Создание синтетических антигенов для лабораторной диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота и классической чумы свиней

Решетников, Геннадий Геннадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание синтетических антигенов для лабораторной диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота и классической чумы свиней
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Создание синтетических антигенов для лабораторной диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота и классической чумы свиней"

На правахрукописи

РЕШЕТНИКОВ Геннадий Геннадьевич

СОЗДАНИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГУБКООБРАЗНОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

03.00.06 "Вирусология"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук ^

ЦТ

Владимир-2005

Работа выполнена в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

(г. Владимир)

Научные руководители:

- доктор биологических наук, профессор РЫБАКОВ Сергей Сергеевич

- кандидат химических наук ЛОМАКИН Александр Иванович

Официальные оппоненты:

УЗЮМОВ Василий Лаврентьевич, доктор ветеринарных наук, профессор (ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир); ВЕРХОВСКИИ Олег Анатольевич, доктор биологических наук (ГУ Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, г. Москва).

Ведущая организация - ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» (ГНУ ВНИИВВиМ, г. Покров, Владимирская область).

Зашита диссертации состоится 7 июня 2005 г. вШ® часов на заседании диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, пос. Юрьевец, ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Автореферат разослан 5 мая 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник

Г. М. Семенова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Классическая чума свиней (КЧС) является высоко контагиозным вирусным заболеванием свиней, наносящим большой экономический ущерб. Несмотря на предпринимаемые ветеринарно-санитарные меры, эта инфекция по-прежнему широко распространена во многих странах мира.

Следует отметить, что существуют два направления в борьбе с КЧС. Первое из них реализуется в странах Западной Европы и США, где отказались от вакцинации животных, и, при подозрении на КЧС, осуществляется убой всего стада ("stamping out") (B.B. Куриннов, 1999). Второе направление применяется в ряде стран Восточной Европы, странах СНГ, в том числе и в России, где основной мерой борьбы является вакцинация и убой больных животных. Однако ни один из этих подходов не обеспечивает надежную защиту животных от этого заболевания (O.I.E. Bulletin, 1990-2004 г.г.).

Окончательный диагноз устанавливается на основе лабораторных методов исследований (В.В. Куриннов, 1993; Е.А. Непоклонов и др., 1998; В.Н. Сюрин и др., 1998). Лабораторная диагностика КЧС основана на выделении и идентификации вируса с использованием культур клеток, прямом обнаружении вирусного антигена и выявлении вирусспецифичных антител. При этом традиционными являются метод иммунофлюоресценции,

иммунопероксидазный метод, реакция нейтрализации вируса, реакция непрямой гемагглютинации (РИГА) (Р.Х. Юсупов, Г.Х. Ильясова, 2000; И.А. Бакулов и др., 2002). За последние два десятилетия были разработаны новые методы, которые нашли свое применение в диагностике этого заболевания. Прежде всего это полимеразная цепная реакция и иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием рекомбинантных белков и антител, полученных к ним (J. Dahle et al., 1991; A. Muller et al., 1996; A.B. Кривонос и др., 2000), а также моноклональных антител, обладающих

высокой аффинностью к вирусу КЧС (S. Edwards et al., 1990,1991; A. Kosmidou et al., 1995).

Так как КЧС относится к особо опасным заболеваниям животных, получение синтетических пептидов позволяет исключить использование инфекционного вирусного материала в некоторых вышеуказанных методах.

Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота (ГЭ КРС) относится к прионным болезням. Ее возникновение приводит к большим экономическим потерям. Доказательством этого может служить вспышка ГЭ КРС в Великобритании. С ноября 1986 года, то есть с момента регистрации первого случая заболевания и до 1996 года, общее число пораженных животных составило более 180 тыс. голов КРС (Ю.Г. Костенко, 2001), а общие затраты составили 4 млрд. фунтов стерлингов (Г.А Надточий, 2002).

Для диагностики ГЭ КРС разработано несколько лабораторных методов: гистологический, в основе которого лежит оценка изменений в препаратах срезов мозга больных животных, а также иммуногистохимический (ИГХМ), иммуноблотт и ИФА с использованием специфичных антител (R.J. Kascscak, 1997; С.С. Рыбаков, 2003). Метод постановки биопробы на естественно восприимчивых животных является чувствительным, но и самым дорогостоящим. Кроме того, он требует продолжительного времени из-за длительности инкубационного периода заболевания. Метод электронной микроскопии позволяет выявлять амилоидные стержни и скрепиассоциированные фибриллы в предварительно обработанных пробах мозга или селезенки инфицированных животных (В.Б. Григорьев, 2000). Однако некоторые авторы указывают на низкую чувствительность данного метода (W.A. Cooley, J.K. Clark, M.J. Stack, 1998).

Высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей прионного белка (РгР) у различных видов животных, а также полное совпадение аминокислотного состава нормальной и аномальной формы белка затрудняют его использование в качестве иммуногена. Применение пептидных

фрагментов, полученных путем химического синтеза, предоставляет широкие возможности в получении специфичных противоприонных антител (S. Harmeyer et al., 1998; О.М. Вольпина и др., 2001; С.С. Рыбаков и др., 2001). Кроме того, известно, что возбудитель ГЭ КРС является опасным для человека. Поэтому использование синтетических антигенов позволяет исключить риск заражения.

Химический синтез искусственных антигенов и их использование в диагностике КЧС и ГЭ КРС является перспективным направлением, так как получение пептидов легко поддается стандартизации, они стабильны при хранении и, в отличие от природных (нативных) антигенов, являются безопасными (P.M. Хаитов, 1981,1988; Доклад научной группы ВОЗ, 1991).

Однако некоторые проблемы диагностики указанных болезней до конца не решены. В связи с этим требуется проведение работы, направленной на получение синтетических антигенов и изучение возможности их применения в различных иммунологических методах исследований.

Цели и задачи исследований. Основная цель данной работы - получение синтетических антигенов и изучение возможности их использования в лабораторной диагностике КЧС и ГЭ КРС.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- выявить наиболее вероятную локализацию потенциальных антигенных детерминант белка Е2 вируса КЧС, прионного белка КРС и синтезировать соответствующие им аминокислотные последовательности, получить на их основе смеси и конъюгаты с белками-носителями;

- изучить антигенные и иммуногенные свойства свободных фрагментов белка Е2 вируса КЧС, конъюгатов пептидов с белками-носителями, смесей и оценить возможность их применения в непрямом варианте ИФА и РНГА для выявления антивирусных антител в пробах сыворотки крови свиней;

- разработать методику использования пептидов - фрагментов белка Е2 вируса КЧС в непрямом варианте ИФА и РНГА для выявления вир\сспецифичных антител в пробах сыворотки крови свиней;

- изучить иммуногенные свойства свободных пептидов - фрагментов прионного белка КРС и смесей, созданных на их основе;

разработать методические указания по применению смеси антипептидных антител, полученных к синтетическим фрагментам из центральной и С-концевой области прионного белка КРС, для выявления возбудителя ГЭ КРС иммуногистохимическим методом.

Научная новизна. Впервые в нашей стране с использованием Boc/Bzl и Fmoc But методов твердофазного синтеза получены пептиды, представляющие собой фрагменты белка Е2 вируса КЧС штамма Ж ВЬШИВВиМ, и пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям 106-126 и 206-229 прионного белка КРС. Изучены физико-химические свойства синтетических антигенов, на их основе получены смеси и конъюгаты с белками-носителями.

Проведены исследования антигенных и иммуногенных свойств пептидов -фрагментов белка Е2 вируса КЧС, созданных на их основе смесей и конъюгатов.

Показана возможность использования смеси пептидов для обнаружения антител к вирусу КЧС в пробах сыворотки крови свиней методом непрямого варианта ИФА и РНГА.

Изучены иммуногенные свойства пептидов - фрагментов прионного белка КРС и смесей, созданных на их основе.

Показана возможность использования смеси антипептидных антител, пол\ченных при иммунизации кроликов синтетическими фрагментами из центральной и С-концевой области прионного белка КРС, для выявления возбудителя ГЭ КРС иммуногистохимическим методом.

Практическая значимость. Разработаны и реализованы схемы синтеза индивидуальных пептидов - фрагментов белка Е2 вируса КЧС и прионного белка КРС с использованием Вос/Вй и Ршос/Ви методов.

Разработаны "Методические указания по использованию синтетических антигенов для обнаружения антител к вирусу классической чумы свиней методом непрямого иммуноферментного анализа", которые утверждены директором института 19.03.2003 г.

Разработаны "Методические указания по использованию синтетических антигенов для обнаружения антител к вирусу классической чумы свиней в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)", которые утверждены директором института 07.02.2003 г.

С использованием вышеуказанных методик проведено исследование 138 проб сыворотки крови свиней из различных свиноводческих хозяйств Российской Федерации.

Разработаны "Методические указания по применению смеси антител к фрагментам прионного белка для лабораторной диагностики губкообразной энцефалопатии КРС иммуногистохимическим методом", которые утверждены директором института 24.03.2005 г. С использованием разработанной методики исследовано 56 препаратов, представляющих собой срезы головного мозга КРС.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота" (Владимир, 2002 г.), Международной научной конференции "Актуальные проблемы инфекционной патологии животных" (Владимир, 2003 г.), Международной научной конференции молодых ученых "Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных" (Владимир, 2004 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

• Синтетические фрагменты белка Е2 вируса КЧС штамма Ж ВНИИВВиМ и прионного белка КРС.

• Результаты изучения антигенных и иммуногенных свойств пептидов -фрагментов белка Е2 вируса КЧС, созданных на их основе смесей и конъюгатов с белками-носителями.

• Результаты исследования проб сыворотки крови свиней согласно методическим указаниям по использованию синтетических антигенов для обнаружения антител к вирусу КЧС в непрямом варианте ИФА и РИГА.

• Иммуногенная активность пептидов - фрагментов прионного белка КРС и смесей, созданных на их основе.

• Результаты испытаний «Методических указаний по применению смеси антител к фрагментам прионного белка для лабораторной диагностики губкообразной энцефалопатии КРС иммуногистохимическим методом».

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы, содержащего 237 источников, из них 142 - зарубежных авторов, и приложения. Работа иллюстрирована 20 рисунками и содержит 15 таблиц.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. Для синтеза пептидов использовали аминокислоты и реагенты фирм Fluka (Швейцария), Sigma (США), Reanal (Венгрия), Merck (Германия). В работе применяли антивидовые коммерческие конъюгаты, выпускаемые НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (г. Москва), биотинилированные моноклональные антитела, специфичные к IgG кролика, экстравидинпероксидазный конъюгат, аминоэтилкарбазол фирмы Sigma (Израиль), протеиназу К фирмы Serva (Германия), бычий сывороточный альбумин (BSA) и гемоцианин фиссурелии (KLH) фирмы Calbiochem (США).

В работе использовали ротационные испарители фирмы Buchi (Швейцария), центрифугу J2-21 (Beckman, США), хроматографические колонки и перистальтические насосы (LKB, Pharmacia, Швеция), коллектор фракций модели 1200 (Isco, США), спектрофотометр фирмы Shimadzy (Япония), полистироловые 96-луночные планшеты (Nunc, Дания), спектрофотометр-ридер фирмы Bio-Rad (Франция). Для проведения ИГХМ использовали оборудование фирм Medite и Microm (Германия), Tiyoda Manufacturing Co., LTD (Япония).

Генно-инженерный белок Е2 был получен от НПО "Нарвак" (г. Москва).

В исследованиях использовали вирус КЧС штамма Ж ВНИИВВиМ.

Иммуногенную активность пептидов изучали на клинически здоровых кроликах массой 1,5-2,5 кг.

Срезы из области задвижки продолговатого мозга КРС, больного ГЭ, были приготовлены из парафиновых блоков, любезно предоставленных Центральной ветеринарной лабораторией г. Дублин (Р. Ирландия).

Компьютерный анализ. Компьютерный анализ антигенной структуры белка Е2 вируса КЧС был проведен с использованием пакета программ PC/Gene (версия 5.15, University of Geneva, Switzerland, January 1988), основанных на определении показателей (коэффициентов и/или профилей) гидрофильности, антигенности, подвижности, амфипатичности отдельных

участков аминокислотной последовательности, а также предполагаемой вторичной структуры исследуемого белка. Поиск антигенных детерминант прионного белка КРС, опубликованный С.С. Рыбаковым и др. (1997), также основывался на расчете указанных показателей.

Твердофазный синтез пептидов. Пептиды были синтезированы твердофазным методом путем последовательного наращивания цепи с С-конца согласно протоколам, опубликованным G. Вага^ (1980) и А.В. Яровым (1989). Для защиты а-аминофункции использовали Вос- или Fmoc- защитные группы, боковые радикалы трифункциональных аминокислот были блокированы временными группами согласно выбранной схеме синтеза.

Деблокирование пептидов выполняли по методам, предложенным Н. Yajima (1983), J.P. Tam et al. (1986), J.P. Тат, R.B. Merrifield (1987).

АМИНОКИСЛОТНЫЙ состав пептидов. Аминокислотный состав пептидов был определен в Институте физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (МГУ, г. Москва) по методу Т. Девени и Я. Гергей (1976) и в ФГУ ВНИИЗЖ с использованием кислотного гидролиза и метода высокоэффективной жидкостной обращенно-фазовой хромотографии на хроматографе Altex фирмы Beckman (США).

Тонкослойная хроматография. При получении производных аминокислот чистоту продуктов реакции контролировали методом тонкослойной хроматографии с использованием пластин марки DC-Alufolien Kieselgel 60 F 2 54 фирмы Merck (Германия). Хроматограммы обрабатывали газообразным хлором и проявляли толидиновым реактивом (Ю. Кирхнер, 1981).

Изучение антигенной активности синтетических фрагментов белка Е2 вируса КЧС и смесей, созданных на их основе. В работе применяли непрямой вариант ИФА (н-ИФА) (Г. Фримель, 1987; У.П. Коллинз, 1991) и РИГА (Я.Е. Коляков, 1986).

Получение конъюгатов пептидов с белками-носителями.

Конъюгирование пептидов с белками-носителями (KLH и BSA) проводили глутаровым альдегидом по общепринятой методике (S. Muller, 1988).

Изучение иммуногенных свойств синтетических антигенов. Кроликам массой 1,5-2,5 кг вводили синтетические антигены в 4 точки спины подкожно с полным (первая иммунизация) и неполным (вторая, третья и четвертая иммунизации) адъювантом Фрейнда. Доза для каждой иммунизации была равна 200 или 400 мкг препарата на одно животное. Антипептидную активность полученных проб сыворотки крови (А11Л) определяли в н-ИФА, используя их последовательные разведения и постоянную концентрацию антигенов: пептидные фрагменты белка Е2 вируса КЧС, смеси на их основе, МАР-конструкция, а также рекомбинантный белок Е2 - 50 мкг/мл, вирус КЧС штамма Ж ВНИИВВиМ, пептидные фрагменты прионного белка КРС и смеси на их основе -10, мкг/мл.

Изучение активности АЛА в РНГА проводили согласно "Методическим указаниям по определению в РНГА специфических антител у свиней, вакцинированных против чумы", утвержденным Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР (10.04.1989 № 433-7). Сенсибилизацию эритроцитов барана осуществляли как вирусом КЧС штамма Ж ВНИИВВиМ, так и синтетическими препаратами по стандартной методике (Я.Е. Коляков, 1986).

Иммуиогистохимический метод. Изучение возможности использования АПА для обнаружения патогенной формы прионного белка КРС в иммуногистохимическом методе проводили согласно "Методическим указаниям по выявлению патогенной изоформы прионного белка в ткани головного и спинного мозга КРС иммуногистохимическим методом", утвержденным Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства РФ 07.06.2001.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Компьютерный анализ. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности белка Е2 вируса КЧС и прионного белка КРС был первым этапом в достижении основной цели диссертационной работы. Во внимание принимался расчет параметров, лежащих в основе пакета программ PC/Gene (показатели или профили гидрофобности, гидрофильности, амфипатичности и другие). Теоретический поиск антигенных детерминант позволил выявить участки, содержащие потенциальные В- и Т- клеточные эпитопы, которые затем были синтезированы твердофазным методом. Аминокислотный состав пептидов представлен в таблице 1.

Таблица 1

Аминокислотная последовательность синтезированных пептидов

№ I Аминокислотная последовательность

Пептидные фрагменты белка Е2 вируса КЧС

1 3-Ala-Cvs(Acm)-Lvs-Glu-Asp-His-Arq-Tyr-Ala-lle-Ser-Ser-Thr-Asn-Lvs-lle-Gly-Leu-Leu-21

2 78-Val-Thr-Phe-Glu-Leu-Leu-Phe-Asp-Gly-Thr-Ser-Pro-Leu-Thr-91

3 82-Leu-Leu-Phe-Asp-Gly-Thr-Ser-Pro-Leu-Thr-91

4 83-Leu-Phe-Asp-Gly-Thr-Ser-Pro-Leu-Thr-Glu-Glu-Met-94

5 86-Gly-Thr-Ser-Pro-Leu-Thr-Glu-Glu-Met-Gly-Asp-Asp-Phe-Glu-Phe-100

6 89-Pro-Leu-Thr-Glu-Glu-Met-Gly-Asp-Asp-Phe-Glu-Phe-Gtv-Leu-102

7 105-Tvr-Asp-Thr-Ser-Pro-Val-Val-Lys-Gly-Lys-Thr-Asn-Thr-Thr-Leu-Leu-Asn-Gly-122

8 119-Leu-Leu-Asn-Gly-Ser-Ala-Phe-H¡s-Leu-Val-Cys(Acm)-129-Gly

9 129-Cys(Acm)-Pro-lle-Gly^-Thr-Gly-Val-Val-Glu-Cys(Acm)-139-Gly

10 139-Thr-Ala-Val-Ser-Pro-Thr-Thr-Leu-Arg-Thr-Glu-Val-Cys(Acm)-151 -Gly

11 147-Leu-Arg-Thr-Glu-Val-Val-Lys-Thr-Phe-Arg-Arg-Glu-Lys-Pro-160-Gly

12 151 -Val-Val-Lvs-Thr-Phe-Arg-Arg-Glu-Lys-Pro-Phe-161

13 148-Arq-Thr-Glu-Val-Val-Lvs-Thr-Phe-Arq-Arq-Glu-Lvs-Pro-Phe-Pro-H¡s-Arq-164

14 151-Val-Val-Lvs-Thr-Phe-Arq-Arg-Glu-Lys-Pro-Phe-Pro-His-Arg-164

15 155-Phe-Arq-Arg-Glu-Lys-Pro-Phe-Pro-His-Arq-164

16 (148-Arg-Thr-Glu-Val-Val-Lys-Thr-Phe-Arg-Arg-Glu-Lys-Pro-Phe-Pro-H¡s-Arg-164-Gly3)8- LysrGIy

17 155-Phe-Arg-Arq-Glu-Lys-Pro-Phe-Pro-H¡s-Arg-Arg-Asp-Ala-Val-168-Gly

18 Cys(Acm)-168-Val-Thr-Thr-Thr-Val-Glu-Asn-Glu-Asp-Leu-Phe-Tyr-Cys(Acm)-180-Gly

19 306-Tyr-Tyr-Glu-Pro-309-Gly

20 302-Leu-Arq-Asn-Lys-Tyr-Tyr-Glu-Pro-Arq-Asp-311-Gly

Пептидные фрагменты прионного белка КРС

21 106-Thr-His-Gly-Gln-Trp-Asn-Lys-Pro-Ser-Lys-Pro-Lys-Thr-Asn-Met-Lys-His-Val-Ala-Gly- Ala-126

22 108-Gly-Gln-Trp-Asn-Lys-Pro-Ser-Lys-Pro-Lys-Thr-Asn-Met-Lys-H¡s-Val-Ala-Gly-Ala-126

23 111 -Asn-Lys-Pro-Ser-Lys-Pro-Lys-Thr-Asn-Met-Lys-His-Val-Ala-Gly-Ala-126

24 206-Gly-Glu-Asn-Phe-Thr-Glu-Thr-Asp-lle-Lys-Met-Met-Glu-Arg-Val-Val-Glu-Gln-Met-Cys(Acm)-lle-Thr-Gln-Tyr-229-Gly

25 216-Met-Met-Glu-Arg-Val-Val-Glu-Gln-Met-Cys(Acm)-lle-Thr-Gln-Tyr-229-Gly

Примечание: - пептиды синтезированы вместе с А.В. Павловым, к.х.н., ст.н.с.

Синтез пептидов.

Твердофазный синтез пептидов Boc/Bz.l методом Синтез пептида (О Boc-Ala-Cys(Acm)-Lys(Cl2z)-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-His(Dnp)-Arg(Tos)-Tyr(Bzl)-Ala-Ile-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-Asn-Lys(Cl2Z)-Ile-Gly-Leu-Leu-полимер получали из Boc-Leu-полимера. Присоединение Boc-Asn осуществляли в виде n-нитрофенилового эфира. Динитрофенильную группу с остатка His снимали 0,1М раствором тиофенола в диметилформамиде при комнатной температуре в течение 1 часа. Пептид отщепляли от полимера с одновременным деблокированием в 2 этапа. На первом - пептидилполимер обрабатывали по методу, предложенному J.P. Тат и R.B. Merrifield (1987). На втором этапе сухой остаток растворяли в трифторуксусной кислоте, добавляли м-крезол до конечной концентрации 10%, охлаждали до 0°С и по каплям вносили трифторметансульфокислоту до 10% (по объему). Реакцию проводили в течение 1 часа, а затем реакционную смесь вновь осаждали в эфир и центрифугировали 10 минут при скорости вращения ротора 10000 об/мин, и температуре 4°С. Отделенный и высушенный от эфира осадок растворяли в 0,1М аммоний-ацетатном буфере. К раствору добавляли водный аммиак до рН 7,5. Пептид выдерживали в растворе 1,5 часа. Раствор наносили на колонку с сефадексом G-10, уравновешенным 0,1 н. уксусной кислотой. Фракцию, содержащую пептид, концентрировали и рехроматографировали в тех же условиях. Затем пептид лиофилизировали. Выход в пересчете на С-концевую аминокислоту составлял 13,5% (59 мг).

Синтез пептидов (2) и (3) Защищенные пептидилполимеры пептидов (2) и (3) были синтезированы из Boc-Thr-полимера. Отщепление пептидов от полимера и удаление защитных групп проводили, как описано для пептида (1), исключая второй этап деблокирования. Выделение и очистку осуществляли аналогично пептиду (1).

Выход полученных пептидов (2) и (3) составлял соответственно 18% (53 мг) и 15% (46 мг).

Синтез пептида (4) Boc-Leu-Phe-Asp(OcHex)-Gly-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Pro-Leu-Thr(Bzl)-G1u(ОВz1)-G1u(ОВz1)-Меt-полимер синтезирован из Boc-Met-полимера. Удаление Вое защитной группы вели в присутствии 5% диметилсульфида (по объему) ввиду наличия остатка Met. Полученный пептидилполимер деблокировали по методу, предложенному J.P. Tam, W.F. Heath и R.B. Merrifield (1986). Выделение и очистку пептида (4) в дальнейшем осуществляли аналогично пептиду (1). Выход пептида составлял 41 мг (17%) в расчете на С-концевую аминокислоту.

Синтез пептида (5) Boc-Gly-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Pro-Leu-Thr(Bzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Met-Gly-Аsр(ОВz1)-Аsр(ОВz1)-Рhе-С1u(ОВz1)-Рhе-полимер получали исходя из Boc-Phe-полимера. После присоединения остатка Met в 94 положении удаление Вос-группы и деблокирование полученного пептидилполимера проводили, как описано для пептида (4). Выделение и очистку пептида (5) в дальнейшем осуществляли аналогично пептиду (1). Пептид был получен с выходом 13% (50 мг) в расчете на С-концевую аминокислоту.

Синтез пептида (12) Boc-Val-Val-Lys(Cl2Z)-Thr(Bzl)-Phe-Arg(Mts)-Arg(Mts)-Glu(OBzl)-Lуs(Сl2Z)-Рrо-Рhе-полимер синтезирован из Boc-Phe-полимера. Отщепление пептида от полимера осуществляли с одновременным деблокированием в один этап аналогично пептиду (2). Выделение и очистку проводили, как описано для пептида (1). Выход полученного пептида составлял 17% (33 мг).

Синтез пептидов (13). (14) и (15) Синтез защищенных пептидилполимеров пептидов (13), (14) и (15) вели исходя из Вос-Аrg(Тоs)-полимера. Деблокирование полученных пептидилполимеров, выделение и очистку пептидов вели аналогично пептиду

(1). Выходы пептидов (13), (14) и (15) составляли соответственно 14% (55 мг), 12% (39 мг) и 10% (25 мг).

Синтез пептида (16) (Вос-Агв(М18)-ТЬг(В/1)-01и(ОБ/1)-Уа1-Уа1-Ьу8(а27)-ТЬг(Б/1)-РЬе-Arg(Mts)-Arg(Mts)-G1u(OBz1)-Lys(C12Z)-Pro-Phe-Pro-His(Dnp)-Arg(Mts)-G1y-01у-С1у)8-Ьу87-01у-РАМ-полимер синтезировали из Вос^1у-РАМ-полимера. После присоединения 3 остатков G1y к лизиновой матрице синтез вели, как представлено выше для пептида (13). Свободную аминогруппу К-концевого аргинина ацилировали 25 мл ЗмМ раствора уксусного ангидрида в диметилформамиде, содержащего 0,3 ммоль К,К-диметиламинопиридина. Деблокирование и одновременно снятие с РАМ-полимера осуществляли в два этапа. Первый - аналогично пептиду (1), а второй - с использованием 1М раствора триметилсилилтрифторметансульфоната в трифторуксусной кислоте в присутствии 2% м-крезола. Реакцию вели 1 час при 0°С, а следующие 1,5 часа -при комнатной температуре. Осадок после деблокирования растворяли в 10% уксусной кислоте и обессоливали на колонке с сефадексом G-10, уравновешенным 0,1 н. уксусной кислотой. Рехроматографию проводили в тех же условиях с применением сефадекса G-25. Содержащие пептид фракции концентрировали и лиофильно высушивали. Было получено 11 мг пептида (16), что составляет 41% в пересчете на С-концевую аминокислоту.

Синтез пептидов (22). (22) (23) Защищенные пептидилполимеры пептидов (21), (22), (23) были синтезированы из Вос-А1а-полимера. Отщепление пептидов от твердой фазы и удаление защитных групп проводили, как описано для пептида (2), сократив время реакции до 3 часов. Выделение вели согласно методике, представленной для пептида (6). Очистку полученных синтетических пептидных фрагментов (21), (22), (23) проводили с использованием геля Тоуореай HW 40, уравновешенного 10% раствором уксусной кислоты. Фракции, содержащие пептид, концентрировали и затем осаждали, как указано для пептида (6).

Остатки сушили в вакуумном эксикаторе над щелочью. Выход пептидов (21), (22), (23) соответственно составлял 28% (195 мг), 19% (165 мг) и 10% (20 мг). Твердофазный синтез пептидов Fmoc/Butметодом Синтез пептида (6) Ршос-Рго-Ьеи-ТЬг(Ви0-О1и(ОВи1)-С1и(ОВи1)-Ме1-С1у-Азр(ОВи1)-А5р(ОВи1)-РЬе-С1и(ОВи1)-РЬе-С1у-Ьеи-полимер синтезировали из Вос-Ьеи-полимера. Полученный пептидилполимер деблокировали с одновременным снятием с твердой фазы, как описано для пептида (2), сократив время реакции до 2 часов. Затем в реакционную смесь добавляли 10-кратный избыток диэтилового эфира. Выпавший осадок отделяли фильтрованием и обрабатывали 1М раствором уксусной кислоты. Фильтрат, содержащий уксусную кислоту и растворенный в ней пептид, концентрировали на роторном испарителе. К остатку добавляли постепенно небольшими порциями ацетон. Осадок тщательно растирали и центрифугировали 15 минут при скорости вращения ротора 8000 об/мин., ацетон декантировали. Сушили полученный пептид в вакуумном эксикаторе над щелочью. Выход пептида (6) составлял 12% (23 мг).

Синтез пептида (7)

Ршос-Туг(В21)-А8р(ОВи1)-ТЬг(В21)-8ег(В21)-Рго-Уа1-Уа1-Ьу8(2)-С1у-Ьу5(2)-ТЬг(В21)-Азп(МЬЬ)-ТЬг(В21)-Т11г(В21)-Ьеи-Ьеи-А8п(МЬЬ)-С1у-полимер

получали из Boc-Gly-полимера. Fmoc-Asn(Mbh), Fmoc-Lys(Z), Fmoc-Ser(Bzl) и Fmoc-Tyr(Bzl) присоединяли в виде пентафторфениловых эфиров. Деблокирование, выделение и очистку вели, как описано для пептида (6). Выход полученного свободного пептида составлял 10% (80 мг).

Синтез пептида (8) Синтезировали Ртос-Ьеи-Ьеи-А5п(МЬЬ)-С1у-8ег(Ви1)-А1а-РЬе-Ни(Т11)-Ьеи-Уа1-Су5(Асш)-С1у-полимер, как описано для пептида (7). Для остатка лейцина в 127 положении не была достигнута желаемая полнота протекания реакции, вследствие чего конденсацию проводили в третий раз. При этом

использовали 15% раствор трифторэтанола в хлористом метилене, содержащий 1,5 экв. Ршое-Ьеи и эквимолярное количество диизопропилкарбодиимида. Fmoc-Asn(Mbh) вводили в пептидную цепь в виде пентафторфенилового эфира. Полученный пептидилполимер пептида (8) деблокировали 1М раствором триметилбромсилана в трифторуксусной кислоте и смесью, содержащей тиоанизол, этандитиол и м-крезол в соотношении 6:3:1 (по объему). Реакцию вели 2 часа при 0°С. Смесь пропускали через фильтр Шотта (диаметр пор 40нм) в охлажденный диэтиловый эфир. Выпавший осадок отделяли центрифугированием, как описано для пептида (6). Эфир декантировали, а плотный остаток растирали со свежей порцией эфира и вновь центрифугировали при тех же условиях. Осадок сушили и очищали аналогично пептиду (6). Было получено 77 мг пептида, что составляло 14% в пересчете на С-концевую аминокислоту.

Синтез пептида (9)

Для получения Вос-Су5(Аст)-Рго-11е-С1у-Тгр-ТЬг(Ви1)-С1у-Уа1-Уа1-О1и(ОВи0-Суз(Аст)-О1у-полимера брали Вос-01у-полимер. Деблокирование,

выделение и очистку пептида (9) вели, как описано для пептида (8). Выход вещества в пересчете на С-концевую аминокислоту составлял 11% (73 мг). .

Синтез пептидов П01П11. (171 (181П9) и (20)

Пептидилполимеры пептидов (10), (11), (17), (18), (19) и (20) получали из Бос-01у-полимера. Производные тирозина, лизина и аспарагина вводили в пептидную цепь, применяя их пентафторфениловые эфиры. Деблокирование, выделение и очистку осуществляли аналогично описанию для пептида (8). Выход пептидов (10), (11), (17), (18), (19) и (20) составлял соответственно 9% (66 мг), 12% (105 мг), 14% (127 мг), 8% (72 мг), 13% (29 мг) и 15% (74 мг).

Аминокислотный анализ. Аминокислотный состав пептидов, определенный с помощью кислотного гидролиза, совпадал с теоретически ожидаемым на 80% и выше (табл. 2). Данное обстоятельство позволяет считать каждый исследованный образец индивидуальным пептидом.

Таблица 2

Аминокислотный состав целевых пептидов - фрагментов белка Е2 вируса КЧС и

прионного белка КРС

ПЕПТИД АМИНОКИСЛОТЫ, ВХОДЯЩИЕ В СОСТАВ ПЕПТИДА

№ фрагмент А1а Агд Аэр аи гау Нв Не Ьеи 1.ув Ме( РЬе Рго Бег ТЬг Тгр Туг Уа1

1. 3-21 1.9 (2) 0.8 (1) 1.0(1) 0.8 (1) 1.2(1) 1.2(1) 2.2 (2) 2.2(2) 1.8(2) - - - 1.7(2) 1.0(1) 0,8(1) •

2. 78-91 - - 0.8 (1) 0,8 (1) 1,0(1) - 2.8 (3) - • 2.1 (2) 1.2 (1) 1.1 (1) 3,4 (3) - 1.2 (1)

3. 82-91 - - 0,8(1) - 0,9(1) - 2.9 (3) - - 1.1 (1) 1.2(1) 1.0(1) 2.3(2) - -

4. 83-94 - 1.2(1) 1.9 (2) 3,3 (3) 1.0(1) - 1.2 (1) 1.2(1) - 1.2(1) - - - • 1.9(2)

5. 86-100 - 1,8 (2) 2,7 (3) 2.0 (2) - 0.8(1) - 1.2(1) 1,8 (2) 1.0(1) О.в (1) 1.7(2) - -

Б. 89-102 - 2.1 (2) 3.1 (3) 2.1 (2) - 2,0 (2) - 0.8 (1) 1.6(2) 0,8 (1) - 1.0(1) - -

7. 105-122 - 2,8 (3) - 2,0 (2) - 2.3 (2) 2.2 (2) - 0,8 (1) 0,8(1) 3,6 (4) 1.2(1) 1.9(2)

8. 119-129^3 |у 0.9 (1) 1.1 (1) - 1,7(2) 0.8 (1) 2.7 (3) - 1.2(1) - 1.1 (1) - - 1.0(1)

9. 129 • 139-Оу - - 0,8(1) 2,6 (3) - 0,8 (1) - - - 1.0 (1) - 1.2(1) 0.8 (1) - 1.6(2)

10. 139-151-&У 1.1 (1) 1.2(1) - 0.8 (1) 0,8 (1) - 0,8 (1) - - 0,9(1) 1.2(1) 3.6 (4) - 1,7(2)

11. 147 - 160-0у - 3.2 (3) 1,2(1) 1.0(1) 1.1 (1) - 0.8 (1) 1.9(2) 1.1 (1) 0.8(1) - 1.9 (2) - 2.0 (2)

12. 151 -161 - 2.2 (2) - 1.2(1) - - - 2,2 (2) 2.0 (2) 0,8 (1) - 0,8(1) - 1.9 (2)

13. 148 -164 - 4.4 (4) - 1.9(2) - 1.2 (1) - 2.1 (2) 2,2 (2) 2.2 (2) - 1.8 (2) - 2.3 (2)

14. 151-164 - 3.1(3) - 1.0(1) - 0.8(1) - 1,7(2) 1.9(2) 2,3 (2) - 1.2 (1) - 1.7(2)

15. 155 - 164 - 2.6(3) - 0,8 (1) - 0,8 (1) - 1.1 (1) 1.7(2) 1.9(2) - - - -

16. <148-164)-МАР - 3.9 (4) - 2,3 (2) - 0,8(1) - 2,0 (2) 1.7 (2) 1.6 (2) - 1.9(2) - 2,3 (2)

17. 155-168-©» 0,8 (1) 4,1 (4) 1.7(2) - 1.0(1) 0,8(1) - 1.0 (1) 1.6(2) 1.8 (2) - - - 1.2(1)

18. 167-18СМ31у - - 1.7(2) 2.4 (2) 0.8 (1) - 0,8(1) - 0.В (1) - - 2,4 (3) 1.0(1) 1.8(2)

19. 306 • 309-&у - - - 0,8 (1) 0.9(1) - - - 1,0 (1) - - 1.7(2) -

20. 302-311-в 1у - 2,0 (2) 1.6(2) 1,2(1) 1.1 (1) - 0,8 (1) 1.2(1) 0,8 (1) - - 1,6(2) -

21. 106-126 2,2 (2) - 2,0 (2) 0.8 (1) 2.2 (2) 1.8(2) - 4,0 (4) 1.1(1) 2,1 (2) 0,8 (1) 1.8(2) - 1.0(1)

22. 108-126 2,2 (2) - 2,0 (2) 0,8(1) 2.2 (2) 0,9 (1) - 4,0 (4) 1.1 (1) 2.1 (2) 0.8 (1) 0,9 (1) - 1.0(1)

23. 111-126 1.9(2) - 2.1 (2) - 1.2(1) 0,8(1) - 4.0 (4) 1.1 (1) 2.2 (2) 0.8(1) 0.9(1) - 0.9(1)

24. 206-229-ау - 1,0(1) 1.8(2) 5.9 (6) 2.2 (2) - 1.8 (2) - 1,0(1) 2.8 (3) 0,9(1) - - 2,8 (3) 0,8(1) 1.8(2)

25. 216-229-&У - 1.0 (1) - 3,8 (4) 1.1 (1) - 0,9(1) - 1.0(1) 3.1 (3) - - - 0.9 (1) 0.8(1) 2.0 (2)

Примечание: в скобках указано количество аминокислотных остатков согласно аминокислотной последовательности белка Е2;

* - используемым методом определить невозможно

Смеси, приготовленные на основе синтезированных пептидов.

Принимая во внимание положительные результаты, полученные со смесями пептидов (P.M. Хаитов, 1988; Ю.А. Семилетов, 1994; Т.Н. Щербакова, 1994), нами были созданы смеси на основе синтезированных фрагментов белка Е2 вируса КЧС и прионного белка КРС. Смеси I - V, VII, IX - XIV содержали по два свободных пептида (рис. 1, 2). Смесь VI состояла из 4 ковалентно связанных пептидов. Смесь VIII - механическая смесь восьми свободных пептидов (рис. 1).

I. 89-102 + 105-122: PLTEEMGDDFEFGL (6)+YDTSPWKGKYNTTLLNG (7)

II. (119-129)Gly + (129-139)Gly: LLNGSAFHLVCG (8)+CPIGWTGWECG (9)

III. (129-139)Gly + (139-151 )Gly: CPIGWTGWECG (9)+CTAVSPTTLRTEVG (10)

IV. (139-151 )Gly + (147-160)Gly: CTAVSPTTLRTEVG (10)+LRTEWKTFRREKPG <n)

V. (155-168)Gly + (167-180)Gly: FRREKPFPHRRDCVG (17)+CVTTTVEDEDLFYCG (18)

VI. (129-139)Gly + (139-151 )Gly + (147-160)Gly + (155-168)Gly:

CPIGWTGWECG (?) + CTAVSPTTLRTEVG (10) + + LRTEWKTFRREKPG (11)+FRREKPFPHRRDCVG (17)

VII. (306-309)Gly + (302-311)Gly: YYEPG (19)+LRNKYYEPRDG (20)

VIII. 89-102 + 105-122 + (119-129)Gly + (129-139)Gly + (139-151 )Gly +

+ (147-160)Gly + (155-168)Gly + (167-180)Gly:

PLTEEMGDDFEFGL (6) +YDTSPWKGKYNTTLLNG 17) + LLNGSAFHLVC (8) + CPIGWTGWEC (9) + +CTAVSPTTLRTEV (10)+LRTEWKTFRREKP (11 )+FRREKPFPHRRDCV (17)+CVTTTVEDEDLFYC (18)

IX. 3-21 + 148-164: ACKEDHRYAISSTNKIGLL (1 )+RTEWKTFRREKPFPHR (13)

X. 3-21 + 151-164: ACKEDHRYAISSTNKIGLL (1)+WKTFRREKPFPHR (14)

Рис. 1. Состав смесей, созданных на основе пептидов - фрагментов белка Е2 вируса КЧС

XI. 106-126 + 206-229-Gly: HGQWNKPSKPKTNMKHVAGA (21) + GENFTETDIKMMEFWEQMCfTQYG (24)

XII. 106-126 + 216-229-Gly: HGQWNKPSKPKTNMKHVAGA (21)+MMEFWEQMCITQYG (25)

XIII. 108-126 + 206-229-Gly: CWNKPSKPKTNMKHVAGA (22) + GENFTETDiKMMER№QMCITCilG (24)

XIV. 108-126 + 216-229-Gly: QWNKPSKPKTNMKHVAGA (22)+MMERWEQMCITQYG (25)

Рис. 2. Состав смесей, созданных на основе пептидов-фрагментов прионного белка КРС

Антигенные и иммуногенные свойства пептидов - фрагментов белка £2 вируса КЧС и созданных на их основе смесей и конъюгатов с белками-носителями.

Антигенность свободных пептидов и смесей изучали в н-ИФА. Антиген наносили на полистироловый 96-луночный планшет, начиная с разведения 1:5 и далее с шагом 2 (исходная концентрация - 1 мг/мл) при постоянном разведении вирусспецифичной сыворотки 1:100. Антигенную активность выражали через десятичный логарифм величины обратного разведения раствора антигена, при котором оптическая плотность комплекса с антителами более чем в 2 раза превышала оптическую плотность неспецифичных комплексов. В качестве положительного контроля использовали культуральный вирус КЧС штамма Ж ВНИИВВиМ.

Представленные в таблице 3 данные показывают, что пептиды и смеси, созданные на их основе, образуют специфичные комплексы с антителами гипериммунной сыворотки. Наибольшую антигенность проявили пептиды 119-129, 155-168 - 3,9 & 139-151, 147-160 - 3,4 смеси VI, IX - 4,0 V, X - 3,9 & I, VIII - 3, 7 & III (3,6 1я), VII (3,5

Таблица 3

Антигенная активность пептидных фрагментов белка Е2 вируса КЧС и смесей, созданных на их основе_

№ Антиген Активность в н-ИФА, (3 № Антиген Активность в н-ИФА, (3

Вирус КЧС 3,8 15. 155-164 2,9

1. 3-21 3,2 16. 155-168-ау 3,9

2. 78-91 3,2 17. 167-180-ау 3.1

3. 82-91 3.2 18. 306-309-^у 3.0

4. 83-94 3,0 19. 302-311-ау 3.1

5. 86-100 3,0 20. I 3.7

6. 89-102 3.0 21. II 3.0

7. 105-122 3.1 22. III 3.6

8. 119-129-0!у 3.9 23. IV 3,3

9. 129-139-в!у 3.2 24. V 3.9

10. 139-151-Ш 3,4 25. VI 4,0

11. 147-160-в!у 3,4 26. VII 3.5

12 151-161 2.5 27. VIII 3.7

13. 148-164 3.2 28. IX 4.0

14. 151-164 2,9 29. X 3,9

Примечание: 1-Х - смеси, созданные на основе свободньк пептидов

На следующем этапе работы изучали иммуногенную активность пептидов. Результат оценивали по способности искусственных антигенов

индуцировать образование антител (АПА), взаимодействующих с вирусом КЧС (ABA).

Так как короткие пептиды в свободном виде обладают слабой иммуногенной активностью, они были конъюгированы с природными белковыми носителями - KLH и BSA. С целью повышения иммуногенной активности пептида 148-164 была получена МАР-конструкция, содержащая восемь копий указанного фрагмента белка Е2 и лизиновую матрицу. Иммуногенность пептидов 151-164 и 155-164 не изучали, поскольку они имели слабую антигенную активность (табл. 3) и низкий выход при синтезе. Титр накопления антител в пробах сыворотки крови животных определяли методами н-ИФА и РНГА, результаты которых представлены в таблице 4.

Таблица 4

Иммуногенная активность конъюгатов пептидов с белками-

нос ителями и см чесеи

№ Иммуноген н-ИФА (титр, Iq) РНГ А (титр. Iq)

АПА ABA штамм ЛКВНИИВВиМ эритроцитарныи набор НИВИ (г Казань)

1. 3-21-BSA 3,7 2,4 <1.3 <1,3

2. 78-91-BSA 3,3 2,4 <1.3 <1,3

3. 82-91-BSA 3,5 2,4 <1,3 1,3

4. 83-94-BSA 3,9 2,2 1,3 1,3

5. 86-100-BSA 3,5 2,4 <1,3 <1,3

6 89-102-KLH 4,2 3,4 <1,3 <1,3

/. 105-122-КШ 4,2 3,4 2,2 1,6

8 119-129-KLH 4,2 3,4 1.9 2,8

9. 129-139-KLH 4,5 3,6 <1,3 <1,3

10 139-151-KLH 4,7 3,4 1,3 1,3

11. 147-160-KLH 3,9 3,2 1,3 2,8

12. 148-164-BSA 3,7 2,2 <1.3 <1,3

13. 151-164-BSA 3,7 2,0 <1,3 <1.3

14. 148-164-МАР 3,0 н\а <1,3 <1,3

15. 155-168-KLH 3,3 3,2 2.5 2.2

16. 167-180-KLH 4,0 3,0 <1,3 1,3

17. 306-309-KLH 3,9 н/а <1,3 1,6

18. 302-311-KLH 3,9 н/а <1,3 1,6

19 I* 3,5 н/а 1,3 1.3

20. II* 3,9 3,0 <1,3 <1,3

21 III* 4,0 3,6 1.6 1Я

22. IV* 2,4 2,5 <1,3 <1,3

23 V* 3,4 3,0 1,6 1,3

24. VI 3,4 3,0 1,3 <1.3

25. VII* 2,4 н/а <1,3 <1,3

26. VIII* 3,4 3,0 13 1,3

27. IX** 4,2 н/а <1,3 <1,3

28. X** 3,9 н/а <1,3 <1,3

29 вирус КЧС шт. ЛК ВНИИВВиМ - 4.2 2.2 22

Примечание:

* - смеси созданы на базе пептидных KLH-конъюгатов;

** - иммунизация проведена с использованием смесей свободных пептидов;

н/а - не активны.

Согласно результатам, полученным в н-ИФА, титры АПА составляли 2,4 - 4,7 lg. В группу наиболее активных иммуногенов вошли пептиды 139-151 (4,7 lg), 129-139 (4,5 lg), 89-102, 105-122 и 119-129 - 4,2 lg, 167-180 (4,0 lg), смесь IX (4,2 lg), смесь III (4,0 lg), II и X - 3,9 lg.

Изучение активности взаимодействия АЛА с вирусом КЧС в н-ИФА показало, что титр ABA был ниже. Наибольшая активность была установлена для сыворотки к KLH-конъюгату пептида 129-139 (3,6 lg). Добавление к нему синтетического фрагмента 139-151 не стимулировало образование ABA с более (смесь 111, табл. 4).

В РИГА с использованием вируса КЧС штамма ЛК ВНИИВВиМ и эритроцитарного набора НИВИ (г. Казань) наибольшую активность показали кроличьи сыворотки, полученные к KLH-конъюгатам пептидов 105-122, 119-129,147-160,155-168 и смесям I, III, V, VIII.

Таким образом, в этой серии экспериментов были изучены антигенные и иммуногенные свойства пептидов - фрагментов белка Е2 вируса КЧС и созданных на их основе смесей и конъюгатов с белками-носителями.

Изучение возможности использования синтетических пептидов и их смесей для выявления антител к вирусу КЧС. С целью выявления антител к вирусу КЧС в пробах сыворотки крови свиней была изучена возможность использования синтетических фрагментов белка Е2 вируса КЧС и созданных на их основе смесей в н-ИФА и РНГА.

Для проведения н-ИФА в качестве антигена были использованы синтетические пептиды 119-129-Gly (8), 129-139-Gly (9), 139-151-Gly (10), смеси I - VI, VIII, генно-инженерный белок Е2 (НПО "Нарвак") и культуральный вирус КЧС штамма ЛК ВНИИВВиМ (концентрация вирусного белка не менее 100 мкг/мл). Исследуемые образцы сыворотки (30 положительных и 15 отрицательных) предварительно были протестированы с применением коммерческого набора Chekit-CSF-Sero (Dr.Bommeli AG, Швейцария) и в РНГА эритроцитарного диагностикума НИВИ (г. Казань).

Представленные в таблице 5 результаты показывают, что все синтетические антигены выявляли вирусспецифичные антитела в положительных образцах сыворотки крови животных. При этом полученные величины оптической плотности специфичных комплексов в 2 и более раза превышали значения оптической плотности комплексов неспецифичного связывания.

В таблице 5 также представлены средние значения 8/Р-показателя и соответствующие им стандартные ошибки, которые могут быть приняты в качестве критериев для разграничения специфичной и неспецифичной реакции в н-ИФА

Таблица 5

Средние значения оптической плотности и Б/Р-показателя исследуемых образцов сыворотки крови и соответствующие им

стандартные (средние квадратичные) ошибки

Средние значения оптической плотности Антигены Средние значения S/P - показателя

положительная сыворотка (п=30) отрицательная сыворотка <п=15) положительная сыворотка (п=30) отрицательная сыворотка (п=15)

0,80 ± 0,04 0,32 ± 0,02 Вирус КЧС 0,67 ± 0,04 0,14 ± 0,02

OJO ± 0,04 0,24 ± 0,03 белок Е2 0,61 ± 0,03 0,31 ± 0,04

0,41 ± 0,02 0,19 ±0,03 смесь I 0,59 ± 0,03 0,35 ± 0,05

0,42 ±0,02 0,17 ±0,02 смесь II 0,60 ±0,02 0,33 ± 0,04

0,41 ± 0,02 0,18 ±0,02 смесь III 0.55 ± 0,02 0,34 ± 0.04

0,36 ± 0,02 0,16 ±0,01 смесь IV 0,56 ± 0,04 0,31 ± 0,04

0,39 ± 0,03 0,17 ±0,02 смесь V 0,50 ± 0,04 0,33 ± 0,04

0,44 ± 0,02 0,17 ±0,02 смесь VI 0,59 ± 0,03 0,36 ± 0,05

0,37 ± 0,02 0,17 ±0,02 смесь VIII 0,53 ± 0,03 0,33 ± 0,04

0,42 ± 0,02 0,17 ±0,02 пептид (8\ 0,61 ± 0,04 0,29 ± 0,04

0,39 ± 0,02 0,18 ±0,02 пептид Щ 0,50 ±0,04 0,29 ± 0,03

0,46 ± 0,03 0,17 ±0,02 пептид (10) 0,64 ± 0,08 0,30 ± 0,04

Достаточно высокую антигенную специфичность показали все синтетические антигены. Однако наименьший разброс значений 8/Р-показателя для положительных (п=30) и отрицательных (п=15) проб был получен для пептидов 119-129 (8), 129-139 (9) и смесей III, VIII (рис. 3).

В РНГА использовали эритроциты, сенсибилизированные указанными выше синтетическими антигенами, за исключением генно-инженерного белка Е2, с концентрацией 1 мг/мл. В качестве исследуемых образцов сыворотки крови животных использовали положительные и отрицательные

пробы, которые применяли в н-ИФА. Реакцию проводили по стандартной методике, начиная с разведения проб сыворотки крови свиней 1:20 и далее с шагом 2. Согласно результатам, полученным в РЫТА, наибольшую антигенную активность с вирусспецифичными антителами показали эритроциты, сенсибилизированные смесью III и пептидом 119-129.

I 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1Л 1^2 1.3

Рис. 3. Области значений S/P-показателя исследуемых антигенов

Опираясь на полученные данные, а также на результаты исследований антигенных свойств пептидов и смесей, созданных на их основе, целесообразно использовать в качестве антигена смесь III. Поэтому следующий этап работы состоял в изучении возможности применения указанной смеси пептидов для выявления антител к вирусу КЧС в пробах сыворотки крови свиней методом н-ИФА и РНГА. Для этого проводили тестирование 138 образцов, поступивших во ВНИИЗЖ из 7 хозяйств РФ. Полученные результаты представлены на рисунке 4.

Параллельно осуществляли постановку н-ИФА на основе рекомбинантного белка Е2. Данные исследований проб сыворотки крови

животных с применением коммерческого набора СИекИ-С8Р-8его (Бг.ВоттеИ АО, Швейцария) и в РНГА эритроцитарного диагностикума НИВИ (г. Казань) были любезно предоставлены лабораторией «Болезней свиней».

лолижитсльиый реэ/пьтат

ПОПиЖИ ГСПЫ1ЫЙ

результат

Рис. 4. Результаты исследования проб сыворотки крови свиней с использованием различных тест-систем

Примечание:

ИФА-смесь III - результаты н-ИФА с использованием смеси III; РНГА-смесь III -результаты РНГА с использованием смеси III; ИФА-Chekit - результаты тест-системы ИФА коммерческого набора Chekit-CSF-Sero (Dr.Bommeli AG, Швейцария);

ИФА-белок Е2 - результаты н-ИФА с использованием рекомбинантного белка Е2 (НПО "Нарвак", г. Москва)

РНГА-вирус - результаты РНГА эритроцитарного диагностикума НИВИ (г. Казань)

При сопоставлении результатов н-ИФА с использованием смеси III с другими методами оказалось, что они совпадают на 68% с данными, полученными при применении коммерческого набора Chekit-CSF-Sero (Dr.Bommeli AG, Швейцария); такой же процент совпадения - 68% был выявлен при сравнении результатов РНГА с применением вирусного антигена, и 78% совпадения получено в н-ИФА с иммобилизованным рекомбинантным белком Е2.

Результаты РНГА с использованием эритроцитов, сенсибилизированных смесью III, совпадали с результатами тест-ситемы ИФА набора СИекИ-СЗР-8его (Ог.БошшеЦ ДО, Швейцария) на 66%, с данными РНГА эритроцитарного диагностикума НИВИ (г. Казань) - на 75%, и 69% совпадений результатов было выявлено в н-ИФА, где в качестве антигена применяли генно-инженерный белок Е2.

Таким образом, показано, что смесь III содержит В-клеточные эпитопы белка Е2 вируса КЧС. Использование этой смеси в качестве антигена позволяет выявлять вирусспецифичные антитела в пробах сыворотки крови животных методом н-ИФА и РНГА.

Изучение иммуногенных свойств синтетических пептидов -фрагментов прионного белка КРС и смесей, созданных на их основе.

Иммуногенность пептидов и смесей, созданных на их основе, оценивали по их способности индуцировать образование антител у лабораторных животных. Титр накопления АЛА определяли методом н-ИФА.

Несмотря на то, что животных иммунизировали свободными пептидами, были получены достаточно высокие титры АПА, значения которых составляли от 1,2 (после первой иммунизации) до 5,4 ^ (после четвертой иммунизации) (табл. 6).

Таблица 6

Титры АПА в пробах сыворотки крови кроликов, иммунизированных __пептидами и их смесями, в н-ИФА_

Доза, мкг Иммуногенность (титр АПА, !д)

Пептид на одно После 1" После 2" После 3" После 4"

животное иммунизации (21 день) иммунизации (21 день) иммунизации (21 день) иммунизации (21 день)

106-126 200 2,8 3.9 * 4.6 4,8

106-126 400 3.5 4.6 5.1 5.4

108-126 200 3,0 3,0 4,2 4,4

108-126 400 3,5 4.4 4,Ь 4.8

111-126 200 2,2 3.3 3.8 3,9

111-126 400 2,6 3.9 4,2 4.4

206-229-С!у 400 1.7 2.5 2.8 3.1

216-229-С!у 400 1,2 3.1 4.0 4.0

Смесь XI 400 3,2 4,2 4.2 4.6

Смесь XII 400 2,7 4.1 4,3 4,5

СмесьХШ 400 2,2 3.6 3,9 40

Смесь XIV 400 3,1 4.1 4,2 4.5

Самыми активными иммуногенами оказались пептиды 106-126 (5,4

108-126 (4,8 1я), смесь XI (4,6 смесь XII и XIV - 4,5

Изучение возможности использования антител против синтетических фрагментов прионного белка КРС для выявления возбудителя ГЭ КРС иммуногистохимическим методом. Результаты исследования активности образцов антипептидной сьшоротки показали, что антитела к пептидам 106-126, 108-126 и 111-126 выявляли патогенную изоформу прионного белка (РгР8с) в разведении 1:1000, 1:750 и 1:500 соответственно (рис. 5а,б,в).

Рис. 5. Иммуногистохимическое окрашивание срезов ткани

продолговатого мозга КРС с использованием образцов антипептидной сьшоротки

Примечание: стрелками указана локализация скоплений патогенной изоформы прионного белка КРС в препарате мозга животного, больного ГЭ КРС; справа -контрольный препарат от здорового животного.

АЛА к синтетическим фрагментам из С-концевой области прионного белка КРС оказались неактивными в ИГХМ.

Рис. 6. Иммуногистохимическое окрашивание срезов ткани продолговатого мозга КРС с использованием смеси образцов антипептидной сыворотки

В дальнейших исследованиях было установлено, что применение смеси образцов антипептидной сыворотки к синтетическим фрагментам из центральной и С-концевой области прионного белка КРС позволяет увеличить разведения АПА в 2 и более раза без потери их специфичной активности.

Так, в составе смеси антитела к пептиду 106-126 были активными в разведении 1:2000, к пептиду 206-229-01у - в разведении 1:400 (рис. 6а). В составе другой смеси образцов пептидспецифичной сыворотки разведение антител к пептиду 111-126 составляло 1:2000 и 1:800 - для АПА к фрагменту 216-229-О!у(рис.6б).

Активность проб сыворотки крови, полученной в результате иммунизации кроликов смесями пептидов - фрагментов прионного белка КРС, была ниже. Самой активной (в разведении 1:750) оказалась сыворотка, полученная на смесь XI. Сыворотка на смесь XIV выявляла РгР8е в разведении 1:500, на смесь XIII - в разведении 1:200. АПА на смесь XII были неактивными в ИГХМ.

Таким образом, в результате проведенной работы показана возможность использования синтетических антигенов для получения противоприонных антител. Наилучший результат в ИГХМ показали смеси проб сыворотки крови кроликов, содержащие АПА к фрагментам из центральной (пептиды 106-126, 111-126) и С-концевой (пептиды 206-229-01у и 216-229-О1у) области прионного белка КРС.

4. ВЫВОДЫ

1. С использованием химического синтеза получено 25 пептидов -фрагментов белка Е2 вируса КЧС и прионного белка КРС.

2. Изучены физико-химические, антигенные и иммуногенные свойства синтезированных пептидов. Полученные результаты позволили отобрать наиболее активные их них.

3. Установлено, что смеси, созданные на основе свободных пептидов -фрагментов белка Е2 вируса КЧС, обладают большей антигенной активностью,

чем индивидуальные пептиды. Смесь синтетических фрагментов 129-139 и 139-151 белка Е2 взаимодействовала с антителами к вирусу КЧС и была пригодна для их выявления в пробах сыворотки крови свиней методом н-ИФА и РИГА.

4. Методом н-ИФА определена иммуногенная активность синтетических фрагментов прионного белка КРС. Сыворотка, полученная к фрагменту 106-126 прионного белка КРС, обладала наибольшей противопептидной активностью. При этом значение титра антипептидных антител составляло 5,4 Фрагменты С-кЪнцевой области прионного белка КРС стимулировали иммунный ответ в меньшей степени.

5. Показана возможность использования пептидов - фрагментов прионного белка КРС для получения антител, специфичных к патогенной изоформе прионного белка КРС. Наибольшая активность в иммуногистохимическом методе была определена для смеси антител к пептидам из центральной (106-126, 111-126) и С-концевой (206-229-01у, 216-229-О1у) области прионного белка КРС.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются:

1. Схемы синтеза фрагментов белка Е2 вируса КЧС и прионного белка КРС для получения пептидов, содержащих антигенные детерминанты других инфекционных агентов, опасных для животных и человека.

2. "Методические указания по использованию синтетических антигенов для обнаружения антител к вирусу классической чумы свиней методом непрямого иммуноферментного анализа", утвержденные директором ФГУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных» 19.03.2003 г.

3. "Методические указания по использованию синтетических антигенов для обнаружения антител к вирусу классической чумы свиней в реакции непрямой гемагтлютинации (РИГА)", утвержденные директором ФГУ

«Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных» 07.02.2003 г.

4. "Методические указания по применению смеси антител к фрагментам прионного белка для лабораторной диагностики губкообразной энцефалопатии КРС иммуногистохимическим методом", утвержденные директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» 24.03.2005 г.

6. Список опубликованных научных работ по теме диссертации

1. Гуленкин В.М., Петров В.Н., Решетников ГГ., Ломакин А.И. Компьютерный анализ антигенной структуры белка Е1 вирусов классической чумы свиней и бычьей диареи // Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных: Тез. докл. науч. конф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура. -Владимир, 1997. - С. 106-107.

2. Решетников ГГ., Петрова О.Н., Ломакин А.И. Изучение структуры иммуногенного белка др55 штамма ЛК ВНИИВВиМ вируса классической чумы свиней с использованием синтетических пептидов // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. - Щелково, 2000. - С. 220 - 222.

3. Решетников ГГ., Петрова О.Н., Рыбаков С.С., Егорова А.И., Байбиков Т.З. Использование синтетических пептидов для выявления специфических антител к вирусу КЧС // Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота: Матер, конф. молодых ученых. - Владимир, 2002. - С.

4. Решетников ГГ., Петрова О.Н., Рыбаков С.С., Луговской А.А., Ломакин А.И. Синтез, антигенные и иммуногенные свойства пептидов - фрагментов белка Е2 вируса классической чумы свиней // Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота: Матер, конф. молодых ученых. -Владимир, 2002. - С. 53-56.

5. Решетников ГГ., Петрова О.Н., Рыбаков С.С., Вольпина О.М., Егоров А.А., Павлов А.В. Использование синтетических антигенов в диагностике инфекционных болезней крупного рогатого скота и свиней // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных: Матер. Междунар. науч. конф., посвящ. 45-летию ВНИИЗЖ. - Владимир, 2003. - С. 214-218.

6. Решетников ГГ., Петрова О.Н., Рыбаков С.С., Рябоконь А.А. Синтез и иммуногенные свойства пептидных фрагментов прионного белка крупного рогатого скота // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: Матер. Междунар. науч. конф. молодых ученых. -Владимир, 2004. - С. 73-75.

7. Федорова А.А., Корпусова Т.И., Петрова О.Н., Решетников ГГ., Ковалишин В.Ф., Пронин И.А., Хлебопашникова СВ., Назаров А.С., Захаров В.М. Иммунобиологические свойства культурального штамма вируса классической чумы свиней // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: Матер. Междунар. науч. конф. молодых ученых. -Владимир, 2004. - С. 100-101.

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», 90 экз., апрель 2005 г.

У f ?! \ {

О 7 |Щ 2005 К. 'У

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Решетников, Геннадий Геннадьевич

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Характеристика вируса КЧС

2.1.1. Классификация, морфология и физико-химические свойства вируса КЧС

2.1.2. Организация генома вируса КЧС и антигенные свойства кодируемых структурных белков

2.1.3. Биологические свойства вируса КЧС

2.2. Характеристика возбудителя ГЭ КРС

2.2.1. Структура прионного белка

2.2.2. Свойства прионного белка

2.2.3. Диагностика прионных болезней

2.3. Получение пептидов и использование созданных на их основе синтетических антигенов в диагностике инфекционных заболеваний животных и человека

2.3.1. Методы теоретического поиска иммунодоминантных участков белков

2.3.2. Краткое описание методов синтеза пептидов

2.3.3. Получение искусственных антигенов на основе синтетических пептидов для диагностики инфекционных заболеваний животных и человека

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание синтетических антигенов для лабораторной диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота и классической чумы свиней"

Актуальность темы. Классическая (европейская) чума свиней (КЧС) является высоко контагиозным вирусным заболеванием свиней, наносящим большой экономический ущерб. Несмотря на предпринимаемые ветеринарно-санитарные меры, эта инфекция по-прежнему широко распространена во многих странах мира [1, 29, 46].

Следует отметить, что существует два направления в борьбе с КЧС. Первое из них реализуется в странах Западной Европы и США, где отказались от вакцинации животных и при подозрении на КЧС осуществляется убой всего стада ("stamping out") [39]. Второе направление применяется в ряде стран Восточной Европы, странах СНГ, в том числе и в России, где основной мерой борьбы является вакцинация и убой больных животных. Однако ни один из этих подходов не гарантирует надежной защиты животных. На это указывают периодически возникающие эпизоотии КЧС, регистрируемые на территории различных государств [О.I.E. Bulletin, 1990-2004 г.г.].

В виду того, что течение болезни, вызываемое вирусом КЧС, характеризуется многообразием форм, окончательный диагноз устанавливается на основе лабораторных методов исследований [38, 40, 50, 90, 185]. Лабораторная диагностика КЧС основана на выделении и идентификации вируса с использованием культур клеток, прямом обнаружении вирусного антигена и выявлении вирусспецифичных антител. При этом традиционными являются метод иммунофлюоресценции, иммунопероксидазный метод, реакция нейтрализации вируса, РНГА. За последние два десятилетия, в связи с бурным развитием молекулярной биологии, генетической и клеточной инженерии, появились новые методы, которые нашли свое применение в диагностике этого заболевания. Прежде всего, это ПЦР и ИФА с использованием рекомбинантных белков и антител, полученных к ним [34, 39, 50, 111, 112, 175], а также мАт, обладающих высокой аффинностью к вирусу КЧС [117,118, 158, 228].

Так как КЧС, наряду с ящуром, сибирской язвой, чумой КРС и другими болезнями, относится к списку особо опасных, получение синтетических пептидов позволяет исключить использование инфекционного вирусного материала в некоторых вышеуказанных методах. Кроме того, существует целый ряд трудностей, связанных с культивированием вируса КЧС [4, 39, 40, 50, 81, 100, 201] и химический синтез искусственных антигенов является в этом случае перспективным направлением.

Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота (ГЭ КРС) относится к прионным инфекциям. Возникновение этой болезни и ликвидация ее последствий приводит к большим экономическим потерям. Доказательством этого может служить вспышка ГЭ КРС в Великобритании. С ноября 1986 года, то есть с момента регистрации первого случая заболевания и до 1996 года, общее число пораженных животных составило более 180 тыс. голов КРС [33], а общие затраты составили 4 млрд. фунтов стерлингов [49].

Для диагностики ГЭ КРС разработано несколько лабораторных методов: гистологический, в основе которого лежит оценка изменений в препаратах срезов мозга больных животных, а также ИГХМ, иммуноблотт и ИФА, с использованием специфичных антител [17, 74, 153]. Метод постановки биопробы на естественно восприимчивых животных является чувствительным, но и самым дорогостоящим. Кроме того, он требует продолжительного времени из-за длительности инкубационного периода заболевания. Метод электронной микроскопии позволяет выявлять амилоидные стержни и скрепиассоциированные фибриллы (САФ) в предварительно обработанных пробах мозга или селезенки инфицированных животных [12, 17]. Однако некоторыми исследователями показана низкая чувствительность данного метода [74].

Высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей прионного белка у различных видов животных, а также полное совпадение аминокислотного состава нормальной и аномальной формы белка, затрудняют его использование в качестве иммуногена. Применение пептидных фрагментов прионного белка, полученных путем химического синтеза, предоставляет широкие возможности в получении специфичных противоприонных антител [5, 73]. Кроме того, известно, что возбудитель ГЭ КРС является опасным для человека. Поэтому использование синтетических антигенов в изучении прионных заболеваний исключает вероятность заражения.

Таким образом, химический синтез позволяет получать антигены, которые также как и нативные (природные), обладают антигенными и иммуногенными свойствами. Кроме того, они стабильны при хранении и являются безопасными; процесс их получения легко поддается стандартизации [63, 84, 85].

В отечественной и зарубежной практике имеется большое количество примеров эффективного использования синтетических пептидов в изучении антигенных и иммуногенных свойств белков различных вирусов животных и человека. В некоторых случаях это позволило создать на их основе диагностические тест-ситемы и коммерческие наборы.

Однако некоторые проблемы диагностики ГЭ КРС и КЧС до конца не решены. В связи с этим требуется проведение работы, направленной на получение синтетических антигенов и изучение возможности их применения в различных иммунологических методах исследований.

Цели и задачи исследований. Основная цель данной работы -получение синтетических антигенов и изучение возможности их использования в лабораторной диагностике КЧС и ГЭ КРС.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- изучить антигенные и иммуногенные свойства свободных фрагментов белка Е2 вируса КЧС, конъюгатов пептидов с белками-носителями, смесей и оценить возможность их применения в непрямом варианте ИФА и РИГА для выявления антивирусных антител в пробах сыворотки крови свиней;

- разработать методику использования пептидов - фрагментов белка Е2 вируса КЧС в непрямом варианте ИФА и РИГА для выявления вирусспецифичных антител в пробах сыворотки крови свиней;

- изучить иммуногенные свойства свободных пептидов - фрагментов прионного белка КРС и смесей, созданных на их основе; разработать методические указания по применению смеси антипептидных антител, полученных к синтетическим фрагментам из центральной и С-концевой области прионного белка КРС, для выявления возбудителя ГЭ КРС иммуногистохимическим методом.

Научная новизна. Впервые в нашей стране с использованием Boc/Bzl и Fmoc/But методов твердофазного синтеза получены пептиды, представляющие собой фрагменты белка Е2 вируса КЧС штамма ЛК ВНИИВВиМ, и пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям 106-126 и 206-229 прионного белка КРС. Изучены физико-химические свойства синтетических антигенов, на их основе получены смеси и конъюгаты с белками-носителями.

Проведены исследования антигенных и иммуногенных свойств пептидов - фрагментов белка Е2 вируса КЧС, созданных на их основе смесей и конъюгатов.

Показана возможность использования смеси пептидов для обнаружения антител к вирусу КЧС в пробах сыворотки крови свиней методом непрямого варианта ИФА и РИГА.

Изучены иммуногенные свойства пептидов - фрагментов прионного белка КРС и смесей, созданных на их основе.

Показана возможность использования смеси антипептидных антител, полученных при иммунизации кроликов синтетическими фрагментами из центральной и С-концевой области прионного белка КРС, для выявления возбудителя ГЭ КРС иммуногистохимическим методом.

Практическая значимость. Разработаны и реализованы схемы синтеза индивидуальных пептидов - фрагментов белка Е2 вируса КЧС и прионного белка КРС с использованием Boc/Bzl и Fmoc/But методов.

Разработаны "Методические указания по использованию синтетических антигенов для обнаружения антител к вирусу классической чумы свиней в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА)", которые утверждены директором института 07.02.2003 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Синтетические фрагменты белка Е2 вируса КЧС штамма ЛК ВНИИВВиМ и прионного белка КРС.

• Результаты изучения антигенных и иммуногенных свойств пептидов фрагментов белка Е2 вируса КЧС, созданных на их основе смесей и конъюгатов с белками-носителями.

• Иммуногенная активность пептидов - фрагментов прионного белка КРС и смесей, созданных на их основе.

Апробация результатов работы. Результаты исследований по теме диссертации представлены и обсуждены на заседаниях ученого совета ФГУ ВНИИЗЖ и на следующих научных конференциях в период 1997-2004 гг.: научной конференции, посвященной 100-летию открытия вируса ящура "Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных" (Владимир, 1997 г.), Всероссийской научно-практической конференции "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов" (Щелково, 2000 г.), конференции молодых ученых "Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота" (Владимир, 2002 г.), Международной научной конференции "Актуальные проблемы инфекционной патологии животных" (Владимир, 2003 г.), Международной научной конференции молодых ученых "Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных" (Владимир, 2004 г.).

Объем и структура работы. Исследования по диссертационной работе выполнены в 1997-2005 г.г. в ФГУ "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир). Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы, содержащего 237 источников, из них 142 - зарубежных авторов, и приложения. Работа иллюстрирована 20 рисунками и содержит 15 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Решетников, Геннадий Геннадьевич

5. ВЫВОДЫ

3. Установлено, что смеси, созданные на основе свободных пептидов -фрагментов белка Е2 вируса КЧС, обладают большей антигенной активностью, чем индивидуальные пептиды. Смесь синтетических фрагментов 129-139 и 139-151 белка Е2 взаимодействовала с антителами к вирусу КЧС и была пригодна для их выявления в пробах сыворотки крови свиней методом н-ИФА и РНГА.

4. Методом н-ИФА определена иммуногенная активность синтетических фрагментов прионного белка КРС. Сыворотка, полученная к фрагменту 106-126 прионного белка КРС, обладала наибольшей противопептидной активностью. При этом значение титра антипептидных антител составляло 5,4 lg. Фрагменты С-концевой области прионного белка КРС стимулировали иммунный ответ в меньшей степени.

5. Показана возможность использования пептидов - фрагментов прионного белка КРС для получения антител, специфичных к патогенной изоформе прионного белка КРС. Наибольшая активность в иммуногистохимическом методе была определена для смеси антител к пептидам из центральной (106-126, 111-126) и С-концевой (206-229-Gly, 216-229-Gly) области прионного белка КРС.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются:

1. Схемы синтеза фрагментов белка Е2 вируса КЧС и прионного белка КРС для получения пептидов, содержащих антигенные детерминанты других инфекционных агентов опасных для животных и человека.

3. "Методические указания по использованию синтетических антигенов для обнаружения антител к вирусу классической чумы свиней в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА)", утвержденные директором ФГУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных» 07.02.2003 г.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Решетников, Геннадий Геннадьевич, Владимир

1. Бобровник С.А., Стародуб Н.Ф. Определение констант скорости реакции антиген-антитело. Кинетические характеристики процесса взаимодействия растворимого и корпускулярного антигена со специфическими антителами // Биохимия.- 1988.- Т. 53, №6.- С. 918-924.

2. Вишняков И.Ф., Куринов В.В., Яшин А.Т. Некоторые особенности КЧС, затрудняющие ее диагностику // Ветеринария.- 1985.- №9.- С. 29-31.

3. Вольпина О.М., Жмак М.Н., Обозная М.Б. и др. Выявление возбудителя губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота с помощью антител против синтетических фрагментов прионного белка // Биоорган, химия.- 2001.- Т.27, №5.- С. 352-358.

4. Гершкович А.А., Кибирев В.К. Методы образования пептидной связи // Синтез пептидов. Реагенты и методы / Под ред. Серебряного С.Б. Киев, 1987.- С. 10-75.

5. Гершкович А.А., Кибирев В.К. Защита функциональных групп аминокислот. Защита аминогруппы // Синтез пептидов. Реагенты и методы / Под ред. Серебряного С.Б. Киев, 1987.- С. 76-151.

6. Гершкович А.А., Кибирев В.К. Защита функциональных групп аминокислот. Защита карбоксильной группы // Синтез пептидов. Реагенты и методы / Под ред. Серебряного С.Б. Киев, 1987.- С. 152-186.

7. Гершкович А.А., Кибирев В.К. Защита функциональных групп аминокислот. Защита боковых функциональных групп // Синтез пептидов. Реагенты и методы / Под ред. Серебряного С.Б. Киев, 1987.- С. 187-229.

8. Гершкович А.А. Потенциальные возможности временных групп в химии пептидов // Биоорган, химия.-1991.- Т.17, №7.- С. 869-899.

9. Григорьев В.Б. Детекция белка приона (РгР) при трансмиссивных спонгиозных энцефалопатиях // XVIII Российская конф. по электрон, микроскопии: Тез. докл.- Черноголовка, 2000.- С. 224.

10. Григорьев В.Б. Прионные болезни животных и человека // Вопр. вирусол,- 2004.- №5.- С. 4-12.

11. Гринин А.С., Рыбаков С.С. Радио-иммунологический анализ.- М.: Энергоиздат, 1984. -121с.

12. Гринштейн Д., Виниц М. Химия аминокислот и пептидов: Пер. с англ.-М.: Мир, 1965. -824с.

13. Губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота: возникновение, диагностика и профилактика // Вестн. ветеринарии.- 1998.- Т.2, №8.- С. 93-106.

14. Гусева Е.В., Сатина Т.А., Рыбаков С.С. Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота.- Владимир: ВНИИЗЖ, 1997.- 91 с.

15. Дагданова А.В. Специфические антитела для детекции прионового протеина // Ветеринария.- 2001.- №5.-С. 23-27.

16. Девени Т., Гергей Я. Гидролиз белков и пептидов // Аминокислоты, пептиды, белки: Пер. с англ. / Под ред. Незлина Р.С. М.: Мир, 1976. - С. 165172.

17. Евстегнеева Р.П., Желтухина Г.А. Синтез и иммунологические свойства пептидного фрагмента pre-S-области белка оболочки вируса гепатита В // Биоорган, химия.- 1990.- Т.16, №1.- С. 34-40.

18. Евстегнеева Р.П., Палькеева М.Е. Методы поиска антигенных детерминант для белков с известной первичной структурой // Биоорган, химия.- 2000,- Т.26, №4.- С. 243-262.

19. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа.- М.: Высш. шк., 1991. -288с.

20. Иванов Б.Б., Мещерякова Е.А., Андронова Т.М., Иванов ВТ. Использование синтетических носителей и адъювантов для повышения иммуногенности синтетического пептида из CS-белка Plasmodium falciparum // Биоорган, химия.- 1991.- Т.26, №4.- С. 243-262.

21. Иванов B.C., Чикин А.Д., Суворова З.К. и др. Исследование антигенной структуры вирусов иммунодефицита человека с помощью синтетических пептидов // Биоорган, химия.- 1992.- Т.18, №6.- С. 784-791.

22. Иммунологические методы: Пер. с нем./Под. ред. Г. Фримеля.- М.: Медицина, 1987.-472с.

23. Кабанов В.А., Петров Р.В., Хаитов P.M. Новый принцип создания искусственных иммуногенов // Журн. Всесоюз. Хим. О-ва. им. Д.И. Менделеева,- 1982.- Т. 27, №4.- С. 417-428.

24. Карасева Н.Г., Кадошников Ю.П. Иммунологические тесты для детекции анти-Н1\/-антител в сыворотках крови пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека 1-го типа // Иммунология.- 1996.- №3.- С. 14-17.

25. Кирхнер Ю. Обнаружение бесцветных соединений // Тонкослойная хроматография: В 2 т: Пер с англ. М.: Мир, 1981. - Т.1.- С. 235.

26. Коляков Я.Е. Ветеринарная иммунология.- М.: Агропромиздат, 1986.272 с.

27. Конопаткин А.А. Чума // Эпизоотол. и инфекц. болезни с.-х. ж-ных. -М., 1984. С. 343-351.

28. Конструирование синтетической ящурной вакцины: отчет о НИР (Заключительный по теме Указание 11.3.)/ВНИЯИ. - Инв. №173 - Владимир, 1990.- 198 с.

29. Костенко Ю.Г. К проблеме губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота // Ветеринария.- 2001.- №10.-С. 7-9.

30. Кривонос А.В., Забережный А.Д., Гребенникова Т.В. и др. Синтез и иммунохимические свойства рекомбинантного главного поверхностного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней // Вопр. вирусологии.-2000.- №2.- С.- 29-36.

31. Кулик Л.Н., Иванов B.C., Габриэлян А.Е. и др. Поиск Т-эпитопов вируса гепатита А с помощью синтетических пептидов // Биоорган, химия.-1993.-Т.19.- №12,-С. 1169-1176.

32. Кулик Л.Н., Иванов B.C., Чикин Л.Д. и др. Моделирование антигенных детерминант вируса гепатита А с помощью синтетических пептидов // Биоорган, химия.- 1994.- Т.20, №7,- С. 709-719.

33. Куприянова М.А., Жмак М.Н., Короев Д.О. и др. Синтетические пептидные конструкции на основе иммунореактивных фрагментов белка VP1 вируса ящура штамма А22 // Биоорган, химия.- 2000.- Т.26, №12,- С. 926-932.

34. Куриннов В.В. Средства и методы дифференциальной лабораторной диагностики классической чумы свиней // Вестн. РАСХН 1999.- №3.- С. 55-59.

35. Куриннов В.В. Эпизоотологические, патогенетические и диагностические особенности классической чумы свиней // Ветеринария.-1993.- №11-12.- С. 6-11.

36. Луговской А.А., Рыбаков С.С., Иванющенков В.Н. и др. Защита естественно-восприимчивых животных от ящура пептидом, синтезированным на лизиновой матрице // Биоорган, химия.- 1992.- Т.18, №7.- С. 942-950.

37. Луговской А.А., Рыбаков С.С., Шажко Ж.А. и др. Изучение возможности использования синтетических пептидов для выявления антител к VIA-антигену вируса ящура // К новой стратегии борьбы с ящуром: Междунар. конф.- Владимир, 1991.- С. 165-166.

38. Луговской А.А. Синтез и изучение свойств пептидов-фрагментов VP1 вируса ящура А22 и О-j: Дис. . канд. биол. наук.- Владимир. 1993,161 с.

39. Лямперт И.М. Некоторые подходы и перспективы создания эффективных и безвредных вакцин в будущем // Иммунология,- 1983.- №3.- С. 11-16.

40. Лярски 3. Серологические исследования // Диагностика вирусных болезней животных / Под ред. В.Н. Сюрина. М.: Колос, 1980. - С. 187-212.

41. Макаров В.В., Джупина С.И., Коломыцев А.А. Классическая чума свиней особенности эпизоотического процесса и проблемы на современном этапе // Аграрная Россия.- 2001.- №3.- С. 42-48.

42. Малярец П.В., Гусева Е.В., Ануфриева Т.А. Характеристика вируса КЧС // Классическая чума свиней. Владимир, 1995. - С. 6-13.

43. Мещерякова Д.В., Андреев С.М., Тарасова С.О. Анализ эпитопной специфичности антител из сывороток HIV-инфицированных лиц сиспользованием функционально значимых фрагментов белков HIV // Иммунология.- 1995.- №1.-С. 10-13.

44. Надточий Г.А. Губкообразная энцефалопатия КРС: методы борьбы и профилактики // Вет. консультант- 2002.- №11-12.-С. 2-3.

45. Непоклонов Е.А., Алипер Т.И., Ленева И.А. Методы лабораторной диагностики классической чумы свиней // Вопр. вирусол.- 1998.- №4.- С. 152158.

46. Новые методы иммуноанализа: Пер. с англ./Под ред. У.П. Коллинза.-М., 1991.- С. 120-122.

47. Павлов А.В., Рыбаков С.С., Иванющенков В.Н. и др. Защита от ящура естественно-восприимчивых животных линейным полимером синтетического пептида // Биоорган, химия,- 1991.- Т.17, №7.- С. 953-963.

48. Пептиды. Основные методы образования пептидных связей: Пер. с англ./Под ред. Э.Гросса, И.Майенхофера.- М.: Мир, 1983. -422 с.

49. Петров В.Н. Синтез и изучение свойств пептидов-фрагментов VP1 вируса ящура А22 и Азия 1: Дис. . канд. биол. наук.- Владимир, 1993.- 155 с.

50. Петрова О.Н., Рыбаков С.С., Луговской А.А. и др. Изучение антигенных свойств синтетических пептидов методом радиоиммуноанализа (РИА) // Актуальн. вопр. вет. вирусол.: Тез. докл. науч.-теорет. конф. молодых учёных.- Владимир, 1990.- С. 87-88.

51. Петров В.Н., Рыбаков С.С., Павлов А.В. и др. Синтез и изучение антигенных и иммуногенных свойств пептидов-фрагментов VP1 вируса ящура типов О, А и Азия 1 // Ящур (К новой стратегии борьбы с ящуром).- Владимир,1992.-Ч.2.-С. 77-93.

52. Петров В.Н., Рыбаков С.С., Петрова О.Н. и др. Использование синтетических пептидов для выявления антител к вирусу ящура в сыворотках крови переболевших животных // Молекулярн. генетика, микробиол. и вирусол.- 1996.- №3.- С. 27-31.

53. Петров В.Н., Рыбаков С.С. Создание пептидных препаратов для вакцинопрофилактики и диагностики ящура и других вирусных болезней (Обзор литературы).- Владимир: ВНИИЗЖ, 1995.- 61 с.

54. Позднев В.Ф. Применение ди-третбутилпирокарбоната для получения. N-трет-бутилоксикарбонильных призводных аминокислот // Химия природ, соединений.- 1974.- Т.6.- С. 764-767.

55. Позднев В.Ф. Синтез трет-бутилоксикарбонильных призводных некоторых трифункциональных аминокислот с применением ди-третбутилпирокарбоната// Биоорган, химия.- 1977.- Т.З, №12.- С. 1605-1610.

56. Применение синтетических антигенов для диагностики инфекционных болезней. Докл. науч. группы ВОЗ. Серия техн. докл. 784,-Женева, 1991.- 76 с.

57. Расули A.M., Клепиков Н.Н., Андреев С.М., Сидорова М.В. Иммунореактивность синтетических пептидов соответствующих В-клеточным эпитопам структурных белков Т-лимфотропного вируса человека 1 типа // Молекулярн. биол.- 1993.- Т.27, №.4,- С. 880-887.

58. Расули A.M., Клепиков Н.Н., Гурцевич В.Э. и др. Иммуноферментная тест-система для сочетанного выявления антител к ретровирусам человека (HTLV-I и HIV-1) на основе синтетических пептидов // Гематол. и трансфузиол,1993.- №5.- С. 36-39.

59. Расули A.M., Сенюта Н.Б., Клепиков Н.Н. и др. Формирование и характеристика панели сывороток, содержащих антитела к HTLV-1. Использование для скрининга синтетических пептидов // Иммунология.- 1994.-№2.- С. 42-46.

60. Ройт А. Основы иммунологии.- М.: Мир, 1991.- 120 с.

61. Рыбаков С.С., Егоров А.А., Вольпина О.М., Жмак М.Н. Сравнительный компьютерный анализ антигенной структуры прионного белка различных видов животных // Пробл. инфекц. патологии с.-х. животных: Тез. докл конф.- Владимир, 1997.- С. 94-95.

62. Рыбаков С.С., Метлин А.Е., Кивируусу Я. и др. Контроль губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота в Финляндии // Ветеринария.- 2002.- №8.- С. 5-9.

63. Рыбаков С.С., Непоклонов Е.А. Гипотезы возникновения губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота // Ветеринария.- 2003.-№9.- С. 20-25.

64. Рыбаков С.С., Рябоконь А.А., Егоров А.А. и др. Диагностика и мониторинг губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота в России // Ветеринария.- 2001.- №2.- С. 17-21.

65. Рыбаков С.С. Скрепи и другие прионные болезни животных и человека.- Владимир: Фолиант, 2003.- 199 с.

66. Семенихин А.Л., Вишняков И.Ф. Состояние и перспективы мер борьбы с классической чумой свиней // Актуальн. вопр. вет. вирусол.: Матер, науч.-практ. конф. ВНИИВВиМ "Классическая чума свиней неотложные проблемы науки и практики".- Покров, 1995.- С. 29-35.

67. Семилетов Ю.А., Карпова В.А., Калинина Т.И., Худяков Ю.Е. Локализация иммунодоминантного сайта в составе корового антигена вируса гепатита В с помощью синтетических пептидов // Биоорган, химия.- 1994,- Т.20, №11.- С. 1175-1185.

68. Семилетов Ю.А., Карпова В.А. Локализация иммунодоминантного сайта в составе антигена вируса гепатита дельта с помощью синтетических пептидов// Биоорган, химия.- 1993.- Т.19, №3.- С. 277-281.

69. Семилетов Ю.А., Фирсова Т.В., Кузин С.Н. и др. Синтез и антигенная активность пептидов из С-концевой части неструктурного белка NS4 вируса гепатита С // Биоорган, химия.- 1993.- Т.19, №11.- С. 1128-1137.

70. Суровой А.Ю., Вольпина О.М,, Иванов В.Т. и др. Моделирование с помощью синтетических пептидов протективных эпитопов белка VP1 вируса ящура серотипов О и А// Биоорган, химия,- 1987.- Т. 13, №8.- С. 1132-1135.

71. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В.

72. Флавовирусные инфекции // Вирусные болезни животных / Под ред. Сюрина В.Н.-М.,- 1998.-С. 97-161.

73. Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии.- М.: Колос, 1999.- С. 138-145.

74. Хаитов P.M., Лиознер А.Л. Биотехнологические аспекты изучения приобретённых иммунодефицитов // Журн. Всесоюз. Хим. О-ва им. Д.И. Менделеева.- 1988.- Т.34.- С. 67-75.

75. Хаитов P.M. Синтетические антигены в иммунодиагностике и иммунопрофилактике // Итоги науки и техники. Сер. иммунология,- М.: ВИНИТИ, 1988,- Т.21.- 171 с.

76. Хаитов P.M. Синтетические антигены: использование в диагностике инфекционных болезней // Иммунология.- 1988.- №4.- С. 5-10.

77. Хаитов P.M. Синтетические антигены. Конструирование иммуногенных молекул по принципу природных аналогов // Иммунология.-1981.- №5.-С. 5-11.

78. Шестопалов Б.В. Предсказание вторичной структуры белка по методу дублетного кода // Мол. биология.-1998.- Т.24, №4.- С. 1117-1125.

79. Щербакова Т.И., Сидорович И.Г, Прокопенко В.Д., Папуашвили М.Н. Определение антител к вирусу иммунодефицита человека в моче. Механизм экскреции специфических антител с мочой у ВИЧ-инфицированных людей // Иммунология.- 1994.- №5.- С. 15-17.

80. Юсупов Р.Х., Ильясова Г.Х. Мониторинг при классической чуме свиней и болезни Ауески свиней // Вет. врач.- 2000.- №1.- С. 47-50.

81. Юсупова Г.Р., Угрюмова B.C., Ильясова Г.Х. О некоторых биологических свойствах вируса чумы свиней // Тр.1 Съезда вет. врачей Респ. Татарстан: Тез. докл., Казань, 1996.- С. 263-265.

82. Яров А.В., Гельфанов В.М., Гречанинова Л.А. и др. Антигенная структура вируса ящура. 5. Защита природовосприимчивых животных от заболевания ящуром с помощью синтетического пептида // Биоорган, химия.-1989.-Т.15, №10.-С. 1313-1317.

83. Яров А.В., Гельфанов В.М., Гречанинова Л.А. и др. Антигенная структура вируса ящура. 4. Синтез и иммуногенные свойства новых фрагментов белка VP1 вируса ящура штамма А22 // Биоорган, химия.- 1989.-Т.15, №9.-С. 1193-1205.

84. Ярославцева Н.Г. V-3 серотипы ВИЧ-1, представленные на территории России // Иммунология.- 1996.- №3.- С. 17-21.

85. Barany G., Merrifield R.B. Solid-phase peptide synthesis // The Peptides. Analysis, Synthesis, Biology. V.2 / Eds. Gross E., Meienhofer J. New York, etc.: Acad. Press., 1980.- P. 3-285.

86. Belosi В., Gaggelli E., Guerrini R. et al. Copper binding to the neurotoxic peptide PrP106-126: thermodynamic and structural studies // Chembiochem.-2004.- V.5, №3.- P. 349-359.

87. Bittle J.L., Hougten R.A., Alexander H. e.a. Protection against foot-and-mouth disease by immunisation with a chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence // Nature.- 1982.- V.298, №5869.- P. 30-33.

88. Bittle J.L., Worrell P., Houghten R.A. et al. Immunization against foot-and-mouth disease with a chemically synthesized peptide // Modern. Appr. New. Vaccines.- New York, 1984.- P. 103-107.

89. Bolin S.R., Black J.W., Fruy M.L., Katz J.B. Detection of cell contaminated with hog cholera virus // J. Am. Vet. Med. Assoc.- 1994.- V.205.- P. 742-745.

90. Bonetto V., Massignan Т., Chiesa R. et al. Synthetic miniprion PrP106 // J. Biol. Chem.- 2002.- V.277, № 35.- P. 31327-31334.

91. Bolton D.C., Seligman S.J., Bablanian G. et al. Molecular location of a species-specific epitope on the hamster scrapie agent protein // J. Virol.- 1991.-V.65, № 7.- P. 3667-3675.

92. Braun U., Kihm V., Pusterla N., Schomann M. Klinischeruntersuchungsgang bei verdacht auf bovine spongiforme enzephalopathie (BSE). 8 p.

93. Callebaut I., Burny A., Krchnak V. e.a. Use synthetic peptides to map sequential epitopes recognized by monoclonal antibodies on the bovine leukemia virus external glycoprotein // Virology.-1991.- V.185.- P. 48-55.

94. Carpino L.A., Han G.Y. The 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino-protecting group// J. Org. Chem.- 1972.- V.37, №22.- P. 3404-3409.

95. Chabry J., Caughey В., Chesebro B. Specific inhibition of in vitro formation of protease-resistant prion protein by synthetic peptides // J. Biol. Chem.-1998.- V.273, №21.- P. 13203-13207.

96. Chabry J., Priola S.A., Wehrly K. et al. Species-independent inhibition of abnormal prion protein (PrP) fopmation by a peptide containing a conserved PrP sequence//J. Virol.- 1999.- V.73, № 8.- P. 6245-6250.

97. Chou P., Fasman G. Description of the method implemented in program BETATURN // Biophys. J.- 1979,- V.26.- P. 367-384.

98. Colijn E.O., Bloemraad M., Wensvoort G. An improved ELISA for• detection of serum antibodies directed against classical swine fever virus // Vet. Microbiol.- 1997.- V.59, №1.- P. 15-25.

99. Dahle J. et al. Use of monoclonal antibodies for the differential diagnosis of pestivirus infections in swine//Tierarztl. Prax.-1991,- V.15, №2.- P. 151-155.

100. De Lizi С., Berzofsky J. T-cell antigenic sites tend to be amphipathic structures // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1985.- V.82, №6.- P. 7048-7052.

101. DiMarchi R., Brooke G., Gale C. et al. Protection of cattle against foot-and-mouth disease by a synthetic peptide // Science.- 1986.- V.232, №4750.- P. 639-641.

102. Doel T.R., Gale C., DoAmoral C.M. et al. Heterotypic protection induced by synthetic peptides corresponding to three serotypes of foot-and-mouth disease virus // J. Virol.- 1990.- V.64, №5.- P. 2260-2264.

103. Dong X.N., Wei K., Liu Z.Q., Chen Y.N. Candidate peptide vaccine induced protection against CSFV // Vaccine.- 2002.- V.21, №3-4.- P. 167-173.

104. Edwards S., Moenning V., Wensvoort G. The development of an international reference panel of monoclonal antibodies for the differentiation of hog cholera virus from others pestivirusis // Vet. Microbiol.- 1991.- V.29, №2.- P. 101108.

105. Edwards S., Sands J.J. Antigenic comparison of hog cholera virus isolates from Europe, America and Asia using monoclonal antibodies // Dtsch. Tierarztl. Wochenschr.- 1990.- V.97.- P. 79-81.

106. Ehrensperger F. Immunological aspect of the infection // Classical Swine Fever and Related Viral Infections. Boston, 1988. - P. 143-163.

107. Eisenberg D., Weiss R.M., Terwilliger T.C. The hydrophobic moment detects periodicity in protein hydrophobicity // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1984,-V.81.- P. 140-144.

108. Faushere J.L., Pliska V. Hydrophobic parameteres of amino acid chains from the partitioning of N-acetyl-amino-acid amides // Eur. J. Med. Chem.- 1983.-V.18.- P. 369-375.

109. Fields G. В., Noble R. L. Solid-phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acid // Int. J. Pept. Prot. Res.- 1990.- V.35.- P. 161214.

110. Francis M.J., Fry C.M., Clarke B.E. et al. A foot-and-mouth disease virus synthetic peptides containing B- and T- cell determinants // Vaccine 87: Modern Appr. New Vaccines.- N.Y., 1987.- P. 60-67.

111. Francis M.J., Fry C.M., Rowlands D.J. et al. Immunological priming with peptides of foot-and-mouth disease virus // J. Gen. Virol.- 1986.- V.66, №11,- P. 2347-2354.

112. Francis M.J., Hastings G.Z., Syred A.D. et al. Non-responsiveness to a foot-and-mouth disease virus peptide overcome by addition of foreign helper T-cell determinants// Nature.- 1987.- V.330, №6144.- P. 168-170.

113. Francis M.J., Rowlands D.J., Brown F. Priming with peptides of foot-and-mouth disease virus // Vaccine 85: Mol. and Chem. Basis Resist. Parasitic, Bact. and Viral Dis.- N.Y., 1985.- P. 203-210.

114. Francki R.I.В., Fauquet C.M., Knudson D.L., Brown F. Fifth report of the Internationale Committe on the Taxonomy of Viruses // Arch. Virol.-1991.- Suppl.2.-P. 223-233.

115. Frommel G. Use of the averaged mutation rate in pieces of protein sequences to predict the location of antigenic determinants // J. Therol. Biol.- 1988.-V.132.- P. 171-177.

116. Fujino M., Wakimasu M., Kitada C. Further studies on the multi-substituted benzensulfonyl groups for protection of the guanidino function of arginine//Chem. Pharm. Bull.-1981,-V.29, №10.- P. 2825-2831.

117. Gamier J., Osguthorpe D., Robson B. Description of the method implemented in program GARNIER // J. Mol. Biol.-1978.-V.120.- P. 97-120.

118. Geysen H.M., Meloen R.H., Barteling S.J. Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1984.- V.81, №12.- P. 3998-4002.

119. Gisin B.F. The monitoring of reaction in solid-phase peptide synthesis with picric acid // Anal. Chim. Acta.- 1972,- V.58.- P. 248-249.

120. Gisin B.F. The preparation of Merrifield-resins through total esterification with cesium salts// Helv. Chim. Acta.- 1970.- V.56, №5.- P. 1476-1482.

121. Goldmann W., Hunter N., Martin T. et al. Different forms of the bovine PrP gene have five or six copies of a short G-C-rich element within the protein-coding exon // J. Gen. Virol.- 1991.- V.72.- P. 201 -204.

122. Grassi J., Comoy E., Simon S. et al. Rapid test for the preclinical postmortem diagnosis of BSE in central nervous system tissue // Vet. Rec.- 2001, №10.- P. 577-582.

123. Greiser-Wilke I., Moenning V., Coulibaly C.O. Identification of conserved epitopes on a hog cholera virus protein // Arch. Virol.- 1990.- V.111, №3-4.- P. 213225.

124. Groschup M.H., Harmeyer S., Pfaff E. Antigenic features of prion proteins of sheep and other mammalian species // J. Immunol. Methods.- 1997,-V.207, №1.- P. 89-101.

125. Groschup M.H., Langeveld J.P., Pfaff E. The major species specific epitope in prion proteins of ruminants // Arch. Virol.- 1994.- V.136, № 3-4.- P. 423431.

126. Groschup M.H., Pfaff E. Stadies of on species-specific epitope in murine, ovine and bovine prion protein // J. Gen. Virol.- 1993.- V.74.- P. 1451-1456.

127. Gu Y., Fujioka H., Mishra R.S. et al. Prion peptide 106-126 modulates the aggregation of cellular prion protein and induces the synthesis of potentialleneurotoxic transmembrane PrP // J. Biol. Chem.- 2002.- V.277, № 35,- P. 3132731334.

128. Hanan E., Goren O., Eshkenazy M., Solomon B. Immunomodulation of the human prion peptide 106-126 aggregation // Biochem. Biophys. Res. Commun.2001.-V.280, № 1.-P. 115-120.

129. Harmeyer S., Pfaff E., Groschup M.H. Synthetic peptide vaccines yield monoclonal antibodies to cellular and pathological prion proteins of ruminants // J. Gen. Virol.- 1998.- V.79.- P. 937-945.

130. Наго I., Gomara V.J. Different approaches to potentiate the immune response induced by a 12-mer synthetic peptide // Curr. Protein. Pept. Sci.- 2000,-V.1, №2.- P. 125-137.

131. Hohlish B.J., Wiesmuller K.H., Schlapp et al. Identification of foot-and-mouth disease virus-specific linear B-cell epitopes to differentiate between infected and vaccinated cattle // J. Virology.- 2003.- V.77, №16.- P. 8633-8639.

132. Норр T.P., Woods K.R. Prediction of protein antigenic determinantsfrom amino acid sequences // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1981.- V.78, №6.- P. 3824-3828.

133. Horiuchi M., Baron G.S., Xiong L.W., Caughey B. Ingibition of interaction and interconversions of prion protein isoforms by peptide fragments from the C-terminal folded domain //J. Biol. Chem.- 2001,- V.276, № 18.- P. 15489-15497.

134. Janin J., Wodak S., Levitt M., Maigret B. Average accessibility surface • area//J. Mol. Biol.- 1978.- V.125.- P. 357-386.

135. Kaden V. The situation classical swine fever in wild boars in the European community and selected aspects of disease transmission // Berl. Munch. Wochenschr.- 1996.- V.111, №6,- P. 201-207.

136. Karplus P.A., Schulz G.E. Prediction of chain flexibility in protein // Naturwissenschaften.- 1985.- V.72.- P. 212-213.

137. Kolaskar A.S., Tongaonkar P.C. A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens // FEBS. Lett.- 1990.- V.276, №1-2.-P. 172-174.

138. Kosmidou A. et al. Differentiation of classical swine fever virus (CSFV) strains using monoclonal antibodies against structural glycoproteins II Vet. Microbiol.- 1995.- V.47, №1-2.- P. 211-218.

139. Kuwata K., Matumoto Т., Cheng H. NMR-detected hydrogen exchange and molecular dynamics simulations provide structural insight into fibril formation of prion protein fragment 106-126 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA- 2003.- V.100, № 25.-P. 14790-14795.

140. Leforban Y., Cariolet P. Characterization and pathogenecity for pigs of a hog cholera virus strain isolated from wild boars // Ann. Rech. Vet.- 1992.- V.23, №1,- P. 93-100.

141. Liebermann H., Reimann I., Bartels T. e.a. Chemosynthetische Peptide gegen Maul-und-Klauenseuche-lmmunantwort gegen freie und tragergebundene Peptide des VP1 von 01 -Kaufbeuren // Arch. exp. Vet. Med.- 1990.- Bd.44, №2,-S. 189-197.

142. Liess B. Persistent infections of hog cholera // Prev. Veter. Med.- 1984.-V2.- P. 109-113.

143. Lim V. Algorithms for prediction of a-helices and p-structural regions in globular proteins//J. Mol. Biol.- 1974,- V.88.- P. 873.

144. Matsushita K., Horiuchi H., Furusawa S. et al. Chicken monoclonal antibodies against synthetic bovine prion protein peptide // J. Vet. Med. Sci.- 1998.-V.60, № 6.- P. 777-779.

145. Meloen R.H., Barteling S.J. Epitope mapping of the outer structural protein VP1 of three different serotypes of foot-and-mouth disease virus // J. Virol.-1986.- V.149.- P. 55-63.

146. Meloen R.H., Puyk W.C., Meijer D.J.F. et al. Antigenicity and immunogenicity of synthetic peptides of foot-and-mouth disease virus // J. Gen. Virol.- 1987.- V.68.- P. 305-314.

147. Merrifield R.B., Vizioli L.D., Boman H.G. Synthesis of the antibacterial peptide cecropin A (1-33) // Biochemistry.-1982.- V.21.- P. 5020-5031.

148. Mitchell A.R., Erickson B.W., Ryabtsev M.N. et al. tert-Butoxycarbonylaminoacyl-4-(oxymethyl)-phenylacetamidomethyl-resin, a more acidresistant support for solid-phase peptide synthesis // J. Amer. Chem. Soc.- 1976.-V.98, №23.- P. 7357-7362.

149. Mohri S., Farquhar C.F., Somerville R.A. et al. Immuno-detection of a disease specific PrP fraction in clinically affected scrapi sheep and BSE cattle // Vet. Rec.- 1992.- V.131.- P. 537-539.

150. Moorman R.J.M., Warmerdam P.A.M., van der Meer B. et al. Molecular cloning and nucleotide sequence of hog cholera virus strain Brescia and mapping of the genomic region encoding envelope protein E1 // Virology.- 1990.- V.177.- P. 184-196.

151. Mostl K., Baumgartmer W. Facten zur BSE-Problematik // Agrarishe rundshau- 1996.-Bd 2.- S. 44-45.

152. Muller A., Depner K.R., Liess B. Evaluation of a gp 55 (E2) recombinant-based ELISA for the detection of antibodies induced by classical swine fever virus // Dtsch. tierarztl. Wochenschr.- 1996.- V.103, №11,- P. 451-453.

153. Muller S. Peptide carrier conjugation // Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. V. 19. Synthetic Polypeptides as Antigens / Eds. Burdon R.H., Knippenberg P.H. - Amsterdam ets., 1988.- P. 95-130.

154. Mylcahy G., Gale C., Robertson P. et al. Isotype responses of infected, virus-vaccinated and peptide-vaccinated cattle to foot-and-mouth disease virus // Vaccine.- 1990.- V.8.- P. 249-256.

155. Nandi P.K. Interaction of prion peptide HuPrP106-126 with nucleic acid // Arch. Virol.- 1997.- V.142, № 12.- P. 2537-2545.

156. Nandi P.K., Leclerc E. Polymerization of murine recombinant prion protein in nucleic solution//Arch. Virol.- 1999.- V.144.- P. 1751-1763.

157. Nishimura О., Fujino M. p-Metoxybenzenesulfonyl as a protecting group of guanidino function in peptide synthesis // Chem. Pharm. Bull.- 1976.- V-24, №7.-P. 1568-1575.

158. O*Donovan C.N., Tobin D., Cotter T.G. Prion protein fragment-(106-126) induces apoptosis via mitochondrial disruption in human neuronal SH-SY5Y cells // J. Biol. Chem.- 2001.- V.276, № 23,- P. 22-31.

159. Parker J., Hodges R. Hydrophobicity of amino acid residues in globular protein // Peptide Res.-1991.- V.4.- P. 347-363.

160. Pearson J.E. Hog cholera diagnostic tecniques // Сотр. Immunol. Microbiol. Infct. Dis.- 1992.- V.15, №3,- P. 213-219.

161. Perce A.J., Ford D.J., Gaizutis M.A. Quantitative and qualitative aspects of immunoassays // Scand. J. Immunol.- 1978.- V.8, №7.- P. 1.

162. Perris N.P., Kitching R.P., Oxtoby J.M. Use of inactivated foot-and-mouth disease virus antigen in liquid-phase blocking ELISA // J. Virol. Metods.-1990.- V.29, №1.- P. 33-41.

163. Pfaff E., Mussgay M., Bohm H.O. Antibodies against a preselected peptide recognize and neutralize foot-and-mouth disease virus // EMBO J.- 1982.-V.1, №2.- P. 869-874.

164. Picard M., Binger C., Plaleau E., Cruciere C. La peste porcine classique chez les sangliers un visage epidemiologique nouveau de France // Bull. Soc. Vet. Prat, de France.- 1993.- V.77, №2.- P. 81 -92.

165. Plaue S., Muller S., Briand J.P., Van Regenmortel M.H.V. Recent advances in solid phase peptide synthesis and prepation of antibodies to synthetic peptides // Biologicals.- 1990.- V.18.- P. 147-157.

166. Ponder J., Richards F. Tertiary templates for proteins. Use of packing criteria in the enumeration of allowed sequences for different structural classics // J. Mol. Biol.- 1987.- V.193.- P. 775-791.

167. Portetelle D., Donday C., Burny A. et al. Synthetic peptides approach to identification of epitopes an bovine leukemia virus envelope glycoprotein gp 51 // Virology.- 1989.- V.169.- P. 34-41.

168. Prusiner S.B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie // Science.- 1982.- V.216.- P. 136-144.

169. Ptitsyn O., Finkelstein A. Theory of protein secondary structure and algorithm of its prediction // Biopolymers.- 1983,- V.22.- P. 15-25.

170. Rao M.J.K., Argos P. A conformational preference parameter to predict helices in integral membrane proteins // Biochim. Biophys. Acta.- 1986.- V.869 P. 197-214.

171. Rothbard I. Protein structure: what is possible to predict now? // Ann. Inst. Paster. Virol.- 1986,- V.137E.- P. 518-522.

172. Rumenapf Т., Meyers G., Stark R., Thiel H.-J. Molecular characterization of hog cholera virus//Arch. Virol.-1991.- № 3.- P. 7-18.

173. Rumenapf Т., Stark R., Meyers G., Thiel H.J. Structural proteins of hog cholera virus expressed by vaccinia virus : further characterization and induction of protective immunity//J. Virol.-1991.- V.65, №2,- P. 589-597.

174. Rumenapf Т., Unger G., Strauss J.H., Thiel H.J. Processing of the envelope glycoproteins of pestiviruses //J. Virol.- 1993.- V.67, №6.- P. 3288-3294.

175. Sandvik Т., Paton D.J., Lowings P.J. Detection and identification of ruminant and porsin pestiviruses by nested amplification of 5'-NCR // J. Virol. Methods.- 1997.- V.64, №1.- P. 43-56.

176. Sarin K.V., Kent S.B.H., Tam J.P., Merrifield R.B. Quantitative monitoring of solid-phase peptide synthesis by the ninhydrin reaction // Anal. Biochem.- 1981.- V.117.- P. 147-157.

177. Schmerr M.J., Jenny A. A diagnostic test for scrapi-infected sheep using• a capillary electrophoresis immunoassay with fluorescent-labeled peptides // Electrophoresis.- 1998.- V.19, №3.- P. 409-414.

178. Sobrino F., Blanco E., Garcia-Briones M., Ley V. Synthetic peptide vaccines: foot-and-mouth disease virus as a model // Dev. Biol. Stand.- 1999.-V.101.- P. 39-43.

179. Sobrino F., Martinez M.A., Carrilo C., Beck E. Antigenic variation of foot-and-mouth disease virus of serotype С during propagation in the field is mainly restricted to only one structural protein (VP1) // Virus Research.- 1989.- V.14, №4.* P.273-280.

180. Stark R., Rumenapf Т., Meyers G., Thiel H.J. Genomic localization of hog cholera virus glycoproteins // Virology.- 1990.- V.174, №1.- P. 286-289.

181. Taboga O., Tami G., Carrillo E. et al. A large-scale evaluation of peptide vaccines against foot-and-mouth disease: lack of solid protection in cattle and isolation of escape mutants // J. Virol.- 1997.- V.7, №4.- P. 2602-2614.

182. Tagliavini F., Prelli F., Verga R. et al. Synthetic peptides homologous toprion protein residues 106-147 form amiloid-like fibrils in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1993.- V.90.- P. 9678-9682.

183. Tam J.P. Synthetic peptide vaccine desing: synthesis and properties of a high-density multiple antigenic peptide system // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1988.-V.85.- P. 5409-5413.

184. Tam J. P., Wong T.-W., Riemen M. W. et al. Cyclohexyl ester as a new protecting group for aspartyl peptides to minimize aspartimid formation in acidic and basic treatments //Tetraedron. Lett.- 1979.- №42,- P. 4033-4036.

185. Terpstra C. Epizootiology of hog cholera // Classical Swine Fever and Realated Viral Infections.- Boston, 1988.- P. 201-216.

186. Thiel H.J., Stark R., Weiland E. et al. Hog cholera virus: molecular composition of virions from a pestivirus//J. Virol.-1991.- V.65, №9.- P. 4705-4712.

187. Thornton J.M., Edwards M.S., Taylor W.R., Barlow D.J. Location of continuous antigenic determinants in the protruding of proteins // EMBO J.- 1986.-V.5.- P. 409-413.

188. Van Oirschot J.T., Terpstra C. Hog cholera virus// Virus Infections of Porcines.- Amsterdam, 1989. P. 113-130.

189. Van Regenmortel M.H.V. Solid phase immunoassays // Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. V. 19. Synthetic Polypeptides as Antigens / Eds. Burdon R.H., Knippenberg P.H. - Amsterdam ets., 1988.- P. 145158.

190. Van Rijn P.A., Bossers A., Wensvoort G., Moormann R.J. Classical swaine fever virus (CSFV) envelope glycoprotein E2 containing one structural antigenic unit protects pigs from lethal CSFV challenge // J. Gen. Virol.- 1996.-V.77, №11.- P.2737-2745.

191. Van Rijn P.A., Miedema G.K., Wensvoort G. et al. Antigenic structure of envelope glycoprotein E1 of hog cholera virus // J. Virol.- 1994.- V.68, №6.- P. 3934-3942.

192. Van Rijn P.A., Van Gennip R.G., De Meijer E.J., Moormann R.J. A preliminary map of epitopes on envelope glycoprotein E1 of HCV strain Brescia // Vet. Microbiol.- 1992,- V.33, №1-4.- P. 221-230.

193. Van Rijn P.A., Van Gennip R.G., De Meijer E.J., Moormann R.J. Epitope mapping of envelope glycoprotein E1 of hog cholera virus strain Brescia // J. Gen. Virol.-1993.- V.74, №10.- P.2053-2060.

194. Volpina O.M., Surovoy A.Y., Zhmak M.N. et al. A peptide constructcontaining B-cell and T-cell epitopes from the foot-and-mouth disease virus VP1 protein induces efficient antiviral protection // Vaccine.- 1999.- V.17, №6,- P. 577584.

195. Volpina O.M., Yarov A.V., Zhmak M.N. et al. Synthetic vaccine against foot-and-mouth disease based on a palmitoyl derivative of the VP1 protein 135-159 fragment of the A22 virus strain//Vaccine.- 1996.- V.14, №14,- P. 1375-1380.

196. Wang C.Y., Chang T.Y., Walfield A.M. et al. Effective synthetic peptide vaccine for foot-and-mouth disease in swine // Vaccine.- 2002.- V.20, №19-20.- P.2603-2610.

197. Weiland E., Stark R., Haas B. et al. Pestivirus glycoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer // J. Virol.- 1990,- V.64, №8,- P. 3563-3569.

198. Welling G.M., Weijer W.J., van der Lee R. et al. Prediction of sequential antigenic region in proteins// FEBS Lett.- 1985.- V.188, №2.- P. 215-218.

199. Wensvoort G., Boonstra J., Bodzinga B.G. Immunoaffinity purificationand characterization of the envelope protein E1 of hog cholera virus // J. Gen. Virol.-1990,- V.71, №3.- P. 531-540.

200. Wenswoort G., Terpstra G., de Kluijver E.P. et al. Antigenic differentiation of pestivirus strains with monoclonal antibodies against hog cholera virus // Vet. Microbiol.-1989.- V.21, №1.- P. 9-20.

201. Wensvoort G. Topographical and functional mapping of epitopes on hog • cholera virus with monoclonal antibodies // J. Gen. Virol.- 1989.- V.70, №11.- P.2865-2876.

202. Wilesmith J.W., Hoinville L.J., Ryan J.B.M., Sayers A.R. Bovine spongiform encephalopathy: aspects of the clinical picture and analysis of possible changes 1986-1990//Vet. Rec.- 1992.- V.130.- P. 197-201

203. Wilson C., Hughes L., Rashid T. et al. Antibodies to prion and Acinetobacter peptide sequences in bovine spongiform encephalopathy // Vet. Immunol, and Immunopathol.- 2004,- V.98.- P. 1-7.

204. Yajima H., Fuji N. Acidolytic deprotecting procedures inpeptide synthesis // The Peptides. Analysis, Synthesis, Biology. V.5 / Eds. Gross E., Meienhofer J. -New York, etc., 1983,- P. 66-109.

205. Yokohama Т., Itohara S., Yuasa N. Detection of species specific epitopes of mouse and hamster prion proteins (PrPs) by anti-peptide antibodies // Arch. Virol.- 1996,- V.141, № 3-4.- P. 763-769.

206. Yokohama Т., Kimura K., Tagawa Y., Yuasa N. Preparation and characterization of antibodies against mouse prion protein (PrP) peptides // Clin. Diagn. Lab. Immunol.- 1995.- V.2, №2.- P. 172-176.

207. Yu M., McColl K.A., Gould A.R. Cloning and nucleotide sequence determination of the major envelope glycoprotein (gp55) gene of hog cholera virus (Weybridge) // Virus Res.- 1993.- V.28, №2,- P. 203-208.

208. Yu M., Wang L.F., Shiell B.J. et al. Fine mapping of a C-terminal linear epitope highly conserved among the major envelope glycoprotein E2 (gp51 to gp54) of different Pestiviruses // J. Virol.- 1996.- V.222, №1.- P. 289-292.

209. Zamorano P.I., Wigdorovitz A., Perez Filgueira D.M. et al. Induction of foot-and-mouth disease virus T and В cell responses in cattle immunized with a peptide representing ten amino acids of VP1 // Vaccine.- 1998.- V.16, №6.- P. 558563.

Информация о работе

Решетников, Геннадий Геннадьевич
кандидата биологических наук
Владимир, 2005
ВАК 03.00.06

Диссертация

Создание синтетических антигенов для лабораторной диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота и классической чумы свиней - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы