Получение поликлональных антител к синтетическому пептиду прионного белка и определение их специфичности

Савенко, Наталья Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение поликлональных антител к синтетическому пептиду прионного белка и определение их специфичности
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение поликлональных антител к синтетическому пептиду прионного белка и определение их специфичности"

На правах рукописи

Савенко Наталья Борисовна

Получение поликлональных антител к синтетическому пептиду прионного белка и определение их специфичности

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2005

Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии (ВИЭВ) им. Я.Р. Коваленко.

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук, профессор Лев Петрович Дьяконов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Сергей Сергеевич Рыбаков (ВНИИЗЖ)

Кандидат биологических наук Ольга Ивановна Конюшко (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. МЛ. Чумакова РАМН)

Ведущая организация - Московская государственная Академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина

Защита диссертации состоится 12 октября 2005 г. в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 006.033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко по адресу: 109428, Москва, Рязанский пр-т., д. 24, корп. 1, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан « б »,

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор ветеринарных на; профессор

Н.П. Овдиенко

jesü

MV1

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Прионные болезни представляют группу нейродегенерахивных расстройств человека (болезнь Крейдфельдта-Якоба (БКЯ), сицдром Гфнпманна-Штройслера, куру) и жйеошых (скрепи овец и коз, трансмиссивная энцефалопатия норок, хроническая изнуряющая болезнь диких оленей и лосей), которые являются причиной нарушений в ЦНС и неизбежно ведут к гибели (SB.Prusiner, 1992).

Многочисленными исследованиями доказано, что прионы - возбудители коровьего «бешенства» могут служил, причиной заболевания человека (Ihackray AM, Klein MA, Aguzzi A, Bujdoso R., 2002). Это заболевание названо новым вариантом болезни Крейцфельдта - Якоба (вБКЯ), которое в отличие от ранее известного заболевания встречается в молодом возрасте. По сравнению со спорадической формой БКЯ, вБКЯ вызывается штаммами прионов, обладающими высокой лимфотропнослью. Доказательством лимфотропизма прионов, вызывающих вБКЯ, стало обнаружение в Великобритании в ходе руганного мониторинга в миндалинах и аппендиксах патогенного приона от людей, умерших в возрасте 10-50 лет (в их числе 70% молодых людей в возрасте 20-29 лет, т.е. среднем возрасте проявления вБКЯ). Высокий процент инфицирования людей инфекционнм прионом связывают с возможностью передачи вБКЯ путем гемотрансфузии (Llewelyn CA, HewittPE., Knight R.S. et al., 2004).

Диагностика прионных болезней до недавнего времени базировалась на выявлении характерных клинических признаков, а также патогисшлошческом исследовании головного мозга. Предложены методы иммуногисгохимии, иммунохимии и др. для посмертной или послеубойной диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота (BSE), скрепи овец и коз (KüblerE., Oech B.,.Raeber AJ., 2003).

Разработка чувствительных специфических методов детекции минимальных количеств PrP* у животных, зараженных прионами, в инкубационном и раннем клиническом периодах болезни, в культурах клеток, сыворотках крови и других биологических жидкостях, приобретает особую значимость. Учитывая, что РгР^ адаптирован к развитию кроме нервной ткани, в лимфоцитах, фолликулярных дендритных клетках, рядом авторов предложены методы доклинического выявления прионов иммуношстохимическим методом в миндалинах, а также в лимфатических узлах конъюнктивы глаза овец (О" Rouike et aL, 1998, 1999; Mackenzie A, 1983; RubensteinR,KascsakR.,MeizP. etaL, 1986) с использованием моноклональных антител к синтетическому прионному пеппщу. В России Вольпиной ОМ, Рыбаковым С.С. и др., (2002), Рыбаковым С.С. и др., (2005) получены псшиклональные антитела к различным синтетическим фрагментам прионного белка и показана их специфичность при иммуногастохимической детекции прионов в гастосрезах головного мозга больных BSE животных.

Необходимо тестировать культуры клеток, полученных из органов и тканей сельскохозяйственных животных и используемых в биотехнологии и вирусологии, на присутствие прионов, а также создание клеточных линий, чувствительных к агенту скрепи, для изучения различных аспектов взаимодействия прионов с клеткой.

Цель работы: получить поликлональные антитела к синтетическим пептидам прионного белка и проверить их специфичность к клеточной и инфекционной изоформам прионного протеина.

Основные задачи исследований:

1. Провести иммунизацию лабораторных животных (кроликов, мышей) синтетическим пептидом прионного белка с аминокислотной последовательностью 106-134 (по бычьему пептиду) и получить сыворотку, содержащую поликлональные антитела к пептиду прионного белка, способную специфически связываться с прионным белком.

2. Получить гибридные культуры, продуцирующие моноклональные антитела к синтетическому пептиду прионного белка, отвечающие за специфическое связывание с прионным белком.

3. Изучить активность поли- и моноклональных антител к прионам в различных реакциях.

Научная новизна работы. Получены поликлональные антитела на синтетический пептид прионного белка с аминокислотной последовательностью 106-134 (по бычьему пептиду).

Определена способность иммунной поликлональной кроличьей сыворотки выявлять инфекционный прион в гистосрезах головного мозга животных, больных ТГЭ и культурах клеток, инфицированных агентом скрепи.

Впервые получены межвидовая гибридная культура спленоциты овцы х лимфоциты кролика (ПО ТК" х Ж) и мышиная гибридома, продуцирующие моноклональные антитела к пептиду прионного белка. Культура ПО ТК'х Ж чувствительна к вирусам инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота.

Практическая значимость исследований. Специфические кроличьи антитела к синтетическому прионному пептиду способны выявлять прионы в культурах клеток и гистосрезах головного мозга.

Получена гибридная культура почка овцы х лимфоциты кролика, чувствительная к вирусам ИРТ и ВД-БС КРС (заявка на патент принята Г-59, ГСП-5 18.08.2005г., № 2005126087).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Получение поликлональных иммунных кроличьих сывороток к пептиду прионного белка.

2. Иммуноцитохимический и иммуногистохимический методы выявления инфекционного приона в культурах клеток, инфицированных агентом скрепи и гистосрезах головного мозга животных, больных ТГЭ с применением иммунной поликлональной кроличьей сыворотки.

ринотрахеита крупного рогатого скота, вирусной диареи - болезни слизистых, парагриппа-3, респираторно-синцитнальной инфекции и их цитопатогенного действия.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференция "1ЕКВМ -80 лет на передовом рубеже ветеринарной науки". Харьков, 2002; Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Подольск, 2002; Научной конференции, посвященной 300- летию основания Санкт -Петербурга "Биологическая, медицинская и ветеринарно- медицинская наука и новейшие технологии на благо человека и человечества." Санкт-Петербург, 2003 г.; Международной научной конференции «Развитие ключевых направлений с/х науки в Казахстане: селекция, биотехнология, генетические ресурсы» г. Астана, 2004 г; на 45-ом Международном конгрессе Европейского общества тканевых культур (ЕТСв), г. Мюнстер 2004 г; международной научной конференции «Сохранение генетических ресурсов» г. Санкт-Петербург, 2004 г.; Международной научной конференции «Ветеринарная медицина» г. Ялта, 2005 г; на межлабораторном совещании ВИЭВ, 2005 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, библиографический список использованной литературы и приложение. Материалы диссертации иллюстрированы 9 таблицами, 32 рисунками. Библиографический список литературы включает 187 источников, из которых 98 иностранных.

2. Собственные исследования.

Работа выполнена в 2001-2005 гг. в лаборатории клеточной биотехнологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, согласно заданию 02.01.20. РНТП «Осуществить поддержание и развитие уникальных коллекций клеточных культур животных, вакцинных и эпизоотических штаммов вирусов, бактерий, грибов, простейших. Создать новые культуры клеток-суперпродуцентов для биотехнологии методами клеточной инженерии».

2.1. Материалы и методы.

2.1.1. Культуры клеток, питательные среды.

В работе использовали мутантные перевиваемые линии клеток ПО ТК\ СПЭВ ИГ, клеток миелом Sp 2/0 ГГФРГ, P3x63.Ag8/653 ГТФРГ, хранящиеся в Криобанке ВИЭВ. Эксперименты по гибридизации, стандартные растворы и методики проводили и готовили согласно с «Методическими рекомендациями по гибридизации соматических клеток сельскохозяйственных животных». М, 1988, 11с. (Дьяконов Л.П., Кущ А.К., Тугизов Ш.М., Майджи Е.В.).

Иммунизацию животных проводили синтетическим пептидом прионного белка с аминокислотной последовательностью 106-134 по бычьему пептиду, синтезированным в ИБХ РАН, согласно договору о творческом сотрудничестве.

В качестве партнеров по слиянию использовали не растущие in vitro клетки селезенки мышей и кроликов, лимфоциты кроликов.

Для получения лимфоцитов брали кровь от иммунных кроликов (самок, 2-3 кг) в растворе гистопака (Sigma) 1:1, центрифугировали 10 минут при 1000 об/мин.

Получение первичнотрипсинизированной культуры клеток селезенки мышей и кроликов проводили согласно методическим рекомендациям по получению мутантных штаммов линий клеток, органов животных (Методические рекомендации по получению мутантных штаммов перевиваемых линий клеток с/х животных, пригодных для гибридизации. М., 1984,16 с. Авторы: Л.П. Дьяконов, A.A. Кущ, Ш.М. Тугизов).

В экспериментах по гибридизации в соответствии с "Методическими рекомендациями по получению мутантных штаммов перевиваемых линий клеток с/х животных, пригодных для гибридизации". М. 1^984,16с. -применяли раствор 5-бром-2-дезоксиуридина (5-БДУ) 500 мкг/20мл питательной среды. 5-БДУ использовали в концентрации от 4 до 150 мкг/мл.

В работе использовали стандартные питательные среды и растворы: среды Игла MEM, Игла MEM с двойным набором аминокислот, ДМЕМ, RPMI-1640, раствор версена (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), 0,25% раствор трипсина на рабочем растворе Хенкса без Са2+ и Mg2' , сыворотка крови эмбрионов КРС фирм НПО «Биолот» и «Sigma». В качестве необходимых добавок для роста миелом использовали: 0,05% 2-

меркаптоэтанол, 0,05 % пируват натрия. Для предотвращения бактериальной контаминации культур использовали: раствор этония из расчета 5-7 мкг/мл среды., 0,05% раствор энроксила, 0,01% амфотерицин В, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 ЕД/мл стрептомицина.

Все рабочие растворы стерилизовали фильтрацией через фильтры размером 0,22 мкм (Millipore, USA).

Культивирование клеток и хранение.

Культуры клеток поддерживали путем периодического пассирования в культуральных сосудах. Пересев монослойных культур осуществляли по мере формирования монослоя с помощью 0,02% версена и 0,25% трипсина в соотношении 7:1 бесцентрифужным методом с коэффициентом пересева 1:41:5. посевная концентрация монослойных культур 100 тыс. кл/мл. Суспензионные культуры пересевали с кратностью 48 часов, посевная концентрация 100 тыс. кл./мл, коэффициент пересева 1:9-1:10.

Цитологические и кариологические методы исследования.

Для приготовления цитологических препаратов клетки выращивали на покровных стеклах в пенициллиновых флаконах. Посевная концентрация составляла 1,5 - 2 х 105 кл/мл, объем суспензии 1,5-2 мл. Выросшие на стеклах клетки фиксировали в растворе Буэна или нейтральным формалином и окрашивали гематоксилин-эозином или азур-эозином по Романовскому -Гимзе.

Приготовления препаратов хромосом для цитогенетического анализа

В основу приготовления препарата положен метод Мурхеда- (i960), который предусматривает накопление в культуре клеток с помощью колхицина метафазных пластинок, обработку клеток гипотоническим раствором, фиксацию препаратов и их окрашивание.

2.1.2. Вирусные штаммы:

В работе использовали герпесвирус (возбудитель инфекционного ринотрахеита КРС), пестивирус (возбудитель диареи - болезни слизистых КРС), парамиксовирус (возбудитель парагриппа-3 КРС), латентный герпесвирус штамм "Movar" крупного рогатого скота. Работа по инфицированию и определению чувствительности культур клеток к вирусам проведена совместно с профессором Белоусовой Р.В., заведующей кафедрой вирусологии МГАВМиБ им. Скрябина К.И., за что выражаем ей большую благодарность.

Титрование вирусов в клеточных культурах.

Титрование вирусов проводили в клеточных культурах, где вирусы размножались с проявлением цитопатогенного эффекта. Учет цитопатогенного действия проводили микроскопированием зараженных культур, начиная с 10-18 часов после инокуляции и до 5-7 дней включительно.

Титр вирусов определяли по методу L.Reed, Н. Muench (1938) и выражали в тканевых цитопатогенных дозах в 1 мл (ТЦД 50/мл)-

2.1.3. Получение конъюгатов пептидов. Раствор 1,5 мг пептида и 3 мг KLH в 1 мл PBS перемешивали 30 мин, затем в течение 1 часа добавляли 400 мкл 0,5% водного раствора глутарового диальдегида. Реакционную массу перемешивали 15 часов, после чего диализовали против PBS с трехкратной сменой буфера.

2.1.4. Лабораторные животные.

В работе использовали самок белых мышей BALB/C 5-6 недельного возраста. Всего в ходе экспериментов использовали 114 опытных мышей и 114 контрольных. Было обескровлено 9 самок кроликов, весом по 2-3 кг. В постановке эксперимента руководствовались требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных.

Получение асцитной жидкости. Мышам внутрибрюшинно вводили пристан 0,5 мл на голову. Через 10-14 дней вводили взвесь клеток гибридомы в концентрации 107 клеток на голову.

Определение титра антител методом ИФА в крови иммунизированных животных и в асците: в лунки планшета (Nunc, MaxiSorp) вносили по 0.1 мл раствора пептида в 0.05 М Ыа-карбонатном буфере (pH 9.6) в концентрации 10 мкг/мл и инкубировали 16 ч при 4°С. Раствор пептида удаляли и плашку четырежды отмывали PBS, содержащим 0.05% Твин-20 (Merck). Подобные промывки проводили после каждой последующей стадии инкубации. В лунки вносили по 0.1 мл образцов сывороток в разведениях, начиная с разведения 1:10, и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Далее проводили инкубацию (1ч, 37°С) с конъюгированными с пероксидазой хрена антителами козы против иммуноглобулинов мышей (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалея) (0.1 мл, 1 мг/мл в PBS + Tween 20), а затем с раствором субстрата (0.1 мл): 0.05% перекись водорода и 0.05% о-фенилендиамин в 0.05 М Na-цитратном буфере, pH 4.5. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 12.5% H2S04. Оптическое поглощение при длине волны 492 нм измеряли на приборе Multiscan Plus MKII (Row Laboratories, Великобритания).

2.1.5. Методы детекции прионов.

Иммуноцитохимическое исследование клеточных культур на наличие прионов. Выявление прионного бежа в культурах клеток проводили согласно методическим рекомендациям (Дьяконов Л.П., Дагданова A.B., Куликова И.Л., Симонова A.C., Шубин В.А., Санджаев Д.Д. Изданы РАСХН., М., 16.01.2002г., 10с.). Методики проведения иммуногистохимии взяты из работ Zanusso G. et al., (1998); Barry R.A. & Prusiner S.B. (1986). *

Для выявления приона в сыворотках крови и белковых препаратах использовали метод Takekida К. et al., (2002) на основе ИФА.

Проведение Вестерн-блага.

Вестерн-блот анализ проводили согласно методике, описанной в работе Kascsak R.J., Rubinstein R., Merz P.A., Tonna-DeMasi M., Fersko R., Carp R.I., DiringerH., (1987).

Дот-блот анализ проводили согласно методике Merz P.A., Sommerville R.A., Wisniewski H.M., Igbal K., (1981).

2.2. Результаты исследований.

2.2.1. Получение поликлональных антител к синтетическому пептиду прионного белка. Оценка уровня антител в сыворотке крови иммунизированных животных в ЙФА.

У больных животных и человека не отмечают иммунного ответа на прионы, однако, синтетические фрагменты прионного белка способны вызывать иммунный ответ у лабораторных животных (мышей и кроликов). Предложено несколько методов иммунизации животных пептидами прионов (К. O'Rourke, 1998; Schmerr MJ. and coll., 1999; Короев Д.О., Котельников О.В., Вольпина О.М. и др., 2000; T. Yokoyama et al., 1996; Kasksak R.J. et al., 1987; Carsten Korth, Peter Streit, Bruno Oesch, 1999; Prusiner S.B., Валу R.A., 1985 и другие авторы). На этом основано получение поли- и моноклональных антител.

Для получения поликлональных иммунных сывороток к синтетическому пептиду прионного белка в работе использовали самок мышей линии BALB/C 5-6 - недельного возраста. Мышей иммунизировали по приведенным ниже схемам.

Метод 1. Мышей (10 голов) иммунизировали синтетическим пептидом прионного белка крупного рогатого скота с аминокислотной последовательностью 106-134, синтезированным Вольпиной О.М. и др. в институте биоорганической химии РАН. Каждой из б-недельных самок мышей BALB\c подкожно в два места ввели в общей дозе 100 мкг свободного пептида, растворенного в 100 мкл полного адыованта Фрэйнда дважды, с интервалом 45 суток. Усиливающее введение 100 мкг пептида без адыованта Фрэйнда провели спустя 10 суток внутривенно. Отбор крови и выявление титра антител в ИФА производили каждые 7 дней опыта, к моменту завершения эксперимента противопептидных антител у мышей обнаружено не было. Гибридизацию проводили на третий день после последней иммунизации с предварительным отбором крови для проведения ИФА на наличие антипептидных антител с любым результатом иммунизации.

Метод 2. Каждой из 14 6-недельных самок мышей BALB\c подкожно в два места ввели в общей дозе 10 мкг свободного пептида, растворенного в 200 мкл полного адьюванта Фрэйнда. Два усиливающих введения по 10 мкг пептида в 200 мкл неполного адьюванта Фрэйнда провели с 14-дневным интервалом. За три дня до слияния клеток мышей иммунизировали внутривенно 10 мкг пептида в фосфатно-буферном растворе без адьюванта. Взятие крови и постановку ИФА проводили каждые 7 суток опыта и через 3 суток после последней иммунизации, результат отрицательный. Убой мышей и гибридизацию спленоцитов проводили на 4 сутки после последней иммунизации.

Метод 3. Мышам (10 голов) (6-8 недельные самки) подкожно вводили трехкратно по 100 мкг свободного пептида в 1-ый день с полным адъювантом

Фрэйнда, в 21-ый и 42-ой дни с неполным адъювантом Фрэйнда, на 49-ый день ввели пептид внутрибрюшинно и на 50-ый - внутривенно без адъюванта. Выявление противопептидных антител проводили каждые 7 дней опыта, результат отрицательный. Убой мышей и гибридизацию спленоцитов проводили на 3 сутки после последней иммунизации.

Метод 4. 10 головам 6-недельных самок мышей ВАЬВ/с подкожно в 2 места вводили 10 мкг свободного пептида, растворенного в равном объеме полного адъюванта Фрэйнда, два усиливающих введения по 10 мкг пептида с неполным адъювантом Фрэйнда проводили с интервалом в 14 дней, последнее введение 10 мкг пептида проводили внутривенно без адъюванта. При еженедельном исследовании сыворотки крови метод не дал положительных результатов. Оценку уровня антител проводили каждые 7 суток опыта. Убой мышей и гибридизацию спленоцитов проводили спустя 3 дня последней иммунизации.

Метод 5. По этой методике провели 2 опыта, в каждый из которых брали по 10 мышей. Мышам (6-8 недельные самки) подкожно вводили трехкратно по 100 мкг свободного пептида с 2-недельным интервалом; при первой иммунизации с ПАФ, при 2 и 3 - в НАФ; четвертое введение - через 3 дня после третьего введения - вводили внутрибрюшинно без адъюванта 100 мкг пептида. Кровь на наличие противопептидных антител исследовали еженедельно и спустя 3 дня после последней иммунизации. Ни при одном из исследований антител к пептиду не обнаружили. Убой мышей и гибридизацию проводили непосредственно после получения результатов заключительного ИФА.

Метод 6. В методике использовали 12 голов мышей. 5-6-недельным самкам внутрикожно вводили 25 мкг/гол конъюгированного с гемоцианином синтетического пептида прионного белка в равном объеме с ПАФ; спустя 7 суток - ту же дозу пептида в ПАФ вводили в гранулему, образовавшуюся после первого введения. Бустер-введение через 2 недели той же дозой пептида в НАФ производили внутримышечно и внутрибрюшинно. Исследование на наличие противопептидных антител проводили еженедельно, результат - отрицательный. Убой осуществлялся через 7 дней после последней иммунизации. Силу иммунного ответа оценивали с помощью твердофазного ИФА (ИФА-тест). Положительным считали результат -1ц>2 (Таблица 1).

Таблица 1. Результаты иммунизации мышей синтетическим пептидом прионного белка при использовании различных методик иммунизации (-1й). ____,_

Метод опыта Метод 1 Метод 2 Метод 3 Метод 4 Метод 5 Метод 6

3 1,3

7 1,3 1,3 1,5 1,3

9 1,3

14 1,3 1,3 1,3 1,6

16 1,3

17 1,3

21 1,3 1,3 1,3 1,6

23 1,6

28 1,3 1,3 1,6 1,9

31 1,6 1,6

35 1,6 1,6 1,6 1,6

38 1,9

42 1,6 1,3 1,3

45 1,9

48 1,3

52 1,6

Обозначения: жирным шрифтом выделепы дни завершения иммунизации, убоя мышей и проведения гибридизации.

Из приведенных данных видно, что ни при одной из схем иммунизации мыши не дали иммунного ответа с достоверным результатом при иммунизации синтетическим пептидом прионного белка.

Получение поликлональных антител иммунизацией кроликов.

В качестве положительного контроля использовали иммунную сыворотку, полученную в ИБХ РАН, в качестве отрицательного - сыворотку крови неиммунных кроликов.

Для получения кроличьей поликлональной сыворотки использовали следующие методики иммунизации животных:

Метод 1. По этой методике было произведено 2 опыта. Кроликов массой 2-3 кг иммунизировали внутримышечно вдоль позвоночника в б точек свободными пептидами 3-кратно в дозе 500 мкг/гол (для первых двух иммунизаций) и 50 мкг/гол для 3-ей иммунизации (по методу Вольпиной О.М., 2002). Второе и третье ведение пептида проводили через 33 и 42 суток после первой иммунизации. Взятие крови и определение титра антител в ИФА проводили каждые 7 дней опыта. Титр антител нарастал спустя 10 дней после второй иммунизации и давал положительный результат, т.е. был в 2

раза выше контрольных показателей. Максимальный титр антител наблюдался на 52 сутки опыта.

Взятие крови и селезенки произвели через 10 дней после последней иммунизации.

Метод 2. Был произведен 1 опыт. Одного кролика массой 2-3 кг иммунизировали 500 мкг свободного пептида, растворенного в ПАФ (для первой иммунизации) и в НАФ (для второй иммунизации) внутримышечно вдоль позвоночного хребта в 6 мест дважды с интервалом 14 дней. Третью иммунизацию проводили через 35 дней, внутривенно, 50 мкг пептида. Кровь для проведения ИФА отбирали из краевой ушной вены каждые 7 дней опыта, титр противоприонных антител нарастал после второй иммунизации и достиг максимального количества к 63 суткам опыта.

Метод 3. По методике был произведен 1 опыт. Кроликов массой 2-3 кг иммунизировали внутримышечно вдоль позвоночника в 6 точек пептидами, конъюгированными с гемоцианином, 3-кратно в дозе 500 мкг/гол (для первых двух иммунизаций) и 50 мкг/гол для 3-ей иммунизации (по методу Вольпиной О.М., 2002). Второе и третье ведение пептида проводили через 33 и 42 суток после первой иммунизации. Первое введение производили в ПАФ, второе и третье в НАФ. При такой иммунизации кроликов, титр противопептидных антител нарастал слабо, и к 63 суткам опыта не достиг уровня, который можно было бы назвать положительной реакцией. Согласно методике, кролик должен был дать иммунный ответ в достаточном титре, но этого не произошло, четвертое введение произвели свободным пептидом в дозе 50 мкг/гол на 46 сутки опыта, пятое введение свободного пептида произвели на 60 сутки опыта внутривенно. Взятие крови производилось через 7 дней после каждой иммунизации и к 63 суткам опыта не достиг уровня, который можно было бы считать положительным. Кролики были убиты и обескровлены.

Силу иммунного ответа оценивали с помощью твердофазного ИФА (ИФА-тест). Положительным считали результат -1^2 (Таблица 2).

Таблица 2. Нарастание титра противопептидных антител у

кроликов при различных методах иммунизации.

метод 7 14 21 29 36 40 42 49 53 56 63

Метод 1. 1,6 1,9 2,6 2,9 3,2 - 3,5 4Д

Метод 2. 1,3 - - - - 2,0 - 2,3 2,3 - 2,6

Метод 3. 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 - 1,6 - - '1,9 1,9

Обозначения: жирным шрифтом выделены дни тотального обескровливания и, соответственно, прекращения эксперимента.

Из таблицы видно, что независимо от методики иммунизации свободными пептидами титр антител нарастает и достигает максимума к 5060 суткам опыта, однако, при более низкой кратности введения антигена титр противопептидных антител возрастает за более короткий срок. При иммунизации конъюгированными пептидами, вопреки ожиданиям, титр антител не достиг уровня титра на введение свободных пептидов.

Получены кроличьи поликлональные антитела к пептиду прионного белка 106-134, обладающие высокой активностью и специфичностью как для .иммуноцитохимического (ИЦХ) метода, так и для иммунохимического метода (ИФА) определения наличия прионов в биологических жидкостях, в частности, в тканевых экстрактах.

Определение активности поликлональной сыворотки кролика.

После получения сывороток крови от кроликов при разных схемах иммунизации был проведен твердофазный ИФА для выявления наиболее активных проб сыворотки в титрах от 1:100 до 1:12800 и титрация антигена в дозах от 1 мкг до 0,05 мкг на лунку для выявления оптимального соотношения дозы антигена и реагирующего с ним разведения сыворотки методом скининга (табл. 3), где 1 - тах коэффициент свечения.

Таблица 3. Результаты скрининга антигена и сыворотки._

АГ сыворотки 1 мкг 0,5 мкг 0,2 мкг 0,1 мкг 0,05 мкг

Нативная 0,3 0,3 0,2 0,2 0

1:10 0,4 0,4 0.4 0,2 0

1:20 0,6 0,6 0,5 0,3 0

1:40 0,7 0,7 0,7 0,5 0,2

1:80 0,9 0,9 0,8 0,6 0,3

1:100 1 1 1 0,8 0,4

1:200 1 1 1 0,8 0,4

1:400 0,9 0,9 0.9 0,6 0,2

1:800 0,7 0,7 0,7 0,4 0

1:1600 0,5 0,5 0,5 0,2 0

1:3200 0,3 0,3 0,3 0 0

1:6400 0 0 0 0 0

1:12800 0 0 0 0 0

Из таблицы видно, что сходные результаты дает применение АГ в дозах 1 мкг, 0,5 мкг и 0,2 мкг. За дозу антигена, используемого в дальнейших исследованиях, принята доза 0,2 мкг как самая экономичная и равноэффективная.

Максимальное разведение сыворотки, при котором специфические антитела способны выявлять антиген - синтетический пептид в концентрации 20 мкг/мл в ИФА составило 1:1600. Для дальнейших исследований использовали разведения иммунных сывороток от 1:100 до 1:1600.

2.2.2. Иммуноцито- и иммуногистохимическое исследование гистосрезов головного мозга, культур клеток и мазков крови на наличие прионов.

Для подтверждения специфичности кроличьей поликлональной сыворотки использовался сравнительный анализ с моноклональными антителами к синтетическому пептиду прионного белка 3F4 производства фирмы Sigma (USA) иммуноцитохимическим методом. В качестве объектов исследования использовались гистосрезы головного мозга овец, больных скрепи и крупного рогатого скота, больного ТГЭ, любезно предоставленные Дагдановой A.B., цитопрепараты культуры клеток ПО ТК'-СО, инфицированной агентом скрепи.

Принцип метода заключается в детекции PrPc/Sc в исследуемом материале посредством специфических антител и вторичных антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена, которые связываются с первичными антителами. Пероксидазу хрена (в случае положительной иммунореакции) выявляют колориметрической реакцией. Выявление прионов проводили с использованием поликлональных кроличьих антител к синтетическому пептиду прионного белка к аминокислотной последовательностью 106-134 по бычьему пептиду, предоставленному Вольпиной О.М. (ИБХ РАН им. М.М. Шемякина и IO.A. Овчинникова), согласно договору о творческом сотрудничестве, и мышиных моноклональных антител к прионам 3F4 (Sigma).

Для выявления прионов иммуноцитохимическим методом в опыт были взяты мазки крови овец; гистосрезы головного мозга овец, больных скрепи, и крупного рогатого скота, больного ТГЭ, любезно предоставленные Дагдановой A.B. (Центральная научная ветеринарная лаборатория, г. Дублин, Ирландия); цитопрепараты гибридной культуры ПО ТК- х СО, инфицированные агентом скрепи, любезно предоставленные Симоновой A.C. (ВИЭВ им. -Я.Р. Коваленко, Москва). Кровь овец была получена в частном овцеводческом хозяйстве Московской области от здоровой овцы и овцы с ярко выраженной патологией ЦНС.

Инактивацию клеточного приона в мазках крови и цито- и гистопрепаратах проводили 3 способами: 10% раствором формалина, 96% метанолом, ацетоном по 1 часу. Половина препаратов каждой группы фиксации автоклавирована при 1,5 атм 30 минут. Все парафиновые гистосрезы отмывали от парафина и автоклавировапи 30 мин при 1,5 атм.

Мышиные моноклональные антитела использовали в разведении 1:1000, кроличью поликлональную сыворотку в разведении 1:100, конъюгат антител к глобулинам кролика и мыши, меченый пероксидазой хрена - 1:1000.

О положительной реакции судили по изменению окраски лимфоидных клеток (для мазков крови и цитопрепаратов) и мембранных структур и ядер (для гистосрезов мозга) (Таблица 4).

Таблица 4. Выявление прионного белка в цитопрепаратах и мазках крови иммуноцитохимпческнм методом с использованием мышиных .моноклональных антител (жирным шрифтом) и кроличьей полнклональнон сыворотки._

"~^~Метод фиксации Препарат 10% формалин 96% метанол ацетон

автоклави-рованные автоклави-рованные автоклави-рованные

Мазки крови здоровой овцы --

Мазки крови больной овцы + + + + + + + + + +

Гистосрезы мозга BSE positive + +

Гистосрезы мозга BSE negative --

Гистосрезы мозга Scrapie positive

Гистосрезы мозга Scrapie negative --

Цитопрепараты ПО ТК" х СО, инфицированной агентом скрепи + + + + + + + + + +

Цитопрепараты ПО ТК' х СО, неинфицированной

В цитопрепаратах культур, инфицированных агентом скрепи (ПО ТК" х

СО), наблюдали тяжи клеток, окрашенные в складчатость цитоплазматических мембран эпителиоподобного типа, вакуолизацию, дегенерирующих клеток и интенсивное лимфоцитоподобного типа (Рисунок 1, Рисунок 2).

В препаратах контрольной культуры ПО-ТК' х СО, неинфицированной агентом скрепи, монослой окрашен равномерно, неинтенсивно, не имеет вакуолей, дегенерирующие клетки отсутствуют (Рисунок 3).

ярко коричневый цвет, пораженных клеток большое количество прокрашивание клеток

Рисунок 1. Гибридная культура ПО TIC-CO, инфицированная агентом скрепи. 5 пассаж - слева. Гибридная культура ПО TIC-JIO, инфицированная агентом скрепи. 5 пассаж - справа. Иммуноцитохимия (пероксидаза хрена) с мышиными моноклональными антителами 3F4. Микрофото, ув. 1000.

*Г

•4

'fa.

Рисунок 2. Гибридная культура ПО ТК"-СО, инфицированная агентом скрепи. 5 пассаж - слева. Гибридная культура ПО ТК~-ЛО, инфицированная агентом скрепи. 5 пассаж - справа. Иммуноцитохимия (пероксидаза хрена). Кроличьи поликлональные антитела. Микрофото, ув. 1000;_____

Рисунок 3. Гибридная культура ПО ТК- х СО, нсинфицнрованная агентом скрепи. 5 пассаж. Иммуноцитохимия (пероксидаза хрена). Слева - мышиные моноклопальные антитела , справа - кроличьи поликлональные антитела. Микрофото, ув. 1000.

Рисунок 4. Гистосрезы головного мозгаВвЕ positive (слева), BSE negative (справа). Иммуноцитохнмия (пероксидаза хрена), кроличья поликлоналышя сыворотка. Микрофото, ув. 400.

ЫЁйттгш

Рисунок 5. Гистосрезы головного мозгяВвЕ positive (слева), BSE negative (справа). Иммуноцитохнмия (пероксидаза хрена), мышиные моноклональные антитела 3F4.

Рисунок б. Гистосрезы головного MosraScrapic positive (слева), Scrapie negative (справа). Иммуноцитохнмия (пероксидаза хрена), кроличья поликлоналышя

Рисунок 7. Гистосрезы головного M03raScrapie positive (слева), Scrapie negative (справа). Иммуноцитохнмия (пероксидаза хрена), мышиные моноклональные антитела 3F4. Микрофото, ув. 400.

Нами были проведены исследования по выявлению изоформ прионов в парафиновых гистосрезах головного мозга овец, больных скрепи (Scrapie positive; S. negative), и крупного рогатого скота, больного ТГЭ (BSE positive; BSE negative) методом иммуноцитохимии с последующим докрашиванием гематоксилином Майера. В качестве контроля часть гистосрезов была окрашена гематоксилином Майера без проведения иммуногистохимической реакции.

В окрашенных гематоксилином препаратах мозга Scrapie positive и BSE positive наблюдаются патоморфологические изменения: вакуолизация нейронов, острое набухание или пикноморфность нейронов, апоптоз клеток глии. Фон ярко прокрашен. Различия с контрольными препаратами Scrapie negative и BSE negative заключаются в морфологии мозговой ткани, разной степени дистрофии нейронов, интенсивности окраски в патологической ткани. Прокрашивания отдельных структур не наблюдается.

Выявление прионов в гистосрезах мозга проводили с использованием мышиных (3F4) и кроличьих (поликлональная сыворотка) антител.

В пораженных клетках наблюдается специфическое яркое окрашивание ядер и внутриклеточных включений, свидетельствующее о наличии прионного протеина (Рисунок 4-7). В гистосрезех мозга больных животных встречается 2 типа поражений. Первый тип выражается вакуолизацией нейроплазмы нейронов. Вакуоли чаще крупные одно и/или многокамерные. Остатки нейроплазмы выявляются около одного полюса клетки. Ядро или отсутствует или обнаруживается в остатках нередко повышенно базофильной нейроплазмы вблизи оболочки нейрона. Частичное расплавление оболочки нейрона выявляли также в нейронах с вакуолями, занимающими не все тело клетки и обычнов участках нейролеммы, примыкающих к вакуоли. В конечной стадии - полное выпадение нейронов и образование пустот.

В препаратах с изменениями второго типа наблюдалось диффузное или очаговое распыление хроматофильного вещества, неравномерный гиперхроматоз, пикноморфность и гибель нейронов. При докрашивании гематоксилин-эозином нейроплазма принимала гомогенный вид. Ядро, обычно набухшее или пикноморфно, расположено в центре или сдвинуто к периферии клетки, форма его округлая или угловатая. Встречали пикнотизированные ядра, контуры оболочки которых были неровными. В некоторых клетках ядра в состоянии распада или не просматриваются. Иногда отмечали эктопию ядер. Встречали нейроны с неравномерным гиперхроматозом. В случаях вакуолизиции и неравномерного гиперхроматоза отмечали гибель нейронов.

При таких же условиях в автоклавированных гистосрезах головного мозга здоровой овцы не наблюдается специфических патоморфологических изменений, свидетельствующих о течении инфекционного процесса, структура тканей и клеток не нарушена, внутриклеточных включений и специфически окрашенных ядер нет (Рисунок 4-7).

Способность кроличьей поликлональной сыворотки наравне с мышиными моноклональными антителами к прионам 3F4 (Sigma) выявлять

инфекционный прион в инфицированных культурах клеток и гистосрезах головного мозга животных, больных ТГЭ, явилась доказательством активности сыворотки в отношении инфекционных прионов во всех дальнейших исследованиях.

Мазки крови овец исследовали 2-мя методами: иммуноцитохимическим на выявление агента скрепи в фиксированных препаратах и окрашиванием по Романовкому с целью изучения морфологической характеристики клеток крови. В препаратах обеих групп не наблюдается различий в морфологии клеток крови. В мазках крови овец, окрашенных по Романовскому, видно: окрашивание ядер сегментоядерных и палочкоядерных нейтрофилов, лейкоцитов. Такая же картина наблюдается и в мазках гепаринизированной крови здоровой овцы, окрашенных по Романовскому.

Иммуноцитохимическое исследование мазков крови проводили по методике иммуногистохимического исследования гистосрезов мозга при разведении поликлонапьной кроличьей сыворотки 1:100.

ИЦХ исследование мазков из негепаринизированной крови больной овцы показало интенсивное окрашивание лимфоидных клеток крови, в некоторорых случаях обозначена клеточная стенка (Рисунок 8).

При иммуноцитохимическом исследовании мазков гепаринизированной крови здоровой овцы (Рисунок 9) не наблюдается столь ярко окрашенных клеточных структур, цитоплазма клеток прокрашена равномерно, ядра не имеют такого интенсивного окрашивания, без включений, клеточная стенка не обозначена.

- *

Рисунок 8. Мазки крови больной овцы. Иммуноцитохимия (псроксидаза хрена). Полнклоиальная кроличья сыворотка. Мнкрофото, ув. 400.

Рисунок 9. Мазки крови здоровой овцы. Иммуноцитохимия (псроксидаза хрена). Полнклоиальная кроличья сыворотка. Микрофото, ув. 1000.

2.2.3. Разработка методов выявления прионного протеина в белковом препарате «Бактивин» Вестерн-блот

анализом.

Вестерн-блот и дот-блот проводили на базе ЗАО «СКАЙ ЛТД», г. Москва, совместно с в.н.с. ЗАО «СКАИ ЛТД» д.б.н. Мальдовым Д.Г. и н.с. МФТИ к.б.н. Ильичевым A.B.

Белковый препарат «Бактивин» представляет собой лиофильно высушенный корковый слой яичников коров.

При электрофорезе белковых фракций положительный контроль отсутствовал вследствие низкой молекулярной массы синтетического пептида, отрицательный контроль - желатин. Исследуемые пробы и желатин использовали в концентрации 100 мкг/мл.

Для определения молекулярной массы белковых фракций в качестве метчиков использовали смесь стандартных белков для электрофореза ("Фармация", Швеция).

Предварительно был определен белковый состав препарата «Бактивин» посредством электрофореза, с целью выявления белковых фракций, сходных по молекулярной массе с прионом.

Мы провели Вестерн-блот анализ с полученными фракциями белка на выявление возможного присутствия прионов по стандартной методике.

Рабочее разведение поликлональной сыворотки 1:100; конъюгата антител к глобулинам кролика, меченый пероксидазой хрена - 1:1000.

Использование поликлональной кроличьей сыворотки показало отрицательные результаты, что дало основание предположить, что белковый препарат «Бактивин» не содержит прионного белка. Однако, метод требует дополнительных доработок с использованием в качестве положительного контроля инфекционного приона.

В качестве дополнительного метода мы использовали дот-блот анализ, который проводили согласно методике Merz P.A., Sommerville R.A., Wisniewski Н.М., Igbal К., (1981). На блоттинговую мембрану сорбировали точечно по 10 мкл исследуемых препаратов (30 минут, 37°С). Мембрану четырехкратно отмывали отмывочным буфером по 3 минуты, (такую процедуру повторяли после нанесения каждого компонента реакции). Поликлональную кроличью сыворотку в разведении 1:100 выдерживали 1 час при 37°С. Антивидовой конъюгат, меченый пероксидазой хрена использовали в разведении 1:1000 (1 час при 37°С). Окрашивание производили тетраметилбензидином для мембран с добавлением 0,05% перекиси водорода, реакцию останавливали 12,5% серной кислотой.

При таком методе свечение на мембране обнаруживали только в местах фиксации положительного контроля - синтетического пептида прионного белка.

2.2.4. Разработка методов иммуноферментного анализа для

выявления прионного протеина в сыворотках крови и белковом препарате.

Нами было отработано несколько методик выявления прионов в сыворотках крови крупного рогатого скота и фетальной сыворотке, используемых для культур клеток, а также сыворотке крови овцы, предположительно больной скрепи, здоровой овцы и ягненка, и белковом препарате «Бактивин».

Для выявления приона в приведенных образцах использовали метод, разработанный Takekida К. et al., (2002) выявления прионов: на планшет сорбировали моноклональные мышиные антитела к приону 3F4 в разведении 1:1000 в количестве 10 мкл (1 час при 37°С и 16 час при 4°С). Отмывали фосфатно-солевым буфером четырежды по 2 минуты (подобные промывки проводили после нанесения каждого компонента реакции). Для снижения вероятности появления неспецифической реакции использовали бычий сывороточный альбумин в концентрации 20 мкг/мл или фибронектин в концентрации 20 мкг/мл (1 час, 37°С). Исследуемые сыворотки и разведения препарата наносили в объеме 100 мкл (1 час, 37°С). После отмывки наносили сыворотку кроликов к синтетическому пептиду в разведениях от 1:100 до 1:6400 (1,5 часа, 37°С). Затем конъюгат антител к глобулинам кролика, меченый пероксидазой хрена (1:1000) (1 час, 37°С). Окраску производили тетраметилбензидином, останавливали окрашивание 12,5% серной кислотой. Измерение оптической плотности производили при длине волны 492 нм на приборе Multiscan Plus MKII (Row Laboratories, Великобритания).

Реакцию проводили в 2 вариантах: 1 - приведенный выше; 2 - на планшет сорбировали кроличьи антитела к пептиду в разведении 1:100, второй вид антител - последовательные двукратные разведения мышиных моноклональных антител (от 1:1000 до 1:64000), конъюгат антител к глобулинам мыши, меченый пероксидазой хрена, в разведении 1:1000.

Нами была проведена серия экспериментов по отработке метода ИФА с различными образцами проб сывороток и белковых препаратов. На наличие инфекционных прионов были исследованы: сыворотка крупного рогатого скота (фирм «Биолот», «ПанЭко», «Фуро»), фетальная сыворотка крупного рогатого скота (фирм «Sigma», «Биолот»), используемые в биотехнологии; сыворотки крови хомяков; мышей и кроликов, иммунизированных синтетическим пептидом; сыворотки крови овец и ягненка; растворы белкового препарата «Бактивин» на различных стадиях технологического процесса.

Пробы исследуемых образцов белкового препарата «Бактивин» использовали как нативные, так и обработанные протеиназой К (20 мкг/мл), меркаптоэтанолом (0,05%, 96'С) для разрушения клеточной изоформы прионов. Пробы сывороток подобной обработке не подвергали.

Используемые контроли: положительный контроль - синтетический пептид прионного белка с аминокислотной последовательностью 106-134 по

бычьему пептиду в концентрации 20 мкг/мл. Отрицательные контроли: желатин - 20 мкг/мл, фибронекган - 20 мкг/мл. Пробы «Бактивина» использовали в концентрации 20 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл, сыворотки исследовали без дополнительного разведения. Оба варианта ИФА дали схожие результаты (Таблица 5).

Таблица 5. Величина оптической плотности (х 103) при исследовании проб сывороток и белкового препарата для различных разведений сыворотки._

Разведение (ЯДВОрОТКИ Проба Контрольная сыворотка кролика 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400

«Бактивин», 20 мкг/мл 170 174 186 165 180 169 153 130

«Бактивин», 50 мкг/мл 192 198 180 192 189 180 160 141

«Бактивин», 100 мкг/мл 188 163 161 170 172 173 169 138

«Бактивин», 20 мкг/мл, (протеиназа К) 183 171 170 172 175 159 149 132

«Бактивин», 50 мкг/мл, (протеиназа К) 185 162 171 141 157 166 149 157

«Бактивин», 100 мкг/мл, (протеиназа К) 184 167 173 141 161 156 147 142

«Бактивин», 20 мкг/мл, (меркаптоэтанол) 123 161 179 146 157 151 139 131

«Бактивин», 50 мкг/мл, (меркаптоэтанол) 127 91 106 107 126 103 101 91

«Бактивин», 100 мкг/мл, (меркаптоэтанол) 129 100 113 110 126 105 102 98

Пептид прионного белка, 20 мкг/мл 124 445 467 426 482 430 4 64 394

Жслатии, 20 мкг/мл 158 123 134 153 123 148 140 135

Фибронектин, 20 мкг/мл 138 123 125 118 133 196 144 183

Сыворотка крови овцы с нервными расстройствами 141 128 141 134 136 116 121 112

Сыворотка крови здоровой овцы 142 128 142 167 158 116 127 193

Сыворотка крови ягненка 132 120 131 132 142 123 123 115

Сыворотка крови КРС «Биолот» 160 148 169 157 162 150 130 134

Сыворотка крови КРС «Фуро» 131 117 138 131 141 125 116 113

Сыворотка крови КРС «ПанЭко» 130 104 117 120 135 118 112 106

Сыворотка крови КРС «Sigma» 136 100 126 125 135 122 172 160

Сыворотка фетальная «Биолот» 127 117 126 127 139 120 116 109

Сыворотка фетальная «Sigma» 172 182 183 175 202 175 184 177

Сыворотка крови хомяков 196 193 201 202 196 162 155 143

Сыворотка крови мышей (метод иммунизации №6) 184 199 197 194 196 166 152 147

Сыворотка крови кроликов (метод иммунизации №1) 167 166 161 171 174 136 144 138

Величина оптической плотности исследуемых проб сывороток и белкового препарата равна величине оптической плотности отрицательных контролей; при разведениях поликлональной кроличьей сыворотки от 1:100 до 1:6400 не выявлено положительной реакции. Средние показатели оптической плотности исследуемых проб и отрицательных контролей ниже показателей положительного контроля более чем в 2 раза.

2.3. Гибридизация соматических и миеломных клеток с антител-продуцирующими клетками мышей и кроликов, характеристика полученных культур и определение продукции моноклональных антител.

Для получения гибридных культур, продуцирующих антитела к синтетическим прионам, использовали мутантные линии клеток, дефектные по ферментам ТК: ПО ТК' - 180, СПЭВ ТК" - 100 и ГГФРТ: Sp 2/0, P3x63Ag8.653 с одной стороны, и первичнотрипсинизированные и диплоидные штаммы клеток селезенки мышей и кроликов, лимфоцитов кроликов, иммунизированных пептидом прионного белка с другой (Таблица 6).

Таблица 6. Результаты гибридизации культур и получения гибридом и

межвидового гибрида ПО ТК" х J DK.

" Культура ^^эдантная Иммунные кле^ки^ Sp 2/0 P3x63Ag8.65 3 ПО Не- СПЭВ тк-

Спленоциты мыши первичнотрипсинизированные SpxCM РЗХхСМ отрицательный Отрицательный

Спленоциты мыши - диплоидный штамм SpxCM РЗХхСМ Отрицательный Отрицательный

Спленоциты кролика первичнотрипсинизированные Отрицательный Отрицательный ПО ТК" х СК Отрицательный

Спленоциты кролика -диплоидный штамм Отрицательный Отрицательный ПОПСхСК Отрицательный

Лимфоциты кролика Отрицательный Отрицательный ПОТК'хЖ Отрицательный

Миеломная линия Бр 2/0 представлена клетками лимфобластоидного типа, суспензионного культивирования, растет на среде ДМЕМ или ИРМ-1640, с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, оптимальная плотность клеток составляет 3-9 х 105 кл/мл, жизнеспособность на нулевом пассаже - 92%, коэффициент пересева 1:10, кратность пересева - 72 часа с полной сменой среды. Кариологически представлена 2п=40, предел изменчивости хромосом - 60-66, модальное число хромосом 63-64, устойчива к 8-азогуанину. По сравнению с миеломной линией РЗх63А§8.653 линия Бр 2/0 проявляет наибольшую пролиферативную активность, что явилось определяющим фактором для проведения гибридизации.

Слияние спленоцитов мышей с мутантными линиями клеток проводили согласно «Методическим рекомендациям по гибридизации соматических клеток с/х животных. М., 1988, (Авторы: Л.П. Дьяконов, А.А. Кущ, Ш.М. Тугизов, Е.В. Майджи, О.Ш. Расулев)».

В результате гибридизации спленоцитов мыши с миеломными линиями получена гибридома Sp 2/0 х СМ, обладающая следующими культурально-морфологическими свойствами: клетки лимфоидного типа, с низкой адгезивной способностью, коэффициент пересева 1:10, кратность пересева 72 часа, культивируются на среде Игла MEM с двойным набором аминокислот, 15% фетальной бычьей сыворотки, HEPES - 0,5 %, 2-меркаптоэтанола -0,02%.

Через 11-14 дней после слияния и появления в лунках колоний гибридных клеток, супернатанты из всех лунок были протестированы на продукцию специфических антител. Скрининг проводили методом непрямого твердофазного ИФА на полистироловых микропанелях, лунки которых сенсибилизированы синтетическим пептидом прионного белка. Ни одна из проб культуральной жидкости не дала позитивного ответа в двух скринингах, однако, все культуры были реклонированы 3 раза методом предельных разведений. На всех стадиях получения клонов гибридом образцы культур криоконсервировали и закладывали в Криобанк.

После каждого клонирования клоны были криоконсервированы и после размораживания проверялись на способность продуцировать моноклональные антитела к синтетическому пептиду прионного белка. При этом жизнеспособность размороженных культур составляла 90-95%, продукции антител выявлено не было.

Получение асцитных препаратов мопоклональных антител.

Для препаративного получения моноклональных антител необходимы массовые культуры гибридомных клеток. При суспензионном культивировании гибридные клетки по мере их роста были переведены в матрасы общим объемом 25 и 75 см3, для получения асцитных препаратов моноклональных антител гибридные клетки в концентрации 107 в объеме 1 мл прививали внутрибрюшинно мышам линии BALB/C, предварительно обработаны пристаном (за 10 дней до введения, по 0,5 мл на голову внутрибрюшинно). Асцитные опухоли образовывались в течение 7 суток после инъекции клеток, причем образование опухоли отмечалось у 100% привитых животных. Количество асцитной жидкости в среднем составило 3 мл от одной мыши в каждом из опытов. При исследовании асцита в ИФА на наличие противопептидных антител, титр антител составил -lg 2,1, что является слабоположительной реакцией.

Культурально-морфологические и антителпродуцирующие свойства гибридной культуры ПО

ТК"х JIK.

Учитывая перспективность гибридных культур клеток сельскохозяйственных животных для биотехнологии и вирусологии, мы провели серию экспериментов по получению межвидовой гибридной культуры - овца х кролик (ПО-ТК' х лимфоциты кролика) - ПО-ТК' х Ж.

В результате экспериментов нами была получена межвидовая гибридная культура ПО-ТК' х Ж путем слияния клеточной линии ПО-ТК' и нормальных лимфоцитов кролика.

Слияние клеток исходных линий проводили в монослое в модификации Егоровой с использованием раствора ПЭГ (полиэтиленгликоля) с молекулярной массой - 1000. Процесс слияния происходил в несколько этапов: сначала сливались мембраны клеток, потом ядра. В процессе слияния и преобразования слившихся ядер в ядро гибридной клетки отмечается появление ядер неправильной формы, крупных ядер с выступами при наличии большого количества митозов в культурах, появление большого количества поликарионов.

Количество хромосом в полученных клетках превышает количество хромосом в клетках исходных линий (овцы и кролика), т.е. в данном случае (на 2 пассаже) окончательный процесс гибридизации не завершен. На более поздних пассажах очевидно, что культура стала стабильной гибридной линией с высоким индексом пролиферации и высокой митотической активностью.

При посевной концентрации 80 тыс. кл./мл, монослой формируется на 3 сутки культивирования. Полученная культура обладает высокой митотической активностью - 50-54%о, наблюдающейся на вторые сутки культивирования; индекс пролиферации составил 3,0-4,0; модальный класс хромосом на 18 пассаже составил 42 и 56 при разбросе от 6 до 86 хромосом.

Получение и окраску препаратов хромосом из культур гибридных клеток проводили по стандартным методикам. Анализ препаратов проводили на микроскопе Nikon microphot-FX. Видеозапись изображения хромосом осуществляли при увеличении 100х с помощью видеокамеры КС-583С и программы Image Scope 1. Работу проводили совместно с доктором биологических наук П.М. Кленовицким.

" При цитогенетическом исследовании гибридных клеток «овца - кролик» (ПО ТК" х Ж) на 32 пассаже обнаружено: число хромосом в^метафазных клетках составляло от 88 до 120. При выборочном кариотипировании отмечено, что в гибридных клетках отсутствует часть метацентрических и субметацентрических хромосом кролика, но присутствуют дополнительные акроцентрические хромосомы. Случаев утери метацентриков овцы в клетках культуры на данном этапе не обнаружено. Во всех проанализированных клетках четко идентифицируется наличие двухплечих хромосом кролика и овцы (Рисунок 10, Рисунок 11). Дифференцировать акроцентрические

хромосомы кролика в силу их малой величины от сходных с ними хромосом овцы на данном этапе исследования оказалось невозможно.

Результаты цитогенетического исследования свидетельствуют о том, что гибридные клетки культуры ПО ТК" х Ж в значительной мере сохранили генетическую информацию, полученную от клеток исходных видов.

аШШ

Рисунок 10. Кариотип гибридной клетки ПО ТК" х ЛК (почка ТК- овцы и

У 0 „ лимфоциты кролика). 2 пассаж. 2п=116: а)

» и 5) д 4 Я 5 ал « < двухплечие хромосомы овцы (6); Ь)

$ % » е ь. <г 5 * двухплечие хромосомы кролика (30,

•) А 5 0 ц О ^ с цулисомия по 11-й и 17-й парам); с)

3 К I \ А А > I */ половые хромосомы кролика XV; ¿)

>1 Ц ¡1 у Ч "й - - Ой «половые хромосомы овцы ХУ; е)

''А йн П Г т М II I» акроцентрнческис хромосомы (70; точная

0 ""1. 0 П Г1ЙЗС' идентификация акроцентриков кролика в

^ Л /! ?) й 0 ЬП силу малых размеров затруднена); О

йй$* о £ 60 дополнительные хромосомы (1-хромосома

Л 4 Й Л й О А е ¡) Ъ' (г (5 „ 1 кролика, 2 - хромосома 2 кролика, 3 -

. Уй хромосома 5 или 6 кролика,); в)

Л Л * ! - ' * " * аберрантные хромосомы (3)'

ей»»

Рисунок 11. Кариотип гибридной клетки с: И» о Ь

ПО ТК' х ЛК (почка ТК- овцы и лимфоциты кролика). 32 пассаж, 2п=111: Vй ь А 0. \) о п и о» к - • » V .'I г» II -

а) двухплечие хромосомы овцы (б); Ь) двухплечие хромосомы кролика (26, Ч И (1 Ж К <7 с. л .8*

нулисомия по 13-й н 14-й парам, А - ь- л * <1(1-,

моносомия по 4-й и 6-й парам); с) и V Ь

половые хромосомы кролика ХУ; <1) половые хромосомы овцы ХУ; с) ЛИ ап г»я :*; Г.- г 5

акроцентрические хромосомы (74; лп по пп оп П о.г>

моносомия по двум парам, точная О о п л ((■ п ПЛ

идентификация акроцентриков кролика г> »\ по

в силу малых размеров затруднена); ф л л ли г> <1 о п л л

дополнительная хромосом неясной <» А

природы. л п »> о ■ Л л (1 п п

л г. СШ А Гш Ц •■> ... - ч

Цитологические препараты .*• л >1

межвидовой гибридной культуры ПО

ТК" х Ж, фиксированные формалином, ацетоном, этанолом и автоклавированные, были подвергнуты иммуноцитохимическому исследованию на наличие прионов. В культурах наблюдали равномерное окрашивание монослоя, в клетках не наблюдается специфических изменений, характерных

для присутствия агента скрепи: включений, цитоплазма без вакуолей по сравнению с культурами ПО ТТС х JIO, ПО ТК- х СО.

В культуральной жидкости клонированной гибридной культуры ПО TIC х Ж методом ИФА обнаруживали наличие противопептидных антител в титре -Ig 1,9, что является слабоположительной реакцией.

На кафедре вирусологии МГАВМиБ, совместно с д.в.н., профессором Белоусовой Р.В. была определена чувствительность новой культуры к вирусам - возбудителям пневмоэнтеритов крупного рогатого скота: ИРТ, ВД -БС, ПГ-З, латентному герпесвирусу штамма «Movar» к.р.с.

ЦПД вируса ВД-БС КРС проявляется в появлении мелкозернистой инфильтрации, округлении и отторжении клеток от субстрата. Наблюдается вакуолизация цитоплазмы, формирование симпластов и вирусные включения в цитоплазме клеток. Разрушение монослоя.

Цитопатогенное действие вируса ИРТ на культуру проявляется набуханием и увеличением в размере ядрышек в пораженных клетках (в ядрах происходит перераспределение хроматина - он распределяется вдоль ядерной оболочки и в виде глыбок внутри ядер), во многих клетках отсутствуют ядрышки. Через 18 часов обнаруживаются крупные внутриядерные включения, занимающие почти все ядро, через 24 часа почти все клетки полностью дегенерируют. Наблюдается разрушение монослоя, размягчение межклеточного матрикса, вакуолизация цитоплазмы.

Полученные результаты показали высокую чувствительность культуры к вирусу ИРТ (ТЦЦ50/МЛ 107>°) по сравнению с исходной мутантной культуры ПО ТК', что позволит в дальнейшем использовать эту культуру для выделения, идентификации и накопления вируса. Культура оказалась чувствительна к вирусу и ВД-БС (ТЦДго/мл Ю5-0) и нечувствительна к аденовирусу, вирусу ПГ-3, респираторно - сентициальному вирусу.

4. Выводы.

1. Разработана эффективная схема иммунизации кроликов синтетическими пептидами прионного белка с аминокислотной последовательностью 106-134 (по бычьему пептиду) THGQWNKPSKPKTMNKHVAGAAAAGAVVG и получены специфичные поликлональные иммунные сыворотки в титре антител -lg 2,6-4,1.

2. Использованные схемы иммунизации мышей свободным синтетическим пептидом и его KLH-конъюгатом не вызывают иммунного ответа в титрах, достаточных для подтверждения положительной реакции.

3. Гибридома на основе мышиных спленоцитов способна вызывать образование асцита, в котором обнаружены противопептидные антитела в титре-lg 2,1.

4. Специфичность полученных поликлональных сывороток крови кроликов подтверждена в экспериментах по иммунохимическому выявлению прионного белка в инфицированных агентом скрепи гибридных культурах клеток ПО ТК' х ЛО, ПО ТК" х СО, гистосрезах головного мозга BSE positive и Scrapie positive.

5. Интенсивное иммуноцитохимическое окрашивание после автоклавирования мазков крови лимфоцитов овцы с нервными расстройствами при использовании поликлональных антител указывает на возможность присутствия инфекционного приона в клетках крови в терминальный период заболевания.

6. Способ предварительной фиксации мазков крови (формалин, ацетон, метанол) не оказывает влияния на чувствительность иммуноцитохимического метода.

7. Получена межвидовая гибридная культура клеток почка овцы х лимфоциты иммунного кролика (ПО-ЛК-3), в культуральной жидкости которой методом ИФА выявлена продукция противопептидных антител в титре-lg 1,9.

8. Межвидовая гибридная культура ПО-ЛК-3 чувствительна к вирусам ИРТ КРС и ВД-БС КРС.

5. Практические предложения.

1. Кроличьи поликлональные антитела к синтетическому пептиду прионного белка рекомендуются к использованию для создания диагностикумов и детекции инфекционного и клеточного прионов в белковых препаратах, биологических жидкостях (сыворотка и плазма крови);

2. Гибридная культура ПО ТК' х Ж рекомендуется для культивирования вирусов ИРТ КРС и ВД-БС КРС, для создания вакцин и диагностикумов (заявка на патент принята Г-59, ГСП-5 18.08.2005г., №2005126087).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ СТАТЕЙ

1. Дьяконов Л.П., Дагданова A3., Симонова A.C., Савенко Н.Б. Современные методы детекции агента скрепи в лимфоидных тканях, культурах клеток и биологических жидкостях. // Сборник трудов Международной научно-практической конференции "IEKBM - 80 лет на передовом рубеже ветеринарной науки", г. Харьков, 2002, стр. 224-226.

2. Дьяконов Л.П., Дагданова A.B., Симонова А.Л., Гальнбек Т.В., Савенко Н.Б.. Клеточные системы в изучении прионов // Сборник трудов Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», г. Подольск, 2002, стр. 38-43.

3. Дьяконов Л.П., Гулюкин М.И., Дагданова А.В, Гальнбек Т.В., Симонова A.C., Савенко Н.Б. Новые биотехнологии в диагностике прионовых инфекций // Сборник тезисов научной конференции, посвященной 300- летию основания Санкт - Петербурга "Биологическая, медицинская и ветеринарно-медицинская наука и новейшие технологии на благо человека и человечества", Санкт-Петербург, 2003 г., стр. 60-63.

4. Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В., Симонова A.C., Сафина А.Н., Савенко Н.Б. Гибридные культуры клеток животных в вирусологии и биотехнологии // Труды международной научной конференции «Ветеринарная медицина - 85», г. Ялта, май 2005 г., стр. 408-412.

5. Савенко Н.Б., Симонова A.C., Белоусова Р.В., Гальнбек Т.В., Дьяконов Л.П. Межвидовая гибридная культура ПО-ТК" х Ж (почка овцы х лимфоциты кролика) // Труды международной научной конференции «Развитие ключевых направлений с/х науки в Казахстане: селекция, биотехнология, генетические ресурсы» г. Астана, 2004 г., стр. 184-186.

6. L.P. Dyakonov, T.V. Galnbeck, A.N. Safina, A.S. Simonova, N.B. Savenko, P.M. Klenovitsky, L.K. Ernst, N.A. Zinovieva, N.A. Shevtsova Caryological characteristics of some interspecific hybrid animal cell cultures // Труды конференции «45-й Международный конгресс Европейского общества тканевых культур (ETCS)» г. Мюнстер 19-22 сентября 2004 г. «Herbsttagung der Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie» Abstracts, p. 43.

7. . Симонова A.C., Савенко Н.Б., Дьяконов Л.П., Колышкин В.М., Мошков А.Е., Вольнина О.М. Детекция клеточных и инфекционных прионов (PrPaSc) в культурах клеток и биотехнологических жидкостях с использованием поли- и моноклональных антител // «Цитология», №9, том 46, стр. 791-792,2004 г.

8. Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В., Симонова A.C., Савенко Н.Б., Сафина А.Н. Жизнеспособность и биологические свойства постоянных и гибридных культур клеток сельскохозяйственных животных после длительного хранения в жидком азоте // «Цитология», том.46, №9, стр 791-792.

Принято к исполнению 02/09/2005 Исполнено 05/09/2005

Заказ № 1009 Тираж: 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИИН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

РНБ Русский фонд

2007-4 11411

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Савенко, Наталья Борисовна

Список условных сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Современные методы детекции прионов.

1.2. Синтетические фрагменты прионных пептидов; методики иммунизации животных.

1.3. Гибридизация соматических, миеломных и антителпродуцирующих клеток с целью получения моноклональных антител.

2. Собственные исследования.

2.1. Материалы и методы.

2.1.1. Культуры клеток, питательные среды.

2.1.2. Вирусные штаммы.

2.1.3. Получение конъюгатов пептидов.

2.1.4. Лабораторные животные.

2.1.5. Получение асцитной жидкости.

2.1.5. Определение титра антител методом ИФА в крови иммунизированных животных и в асците.

2.1.6. Иммуноцитохимическое исследование клеточных культур на наличие прионов.

2.1.7. Проведение Вестерн-блота.

2.1.8. Выявление прионов методом ИФА.

2.2. Результаты.

2.2.1. Получение поликлональных антител к синтетическому пептиду прионного белка. Оценка уровня антител в сыворотке крови иммунизированных животных в ИФА.

2.2.2. Иммуноцитохимическое исследование культур клеток, гистосрезов головного мозга и мазков крови.

2.2.3. Разработка метода выявления прионного протеина в белковом препарате «Бактивин» Вестерн-блот анализом.

2.2.4. Разработка методов иммуноферментного анализа для выявления прионного протеина.

2.3. Гибридизация соматических и миеломных клеток с антител продуцирующим и клетками мышей и кроликов, характеристика полученных культур и определение продукции моноклональных антител в культуральной среде.

3. Обсуждение.

4. Выводы.

5. Практические предложения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение поликлональных антител к синтетическому пептиду прионного белка и определение их специфичности"

Прионные болезни представляют группу нейродегенеративных расстройств человека (болезнь Крейцфельдта-Якоба (БКЯ), синдром Герштманна-Штройслера, куру) и животных (скрепи овец и коз, трансмиссивная энцефалопатия норок (ТЭН), хроническая изнуряющая болезнь диких оленей и лосей). Начиная с 1985 года прионные болезни идентифицированы еще у 12 видов представителей кошачьих и копытных: губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, антилопы, сернобыка, арабского сернобыка, большого куду, канны, кошки, муфлона, пумы, гепарда, криворогого сернобыка, оцелота). Из этих "новых" 12 болезней 11 связаны с появлением трансмиссивной губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота (ТГЭ). Эти заболевания являются причиной нарушений в ЦНС и неизбежно ведут к гибели (S.B. Prusiner, 1992).

Диагностика прионных болезней до недавнего времени базировалась на выявлении характерных клинических признаков, а также патогистологическом исследовании головного мозга. Предложены методы иммуногистохимии, иммунохимии и др. для посмертной или послеубойной диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота (BSE), скрепи овец и коз.

Существующие подходы для ранней диагностики ТГЭ основаны на клинических признаках, электроэнцефалографии, ядерном магнитном резонансе или на биопсии мозга. Подтверждение диагноза при подозрении на болезнь, тем не менее, основано на гистологическом и иммуногистохимическом (ИГХ) исследовании мозга.

Многочисленными исследованиями доказано, что прионы — возбудители коровьего «бешенства» могут служить причиной заболевания человека (Thackray A.M., Klein М.А., Aguzzi A., Bujdoso R., 2002). Это заболевание названо новым вариантом болезни Крейцфельдта - Якоба (вБКЯ), которое в отличие от ранее известного заболевания встречается в молодом возрасте. По сравнению со спорадической формой БКЯ, вБКЯ вызывается штаммами прионов, обладающими высокой лимфотропностью. Доказательством лимфотропизма прионов, вызывающих вБКЯ, стало обнаружение в Великобритании в ходе рутинного мониторинга в миндалинах и аппендиксах патогенного приона от людей, умерших в возрасте 10-50 лет (в их числе 70% молодых людей в возрасте 20-29 лет, т.е. среднем возрасте проявления вБКЯ). Высокий процент инфицирования людей инфекционнм прионом связывают с возможностью передачи вБКЯ путем гемотрансфузии (Llewelyn С.А., Hewitt Р.Е., Knight R.S. et al., 2004).

Учитывая сложную эпизоотическую ситуацию по ГЭП КРС в Англии, странах Евразии и других континентов, возможность заноса инфекции на территорию России, и длительный инкубационный период (до 2-13 лет) стала актуальна проблема доклинической диагностики прионных болезней крупного рогатого скота и овец с целью раннего выявления прионов и, впоследствии, проведения мероприятий по оздоровлению стада.

Не меньшее значение имеет раннее выявление зараженных животных до убоя, и для предотвращения поступления в продажу мяса и мясопродуктов от скрытых носителей инфекции. Для биотехнологии и производства биопрепаратов необходимо использовать свободные от агента скрепи (PrPSc) культуры клеток, сыворотки крови и продукты сыворотки крови животных.

Поэтому разработка чувствительных специфических методов детекции минимальных количеств PrPSc у животных, зараженных прионами, в инкубационном и раннем клиническом периодах болезни, в культурах клеток, сыворотках крови и других биологических жидкостях, приобретает особую значимость. Учитывая, что PrPSc адаптирован к развитию кроме нервной ткани, в лимфоцитах, фолликулярных дендритных клетках, рядом авторов предложены методы доклинического выявления прионов иммуногистохимическим методом в миндалинах, а также в лимфатических узлах конъюнктивы глаза овец (О" Rourke et al., 1998, 1999; Mackenzie А., 1983; Rubenstein R, Kascsak R, Meiz P. et al., 1986) с использованием моноклональных антител к синтетическому прионному пептиду. В России Вольпиной О.М.,

Рыбаковым С.С. и др., (2001), Рыбаковым С.С., Решетниковым Г.Г. и др., (2005) получены поликлональные антитела к различным синтетическим фрагментам прионного белка и показана их специфичность при иммуногистохимической детекции прионов в гистосрезах головного мозга больных BSE животных.

Необходимо также тестировать культуры клеток, полученные из органов и тканей сельскохозяйственных животных (овец, крупного рогатого скота) и используемых в биотехнологии и вирусологии, на присутствие прионов, а также создание клеточных линий, чувствительных к агенту скрепи, в качестве биопробы, наряду с лабораторными животными, и изучения различных аспектов взаимодействия прионов с клеткой.

Цель: получить поликлональные антитела к синтетическим пептидам прионного белка и проверить их специфичность к клеточной и инфекционной изоформам прионного протеина.

- провести иммунизацию лабораторных животных (кроликов, мышей) синтетическим пептидом прионного белка с аминокислотной последовательностью 106-134 (по бычьему пептиду) и получить сыворотку, содержащую поликлональные антитела к пептиду прионного белка, способную специфически связываться с прионным белком,;

- получить гибридные культуры, продуцирующие моноклональные антитела к синтетическому пептиду прионного белка, отвечающие за специфическое связывание с прионным белком;

- изучить активность поли- и моноклональных антител к прионам в различных реакциях.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ

Задачи:

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования проведены с использованием синтетического пептида прионного белка с аминокислотной последовательностью 106-134 по бычьему пептиду; на лабораторных животных — мышах и кроликах. В работе использовались мутантные культуры клеток, хранящиеся в Криобанке ВИЭВ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Получены поликлональные антитела на синтетический пептид прионного белка с аминокислотной последовательностью 106-134 (по бычьему пептиду).

Впервые получены межвидовая гибридная культура спленоциты овцы х лимфоциты кролика (ПО ТК" х ЛК) и мышиная гибридома, продуцирующие моноклональные антитела к пептиду прионного белка. Культура ПО ТК-х ЛК чувствительна к вирусам инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Специфические кроличьи антитела к прионовому пептиду способны выявлять прионы в культурах клеток и гистосрезах головного мозга.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Получение поликлональных иммунных кроличьих сывороток к пептиду прионного белка.

3. Получение, культурально-морфологическая и кариологическая характеристика гибридной культуры почки овцы и лимфоцитов иммунного кролика. Изучение ее чувствительности к вирусам инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, вирусной диареи — болезни слизистых, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной инфекции и их цитопатогенного действия.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференция "IEKBM - 80 лет на передовом рубеже ветеринарной науки". Харьков, 2002; Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Подольск, 2002; Научной конференции, посвященной 300- летию основания Санкт - Петербурга "Биологическая, медицинская и ветеринарно- медицинская наука и новейшие технологии на благо человека и человечества." Санкт-Петербург, 2003 г.; Международной научной конференции «Развитие ключевых направлений с/х науки в Казахстане: селекция, биотехнология, генетические ресурсы» г. Астана, 2004 г; на 45-ом Международном конгрессе Европейского общества тканевых культур (ETCS), г. Мюнстер 2004 г; международной научной конференции «Сохранение генетических ресурсов» г. Санкт-Петербург, 2004 г.; Международной научной конференции «Ветеринарная медицина» г. Ялта, 2005 г; на межлабораторном совещании ВИЭВ, 2005 г.

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Савенко, Наталья Борисовна

4. Выводы.

1. Разработана эффективная схема иммунизации кроликов синтетическими пептидами прионного белка с аминокислотной последовательностью 106-134 (по бычьему пептиду) -THGQWNKPSKPKTMNKHVAGAAAAGAWG и получены специфичные псшиклональные иммунные сыворотки в титре антител -lg 2,6-4,1.

3. Гибридома на основе мышиных спленоцитов способна вызывать . образование асцита, в котором обнаружены противопептидные антитела в титре -lg 2,1.

4. Специфичность полученных поликлональных сывороток крови кроликов подтверждена в экспериментах по иммунохимическому выявлению прионного белка в инфицированных агентом скрепи гибридных культурах клеток ПО ТК" х ЛО, ПО ТК" х СО, гистосрезах головного мозга BSE positive и Scrapie positive.

5. Интенсивное иммуноцитохимическое окрашивание после' автоклавирования мазков крови лимфоцитов овцы с нервными расстройствами при использовании поликлональных антител указывает ^на возможность присутствия инфекционного приона в клетках крови в терминальный период заболевания.

8. Межвидовая гибридная культура ПО-ЛК-3 чувствительна к вирусам ИРТ КРС и ВД-БС КРС.

5. Практические предложения.

Кроличьи поликлональные антитела к синтетическому пептиду прионного белка рекомендуются к использованию для создания i диагностикумов и детекции инфекционного и клеточного прионов в белковых препаратах, биологических жидкостях (сыворотка и плазма крови). . Гибридная культура ПО ТК' х J1K рекомендуется для культивирования вирусов ИРТ КРС и ВД-БС КРС, для создания вакцин и диагностикумов (заявка на патент принята Г-59, ГСП-5 18.08.2005г., №2005126087).

100

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савенко, Наталья Борисовна, Москва

1. Алексанян Ю.Т., Давтян Т.К. О проблеме получения человеческих моноклональных антител // «Иммунология», 1991., №3, с.10-13.

2. Баев А.А Биотехнология. М: Наука,1984, 318с.

3. Байтубаев Н.Г. Получение моноклональных антител для диагностики гриппа лошадей. Автореф. канд. дисс. М., 1992.

4. Белкина Н.М. Сравнительное изучение морфологических изменений в культуре клеток под действием вирусов группы герпеса // Бюлл. ВИЭВ, в. 14., 1972, с.25-28.

5. Верховский О.А. Иммуноферментный метод тестирования гибридом, проуцирующих моноклнальные антитела к IgM свиньи // Тезис, докл., Бюлл. ВИЭВ., вып. №69, М., 1989, с.3-6.

6. Верховский О.А. Моноклональные антитела в ветеринарии // Труды ВИЭВ "Иммунитет с/х животных", вып. № 67, с. 11-22 , М.1989.

7. Верховский О.А. Поли- и моноклональные антитела в анализе гуморального иммунного ответа, структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов животных Дисс. докт. биолог, наук., М., 1998.

8. Глебов O.K., Абрамян Д.С. Природа фенотипической изменчивости соматических клеток в культуре: нестабильные фенотипические изменения // «Цитология», 1984, т.24., стр.236-251.

9. Дагданова А.В. Биологические свойства клеточного (РгРс) и инфекционного (PrPSc) прионного протеина in vitro и его иммуноцитохимическая детекция в культурах клеток Дисс. докт. биол.наук.,М.2002.

10. Н.Дагданова А.В. Прионы и их цитопатогенное действие. В кн.: "Животная клетка в культуре", под редакцией Л.П.Дьяконова, В.И.Ситькова. М."Спутник", 2000, 315-332.

11. Дагданова А.В. Роль клеток лимфоцитарно-макрофагального пула в патогенезе прионовых инфекций // Вестник РАСХН, 2001,8 , 67-70.

12. Дагданова А.В., Дьяконов Л.П. Клеточные системы in vitro в изучении прионов // «С/х биология», 2000,6, 3-10.

13. Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В., Блюмкин В.Н., Илинецкий В.В. Культуры клеток щитовидной железы-продуценты тиреоидных гормонов // «Цитология», 1992т.34.№9, стр.60.

14. Дьяконов Л.П. Гибридные и генетически трансформированные культуры клеток в биотехнологии и ветеринарной медицине // «С/х биология», 4, 1994, стр. 26-31.

15. Дьяконов Л.П. Основные достижения и перспективы развития клеточной биотехнологии // Труды ВИЭВ, 1998, т.71, с.149-161.

16. Дьяконов Л.П., Белоусова Р.В., Лобунцова Д.В. и др. Штамм клеток почки теленка, используемый в качестве продуцента активатора плазминогена. //

17. Авт. Свидетельство №1212043.,1985.

18. Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В., Симонова А.С., Сафина А.Н., Савенко Н.Б. Гибридные культуры клеток животных в вирусологии и биотехнологии // Труды международной научной конференции «Ветеринарная медицина» г. Ялта, 2004 г., стр. 48-51.

19. Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В., Щекалева И.В., Антипова Т.А., Ярных Е.В. Внутривидовая гибридная культура клеток СПЭВ ТК" х лимфоциты свиньи // «С.х. биология», 1996, №2, с. 25-30.

20. Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В., Щекалева И.В., Антипова Т.А., Ярных Е.В. Внутривидовая гибридная культура клеток СПЭВ ТК"х лимфоциты свиньи (А4хС) как модельная система для культивирования герпесвирусов лошадей // «С.х. биология», 1996, № 2, с. 25-30.

21. Дьяконов Л.П., Кущ А.К., Тугизов Ш.М., Майджи Е.В. Методические рекомендации по гибридизации соматических клеток сельскохозяйственных животных М., 1988 г.

22. Дьяконов Л.П., Миронова Л.Л., Конюшко О.И. Методические указания по контролю перевиваемых культур клеток из органов и тканей овец на отсутствие агента скрепи, М., 1996 г.

23. Дьяконов Л.П., Миронова Л.Л., Конюшко О.И. Методические указания по контролю перевиваемых культур клеток из органов и тканей овец на отсутствие агента скрепи, М., 1996.

24. Дьяконов Л.П., Ситьков В.И. "Животная клетка в культуре" М., 2000, 400 с.

25. Ездакова Н.Ю. Получение и характеристика моноклональных антител к иммуноглобулину класса М рогатого скота Дисс. канд. биол. наук., М., 1994.

26. Кетти Д. Антитела. Методы. // М., Мир, 1991,287с.

27. Конюшко О.И., Миронова Л.Л., Дьяконов Л.П. Метод контроля клеточных субстратов на присутствие агента скрепи, Бюлл. ВИЭВ, М., № 77, 1996, стр. 31-33.

28. Копровский X., Виктор Т. Моноклональные антитела к вирусу бешенства. В кн.: Моноклональные антитела. М., Мир, 1983, стр. 341-357.

29. Короев Д.О., Котельникова О.В., Вольпина О.М. и др. Индукция противоменингитного иммунитета с помощью синтетических пептидов // «Биоорганическая химия», 2000, том 26, № 5, с. 323-329.

30. Коромыслов Г.Ф., Караваев Ю.Д., Шуляк А.Ф. Медленные инфекции овец. Распространение, этиология, клиническое проявление и патоморфологические изменения // Труды ВИЭВ, том.64, М., 1987, с.4-13.

31. Куликова И.Л., Гальнбек Т.В., Дьяконов Л.П., Симонова А.С. Цитоморфологическая характеристика новых мутантных культур клеток почки овцы и внутривидовых гибридных культур с лимфоцитами и спленоцитами // доклады РАСХН, №5, 2001, с. 39-41.

32. Куликова И.Л., Гальнбек Т.В., Дьяконов Л.П., Симонова А.С., Шуляк А.Ф., Ярных Е.В. Мутантная линия клеток почки овцы Ovis aries L, дефектная по тимидинкиназе ПО-ЮО-ТК, для гибридизации клеток животных in vitro -Патент № 2184776, 2002.

33. Ларина Г.Н. Сравнительная эффективность методов трансформации клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ, СПЭВ ТК") генами ИС-а2 интерферона человека, pSV2neo, pAGO ТК Авт. канд. диссертации. М.,1992 г.

34. Майджи Е.В. Гибриды соматических клеток сельскохозяйственных животных и их чувствительность к некоторым вирусам Дисс. канд. биолог, наук, М., 1987.

35. Майджи Е.В. Гибриды соматических клеток сельскохозяйственных животных и их чувствительность к некоторым вирусам Дисс. канд. биолог, наук, М., 1987.

36. Майджи Е.В., Тугизов Ш.М., Дьяконов Л.П. Количественный хромосомный анализ сублиний гибридных клеток некоторых сельскохозяйственных животных в связи с чувствительностью к различным вирусам // «С.х. биология», № 6, 1990, с.52-57.

37. Майджи Е.В., Ш.М. Тугизов, Л.П. Дьяконов и др. Оптимизация условий гибридизации мутантных клеток свиньи и лимфоцитов лошади // «С.х. биология», 1990, №2, с. 182-187.

38. Макаров В.В. Вирусная диарея крупного рогатого скота. В сб. Карантинные и малоизвестные болезни животных М. Колос, 1983. С.85-90.

39. Малоголовская С.А., Васильев Д.А., Макаров В.В. Моноклональные антитела // (Учебное пособие), Ульяновск, 1998 г., 30с.

40. Маршак М.И., Варшавер Н.Б. Спонтанный темп возникновения мутаций резистентности к 8-азагуанину в диплоидных и анеуплоидных клетках человека // «Генетика», 1970 г., т.7, с.130-138.

41. Методические рекомендации по диагностике медленных инфекций овец Шишков В.П., Шубин В.А., Суворов B.C., Кувшинов В.Л., Бобоженов М.М., Кунаков А.А., Архипов Н.И., Брагин Г.И., М., 1988.

42. Методические рекомендации по получению генетически трансформированных геном прионного протеина (Prnp-ген) моноцитов мыши // Изданы РАСХН, май 2002,16 стр.

43. Методические рекомендации по получению мутантных штаммов перевиваемых линий клеток с/х животных, пригодных для гибридизации М., 1984, 16 с. (Авторы: Л.П. Дьяконов, А.А. Кущ, Ш.М. Тугизов).

44. Монкс О., Костелло А., Вивере Э., Авилов В.М., Рыбаков С.С. Контроль губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота в Ирландии //«Ветеринария», 1998, 1,стр. 16-22.

45. Моноклональные антитела. Гибридомы: новый уровень биологического анализа. (Ред. Р.Г. Кеннет, Т.Дж. Мак-Керн, К.Б. Бехтол), М., Медицина, 1983, с. 416.

46. Мусиенко М.И. Культуры клеток трансгенных животных и тестирование физиологически активных веществ (соматотопин, интерферон) иммуноферментным методом Дисс. канд. биол. наук. М., 1992.

47. Мусиенко М.М., Макаревич А.В., Эрнст JT.K. и др. Культура клеток из ткани трансгенного кролика продуцент гормона роста крупного рогатого скота. - Докл. ВАСХНИЛ, 1991, №1 стр.28-32.

48. Пинаев Г.П. Методы культивирования клеток // Сборник научных трудов. Л., Наука, 1988, 319 с.

49. Решетников Г.Г. Создание синтетических антигенов для лабораторной диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота и классической чумы свиней. Дисс. канд. биол. наук, Владимир, 2005.

50. Рингерц Н., Р. Сэвидж. Гибридные клетки. М., Мир, 1979, 416 с.

51. Ройхель В.М. Патогенез и диагностика некоторых медленных прионовых инфекций. Дисс., доктора медиц. наук, М., 1997.

52. Суворов B.C. Патоморфологические изменения, вопросы патогенеза и диагностика скрепи овец. Диссертация кандидата ветеринарных наук, М., 1987.

53. Третьякова И.А. Чувствительность культур клеток к парвовирусу крупного рогатого скота // Бюлл. ВИЭВ., вып. 68, М., 1988, с.43-44.

54. Трофимова М.Н., Новиков В.В., О.М.Сандова и др. Наработка моноклональных антител в асцитной форме и методы их очистки // «Биотехнология», 1987, 3, 6, с.735-737.

55. Тугизов Ш.М. Мутантные и гибридные клетки крупного рогатого скота и свиньи для вирусологических исследований. Дисс.канд. биол.наук. М., 1985.

56. Тугизов Ш.М. Мутантные и гибридные клетки крупного рогатого скота и свиньи для вирусологических исследований. Дисс. канд. биол. наук. М., 1985.

57. Тугизов Ш.М. Структурно-функциональный анализ мембранных белков вирусов в генетически трансформированных клетках. Автореф. дисс. докт. биол. наук, М., 1996.

58. Федоров Ю.Н., Верховский О.А. Достижения и перспективы развития ветеринарной иммунологии II Труды ВИЭВ., 1998, т.71., с. 114-124.

59. Феоктистова Т.А., Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю. Количественный метод определения IgM рогатого скота в биологических жидкостях с использованием моноклональных антител // Бюлл. ВИЭВ, вып.68, с.3-5., М., 1988.

60. Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология). Методы культивирования клеток: Сб. научн. тр. Л.: Наука, 1988, с. 194-205.

61. Чевелев С.Ф., Пичугин Л.М., Архипов Н.И. Цитологические изменения в культуре клеток почки телят, зараженных вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота // Вопросы ветер, вирусол., микробиологии, эпизотологии. Покров, 1973, с.40.

62. Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Скалецкий Н.Н., Игнатенко С.Н. и др. Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы, М., "Канон", 1995, стр. 381.

63. Barry R.A. & Prusiner S.B. Monoclonal antibodies to the cellular and scrapie prion proteins. - J. Inf. Dis., 1986, 3, 518-521.

64. Beekes M., Baldauf E., Cassens S, Diringer H., Keyes P., Scott A.C., Wells

65. Behrens A., Genoid N., Naumann H., Rulicke Т., Janett F., Heppner F.L., Ledermann В., Aguzzi A. Absence of the prion protein homologue Doppel causes male sterility. - EMBO, vol. 25, no 14, pp. 3652-3658, 2002.

66. Bolton D.C., McKinley M.P., Prusiner S.B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. - Science, 1982; 218; 1309-1311.

67. Borchelt D.R., Koliatsos V., Guarneri M. et al. Rapid anterograde axonal transport of the cellular prion glicoprotein in the peripheral and CNS. - J. Biol. Chem., 1994, 269, 14711-14714.

68. Brandler S., Isenmann S., Raeber A. et al. Normal host prion protein necessary for scrapie-induced neurotoxicity. - Nature, 1996, 379, 339-343.

69. Broun D.R., Schmidt B. and Kretzschmar H.A. Prion protein fragment Interacts with PrP-Deficient Cells. - J. Neuroscience research, 1998, 52; 260-267.

70. Broun D.R., Schmidt B. and Kretzschmar H.A. A neurotoxic prion protein fragment enchanges proliferation of microglia but not astrocytes in culture. - Glia 18, 1996-b, 59-67.

71. Broun D.R., Schmidt В., Groseschup M.H., Kretzschmar H.A. Replication of scrapie in spleens of SCID mice follows reconstitution with wild-tipe mouse bone marrow. - Europan J Cell Biol., jan. 1998, 75, p. 29-37.

72. Brown D.R. PrPSc-like prion protein peptide inhibits the function of cellular prion protein. - Biochem., 2000, 352, 511-518.

73. Brown D.R., Herms J. and Kretzschmar H.A.- Mouse cortical cells lacking cellular PrP survive in culture with a neurotoxic PrP fragment. Neuroreport, 1994, 5, 2057-2060.

74. Butler D.A., Scott M.R.D., Bockman J.M. et al. Scrapie infected murine neuroblastoma cells produce protease-resistent prion protein. - J. Of Virology, 1988, 62, 1558-1564.

75. Call К., Thilly W. 5-azacytidine inhibits the induction of transient TK-deficient cells by 5-bromodeoxyuridine. - Mutat. Res., 1991, Vol.248., p. 101-114.

76. DeArmond S.J., Mobley W.C., DeMott D.L. et al. Changes in the localization of brain prion protein during scrapie infection. - Neurology, 1987, 37, 1271-1280.

77. Earley E.M., Osterling M.C. Fusion of mouse-mouse cells to produce hibridomas secreting monoclonal antibody. - J. Tussue Cult. Meth.,1985, v.9., n3., p.141-146.

78. ECACC Cell Line Catalogue, 5-Edition, Salisbury, UK, 1997.

79. Europan Comission. The evaluation of tests for the diagnosis of transmissible spongiform encephalopathy in bovines. 8 july 1999, p. 4325-4328.

80. Forloni G., Angeretti N., Chiesa R. et al. Neurotoxicity of prion protein fragment. - Nature, 1993, 362, 543-546.

81. Forloni G., Del Bo K., Angeretti N. et al. A neurotoxic prion protein fragment induces rat astroglial proliferation and hypertrophy. - Eur. J. Neurosci., 1994, 6, 1415-1422.

82. Gajdusek D.C. Unconventional viruses and the origin and disappearance of kuru. - Science, 1977, 197, 943-960.

83. Giese A., Groschup M.H., Hess B. and Kretzschmar H.A. Neuronal cell death in scrapie-infected mice is due to apoptosis. - Brain Pathol., 1995, 5, 213221.

84. Goldmann W., Hunter N., Martin Т., Dawson M., Hope J. PrP-dependent association of prions with splenic but not circulating lymphocytes of scrapie-infected mice. - J. Gen. Virol. 1991. v. 72, p. 201-204.

85. Granthwohl-KUD, Horiuchi-M., Ishiguro-N., Shinigawa-M. Sensitiveenzyme-linked immunosorbent assay for detection of PrPSc in crude tissue extracts from scrapie-infected mice. Journal-of-Virological-Methods.- 1997,V.64, №2, P.205-216.

86. Harmeyer S., Pfaff E., Groschup M.N. Scrapie pathogenesis in subclinically infegted B-cell-deficient mice. - J. Gen. Virol. 1998. v. 79, p. 937-945.

87. Harris D.A. Cellular biology of prion diseases. - Clinical Microbiol. Rev., 1999, 12, 427-444.

88. Hill A.F., Zeidler M., Ironside J., Collinge J. Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. - Lancet, 1997; 349; 99-100.

89. Hope J., Shearman M.S., Baxter H.C. et al. Cytotoxicity of prion protein peptide (PrP106-126) differs in mechanism from the cytotoxic activity of the Alzheimer's disease amyloid peptide A25-55. - Neurodegeneration, 1996, 5, 1- 11.

90. Huang Z., Prusiner S.B. and Cohen F.E.- Structures of prion proteins and conformational models for prion diseases. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1996, 207, 49-67.

91. J.-Y. Madec, S. Simon, S. Lezmi, A. Bencsik, J. Grassi and T. Baron. -Abnormal prion protein in genetically resistant sheep from a scrapie-infected flock. -J Gen Virol 85 (2004), 3483-3486.

92. Kascsak R.J., Rubinstein R., Merz P.A., Tonna-DeMasi M., Fersko R., Carp R.I., Diringer H. Mouse polyclonal and monoclonal antibody to scrapie-associated fibril proteins. - J Virology, dec. 1987, p. 3688-3693.

93. Katz J.B., Pedersen J.C., Jenny A.L., Taylor W. Assessment of western immunoblotting for the confirmatory diagnosis of ovine scrapie and bovine spongiform encephalopathy (BSE). - J. Vet. Diagn. Invest. 1992, V.4, №4, p.447

94. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody predefined specificity. - Nature, 1975, 256,55, 17, 495-497.

95. Korth C., Streit P., Oesch B. Methods in Enzymology, vol. 309, 1999, p. 110.

96. Krasemann S., Groschup M.H., Harmeyer S. et al.- Generation of monoclonal antibodies against human prion protein in PrP0/0 mice. Mol. Med., 1996, 6, 725-734.

97. Kretzschmar H.A., Prusiner S.B., Stowring L.E. and DeArmond S.J. -Scrapie prion protein are synthesized in neurons. Am. J. Pathol., 1986, 122, 1-5.

98. Ktibler E., Oech В., Raeber A.J. Diagnosis of prion protein. - British Medical Bulleten, 2003, 66; pp. 267-279.

99. Kubosaki A., Yusa S., Nasu Y. et al. Distribution of cellular isoform of prion protein in T-lymphocytes and bone marrow, analyzed by wild-type and prion protein gene - deficient mice. - Biochem. Biophis. Res. Commun. 2001, mar. 23; 282(1); p. 103-107.

100. Lane H.C. Human monoclonal antikeyhole limpet hemocyanin antibody - secreting hybridomas produced from peripheral blood В lymphocytes of a keyhole limpet hemocyanin immune individual. - J. Exp. Med. 1982. 133. 155.

101. Littlefield J.W. Selection of hybrids from mating of fibroblasts in vitro and their presumed recombinants. - Science, 1964, Vol. 41, p. 190-196.

102. Littlefield J.W. The use of drug resistant markers to study the hybridization of mouse fibroblasts. - Exp. cell res., 1966, Vol. 41, p. 88-95.

103. Llewelyn С.A., Hewitt P.E., Knight R.S., Amar K., Cousens S., Mackenzie J., Will R.G. vCJD may be the first case of human prion disease transmitted by blood diffusion. - Lancet 363, pp. 417-421, 2004.

104. Loo D.T., Copani A., Pike C.J. et al. Apoptosis is induced by B-amyloid in cultured central nervous system neurons. - Proc. Natl. Acad. U.S.A., 1993,90, 7951-7955.

105. Lopez G.F., Zahn R., Riek R., Wuthrich K. Prion protein expression in human leukocyte differentiation. - PNAS. 2000, v. 97, p. 8334-8339.

106. Mackenzie A. Immunohistochemical demonstration of glial fibrillary acid protein in scrapie. - J. Сотр. Pathol., 1983, 93, 251-259.

107. Matsushita K., Horiuchi H., Furusawa S., Horiuchi M., Shinagawa M., Matsuda H. Prions prevent neuronal precursor cell-line death. - J. Vet. Med. Csi. 1998, v. 60, p. 777-779.

108. Matsuya Y., Yamane I. Cell hybridization and cell agglutination. I. Enhancement of cell hybridization by lectins. - J. Cell Sci. 1985. V.78. p. 236-271.

109. Merz P.A., Sommerville R.A., Wisniewski H.M., Igbal K. — Abnormal fibris from scrapie-infected brain.- ActaNeuropathol., 1981., v.54., p.63-74.

110. Moser M., Colello R.J., Pott U., Oesch В.- Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron, 1995, 14, 509-517.

111. Mueller W., Ushijima H., Schroder H. et al. Cytoprotective effect of NMDA receptor antagonists on prion protein (PrPSo)-induced toxicity in rat cortical cell cultures. - Eur. J. Pharmacol, 1993, 246, 261-267.

112. Nabholz M.et al. Hybridoma technology special reference to parasitic disease. - UNDP, World Banc. WHO, 1979.

113. Neari К., Caughey В., Ernst D. Protease Sensitivity and Nuclease Resistance of the Scrapie Agent Propagated in vitro in Neuroblastoma cells. -J.Virologi. 1991, vol.65, N2, p. 1031-1034.

114. Nguyen J., Baldwin M.A., Cohen F.E., Prusiner S.B. Prion protein peptides induce alpha-helix to beta sheet conformation transitions. - Biochemistry, 1995. v. 34, p. 4186-4192.

115. O'Rourke K.I., Baszler T.V., Miller J.M. et al. Monoclonal antibody F89/160.1.5 defines a conserved epitope on the ruminant prion protein. - J. Clin. Microbiol., 1998a, 36, 1750-1755.

116. O'Rourke K.I., Baszler T.V., Parish S.M. and Knowles D.P. -Preclinical detection of PrPSc in nictitating membrane lymphoid tissue of sheep. -Vet. Rec., 1998b, 142, 486-491.

117. Oesch В., Westaway D., Walchli M. et al. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. - Cell, 1985, 40, 735-746.

118. Okada Y., Murayama F. Fusion of cells by HVJ: Requirement of concentration of virus particles at the site of contact of two cells for fusion. - Exp, cell res., 1968, Vol. 52. p. 34-42.

119. Pan K.-M., Baldwin M., Nguyen J. et al. Conversion of a-helices into |3-sheets features in the formation of the scrapie prion protein. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 10962-10966.

120. Prusiner S.B. Molecular biology of prion diseases. - Science, 1991, 252, 1515-1522.

121. Prusiner S.B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. -Science, 1982,216, 136-144.

122. Prusiner S.B.- Genetic and infectious prion diseases. Arch. Neurol., 1993, 50, 1129-1153.

123. Prusiner S.B. Prion disease and BSE crisis. Science. 1977, v. 278, p. 245-251.

124. Prusiner S.B., Groth D., Bolton D.C., Kent S.B., Hood L.E. Purification and structural studies of major screpie prion protein. - Cell. - 1994., v.38., p. 127-134.

125. Prusiner S.B., Groth D., Serban A. et al. Ablation of the prion protein gene in mice prevents scrapie and facilitates of anti-PrP antibodies. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90,10608-10612.

126. Prusiner-S.B. Prions. - Encyclopedia of molecular biology and molecular medicine, Volume-5: Plasmids to synthetic peptide and nonpeptide combinatorial libraries. 1996, p. 57-73.

127. Race R.E., Fadness L.H., Chesebro B, Characterisation of screpie infection in mouse neuroblastoma cells. - J.gen. Virology, 1987, 68, 1391-1399.

128. Reicl H., Balen A., Jansen C.A.M. Prion transmission in blood and urine: what are the implications for recombinant and urinary-derived gonadotropins? - Human Reproduction, vol. 17, no. 10, pp. 2501-2508, 2002.

129. Rubenstein R., Deng H., Scalici C.L. et al. Alterations in neurotransmitter-related enzyme activity in scrapie-infected PC 12 cells. - J. Gen. Virol., 1991,72, 1279-1285.

130. Rubenstein R., Kascsak R., Merz P. et al.- Detection of scrapie-associated fibrils proteins using anti-SAF antibody in non-purified tissue preparations. J. Cen. Virol., 1986, 67, 671-681.

131. Sauer H., Dagdanova A., Hescheler J. and Wartenberg M. Redox-regulation of intrinsic prion expression in multicellular prostate tumor spheroids. -Free Radical Biology & Medicine, 1999, 27, 1276-1283.

132. Schaetzl H.M., Laszlo L., Holtzmann D.M. et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. - J. Virology, 1997, 71, 8821-8831.

133. Schmerr M.J., Cutlip, Jenny A.L. Capillary isoelectric focusing of the scrapie prion protein. - J. Chromatography A, 802 (1998), p. 135-141.

134. Schreuder B.E., Keulen L.J., Vromans M.E. et al.- Preclinical test for prion diseases. Nature, 1996, 381, 563.

135. Schultz H.M., Laszlo L., Holtzmann D.M., Tatzelt J., de Armond S.J. el al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with Scrapie prions exhibits apoptosis. - J. of Virology, 1997, 71, 8821-8831.

136. Schulz-Schaeffer W.J., Tschoeke S., Kranefuss N. et al.- The paraffin-embedded tissue blot detects PrPSc early in the incubation time in prion diseases. -Am. J. Pathol., 2000,156, 51-56.

137. Scott M.R., Butler D.A. — Prion protein gene expression in cultured cells Bibliogr. P.76 vol. 2 1988 № 2.

138. Serban A., Legname G., Hansen K., Kovaleva N., Prusiner S.B. -Immunoglobulins in urine of hamsters with Scrapie. J. Biol. Chem., vol. 279, no. 47, nov 19, pp. 48817-48820, 2004.

139. Shaked M. Gedeon, Shaked Yuval, Zehavit Kariv-Inbol, Mishele Halimi, and Ruth Yabizon. A Protease-resistent Prion protein isoform present inurine of Animals and Humans affected with Prion Diseases J. Biol. Chem., vol. 276, №34, pp. 31479-31482, 2001.

140. Shaked Y., Rosnmann H., Talmor G., Gabizon R. A. C-terminal PrP isoform is present in mature sperm. — J. Biol. Chem., vol. 274, 45, 32153-32158, November 5, 1999.

141. Sigurdson C.J., Williams E.S., Miller M.W., Spraker T.R., O'Rourke K.I., Hoover E.A. Oral transmission and early lymphoid tropism of chronic wasting disease PrPRES in mule deer fawns (Odocoileus hemionus). - J Gen Virol, 1999; 80; 2757-64.

142. Smith С J., Drace A.F., Banfield B.A., Bloomberg G.B., Palmer M.S., Clarke A.R., Collinge J. PrP-expressing tissue required for transfer of scrapie infectivity from spleen to brain. - FEBS Lett. 1997, v. 405, p. 378-384.

143. Somerville R.A., Birkett C.R., Farquhar C.P., Hunter N. -Immunodetection of PrPSc in spleens of some scrapie-infected sheep but not BSE-infected cows. J. Gen. Virol., 1997, V.78, № 9, p. 2389-2396.

144. Taraboulos A., Raeber A.J., Borchelt D.R. et al. Synthesis and trafficking of prion proteins in cultured cells.- Mol. Biol. Cell., 1992, 3, 851-863.

145. Taraboulos A., Scott M., Semenov A. et al.- Cholesterol depletion and modification of COO-terminal targeting sequence of the prion protein inhibit formation of the scrapie isoform. J. Cell. Biol., 1995, 129, 121-125.

146. Thackray A.M., Klein M.A., Aguzzi A., Bujdoso R. Ghronic subclinical prion disease induced by low-dose inoculum. - J. Virol., p. 2510-2517, vol. 76, no 5, march 2002.

147. Vorberg I., Groschup M.H., Pfaff E., Priola S.A. Multiple amino residues within the rabbit prion protein inhibit formation of its abnormal isoform. - J Vorol., pp. 2003-2009, vol. 77, no. 3, feb. 2003.

148. Yokoyama Т.- The immuno detection of theabnormal isoform of prion protein. Histochem J., 1999, V.31, P.209-212.

149. Yokoyama Т., Itohara S., Yuasa N. Detection of species specific of mouse and hamster prion protein (PrPs) by anti-peptide antibodies. Arch. Virology (1996) 141:763-769.

150. Yokoyama Т., Kimura K., Tagawa Y., Yuasa N. Preparation and characterisation of antibodies against mouse prion protein (PrP) peptides. - Clin. Diagn. Lab. Immun., mar., 1995, p. 172-176.

151. Yokoyama Т., Momotani E., Kimura K, Yuasa N.- Immunoreactivity of specific epitopes of PrPSc is enhanced by pretreatment in a hydrated autoclave. -Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1996, V.3, №4, P.470-471.

Информация о работе

Савенко, Наталья Борисовна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.23

Диссертация

Получение поликлональных антител к синтетическому пептиду прионного белка и определение их специфичности - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы