Характеристика рекомбинантного прионного белка крупного рогатого скота (Bos taurus) и разработка методов выявления патологической изоформы прионов

Покидышев, Алексей Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика рекомбинантного прионного белка крупного рогатого скота (Bos taurus) и разработка методов выявления патологической изоформы прионов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика рекомбинантного прионного белка крупного рогатого скота (Bos taurus) и разработка методов выявления патологической изоформы прионов"

На правах рукописи

□03484447

Покидышев Алексей Николаевич

ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ПРИОННОГО БЕЛКА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (BOS TAURUS) И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКОЙ ИЗОФОРМЫ

ПРИОНОВ

03.00.03 - молекулярная биология 03.00.04 - биохимия

2 6 НОЯ 2009

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003484447

Работа выполнена в лаборатории структуры и морфогенеза вирусов Учреждения Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН» и ЗАО «Научно-производственное объединение НАРВАК».

Научные руководители:

доктор биологических наук Григорьев Владимир Борисович

кандидат биологических наук Кальнов Сергей Леонидович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Гараев Мансур Мухамедович

доктор медицинских наук, профессор Зуев Виктор Абрамович

Ведущая организация:

ФГУ «Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова»

Защита диссертации состоится «0% декабря 2009 года в /Му часов на заседании диссертационного совета Д 00.020.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН», по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН».

Автореферат разослан « Об» ноября 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

Е.И. Бурцева

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Трансмиссивные губкообразные энцефалопатии (ТГЭ) являются особым классом нейродегенеративных болезней, встречающихся как у человека, так и у животных. В настоящее время, гипотеза о том, что инфекционным агентом, вызывающем ТГЭ, является только аномальная изоформа клеточного белка организма-хозяина, является общепринятой, а выделенный инфекционный агент был назван прионом (Prusiner S.B., 1982; Prusiner S.B. et al., 1990).

Считается установленным, что возникновение и развитие летальных прионных болезней связано с изменением конформации нормального белка организма (РгРс), индуцированным внедрением экзогенного аномального приона (PrPd) или аналогичной прионной частицей, образовавшейся в организме спорадически, с последующим необратимым накоплением патогенных белковых изоформ (Prusiner S.B., 1998). Однако фактически неизученными остаются механизмы индуцированного и спонтанного конформационных переходов, наблюдаемых при прионных инфекциях. Выделенные «штаммы» прионных белков, указывают на множественность возможных конформационных состояний прионов, стабилизирующихся в результате образования характерных для ТГЭ белковых агрегатов - фибрилл (Sigurdson C.J., et al., 2007). Аналогичные агрегаты гетерологичных прионам белков, также были зарегистрированы в живых организмах (в том числе при развитии амилоидозов) или получены in vitro (Gruys Е. 2004; Lachmann H.J., 2006). Последнее наблюдение даёт основание относиться к данному явлению как к достаточно распространенному, но малоизученному варианту фолдинга белков.

За последние несколько лет появились данные о возможности обнаружения патогенной конформации прионного белка практически в любом органе и ткани пораженного организма, доказано выделение инфекционного агента с молоком, слюной, мочой (Mathiason С.К., 2006). В этой связи, существенный интерес представляет собой исследование возможности внутри- и межвидовой трансмиссии заболевания.

Использование рекомбинантных прионных белков или их фрагментов является удобным методом изучения механизмов, происходящих при конверсии белков, мутаций, индуцирующих возникновение заболевания, возможности межвидовой трансмиссии. Кроме того, в настоящее время, для разработки всех вариантов тест-систем (основанных на иммунологическом анализе), выявляющих возбудителей ТГЭ, необходимы рекомбинантные аналоги нативных прионных белков.

Очевидно также, что моноклональные антитела (МКА) являются фактически единственным инструментом, пригодным для диагностики прионных инфекций в целом. Полученные на сегодняшний день моноклональные антитела не позволяют проводить прямую дифференциацию изоформ прионных белков, что приводит к необходимости использовать дополнительные этапы обработки проб, элиминируя «неинфекционные» молекулы. Таким образом, получение новых моноклональных антител к прионным белкам является актуальной задачей, решение которой позволит разрабатывать новые методы выявления патогенных прионных белков, в том числе и для прижизненной диагностики ТГЭ.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы являлась разработка системы, in vitro моделирующей конформационные изменения прионных белков при ТГЭ и методов выявления патологической изоформы прионов.

Для достижения поставленных целей были определены следующие задачи:

1. Разработать технологию и получить рекомбинантный фрагмент прионного белка.

2. Изучить возможность самоорганизации рекомбинантного прионного белка в амилоидоподобные структуры in vitro.

3. Оценить влияние различных факторов на процесс изменения конформаций рекомбинантного прионного белка in vitro.

4. Определить иммуногенность полученного рекомбинантного прионного белка

5. Получить гибридомные клеточные линии, стабильно продуцирующие моноклональные антитела к рекомбинантному прионному белку.

6. Определить иммунологическую активность, специфичность и иммунохимические свойства полученных моноклональных антител.

7. Апробировать рекомбинантный антиген и МКА в качестве иммунодиагностических реагентов в различных методах выявления патологической изоформы прионов

Научная новизна и практическая значимость работы. Разработана технология получения и очистки рекомбинантного фрагмента прионного белка крупного рогатого скота (КРС). Разработаны подходы к получению различных конформаций данного рекомбинантного белка, представлены доказательства, подтверждающие структурную гомологию фибрилл РгР, наблюдаемых при ТГЭ, и агрегатов, образуемых рекомбинантным фрагментом прионного белка.

Получена панель моноклональных антител к рекомбинантному фрагменту прионного белка КРС. Выделены клоны МКА, способные к специфическому связыванию с инфекционными изоформами прионных белков человека и животных. Разработаны подходы к диагостике ТГЭ человека и животных с использованием полученных моноклональных антител.

Основные положения выносимые на защиту:

- результаты экспериментов по изучению молекулярно-биологических свойств рекомбинантного фрагмента прионного белка крупного рогатого скота

- иммунохимическая характеристика МКА к rBovPrP( 102-240)

- методологические подходы к выявлению патологической изоформы прионов с использованием рекомбинантного антигена и моноклональных антител

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и опубликованы в материалах 2-го семинара Научно-консультационного комитета МНТЦ «Борьба с глобальными инфекциями» (г. Иркутск, 2009), 2 -го Международного конкурса научных работ молодых учёных в области нанотехнологий (в рамках форума Rusnanotech-2009, г. Москва, 2009), международных конференций «Prion 2007» (г. Эдинбург, Великобритания), «Prion 2008» (г. Мадрид, Испания), «Prion 2009» (г. Салоники, Греция), а также доложены

на 1-ой ежегодной научной конференции молодых учёных НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского (г. Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 (и одна принята к печати) научные работы, в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Опубликовано 7 тезисов научных докладов на российских и международных конференциях.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка цитированной литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 6 таблицами и 46 рисунками. Список литературы включает 255 источников (20 отечественных и 235 зарубежных авторов).

Собственные исследования

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Бактерии. В работе были использованы следующие штаммы Escherichia coli: Top 10, BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21 trxB(DE3)pLysS, Origami(DE3). Tuner(DE3). Rosetta(DE3) (Novagen, США), СЦ и C43 (Miroux В, Walker JE (1996)) [подчёркнутые штаммы E.coli, были любезно предоставлены к.б.н. А.г. Прилиповым (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского)].

Моноклональные антитела. В работе использованы моноклональные антитела 6Н4 (Prionics, США) и SAF32 (Cayman Chem., США) специфичные прионным белкам большого количества млекопитающих, включая КРС и человека; моноклональные антитела к IgG мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США).

Олигонуклеотиды. Для амплификации фрагмента гена прионного белка КРС использовали олигонуклеотиды:

ВашШ

bovPRNP-304-F: 5'- gtgg gga тсс ggg тса agg tgg tac с-3'

Hindlll

bovPRNP-720-R: 5'- tcac aag стт ссс tcg тгс gta ata agc c-3'

Наличие сайтов рестрикции для эндоиуклеаз (BamHI и HindIII) в олигонуклеотидах, обеспечило возможность осуществления встраивания амплифицированной последовательности в донорную плазмиду рЕТ23Ь+. Цитирование проводили в течение ночи при 16°С с лигазой Т4 (Fermentas, Литва).

Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli. Полученные клоны проверяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рестрикционным анализом. Положительные по рестрикционному анализу клоны использовали для секвенирования клонированной нуклеотидной последовательности.

Наработку рекомбинантного белка осуществляли с использованием системы экспрессии E.coli рЕТ (Novagen, США). Трансформацию экспрессионного штамма E.coli рекомбинантной плазмидой и индукцию проводили согласно стандартным методикам (Sambrook et al., 1989).

Анализ уровня экспрессии рекомбинантного белка в E.coli и степени чистоты очищенных препаратов белка проводили методом ступенчатого электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (Laemmli U.K., 1970). Локализацию белковых зон после их разделения определяли, используя стандартную процедуру их окрашивания красителем Кумасси ярко-голубой R-250 или, осуществляя окрашивание серебром, согласно методике фирмы производителя набора "Silver Stainig Kit" (Sigma, США).

Очистку рекомбинантных продуктов проводили методом металло-аффинной хроматографии, согласно методике изготовителя Ni-нитрилацетат агарозы (Qiagen, США).

Для определения антигенной активности рекомбинантного белка, а также специфичности полученных МКА, применяли метод иммуноблоттинга. Белки, после разделения ДСН-электрофорезом в ПААГ, переносили на мембрану поливинилиденфторида ("Immobilon-P", PVDF Membrane, Millipore, США) в полусухой буферной системе (Kyhse- Andersen, 1984). Иммунохимическое окрашивание полученных реплик осуществляли с помощью непрямого варианта ИФА, с соблюдением всех его стадий.

При выполнении работы использовали прямой, непрямой и «сэндвич» варианты твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Во всех случаях применяли плоскодонные полистироловые 96-луночные микропанели (Grainer, Германия).

Сорбцию белковых препаратов в лунках микропанелей проводили в выбранном разведении, в ОДМ карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,6 (100 мкл/лунку), в течение 18 часов при +4°С. Свободные участки пластика блокировали, внося в каждую лунку по 150 мкл 1% раствора гидролизата желатина ("TopBlock", Gerbu, Германия) в 10 мМ фосфатно-солевом буфере (ФСБ; 10 мМ фосфатный буфер, 170 мМ NaCI, рН 7,4). На последующих этапах, в зависимости от варианта постановки ИФА, в лунки планшет вносили испытуемые препараты рекомбинантного белка, специфичных антител, или антител, конъюгированных с ферментной меткой -пероксидазой хрена (ПХ). Для определения эффективности связывания конъюгированных с ПХ антител использовали коммерческие препараты 3,3', 5, 5' -тетраметилбензидин и перекись водорода (Н202) (МДЛ, Россия). Реакцию останавливали через 15 минут, добавлением в лунки по 50 мкл 1М серной кислоты. Результаты реакции оценивали, используя планшетный спектрофотометр (Multiscan EX, Thermo, США) при длине волны 450 нм, по коэффициенту оптического поглощения (ОП 450). Перед внесением внесением каждого последующего компонента, осуществляли 4-кратное промывание лунок микропанели раствором ФСБТ (фосфатно-солевой буфер с Tween 20; 10 мМ фосфатный буфер, 170 мМ NaCI, 0,001 об.% Tween 20, рН 7,4).

Исследование процесса образования рекомбинантным фрагментом прионного белка фибрилл, проводили, инкубируя реакционную смесь объёмом 200 мкл в круглодонных микропанелях (Grainer, Германия), при температуре +37°С и перемешивая на орбитальном планшетном шейкере (Elmi, Финляндия).

Исследование морфологии образующихся агрегатов, проводили при помощи электронной микроскопии с использованием метода негативного контрастирования образцов 2% водным раствором уранилацетата. При подготовке препаратов для микроскопии использовали медные сеточки-подложки, покрытые формвар-углеродной пленкой и обработанных в тлеющем разряде. Абсорбцию и

контрастирование препаратов на сеточке-подложке осуществляли согласно стандартной методике (\Vurtz М., 1989). Микроскопию и документирование результатов выполняли с использованием электронного микроскопа ШОЬ ЮОБ.

Для обработки проб протеиназой К, анализируемые препараты разбавляли 0,1 М Тт-НО буфером, содержащем 10 мМ Са++, рН 7,4, до концентрации мочевины (или гуанидин гидрохлорида) 1М, а затем вносили протеиназу К (молярное соотношение рекомбинантного белка и фермента составляло 50:1). Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 1 часа, после чего фермент ингибировали, внесением фенилметилсульфонилфторида (РМвБ), с последующим выполнением пробоподготовки для ДСН-электрофореза в ПААГ и электронной микроскопии.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1 Выбор фрагмента гена прионного белка для экспрессии в клетках Е.соН

После проведения анализа аминокислотных последовательностей прионного белка у различных видов животных, установлено, что прионный белок высоко консервативен среди позвоночных.

Литературные данные позволили выделить следующие элементы, характерные для прионных белков позвоночных:

1. Наличие сигнальных последовательностей на Ы- и С- концах молекулы;

2. Наличие 5-6 аминокислотных октаповторов на Ы-конце «зрелой» молекулы РгРс, последовательность данного региона у позвоночных организмов практически не изменяется.

3. Две точки Ы-гликозилирования, расположенные вблизи С-конца «зрелой» молекулы РгРс (Абп1 81 Аэп 197, для прионного белка человека);

4. Обработка инфекционных изоформ прионных белков протеиназой К приводит к образованию белковых агрегатов, состоящих из С-концевых фрагментов прионного белка;

5. Максимальная степень изменчивости прионных белков приходится на С-концевую половину молекулы, что, учитывая существование явления межвидового барьера при трансмиссии ТГЭ и наличие штаммов

инфекционных белков, может подтверждать гипотезу о ключевой роли данного участка молекулы в процессе приобретения ею патогенной конформации;

6. Ряд двухвалентных катионов стабилизируют нативную конформац молекулы, взаимодействуя с областью октаповторов. Введение подобн ионов в реакционную смесь, при получении протеиназорезистенть конформаций прионных белков, резко ингибирует данный процесс.

Вышеуказанные факты позволили нам сделать вывод о целесообразно! получения рекомбинантного фрагмента прионного белка, лишенного регю октаповторов. Учитывая то, что в настоящее время губкообразная энцефалопа-крупного рогатого скота остаётся малоизученной, но вместе с тем шире распространённой ТГЭ, для клонирования в плазмидный вектор использов; фрагмент нуклеотидной последовательности гена PRNP крупного рогатого сю (Bos taurus) соответствующий последовательности прионного белка со 102 по \ аминокислоту).

2.2 Создание гениоинженерной конструкции для экспрессии фрагмента гена прионного белка крупного рогатого скота (Bov-PRNP) в клетках Е. coli

Амплификация клонируемой последовательности. Для проведения ПЦР бь использованы праймеры bovPrP304-F и bovPrP720-R. В качестве матрицы г амплификации целевого фрагмента PRNP использовали рекомбинантн плазмидный вектор pIRES-Neo/Bovine-PrP, содержащий ген прионного 6ej крупного рогатого скота, любезно предоставленный д.б.н. Григорьевым В.Б. (CI Франция)

Анализ продуктов ПЦР методом элетрофореза в агарозном геле позвох установить, что в результате амплификации были получены фрагменты Д] ожидаемого размера - 438 н.п.

Обработанный рестриктазами (EcoRI и HindHI) амплифицированный фрагме ДНК лигировали по липким концам с донорной плазмидой рЕТ23Ь+ (так обработанной аналогичными рестриктазами).

Лигазной смесью трансформировали клетки E.coli Тор 10 (Invitrogene). Трансформированные электропорацией бактериальные клетки высевали на селективный LB-arap (содержащий ампициллин 100 мкг/мл). Выборочные клоны пересевали на свежий селективный LB-arap и проверяли на наличие плазмиды со специфической вставкой методом ПЦР, с использованием клонировочных олигонуклеотидов.

При проведении рестрикционного анализа, обнаружено, что все 4 полученные плазмиды имеют в своём составе вставку требуемого размера.

Секвенированием было установлено, что последовательности содержащиеся в отобранных клонах плазмид идентичны и соответствуют фрагменту прионного белка КРС со 102 по 240 а.о. (выполнено совместно с аспирантом НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского А.Г.Южаковым).

2.3 Экспрессия фрагмента прионного белка крупного рогатого скота в клетках E.coli

С целью подбора оптимальных условий для получения рекомбинантного белка, были протестированы различные экспрессионные штаммы E.coli.

Трансформации вектором подвергали химически компетентные клетки E.coli следующих штаммов: BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21trxB(DE3)pLysS, Origami(DE3), Tuner(DE3), Rosetta(DE3) (все Novagen, США), C41 и С43 (Miroux В, Walker JE (1996)). Свежие колонии вышеперечисленных штаммов, трансформированных рекомбинантными плазмидами, были использованы для проведения индукции с добавлением индуктора - изопропил-ß-D-l-тиогалактопиранозида (ИПТГ), до конечной концентрации 0,4 мМ. Синтез белков контролировали методом ДСН-электрофореза в ПААГ. Полученные данные свидетельствуют о накоплении в трансформированных клетках значительного количества белка с молекулярной массой около 19 кДа, что соответствует расчётной массе экспрессируемого полипептида. Его соответствие фрагменту прионного белка подтвердили результаты иммуноблоттинга (рис. 2) с антителами 6Н4 (Prionics, США), специфичным прионным белкам человека и животных. Анализ белкового состава клеток до и после индукции методом ДСН-электрофореза в ПААГ позволил

установить, что наивысший уровень экспрессии целевого полипептида происходи клетках ВЬ-2ИгхВ(БЕЗ)рЬу88.

Собранные центрифугированием клетки Е.соИ использовали для выделе! рекомбинантного белка методом металло-аффинной хроматографии.

2.4. Очистка и иммунохимическая характеристика рекомбинантного фрагмента прионного белка КРС (гВоуРгР(102-240)).

Наличие на карбоксильном конце молекулы привнесенной последовательное из 6 аминокислотных остатков гистидина (His-tag) (рис. 1), позволило производи высокоэффективную очистку металло-аффинной хроматографией, в основе кото{ лежит возможность образования прочной хелатной связи между иона №2 ^иммобилизованным на сорбенте и гетероциклами имидазола в сост. гистидиновых остатков белка.

Очистку проводили в денатурирующих условиях (присутствие мочевины концентрации 8М), так как при экспрессии рекомбинантного фрагмента бактериальных клетках наблюдалось образование агрегатов белка (те; включений), нерастворимых в отсутствии денатурирующих агентов. Соглас методике производителя сорбента, сорбцию белка на №-нитрилацетат-агар< проводили при рН 8,0, элюцию неспецифически связанных с сорбентом белков г рН 6,3, а элюцию целевого белка при рН 4,5.

ВОУРГР (102-240)

бхЫэ гад

-МАЗМТевО<2М вм>рвс>ввтн вОКЫКРЭКРК ТЫМКНУАбАА

ААвАУУвОХЛЗ ЗУМИЗЗАМБК РГЛНГЗЗОУЕ ОЕУУЕЕНМКЕ

УРЫОУУУИРУ ООУЗЫОМГУ НРСУШТУКЕ НТУТТТТКвЕ

NГТЕТРIКММ ЕИУУЕОИСТТ ОУОИЕЗОАУУ ОРОКЬАААЬЕ

нннннн-(соон)

Рисунок 1. Структура рекомбинантного белка гВоуРгР(102-240).

А. - расположение привнесенных последовательностей относительно

фрагмента прионного белка (выделены цветом); Б. - первичная последовательность гВоуРгР( 102-240) (различные функциональные участки молекулы выделены цветом).

Элюцию целевого белка с сорбента определяли по активности получаемых фракций в непрямом варианте ИФА, с использованием МКА 6Н4, специфичным прионным белкам большинства млекопитающих. Основная доля рекомбинантного белка прочно связывалась с сорбентом вплоть до значения рН = 5,5, что позволило получить очищенные препараты рекомбинантного белка при проведении одностадийной процедуры очистки (рис. 2).

Высокий уровень экспрессии изучаемого рекомбинантного белка, а также наличие привнесенных последовательностей обеспечивших возможность осуществлять высокоэффективную процедуру очистки позволило добиться высокого выхода очищенного рекомбинантного белка с единицы массы бактериальных клеток (до 15 мг/г).

Рисунок 2.

Рекомбинантный фрагмент прионного белка КРС:

1 - экспрессия rBovPrP( 102-240) в клетках

Е. coli BL21trxB(DE3)pLysS;

2 - специфическое связывание МКА 6Н4 (Prionics)

с rBovPrP( 102-240) в лизате клеток Е. coli BL-21trxB(DE3)pLysS;

3 - очищенный препарат rBovPrP( 102-240))

(1 и 3 - ДСН-электрофорез в 12% ПААГ, окрашивание Кумасси ярко синий R-250; 2 - иммуноблот, МКА 6Н4)

исследователями было установлено, что ряд двухвалентных катионов может в значительной мере изменять способность рекомбинантных прионных белков к формированию амилоидоподобных агрегатов. Поэтому, при очистке белка особое внимание уделяли сохранению целостности сорбента, и минимизации ко-элюции ионов никеля. Для этого применяли низкие скорости тока элюента совместно с использованием свежих сорбентов и малыми размерами хроматографических колонок, что благодаря высокой ёмкости применяемой нитрилацетат агарозы и высокой доле целевого белка в общем клеточном,

Различными

позволило получить высококонцентрированные препараты рекомбинантного бел максимально-свободные от примесей Ni+2.

2.5. Определение молекулярной массы и чистоты полученного препар; рекомбинантного белка.

Для определения гомогенности получаемого препарата, проводили изуче! белкового состава полученных при очистке фракций, показавших наивысш активность в непрямом ИФА, методом ДСН-электрофореза в ПААГ. Окрашива! белков в составе геля осуществляли с использованием красителя Кума( бриллиантовый синий R-250 (рис. 2), а также применяя окрашивание бел! серебром (рис. 9).

Кроме того, молекулярная масса и гомогенность получаемого препарата 6ej были исследованы методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Данная работа бь выполнена совместно с аспиранткой МГУ им. М.В.Ломоносова Сафиевой Д.О., г руководством д.х.н., проф. И.Н. Курочкина и д.х.н., проф. С.Д. Варфоломеева, базе НИИ биохимической физики им. Н.М. Эммануэля, РАН. При проведен экспериментов была определена точная масса рекомбинантного белка - 18,64 кД, также детектировано незначительное содержание в пробе молекул массой 37,15 i являющихся, по-видимому, димерами rBovPrP( 102-240), образованны межмолекулярными дисульфидными связями.

2.6 Характристика процессов происходящих при самоорганизации фибрилл рекомбинантного прионного белка in vitro.

Проведенные эксперименты позволили выявить следующие закономерности формировании сложных агрегатов рекомбинантного прионного белка.

При быстром снижении концентрации хаотропных агентов (мочеви! гуанидин гидрохлорид <1 М) и значении рН < 6,0, белок не образует агрегат детектируемых электронной микроскопией (негативное контрастирование), формируемая им изоформа, не проявляет резистентности к обработке протеиназ К. Значения рН > 6,0, стимулируют образование протеиназолабильным белк (мономером РгР) крупных аморфных агрегатов (электронная микроскоп] негативное контрастирование).

По видимому, в данных условиях происходит формирование изоформы белка богатой альфа-спиральными участками, и аналогичной РгРс.

Незначительное снижение концентрации хаотропных агентов, относительно обеспечивающих денатурированное состояние молекулы белка, приводит к формированию изоформ гВоуРгР( 102-240), проявляющих высокую резистентность к воздействию протеиназы К и формирующих агрегаты в виде фибрилл. При этом свойства и динамика образования получаемых структур в значительной степени зависят от исходной концентрации белка в растворе, температуры реакционной смеси, значения рН, условий инкубации.

В частности, при инкубации белка (20мкМ) в 0,05М Ыа-ацетатном буфере (рН 4,5) в присутствии мочевины (4М), через 24 ч были обнаружены тонкие протофибриллы (ПФ) диаметром около 8нм и длиной до 5мкм, представлявшие собой спирали с шагом между витками 6 нм. ПФ формировали пучки, состоящие из 3-5 гибких ПФ, которые перекручивались между собой (рис. 3 и 4).

В образцах после 48 ч инкубации, наряду с увеличивающимся количеством ПФ, регистрировали компактные фибриллы диаметром около 12 нм и длиной до 4 мкм, в которых вышеуказанная периодичность не выявлялась (рис. 4). Вероятно, этот тип фибрилл образуется в результате плотного скручивания пучка ПФ.

Начиная с 3 суток инкубации, наблюдали образование коротких ригидных фибрилл диаметром 16-25 нм и длиной 80-160 нм. Однако структура последних отличалась от структуры как ПФ, так и от структуры длинных фибрилл, скрученных в пучки. Они представляли собой либо короткие единичные, либо две неплотно скрученные лентообразные фибриллы, обладавшие высокой степенью полиморфизма (рис. 5-1). По-видимому, данный тип агрегатов образуется в результате фрагментации латерально ассоциированных плотноскрученных пучков протофибрилл.

При дальнейшей инкубации (до 10 суток), короткие фибриллы образовывали крупные агрегаты (рис. 5-2), морфологически сходных скоплениям фибриллами прионного белка, регистрируемым в амилоидных бляшках при ТГЭ.

Рисунок 3. Электронограмма пучка гибких протофибрилл образованных гВоуРгР(102-240).

Рисунок 4. Электронограмма гибких протофибрилл образованных гВоуРгР(1 02-240), а также более крупных фибрилл образовавшихся в результате плотного скручивания протофибрилл.

Рисунок 5.

1) Электронограмма коротких фибрилл гВоуРгР( 102-240), образовавшихся в результате фрагментации длинных, плотно скрученных пучков протофибрил.

2) Электронограмма фибрилл образованных гВоуРгР( 102-240). Терминальная стадия - образование крупного агрегата, схожего с наблюдаемыми в амилоидных бляшках при ТГЭ

Фибриллы слабо изменяли свою морфологию при удалении из раствора хаотропных агентов, а такжепроявляли высокую резистентность к обработке протеиназой К, что вело к частичному разрушение агрегатов (рис. 6-1), а при анализе белкового состава препарата методом ДСД-электрофореза в ПААГ -образованию фрагментов рекомбинантного белка массой 8-14 кД (рис. 6-2).

Рисунок 6. Резистентность образуемых фибрилл к воздействию протеиназы К.

1. - фибриллы образованные rBovPrP( 102-240) до (А) и после (В) обработки протеиназой К (просвечивающая электронная микроскопия, негативное контрастирование)

2. - препарат фибрилл rBovPrP( 102-240) до (-) и после (+) обработки протеиназой К (ДСН электрофорез в 12 % ПААГ, восстанавливающие условия, окрашивание - Silver Staining Kit, Sigma, США).

Исследование процесса образования фибрилл рекомбинантного прионнс г белка, а также их морфологии, позволило предложить схему, иллюстрирующ основные этапы самосборки амилоидоподобных структур in vitro (рис. 7.).

VI. V. IV. III. II.

амилоидоподобных агрегатов рекомбинантным фрагментом прионного белка крупного рогатого скота (со 102-по 240 а.к. - rBovPrP(102-240)) in vitro.

(I. - мономеры rBovPrP( 102-240); II. и III. - образование протофиламентов; IV и V -

скручивание пучка протофибрилл, приводящее к образованию фибриллы; VI. -латеральное взаимодействие нескольких фибрилл^П. - фрагментация фибрилл, с образованием разветвленной сети агрегатов)

Описанные выше процессы образования фибрилл, происходят при концентрации мочевины от 1 до 4 М. Фибриллы практически идентичной морфологии образуются при проведении реакции в присутствии гуанидингидрохлорида в концентрациях от 1 до 3 М. При концентрациях хаотропных агентов, превышающих указанные, образование каких-либо агрегатов рекомбинантного белка не происходило (в течение 14 дней наблюдения). Тем не менее, было обнаружено присутствие белковых фибрилл, аналогичным представленным на рисунках 3 и 4 (первые 2 стадии), в концентрированных, очищенных препаратах рекомбинантного белка содержащих мочевину (8М) и более 3 месяцев хранившихся при +4°С.

/ ч /_

Рисунок 7. Предполагаемая схема процесса образования

\ f

Для отдельных партий рекомбинантного белка было зафиксиров образование агрегатов, отличных от вышеописанных. Они представляли СО' гибкие фибриллы длиной 50-200 нм, диаметром 10-12 нм, не проявляю! способности к вторичной ассоциации в крупные разветвлённые агрегаты (рис. 8).

Рисунок 8. Электронограмма гибких фибрилл образованных гВоуРгР(1 02-240).

На сегодняшний день, подобные явления могут быть интерпретированы результат существования нескольких стабильных конформаций прионного бeJ формирующих фибриллы, так и как следствие содержания в образцах соединег;" оказывающих влияние на процесс образования фибрилл.

Уникальным фактом, зарегистрированным при проведеннии эксперимен-является одновременное образование фибрилл различной морфологии. Б] обнаружено, что при высоких концентрация рекомбинантного белка (более 40 мг : может происходить одновременное образование как гибких фибрилл (рис.8), так длинных жёстких фибрилл образующих фрагментирующиеся пучки (рис. 3-5; Обнаруженное явление, подтверждает возможность одновременного развития д) вероятно, различных по своим механизмам процессов, что необходимо учитьн при дальнейших исследованиях кинетики образования амилоидоподобных струю

Таким образом, результаты проведенной работы, подтвердили возможность образования рекомбинантным фрагментом (С-концевая область) прионного белка КРС структур, по ряду свойств (морфология, высокая устойчивость к протеиназам), сходных с фибриллами прионног белка наблюдаемыми при ТГЭ человека и животных. Дальнейшее изучение процесса самосборки фибрилл in vitro, позволило выделить основные этапы данного явления, очевидно, общего для большой группы белков, структурные изменения которых приводят к развитию амилоидозов.

2.7 Получение моноклональных антител к рекомбинантному фрагменту прионного белка крупного рогатого скота и их иммунохимичесая характеристика.

Важнейшей целью наших исследований являлось получение панели моноклональных антител специфичных прионным белкам человека и животных.

Работы по получению МКА к rBovPrP( 102-240) выполнены совместно с к.б.н. Козловым А.Ю. и к.б.н. Костиной Л.В..

В качестве антигена при получении МКА мы использовали очищенный рекомбинантный фрагмент прионного белка крупного рогатого скота, rBovPrP(102-240). Введение мышам линии balb/c данного антигена, позволило получить выраженный уникальный иммунный ответ, что, вероятно, обусловлено конформационными особенностями использованного препарата фрагмента прионного белка, как правило, иммунотолерантного для большинства видов млекопитающих.

После проведения гибридизции, скрининга и клонирования гибридом, было выделено 13 клонов, стабильно продуцирующих антитела к rBovPrP(102-240) (таблица 1). С целью получения препаративных количеств МКА проводили культивирование гибридомных клеток в брюшной полости мышей линии balb/c.

Таблиц

Иммунохимическая характеристика МКА к рекомбинантному фрагме) прионного белка КРС, гВоуРгР(1 02-240)

МКА субизотип Активность МКА в асцитической жидкости в ИФА* Взаимодействие с гВоуРгР(Ю2- 240) в иммуноблоте Взаимодействие с протеиназорезистентными фрагментами гВоуРгР( 102-240) (полученными при обработке фибрилл протеиназой К)в иммуноблоте

9Ъ8 10б + ±

ЗеЮ 1ёМ 104 + -

1Ь4 1802а 6x104 + -

1е 12 1801 4x104 + -

2 а 1801 103 + -

2с 8 1ёР2а 106 + +

10е1 \gG2a. ю5 + +

8<17 6x104 + -

6а5 1801 105 + +

9с12 1801 106 + +

4е1 18М 103 + -

4^11 Ь 4x103 + -

7П 1801 6x104 + -

2.8. Использование полученных МКА для выявления/детекции протеиназорезистентной конформации прионных белков.

Обязательным условием для использования МКА в диагностике ТГЭ, являе их специфическое взаимодействие с протеиназорезистентными фрагмент; прионных белков, образующимися при стандартной обработке инфекционн материала протеиназой К, элиминирующей клеточный прионный белок (РгРс).

Применение метода иммуноблоттинга позволило установить, что все отобранных клонов МКА специфически взаимодействовали с рекомбинантн прионным белком. Кроме того, были выявлены клоны антител способ! специфически взаимодействовать с фрагментами рекомбинантного прионн белка, образующимися при частичном гидролизе фибрилл данного бе протеиназой К (рис. 9).

45- ' (с. i

31- 1 г" в

14- в * 1 :: ■ 1 - а I й а ib , * 1 * : в'

- + - + - + " + - + -+ - + - + - + - + - + - + - + - + - +

м р 6н4 saf32 9с12 9вв 2f7 2с8 1е12 1в4 10Е1 7f7 8d8 6а5 зе10 *

Рисунок 9. ДСН-электрофорез в ПААГ и иммуноблот препарата фибрилл до (-) и после (+) обработки протеиназой К.

(Р - белковый состав препаратов, окрашивание серебром; 6Н4 и 8АР32 -референтные МКА; 9С12, 9В8, 2Р7, 2С8, 1Е12, 1В4, 10Е1,7Р7, 8Б8, 6А5,ЗЕ10-полученные в ходе работы МКА; * - контроль конъюгата)

МКА, полученные в ходе проведенных работ, испытывали на предмет возможности использования для выявления инфекционных изоформ РгР, в различных форматах иммунологического анализа.

В работе выполненной на базе ФГУ «ВНИИЗЖ», совместно с сотрудниками лаборатории редких и малоизученных болезней животных д.б.н., профессором С.С.

Рыбаковым, A.A. Егоровым, А.С.Рябоконь, было установлено, что МКА клонов 2С8 и 9С12 специфически связываются с инфекционной изоформой прионного белка крупного рогатого скота и овец, и могут быть успешно использованы для постмортальной диагностики прионных болезней этих животных методом иммуногистохимии. Применение указанных клонов антител, в данном случае, позволяет регистрировать диффузные отложения аномального белка в тканях головного мозга (рис.10).

Кроме того, показано, что эти же МКА позволяют эффективно обнаруживать скопления инфекционного прионного белка в тканях головного мозга человека (рис. 11). Специфичность моноклональных антител, а также локальное увеличение концентрации прионного белка в так называемых амилоидных бляшках, наблюдаемых в большинстве случаев ТГЭ человека, позволяет проводить

постмортальную диагностику прионных инфекций человека мето, иммуногистохимического анализа, даже без обработки срезов протеолитичесю ферментами.

Рисунок 10. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов ткан« головного мозга (обекс) крупного рогатого скота позитивного (1) и негативн (2) в отношении губкообразной энцефалопатии с использованием МКА 2с8.

Увеличение х625.

(Коричневые области на фотографии слева, демонстрируют области наибольшего накопления протеиназорезистентного прионного белка.)

Рисунок 11.

Детекция инфекционной изоформы прионного белка человека в тканях головного ; мозга.

Иммуногистохимическое окрашивав препарата полутонкого среза мозга человека (область мозжечка) 1

больного нвБКЯ; с использованием МКА 2С8. Световая микроскопия, увеличение х Г..

(препарат приготовлен без обработки протеиназой К, видна обширная вакуолизация тканей, скопления прионного белка в составе амилоидн:: бляшек отмечены стрелками)

Возможность применения полученных МКА для проведения диагностических исследований по выявлению прионных болезней человека (Болезнь Крейтцфельдта-Якоба и др.) методом иммуноблоттинга, была продемонстрирована совместно с д.б.н. H.H. Полешуком и к.б.н. С.П. Капитульцом (НИИ эпидемиологии и микробиологии, Минск, Беларусь) (рис. 12).

(в 1 2

Рисунок 12. Применение моноклонального антитела 9С12 для выявления резистентной к протеиназе К изоформе приониого белка в тканях головного мозга человека.

1 - гомогенат тканей головного мозга здорового человека

2 - гомогенат тканей головного мозга человека, с диагнозом БКЯ. (обработка протсиназой К, иммуноблот, первичные антитела 9С12)

Моноклональные антитела, взаимодействующие с протеиназорезистентными фрагментами фибрилл, образованных гВо\'РгР( 102-240), служили основой при разработке диагностической системы для выявления РгР'" основанной на «сэндвич»-варианте твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

| В данной части работы были синтезированы конъюгаты моноклональных

антител с ферментной меткой (пероксидаза хрена), проведены исследования подбору оптимальных пар МКА, анализированы различные способы постановки

| реакции, определена чувствительность системы (при использовании рекомбинантного белка).

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют об идентичности или значительном перекресте эпитопов МКА 9с 12, 717,6а5, что. по видимому, делает невозможным создание на их основе эффективного «сэндвич»-варианта анализа. Вместе с тем. их сочетание с МКА 2с8, позволяет проводить детекцию ирионного белка с чувствительностью до 10 нг/мл, что достаточно для обнаружения РгР""' в гомогенатах головного мозга организмов, поражённых ТГЭ.

3. выводы

1. Получен рекомбинантный вектор, позволяющий проводить экспрессию фрагмента прионного белка (со 102 по 240 а.к.) крупного рогатого скота (Bos taurus) в клетках E.coli..

2. Разработана технология очистки и охарактеризованы свойства рекомбинантного фрагмента прионного белка КРС.

3. Подтверждено существование множественности конформационных состояний прионных белков, в том числе и отличных от наблюдаемых in vivo. Показана возможность параллельного образования различных стабильных изоформ прионных белков in vitro.

4. На основании изучения свойств рекомбинантного фрагмента прионного белка крупного рогатого скота, предложена общая схема образования амилоидных фибрилл наблюдаемых при ТГЭ.

5. Получена панель моноклональных антител (МКА) специфически связывающихся с прионными белками человека и животных. Установлено, что антитела клонов 2С8, 9С12, 6А5, 7А7 взаимодействуют с эпитопами прионных белков человека, крупного рогатого скота и овцы, локализованных в протеиназорезистентной области инфекционных изоформ.

6. Установлено, что полученные моноклональные антитела 9С12, 6А5 и 7F7 направлены к одному или двум близкорасположенным эпитопам РгР, которые топографически удалены от эпитопа РгР, распознаваемого МКА 2С8.

7. Установлено, что полученные антитела могут быть использованы для посмертной диагностики трансмиссивных губкообразных энцефалопатий человека и животных, методами иммуногистохимического анализа и иммуноблоттинга.

8. На основе моноклональных антител 2С8 и 9С12 разработан «сэндвич»-вариант ИФА, позволяющий выявлять протеиназорезистентные конформации молекул РгР, с чувствительностью до 10 нг/мл.

4. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Григорьев В.Б. Фибриллизация рекомбинантного белка приона крупного рогатого скота (рек-PrP) in vitro. / В.Б. Григорьев, С.Л. Кальнов, А.Н. Покидышев. В.В. Цибезов, М.В. Баландина, P.A. Гибадулин, O.A. Верховский, С.М. Клименко // Доклады Академии Наук. - 2008. - Т.420. - №2. - С.1-3.

2. Григорьев В.Б. Спонтанная конверсия рекомбинантного белка приона крупного рогатого скота в протеиназорезистентную форму in vitro. II В.Б. Григорьев, А.Н. Покидышев, С.Л. Кальнов // Материалы научно-практической конференции «Современные проблемы инфекционной патологии человека» (Минск, Республика Беларусь). - 2009 г. - С. 234 - 237.

3. Григорьев В.Б. Конформационная пластичность рекомбинантного белка приона крупного рогатого скота. / В.Б. Григорьев, С.Л. Кальнов, А.Н. Покидышев, С.М. Клименко // Доклады Академии Наук. - 2010. - Т.430. -№3 - (принято к печати).

4. Григорьев В.Б. Методы диагностики прионных заболеваний. / В.Б. Григорьев,

A.Н. Покидышев. С.Л. Кальнов, С.М. Клименко // Вопросы вирусологии. -2009. - №5. - С. 4-9.

5. Кальнов С.Л. Получение и характеристика полноразмерного рекомбинантного РгР белка крупного рогатого скота. / С.Л. Кальнов, В.Б. Григорьев, К.П. Алексеев, А.Н. Власова, P.A. Гибадулин, А.Н. Покидышев, М.В. Баландина,

B.В. Цибезов, O.A. Верховский // Бюлл. экси. биол. мед. - 2006. - Т. 141. -№1. - С. 62-65.

6. Покидышев А.Н. Использование рекомбинантных прионных белков для изучения процессов образования амилоидных фибрилл и разработки средств диагностики трансмиссивных губкообразных энцефалопатий. / А.Н. Покидышев, В.Б. Григорьев, С.Л. Кальнов // Второй международный форум по нанотехнологиям (Москва).Сборник докладов. - 2009. - С. 802-804.

7. Grigoriev V.B. Fibrillization of Recombinant Bovine Prion Protein (PrP) in vitro. / V.B. Grigoriev, S.L. Kalnov, V.V. Tsibezov, A.N. Pokidvshev. M.V. Balandina,

O.A. Verkhovsky, R.A. Gibadulin // The 16th International Microscopy Congress (Sapporo, Japan). Book of Abstracts. - 2006. - P. 377.

8. Grigoriev V.B. Peculliar properties of recombinant bovine PrP. / V.B. Grigoriev, S.L. Kalnov, A.N. Pokidyshev. A.U. Kozlov, V.V. Tsibezov, M.V. Baiandina, R.A. Gibadulin, O.A. Verkhovsky // «Prion 2008» (Madrid, Spain). Book of Abstracts. -2008.-P. 55.

9. Grigoriev V.B. Conformational plasticity of the recombinant bovine PrP. / V.B. Grigoriev, S.L. Kalnov, A.N. Pokidyshev // Prion 2009 (Thessaloniki, Greece). Book of abstracts. - 2009. - P. 55.

10.Kalnov S.L. Spontaneous Fibrillisation of RecBovine PrP(102-240) in Vitro. / S.L. Kalnov, V.B. Grigoriev, A.N. Pokidyshev. V.V. Tsibezov, M.V. Balandina, R.A. Gibadulin, O.A. Verkhovsky // Prion 2007 (Edinburgh, UK) Book of Abstracts. -2007.-P. 28.

11. Pokidyshev A.N. Two pathways of self assembly recombinant prion protein in vitro. / A.N. Pokidyshev, V.B. Grigoriev, S.L. Kalnov // 12th SAC Seminar «Combating Global Infections» (Irkutsk). Book of abstracts. - 2009. - P.39.

Благодарности:

Автор выражает искреннюю благодарность научным руководителям - доктору биологических наук В.Б. Григорьеву и кандидату биологических наук C.JI. Кальнову, за предоставление возможности выполнения данной работы, научное руководство, помощь в написании и оформлении печатных работ.

Автор выражает благодарность за методическую и консультативную помощь в работе:

д.б.н. наук, профессору O.A. Верховскому д.б.н., профессору С.С. Рыбакову д.б.н., профессору H.H. Полещуку д.вет.н., профессору Б.Г.Орлянкину к.б.н В.В. Цибезову к.б.н. М.В. Баландиной к.б.н. А.Н. Власовой к.б.н. К.П. Алексееву к.б.н. А.Ю. Козлову к.б.н. JI.B. Костиной к.б.н. C.B. Альховскому В.В. Грабовецкому А.Г. Южакову

Заказ № 163-а/10/09 Подписано в печать 30.10.2009 Тираж 150 экз. Усл. п.л. 1,5

' \ ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

i^Ji www.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Покидышев, Алексей Николаевич

1. Оглавление.

2. Перечень сокращённых названий.

3. Введение.

4. Обзор литературы.

4.1. Прионы в инфекционной патологии млекопитающих.

4.2. Прионные белки - структура, свойства и функции.

4.3. Молекулярные механизмы и патогенез прионных болезней.

4.4. Лабораторные модели для изучения конверсии прионных белков.

4.5. Диагностика ТГЭ.^

5. Материалы.

6. Методы.

6.1. Манипуляции с ДНК.

6.1.1. Амплификация целевого фрагмента ДНК.

6.1.2. Рестрикция.

6.1.3. Лигирование.

6.1.4. Электрофорез ДНК в геле агарозы.

6.1.5. Выделение молекул ДНК гелей агарозы.

6.1.6. Выделение ппазмидной ДНК из клеток Е. coli.

6.1.7. СеквеиированиеДНК.

6.2. Экспрессия рекомбинантного полипептида в клетках E.coli.^

6.2.1. Приготовление ростовых сред для E.coli.

6.2.2. Получение компетентных для электропорации клеток E.coli.

6.2.3. Получение химически компетентных клеток E.coli.

6.2.4. Трансформация экспрессионных штаммов E.coli ппазмидной ДНК.

6.2.5. Индукция экспрессии целевого фрагмента прионного белка КРС в ^ клетках E.coli.*.

6.3. Получение моноклон ал ьных антител.^

6.3.1. Иммунизация.

6.3.2. Миеломная клеточная линия.

6.3.3. Культивирование клеток.

6.3.4. Слияние клеток и выращивание гибридом.

6.3.5. Криоконсервация гибридом.

6.3.6. Получение асцитных жидкостей, содержащих МКА.

6.3.7. Получение МКА из асцитных жидкостей.

6.3.8. Субтипирование МКА.

6.4. Работы с препаратами белков. б. 4.1. Определение концентрации белка в растворах.

6.4.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии „„ додегртсулъфата натрия (ПААГ-ДСН).

6.4.3. Пммуноблоттинг.

6.4.4. Методы твердофазного иммуноферментного анализа.

6.4.5. Синтез конъюгатов моноклоналъных антител с пероксидазой хрена.

6.4.6. Выделение рекомбинантного фрагмета прионного белка КРС, ~ методом металлоаффинной хроматографии.

6.4.7. Лиофилизация белковых препаратов.

6.4.8. Получение фибрилл rBovPrP(l02-240).

6.4.9. Обработка различных изоформ рекомбинантного прионного белка „^ протеиназой К.

6.5. Электронная микроскопия.

6.5.1. Электронная микроскопия агрегатов образованных рекомбинантным у у фрагментом прионного белка КРС.

6.5.2. Иммуномаркирование САФ.

6.6. Иммуногистохимический анализ.^

7. Результаты исследований.

7.1. Выбор фрагмента гена прионного белка для экспрессии в клетках g j E.coli.

7.2. Создание генноинженерной конструкции для экспрессии целевого фрагмента гена прионного белка крупного рогатого скота (Bov- 8 2 PRNP) в клетках Е. coli.

7.3. Экспрессия фрагмента прионного белка крупного рогатого скота в g5 клетках E.coli.

7.4. Очистка и иммунохнмпческая характеристика рекомбинантного g 5 фрагмента прионного белка КРС.

7.5. Определение молекулярной массы и чистоты полученного препарата рекомбинантного белка.

7.6. Получение иротеиназорезистентных изоформ рекомбинантного прионного белка.

7.7. Получение моноклональных антител к рекомбинантному фрагменту прионного белка крупного рогатого скота.

7.8. Иммунохимическая характеристика МКА.

7.9. Разработка твердофазного «сэндвич» ИФА для выявления ^ ду патологической изоформы прионных белков.

8. Обсуждение.

9. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика рекомбинантного прионного белка крупного рогатого скота (Bos taurus) и разработка методов выявления патологической изоформы прионов"

3.1 Актуальность темы.

Трансмиссивные губкообразные энцефалопатии (ТГЭ) являются особым классом нейродегенеративных болезней, встречающихся как у человека, так и у животных. В настоящее время гипотеза о том, что инфекционным агентом, вызывающем ТГЭ, является только аномальная изоформа клеточного белка организма-хозяина, является общепринятой, а выделенный инфекционный агент был назван прионом [194; 195].

Считается установленным, что возникновение и развитие летальных прионных болезней связано с изменением конформации нормального белка организма (РгР°), индуцированным внедрением экзогенного аномального приона или аналогичной прионной частицей, образовавшейся в организме спорадически, с последующим необратимым накоплением патогенных белковых изоформ [196].

На сегодняшний день актуальными являются как вопросы биологии прионных болезней, так и проблемы выявления и идентификации их возбудителей, т.е. патогенных белковых инфекционных агентов (PrPd).

Фактически неизученными остаются механизмы индуцированного и спонтанного конформационных переходов наблюдаемых при прионных инфекциях. Выделенные «штаммы» прионных белков указывают на множественность возможных конформационных состояний прионного белка стабилизирующихся в результате образования характерных для ТГЭ белковых агрегатов - фибрилл [218]. Аналогичные агрегаты других гетерологичных белков также были зарегистрированы в живых организмах (при развитии амилоидо-зов) или получены in vitro [97; 134]. Последнее наблюдение даёт основание относиться к данному явлению, как к достаточно распространенному, но малоизученному варианту фолдинга белков.

За последние несколько лет появились данные о возможности обнаружения патогенной конформации прионного белка практически в любом органе и ткани пораженного организма, доказано выделение инфекционного 8 агента с молоком, слюной, мочой [152]. В этой связи, существенный интерес представляет собой исследование возможности внутри- и межвидовой трансмиссии заболевания.

Использование рекомбинантных прионных белков или их фрагментов является удобным методом изучения механизмов происходящих при конверсии белков, мутаций индуцирующих возникновение заболевания, возможности межвидовой трансмиссии. Кроме того, в настоящее время, для разработки всех вариантов тест-систем выявления возбудителей ТГЭ, основанных только на иммунологическом анализе, необходимы рекомбинантные аналоги нативных прионных белков.

Очевидно также, что моноклональные антитела (МКА) являются фактически единственным инструментом, пригодным для диагностики прионных инфекций в целом. Полученные на сегодняшний день моноклональные антитела не позволяют проводить прямую дифференциацию изоформ прионных белков, что приводит к необходимости использовать дополнительные этапы обработки проб элиминируя «неинфекционные» молекулы. Таким образом, получение новых моноклональных антител к прионным белкам является важнейшей задачей, позволяющей разрабатывать новые методы выявления патогенных прионных белков, в том числе и для нерешенной проблемы прижизненной диагностики ТГЭ.

3.2 Цели и задачи исследования.

Целью данной работы являлась разработка системы in vitro моделирующей конформационные изменения прионных белков при ТГЭ и методов выявления патологической изоформы прионов.

Для достижения поставленных целей были определены следующие задачи:

1. Разработать технологию и получить рекомбинантный фрагмент при-онного белка.

2. Изучить возможность самоорганизации рекомбинантного прионного белка в амилоидоподобные структуры in vitro.

3. Оценить влияние различных факторов на процесс изменения конфор-маций рекомбинантного прионного белка in vitro.

4. Определить иммуногенность полученного рекомбинантного прионного белка

6. Определить иммунологическую активность, специфичность и имму-нохимические свойства полученных моноклональных антител.

7. Апробировать рекомбинантный антиген и МКА в качестве иммуноди-агностических реагентов в различных методах выявления патологической изоформы прионов

3.3 Научная новизна и практическая значимость работы.

Разработана технология получения и очистки рекомбинантного фрагмента прионного белка КРС. Разработаны подходны к получению различных конформаций данного рекомбинантного белка, представлены доказательства, подтверждающие структурную гомологию фибрилл РгР, наблюдаемых при ТГЭ, и агрегатов, образуемых рекомбинантным фрагментом прионного белка.

3.4 Основные положения выносимые на защиту.

• результаты экспериментов по изучению молекулярно-биологических свойств рекомбинантного фрагмента прионного белка крупного рогатого скота

• иммунохимическая характеристика МКА к rBovPrP( 102-240)

• методологические подходы к выявлению патологической изоформы прионов с использованием рекомбинантного антигена и моноклональ-ных антител

3.5 Апробация работы.

Материалы диссертационной работы были доложены и опубликованы в материалах 2-го семинара Научно-консультационного комитета МНТЦ «Борьба с глобальными инфекциями» (г. Иркутск, 2009), 2 -го Международного конкурса научных работ молодых учёных в области нанотехнологий (в рамках форума Rusnanotech-2009, Москва, 2009), международных конференций «Prion 2007» (г.Эдинбург, Великобритация), «Prion 2008» (г. Мадрид, Испания), «Prion 2009» (г. Салоники, Греция), а также доложены на Т-ой ежегодной научной конференции молодых учёных НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского (г. Москва, 2008).

3.6 Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 3 (и одна принята к печати) научные работы, в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Опубликовано 7 тезисов научных докладов на российских и международных конференциях.

3.7 Объём и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 150 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка цитированной литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 9 таблицами и 44 рисунками. Список литературы включает 259 источников (23 отечественных и 236 зарубежных авторов).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Покидышев, Алексей Николаевич

9.ВЫВОДЫ.

1. Получен рекомбинантный вектор, позволяющий проводить экспрессию фрагмента прионного белка (со 102 по 240 а.к.) крупного рогатого скота {Bos taurus) в клетках E.coli.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Покидышев, Алексей Николаевич, Москва

1. Григорьев В.Б. Методы диагностики прионных заболеваний. / В.Б. Григорьев, А.Н. Покидышев, C.JT. Кальнов, С.М. Клименко // Вопросы вирусологии. 2009. - № 5. - С. 4-9.

2. Дагданова A.B. Роль клеток лимфоцитарно-макрофагального пула в патогенезе прионовых инфекций./ A.B. Дагданова // Вестник РАСХН. -2001.-№ 2.-с. 6-8.

3. Зуев В.А. Прионные болезни человека и животных: Руководство для врачей/ В.А. Зуев, И.А. Завалишин, В.М. Ройхель. М.: Медицина, 1999. - 192с.

4. Комар A.A. Дрожжевой прион URE3.: от генетики до биохимии. / A.A. Комар, Р. Мелкий, К. Кюланн // Биохимия. 1999. - Т. 64. - Вып. 12.-С. 1659-1667.

5. Коромыслов Г.Ф. Эпизоотическая ситуация по медленным инфекциям овец романовской породы в хозяйствах Нечерноземья. / Г.Ф.

6. Коромыслов, В.А. Шубин, B.C. Суворов // Аграрная наука. 1994. - № 5.-С. 31-33.

7. Кушниров В.В. Структурное и функциональное сходство белков дрожжей Sup35p и Ure2p и прионов млекопитающих. / В.В. Кушниров, М.Д. Тер-Аванесян, В.Н. Смирнов // Молекулярная биология. 1995. -№ 29. - с. 427-430.

8. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование/ Т. Маниатис, Э.Фрич, Дж. Сэмбрук; пер. с англ.А.А. Баева, К.Г. Скрябина. М.: Мир, 1984. - 480 с

9. Надточей Г.А. Прионные инфекции: диагностика, профилактика и меры борьбы. Прионные и ретровирусные болезни животных. // Г.А. Надточей // Бюл. ВИЭВ. 1996. - Вып. 77. - с. 5-10.

10. Надточей Г.А. Экспериментальные прионные инфекции у животных. / Г.А. Надточей, В.А. Шубин, К.П. Юров, Г.Ф. Коромыслов // Труды ВИЭВ. 1999. - Т. 72. - с. 299-305.

11. Орлянкин Б.Г. Структура и биология прионов. / Б.Г. Орлянкин // Сельскохозяйственная биология. 1998. — № 2. — с. 46-58.

12. Покровский В.И. Прионы и прионные болезни. / В.И. Покровский, О.П. Киселёв, Б.Л. Черкасский М.: Издательство РАМН, 2004. - 384 с.

13. Ройхель В.М. Прижизненная диагностика прионовых трансмиссивных энцефалопатий. / В.М. Ройхель, Г.И. Фокина, Л.М. Кондакова и др // Вопросы вирусологии. 1997. — № 5. - с. 203-205.

14. Рыбаков С.С. Методические укказания по гистологической диагностике губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота. / С.С. Рыбаков, Е.В. Гусева, A.B. Чепуркин, A.A. Егоров М. - 2001. - 13 с.

15. Рыбаков С.С. Скрепи и другие прионные болезни животных и человека. / С.С. Рыбаков Владимир: Фолиант, 2003. — 199 с.

16. Рыбаков С.С. Клиническое проявление и диагностика губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота. / С.С. Рыбаков, К.Н. Груздев // Ветеринария. 2004. -№ 7. - с. 18-23.

17. Рыбаков С.С. Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота. / С.С. Рыбаков Владимир, 2007. - 588 с.

18. Рыбаков С.С. Меры, направленные на предотвращение возникновения и заноса ГЭ КРС в Россию. /С.С. Рыбаков, А.А. Егоров // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. — 2009. -№ 1. — с. 22-23.

19. Рыбаков С.С. Отбор патологического материала для диагностики ГЭ КРС. / С.С. Рыбаков, А.А. Егоров // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. 2009. - № 1. — с. 23 - 24.

20. Суворов B.C. Патоморфологическая дифференциация прионных инфекций: скрепи овец и губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота. /B.C. Суворов, В.А. Шубин, Г.А. Надточей, К.П. Юров, Д.Д. Санджаев// Труды ВИЭВ. 2003. - Т. 73. - с. 60-63.

21. Шуляк Б.Ф. Губчатая энцефалопатия кошек. / Шуляк Б.Ф. // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние животные. 2005. - № 2. - с. 2-3.

22. Aguzzi A. Understanding the diversity of prions. / A. Aguzzi // Nature cell biology. 2004. - Vol. 6. - № 4. - P. 290 - 292.

23. Aguzzi A. Prion biology: the quest for the test. / A. Aguzzi // Nat. methods. 2007. - Vol. 4. - № 8. - P. 614-616.

24. Aguzzi A. Molecular mechanisms of prion pathogenesis / A. Aguzzi, C. Sigurdson, M. Heikenwaelder // Annu Rev. Pathol. 2008. - № 3. - P. 11-40.

25. Aksamit A. J. Quantitation of 14-3-3 and neuron —specific enolase proteins in CFS in Creutzfeldt-Jacob disease. / A. J. Aksamit, С. M. Preissner, H. A. Homburger // Neurology. 2001. - Vol. 57. - № 4. - P. 728-730.

26. Arslan E. Kinetics of autocatalysis in small systems. / E. Arslan, I.J. Laurenzi // J. Chem. Phys. 2008. - Vol. 128. - № 1. p. 15.

27. Atarashi R. Ultrasensitive detection of scrapie prion protein using seeded conversion of recombinant prion protein / R. Atarashi, R.A. Moore, V.L. Sim,

28. A.G. Hughson, D.W. Dorward, H.A. Onwubiko, S.A. Priola, B. Caughey // Nat. Methods. 2007. - Vol. 4. - № 8. - P. 645-650.

29. Aucouturier P. Biochemical and conformational variability of human prion strains in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease./ P. Aucouturier, R.J. Kascsak,

30. B. Frangione, T. Wisniewski // Neuroscience Letters. 1999. - Vol. 274. — № l.-P. 33-36.

31. Banks W.A. Leptin enters the brain by a saturable system independent of insulin. / W.A. Banks, A.J. Kastin, W. Huang, J.B. Jaspan, L.M. Maness // Peptides 1996. -№ 17. - P. 305-311.

32. Banks, W.A. Transport of insulin across the blood-brain barrier: saturability at euglycemic doses of insulin. / W.A. Banks, J.B. Jaspan, W. Huang, A.J. Kastin // Peptides. 1997. - № 18. - P. 423^129.

33. Banks W.A. Transport of prion protein across the blood-brain barrier. / W.A. Banks, S.M. Robinson, R. Diaz-Espinoza, A. Urayama, C. Soto // Exp. Neur. 2009. -№ 218. - P. 162-167.

34. Baron T. Mouse models of prion disease transmission. / T. Baron // Trends Mol. Med.-2002.-Vol. 8.-№ 10.-P. 495-500.

35. Baskakov I.V. Autocatalytic conversion of recombinant prion proteins displays a species barrier. / I.V. Baskakov // J. Biol. Chem. — 2004. Vol. 279.-№9.-P. 7671-7677.

36. Baskakov I.V. Converting the prion protein: what makes the protein infectious. / I.V. Baskakov, L. Breydo // Biochim. Biophys. Acta. 2007. -Vol. 1772. - № 6. - P. 692-703.

37. Baskakov I.V. The reconstitution of mammalian prion infectivity de novo. / I.V. Baskakov // FEBS J. 2007. - Vol. 274. - № 3. - P. 576-587.

38. Basu S. Modulation of PK-resistant PrPSc in cells and infectious brain homogenate by pathogenesis. / S. Basu, M.L. Mohan, X. Luo, B. Kundu, Q. Kong, N. Singh // Mol. Biol. Cell. 2007. - № 18. - P. 3302-3312.

39. Benestad S.L. Cases of scrapie with unusual features in Norway and designation of new type, Nor98. / S.L. Benestad, P. Sarradin, B. Thu, J. Schönheit, M.A. Tranulis, B. Bratberg // Vet. Res. 2003. - Vol. 153. - № 7. -P. 202-208.

40. Beringue V. Regional heterogeneity of cellular prion protein isoforms in the mouse brain. / V. Beringue, G. Mallinson, M. Kaisar, M. Tayebi, Z. Sattar, G. Jackson, D. Anstee, J. Collinge, S. Hawke // Brain. 2003. - № 126. - P. 2065-2073.

41. Bessen R.A. Non-genetic propagation of strain-specific properties of scrapie prion protein./ R.A. Bessen, D.A. Kocisko, G.J. Raymond, S. Nandan, P.T Lansbury, B. Caughey. // Nature. 1995. - Vol. 375. - № 6533. - P. 698700.

42. Bieschke J. Autocatalytic self-propagation of misfolded prion protein. / J. Bieschke, P. Weber, N. Sarafoff, M. Beekes, A. Giese, H. Kretzschmar // Proc Natl Acad Sei USA. 2004. - Vol. 101. -№ 33. P. 12207-12211.

43. Bocharova O.V. In vitro conversion of full-length mammalian prion protein produces amyloid form with physical properties ofPrP(Sc). / O.V.

44. Bocharova, L. Breydo, A.S. Parfenov, V.V. Salnikov, I.V. Baskakov I I J. Mol. Biol. 2005. - Vol. 346. - № 2. - P. 645-659.

45. Brimacombe D.B. Characterization and polyanion-binding properties of purified recombinant prion protein. / D.B. Brimacombe, A.D. Bennett, F.S. Wusteman, A.C. Gill, J.C. Dann, C.J. Bostock // Biochem J. 1999. - Vol. 342.-№3.-P. 605-613.

46. Brown D.R. Microglial expression of the prion protein. / D.R. Brown, A. Besinger, J.W. Herms, H.A. Kretzschmar // Neuroreport. 1998. - № 9. - P. 1425-1429.

47. Brown D.R. Normal prion protein has an activity like that of superoxide dismutase. / D.R. Brown, B.S. Wong, F. Hafiz, C. Clive, S.J. Iiaswell, I.M. Jones // Biochem. J. 1999. - № 344. - P. 1-5.

48. Brown D.R. Consequences of manganese replacement of copper for prion protein function and proteinase resistance. / D.R. Brown, F. Hafiz, L.L. Glasssmith, B.S. Wong, I.M. Jones, C. Clive, S.J. Haswell // EMBO J. 2000. - № 19.-P. 1180-1186.

49. Brown P. Blood infectivity and the prospects for a diagnostic screening test in Creutzfeldt-Jacob disease. / P. Brown, L. Cervenakova, H. Diringer // J. Lab. Clin. Med.-2001.-Vol. 137.-№4.-P. 5-13.

50. Buschmann A. Detection of cattle-derived BSE prion using transgenic mice overexpressing bovine PrPc. / A. Buschmann, E. Pfaff, K. Reifenberg, H.M. Müller, M.H Groschup // Arch. Virol. Suppl. 2000. - №. 16. - P. 7586.

51. Calzolai L. Prion protein NMR structures of chickens, turtles, and frogs. / L. Calzolai, D.A. Lysek, D.R. Perez, P. Güntert, K. Wüthrich // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2005. - Vol. 102.-№3.-P. 651-655.

52. Carmona P. In vivo detection of scrapie cases from blood by infrared spectroscopy. / P. Carmona, M. Monzón, E. Monleón, J.J. Badiola, J. Monreal //J. Gen. Virol.-2005.-Vol. 86. -№> 12.-P. 3425-3431.

53. Cashman N.R. Cellular isoform of the scrapie agent protein participates in lymphocyte activation. / N.R. Cashman, R. Lortscher, J. Nalbantoglu, I. Shaw, R.J. Kascsak, D.C. Bolton, P.E. Bendheim//Cell. 1990.-№ 61.-P. 185192.

54. Castilla J. In vitro generation of infectious scrapie prions / J. Castilla, P. Saá, C. Hetz, C. Soto//Cell. 2005.-Vol. 121.-№ 2.-P. 195-206.

55. Castilla J. Protein misfolding cyclic amplification for diagnosis and prion propagation studies. / J. Castilla, P. Saa, R. Morales, K. Abid, K. Maundrell, C. Soto // Methods Enzymol. 2006. - № 412. - P. 3-21.

56. Caughey B. Prion protein and the transmissible spongiform encephalopathies. / B. Caughey, B. Chesebro // Trend in Cell Biology. 1997. -Vol. 7. №2.-P. 56-62.

57. Cervenakova L. Advances in sreening test development for transmissible spongiform encephalopathies. / L. Cervenakova, P. Brown // Expert Rev. Anti. Infect. Ther. 2004. - Vol. 2. - № 6. - P. 873-880.

58. Collinge, J. Molecular analysis of prion strain variation and the aetiology of "new variant" CJD. / J. Collinge, K.C. Sidle, J. Meads, J. Ironside, A. F. Hill // Nature. 1996. - № 383. - P. 685-690.

59. Come J.H., Fraser P.E., Landsbury P.T. A kinetic model for amyloid formation in the prion diseases: importance of seeding. / J.H. Come, P.E. Fraser, P.T. Landsbury // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - №. 13.-P. 5959-5963.

60. Cotto E. Molecular characterization, philogenetic relationships and developmental expression patterns of prion genes in zebrafish / E. Cotto, M. Andre, J. Forgue, H.J. Fleury, P.J. Babin //FEBS Journal. 2004. - № 272. -P. 500-513.

61. Crozet C. Cellular pathogenesis in prion diseases. / C. Crozet, F. Beranger, S. Lehmann // Vet. Res. 2008. - Vol. 39. - № 4. - P. 44.

62. Cuille J., Chelle P.L. Experimental transmission of trembling to the goat./ J. Cuille, P.L.Chelle // CR Seances Acad.Sci. 1939. - № 208. - P. 10581060.

63. DeArmond S. J. Etiology and pathogenesis of prion diseases. / S. J. DeArmond, S.B. Prusiner // American Journal of Pathology, 1995. - Vol. 146.-№4.-P. 785-811.

64. Deleault N.R. Formation of native prions from minimal components in vitro. / N.R. Deleault, B.T. Harris, J.R. Rees, S. Supattapone // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. - Vol. 104. -№ 23. - P. 9741-9746.

65. DeMarco M. L. From conversion to aggregation: Protofibril formation of the pion protein. / M.L. DeMarco, V. Daggett // PNAS. 2004. - Vol. 101. -№8.-P. 2293-2298.

66. Eiden M. Synthetic prions./ M. Eiden, A. Buschmann, L. Kupfer, M.H. Groschup // J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health. 2006. - Vol. 53. -№ 6. P.-251-256.

67. Endo T. Diversity of oligosaccharide structures linked to asparagines of the scrapie prion protein. // T. Endo, D. Groth, S.B. Prusiner, A. Kobata Biochemistry. -1989. -№ 28. P. 8380-8338.

68. Farquhar C. F. Post-mortem immunodiagnosis of scrapie and bovine spongiform encephalopathy / C.F. Farquhar, R. A. Somerville, L. A. Ritchie // J. Virol. Methods. 1989. 24. - P. 215-222.

69. Foster J. D. Immunolocalisation of the prion protein (PrP) in the brains of sheep with scrapie / J.D. Foster, M. Wilson, N. Hunter // Vet. Rec. 1996. -№ 139.-P. 512-515.

70. Fraser H. Diversity in the neuropathology of scrapie-like diseases in animals / H. Fraser // Br. Med. Bull. 1993. - № 49 p. 792-809.

71. Gajdusek D. Transmission and passage of experimenal "kuru" to chimpanzees / D. Gajdusek, C.J. Gibbs, M. Alpers // Science. 1967. - № 155.-P. 212-214.

72. Gajdusek D.C. Transmissible and non-transmissible amyloidoses: autocatalytic post-translational conversion of host precursor proteins to beta-pleated sheet configurations. / D.C. Gajdusek // J. Neuroimmunol. 1988. -Vol. 20.-№2-3.-P. 95-110.

73. Gambetti P. Human brain amyloidoses. / P. Gambetti, C. Russo // Nephrol Dial Transplant. 1998. - № 13. - P. 33-40.

74. Giese A. Effects of metal ions on de novo aggregation of full-length prion protein. / A. Giese, J. Levin, U. Bertsch, H. Kretzschmar // Biochem. and Biophys. Reseach Communications. 2004. - № 320. - P. 1240-1246.

75. Reisacher, W.R. Mayr // Transfusion. 2003. - Vol. 43. - № 12. - P. 17061710.

76. Goder V. Topogenesis of membrain proteins: determinants and dynamics / V. Goder, M. Spiess // FEBS Lett. 2001. - Vol. 504. - № 3. - P. 87-93.

77. Grassi J. Progress and limits of TSE diagnostic tools. / J. Grassi, S. Maillet, S. Simon, N. Morel // Vet. Res. 2008. - Vol. 39. - P. 1-39.

78. Green A. J. Increased S-lOOb in the cerebrospinal fluid of some cattle with bovine spongiform encephalopathy. / A.J. Green, R. Jackman, T.A. Marshal, E.J. Thompson //Vet. Rec. 1999. -Vol. 145.-№4.-P. 107-109.

79. Greer M.L. A mathematical analysis of the dynamics of prion proliferation. / M.L. Greer, L. Pujo-Menjouet, G.F. Webb // J. Theor. Biol. 2006. - Vol. 242.-№3.-P. 598-606.

80. Grosset A. .Rapid presymptomatic detection of PrPsc via conformationally responsive palindromic PrP peptides. / A. Grosset, K. Moskowitz, C. Nelsen, T. Pan, E. Davidson, C.S. Orser // Peptides. 2005. - Vol. 26. - № 11. - P. 2193-2200.

81. Grays E. Protein folding pathology in domestic animals. / E. Grays // J Zhejiang. Univ. Sci. 2004. - Vol. 5. - № 10. P. 1226-1238.

82. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. / T.A. Hall // Nucl. Acids. Symp. Ser.- 1999. № 41. - P. 95-98.

83. Haritani M. Hydrated autoclave pretreatment enhancement of prion protein immunoreactivity in formalin-fixed bovine spongiform encephalopathy-affected brain / M. Haritani, Y. I. Spencer, G.A.H. Wells // Acta Neuropathol.- 1992.-№ 87. -P.86-90.

84. Harris D.A. Cellular biology of prion diseases. / D.A. Harris // Clin. Microbiol. Rev. 1999. - Vol. 12. - № 3. - P. 429-444.

85. Hegde R.S. A Transmembrane Form of the Prion Protein in Neurodegenerative Disease / R.S. Hegde // Science. 1998 - № 279. - P. 827-834.

86. Hedge R.S. Regulation of protein biogenesis at the endoplasmic reticulum membrane. / R.S. Hedge, V.R.Lingappa // Trends Cell. Biol. 1999. - Vol. 9.- № 4. P. 132-137.

87. Herrmann L. M. Cellular prion protein is expressed on peripheral blood mononuclear cells but not platelets of normal and scrapie-infected sheep / L.M. Herrmann et al. // Haematologica. 2002. - № 86. - P. 146-153.

88. Hilton D. A. Accomulation of prion protein in tonsil and appendix: review of tissue samples./ D.A. Hilton, A.C. Ghani, L. Conyers, P. Edwards, L. McCardle, D. Ritchie, M. Penney, J.W. Ironside.// Brit. Med. J. 2002. - Vol. 325. - № 7365. - P. 633-634.

89. Hilton D.A. Prevalence of lymphoreticular prion protein accumulation in UK tissue samples. / D.A. Hilton, A.C. Ghani, L. Conyers, P. Edwards, L. McCardle, D. Ritchie, M. Penney, D. Hegazy, J.W. Ironside. // J. Pathol. -2004.-Vol. 203.-№3.-P. 733-739.

90. Hilton D. A. Pathogenesis and prevalence of variant Creutzfeldt-Jacob disease. / D.A. Hilton // J.Pathol. 2006. - Vol. 208. - № 2. - P. 134-141.

91. Holada K. Different levels of prion protein (PrPc) expression on hamster, mouse and human blood cells. / K. Holada, L.G. Vostal // Br. J.Hematol. -2000. Vol. 110. - № 2. - P. 472-480.

92. Hornshaw M.P. Copper binding to the N-terminal tandem repeat regions of mammalian and avian prion protein. / M.P. Hornshaw, J.R. McDermott, J.M. Candy//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. -№ 207. - P. 621-629.

93. Houston F. Transmission of BSE by blood transfusion in sheep. / F. Houston, J.D. Foster, A. Chong, N. Hunter, C.J. Bostock // Lancet. 2000. -Vol. 356. №9234.-P. 999-1000.

94. Hunter N. Transmission of prion disease by blood transfusion. / N. Hunter, J. Foster, A. Chong, S. McCutcheon, D. Parnham, S. Eaton, C. MacKenzie, F. Houston // J. Gen. Virol. 2002. - Vol. 83. - № 11. - P. 2897-2905.

95. Ingrosso L. Molecular diagnostics of transmissible spongiform encephalopathies. / L. Ingrosso, V. Vetugno, F. Cardone, M. Pocchiari // Trend Mol. Med. 2002. - Vol. 8. - № 6. - P. 273-280.

96. Jackson G.S. Reversible conversion of monomeric human prion protein between native and fibrilogenic conformations. / G.S. Jackson, L.L. Hosszu,

97. A. Power, A.F. Hill, J. Kenney, H. Saibil, C J. Craven, J.P. Waltho, A.R. Clarke, J. Collinge // Science. 1999. - Vol. 283. -№ 5409. - P. 1935-1937.

98. Jackson G.S. The molecular pathology of CJD: old and new variants. / G.S. Jackson, J. Collinge // J. Mol. Pathol. 2001. - Vol. 54. - № 6. - P. 393399.

99. Jackson G.S. Location and properties of metal-binding sites on the human prion protein. / G.S. Jackson, I. Murray, L.L. Hosszu, N. Gibbs, J.P. Waltho, A.R. Clarke, J. Collinge// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. - № 98. - P. 8531-8535.

100. Jarrett J.T. Seeding "one-dimensionalcrys tallization" of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie ? / J.T. Jarret, P.T.Lansbury.//Cell. 1993. -№ 73. - P. 1055-1058.

101. Jones E.M. Fibril conformation as the basis of species- and strain-dependent seeding specificity of mammalian prion amyloids. / E.M. Jones, W.K. Surewicz// Cell. -2005. -Vol. 121.-№ l.-P. 63-72.

102. Kitamoto T. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids / T. Kitamoto, K. Ogomori, J. Tateishi, S.B. Prusiner // Lab. Invest. 1987. - Vol. 57. - № 2. - P. 230-236.

103. Klohn P.C. A quantitative, highly sensitive cell-based infectivity assay for mouse scrapie prions. / P.C. Klohn, L. Stoltze, E. Flechsig, M. Enari, C. Weissmann // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100. № 20. - P. 11666-11671.

104. Kneipp J. Molecular changes of preclinical scrapie can be detected by infrared spectroscopy. / J. Kneipp, M. Beekes, P. Lasch, D. Naumann// J. Neurosci. 2002. - Vol. 22. - № 8. - P. 2989-2997.

105. Kocisko D.A. Cell-free formation of protease-resistant prion protein. / D.A. Kocisko, J.H. Come, S.A. Priola, B. Chesebro, G.J. Raymond, P.T. Lansbury, B. Caughey // Nature. 1994. - Vol. 370. - № 6489. P. 471-474.

106. Kohler G.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity / G. Kohler, C. Milstain // Nature. 1976. - Vol.256. -P.495-497.

107. Kordek R. The diagnosis of human prion disease. / R. Kordek // Folia Neuropathol. 2000. - Vol. 38. -№ 4. -P. 151-160.

108. Korth C. Prion (PrPsc)-specific epitope defined by a monoclonal antibody. / C. Korth, B. Stierli, P. Streit, M. Moser, O. Schaller, R. Fischer, W. Schulz' Schaeffer, H. Kretzschmar, A, Raeber, U. Braun, F. Ehrensperger, S.

109. Hornemann, R. Glockshuber, R. Riek, M. Billeter, K. Wuthrich, B. Oesch // ( Nature. 1997. - Vol. 390. - № 6655. - P. 74-77.

110. Korth C. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgen. / C. Korth, K. Kaneko, D. Groth, N. Heye, G. Telling, J. Mastrianni, P. Parchi, P. Gambetti,

111. R.Will, J. Ironside, C. Heinrich, P. Tremblay, S.J. DeArmond, S.B. Prusiner // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003. - Vol. 100. - № 8. - P. 4784-4789.

112. Kuzuhara S. Gerstmann-Straussler-Scheinker's disease. / S. Kuzuhara, I. Kanazawa, H. Sasaki, T. Nakanishi, K. Shimamura // Ann. Neurol. 1983. -Vol. 14. №2.-P. 216-225.

113. Kyhse-Andersen J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus with-out buffer tank for rapid transfer of protein from polyacrylamide to nitrocellulose / J. Kyhse-Andersen // J. Biophys. Biochem. Meth. 1984. - № 10.-P. 203-209.

114. Lachmann H.J. Systemic amyloidosis. / H.J. Lachmann, P.N. Hawkins // Current Opinion in Pharmacology 2006. - № 6. - P. 214-220.

115. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - № 227. - P. 680-685.

116. Lane A. Polymeric ligands with specificity for aggregated prion protein. / A. Lane, C.J. Stanley, S. Dealler, S.M. Wilson // Clin. Chem. 2003. - Vol. 49. -№ 10.-P. 1774-1775.

117. Laurent M. Autocatalytic processes in cooperative mechanisms of prion diseases. / M. Laurent // FEBS Lett. 1997. - № 407. - P. 1-6.

118. Le Nel A. Controlled proteolysis of normal and pathological prion protein in a microfluidic chip. / A. Le Nel, N. Mine, C. Smadja, M. Slovakova, Z. Bilkova, J.M. Peyrin, J.L. Viovy, M. Taverna // Lab. Chip. 2008. - Vol. 8. -№2.-P. 294-301.

119. Leffers K.W. Assembly of natural and recombinant prion protein into fibrils. / K.W.Leffers, H. Wille, J. Stohr, E. Junger, S.B. Prusiner, D. Riesner // Biol. Chem. 2005. - Vol. 386. - № 6. - P. 569-580.

120. Legname G. Synthetic mammalian prions. / G. Legname, I.V. Baskakov, H.O. Nguyen, D. Riesner, F.E. Cohen, S.J. DeArmond, S.B. Prusiner // Science. 2004. - Vol. 305. - № 5684. P. 673-676.

121. Lehto M. Current and future molecular diagnostics for prion diseases. / M. Lehto, H.E. Peery, N.R. Cashman // Expert Rev. Mol. Diagn. 2006. - Vol. 6.-№4.-P. 597-611.

122. Liberski P.P. Isolation and purification of scrapie-associated fibrils and prion protein from scrapie-infected hamster brain. / P.P. Liberski, A. Plucienniczak, E. Hrabec, A. Bogucki // J. Comp. Pathol. 1989. - Vol. 100. - № 2. - P. 177-185.

123. Liberski P.P. The ultrastructural diversity of scrapie-associated fibrils isolated from experimental scrapie and Creutzfeldt-Jakob disease. / P.P. Liberski, P. Brown, S.Y. Xiao, D.C. Gajdusek // J. Comp. Pathol. 1991. -Vol. 105. - № 4. - P. 377-386.

124. Llewelyn C. A. Possible transmission of variant Creutzfeldt-Jacob disease by blood transfusion. / C.A. Llewelyn, P.E. Hewitt, R.S. Knight, K. Amar, S. Cousens, J. Mackenzie, R.G. Will // Lancet. 2004. - Vol. 363. - № 9407. -P. 417-421.

125. M'Go wan J.P. // J.Comp.Path. & Therap. 1918. - № 31. - P. 278.

126. MacGregor I. Distribution normal prion protein in blood. /1. MacGregor, O. Drummond, Turner M, R. Barclay, C. Prowse // Trunsfusion Sci. — 2000. -Vol. 22. № 1-2.-P. 51.

127. Maissen M. Plasminogen binds to disease-associated prion protein of multiple species. / M. Maissen, C. Roeckl, M. Glatzel, W. Goldmann, A. Aguzzi// Lancet. -2001. Vol. 357. -№ 9273. - P. 2026-2028.

128. Makarava N. Expression and purification of full-length recombinant PrP of high purity. / N. Makarava, I.V. Baskakov // Methods Mol. Biol. 2008. - № 459.-P. 131-143.

129. McBride P. A. PrP protein is associated with follicular dendritic cells of spleens and lymph nodes in uninfected and scrapie-infected mice / P.A. McBride, P. Eikelenboom, G. Kraal, H. Fraser, M.E. Bruce // J. Pathol. -1992.-Vol. 168.-№4-P. 413-418.

130. McGregor I. Immunoassay of human plasma cellular prion protein. /1. McGregor, O. Drummond // Transfusion. 2001. - Vol. 41. - №1. - P. 6166.

131. Mead S. Prion disease genetics. / S. Mead // Eur. J. Hum. Genet. 2006. -Vol. 14. -№ 3. - P. 273-281.

132. Miele G. A novel eritroid-specific marker of transmissible spongiform encephalopathies. / G. Miele, J. Manson, M. Clinton // Nat. Med. 2001. -Vol. 7. -№ 3. - P. 361-364.

133. Miller J.M. Immunohistochemical detection of prion protein in sheep with scrapie / J.M. Miller, A.L. Jenny, W.D. Taylor, R.F. Marsh, R. Rubenstein, R.E. Race // J.Vet.Diagn.Invest. 1993. - Vol. 5. - № 3. - P.309-316.

134. Miroux B. Over-production of proteins in Escherichia coli: Mutanthosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. / B. Miroux, J.E. Walker // J Mol Biol. 1996. - № 260. - P. 289-298.

135. Missler U. Measurment of glial fibrillary acidic protein in human blood: analytical method and preliminary clinical results./ U. Missler, M. Wiesmann, G. Wittmann, O. Magerkurth, H. Hagenstrom // Clin. Chem. 1999. - Vol. 45.-№ l.-P. 138-141.

136. Moronchini G., Kanu N., Solforosi L.et al. Motif-grafted antybodies containing the replicative interface of cellular PrP are specific for PrPsc. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2004. Vol. 101. № 28. - P. 10404-10409.

137. Moser M. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. / M. Moser, R.J. Collelo, U. Pott, B. Oesch // Neuron. 1995. - № 14. P. 509-517.

138. Murayama Y. Specific detection of prion antigenic determinants retained in bovine meat and bone meal by flow microbead immunoassay. / Y. Murayama, M. Yoshioka, H. Horii // J. Appl. Microbiol. Vol. 101. - № 2. -P. 369-376.

139. Nakane P. Peroxydase labeled antibody. A new method of conjugation. / P. Nakane, A. Kawaoi // J.Histochem.Cytochem. 1974. - Vol. 22. - № 12. - P. 1084-1091.

140. Novitskaya V. Probing the conformation of the prion protein within a single amyloid fibril using a novel immunoconformational assay./ Novitskaya V., Makarava N., Bellon A., Bocharova O.V. // J. Biol. Chem. 2006. - Vol. 281.-№22.-P. 15536-15545.

141. Orem N.R. Copper (II) ions potently inhibit purified PrPres amplification./ N.R. Orem, J.C. Geoghegan, N.R. Deleault, R. Kascsak, S. Supattapone // J. Neurochem. 2006. - Vol. 96. - № 5. - P. 1409-1415.

142. O'Rourke K. I. Preclinical detection of PrP-Sc in nictitating membrane lymphoid tissue of sheep / K.I. O'Rourke, T.V. Baszler, S.M. Parish, D.P.Knowles // Vet. Rec. 1998. - Vol. 142.-№ 18.-P. 489-491.

143. Pammer J. Human keratinocytes express cellular prion-releated proteinin vitro and during inflammatory skin disease. / J. Pammer, W. Weninger, E. Tschachler//Am. J.Pathol.- 1998.-Vol. 153.-P. 1353-1358.

144. Pan K.M. Purification and properties of the cellular prion protein from Syrian hamster brain. / K.M. Pan, N. Stahl, S.B. Prusiner// Protein Sci. -1992.l.-P. 1343-1352.

145. Pan T. Detection of misfolded prion protein in blood with conformationally sensitive peptides. / T. Pan, J. Sethi, C. Nelsen, A. Rudolph,

146. Cervenakova, P. Brown, C.S.Orser 11 Trunsfusion. 2007. - Vol. 47. - № 8.-P. 1418-1425.

147. Parveen I. The use of non- prion biomarkers for the diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies in the live animal. /1. Parveen, J. Moorby, G. Allison, R. Jackman // Vet. Res. 2005. - Vol. 36. - № 5-6. - P. 665-683.

148. Pastrana M.A. Isolation and characterization of a proteinase K-sensitive PrPsc fraction. / M.A. Pastrana, G. Sajnani, B. Onisko, J. Castilla, R. Morales, C. Soto, J.R. Requena// Biochemistry. 2006. - Vol. 45. -№ 51. - P. 1571015717.

149. Peden A. H. Preclinical vCDJ after blood transfusion in PRNP codon 129 heterozygous patient. / A.H. Peden, M.W. Head, D.L. Ritchie, J.E. Bell, J.W. Ironside // Lancet. 2004. - Vol. 364. - № 9433. - P. 527-529.

150. Peretz D. Strain-specified relative conformational stability of the scrapie prion protein. / D. Peretz, M.R. Scott, D. Groth, R.A., Williamson., D.R. Burton, F.E. Cohen, S.B. Prusiner // Protein Sci. 2001. - Vol. 10. - № 4. -P. 854-863.

151. Perini F. Prion protein released by platelets. / F. Perini, B. Frangione, F. Prelli//Lancet. 1996. Vol. 347.-№ 9015. - P. 1635-1636.

152. Pertinhez T.A. Stimulation and inhibition of fibril formation by a peptide in the presence of different concentrations of SDS. / T.A. Pertinhez, M. Bouchard, R.A Smith., C.M. Dobson, L.J. Smith // FEBS Letters. 2002. -Vol. 529. - № 2-3. - P. 193-197.

153. Picard-Hagen N. Prion protein in cerebrospinal fluid of healthy and naturally scrapie-affected sheep. / N. Picard-Hagen, V. Gayrard, C. Viguie, M. Moudjou, C. Imbs, P.L. Toutain // J.Gen.Virol. 2006. - Vol. 87. - № 12. -P. 3723-3727.

154. Politopoulou G. Age-releated expression of cellular prion protein in human peripheral blood leukocytes. / G. Politopoulou, J.D. Seebach, M. Schmugge, H.P. Schwarz, A. Aguzzi // Haematologica. 2000. - Vol. 85. P. 580-587.

155. Prusiner S.B. Molecular biology of prion diseases / S.B. Prusiner // Science. 1991.-Vol. 252.-№ 5012-P. 1515-1522.

156. Prusiner S.B. Novel proteinaceous infection particles cause scrapie / S.B. Prusiner// Science. 1982. - Vol. 216. -№ 4542. - P. 136-144.

157. Prusiner S.B. Prion diseases of the central nervous system. / S.B. Prusiner, S.J. DeArmond // Monogr. Pathol. 1990. - № 32. - P. 86-122.

158. Prusiner S.B. Prions / S.B. Prusiner // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. -Vol. 95.-№23.-P. 13363-13383.

159. Prusiner S.B. The prion diseases./ S.B. Prusiner // Brain Patology. 1998. -Vol. 8. — № 3. - P. 499-513.

160. Requena J.R. Oxidation of methionine residues in the prion protein by hydrogen peroxide. / J.R. Requena, M.N. Dimitrova, G. Legname, S. Teijeira, S.B. Prusiner, R.L. Levine // Arch. Biochem. Biophys. 2004. - Vol. 432. -№2.-P. 188-195.

161. Riek R. NMR structure of the mouse prion protein domain PrP(121-231). / R. Riek, S. Hornemann, G. Wider, M. Billeter, R. Glockshuber, K.Wuthrich.// Nature(Lond-). 1996. - Vol. 382. -№ 6587. - P. 180-182.

162. Riek R. NMR characterization of the full-length recombinant murine prion protein, mPrP(23-231). / R. Riek, S. Hornemann, G. Wider, M. Billeter, R.

163. Glockshuber, K. Wuthrich. // FEBS Lett. 1997. Vol. 413. - № 2. - P. 282288.

164. Rivera-Milla E. An evolutionary basis for scrapie disease: identification of a fish prion mRNA. / E. Rivera-Milla, C.A. Stuermer, E. Malaga-Trillo // Trends Genetics. 2003. - Vol. 19. - № 2. - P. 72-75.

165. Robertson C. Cellular prion protein is released on exosomes from activated platelets. / C. Robertson, S.A. Booth, D.R. Beniac, M.B. Coulthart, T.F. Booth, A. McNicol // Blood. 2006. - Vol. 107. - № 10. - P. 3907-3911.

166. Rubenstein R. Detection and discrimination of PrPsc by multi-spectral ultraviolet fluorescence. / C. Robertson, S.A. Booth, D.R Beniac, M.B. Coulthart, T.F. Booth, A. McNicol // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1998.-Vol. 246. -№ l.-P. 100-106.

167. Saá P. Cyclic amplification of protein misfolding and aggregation. / P. Saá, J. Castilla, C. Soto // Methods Mol. Biol. 2005. - № 299. - P. 53-65.

168. Saborio G.P. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. / G.P. Saborio, B. Permanne, C. Soto // Nature. 2001. - V. 411. - № 6839. - P. 810-813.

169. Safar J. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. / Safar J., Wille H., Itri V., Groth D., Serban H., Torchia M., Cohen F.E., S.B. Prusiner // Nat. Med. 1998. - Vol. 4. - № 10. - P. 11571165.

170. Sakudo A. Recent developments in prion disease research: Tools and in vitro cell culture models. / A. Sakudo, I. Nakamura, K. Ikuta, T. Onodera // J. Vet. Med. Sci. 2007. - Vol. 69. - № 4. - P. 329-337.

171. Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. -2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY.

172. Sanchez-Valle R. 14-3-3 Protein isoforms and atypical patterns of the 143-3 assay in the diagnosis of Creutzfeldt-Jakob disease. / R. Sanchez-Valle, A. Saiz, F. Graus // Neurosci. Lett. 2002. - Vol. 320. - № 1-2. - P. 69-72.

173. Schmitt-Ulms G. Evolutionary Descent of Prion Genes from the ZIP Family of Metal Ion Transporters / G. Schmitt-Ulms, S. Ehsani, J.C. Watts, D.Westaway, H. Wille // PLoS One. 2009. - Vol. 4 - № 9. - P. 1-13.

174. Schofield F.W. 1938 Rpt. Ont.Vet. College - P.34.

175. Shaked Y. A C-terminal-truncated PrP isoform is present in mature sperm. / Y. Shaked, H. Rosenmann, G. Talmor, R. Gabizon // J.Biol. Chem. 1999. -Vol. 274. -№ 45. - P. 32153-32158.

176. Somerville R.A. Structural and biochemical evidence that scrapie-associated fibrils assemble in vivo. / R.A. Somerville, L.A. Ritchie, P.H. Gibson // J. Gen. Virol. 1989. - Vol. 70. - № 1. - P. 25-35.

177. Somerville R.A. Transmissible spongiform encephalopathy strain, PrP genotype and brain region all affect the degree of glycosylation of PrPSc. / R.A. Somerville, S. Hamilton, K. Fernie// J. Gen. Virol. 2005. -№ 86. - P. 241-246.

178. Soto C. Protein misfolding and neurodegeneration. / C. Soto, L.D. Estrada //Arch Neurol.-2008.-Vol. 65.-№2.-P. 184-189.

179. Stack M. Western immunoblotting techniques for the study of transmissible spongiform encephalopathies. // Methods and tools in biosciences and medicine- techniques in prion research. Ed. Lehmann S.,Grassi J. P. 97-116. - Birkhauser Verlag. Berlin

180. Stahl N. Scrapie prion protein contains a phosphatidylinositol glycolipid. / N. Stahl, D.R. Borchelt, K. Hsiao, S.B. Prusiner // Cell. 1987. - № 51. - P. 229-240.

181. Stohr J. Mechanisms of prion protein assembly into amyloid. / J. Stohr, N. Weinmann, H. Wille, T. Kaimann, L. Nagel-Steger, E. Birkmann, G. Panza, S.B. Prusiner, M. Eigen, D. Riesner // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. -Vol. 105.-№7.-P. 2409-2414.

182. Supattapone S. Prion protein conversion in vitro. / S. Supattapone // J. Mol. Med. 2004. - Vol. 82. - № 6. - P. 348-356.

183. Surewicz W.K. The Emerging Principles of Mammalian Prion Propagation and Transmissibility Barriers: Insight from Studies inVitro. / W.K. Surewicz,

184. E.M. Jones, A.C. Apetri // Acc. Chem. Res. 2006. - № 39. - P. 654-662.

185. Swerdlow R H. Pathogenesis of Alzheimer's disease / R.H. Swerdlow // Clin Interv Aging. 2007. - Vol. 2. - № 3. - P. 347-359.

186. Swietnicki W. Aggregation and fibrillization of the recombinant human prion protein huPrP 90-231./ W. Swietnicki, M. Morillas, S.G. Chen, P. Gambetti, W.K. Surewicz // Biochemistry. 2000. - Vol. 39. - № 2. - P. 424431.

187. Tanaka M. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. / M. Tanaka, P. Chien, N. Naber, R. Cooke, J.S. Weissman // Nature. 2004. - Vol. 428. - № 6980. - P. 323-328.

188. Tcherkasskaya O. Conformational biosensor for diagnosis of prion disease. / O. Tcherkasskaya, E. A. Davidson, M.J. Schmerr, C. S. Orser // Biotechnology Letters. 2005. - Vol. 27. - № 9. - P. 671-675.

189. Telling G.C. N-terminally tagged prion protein supports prion propagation in transgenic mice / G.C. Telling, P. Tremblay, M. Torchia, S.J. Dearmond,

190. F.E. Cohen, S.B. Prusiner // Protein Science. 1997. - Vol. 6. - № 4. - P. 825-833.

191. Torrent J. High pressure induces scrapie-like prion protein misfolding and amyloid fibril formation. / J. Torrent, M.T. Alvarez-Martinez, M.C. Harricane, F. Heitz, J.P. Liautard, C. Balny, R. Lange // Biochemistry. 2004. -Vol. 43.-№22.-P. 7162-7170.

192. Trieschmann L. Ultra-sensitive detection of prion protein fibrils by flow cytometry in blood from cattle affected with bovine spongiform encephalopathy. / L. Trieschmann, A. Navarrete Santos, K. Kaschig, S.

193. Torkler, E. Maas, H. Schatzl, G. Bohm // BMC Biotechnol. 2005. - Vol. 5. -P. 26.

194. Wadsworth J.D. Tissue distribution of protease resistant prion protein in variant Creutzfeldt-Jakob disease using a highly sensitive immunoblotting assay / J.D. Wadsworth // Lancet. 2001. - № 358. - P. 171-180.

195. Watts J. C. The prion protein family: diversity, rivalry, and dysfunction. / J.C. Watts, D. Westway // Bioch. Bioph. Acta. 2007. - Vol. 1772. - № 6. -P. 654-672.

196. Wells G.A.H. Recently described scrapie-like encephalopathies of animals: case definitions / G.A.H. Wells, I.S. McGill // Res. Vet. Sci. 1992. - Vol. 53.-№ l.-P. 1-10.

197. WHO Guidelines on Tissue Infectivity Distribution in Transmissible Spongiform Encephalopathies, 2006

198. Wickner RB. Prions of fungi: inherited structures and biological roles. / R.B. Wickner, H.K. Edskes, F. Shewmaker, T. Nakayashiki // Nat Rev Microbiol.-2007.-Vol. 5.-№8.-P. 611-618.

199. Williams E.S. Spongiform encephalopathies in cervidae / E.S. Williams, S. Young// Rev. Sci. Tech. OIE. 1982. - № 11. - P. 551-567.

200. Williamson R. A. Mapping the prion protein using recombinant antibodies./ R.A. Williamson, D. Peretz, C. Pinilla, H. Ball, R.B. Bastidas, R. Rozenshteyn, R.A. Houghten, S.B. Prusiner, D.R. Burton // J.Virol. 1998. -Vol. 72. -№ 11.-P. 9413-9418.

201. Winklhofer K.F. A sensitive filter retention assay for the detection of PrPSc and the screening of anti-prion compounds / K.F. Winklhofer, F.U. Harlt, J. Tatzelt // FEBS Lett. 2001. - Vol. 503. - №. 1. - P. 41-45.

202. Yakovleva O. Effect of protease treatment on plasma infectivity in variant CJD mice. / O. Yakovleva, A. Janiak, C. McKenzie, L. McShane, P. Brown, L.Cervenakova // Transfusion. 2004. - Vol. 44. - № 12. - P. 1700-1705.

203. Yang W.C. Capillary electrophoresis-based noncompetitive immunoassay for the prion protein using fluorescin-labeled protein as a fluorescent probe. /

204. W.C. Yang, M.J. Schmerr, R. Jackman, W. Bodemer, E.S. Yeung // Anal. Chem. 2005. - Vol. 77. - № 14. - P. 4489-4494.

205. Ye X. Astrocytosis and amyloid deposition in scrapie-infected hamster. / X. Ye, A.C. Scallet, R.J. Kascsak, R.I. Carp // Brain Res. 1998. - Vol. 809.- № 2. P. 277-287.

206. Zahn, R., A. Liu, T. Luhrs, R. Riek, C. vonSchroetter, F.L. Garcia, M. Billeter, L. Calzolai, G. Wilder, and K. Wuthrich. NMR solution structure of the human prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 2000. - Vol. 97. - № l.-P. 145-150.

207. Zou W.Q. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. / W.Q. Zou, N.R. Cashman // J. Biol. Chem.- 2002. Vol. 277. - № 46. - P. 43942-43947.

208. Zou W. Q. Antybody to DNA detectes scrapie but not normal prion protein. / W.Q. Zou, J. Zheng, D.M. Gray, P. Gambetti, S.G. Chen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004. - Vol. 101.-№5.-P. 1380-1385.

Информация о работе

Покидышев, Алексей Николаевич
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Характеристика рекомбинантного прионного белка крупного рогатого скота (Bos taurus) и разработка методов выявления патологической изоформы прионов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы