Антитела против синтетических пептидных фрагментов прионного белка для выявления клеточного приона и его патогенной изоформы

Обозная, Мария Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Антитела против синтетических пептидных фрагментов прионного белка для выявления клеточного приона и его патогенной изоформы
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Антитела против синтетических пептидных фрагментов прионного белка для выявления клеточного приона и его патогенной изоформы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им академиков ММ ШЕМЯКИНАиЮА ОВЧИННИКОВА

на правах рукописи

Обозная Мария Борисовна

АНТИТЕЛА ПРОТИВ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ ПРИОННОГО БЕЛКА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО ПРИОНА И ЕГО ПАТОГЕННОЙ ИЗОФОРМЫ

03 00 03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

москол -

Работа выполнена в Институте биоорганической химии

им академиков ММ Шемякина иЮ А Овчинникова Российской Академии Наук

Научный руководитель, доктор химических наук О М Вольпина

Официальные оппоненты доктор химических наук А Г. Габибов

доктор биологических наук Е Ф Колесанова

Ведущая организация Институт молекулярной биологии

имени В А Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится « 3 » (Х^уреууД 2008 г в'ОЭч на заседании специализированного совета Д 002 019 01 при Институте биоорганической химии им академиков ММ Шемякина и ЮА Овчинникова РАН по адресу. 117997, ГСП-7, г. Москва, ул Миклухо-Маклая, д 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инстшута биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Автореферат разослан марта 2008 г

Ученый секретарь специализированного совета, д физ.-мат н ^

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Трансмиссивные губкообразные энцефалопатии, или прионные болезни - это неизлечимые нейродегенеративные заболевания, поражающие человека и некоторые другие виды млекопитающих Одним из таких заболеваний является губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, эпидемия которой нанесла огромный ущерб сельскому хозяйству Великобритании и ряда других европейских стран Попадание в организм человека продуктов питания либо лекарственных препаратов, полученных из тканей больных животных, может вызвать прионное заболевание - новый вариант болезни Крейтцфельдга-Якоба

Инфекционный агент прионных болезней представляет собой патогенную изоформу нормального прионного белка - РтР Нормальная (РгРс) и патогенная (РгР5с) изоформы идентичны по своей аминокислотной последовательности, но различаются по конформации белковой цепи Механизм патогенеза объясняют превращением нормального белка в патогенный, которое происходит при их непосредственном контакте, с последующим накоплением агрегатов измененного белка в головном мозге и массовой гибелью нейронов Патогенная изоформа белка отличается склонностью к агрегации и устойчивостью к протеолизу Современная диагностика прионных болезней основана на детекции с помощью антител остающегося в образцах мозга РгР8с после обработки протеиназой Кроме того, антитела применяют для детального изучения механизмов патогенеза и разработки подходов к иммунотерапии Таким образом, получение антител к прионному белку - это актуальная задача современной науки Необходимо подчеркнуть, что в России не существует отечественного иммунохимического диагностического теста для выявления губкообразной энцефалопатии

Проблема получения антител к прионному белку связана с его низкой иммуногенностью, поскольку белки разных видов млекопитающих гомологичны более чем на 90% В связи с этим получение антител затруднено из-за существования толерантности к прионному белку как к эндогенному антигену Иммунизация белком приводит к образованию антител, направленных только к небольшому числу эпитопов, несущих межвидовые аминокислотные замены Альтернативным способом получения антител в таком случае служит иммунизация синтетическими пептидными фрагментами прионного белка, конъюгированными с белком-носителем

В настоящем исследовании для получения антител к прионному белку мы предлагаем использовать неконъюгированные с белком-носителем синтетические фрагменты белка Такой подход позволит направленно получить антитела к выбранным структурно и функционально важным участкам белковой цепи Кроме того, этот метод позволит избежать

нежелательных иммунных реакций, возникающих при традиционной иммунизации пептидно-белковыми конъюгатами

Цели и задачи работы Цель диссертационной работы состояла в получении с помощью синтетических пептидов и рекомбинантюго белка поликлональных и моноклональных антител, направленных к определенным структурно-функциональным районам прионного белка, способных выявлять изоформы прионного белка, а также обладающих потенциальным иммунотерапевтическим действием

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи

1 Выбор потенциально иммуноактивных пептидов, соответствующих определенным структурно-функциональным районам прионного белка, а также их аналогов, включающих аминокислотные замены, приводящие к формированию потенциальных Т-эпигопов

2 Получение антител к синтетическим пептидам, соответствующим выбранным фрагментами кроликов и у мышей

3 Изучение способности полученных антител связываться с прионным белком методами иммуноферментного анализа, иммуноблоттинга и иммуногистохимии

4 Выявление пептидных фрагментов прионного белка, антитела к которым пригодны для разработки методов диагностики прионных болезней и их иммунотерапии

5 Получение моноклональных антител к прионному белку и их характеристика Научная новизна и практическая значимость работы В представленной работе с

использованием теоретических методов анализа и данных литературы выбраны семь ранее не описанных пептидных фрагментов прионного белка, соответствующих его функционально значимым участкам Также с помощью аминокислотных замен осуществлено моделирование активности выбранных пептидов Показано, что большинство пептидов в свободном виде, без конъюгации с белком-носителем, вызывают образование противопептидных антител у кроликов и у мышей трех линий Выявлены участки прионного белка, антитела к которым связываются с РгР3° и/или РгРс в иммуноферментном анализе, на иммуноблоте и пригодны для разработки диагностикума прионных заболеваний на основе иммуногистохимического теста и иммуноблоттинга Впервые показано, что кроличьи антитела к пептиду 106-134 препятствуют накоплению патогенного приона в культуре клеток, что указывает на возможность использования этого пептида для разработки средств терапии прионных болезней Получены и охарактеризованы моноклональные антитела к прионному белку, пригодные для диагностики прионных болезней иммуногистохимическим методом

Апробация работы и публикации. Результаты настоящей работы были представлены на XIV, XVIII и XX Международной зимней научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2002, 2006, 2008),

27-м Европейском пептидном симпозиуме (Сорренто, 2002), 10-м Германо-российском пептидном симпозиуме (Фридрихрода, 2003), 1-ой Международной конференции европейской общества "НейроПрион" (Париж, 2004)

Материалы диссертационной работы изложены в 10 публикациях, в числе которых 3 статьи в реферируемых научных журналах

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 116 страницах и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 154 ссылки

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 1 Выбор пептидов в последовательности прионного белка

Для получения антител выбирали потенциально иммуноактивные участки прионного белка КРС (Рис 1), входящие в структурно и функционально значимые районы белковой последовательности В результате анализа данных литературы выбрали семь пептидов (25-36)-(62-69), (17-36)-(62-69), 106-134, 172-202, 186-202, 214-240 и 224-240 (Табл 1), содержащих участки, играющие важную роль в патогенезе прионных болезней Необходимо пояснить, что пептиды (25-36)-(62-69) и (17-36)-(62-69) включают в себя два участка белковой цепи, объединенные в один пептид Участки 25-36 и 17-36 находятся в N-концевом районе белка, а участок 62-69 соответствует одному из уникальных восьмичлснных аминокислотных повторов, содержащихся в последовательности белка Участок 106-134 предположительно претерпевает важные конформаиионные изменения при превращении РгРс в PrPSc, а участки 172-202 и 214-240 имеют а-спиральную конформацию, сохраняющуюся при образовании патогенной изоформы

В соответствии с описанным методом предсказания Т-хелперных эпитопов -участков, ответственных за индукцию антител [Вольпина с соавт, 2002], в ряду выбранных пептидов только фрагмент (17-36)-(62-69) исходно содержит теоретически рассчитанные

10 20 30 40 50 60

MVKSHIGSWI. L^LgVAMWSD VGLCKKRPKP GGGWNTGGSR YPGQGSPGGN RYPPQGGGGW 70 80 90 100 110 120

GQPHGGGWGQ PHGGGWGQPH GGGWGQPHGG GWGQPHGGGG WGQGGTHGQW NKPSKPKTNM 130 140 150 160 170 180

KHVAGAAAAG AWGGLGGYM LGSAMSRPLI HFGSDYEDRY YRENMHRYPN QVYYRPVDQY 190 200 210 220 230 240

SNONNFVHDC VNITVKEHTV TTTTKGENFT ETDIKMMERV VEQMCITOYO RESOAYYORG

250 260

ASVIbFS-SPF VlbLISFLIF.LIVG

Рисунок 1. Аминокислотная последовательность предшественника прионного белка КРС (Swiss-Prot accession number PI0279) Серым цветом отмечены последовательности, удаляемые во время процессинга Подчеркнуты выбранные для синтеза участки белка

Таблица 1 Аминокислотная последовательность синтетических пептидов прионного белка КРС и их аналогов В последовательности пептидов выделены жирным шрифтом и курсивом аминокислотные замены, и подчеркнуты теоретически рассчитанные Т-хелперные эпитопы

Пептид Замены ал Аминокислотная последовательность

(25-36)-(62-69) - ЮЖРКРОСЗОШТ (QPHGGGWG)

(17-36)-(62-69) - MWSDVGLCKKRPKPGGGWNT (ОРШввЮС)

106-134 101-134(Ц 106-134(У) 106-134(УУ) О104Ь С>,09у н'07у, С,08У ТНСОДОНКРЗКРКТЫМКН\/А&ААААСА\ЛЛЗ Юв0ЬСТН60ВДКРЗКРКТШКтГАвААААвА\Л7в THGVWNKPSKPKTШKHVAGAAAAGAWG Т7У0ШКРЗКРКТШКНУАОААААСА\АЛЗ

186-202 - ЕТ/НПСТШТУКЕНТУТТ

172-202 172-202(К) к,82к УУЖРУООУБЫОШРУШС^ЛЛТУКЕНТтаТ УУУЕРТО0УЗТОШЕУНОСТЫ1ТТСЕШЛ/ТТ

224-240 - МС1Т0У0ЯЕ30АУУ0Кв

214-240 209-240(№) 209-240(ТмТУИ) Т210Ы,Е2ПР Т21ЧЕ211Р, Т212У, Б213К IКММЕБЯ/УЕОМСI ТОУОИЕЗ ОАУУОЯО ИИТОIКММЕИУУЕОМС1ТОУ(2КЕЗ ОАУУОЯО Р№УЯ1КШЕЯУУЕОМС1ТОУ<2ЯЕЗОАУУОНа

Т-эпитопы Выбранными пептидами планировали иммунизировать как кролике«, так и мышей трех линий Мыши имеют менее широкий, чем кролики, репертуар молекул главного комплекса гистосовместимости, и вероятность получения мышиных антител н^ тот или иной антиген является более низкой Поэтому с целью изучения возможностей усиления иммунного ответа на фрагменты прионного белка были получены аналоги выбранных пептидов, содержащие аминокислотные замены Замены были произведены на основании данных литературы [Бати'Агщек) е1 а1, 2002] и в соответствии с описанным алгоритмом [Вольпина с соавт, 2002], чтобы сформировать в последовательности пептидов потенциальные Т-хелперные эпитопы В результате, были получены шесть аналогов фрагментов прионного белка Ю1-134(О104Ц, Ю6-134((3109У), Ю6-134(Н107У, О108У), 172-202(1Ч182К), 209-240(Т210Ы; Е211Р), 209-240(Т21ОК, Е2ПГ, Т212У, Э213К) (Табл 1) Синтез выбранных пептидов и их аналогов был осуществлен в Лаборатории синтетических вакцин ИБХРАН

2 Получение и характеристика антител к синтетическим фрагментам прионного белка

у кроликов

Изучение иммуногенной активности свободных синтетических пептидов и их конъюгатов с белком-носителем Кроликов традиционно используют для получения больших количеств антител для исследовательских и диагностических целей Для иммунизации

кроликов использовали семь неконъюгированных с белком-носителем фрагментов прионного белка (25-36)-(62-69), (17-36>(62-69), 106-134,172-202,186-202,214-240,224-240 (см табл 1) Для сравнения иммуногенной активное™, кроликов также иммунизировали конъюгатами этих пептидов с КЬН Иммунизацию проводили четырехкратно Исследование полученных сывороток кроликов в ИФА на связывание с соответствующими пептидами показало, что все неконъюгированные фрагменты индуцировали у кроликов образование антител с высокими титрами (от 1 64000 до 1 640000) (Табл 2) Сравнительный анализ результатов показал, что свободные, неконъюгированные пептиды во всех случаях, за исключением пептидов 186-202 и 214-240, индуцируют у кроликов образование более высокого уровня антител, чем К1Л-конъюгаты

Таблица 2 Титр противопептидных антител в ИФА сывороток кроликов после иммунизации свободными синтетическими пептидами прионного белка и их КЬН-конъюгатами

Иммуноген Сыворотка Титр Ат

(25-36Н62-69) 25-М 1 64000

25-К2 1 64000

(25-36)-(62-69)-КЬН 25-Ик1 1 16000

25-Юс2 1 4000

(17-36>(62-69) 17-Ю 1 64000

17-112 1 128000

(17-36)-(62-69)-КЬН 17-Кк1 1 16000

17-Кк2 1 32000 1 128000

106-134 106-И

106-К2 1 128000

(106-134)-КЬН 186-202 106-Кк 186-Ы 1 64000 1 128000

186-К2 1 128000

(186-202)-КЬН 172-202 186-Кк1 1 320000

186-Кк2 172-Я 1 640000

1 640000

(172-202)-КЬН 224-240 172-Ис1 1 40000

172-1Ус2 224-Ю 1 160000 1 640000

224-02 1 640000

(224-240)-КЬН 224-Ик1 1 16000

224-Кк2 1 4000

214-240 214-Ш 1 128000

214-К2 1 256000

(214-240)-КЬН 214-Кк1 1 400000

214-Кк2 1 100

Таким образом, несмотря на большую гомологию последовательностей пригонных белков, в результате иммунизации кроликов свободными пептидами были получены сыворотки с высоким уровнем противопептидных антител, которые использовали для дальнейших исследований.

Изучение связывания противопептидных антител кроликов с рекомбинантным прионным белком. Для изучения связывания с прионным белком кроличьих противопептидных антител, полученных после иммунизации свободными пептидами, использовали рекомбинантные прионные белки КРС (гВоРгР) и мыши (гМоРгР). Для получения гВоРгР использовали плазмидный вектор pTrcHisRind(25-241), созданный на основе вектора pTrcHis и содержащий ДНК-конструкт, кодирующий последовательность прионного белка без N- и С-концевых сигнальных пептидов. Рекомбинантный прионный белок КРС, состоящий из аминокислотных остатков 25-241 и N-концевой последовательности His6, зкспрессировали в клетках Е. coli. Из лизата трансформированных бактерий рекомбинантный белок выделяли на колонке с №2+-агарозой. По данным электрофоретического анализа был получен высокоочищенный белок с молекулярной массой около 28 кДа (Рис. 2). Аналогично полученный рекомбинантный прионный белок мыши и плазмидный вектор pTrcHisRmd(25-241) были любезно предоставлены профессором Н.М. Schatzl, Мюнхен, Германия.

Рисунок 2. Электрофореграмма (10%-ный SDS-PAAG). (1) -белковые маркеры молекулярного веса, (2) - рекомбинантный прионный белок КРС.

Противопептвдные сыворотки кроликов исследовали на связывание с белками гВоРгР и гМоРгР методами ИФА и иммуноблоттинга. В качестве положительного контроля при проведении иммуноблоттинга было использовано мкА 4Н11, специфичное к прионному белку [Ertmer et al., 2004]. По результатам ИФА было выявлено шесть сывороток, антитела из которых связываются как с белком КРС, так и с белком мыши: 106-R1, 106-R2, 186-R1, 224-R1, 224-R2 и 214-R2 (Табл. 3). Титр антител к белку был высоким (1:2000-1:64000), но все-таки в несколько раз ниже, чем титр противопептидных антител. На иммуноблоте с гВоРгР и гМоРгР связывались антитела из сывороток 106-R1, 106-R2, 172-R, 224-R1, 224-R2 и 214-R2, (Рис. 3, Табл. 3). Результаты связывания с рекомбинантными белками, полученные двумя методами, коррелируют между собой, за исключением сывороток 186-R1 и 172-R. Сыворотка 186-R1 связывалась с белком только в ИФА, а сыворотка 172-R, наоборот, только на иммуноблоте. Необходимо отметить, что

кДа 130 95 72 55

43 34

-28кДа

Таблица 3. Связывание противопептидных антител из сывороток кроликов с рекомбинантными белками гВоРгР и гМоРгР в ИФА и на иммуноблоте.

Иммуноген Сыворотка Титр Ат в ИФА Связывание Ат на иммуноблоте2

гВоРгР гМоРгР гВоРгР гМоРгР

(25-36)-(62-69) 25-Ю <1:100 <1:100 (-) (-)

25-Я2 <1:100 <1:100 (-) (-)

(17-36)-(62-69) 17-Я1 <1:100 <1:100 (-) (-)

17-Я2 <1:100 <1:100 (-) (-)

106-134 106-Ю 1:16000 1:16000 (+++) (++)

106-1*2 1:32000 1:64000 (+++) (++)

186-202 186-Ю 1:4000 1:4000 (-) (-)

186-1*2 <1:100 <1:100 (-) (-)

172-202 172-Я <1:100 <1:100 (++) (+)

172-Я1 1:25600 н.о.

224-240 224-Я 1 1:3200 1:2000 (++) (+)

224-Я2 1:12800 1:4000 (+++) (++)

214-240 214-Я1 <1:100 <1:100 (-) (-)

214-Я2 1:4000 1:16000 (++) (++)

1 Связывание с денатурированным гВоРгР;

1 См. рис. 3. По сравнению со связыванием контрольных мкА 4Н11 связывание антител из сывороток кроликов: (+) - слабее; (++) - сравнимо; (+++) - сильнее. (-) - нет связывания.

Рисунок 3. Связывание противопептидных антител из сывороток кроликов с рекомбинантными белками гВоРгР (А) и гМоРгР (Б) на иммуноблоте: сыворотка 106-Я1 (1), 106-1*2 (2), 172-Я (3), 224-Я1 (4), 224-Я2 (5), 214-ВС! (6), и положительный контроль мкА 4Н11 (7). Позиции маркеров молекулярного веса указаны слева.

4 5

иммуноблоттинг проводили в денатурирующих условиях, а при проведении ИФА белок не денатурировали. Сохранение вторичной структуры белка в ИФА может препятствовать связыванию с антителами из сыворотки 172-11, если они направлены к линейному эпитопу. И, наоборот, антитела из сыворотки 186-Я1, если они направлены к конформационному эпитопу, не будут связываться с денатурированным белком на иммуноблоте. Наши предположения были подтверждены результатами ИФА, в котором на планшет наносили денатурированный гВоРгР. При этом ранее не активная в ИФА сыворотка 172-11 проявила связывание с белком с титром 1:25600 (Табл. 3).

Ни в ИФА, ни на иммуноблоте с прионным белком не связываются только противопептидные антитела к N-концевым пептидам (25-36)-(62-69) и (17-36)-(62-69). Возможно, распознаванию мешает наличие на N-конце рекомбинантного белка последовательности His6.

Таким образом, иммунизация кроликов большинством пептидов, а именно 106-134, 186-202, 172-202, 224-240 и 214-240, вызывает образование антител, связывающихся с рекомбинантным прионным белком.

Изучение связывания противопептидных антител кроликов с PrPSc и РгРс изоформами прионного белка, выделенными из клеток. На следующем этапе следовало выяснить, способны ли сыворотки, связывающиеся с рекомбинантным прионным белком, так же эффективно связываться на иммуноблоте с PrPSc и РгРс, выделенными из клеток нейробластомы мыши. В эксперименте использовали клетки N2a (нормальные) и ScN2a (зараженные PrPSc). Хотя сыворотки были получены к фрагментам прионного белка КРС, выбор для данного исследования клеток, экспрессирующих прионный белок мыши, представляется адекватным. Описанные выше эксперименты показали, что противопептидные кроличьи антитела примерно с одинаковой эффективностью выявляют как белок КРС, так и белок мыши (см. табл. 3).

Шесть сывороток, ранее проявивших связывание с рекомбинантным белком на иммуноблоте: 106-R1, 106-R2, 172-R, 224-R1, 224-R2 и 214-R2, были изучены методом иммуноблоттинга на связывание с PrPSc. Для выделения PrPSc клетки ScN2a лизировали и обрабатывали лизат протеиназой К. Обработка протеиназой традиционно используется для удаления РгРс при выделении патогенного приона, который, благодаря своей вторичной структуре, умеренно устойчив к протеолизу. В неденатурирующих условиях расщепляется только N-концевой участок PrPSc вплоть до 101 аминокислотного остатка, и образующийся укороченный белок обозначают в литературе как РгР27'30. Было выявлено, что две сыворотки эффективно связываются с патогенным прионным белком из клеточных лизатов (Рис. 4) -

106-R1 и 106-R2. Эти сыворотки выявляют все три формы прионного белка: ди-, moho-, и негликозилированную. (Рис. 4, дорожки 1 и 2).

кДа

1 ^И <. % f¡§§

ш щЁ ■

И 'IS; - 1

|НМ ■ ■

.....'ЩЬ

30-_______

Рисунок 4. Связывание противопептидных антител из сывороток кроликов с выделенным из клеток PrPSc на иммуноблоте: сыворотка 106-R1 (1), 106-R2 (2), 172-R (3), 224-R1 (4), 224-R2 (5), 214-R2 21—RTI (6), и положительный контроль мкА 4Н11 (7). Слева

указаны позиции маркеров молекулярного веса. Справа обозначено местоположение полос, 1 2 3 4 5 6 7 соответствующих ди-, moho-, и негликозилированным

формам прионного белка (a, b и с, соответственно).

Можно отметить, что сыворотка 224-К2 тоже проявила связывание, но гораздо менее эффективное, чем контрольные мкА и положительные сыворотки (дорожка 5).

Те же шесть сывороток: 106-К1, 106-1*2, 172-Я, 224-Я1, 224-1*2 и 214-1*2, были изучены методом иммуноблоттинга на связывание с РгРс. Для этого использовали лизат клеток Ы2а. Количество РтРс в клетках значительно меньше, чем количество РгР3с, который, в отличие от нормального белка, плохо катаболизируется. Чтобы увеличить содержание РгРс в образцах, была проведена иммунопреципитация прионного белка с помощью мкА 4Н11. Тестирование обогащенных РгРс фракций осуществляли методом иммуноблоттинга, где положительным контролем служила специфичная к прионному белку кроличья сыворотка А7 [Ептег е1 а!., 2004]. Три противопептидных сыворотки: 106-1*1, 106-1*2 и 224-1*2, в разной степени выявляли иммунопреципитированный РгРс, в основном его дигликозилированную форму (Рис. 5, дорожки 1, 3, 5). Наиболее активной оказалась сыворотка 106-1*1 (дорожка 1), сыворотки 106-1*2 (дорожка 3) и 224-1*2 (дорожка 5) связались с белком менее эффективно, но при этом 106-1*2 выявляла четкую полосу в районе, соответствующем моногликозилированной форме белка

Рисунок 5. Связывание противопептидных антител из сывороток кроликов с выделенным из клеток РгРс на иммуноблоте: сыворотка 106-R1 (1, 2), 106-R2 (3, 4), 224-R2 (5, 6) и положительный контроль антитела А7 (7). На дорожки 2, 4, 6 были нанесены сыворотки, предварительно инкубированные с теми пептидами, к которым были получены. Слева указаны позиции маркеров молекулярного веса. Справа обозначено местоположение полос, соответствующих ди-, moho-, и негликозилированным формам прионного белка (a, b и с, соответственно).

Для подтверждения специфичности связывания, иммунные сыворотки перед нанесением на блот инкубировали с теми пептидами, к которым они были получены. В результате на иммуноблоте пропали полосы, соответствующие дигликозилированной форме приона (дорожки 2, 4, 6), но полоса в районе моногликозилированной формы, проявляемая сывороткой 106-R2 (дорожка 4), осталась, что говорит о её неспецифичной природе.

Таким образом, из всех противопептидных антител, связывающихся с рекомбинантным прионным белком, только антитела к пептиду 106-134 проявили способность эффективно выявлять PrPSc и РтРс изоформы прионного белка, выделенные из клеток. Такое различие в связывании с рекомбинантным и нативным белками может быть результатом того, что основная часть нативного РгР находится в гликозилированной форме, что может препятствовать связыванию антител с белком. Сайты гликозилирования - Asn"2 и

20 _

Авп208, расположены как раз в последовательности фрагментов 172-202, 186-202 и в непосредственной близости от фрагмента 214-240 Видимо, поэтому антитела к данным пептидам не проявили связывания с выделенным из клеток прионным белком, и основную активность в тестах проявили только антитела к пептиду 106-134, пригодные для выявления РгР5с и РгР° методом иммуноблоттинга

Исследование способности противопептидных антител кроликов выявлять патогенный прионный белок в иммуногистохимическом тесте Противопептидные сыворотки кроликов, полученные после иммунизации свободными фрагментами прионного белка, исследовали в ИГХ на их способность специфически выявлять РгР5с на срезах мозга КРС, больного губкообразной энцефалопатией Иммуногисгохимические исследования были проведены совместно с сотрудниками Федерального центра охраны здоровья животных Россельхознадзора, г Владимир В качестве отрицательного контроля использовали срезы мозга здоровых животных В ходе эксперимента все препараты мозга обрабатывали протеиназой К Активность антител была изучена при различных разведениях сывороток, и сыворотки, антитела которых в условиях ИГХ теста проявили связывание с препаратами мозга больного КРС в разведении >1 1000, и в то же время не связывались с препаратами мозга здоровых животных в разведении <1 500, рассматривались как проявившие специфическую активность Такими оказались сыворотки 25-111, 25-1*2, 106-Ш, 106-112, 172-Я и 214-Л1, полученные к пептидам (25-36)-(62-69), 106-134, 172-202 и 214-240, соответственно На рисунке 6 в качестве примера приведены результаты ИГХ исследований, полученные с использованием сывороток 106-Ш и 214-Ш На фотографиях срезов мозга КРС, больных губкообразной энцефалопатией, отчетливо ввдны скопления РгР5с, выявленные с помощью противопептидных антител

Необходимо отметить, что антитела, полученные к пептидам (25-36)-(62-69), 172-202 и 214-240, проявляли активность в ИГХ тесте, но не связывались с выделенным прионным белком на иммуноблоте Возможно, это связано с различиями в использовавшихся образцах (мозг КРС, больного губкообразной энцефалопатией, в одном случае и клетки нейробластомы мыши, инфицированные скрепи, в другом случае), а также с неполным протеолизом М-концевого участка РгР5с, возможным в условиях проведения ИГХ теста

Таким образом, мы впервые показали, что иммунизация кроликов свободными, не конъюгированными с белком-носителем синтетическими пептидами прионного белка позволяет получить антитела, которые связываются с рекомбинангным прионным белком и/или выявляют нормальный и патогенный прионный белок в различных тестах - ИФА, иммуноблоттинге, ИГХ Выявлено, что антитела к пептидам (25-36)-(62-69), 106-134, 172-202 и 214-240 пригодны для детекции патогенного приона иммуногисгохимическим методом Показано, что антитела к пептиду 106-134 проявляют ярко выраженную активность

и способны выявлять нормальный и патогенный прионный белок всеми использованными методами.

» Х- к - ' р. 4 * е ш Б ' • .

. > - ■ • • ••!• \ ' Л • $ # в т тт • ... ° " • * * ': р -г"*-' •

Рисунок 6. ИГХ срезов мозга КРС, обработанных сыворотками 214-Я1 (А, Б) и 106-Ю (В, Г). На срезах мозга КРС, больного губкообразной энцефалопатией (А, В, разведение сывороток 1:1000) выявлены окрашенные с помощью антител скопления РгР8с (показаны стрелками), на контрольных срезах мозга здоровых животных (Б, Г, разведение сывороток 1:500) окрашивание отсутствует.

3. Препятствие накоплению патогенного приона в культуре клеток в присутствии противопептидных кроличьих антител.

Антитела к прионному белку в настоящее время рассматриваются как средство для иммунотерапии прионных болезней. Ряд исследователей показали, что добавление к культуральной среде антител к прионному белку способствует уменьшению уровня РгР& или даже его полному удалению из инфицированных клеток [Епап е! а1., 2001; ОПсИ й а1., 2003; Регаис1е1 а а1., 2005]. Исследования подобных свойств антител, полученных к свободным синтетическим фрагментам прионного белка, являющихся потенциальными иммунотерапевтическими препаратами, в литературе не описаны. В настоящей работе для исследования влияния противопептидных антител на накопление патогенного приона в культуре БсШа клеток были выбраны иммунные сыворотки 106-К1 и 106-112, которые, как было показано, связываются с выделенными из клеток РгР5с и РгРс (см. рис. 4 и 5). Сыворотки добавляли к среде, в которой культивировали зараженные клетки, в разведении 1:50. Отрицательным контролем служили соответствующие преиммунные сыворотки кроликов (Ю6-Ю.О для 106-Я1 и 106-112.0 для 106-112). В присутствии кроличьих сывороток клетки выращивали в течение 8 дней, затем добавление сывороток прекращали и культивировали клетки в течение еще 4 дней.

Было показано, что добавление сыворотки 106-111 приводит к значительному уменьшению количества РгР5с (Рис. 7). На 4-ый день обработки сывороткой 106-К1 патогенный прион вообще не обнаруживался (Рис. 7А, дорожка 2), в то время как в

Разведение! -.1 -.5 :10-.25 .50:100:200 (1)

Рисунок 7. Мониторинг изменения количества РгР 0 в клетках ScN2a, обработанных иммунной сывороткой 106-R1 (А) и контрольной преиммунной сывороткой 106-R1.0 (Б). Необработанные клетки (1) и клетки на 4-ый (2), 8-ой (3) и 12-ый (4) день эксперимента. Слева указаны позиции маркеров молекулярного веса. В середине обозначено местоположение полос, соответствующих ди-, moho-, и негликозилированным формам прионного белка (a, b и с, соответственно).

В) Сравнительный количественный анализ

содержания PrPSc на 8-ой день эксперимента в клетках ScN2a, обработанных иммунной

сывороткой 106-R1 (1) и контрольной преиммунной

сывороткой 106-R1.0 (2), осуществленный с помощью дот-блотгинга.

Г) Количество PrPSc на 8-ой день эксперимента в клетках ScN2a, обработанных иммунной

сывороткой 106-R1 (1) и контрольной преиммунной

сывороткой 106-R1.0 (2). Иммуноокрашивание проведено с помощью мкА 4Н11 к прионному белку и флуоресцентно меченых вторичных антител.

контрольных клетках его количество оставалось прежним (Рис. 7Б, дорожка 2). На 8-ой день обработки сывороткой 106^1 количество патогенного приона в клетках немного возрастало (Рис. 7А, дорожка 3), но все же было значительно уменьшено по сравнению с контрольными образцами (Рис. 7Б, дорожка 3). После отмены добавления сыворотки количество РгР8с возвращалось к контрольному уровню (Рис. 7А, дорожка 4). Обработка клеток другой иммунной сывороткой (106-Я2) не приводила к изменению количества патогенного приона.

Был проведен сравнительный количественный анализ содержания РгР5с в клетках 5сИ2а после обработки иммунной сывороткой 106^1 и контрольной преиммунной сывороткой 106^1.0. Обработанные протеиназой К лизаты клеток, полученные на 8-ой день эксперимента, разводили в 5-200 раз и оценивали количество РгР5с на дот-иммуноблоте с помощью с помощью мкА 4Н11 (Рис. 7В). В лизатах контрольных клеток РгР5с

детектировали вплоть до 100-кратного разведения, в то время как в лизатах обработанных сывороткой 106-Ш клеток - только до 5-кратного Это свидетельствует о ~20-кратном снижении количества патогенного приона в этих клетках Значительное уменьшение количества прионного бежа было также подтверждено при сравнительном анализе результатов, полученных при иммуноцитофлуоресцентном анализе количества РгР на клетках, обработанных в течение 8 дней иммунной сывороткой Юб-Ш или контрольной сывороткой Юб-Ш 0 (Рис 7Г) В случае клеток, обработанных контрольной сывороткой 106-Ш 0, наблюдалась высокая интенсивность флуоресценции, коррелирующая с содержанием прионного белка, а в случае клеток, обработанных сывороткой Юб-Ш, сигнал практически отсутствовал

Таким образом, антитела сыворотки 106-Ш, полученные к пептиду 106-134, способствуют уменьшению количества патогенного приона в культуре клеток Влияние на содержание РгР5с, наблюдающееся только при добавлении этой сыворотки, можно объяснить тем, что Юб-Ш эффективнее всех выявляла выделенный из клеток РгРс (см рис 5), что, согласно исследованиям, является определяющим для освобождения клеток от патогена [Регаи<1е1 й а1, 2005] В итоге, мы впервые показали, что антитела к пептиду 106-134 препятствуют накоплению патогенного приона в культуре клеток, что указывает на потенциальную возможность применения этого пептида в неконъюгированной с белком-носителем форме для разработки подходов к иммунотерапии прионных болезней

4. Получение и характеристика антител к синтетическим фрагментам прионного белка

у мышей

Изучение иммуногенной активности синтетических пептидов и их аналогов при иммунизации мышей трех линий Скрепи - болезнь овец и коз, которую считают прототипом всех трансмиссивных губкообразных энцефалопатий, экспериментально передаётся мышам посредством инокуляции инфекционного материала Поэтому прионные болезни изучают в основном на мышиных моделях Вследствие этого исследование способов индукции антител к прионному белку у мышей предоставляет основу для изучения механизмов патогенеза прионных болезней и для разработки оптимальных способов получения моноклональных антител Одним из перспективных методов стимуляции иммунного ответа является иммунизация животных свободными синтетическими пептидами Но в литературе имеются пока крайне скудные данные, посвященные получению мышиных антител с помощью неконъюгированных с белком-носителем синтетических фрагментов прионных белков, и систематические исследования этого вопроса отсутствуют

В настоящей работе мышей иммунизировали пятью фрагментами прионного бежа (25-36)-(62-69), (17-36)-(62-69), 106-134, 172-202, 214-240, и шестью их аналогами

101-134(Ь), 106-134(У), 106-134(УУ), 172-202(К), 209-240(№), 209-240(№У11) (см табл 1) Каждым пептидом иммунизировали по 5 мышей трёх линий ВАЬВ/с, С57ВЬ/6.1 и СВАЛ, различающихся по гаплотипу главного комплекса гистосовместимости (Н-2а, Н-2Ь и Н-2к, соответственно) Иммунизации проводили подкожно свободными, не коньюгированными с бежом-носигелем пептидами двукратно с интервалом в 45 дней Пулы сывороток тестировали на наличие противопептидных антител методом ИФА Результаты исследований показали (Табл 4), что большинство пептидов индуцировали образование антител у мышей двух или трех линий, но один фрагмент, а именно (25-36)-(62-69), оказался неиммуногенным для мышей всех линий Титры антител в большинстве сывороток были высокими (>1 1000) Только при иммунизации пептидом 106-134 и его аналогами мышей линий ВАЬВ/с и С57ВЬЛУ, а также мышей линии СВАУ аналогом 106-13400 были отмечены более низкие значения

Таблица 4. Титр противопептидных антител в ИФА сывороток мышей трех линий после двукратной иммунизации синтетическими пептидами прионного белка и их аналогами

Иммуноген Титр Ат в пулах сывороток мышей

ВАЬВ/с С57ВЬ/6.1 СВАЛ!

(17-36)-(62-69) 1:12800 <1 10 1.8000

(25-36)-(62-69) <1 10 <1 10 <1 10

106-134 1:640 1:640 1-1600

101-134(Ь) 1 20 <1 10 1 3200

106-134(У) 1:80 1160 1:20

106-134(УУ) 1:640 1:640 1 1600

172-202 1 25600 1:32000 1:64000

172-202(К) 1:32000 1 64000 1-64000

214-240 1-32000 1:2000 1:32000

209-240(№) 1:32000 1-3200 1-6400

209-240(ОТУ1{) 1 64000 <1 10 1.4000

Сравнение титров антител, индуцированных фрагментами с природной последовательностью и их аналогами, показало, что в ряде случаев введение аминокислотных замен привело к увеличению титров антител в 1 25-2 раза (иммунизация пептидом 101-134 мышей СВАУ, пептидом 172-202(К) мышей ВАЬВ/с и С57ВЬ/61, пептидом 209-240(№) мышей С57В1ЖГ и пептидом 209-240(№УК) мышей ВАЬВ/с) Это показывает, что в данных случаях произведенные замены оказались эффективны и способствовали увеличению иммуногенной активности пептидов В двух случаях введение замен привело к исчезновению антител (иммунизация пептидами 101-134 и 209-240(№УЯ)

мышей С57ВЬ/6Т), что свидетельствует, видимо, о нарушении структуры эпитопов, ответственных за индукцию антител

Таким образом, в результате иммунизации мышей трёх линий, различающихся по гаплотипу (Н-2а, Н-2Ь или Н-2к), неконъюгированными с белком-носителем синтетическими фрагментами прионного белка (17-36)-(62-69), 106-134, 172-202 и 214-240, характеризующимися высокой степенью гомологии с собственным прионным белком мыши, а также их аналогами, были получены поликлональные противопептидные антитела

С целью выбора пептидов, пригодных для получения моноклональных антител к прионному белку, мышей линии ВАЬВ/с иммунизировали также по схеме, включающей три иммунизации, которую часто используют для повышения иммунного ответа при получении моноклональных антител Иммунизации проводили внутрибрюпшнно с интервалами в 21 и 14 дней Полученные индивидуальные сыворотки тестировали на наличие противопептидных антител методом ИФА (Табл 5)

Таблица 5. Титр противопептидных антител в ИФА сывороток мышей линии ВАЬВ/с после трёхкратной иммунизации синтетическими пептидами прионного белка

Иммуноген Титр Ат в индивидуальных сыворотках мышей

1 2 3 4 5

(17-36)-(62-69) 1:125 1:125 1-125 1 125 <1 10

(25-36)-(62-69) <1 10 <1 10 <1 10 <1 10 <1 10

106-134 1.125 <1 10 <1 10 <1 10 <1 10

172-202 1:15625 1:78125 1 78125 1:390625 1 390625

214-240 1 15625 1.15625 1:15625 1:78125 1:78125

Сравнительный анализ результатов иммунизации по двум разным схемам показал, что, по сравнению с двукратной схемой, при трехкратной иммунизации фрагментами (17-36)-(62-69) и 106-134 тигры антител значительно падают Пептид (25-36)-(62-69) не проявляет иммуногенной активности при иммунизации по обеим схемам В то же время, при иммунизации фрагментами 172-202 и 214-240, как при двукратной, так и при трехкратной, титры антител достигают высокого уровня Поэтому для получения моноклональных антител могут быть пригодны пептиды 172-202 и 214-240, гарантированно индуцирующие высокий уровень антител у каждой иммунизированной мыши

Изучение связывания противопептидных антител мышей с рекомбинангным прионным белком КРС Противопептидные сыворотки мышей, полученные после двукратной иммунизации, исследовали на связывание с гВоРгР методом ИФА Изучали только пулы сывороток, имеющие противопептидные антитела Было выявлено, что

противопептидные антитела сывороток мышей ВАЬВ/с и/или СВАЯ, полученные к четырем пептидам и к четырем их аналогам, связываются с рекомбинантным прионным белком с титром от 1 400 до 1 12800 (Габл 6) Интересно, что противопептидные антитела ни одной

Таблица 6 Связывание противопептидных антител из сывороток мышей трех линий, полученных после двукратной иммунизации, с гВоРгР в ИФА

Иммуноген Титр Ат

ВАЬВ/с С57В1У6 СВАЛГ

(17-36И62-69) 1.12800 н о 1 320

106-134 <1 10 <1 10 1 1280

101-134(Ц <1 10 но 1 1280

1О6-134(\0 <1 10 <1 10 <1 10

106-134(УУ) <1 10 <1 10 <1 10

172-202 1 640 <1 10 1 6400

172-202(К) <1 10 <1 10 1 640

214-240 1 400 <1 10 1 400

2О9-24О0МР) 1 400 <1 10 <1 10

209-240(№УК) 1 800 н о <1 10

из сывороток мышей линии С5ТВиб] не связывались с белком, хотя, например, титр антител к пептиду 172-202(К) достигал значения 1 64000 Все антитела, полученные у мышей линий ВАЬВ/с и СВА/.Т к пептидам с природной последовательностью, связывались с рекомбинантным белком, за исключением сывороток с низким титром 1 640, полученных у мышей линии ВАЬВ/с к пептиду 106-134 В то же время, не все антитела, полученные к аналогам пептидов, были способны выявлять прионный белок, что может быть объяснено наличием у этих пептидов аминокислотных замен

Таким образом, было показано, что иммунизация свободными синтетическими фрагментами прионного белка вызывает у мышей линий ВАЬВ/с и СВАЛ образование антител, распознающих полноразмерный рекомбинантный прионный белок КРС

Способность противопептидных антител мышей выявлять патогенный прионный белок в иммуногистохимическом тесте Все полученные сыворотки мышей, содержащие противопептидные антитела, были исследованы в ИГХ на способность выявлять РтР8с на срезах мозга КРС, больного губкообразной энцефалопатией В таблице 7 приведены сыворотки, антитела которых проявили связывание с препаратами мозга больного КРС в разведении >1 1000, а с препаратами мозга здоровых животных в разведении <1 500 Патогенный прион выявляли антитела, полученные к пептиду (17-36)-(62-69), 172-202 и его

Таблица 7 Сыворотки мышей, антитела которых проявили связывание с РгР8с в ИГХ срезов мозга КРС, больного губкообразной энцефалопатией

Иммуноген Число иммунизаций Линия мышей

(17-36)-(62-69) 2 ВАЬВ/с

СВАЛ

172-202 3 ВАЬВ/с

172-202 (К) 2 СВАЛ

214-240 3 ВАЬВ/с

аналогу 172-202(К) и к пептиду 214-240 Все сыворотки, активные в иммуногистохимическом тесте, содержали высокие (>1 8000) титры противопептидных антител Интересно, что активность в ИГХ проявили сыворотки, полученные после трехкратной иммунизации пептидами 172-202 и 214-240, но не после двукратной

Таким образом, двукратная иммунизация пептидами (17-36)-(62-69) и 172-202(К) мышей линии ВАЬВ/с и/или СВАЛ и трехкратная иммунизация мышей линии ВАЬВ/с пептидами 172-202 и 214-240 приводит к образованию антител, выявляющих патогенный прионный белок в ИГХ Соответственно, иммунизация этими четырьмя пептидами может быть применена для изучения механизмов патогенеза прионных болезней, и, кроме того, пептиды 172-202 и 214-240 потенциально могут быть использованы для получения диагностических моноклональных антител, выявляющих губкообразную энцефалопатию крупного рогатого скота

5. Получение и характеристика моноклональных антител к прионному белку у мышей

Получение моноклональных антител к прионному белку является сложной задачей К этому эндогенному белку существует врожденная толерантность, которую не всегда удается обойти даже при иммунизации прионным белком другого вида млекопитающих, ввиду высокой гомологии его аминокислотных последовательностей среди разных видов Для решения этой проблемы были созданы и используются трансгенные мыши, лишенные гена прионного белка Но задача настоящего исследования состояла в получении моноклональных антител к прионному белку у обычных нетрансгенных животных Кроме того, что эти мыши более доступны, именно они, в отличие от трансгенных бесприонных, служат для создания моделей прионных болезней, на которых проводится изучение механизмов этих заболеваний и разработка способов их иммунопрофилактики и иммунотерапии

Для получения гибридом мышей линии ВАЬВ/с иммунизировали свободными пептидами 172-202 и 214-240 внутрибрюпшнно по трехкратной схеме и выбирали мышей с

наиболее высоким содержанием антител в сыворотке (1 390625 и 1 78125, соответственно, см табл 5) Гибридомы получали по стандартной методике [Köhler and Milstem, 1975] С помощью ИФА культуральных супернатантов на связывание с пептидами были выявлены три положительных первичных клона к пептиду 172-202 и пять - к пептиду 214-240 В результате клонирования были получены вторичные клоны, продуцирующие моноклональные антитела класса IgM, и в процессе культивирования происходило переключение на антитела класса IgGl Культуральные жидкости вторичных клонов были исследованы в ИГХ, и было показано, что патогенный прион на срезах мозга больного КРС выявляют только антитела, полученные к пептиду 214-240 Однако в ходе дальнейшего культивирования гибридомы, продуцирующие антитела к пептиду 214-240, прекратили вырабатывать антитела, т е оказались нестабильны

На следующем этапе исследований для получения моноклональных антител использовали рекомбинантный прионный белок КРС ВоРгР(25-241) Мышей линии BALB/c двукратно иммунизировали белком и для получения гибридом выбирали мышь с наиболее высоким содержанием антител в сыворотке (1 390625) С помощью ИФА культуральных супернатантов на связывание с рекомбинантным белком были выявлены 20 положительных первичных клонов Все клоны, кроме трех, через некоторое время прекращали вырабатывать антитела После клонирования были выбраны стабильные вторичные клоны этих гибридом -4С2/В8, 5С8/С6 и 5D10/D2 В процессе культивирования гибридных клеток были получены культуральные и асцитные жидкости, содержащие мкА, титры которых представлены в таблице 8

Таблица 8 Титр моноклональных антител к гВоРтР в ИФА культуральной (к ж) и асцитной (а ж ) жидкостей

мкА ТитрмкА(к ж) Титр мкА (а. ж )

4С2/В8 1 40960 1 1280000

5С8/С6 1 40960 1 1280000

5D10/D2 1 5120 1 204800

Определение изотипов тяжелых цепей мкА проводили с помощью твердофазного ИФА, используя козьи антитела против шести классов иммуноглобулинов мыши (IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM и IgA) Тестирование показало, что все три мкА относятся к классу IgM Известно, что выработка антител класса IgM может быть индуцирована агрегированными белками как поливалентными антигенами, без первоначальной Т-клеточной помощи [Rosenberg, 2006] Как показывают исследования, рекомбинантный прионный белок склонен к образованию димеров и даже полимерных агрегатов [Pan et al, 2005], поэтому возможно, что некоторая часть рекомбинантного прионного бежа КРС,

использованного нами для иммунизации, также существует в агрегированной форме, что и могло привести к образованию антител класса 1§М.

Для того чтобы определить, являются ли эпитопы полученных моноклональных антител линейными или конформационными, мкА были исследованы на связывание с прионным белком методом иммуноблотгинга. Результаты показали (Рис. 8), что все мкА -кДа 4С2/В8, 5С8/С6 и 5010/02 - выявляют полосу

рекомбинантного прионного белка КРС в районе 28 кДа и, значит, связываются с линейными эпитопами.

Рисунок 8. Связывание моноклональных антител (асцитных "жидкостей) 5С8/С6 (2), 4С2/В8 (3), 5010/02 (4) с -28кДа гВоРгР. На дорожке 1 показано положение окрашенных белковых маркеров молекулярного веса.

Для определения эпитопной специфичности антител методом ИФА были использованы семь фрагментов прионного белка КРС: (17-36)-(62-69), (25-36)-(62-69), 106-134, 172-202, 186-202, 214-240 и 224-240 (см. табл. 1). Результаты показали, что мкА 5010/02 связываются с И-концевым пептидом (17-36)-(62-69), а два мкА: 4С2/В8 и 5С8/С6, связываются с С-концевым пептидом 214-240 (Табл. 9).

Таблица 9. Связывание моноклональных антител (асцитных жидкостей) с синтетическими фрагментами прионного белка в ИФА.

Пептид (17-36)-(62-69) (25-36)-(62-69) 106-134 172-202 186-202 214-240 224-240

мкА Титр Ат

4С2/В8 < 1:50 < 1:50 < 1:50 < 1:50 < 1:50 1:81000 < 1:50

5С8/С6 < 1:50 < 1:50 < 1:50 < 1:50 < 1:50 1:81000 < 1:50

5D10/D2 1:12800 < 1:50 < 1:50 < 1:50 < 1:50 < 1:50 < 1:50

Оказалось, что мкА 5D10/D2, связывающиеся с пептидом (17-36)-(62-69), не связываются с более коротким N-концевым пептидом (25-36)-(62-69). В то же время, эти антитела связываются в ИФА и на иммуноблоте с рекомбинантным прионным белком, последовательность которого после His6 начинается с остатка Lysb. Сопоставление этих данных позволяет предположить, что эпитоп антител 5D10/D2 находится в районе остатков 25-36 (KKRPKPGGGWNT), причем а-ЫНг-группа остатка Lys23, по-видимому, должна входить в состав пептидной связи (с остатком Cys в случае пептида (17-36)-(62-69) и с остатком His в случае рекомбинантного белка). Таким образом, мкА 5D10/D2, вероятно, не будут связываться с выделенными из клеток РгРс и PrPSc. Тем не менее, эти антитела могут

быть пригодны для иммунодетекции или для аффинного выделения рекомбинантного прионного белка, несущего на N-концевом аминокислотном остатке Lys25 последовательность His6

Два других мкА, 4С2/В8 и 5С8/С6, связывались с одним и тем же пептидом - 214-240, но не связывались с более коротким пептидом 224-240 Для более точного определения специфичности этих антител был использован набор перекрывающихся десятичленных фрагментов последовательности 215-233 и полноразмерный пептид 214-240 (Табл 10) Для проведения ИФА они были конъюгированы с овальбумином, поскольку короткие пептиды, как правило, плохо сорбируются на планшеты Результаты показали, что оба мкА с одинаковым сродством связываются с ко1гыогата.\м фрагментов 220-229, 222-231 и конъюгатом контрольного фрагмента 214-240, и не связываются с конъюгатами остальных фрагментов (Табл 10) Можно предположить, что оба антитела, 4С2/В8 и 5С8/С6, имеют одинаковый эпитоп, который находится в районе аминокислотных остатков 222-229 (EQMCITQY), общем для фрагментов 220-229 и 222-231 Эти антитела могут быть пригодны для выявления различных форм прионного белка, так как их эпитоп находится в устойчивом к протеолизу С-концевом районе PrPSc Интересно, что хотя мышей иммунизировали рекомбинантным белком, в итоге моноклональные антитела были получены к участку пептида 214-240, который был выбран по результатам наших предыдущих исследований как перспективный пептид для получения моноклональных антител

Таблица 10. Связывание моноклональных антител (асцитных жидкостей) с пептидом 214-240 и его фрагментами, конъюгированными с овальбумином, в ИФА Предполагаемый эпитоп моноклональных антител подчеркнут

Пептид Аминокислотная последовательность мкА

5С8/С6 4С2/В8

215-224 KMMERWEQM <1 50 <1 50

216-225 MMERWEQMC <1 50 <1 50

218-227 ERWEQMCIT <1 50 <1 50

220-229 WEQMCITQY 1:16000 1 32000

222-231 EQMCITQYQR 1 8000 1 8000

224-233 MCITQYQRES <1 50 <1 50

214-240 IKMMERWEQMCITQYQRESQAYYQRG 1.64000 1 64000

Далее были проведены очистка и оценка аффинности моноклональных антител

5С8/С6 Поскольку эпитоп мкА был нами определен, для очистки антител синтетический

фрагмент 214-240 прионного белка конъюгировали с ОГОг-сефарозой На полученном

сорбенте провели аффинную очистку асцитной жидкости, и получили очищенные антитела с

концентрацией 0.42 мг/мл. Их чистоту проверяли методом электрофореза в БОЗ-РААС (Рис. 9) с последующей идентификацией белковых полос с помощью анализа масс-спектров продуктов трипсинолиза этих белков. Масс-спектрометрический анализ и интерпретация результатов были проведены сотрудником лаборатории химии пептидов ИБХ РАН Р.Х. Зиганшиным. Как показали результаты электрофоретического и масс-спектрометрического анализов, были получены высокоочищенные антитела, состоящие из тяжелой ц-цепи с молекулярной массой 70 кДа и легкой к-цепи с молекулярной массой 23 кДа.

<-70 кДа [1-цепь

<-23 кДа

Рисунок 9. Элекгрофореграмма (12.5%-ный БОБ- РААО). К-цепь (1) - белковые маркеры молекулярного веса, (2) - аффинно очищенные мкА 5С8/С6, тяжелая ц-цепь (-70 кДа) и легкая к-цепь (-23 кДа).

Определение аффинности антител к иммобилизованному антигену проводили с помощью ИФА связывания аффинно очищенных антител в уменьшающейся от 2400 нг/мл до 1.2 нг/мл концентрации с сорбированным на планшете рекомбинантным прионным белком (Рис. 10). По результатам ИФА строили график зависимости оптического поглощения от концентрации мкА (Рис. 10А). На этом графике выбирали точки, лежащие на одной прямой (диапазон концентраций мкА от 1200 нг/мл до 37.5 нг/мл), и, используя данные ИФА в выбранном диапазоне, строили график зависимости оптического поглощения от концентрации мкА в двойных обратных координатах (Lineweaver-Burk plot) (Рис. 10Б). Аппроксимация этого графика дает прямую с пересечением оси абсцисс, соответствующим -Кафф [Apsalons and Bichko, 1994]. Таким образом, наблюдаемая константа аффинности мкА с иммобилизованным на планшете прионным белком оказалась равной 5.7х109 М"'. Необходимо отметить, что наблюдаемое значение константы является приближенным, так как в случае имеющих 10 антигенсвязывающих сайтов антител класса IgM связывание антигена по всем десяти сайтам стерически затруднено и, таким образом, сайты связывания не являются независимыми. Аффинно очищенные антитела 5С8/С6 исследовали в иммуногистохимическом тесте на их способность выявлять скопления патогенного прионного белка на срезах мозга больного губкообразной энцефалопатией КРС. При проведении иммуногистохимического окрашивания срезов мозга было показано, что эти мкА в концентрации 12 мкг/мл специфически связываются с PrPSc на срезах мозга больного КРС, не обнаруживая фоновых реакций с тканями мозга здоровых животных.

Рисунок 10. Определение константы аффинности очищенных моноклональных антител 5С8/С6 к иммобилизованному рекомбинантному прионному белку.

А) График зависимости оптического поглощения А492 в ИФА от концентрации антител [Ат], (нг/мл). Серым цветом выделен диапазон концентраций, в котором значения лежат на одной прямой.

Б) График зависимости оптического поглощения А492 от концентрации антител [Ат], (нМ), построенный в двойных обратных координатах (Lineweaver-Burk plot) для выбранного по графику 5а диапазона концентраций. Аппроксимация графика дает прямую с пересечением оси абсцисс, соответствующим -Кафф

Таким образом, у нетрансгениых мышей были получены три моноклональных антитела к прионному белку, два из которых имеют эпитоп на участке 222-229 прионного белка, а одно - на участке 25-36. Показано, что эти антитела связываются с рекомбинантным прионным белком в ИФА и на иммуноблоте, и что очищенные мкА с эпитопом 222-229 выявляют патогенный прион в иммуногистохимическом тесте. Соответственно, полученные антитела потенциально пригодны для выявления изоформ РгРс и РгР3с в различных диагностических и исследовательских тестах.

Выводы

1. На основе теоретических методов анализа и данных литературы осуществлен выбор потенциально иммуноактивных фрагментов прионного белка и их аналогов.

2. Показано, что выбранные синтетические пептидные фрагменты прионного белка, неконъюгированные с белком-носителем, вызывают образование антител у кроликов и у мышей трех линий. Изучено связывание антител с нормальным и патогенным прионным белком различными методами.

3. Установлено, что кроличьи антитела к пептидам (25-36)-(62-69), 106-134, 172-202 и 214-240 пригодны для разработки диагностикума прионных заболеваний на основе иммуногистохимического анализа, и антитела к пептиду 106-134 - на основе иммуноблоттинга

4 Выявлено, что кроличьи антитела к пептиду 106-134 препятствуют накоплению патогенного приона в культуре клеток.

5 Установлено, что мышиные антитела к пептидам (17-36)-(62-69), 172-202 и его аналогу 172-202(К), а также к пептиду 214-240 выявляют патогенный прионный белок в иммуногистохимическом тесте

6 Получены и охарактеризованы три моноклональных антитела к прионному белку Выявлено, что эпитопы двух антител локализованы на участке белка 222-229, а эпитоп третьего локализован на участке 25-36, и показано, что антитела с эпитопом 222-229 пригодны для выявления патогенного прионного белка иммуногистохимическим методом

Список сокращений

KLH - гемоцианин улитки Megathura crenulata (keyhole limpet hemocyamn)

SDS - додецилсульфат натрия

SDS-PAAG - полиакриламидный гель, содержащий додецилсульфат натрия

ВоРгР - прионный белок КРС, гВоРгР - рекомбинантный прионный белок КРС

МоРгР - прионный белок мыши, гМоРтР - рекомбишнтный прионный белок мыши

РгРс - нормальная изоформа прионного белка

PrPSc - патогенная изоформа прионного белка

Ат — антитело, антитела

ИГХ - иммуногистохимический тест

ИФА - иммуноферментный анализ

КРС - крупный рогатый скот

мкА — моноклональное антитело, моноклональные антитела

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях 1 ) Вольпина О M, Жмак M H, Обозная M Б. Титова MA, Короев Д О , Волкова Т Д, Егоров А А, Рыбаков С С, Иванов В Т Антитела против синтетических фрагментов прионного белка для диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота Биоорганическая химия, 2001, т27, №5, с352-358 (ОМ Volpina, MN Zhmak, M В Oboznava. M A Titova, D О Koroev, T D Volkova, S S Ribakov, A A Egorov, V T Ivanov Antibodies against synthetic prion protein fragments for the detection of bovme spongiform encephalopathy , Russian Journal of Bioorgamc Chemistry, 2001, V 27, №5, p311-317)

2) МБ Обозная. О M Вольпина, M H Жмак, M A Титова, T Д Волкова, A A Егоров, С С Рыбаков, В Т Иванов Индукция иммунного ответа синтетическими фрагментами прионного белка и их аналогами у мышей разных линий Биоорганическая химия, 2004, т 30, № 4, с 356-363 (Induction of Immune Response by Synthetic Fragments of the Bovine Prion Protein and Their Analogues in Mice of Various Lines M В Oboznava. О M Volpina, M N Zhmak, M A Titova, T D Volkova, A A Egorov, S S Rybakov and V T Ivanov Russian Journal of Bioorgamc Chemistry, 2004, №4, p320-326 )

3) М В Oboznava. S Gilch, M A Titova, D О Koroev, T D Volkova, О M Volpina, and H M Schatzl Antibodies to a Nonconjugated Prion Protein Peptide 95-123 Interfere with PrPSc Propagation in Pnon-Infected Cells Cellular and Molecular Neurobiology, 2007,27(3), p 271-284 Epub 2007 Jan 5

4) M Б Обозная. Д О Короев, М Н Жмак, М А Титова, Т Д Волкова, О М Вольпина Получение антител к синтетическим фрагментам прионного белка у мышей разных линий Тезисы докладов и стендовых сообщений XIV зимней международной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва,

2002, с 103

5) TD Volkova, MNZhmak, М В Oboznava, MA Titova, D О Koroev, SS Rybakov, A A Egorov, О M Volpina, V T Ivanov Mice antipeptide antibodies for detection of protease resistant PrP isoform. J Peptide Sci, 2002, suppl to v 8, P C65, S162

6) Volpina О M, Titova M A, Koroev D О , Volkova T D, Oboznava M В . Nesmeyanov V A, Kotelnikova О V , Timofeev A V Immunogenic synthetic fragments of bacterial and viral proteins Abstracts of Tenth German-Russian Peptide Symposium, 2003, p 34

7) T D Volkova, M N Zhmak, M В Oboznava. M A Titova, D О Koroev, S S Rybakov, A A Egorov, О M Volpina, V T Ivanov Mice antipeptide antibodies for detection of protease resistant PrP isoform. In "Peptides 2002", Eds E Benedetti, С Pedone, Edizioni Znno, Napoli,

2003, p 656-657

8) S Gilch, A Ertmer, M Nunziante, G Schulz, F Wopfner, M Oboznava. E Maas, С Kehler, С Bruns, I Vorberg, H M Schatzl Novel targets for experimental therapy and prophylaxis against prion infections Abstracts of the First International Conference of the Network of Excellence NeuroPnon, Pans, 2004, p 71

9) M Б Обозная. M А Титова, T Д Волкова, Д О Короев, 3 Гилх, X Шэтцл, ОМ Вольпина Антитела к фрагменту 106-134 прионного белка препятствуют накоплению патогенного приона в культуре клеток Тезисы докладов и стендовых сообщений XVIII зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 2006, с 76

10) М Б Обозная. ТД Волкова, ДО Короев, ОМ Вольпина Подходы к иммунотерапии и иммунопрофилактике прионных болезней Тезисы докладов и стендовых сообщений XX зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 2008, с 31

Подписано в печать 05 03 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 130 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Обозная, Мария Борисовна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ "Антитела к прионному белку: методы получения и рбласти применения"

1.1. Прионные болезни

1.2. Структура прионного белка

1.3. Методы получения антител к прионному белку

1.3.1. Иммунизация выделенным прионым белком

1.3.2. Иммунизация трансгенных бесприонных мышей

1.3.3. Иммунизация рекомбинантным прионным белком

1.3.4. ДНК-иммунизация

1.3.5. Иммунизация синтетическими фрагментами прионного белка, конъюгированными с белком-носителем

1.3.6. Иммунизация мультиантигенными пептидными комплексами

1.3.7. Иммунизация свободными неконъюгированными синтетическими фрагментами прионного белка

1.4. Области применения антител к прионному белку

1.4.1. Методы иммунодиагностики прионных болезней иммунодетекция прионного белка)

1.4.2. Подходы к иммунопрофилактике и иммунотерапии прионных болезней: исследования in vitro

1.4.3. Подходы к иммунопрофилактике и иммунотерапии прионных болезней: исследования in vivo

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ '

2.1. Выбор пептидов в последовательности прионного белка

2.2. Получение и характеристика антител к синтетическим фрагментам прионного белка у кроликов

2.2.1. Изучение иммуногенной активности свободных синтетических пептидов и их конъюгатов с белком-носителем

2.2.2. Получение рекомбинантного прионного белка

2.2.3. Изучение связывания противопептидных антител кроликов с рекомбинантным прионным белком

2.2.4. Изучение связывания противопептидных антител кроликов с PrPSc и РгРС изоформами прионного белка, выделенными из клеток

2.2.5. Исследование способности противопептидных антител кроликов выявлять патогенный прионный белок в иммуногистохимическом тесте

2.2.6. Препятствие накоплению патогенного приона в культуре клеток в присутствии противопептидных кроличьих антител

2.3. Получение и характеристика антител к синтетическим фрагментам прионного белка у мышей

2.3.1. Изучение иммуногепной активности синтетических пептидов и их аналогов при иммунизации мышей трех линий

2.3.2. Изучение связывания противопептидных антител мышей с рекомбинантным прионным белком

2.3.3. Исследование способности противопептидных антител мышей выявлять патогенный прионный белок в иммуногистохимическом тесте

2.4. Получение и характеристика моноклональных антител к прионному белку у мышей

2.4.1. Получение моноклональных антител к синтетическим пептидам прионного белка

2.4.2. Получение моноклональных антител к рекомбинантному прионному белку

3. ЭКСПЕРИМ ЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Химические реагенты и биологические препараты

3.2. Оборудование и расходные материалы

3.3. Культуры клеток '

3.4. Животные

3.5. Получение конъюгатов пептидов с KLH или с овальбумином

3.6. Получение рекомбинантного прионного белка КРС

3.7. Иммунизация животных

3.7.1. Им мунизация кроликов

3.7.2. Иммунизация мышей для получения иммунных сывороток

3.7.3. Иммунизация мышей для получения моноклональных антител

3.8. Получение сывороток крови

3.9. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА)

3.10. Получение моноклональных антител

3.10.1. Ведение клеточных культур

3.10.2. Замораживание и размораживание клеток

3.10.3. Выделение мышиных перитонеальных макрофагов

3.10.4. Получение гибридом

3.10.5. Скрининг и клонирование гибридом

3.10.6. Культивирование гибридом для наработки антител

3.10.7. Изотипирование антител

3.11. Выделение РгР из клеток нейробластомы. 93 3.11.1. Выделение PrPSc из клеток ScN2a '

3.11.1. Выделение РгР из клеток N2a

3.12. Электрофорез и иммуноблоттинг

3.12.1. Электрофорез и иммуноблоттинг, метод 1 (рис. 2.3, 2.9, 2.10)

3.12.2. Электрофорез и иммуноблоттинг, метод 2 (рис. 2.4-2.6, 2.8)

3.13. Изучение влияния иммунных сывороток на содержание патогенного приона в культуре клеток

3.13.1. Схема эксперимента и иммуноблоттинг образцов

3.13.2. Количественный дот-блоттинг образцов

3.13.3. Иммуноцитохимический анализ

3.14. Иммуногистохимический тест

3.15. Аффинная очистка антител

3.15.1. Аффинная очистка

3.15.2. Трипсинолиз очищенных антител и масс-спектрометрический анализ фрагментов

3.16. Определение аффинности антител 100 ВЫВОДЫ 101 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

At - антитело, антитела

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГФИ - гликозилфосфатидилинозитол

ДМСО - диметилсульфоксид

КРС - крупный рогатый скот

ИГХ - иммуногистохимический анализ

ИФА - иммуноферментный анализ мкА - моноклональное антитело, моноклональные антитела

НАФ — неполный адъювант Фрейнда

ПАФ — полный адъювант Фрейнда

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

KLH - гемоцианин улитки Megathura crenulata (keyhole limpet hemocyanin)

MAP - мультиантигенные пептидные комплексы

PrP - прионный белок (prion protein)

PrPc - нормальная изоформа прионного белка

PrPSc - патогенная изоформа прионного белка

РгР27"30 — укороченная в результате частичного протеолиза форма патогенного прионного белка гРгР - рекомбинантный прионный белок SDS - додецилсульфат натрия

SDS-PAAG - полиакриламидный гель, содержащий додецилсульфат натрия

Введение Диссертация по биологии, на тему "Антитела против синтетических пептидных фрагментов прионного белка для выявления клеточного приона и его патогенной изоформы"

Трансмиссивные губкообразные энцефалопатии, или прионные болезни — это неизлечимые пейродегенеративные заболевания, поражающие человека и некоторые другие виды млекопитающих. Одним из таких заболеваний является губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, эпидемия которой нанесла огромный ущерб сельскому хозяйству Великобритании и ряда других европейских стран. Попадание в организм человека продуктов питания либо лекарственных препаратов, полученных из тканей больных животных, может вызвать прионное заболевание - новый вариант болезни Крейтцфельдта-Якоба. Инфекционный агент этих заболеваний представляет собой патогенную изоформу нормального клеточного белка - РгР. Нормальная (РгРс) и патогенная (PrPSc) изоформы идентичны по своей аминокислотной последовательности, но отличаются по конформации белковой -цепи. Механизм патогенеза объясняют превращением нормального белка в патогенный, которое происходит при их непосредственном контакте, с последующим накоплением агрегатов измененного белка в головном мозге и массовой гибелью нейронов. Патогенная изоформа белка отличается склонностью к агрегации и устойчивостью к протеолизу.

Современная диагностика прионных болезней основана на детекции с помощью антител остающегося в образцах мозга PrPSc после обработки протеиназой. Показано, что антитела к прионному белку способствуют удалению патогенного белка из инфицированных клеток и замедляют ход заболевания у экспериментально зараженных животных. Таким образом, для разработки чувствительных методов диагностики прионных болезней, а также для детального изучения особенностей их патогенеза и создания средств иммунотерапии нужны антитела, специфичные к различным участкам приона. Получение антител к прионному белку - это актуальная задача, особенно принимая во внимание, что в России пока не существует отечественного иммунохимического диагностического теста для выявления губкообразной энцефалопатии.

Проблема получения антител к прионному белку связана с его низкой иммуногенностью, поскольку белки разных видов млекопитающих гомологичны более чем на 90%. В связи с этим получение антител затруднено из-за существования толерантности к прионному белку как к эндогенному антигену. Иммунизация белком приводит к образованию антител, направленных только к небольшому числу эпитопов, несущих межвидовые аминокислотные замены. Альтернативным способом получения антител в таком случае служит иммунизация синтетическими пептидными фрагментами прионного белка, конъюгированными с белком-носителем.

В настоящем исследовании для получения антител к прионному белку мы предлагаем использовать неконъюгированные с белком-носителем синтетические фрагменты белка. Такой подход позволит направленно получить антитела к выбранным структурно и функционально важным участкам белковой цепи. Кроме того, этот метод позволит избежать нежелательных иммунных реакций, возникающих при традиционной иммунизации пептидно-белковыми конъюгатами. Таким образом, диссертационная работа посвящена получению с помощью синтетических пептидов и рекомбинантного белка поликлональных и моноклональных антител, направленных к определенным структурно-функциональным районам прионного белка, способных выявлять изоформы прионного белка, а также обладающих потенциальным иммунотерапевтическим действием.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: "АНТИТЕЛА К ПРИОННОМУ БЕЛКУ: МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ"

1.1. ПРИОННЫЕ БОЛЕЗНИ

Трансмиссивные губкообразные энцефалопатии, или прионные болезни - это неизлечимые нейродегенеративные заболевания, поражающие человека и некоторые другие виды млекопитающих. В настоящее время известно четыре болезни человека — болезнь Крейтцфельдта-Якоба, куру, синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, фатальная семейная инсомния, и шесть болезней животных - скрепи овец и коз, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота (так называемое «бешенство коров»), трансмиссивная энцефалопатия норок, хроническая изнуряющая болезнь оленей и лосей, губкообразная энцефалопатия кошек и губкообразная энцефалопатия экзотических копытных [1, 2]. Необычность этих болезней заключается в том, что инфекционный агент не является бактерией или вирусом, а представляет собой белковую молекулу — патогенную изоформу (PrPSc) нормального клеточного прионного белка (РгРс) [3]. Прионный белок закодирован в геноме млекопитающих и экспрессируется на поверхности многих клеток организма, а больше всего прионной мРНК найдено в нейронах [4-6].

Прионные болезни могут быть наследственными, приобретенными и спорадическими, но независимо от этиологии заболевания оно может быть передано инфекционным путем [7]. Проникновение инфекционного агента - белка PrPSc - вызывает превращение нормального РгРс белка хозяина в патогенный белок с последующим накоплением его агрегатов. В дальнейшем происходит массовая гибель нейронов, поэтому срезы больного мозга на терминальных стадиях болезни содержат характерные губкообразные изменения. Заражение прионами человека и животных обычно происходит при употреблении пищи, содержащей инфекционный материал. Так, например, причиной возникновения эпидемии губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота в Великобритании считают использование в рационе скота мясо-костной муки, приготовленной из больных животных. В свою очередь, употребление людьми заражённой говядины считают причиной появления неизвестной ранее разновидности болезни Крейтцфельдта-Якоба, так называемого «нового варианта» этой болезни [1, 8]. А болезнь куру, ранее встречавшуюся у жителей Океании, связывают с ритуальным каннибализмом

9].

Заражение также может происходить ятрогенным путем, например, через недостаточно стерилизованные нейрохирургические инструменты. Экспериментальное заражение лабораторных животных производится путем интраперитонеального, перорального или интрацеребрального введения гомогената мозга больного человека или животного здоровому животному.

Развитие губкообразных энцефалопатии, не связанное с проникновением инфекции, имеет наследственный или спорадический характер. Семейная форма болезни Крейтцфельдта-Якоба, фатальная семейная инсомния, синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера - все эти болезни человека являются наследственными и связаны с врождёнными мутациями в гене прионного белка [2]. К спорадической форме прионных заболеваний относится большинство случаев болезни Крейтцфельдта-Якоба, когда у пациентов с характерными клиническими проявлениями болезни не находят генетических изменений. Возможной причиной возникновения спорадической болезни Крейтцфельдта-Якоба считают спонтанное или обусловленное соматическими мутациями превращение белка РгРс в PrPSc [1].

Неотъемлемым морфологическим признаком болезни является накопление агрегатов белка PrPSc (прионных фибрилл и амилоидных бляшек) в тканях головного мозга [1, 10]. Но в условиях отсутствия или прекращения экспрессии РгРс агрегаты PrPSc не оказывают патологического действия у лабораторных животных [11, 12]. Эти и многие другие данные свидетельствуют о том, что механизм патогенеза прионных заболеваний пока до конца не выяснен.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Обозная, Мария Борисовна

выводы

4. Выявлено, что кроличьи антитела к пептиду 106-134 препятствуют накоплению патогенного приона в культуре клеток.

5. Установлено, что мышиные антитела к пептидам (17-36)-(62-69), 172-202 и его аналогу 172-202(К), а также к пептиду 214-240 выявляют патогенный прионный белок в иммуногистохимическом тесте.

6. Получены и охарактеризованы три моноклональных антитела к прионному белку. Выявлено, что эпитопы двух антител локализованы на участке белка 222-229, а эпитоп третьего локализован на участке 25-36, и показано, что антитела с эпитопом 222-229 пригодны для выявления патогенного прионного белка иммуногистохимическим методом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Обозная, Мария Борисовна, Москва

1. Prusiner S.B. Prion diseases and the BSE crisis.// Science. 1997. V.278. P.245-251.

2. Покровский В.И., Киселёв О.И. Молекулярные основы прионных болезней.// Вестн.1. РАМН. 1998. №10. С.45-55.

3. Prusiner S.B. Molecular biology of prion diseases.// Science. 1991. V.252. P.1515-1522.

4. Basler K., Oesch В., Scott M., Westaway D., Walchli M., Groth D.F., McKinley M.P.,

5. Prusiner S.B., Weissmann C. Scrapie and cellular PrP isoforms are encoded by the same chromosomal gene.// Cell. 1986. V.46. P.417-428.

6. Kretzschmar H.A., Prusiner S.B., Stowring L.E., DeArmond S.J. Scrapie prion proteins aresynthesized in neurons.// Am. J. Pathol. 1986. V.122. P. 1-5.

7. Oesch В., Westaway D., Walchli M., McKinley M.P., Kent SB., Aebersold R., Barry R.A.,

8. Tempst P., Teplow D.B., Hood L.E. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.// Cell. 1985. V.40. P.735-746.

9. Шкундина И.С., Тер-Аванесян М.Д. Прионы.// Успехи биологической химии. 2006.1. Т.46. С.З—42.

10. Will R.G., Ironside J.W., Zeidler М., Cousens S.N., Estibeiro К., Alperovitch A., Poser S.,

11. Pocchiari M., Hofman A., Smith P.G. A new variant of Creutzfeldt-Jakob disease in the UK.// Lancct. 1996. V.347. P.921-925.

12. Goldfarb L.G., Cervenakova L., Gajdusek D.C. Genetic studies in relation to kuru: anoverview.//Curr. Mol. Med. 2004. V.4. P.375-384.

13. Hegde R.S., Tremblay P., Groth D., DeArmond S.J., Prusiner S.B., Lingappa V.R.

14. Transmissible and genetic prion diseases share a common pathway of neurodegeneration.//Nature. 1999. V.402. P.822-826.

15. Brandner S., Raeber A., Sailer A., Blattler Т., Fischer M., Weissmann C., Aguzzi A. Normalhost prion protein (PrPC) is required for scrapie spread within the central nervous system.//PNAS. 1996. V.93. P.13148-13151.

16. Mallucci G., Dickinson A., Linehan J., Klohn P.C., Brandner S., Collinge J. Depletingneuronal PrP in prion infection prevents disease and reverses spongiosis.// Science. 2003. V.302(5646). P.871-874.

17. MacGregor I. Prion protein and developments in its detection.//Transfus. Med. 2001. V.l 1.1. P.3-14.

18. Groschup MH, Harmeyer S, Pfaff E. Antigenic features of prion proteins of sheep and ofother mammalian species.//J. Immunol. Methods. 1997. V.207(l). P.89-101.

19. Pan Т., Li R., Wong B.S., Liu Т., Gambetti P., Sy M.S. Heterogeneity of normal prionprotein in two- dimensional immunoblot: presence of various glycosylated and truncated forms.// J. Neurochem. 2002. V. 81(5). P. 1092-1101.

20. Harmeyer S, Pfaff E, Groschup MH. Synthetic peptide vaccines yield monoclonal antibodiesto ccllular and pathological prion proteins of ruminants.// J Gen Virol. 1998. V.79(4), P.937-945.

21. Lopez Garcia F., Zahn R., Riek R., Wuthrich K. NMR structure of the bovine prionprotein.// PNAS. 2000. V.97. P.8334-8339.

22. Homemann S., Schorn C., Wuthrich K. NMR structure of the bovine prion protein isolatedfrom healthy calf brains.// EMBO Rep. 2004. V.5(12). P.l 159-1164.

23. DeMarco M.L., Daggett V. Local environmental effects on the structure of the prionprotein.// CR Biologies. 2005. V.328(10-l 1). P.847-862.

24. Smith C.J., Drake A.F., Banfield B.A., Bloomberg G.B., Palmer M.S., Clarke A.R., Collinge

25. J. Conformational properties of the prion octa-repeat and hydrophobic sequences.// FEBS Lett. 1997. V.405. P.378-384.

26. Liemann S., Glockshuber R. Transmissible spongiform encephalopathies.// Biochem.

27. Biophys. Res. Commun. 1998. V.250. P.187-193.

28. Pan K.M., Baldwin M., Nguyen J., Gasset M., Serban A., Groth D., Mehlhom I., Huang Z.,

29. Fletterick R.J., Cohen F.E. Conversion of alpha-helices into beta-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins.// PNAS. 1993. V.90. P.10962-10966.

30. Govaerts C., Wille H., Prusiner S.B., Cohen F.E. Evidence for assembly of prions with lefthanded beta-helices into trimers.// PNAS. 2004. V. 101(22). P. 8342-8347.

31. Forloni G., Angerctti N., Chiesa R., Monzani E., Salmona M., Bugiani O., Tagliavini F.

32. Neurotoxicity of a prion protein fragment.//Nature. 1993. V.362. P.543-546.

33. Selvaggini C., De Gioia L., Cantu L., Ghibaudi E., Diomede L., Passerini F., Forloni G.,

34. Bugiani O., Tagliavini F., Salmona M. Molecular characteristics of a protease-resistant, amyloidogenic and neurotoxic peptide homologous to residues 106-126 of the prion protein.//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. V.194. P.1380-1386.

35. Meyer R.K., McKinley M.P., Bowman K.A., Braunfeld M.B., Barry R.A., Prusiner S.B.

36. Separation and properties of cellular and scrapie prion proteins.// PNAS. 1986. V.83. P.2310-2314.

37. Aguzzi A., Polymenidou M. Mammalian prion biology: one century of evolving concepts.//

38. Cell. 2004. V. 116(2). P.313-327.

39. Jarrett, J.T., Lansbury, P.T. Jr. Seeding "one-dimensional crystallization" of amyloid: apathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie?// Cell. 1993. V.73. P.1055-1058.

40. Caughey В., Kocisko D.A., Raymond G.J., Lansbury P.T. Jr. Aggregates of scrapieassociated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state.// Chem. Biol. 1995. V.2. P.807-817.

41. Bendheim P.E., Barry R.A., DeArmond S.J., Stites D.P., Prusiner S.B. Antibodies to ascrapie prion protein.//Nature. 1984. V.310(5976). P.418-421.

42. Rubenstein R., Kascsak R.J., Merz P.A., Papini M.C., Carp R.I., Robakis N.K., Wisniewski

43. H.M. Detection of scrapie-associated fibril (SAF) proteins using anti-SAF antibody in non-purified tissue preparations.// J. Gen. Virol. 1986. V.67(Pt 4). P.671-681.

44. Barry R.A., McKinley M.P., Bendheim P.E., Lewis G.K., DeArmond S.J., Prusiner S.B.

45. Antibodies to the scrapie protein decorate prion rods.// J. Immunol. 1985. V.135(l). ■ P.603-613.

46. Cho H.J. Antibody to scrapie-associated fibril protein identifies a cellular antigen.// J. Gen.

47. Virol. 1986. V.67(Pt 2). P.243-253.

48. Kascsak R.J., Rubenstein R., Merz P.A. Carp R.I., Robakis N.K., Wisniewski H.M.,

49. Diringer H. Immunological comparison of scrapic-associatcd fibrils isolated from animals infected with four different scrapie strains.// J. Virol. 1986. V.59(3). P.676-683.

50. Takahashi K., Shinagawa M., Doi S., Sasaki S., Goto H., Sato G. Purification of scrapieagent from infected animal brains and raising of antibodies to the purified fraction.// Microbiol. Immunol. 1986. V.30(2). P.123-131.

51. Barry R.A., Prusiner S.B. Monoclonal antibodies to the cellular and scrapie prion proteins.//

52. J. Infect. Dis. 1986. V.154(3). P.518-521.

53. Kascsak R.J., Rubenstein R., Merz P.A., Tonna-Demasi M., Fersko R., Carp R.I.,

54. Wisniewski H.M., Diringer H. Mouse polyclonal and monoclonal antibody to scrapie-associated fibril proteins.// J. Virol. 1987. V.61(12) P.3688-3693.

55. Bolton D.C., Seligman S.J., Bablanian G., Windsor D., Scala L.J., Kim K.S., Chen С .J.,

56. Kascsak R.J., Bendheim P.E. Molecular location of a species-spccific epitope on the hamster scrapie agent protein.//J. Virol. 1991. V.65(7). P.3667-3675.

57. Rogers M., Serban D., Gyuris Т., Scott M., Torchia Т., Prusiner S.B. Epitope mapping of the

58. Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system.//J. Immunol. 1991. V.147(10). P.3568-3574.

59. Bueler H., Fischer M., Lang Y., Bluethmann H., Lipp H.P., DeArmond S.J., Prusiner S.B.,

60. Aguet M., Weissmann C. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein.//Nature. 1992. V.356(6370). P.577-582.

61. Bueler H., Aguzzi A., Sailer A., Greiner R.A., Autenried P., Aguet M., Weissmann C. Micedevoid of PrP are resistant to scrapie.// Cell. 1993. V.73(7). P.1339-1347.

62. Prusiner S.B., Groth D., Serban A., Kochler R., Foster D., Torchia M., Burton D., Yang

63. S.L., DeArmond S.J. Ablation of the prion protein (PrP) gene in mice prevents scrapie and facilitates production of anti-PrP antibodies.//PNAS. 1993. V.90. P. 10608-10612.

64. Williamson R.A., Peretz D., Smorodinsky N., Bastidas R., Serban H., Mehlhorn I.,

65. Dearmond S.J., Prusiner S.B., Burton D.R. Circumventing tolerance to generate autologous monoclonal antibodies to the prion protein.// PNAS. 1996. V.93. P.7279-7282.

66. Williamson R.A., Peretz D., Pinilla C., Ball H., Bastidas R.B., Rozenshteyn R., Houghten

67. R.A., Prusiner S.B., Burton D.R. Mapping the prion protein using recombinant antibodies.//J. Virol. 1998. V.72(ll). P.9413-9418.

68. Korth C., Stierli В., Streit P., Moser M., Schaller O., Fischer R., Schulz-Schacffcr W.,

69. Kretzschmar H., Raeber A., Braun U., Ehrensperger F., Hornemann S. Glockshuber R., Riek R., Billeter M., Wuthrich K., Oesch B. Prion (PrPSc)-specific epitope defined by a monoclonal antibody.//Nature. 1997. V.390. P.74-77.

70. Zanusso G., Liu D., Ferrari S., Hegyi I., Yin X., Aguzzi A., Hornemann S., Licmann S.,

71. Glockshuber R., Manson J.C., Brown P., Petersen R.B., Gambetti P., Sy M.S. Prion protein expression in different species: analysis with a panel of new mAbs.// PNAS. 1998. V.95. P.8812-8816.

72. Krasemann S., Groschup M., Hunsmann G., Bodemer W. Induction of antibodies againsthuman prion proteins (PrP) by DNA-mediatcd immunization of PrP0/0 mice.// J. Immunol. Methods. 1996. V.199(2). P.109-118.

73. Krasemann S., Groschup M.H., Harmeyer S. Hunsmann G., Bodemer W. Generation ofmonoclonal antibodies against human prion proteins in PrPO/O mice.// Mol. Med. 1996. V.2(6). P.725-734.

74. Krasemann S., Jurgens Т., Bodemer W. Generation of monoclonal antibodies against prionproteins with an unconventional nucleic acid-based immunization strategy.// J. Biotechnol. 1999. V.73. P.l 19-129.

75. Gregoire S., Logrc C., Metharom P., Loing E., Chomilier J. Rosset M.B., Aucouturier P.,

76. Carnaud C. Identification of two immunogenic domains of the prion protein PrP - which activate class ll-restricted T cells and elicit antibody responses against the native molecule.//J Leukoc Biol. 2004. V. 76(1). P. 125-134.

77. Mehlhom I., Groth D., Stockel J., Moffat B,, Reilly D., Yansura D., Willett W.S., Baldwin

78. M., Fletterick R., Cohen F.E., Vandlen R., Henncr D., Prusiner S.B. High-level expression and characterization of a purified 142-residue polypeptide of the prion protein.// Biochemistry. 1996. V.35(17). P.5528-5537.

79. Weiss S., Famulok M., Edenhofer F., Wang Y.H., Jones I.M., Groschup M., Winnacker E.L.

80. Overexpression of active Syrian golden hamster prion protein PrPc as a glutathione S-transferasc fusion in heterologous systems.// J. Virol. 1995. V.69(8). P.4776^1783.

81. Weiss S., Rieger R., Edenhofer F., Fisch E., Winnacker E.L. Recombinant prion proteinrPrP27-30 from Syrian golden hamster reveals proteinase К sensitivity.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V.219(l). P.173-179.

82. Baron T.G., Betemps D., Groschup M.H., Madec J.Y. Immunological characterization of thesheep prion protein expressed as fusion proteins in Escherichia coli.// FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1999. V.25(4). P.379-384.

83. Foster J.D., Wilson M., Hunter N. Immunolocalisation of the prion protein (PrP) in thebrains of sheep with scrapie.// Vet. Rec. 1996. V. 139(21). P.512-515.

84. Li R., Liu Т., Wong B.S., Pan Т., Morillas M., Swietaicki W., O'Rourke K., Gambetti P.,

85. Surewicz W.K., Sy M.S. Identification of an epitope in the С terminus of normal prion protein whose expression is modulated by binding events in the N terminus.// J. Mol. Biol. 2000. V.301(3). P.567-573.

86. Betemps D., Baron T. Molecular specificities of antibodies against ovine and murinerecombinant prion proteins.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V.281(l). P.101-108.

87. Laffling A.J., Baird A., Birkett C.R., John H.A. A monoclonal antibody that enables specificimmunohistological detection of prion protein in bovine spongiform encephalopathy cases.//Neurosci. Lett. 2001. V.300(2). V.99-102.

88. Thackray A.M., Madec J.Y., Wong E., Morgan-Warren R., Brown D.R., Baron Т., Bujdoso

89. R. Detection of bovine spongiform encephalopathy, ovine scrapie prion-rclated protein (PrPSc) and normal PrPc by monoclonal antibodies raised to copper-refolded prion protein.// Biochem. J. 2003. V.370(Pt 1). P.81-90.

90. Nakamura N., Shuyama A., Hojyo S., Shimokawa M., Miyamoto K., Kawashima Т., Aosasa

91. M., Horiuchi H., Furusawa S., Matsuda H. Establishment of a chicken monoclonal antibody panel against mammalian prion protein.// J. Vet. Med. Sci. 2004. V.66(7). P.807-814.

92. Fcrnandcz-Borges N, Brun A, Whitton JL, Parra B, Diaz-San Segundo F, Salguero FJ,

93. Torres JM, Rodriguez F. DNA vaccination can break immunological tolerance to PrP in wild-type mice and attenuates prion disease after intracerebral challenge.// J. Virol. 2006. V.80(20). P.9970-9976.

94. Barry R.A., Kent S.B., McKinley M.P., Meyer R.K., DeArmond S.J., Hood L.E., Prusiner

95. S.B. Scrapie and cellular prion proteins share polypeptide epitopes.// J. Infect. Dis. 1986. V.153(5). P.848-854.

96. Shinagawa M., Munekata E., Doi S., Takahashi K., Goto H., Sato G. Immunoreactivity of asynthetic pentadecapeptide corresponding to the N-terminal region of the scrapie prion protein.// J. Gen. Virol. 1986. V.67(Pt8). P. 1745-1750.

97. Wiley C.A., Burrola P.G., Buchmeier M.J., Wooddell M.K., Barry R.A., Prusiner S.B.,1.mpert P.W. Immuno-gold localization of prion filaments in scrapie-infected hamster brains.// Lab. Invest. 1987. V.57(6). P. 646-656.

98. Barry R.A., Vincent M.T., Kent S.B., Hood L.E., Prusiner S.B. Characterization of prionproteins with monospecific antisera to synthetic peptides.// J. Immunol. 1988. V.140(4). P.1188-1193.

99. Horiuchi M., Yamazaki N., Ikeda Т., Ishiguro N., Shinagawa M. A cellular form of prionprotein (PrPC) exists in many non-neuronal tissues of sheep.// J. Gen. Virol. 1995. V.76. P.2583-2587.

100. O'Rourke K.I., Baszler T.V., Miller J.M., Spraker T.R., Sadler-Riggleman I., Knowles D.P.

101. Monoclonal antibody F89/160.1.5 defines a conserved epitope on the ruminant prion protein.// J. Clin. Microbiol. 1998. V.36(6). P.1750-1755.

102. Groschup M.H., Pfaff E. Studies on a species-specific epitope in murine, ovine and bovineprion protein.//J. Gen. Virol. 1993. V.74(Pt7). P.1451-1456.

103. Takahashi H., Takahashi R.H., Hasegawa H., Horiuchi M., Shinagawa M., Yokoyama Т.,

104. Kimura K., Haritani M., Kurata Т., Nagashima K. Characterization of antibodies raised against bovine-PrP-peptides.//J. Neurovirol. 1999. V.5(3). P.300-307.

105. Vorberg I., Buschmann A., Harmeyer S., Saalmuller A., Pfaff E., Groschup M.H. A novelepitope for the specific detection of exogenous prion proteins in transgenic mice and transfected murine ccll lines.// Virology. 1999. V.255. P.26-31.

106. Curin Serbee V., Bresjanac M., Popovic M., Pretnar Hartman K., Galvani V., Rupreht R.,

107. Cernilec M., Vranac Т., Hafner I., Jerala R. Monoclonal antibody against a peptide of human prion protein discriminates between Creutzfeldt-Jacob's disease-affected and normal brain tissue.// J. Biol. Chem. 2004. V.279(5). P.3694-3698.

108. Tam J.P. Synthetic peptide vaccine design: synthesis and properties of a high-densitymultiple antigenic peptide system.// PNAS. 1988. V.85. P.5409-5413.

109. Tam J.P. Recent advances in multiple antigen peptides.// J. Immunol. Methods. 1996. V.196.1. P.17-32.

110. Yokoyama Т., Kimura К., Tagawa Y.,Yuasa N. Preparation and characterization ofantibodies against mouse prion protein (PrP) peptides.// Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1995. V.2(2). P. 172-176.

111. Yokoyama Т., Itohara S., Yuasa N. Detection of species specific epitopes of mouse andhamster prion proteins (PrPs) by anti-peptide antibodies.// Arch. Virol. 1996. V. 141(3-4). P.763-769.

112. Arbel M., Lavie V., Solomon B. Generation of antibodies against prion protein in wild-typemice via helix 1 peptide immunization.// J. Neuroimmunol. 2003. V. 144(1-2). P.38-45.

113. Bainbridge J., Jones N., Walker B. Multiple antigenic peptides facilitate generation of antiprion antibodies.// Clin. Exp. Immunol. 2004. V.137(2). P.298-304.

114. Brennan F.R., Dougan G. Non-clinical safety evaluation of novel vaccines and adjuvants:new products, new strategies.// Vaccine. 2005. V.23(24). P.3210-3222.

115. Di Martino A., Bigon E., Corona G., Callegaro L. Production and characterization ofantibodies to mouse scrapie-amyloid protein elicited by non-carrier linked synthetic peptide immunogens.//J. Mol. Recognit. 1991. V.4(2-3). P.85-91.

116. Souan L., Tal Y., Felling Y., Cohen I.R., Taraboulos A., Мог F. Modulation of proteinase-Kresistant prion protein by prion peptide immunization.// Eur. J. Immunol. 2001. V.31. P.2338-2346.

117. Rosset M.B., Ballerini C., Gregoire S., Metharom P., Carnaud C., Aucouturier P. Breakingimmune tolerance to the prion protein using prion protein peptides plus oligodeoxynucleotide-CpG in mice.// J. Immunol. 2004. V. 172(9). P.5168-5174.

118. Вольпина O.M., Титова M.A., Короев Д.О., Волкова Т.Д., Обозная М.Б., Жмак М.Н.,

119. Алексеев Т.А., Цетлин В.И. Получение антител к а7-субъединице никотинового ацетилхолинового рецептора человека с помощью иммуноактивных синтетических пептидов.//Биоорган.химия. 2006. Т. 32(2). С.169-175.

120. Eghiaian F., Grosclaude J., Lesceu S., Debey P., Doublet В., Treguer E., Rezaei H.,

121. Knossow M. Insight into the PrPC->PrPSc conversion from the structures of antibody-bound ovine prion scrapie-susceptibility variants.// PNAS. 2004. V.101(28). P.10254-10259.

122. Peretz D., Williamson R.A., Matsunaga Y., Serban H., Pinilla C., Bastidas R.B.,

123. Rozenshteyn R., James T.L., Houghten R.A., Cohen F.E., Prusiner S.B., Burton D.R. A conformational transition at the N terminus of the prion protein features in formation of the scrapie isoform.// J. Mol. Biol. 1997. V.273. P.614-622.

124. Matsunaga Y., Peretz D., Williamson A., Burton D., Mehlhorn I., Groth D., Cohen F.E.,

125. Prusiner S.B., Baldwin M.A. Cryptic epitopes in N-terminally truncated prion protein are exposed in the full-length molecule: dependence of conformation on pH.// Proteins. 2001. V.44(2). P.110-118.

126. Kanyo Z.F., Pan K.M., Williamson R.A., Burton D.R., Prusiner S.B., Fletterick R.J., Cohen

127. F.E. Antibody binding defines a structure for an epitope that participates in the PrPC->PrPSc conformational change.// J. Mol. Biol. 1999. V.293(4). P.855-863.

128. Sakudo A., Nakamura I., Ikuta K., Onodcra T. Recent developments in prion diseaseresearch: diagnostic tools and in vitro cell culture models.// J. Vet. Med. Sci. 2007. V.69(4). P.329-337.

129. Dumoulin M., Dobson C.M. Probing the origins, diagnosis and treatment of amyloiddiseases using antibodies.// Biochimie. 2004. V.86. P.589-600.

130. Kubler E., Oesch В., Raebcr A.J. Diagnosis of prion diseases.// Br. Med. Bull. 2003. V.66.1. P.267-279.

131. Safar J., Wille H., Itri V., Groth D., Serban H., Torchia M., Cohen F.E., Prusiner S.B. Eightprion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations.// Nat. Med. 1998. V.4(10). P.1157-1165.

132. Ermonval M., Mouillet-Richard S., Codogno P., Kellermann O., Botti J. Evolving views inprion glycosylation: functional and pathological implications. Biochimie. 2003. V.85(l-2). P.33-45.

133. Pan Т., Colucci M., Wong B.S., Li R., Liu Т., Petersen R.B., Chen S., Gambetti P., Sy M.S.

134. Novel differences between two human prion strains revealed by two-dimensional gel electrophoresis.// J. Biol. Chem. 2001. V.276(40). P.37284-37288.

135. Thuring C.M., Erkcns J.H., Jacobs J.G., Bossers A., Van Keulen L.J., Garssen G.J., Van

136. Head M.W., Bunn T.J., Bishop M.T., McLoughlin V., Lowrie S., McKimmie C.S., Williams

137. M.C., McCardle L., MacKenzie J., Knight R., Will R.G., Ironside J.W. Prion protein heterogeneity in sporadic but not variant Creutzfeldt-Jakob disease: UK cases 19912002.// Ann. Neurol. 2004. V.55(6). P.851-859.

138. Notari S., Capellari S., Giese A., Westner I., Baruzzi A., Ghetti В., Gambetti P.,

139. Kretzschmar H.A., Parchi P. Effects of different experimental conditions on the PrPSc . core generated by protease digestion: implications for strain typing and molecular classification of CJD.// J. Biol. Chem. 2004. V.279(16). P. 16797-16804.

140. Schoch G., Seeger H., Bogousslavsky J., Tolnay M., Janzer R.C., Aguzzi A., Glatzel M.

141. Analysis of prion strains by PrPSc profiling in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease.// PLoS Med. 2006. V.3(2, el4). P.0236-0243.

142. Schulz-Schaeffer W.J., Tschoke S., Kranefuss N., Drose W., Hause-Reitner D., Giese A.,

143. Groschup M.H., Kretzschmar H.A. The paraffin-embedded tissue blot detects PrP(Sc) early in the incubation time in prion diseases.// Am. J. Pathol. 2000. V. 156(1). P.51-56.

144. Schmerr M.J., Jenny A. A diagnostic test for scrapie-infected sheep using a capillary electrophoresis immunoassay with fluorescent-labeled peptides.// Electrophoresis. 1998. V.19(3). P.409-414.

145. Schmer M.J., Jenny A.L., Bulgin M.S., Miller M.J., Hamir A.N., Cutlip R.C., Goodwin

146. K.R. Use of capillary electrophoresis and fluorescent labeled peptides to detect the abnormal prion protein in the blood of animals that are infected with a transmissible spongiform encephalopathy.// J. Chromatogr. A. 1999. V.853. P.207-214.

147. Jackman R., Everest D.J., Schmerr M.J., Khawaja M., Keep P., Docherty J. Evaluation of apreclinical blood test for scrapie in sheep using immunocapillary electrophoresis. J. AOAC Int. 2006. V.89(3). V.720-727.

148. Dormont D. Approaches to prophylaxis and therapy.// Br. Med. Bull. 2003. V.66. P.281- .292.

149. Schenk D., Barbour R., Dunn W., Gordon G., Grajeda H., Guido Т., Ни K., Huang J.,

150. Horiuchi M., Caughey B. Specific binding of normal prion protein to the scrapie form via alocalized domain initiates its conversion to the protease-resistant state.// EMBO J. 1999. V.18(12). P.3193-3203.

151. Kascsak R.J., Rubenstein R., Merz P.A., Tonna-Demasi M., Fersko R., Carp R.I., Wisniewski H.M., Diringer H. Mouse polyclonal and monoclonal antibody to scrapie-associated fibril proteins.//J. Virol. 1987. V.61(12). P.3688-3693.

152. Enari M., Flechsig E., Weissmann C. Scrapie prion protein accumulation by scrapie-infected neuroblastoma cells abrogated by exposure to a prion protein antibody.// PNAS. 2001. V.98(16). P.9295-9299.

153. Perrier V., Solassol J., Crozet C., Frobert Y., Mourton-Gilles C., Grassi J., Lehmann S.

154. Anti-PrP antibodies block PrPSc replication in prion-infected cell cultures by accelerating PrPC degradation.// 2004. J. Neurochem. V.89. P.454-463.

155. Demart S., Fournier J.G., Creminon C., Frobert Y., Lamoury F., Marce D., Lasmezas C.,

156. Dormont D., Grassi J., Deslys J.P. New insight into abnormal prion protein using monoclonal antibodies.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V.265(3). P.652-657.

157. Kim C.L., Umetani A., Matsui Т., Ishiguro N., Shinagawa M., Horiuchi M. Antigeniccharacterization of an abnormal isoform of prion protein using a new diverse panel of monoclonal antibodies.// Virology. 2004. V.320(l). P.40-51.

158. Kim C.L., Karino A., Ishiguro N., Shinagawa M., Sato M., Horiuchi M. Cell-surface retention of PrPC by anti-PrP antibody prevents protease-resistant PrP formation.// J. Gen. Virol. 2004. V.85(Ptll). P.3473-3482.

159. Beringue V., Vilette D., Mallinson G., Archer F., Kaisar M., Tayebi M., Jackson G.S.,

160. Clarke A.R., Laude H., Collinge J., Hawke S. PrPSc binding antibodies are potent inhibitors of prion replication in cell lines.// J. Biol. Chem. 2004. V.279(38). P.39671-39676.

161. Beringue V., Mallinson G., Kaisar M., Tayebi M., Sattar Z., Jackson G., Anstee D., Collinge J., Hawke S. Regional heterogeneity of cellular prion protein isoforms in the mouse brain.// Brain. 2003. V.126(Pt9). P.2065-2073.

162. Vilette D., Andreoletti O., Archer F., Madelaine M.F., Vilotte J.L., Lehmann S., Laude H.

163. Ex vivo propagation of infectious sheep scrapie agent in heterologous epithelial cells expressing ovine prion protein. PNAS. 2001. V.98(7). P.4055-4059.

164. Sabuncu E., Petit S., Le Dur A., Lan Lai Т., Vilotte J.L., Laude H., Vilette D. PrP polymorphisms tightly control sheep prion replication in cultured cells.// J. Virol. 2003. V.77(4). P.2696-2700.

165. Feraudet C, Morel N, Simon S, Volland H, Frobert Y, Creminon C, Vilette D, Lehmann S,

166. Grassi J. Screening of 145 anti-PrP monoclonal antibodies for their capacity to inhibit PrPSc replication in infected cells.// J. Biol. Chem. 2005. V.280(12). P.l 1247-11258.

167. Pankiewicz J., Prelli F., Sy M.S., Kascsak R.J., Kascsak R.B., Spinner D.S., Carp R.I.,

168. Meeker H.C., Sadowski M., Wisniewski T. Clearance and prevention of prion infection in cell culture by anti-PrP antibodies.// Eur. J. Neurosci. 2006. V.23(10). P.2635-2647.

169. Tal Y., Souan L., Cohen I.R., Meiner Z., Taraboulos A., Мог F. Complete Freund'sadjuvant immunization prolongs survival in experimental prion disease in mice.// J. Neurosci. Res. 2003. V.71(2). P.286-290.

170. Heppner F.L., Musahl C., Arrighi I., Klein M.A., Rulicke Т., Oesch В., Zinkernagel R.M.,

171. Kalinke U., Aguzzi A. Prevention of scrapie pathogenesis by transgenic expression of anti-prion protein antibodies.// Science. 2001. V.294. P.178-182.

172. White A.R., Enever P., Tayebi M., Mushens R., Linehan J., Brandner S., Anstee D.,

173. Collinge J., Hawke S. Monoclonal antibodies inhibit prion replication and delay the development of prion disease.// Nature. 2003. V.422. P.80-83.

174. Liu Т., Zwingman Т., Li R., Pan Т., Wong B.S., Petersen R.B., Gambetti P., Herrup K., Sy

175. M.S. Differential expression of cellular prion protein in mouse brain as detected with multiple anti-PrP monoclonal antibodies.// Brain Res. 2001. V.896(l-2). P.l 18-129.

176. Sigurdsson E.M., Sy M.S., Li R., Scholtzova H., Kascsak R.J., Kascsak R., Carp R., Meeker H.C., Frangione В., Wisniewski T. Anti-prion antibodies for prophylaxis following prion exposure in mice.// Neurosci. Lett. 2003. V.336(3). P.185-187.

177. Adler V., Zcller В., Kryukov V., Kascsak R., Rubenstein R., Grossman A. Small, highly ■structured RNAs participate in the conversion of human recombinant Prp (Sen) to Prp (Res) in vitro.//J. Mol. Biol. 2003. V.332. P.47-57.

178. Sigurdsson E.M., Brown D.R., Daniels M., Kascsak R.J., Kascsak R., Carp R., Meeker

179. H.C., Frangione В., Wisniewski T. Immunization delays the onset of prion disease in mice.// Am. J. Pathol. 2002. V.161(l). P.13-17.

180. Koller M.F., Grau Т., Christen P. Induction of antibodies against murine full-length prionprotein in wild-type mice.// J. Ncuroimmunol. 2002. V.132(l-2). P.l 13-116. '

181. Polymenidou M., Heppner F.L., Pellicioli E.C., Urich E., Miele G., Braun N., Wopfner F.,

182. Schatzl H.M., Bechcr В., Aguzzi A. Humoral immune response to native eukaryotic prion protein correlates with anti-prion protection.// PNAS. 2004. V.101(Suppl.2). P. 1.467014676.

183. Andrievskaia O., McRae H., Elmgren C., Huang H., Balachandran A., Nielsen K. Generation of antibodies against bovine recombinant prion protein in various strains of mice.// Clin. Vaccine Immunol. 2006. V.13(l). P.98-105.

184. Ishibashi D., Yamanaka H., Yamaguchi N., Yoshikawa D., Nakamura R., Okimura N.,

185. Yamaguchi Y., Shigematsu K., Katamine S., Sakaguchi S. Immunization with recombinant bovine but not mouse prion protein delays the onset of disease in mice inoculated with a mouse-adapted prion.// Vaccine. 2007. V.25(6) P.985-992.

186. Purcell A.W., McCluskey J., Rossjohn J. More than one reason to rethink the use ofpeptides in vaccine design.//Nat. Rev. Drug. Discov. 2007. V.6(5). P.404-414.

187. Schwarz A., Kratke O., Burwinkel M., Riemer C., Schultz J., Henklein P., Bamme Т.,

188. Baicr M. Immunisation with a synthetic prion protein-derived peptide prolongs survival times of mice orally exposed to the scrapie agent.// Neurosci. Lett. 2003. V.350(3). P. 187189.

189. Magri G, Clerici M, DaH'Ara P, Biasin M, Caramelli M, Casalone C, Giannino ML, Longhi

190. Smith C.J., Drake A.F., Banfield B.A., Bloomberg G.B., Palmer M.S., Clarke A.R., Collinge J. Conformational properties of the prion octa-repeat and hydrophobic sequences.//FEBS Lett. 1997. V.405. P.378-384.

191. Вольпина O.M., Титова M.A., Жмак M.H., Короев Д.О., Обозная М.Б., Волкова Т.Д.,

192. Иванов В.Т. Предсказание структуры пептидов, способных индуцировать образование антител у мышей.// Биоорган.химия. 2002. Т. 28(5). С.387-395.

193. Sant'Angelo D.B., Robinson Е., Janeway С.A. Jr., Denzin L.K. Recognition of core andflanking amino acids of MHC class II-bound peptides by the T cell receptor.// Eur. J. Immunol. 2002. V.32(9). P.2510-2520.

194. Ertmcr A., Gilch S., Yun S.W., Flechsig E., Klebl В., Stein-Gerlach M., Klein M.A.,

195. Schatzl H.M. The tyrosine kinase inhibitor STI571 induces cellular clearance of PrPSc in prion-infected cells.// J. Biol. Chem. 2004. V.279. P.41918-41927.

196. Jeffrey M., Halliday W.G., Goodsir C.M. A morphometric and immunohistochemical studyof the vestibular nuclear complex in bovine spongiform encephalopathy.// Acta Neuropathol. 1992. V.84. P.651-657.

197. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity.//Nature. 1975. V.256 (5517). P.495-497.

198. Rosenberg A.S. Effects of protein aggregates: an immunologic perspective.// AAPS J.2006. V.8(3). E501-E507.

199. Pan Т., Chang В., Wong P., Li C., Li R., Kang S.C., Robinson J.D., Thompsett A.R., Tein

200. Apsalons U., Bichko V. The affinities of monoclonal antibodies against core antigen of .hepatitis В virus.//Arch. Virol. 1994. V.l34(3-4). P.393-402.

201. Вольпина O.M., Жмак M.H., Обозная М.Б., Титова М.А., Короев Д.О., Волкова Т.Д.,

202. Егоров А.А., Рыбаков С.С., Иванов В.Т. Антитела против синтетических фрагментов прионного белка для диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота.// Биоорган, химия. 2001. Т.27. С.352-358.

203. Обозная М.Б., Вольпина О.М., Жмак М.Н., Титова М.А., Волкова Т.Д., Егоров А.А.,

204. Рыбаков С.С., Иванов В.Т. Индукция иммунного ответа синтетическими фрагментами прионного белка и их аналогами у мышей разных линий.// Биоорган. Химия. 2004. Т.30(4). С.356-363.

205. Proske D., Gilch S., Wopfcer F., Schatzl H.M., Winnacker E.L., Famulok M. Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation.// Chem. Bio. Chem. 2002. V.3. P.717-725.

206. Lowry O.H., Rosenbrough N.Y., Farr A.H., Randall R.G. Protein Measurement with the

207. Folin Phenol Reagent.// J. Biol. Chem. 1951. V.193. P.265-275.

208. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970. V.227. P.680-685.

Информация о работе

Обозная, Мария Борисовна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Антитела против синтетических пептидных фрагментов прионного белка для выявления клеточного приона и его патогенной изоформы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Антитела против синтетических пептидных фрагментов прионного белка для выявления клеточного приона и его патогенной изоформы - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы