused by beta-amyloid peptides: relation to Alzheimer's disease.// Brain Res. 1997. V.776(l-2). P.40-50.

92. Esiri M.M., Carter J., Ironside J.W. Prion protein immunoreactivity in brain samples from an unselected autopsy population: findings in 200 consecutive cases.// Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2000. V.26(3). P.273-284.

93. Kretzchmar H.A., Prusiner S.B., Stowring L.E., DeArmond S.J. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons.// Am. J. Pathol. 1986. V.122. P.1-5.

94. Weissmann C., Fischer M., Raeber A., Bueler H., Sailer A., Shmerling D., Rulicke T., Brandner S., Aguzzi A. The role of PrP in pathogenesis of experimental scrapie.// Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1996. V.61. P.511-522.

95. Kuwahara C., Takeuchi A.M., Nishimura T., Haraguchi K., Kubosaki A., Matsumoto Y., Saeki K., Yokoyama T., Itohara S., Onodera T. Prions prevent neuronal cell-line death.//Nature. 1999. V.400. P.225-226.

96. Lauren J., Gimbel D.A., Nygaard H.B., Gilbert J.W., Strittmatter S.M. Cellular prion protein mediates impairment of synaptic plasticity by amyloid-b oligomers.// Nature. 2009. V.457. P.l 128-1134.

97. Gimbel D.A., Nygaard H.B., Coffey E.E., Gunther E.C., Lauren J., Gimbel Z.A., Strittmatter S.M. Memory impairment in transgenic Alzheimer mice requires cellular prion protein.// J. Neurosci. 2010. V.30(18). P.6367-6374.

98. Chen S., Yadav S.P., Surewicz W.K. Interaction between human prion protein and amyloid-beta (Abeta) oligomers: role OF N-terminal residues.// J. Biol. Chem. 2010. V.285(34). P.26377-26383.

99. Parkin E.T., Watt N.T., Hussain I., Eckman E.A., Eckman C.B., Manson J.C., Baybutt

100. H.N., Turner A.J., Hooper N.M. Cellular prion protein regulates beta-secretase cleavage of the Alzheimer's amyloid precursor protein.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104(26). P.l 1062-11067.

101. Calella A.M., Farinelli M., Nuvolone M., Mirante O., Moos R., Falsig J., Mansuy

102. M., Aguzzi A. Prion protein and Abeta-related synaptic toxicity impairment.// EMBO Mol Med. 2010. V.2(8). P.306-314.

103. Forloni G., Balducci C. P-amyloid oligomers and prion protein: Fatal attraction?// Prion. 2011. V.5(l). P.10-15.

104. Zou W.Q., Xiao X., Yuan J., Puoti G., Fujioka H., Wang X., Richardson S., Zhou X., Zou R., Li S., et al. Amyloid-{beta}42 Interacts Mainly with Insoluble Prion Protein in the Alzheimer Brain.// J. Biol. Chem. 2011. V.286(17). P.15095-15105.

105. Chen S., Yadav S.P., Surewicz W.K. Interaction between human prion protein and amyloid-beta (Abeta) oligomers: role OF N-terminal residues. J. Biol. Chem. 2010. V.285(34). P.26377-26383.

106. Bartus R.T., Dean R.L. 3rd, Beer B., Lippa A.S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction.// Science. 1982. V.217(4558). P.408-414.

107. Coyle J.T., Price D.L., DeLong M.R. Alzheimer's disease: a disorder of cortical cholinergic innervations.// Science. 1983. V.219(4589). P.l 184-1190.

108. Maelicke A., Albuquerque E.X. Allosteric modulation of nicotinic acetylcholine receptors as a treatment strategy for Alzheimer's disease.// Eur. J. Pharmacol. 2000. V.393(1-3). P.165-170.

109. Gil-Neciga E., Gobartt A.L. Treatment pattern of Alzheimer's disease with cholinesterase inhibitors (TRAIN study).// Rev. Neurol. 2008. V.46(8). P.461-464.

110. Li J., Wu H., Zhou R., Liu G., Dong B. Huperzine A for Alzheimer's disease.// Cochrane Database Syst. Rev. 2008. 2:CD005592.

111. Giacobini E. The cholinergic system in Alzheimer disease.// Prog. Brain Res. 1990. V.84. P.321-323.

112. Lopez-Arrieta J.M., Schneider L. Metrifonate for Alzheimer's disease.// Cochrane Database Syst. Rev. 2006. 2:CD003155.

113. Roberson M.R., Harrell L.E. Cholinergic activity and amyloid precursor protein metabolism. Brain Res. Rev. 1997. V.25(l). P.50-69.

114. Harries M.H., Samson N.A., Cilia J., Hunter A.J. The profile of sabcomeline (SB-202026), a functionally selective Ml receptor partial agonist, in the marmoset.// Br. J. Pharmacol. 1998 May;124(2):409-15

115. Fisher A., Brandeis R., Bar-Ner R.H., Kliger-Spatz M., Natan N., Sonego H., Marcovitch I., Pittel Z. AF150(S) and AF267B: Ml muscarinic agonists as innovative therapies for Alzheimer's disease.// J. Mol. Neurosci. 2002. V. 19(1-2). P. 145-153.

116. Kammer H., Mayhaus M., Albrecht С., Enderich J., Wegner M., Nitsch R.M. Muscarinic acetylcholine receptors activate expression of the EGR gene family of transcription factors.// J. Biol. Chem. 1998. V.273(23). P.14538-14544.

117. Бачурин C.O. Медико-биохимические подходы к направленному поиску лекарственных средств для предупреждения и лечения болезни Альцгеймера.// Электронная библиотека психиатрии. 2001.

118. Гаврилова С.И., Жариков Г.А. Лечение болезни Альцгеймера.// Психиатрия и психофармакотерапия. 2001. Т.З, №2.

119. Wood S.J., MacKenzie L., Maleeff В., Hurle M.R., Wetzel R. Selective inhibition of Abeta fibril formation.// J. Biol. Chem. 1996. V.271(8). P.4086-4092.

120. Allsop D., Howlett D., Christie G., Karran E. Fibrillogenesis of beta-amyloid.// Biochem. Soc. Trans. 1998. V.26(3). P.459-463.

121. Kisilevsky R., Lemieux L.J., Fraser P.E., Kong X., Hultin P.G., Szarek W.A. Arresting amyloidosis in vivo using small-molecule anionic sulphonates or sulphates: implications for Alzheimer's disease.//Nat. Med. 1995. V.l(2). P.143-148.

122. Ono K., Hasegawa K., Naiki H., Yamada M. Anti-amyloidogenic activity of tannic acid and its activity to destabilize Alzheimer's beta-amyloid fibrils in vitro.// Biochim. Biophys. Acta. 2004. V. 1690(3). P. 193-202.

123. Liu R., Barkhordarian H., Emadi S., Park C.B., Sierks M.R. Trehalose differentially inhibits aggregation and neurotoxicity of beta-amyloid 40 and 42.// Neurobiol. Dis. 2005. V.20(l). P.74-81.

124. Mook-Jung I., Joo I., Sohn S., Kwon H.J., Huh K., Jung M.W. Estrogen blocks neurotoxic effects of beta-amyloid (1-42) and induces neurite extension on В103 cells.//Neurosci. Lett. 1997. V.235(3). P.101-104.

125. Pappolla M., Bozner P., Soto C., Shao H., Robakis N.K., Zagorski M., Frangione В., Ghiso J. Inhibition of Alzheimer beta-fibrillogenesis by melatonin.// J. Biol. Chem. 1998. V.273(13). P.7185-7188.

126. Tjernberg L.O., Naslund J., Lindqvist F., Johansson J., Karlstrom A.R., Thyberg J., Terenius L., Nordstedt C. Arrest of beta-amyloid fibril formation by a pentapeptide ligand.//J. Biol. Chem. 1996. V.271(15). P.8545-8548.

127. Ghanta J., Shen C.L., Kiessling L.L., Murphy R.M. A strategy for designing inhibitors of beta-amyloid toxicity.// J. Biol. Chem. 1996. V.271(47). P.29525-29528.

128. Pallitto M.M., Ghanta J., Heinzelman P., Kiessling L.L., Murphy R.M. Recognition sequence design for peptidyl modulators of beta-amyloid aggregation and toxicity.// Biochemistry. 1999. V.38(12). P. 3570-3578.

129. Hughes E., Burke R.M., Doig A.J. Inhibition of toxicity in the beta-amyloid peptide fragment beta -(25-35) using N-methylated derivatives: a general strategy to prevent amyloid formation.// J. Biol. Chem. 2000. V.275(33). P.25109-25115.

130. Gordon D.J., Tappe R., Meredith SC. Design and characterization of a membrane permeable N-methyl amino acid-containing peptide that inhibits Abetal-40 fibrillogenesis.// J. Pept. Res. 2002. V.60(l). P.37-55.

131. Gordon D.J., Meredith S.C. Probing the role of backbone hydrogen bonding in beta-amyloid fibrils with inhibitor peptides containing ester bonds at alternate positions.// Biochemistry. 2003. V.42(2). P.475-485.

132. Sciarretta K.L., Boire A., Gordon D.J., Meredith SC. Spatial separation of beta-sheet domains of beta-amyloid: disruption of each beta-sheet by N-methyl amino acids.// Biochemistry. 2006. V.45(31). P.9485-9495.

133. Wood S.J., Wetzel R., Martin J.D., Hurle M.R. Prolines and amyloidogenicity in fragments of the Alzheimer's peptide beta/A4.// Biochemistry. 1995. V.34(3). P.724-730.

134. Soto C., Sigurdsson E.M., Morelli L., Kumar R.A., Castaño E.M., Frangione B. Betasheet breaker peptides inhibit fibrillogenesis in a rat brain model of amyloidosis: implications for Alzheimer's therapy.// Nat. Med. 1998. V.4(7). P.822-826.

135. Permanne B., Adessi C., Fraga S., Frossard M.J., Saborio G.P., Soto C. Are beta-sheet breaker peptides dissolving the therapeutic problem of Alzheimer's disease?// J. Neural. Transm. Suppl. 2002. V.62. P.293-301.

136. Chacon M.A., Barría M.I., Soto C., Inestrosa N.C. Beta-sheet breaker peptide prevents Abeta-induced spatial memory impairments with partial reduction of amyloid deposits.// Mol. Psychiatry. 2004. V.9(10). P.953-961.

137. Adessi C, Soto C. Converting a peptide into a drug: strategies to improve stability and bioavailability.// Curr. Med. Chem. 2002. V.9(9). P.963-978.

138. Estrada L.D., Soto C. Disrupting beta-amyloid aggregation for Alzheimer disease treatment.// Curr. Top. Med. Chem. 2007. V.7(l). P.l 15-126.

139. Cummings J.L., Vinters H.V., Cole G.M., Khachaturian Z.S. Alzheimer's disease: etiologies, pathophysiology, cognitive reserve, and treatment opportunities.// Neurology. 1998. V.51(l). S2-17; discussion S65-7.

140. Grundman M. Current therapeutic advances in Alzheimer's disease.// Research and practice in Alzheimer's disease. 2001. V.5. P.172-177.

141. Jacobsen J.S., Reinhart P., Pangalos M.N. Current Concepts in Therapeutic Strategies Targeting Cognitive Decline and Disease Modification in Alzheimer's Disease.// NeuroRx. 2005. V.2. P.612-626.

142. Imbimbo BP. Therapeutic potential of gamma-secretase inhibitors and modulators.// Curr. Top. Med. Chem. 2008. V.8(l). P.54-61.

143. Shenk D., Barbour R., Dunn W. Immunization with amyloid-P attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse.//Nature. 1999. V.400(6740). P. 173-177.

144. Shenk D. Amyloid-P immunotherapy for Alzheimer's disease: the end of the beginning.//Nat. Rev. Neurosci. 2002. V.3(10). P.824-828.

145. Senior K. Dosing in Phasell trial of Alzheimer's vaccine suspended.// Lancet. Neurol. 2002. V.l(l). P.3.

146. Nicoll J.A., Wilkinson D., Holmes C., Steart P., Markham H., Weller R.O. Neuropathology of human Alzheimer's disease after immunization with amyloid-P peptide: a case report.//Nat. Med. 2003. V.9(4). P.448-452.

147. McLaurin J., Cecal R., Kierstead M.E., Tian X., Phinney A.L., Manea M., French J.E., Lambermon M.H., Darabie A.A., Brown M.E., Janus C., Chishti M.A., Home P., Westaway D., Fraser P.E., Mount H.T., Przybylski M., St George-Hyslop P.

148. Therapeutically effective antibodies against amyloid-ß peptide target amyloid-ßresidues 4-10 and inhibit citotoxicity and fibrillogenesis.// Nat. Med. 2002. V.8(ll). P.1263-1269.

149. Wang C.Y., Finstad C.L., Walfield A.M., Sia C., Sokoll K.K., Chang T.Y., et al. Site-specific UBITh amyloid-beta vaccine for immunotherapy of Alzheimer's disease.// Vaccine. 2007. V.25. P.3041-3052.

150. Solomon B., Koppel R., Hanan E., Katzav T. Monoclonal antibodies inhibit in vitro fibrillar aggregation of the Alzheimer ß-amyloid peptide.// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996. V.93(l). P.452-455.

151. Solomon B., Koppel R., Frankel D., Hanan-Aharon E. Disaggregation of Alzheimer ß-amyloid by site-directed mAb.// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. V.94(8). P.4109-4112.

152. Billings L.M., Oddo S., Green K.N., McGaugh J.L., LaFerla F.M. Intraneuronal A0 causes the onset of early Alzheimer's disease-related cognitive deficits in transgenic mice.// Neuron. 2005. V.45(5). P.675-688.

153. Gardberg A.S., Dice L.T., Ou S., Rich R.L., Helmbrecht E., Ko J., Wetzel R., Myszka D.G., Patterson P.H., Dealwis C. Molecular basis for passive immunotherapy of Alzheimer's disease.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104(40). P. 15659-15664.

154. Panza F., Frisardi V., Imbimbo B.P., D'Onofrio G., Pietrarossa G„ Seripa D., Pilotto A., Solfrizzi V. Bapineuzumab: anti-p-amyloid monoclonal antibodies for the treatment of Alzheimer's disease.// Immunotherapy. 2010. V.2(6). P.767-782.

155. Mattson M.P., Cheng B., Davis D., Bryant K., Lieberburg I., Rydel R.E. beta-Amyloid peptides destabilize calcium homeostasis and render human cortical neurons vulnerable to excitotoxicity.// J. Neurosci. 1992. V.12(2). P.376-389.

156. Orgogozo J.M., Rigaud A.S., Stoffler A., Mobius H.J., Forette F. Efficacy and safety of memantine in patients with mild to moderate vascular dementia.// A randomized, placebo-controlled trial (MMM 300). Stroke. 2002. V.33. P. 1834-1839.

157. Reitz A.B., Demeter D.A., Lee D.H.S., Wang H.-Y., Chen R.H., Ross T. M., Scott M.K., Plata-Salaman C.R., Carlos R. Method of treating neurodegenerative disoders via inhibition of amyloid beta peptide binding.// 2002. US Patent N 6441049.

158. Reitz A.B., Demeter D.A., Lee D.H.S., Wang H.-Y., Chen R.H., Ross T. M., Scott M.K., Plata-Salaman C.R., Carlos R. Method for treating neurodegenerative disoders. // 2006. US Patent N 7018797.

159. Manning R.W., Reid C.M., Lampe R.A., Davis L.G. Identification in rodents and other species of a mRNA homolodous to the human beta-amyloid precursor.// Mol. Brain Res. 1988. V.3. P.293-298.

160. Hsiao K., Chapman P., Nilsen S., Eckman C., Harigaya Y., Younkin S., Yang F., Cole G. Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice.// Science. 1996. V.274. P.99-102.

161. Brunkan A.L., Goate A.M. Presenilin function and gamma-secretase activity.// J Neurochem. 2005. V.93. p.769-792.

162. Shen J., Bronson R.T., Chen D.F., Xia W., Selkoe D.J., Tonegawa S. Skeletal and CNS defects in Presenilin-1-deficient mice.// Cell. 1997. V.89. P.629-639.

163. Spires T.L., Hyman B.T. Transgenic models of Alzheimer's disease: Learning from animals.//NeuroRx. 2005. V.2. P.423-437.

164. Irizarry M.C., McNamara M., Fedorchak K., Hsiao K., Hyman B.T. APPSw transgenic mice develop age-related A beta deposits and neuropil abnormalities, but no neuronal loss in CAI.// J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1997. V.56(9). P.965-973.

165. Martin B., Brenneman R., Becker K.G., Gucek M., Cole R.N., Maudsley S. iTRAQ analysis of complex proteome alterations in 3xTgAD Alzheimer's mice:understanding the interface between physiology and disease.// PLoS One. 2008. V.3(7). P.2750.

166. Han M., Liu Y., Tan Q., Zhang B., Wang W., Liu J., Zhang X.J., Wang Y.Y., Zhang J.M. Therapeutic efficacy of stemazole in a beta-amyloid injection rat model of Alzheimer's disease.// Eur. J. Pharmacol. 2011. V.657(l-3). P.104-110.

167. Kovacs T., Cairns N.J., Lantos P.L. beta-amyloid deposition and neurofibrillary tangle formation in the olfactory bulb in ageing and Alzheimer's disease.// Neuropathol. Appl. Neurobiol. 1999. V.25(6). P.481-491.

168. Van Hoesen G.W., Parvizi J., Chu C.C. Orbitofrontal cortex pathology in Alzheimer's disease.// Cereb. Cortex. 2000. V.10(3). P.243-251.

169. Attems J., Lintner F., Jellinger K.A. Olfactory involvement in aging and Alzheimer's disease: an autopsy study.// J. Alzheimers Dis. 2005. V.7(2). P.149-157.

170. Ferreyra-Moyano H., Barragan E. The olfactory system and Alzheimer's disease.// Int J Neurosci. 1989. V.49(3-4). P.157-197.

171. Pearson R.C., Esiri M.M., Hiorns R.W., Wilcock G.K., Powell T.P. Anatomical correlates of the distribution of the pathological changes in the neocortex in Alzheimer disease.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V.82(13). P.4531-4534.

172. Brunjes P.C., Frazier L.L. Maturation and plasticity in the olfactory system of vertebrates.// Brain Res. 1986. V.396(l). P.l-45.

173. Christen-Zaech S., Kraftsik R., Pillevuit O., Kiraly M., Martins R., Khalili K., Miklossy J. Early olfactory involvement in Alzheimer's disease.// Can. J. Neurol. Sci. 2003. V.30(l). P.20-25.

174. Loopuijt L.D., Sebens J.B. Loss of dopamine receptors in the olfactory bulb of patients with Alzheimer's disease.// Brain Res. 1990. V.529(l-2). P.239-244.

175. Leonard B.E., Tuite M. Anatomical, physiological, and behavioral aspects of olfactory bulbectomy in the rat.// Int. Rev. Neurobiol. 1981. V.22. P.251-286.

176. Song C., Leonard B.E. The olfactory bulbectomised rat as a model of depression.// Neurosci. Biobehav. Rev. 2005. V.29(4-5). P.627-647.

177. Yamamoto T., Jin J., Watanabe S. Characteristics of memory dysfunction in olfactory bulbectomized rats and the effects of cholinergic drugs.// Behav. Brain Res. 1997. V.83. P.57-62.

178. Nesterova I.V., Gurevich E.V., Nesterov V.I., Otmakhova N.A., Bobkova N.V. Bulbectomy-induced loss of raphe neurons is counteracted by antidepressant treatment.// Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 1997. V.21. P.127-140.

179. Бобкова H.B., Нестерова И.В., Нестеров B.B. Состояние холинергических структур переднего мозга у бульбэктомированных мышей.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Т.131. С.427-431.

180. Struble R.G., Dhanraj D.N., Mei Y., Wilson M., Wang R., Ramkumar V. Beta-amyloid precursor protein-like immunoreactivity is upregulated during olfactory nerve regeneration in adult rats.// Brain Res. 1998. V.780. Р.129-137ю

181. Александрова И.Ю., Кувичкин B.B., Кашпаров И.А., Медвиская Н.И., Нестерова И.В., Лунин С.М., Самохин А.Н., Бобкова Н.В. Повышенный уровень р-амилоида в мозге у бульбэктомированных мышей.// Биохимия. 2004. Т.69 (2). С. 176-180.

182. Bobkova N., Vorobyov V., Medvinskaya N., Aleksandrova I., Nesterova I. Interhemispheric EEG differences in olfactory bulbectomized rats with different cognitive abilities and brain beta-amyloid levels.// Brain Res. 2008. V.1232. P. 185194.

183. Новоселова Е.Г., Бобкова H.B., Глушкова O.B., Синотова О.А., Огай В.Б., Медвинская Н.И., Самохин А.Н. Иммунодипрессивное состояние мышей после бульбэктомии.// Известия Академии наук. Серия биологическая. 2004. Т.6. С.732-739.

184. Schaeffer V., Meyer L., Patte-Mensah C., Eckert A., Mensah-Nyagan A. Dose-dependent and sequence-sensitive effects of amyloid-b peptide on neurosteroidogenesis in human neuroblastoma cells.// Neurochem. Int. 2008. V.52. P.948-955.

185. Brejc K., van Dijk W.J., Klaassen R.V., Schuurmans M., van Der Oost J., Smit A.B., Sixma Т.К. Crystal structure of an ACh-binding protein reveals the ligand-binding domain of nicotinic receptors.// Nature. 2001. V.411(6835). P.269-276.

186. Novere N., Grutter Т., Changeux J.P. Models of the extracellular domain of the nicotinic receptors and of agonist- and Ca2+-binding sites. // Proc. Natl. Acad. Sci. 2002. V.99(5). P.3210-3215.

187. Criado М., Hochschwender S., Sarin V., Fox J.L., Lindstrom J. Evidence for unpredicted transmembrane domains in acetylcholine receptor subunits.// Proc. Natl. Acad. Sci. 1985. V. 82(7). P.2004-2008.

188. Chui D.H., Dobo E., Makifuchi Т., Akiyama H., Kawakatsu S., Petit A., Checler F., Araki W., Takahashi K., Tabira T. Apoptotic neurons in Alzheimer's disease frequently show intracellular Abeta42 labeling. J. Alzheimer's Dis. 2001. V.3(2). P.231-239.

189. Purcell A., Zeng W., Mifsud N., Ely L., Macdonald W., Jackson D. Dissecting the role of peptides in the immune response: theory, practice and the application to vaccine design. //J. Pept. Sci. 2003. V.9. P.255-281.

190. О. M. Волышна, M. А. Титова, M. H. Жмак, Д. О. Короев, М. Б. Обозная, Т. Д. Волкова, В. Т. Иванов. Предсказание структуры пептидов, способных индуцировать образование антител у мышей.// Биоорганическая химия. 2002. Т.28(5). С.387-395.

191. Oboznaya MB, Gilch S, Titova MA, Koroev DO, Volkova TD, Volpina OM, Schatzl HM. Antibodies to a nonconjugated prion protein peptide 95-123 interfere with PrP( Sc ) propagation in prion-infected cells.// Cell. Mol. Neurobiol. 2007 V.27(3). P.271-284.

192. Ionov M., Burchell V., Klajnert В., Bryszewska M., Abramov A.Y. Mechanism of neuroprotection of melatonin against beta-amyloid neurotoxicity.// Neuroscience. 2011. V. 180. P.229-237.

193. Fucile S., Renzi M., Lax P., Eusebi F. Fractional Ca(2+) current through human neuronal alpha7 nicotinic acetylcholine receptors.// Cell Calcium. 2003. V.34(2). P.205-209.

194. Ferreiro C.R. Oliveira and C. Pereira, Involvement of endoplasmic reticulum Ca2+ release through ryanodine and inositol 1,4,5-triphosphate receptors in the neurotoxic effects induced by the amyloid-b peptide.// J. Neurosci. Res. 2004. V.76. P.872-880.

195. Ferreiro E., Resende R., Costa R., Oliveira C.R., Pereira C.M. An endoplasmic-reticulum-specific apoptotic pathway is involved in prion and amyloid-beta peptides neurotoxicity.//Neurobiol Dis. 2006. V.23. P.669-678.

196. Ferreiro E., Oliveira C.R., Pereira C.M. The release of calcium from the endoplasmic reticulum induced by amyloid-beta and prion peptides activates the mitochondrial apoptotic pathway.//Neurobiol Dis. 2008. V.30(3). P.331-342.

197. Race В., Meade-White K., Race R., Baumann F., Aguzzi A., Chesebro B. Prion protein on astrocytes or in extracellular fluid impedes neurodegeneration induced by truncated prion protein.// Exp. Neurol. 2009. V.217(2). P.347-352.

198. Yu W.F., Guan Z.Z., Bogdanovic N., Nordberg A. High selective expression of alpha7 nicotinic receptors on astrocytes in the brains of patients with sporadic137

199. Alzheimer's disease and patients carrying Swedish APP 670/671 mutation: a possible association with neuritic plaques.// Exp. Neurol. 2005 V.192(1). P.215-225.

200. Demuro A., Smith M., Parker I. Single-channel Ca(2+) imaging implicates Api-42 amyloid pores in Alzheimer's disease pathology.// J. Cell Biol. 2011. V. 195(3). P.515-524.

201. Abramov A.Y., Canevari L., Duchen M.R. Calcium signals induced by amyloid beta peptide and their consequences in neurons and astrocytes in culture.// Biochim. Biophys. Acta. 2004 V.1742(l-3). P.81-87.

202. Abramov A.Y., Duchen M.R. The role of an astrocytic NADPH oxidase in the neurotoxicity of amyloid beta peptides.// Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2005 V.360(1464). P.2309-2314.

203. DeCoursey Т.Е., Cherny V.V., Zhou W., Thomas L.L. Simultaneous activation of NADPH oxidase-related proton and electron currents in human neutrophils.// PNAS. 2000. V.97(12). P. 6885-6889.

204. Namura S., Zhu J., Fink K., Endres M., Srinivasan A., Tomaselli K.J., Yuan J., Moskowitz M.A. Activation and cleavage of caspase-3 in apoptosis induced by experimental cerebral ischemia.//J. Neurosci. 1998. V.18(10). P.3659-3668.

Информация о работе

Камынина, Анна Владимировна
кандидата биологических наук
Пущино, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Иммунотерапевтическая активность фрагментов альфа7-субъединицы ацетилхолинового рецептора и прионного белка в экспериментальных моделях болезни Альцгеймера - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы