Роль агрегации и образования дисульфидных связей в формировании амилоидных структур естественно развернутыми белками: прионом и казеином

Стройлова (Щуцкая), Юлия Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль агрегации и образования дисульфидных связей в формировании амилоидных структур естественно развернутыми белками: прионом и казеином
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль агрегации и образования дисульфидных связей в формировании амилоидных структур естественно развернутыми белками: прионом и казеином"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

3019

На правах рукописи

УДК 577.112

ЮЛИЯ ЮРЬЕВНА СТРОЙЛОВА (ЩУЦКАЯ)

РОЛЬ АГРЕГАЦИИ И ОБРАЗОВАНИЯ ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ В ФОРМИРОВАНИИ АМИЛОИДНЫХ СТРУКТУР ЕСТЕСТВЕННО РАЗВЕРНУТЫМИ БЕЛКАМИ: ПРИОНОМ И КАЗЕИНОМ

специальность 03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 НОЯ 2010

Москва-2010

004613019

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в лаборатории функциональных взаимодействий молочных белков государственного агрономического института в городе Нант

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Владимир Израилевич Муронец профессор ТомаЭртле

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Борис Иванович Курганов

доктор биологических наук, профессор Николай Николаевич Чернов

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится 15 ноября 2010 г. в 15. часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 . при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, Большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан октября 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В течение долгого времени процесс агрегации белков практически не исследовали, считая ее скорее неприятным препятствием, возникающим при изучении белков, однако в последнее время ситуация изменилась. Основной причиной всплеска интереса к этому процессу является то, что накопление белковых агрегатов в клетке ведет к развитию нейродегенеративных заболеваний (Mazzola and Sirover, 2003). Известна связь прионов и их агрегатов с хроническими нейродегенеративными заболеваниями, такими как скрейпи у овец, губчатая энцефалопатия у крупного рогатого скота и болезнь Крейцфельда-Якоба у человека (Prusiner, 1994; Prusiner, 1998; Prusiner et al., 1998). Патологическая агрегация прионов в амилоидную форму считается причиной скрейпи (Prusiner and DeArmond, 1991). Такая трансформация сопровождается конформационными изменениями в третичной структуре, увеличением количества (3-слоев и повышением устойчивости белка к действию протеаз. Причины и механизмы этого процесса являются объектом многочисленных исследований, однако до сих пор не ясны.

В последние годы стало известно, что белки могут быть функционально активны не только в глобулярном, но и в частично или полностью развернутом состоянии (Uversky et al., 2000), причем именно такие белки вовлечены в нейродегенеративные процессы.

Межмолекулярные взаимодействия белковых молекул между собой могут приводить к образованию ассоциатов, аморфных агрегатов, амилоидоподобных и амилоидных фибрилл. Для возникновения таких контактов необходимо наличие гидрофобных участков полипептидной цепи, экспонированных в растворитель. Поэтому агрегация частично или полностью неупорядоченных белков более вероятна по сравнению с глобулярными белками и представляет особый интерес. Таким образом, изучение особенностей агрегации представителей класса естественно развернутых белков, к которым относятся прион и казенны, является актуальной проблемой.

Целью нашей работы было выявление новых факторов, влияющих на агрегацию белков с естественно развернутой структурой.

Для этого нами было выбрано два объекта: овечий прион и казеин. Овечий прион является частично несвернутым белком (примерно половина последовательности), а казеин считается малоструктурированным белком.

Патологическая агрегация приона и его переход в амилоидную форму вызывают прионную болезнь; некоторые казенны, в частности, к-казеин, в определенных условиях также способны к образованию амилоидных фибрилл. \

Таким образом, казенны являются адекватной модельной системой для исследования агрегации неструктурированных белков.

Оба белка содержат более 10% остатков пролина. Сравнение двух этих белков интересно еще и тем, что Р-казеин формирует мицеллы в нативном состоянии.

Перед нами стояли следующие задачи:

- Исследовать влияние температуры и образования дисульфидных связей на мицеллизацию и структуру казеина;

- Исследовать амилоидогенную агрегацию приона под действием температуры и фосфолипидов;

- Исследовать влияние образования дисульфидных связей при гомоцистеинилировании на агрегацию казеинов и приона.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В данной работе впервые охарактеризовано влияние образования дисульфидных связей на мицеллизацию и агрегацию казеина. Исследование новоприобретённой способности к полимеризации мутантных форм и ее влияния на структуру и мицеллизацию Р-казеина носит фундаментальный характер.

Результаты, полученные в данной работе, дополняют современные представления о возможных молекулярных причинах спорадических форм прионных заболеваний. В частности, данное исследование позволило установить, что патологическая агрегация приона может быть вызвана изменениями в его липидном окружении.

Показанное в данной работе амилоидогенное влияние гомоцистеинилирования на агрегацию приона позволяет предположить провоцирующее влияние гомоцистеина, опосредованное через гомоцистеинтиолактон, на появление патологических амилоидогенных агрегатов приона.

Результаты, полученные при гомоцистеинилировании приона и к-казеина, позволили выявить влияние новообразованных дисульфидных связей на амилоидогенные белки. Проведенные исследования существенно расширяют представления о механизмах взаимодействия гомоцистеинтиолактона со склонными к патологической амилоидоподобной агрегации белками, что существенно для понимания молекулярных механизмов токсичности гомоцистеина. Проведение исследований по влиянию различных факторов (в том числе образования дисульфидных связей) на агрегацию естественно развернутых белков необходимо для понимания процессов, которые происходят с такими белками, формирующими надмолекулярные структуры и

склонными к образованию амилоидных структур. Одним из таких белков, имеющим важное практическое значение, является казеин молока. Следует также отметить, что коровье молоко и сыворотка содержат микромолярные концентрации N-связанного с белком гомоцистеина, и, следовательно, такого рода процессы могут иметь важное значение для регуляции потребительских свойств молока (стабильность эмульсионных свойств при хранении, особенности створаживания, эффективность отделении сыворотки и т.д.). Не менее важно учитывать возможное влияние N-связанного с белком гомоцистеина, прежде всего в случае казеина, на особенности переваривания и всасывания других белковых компонентов пищи, включая такие амилоидогенные белки, как прионы.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на научном семинаре кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на научных семинарах в лаборатории функциональных взаимодействий молочных белков государственного агрономического института в городе Нант, на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Россия, Казань, 2009), Forum des Doctorants de l'Ecole Doctorale de Chimie-Biologie de l'Université de Nantes (2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, включая 3 статьи и одни тезисы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, разделов «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Выводы» и списка цитируемой литературы. Работа содержит Ü12/ страниц машинописного текста, 7 таблиц и 67 рисунков. Список литературы включает .//¿отечественных и зарубежных источников.

В работе приняты следующие сокращения: ДЛС - метод динамического лазерного светорассеяния, ДСН - додецилсульфат натрия, ИК -инфракрасная спектроскопия, КД - круговой дихроизм, ФИ - фосфатидилинозитол, ANS -натриевая соль 1,8-анилинонафталинсульфоновой кислоты GPI - гликофосфатидилинозитол, MALDI-TOF - Масс-спектрометрия с использованием матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации и времяпролетного детектора, WT - дикий тип.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были aSl-, ß- и к-казеины из коровьего молока, рекомбинантный ß-казеин и его мутанты, а также рекомбинантный овечий прион.

Экспрессию рекомбинантных В-казеинов и приона проводили в Е. coli.

Для очистки приона использовали аффинную хроматографию на Ni-связанной сефарозе вследствие наличия у приона сродства к металлам (Rezaei et al., 2000).

Нативные казенны молока разделяли с помощью анионообменной хроматографии (Mercier et al., 1968), рекомбинантный ß-казеин и его мутанты получали с помощью трехстадийной очистки, включающей две обратно-фазовых хроматографии и анионообменную.

Получение олигомерных термоагрегатов приона проводили, используя аппарат для ПЦР (Techne) в диапазоне температуры между 45 и 90°С. Для исследований взаимодействия с фосфатидилинозитолом его растворяли в смеси этанол-хлороформ в концентрации 10 мг/мл.

Для гомоцистеинилирования использовали 100-кратный молярный избыток гомоцистеинтиолактона в расчете на содержание остатков лизина в белке, если не указано иное. Гомоцистеинилирование проводили с 20 мкМ раствором белка в 20 мМ MOPS или 25 мМ фосфатном буфере, pH 7,5. Свежеприготовленный раствор гомоцистеинтиолактона добавляли к раствору белка и контролировали pH, добавляя NaOH при закислении. Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течении 20-24 часов в случае приона, при 10, 37 и 50°С в случае казеинов. Из литературных данных известно, что за это время непрореагировавший тиолактон полностью гидролизуется.

Для димеризации лиофилизированные рекомбинантные формы ß-казеина (дикий тип и цистеинилированные мутанты) растворяли в 50 мМ Трис-НС1 буфере, содержащем 80 мМ NaCl, 0,05% азид натрия, pH 8,2, до конечной концентрации 20 мкМ. Для получения преимущественно димерных форм белки инкубировали в присутствии 60 мкМ Н2О2.

Гидродинамический диаметр приона и казеинов в нативном и агрегированном состоянии измеряли на приборе Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Malvern). Спектры кругового дихроизма записывали при длине волны от 190 до 250 нм на приборе Jobin Yvon CD Mark 6 (Long-Jumeau, Франция) в кювете с длиной оптического пути 0,01 мм. ИК-спектры записывали на спектрометре Bruker Vector 22 (Bruker GmbH, Германия). Образцы гомоцистеинилированного и контрольного белка помещали между двумя пластинками из фторида бария с разделителем толщиной 56 нм.

Спектры флуоресценции снимали на спектрофлуориметре FluoroMax-3 (Horiba Jobin Yvon, Long-Jumeau, Франция).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Димеризация мутантных форм В-казенна

В лаборатории функциональных взаимодействий белков молока были созданы мутанты [3-казеина со вставками цистеина на И- и С-концах (Оагщпагё е1 а1„ 2007):

Дикий тип МКЕЬЕ^ЕЬГдУРбЕ^ЕБ^ЗБЕЕБ^ШШЕКРаЗ-----РРП208У

Мутант С4 М6КЕ1СлЕ1МУРвЕ1УЕ51555ЕЕ51ТК1МКК1ЕКЕЦ5-----РРИ208У

Мутант С208 МСКЕ1.Е,.Е1ЫУРОЕ1УЕ51_555ЕЕ51ТР|[ЧКК1ЕКРа5-----РР1С203У

Мутант С4-208 МСКЕ1С4Е1_МУР6Е1УЕ5155БЕЕ51Тт[\1КК|ЕКР0.5 -— РР1С208У

Мы проанализировали способность полученных мутантных форм к димеризации при различных температурах. Анализ геля ДСН-электрофореза (Рис. 1) показывает значительные отличия в скорости димеризации двух изучаемых мутантов. С-концевой мутант обладает значительно более выраженной способностью к димеризации, чем М-концевой в обоих использованных буферах.

Рекомбинантный казеин дикого типа не димеризуется по причине отсутствия цистеина и приведен в качестве контроля. Из рисунка видно, что скорость димеризации растет с увеличением температуры, подчиняясь общему для всех химических реакций уравнению Аррениуса.

Рис. 1. Результат ДСН-электрофореза, иллюстрирующий димеризацию рекомбинантных казеинов при рН 6,8 и температурах 60°С и 25°С А: 60°С - фосфатный буфер : 1,2,3 - \УТ, 0, 10 мин, 1 ч. 4, 5, 6 - С208, 0, 10 мин, 1 ч. 7, 8, 9-С4, 0, 10 мин, 1 ч. Б: 25"С - фосфатный буфер : 1,2,3, 4 - С208, 0, 1 ч, 10 ч,24 ч. 5,6, 7, 8-С4, 0, 1ч, 10 ч, 24 ч. 9-ШТ.

Кинетические кривые димеризации С- и Ы-концевого мутантов казеина были получены методом интегрирования оптической плотности соответствующих полос на ДСН-электрофорезе с помощью программы ОпеОБсап. Описание полученных данных было проведено методом нелинейной регрессии. Кинетические кривые димеризации аппроксимировались уравнением, соответствующим зависимости концентрации продукта реакции первого порядка от времени: А=а-(1-ек'). Результаты аппроксимации представлены в таблице 1, из которой следует, что при 25°С С-концевой мутант димеризуется примерно в 10 раз быстрее, чем Ы-концевой. При температуре 60°С константы скорости димеризации различаются еще сильнее (почти в 20 раз).

Таблица !. Оценочные значения констант скорости димеризации мутантов казеина при различных температурах.

Температура, °С к, мин"1

Мутант С4 Мутант С208

25 0,004 0,04

60 0,008 0,148

Таким образом, при температурах 25 и 60°С димеризация С-концевого мутанта С208 происходит значительно эффективнее, чем 1Ч-концевого мутанта С4. При этом при температуре 4°С разница в скорости нивелируется (результат не показан). Логично предположить, что при димеризации Ы-концевого мутанта С4 взаимодействие молекул будет осложнено электростатическим отталкиванием одноименно заряженных участков, тогда как димеризация С-концевого мутанта будет облегчена гидрофобными взаимодействиями. При понижении температуры они ослабляются и скорость димеризации падает (Рис. 2).

Мутант С208

Мутант С4

Рис. 2. Схема димеризации

цистеинилированных

мутантов

Следует отметить, что двойной мутант р-казеина С4-208 обладает высокой реакционной способностью. Уже при растворении белок обнаруживается в различных полимерных формах, а через 2 часа мономерная форма практически исчезает. По всей видимости, такой белок может

формировать длинные цепочки, образуя сшитые полимеры с высокой степенью полимеризации (данные не представлены).

2. Влияние димеризации мутантных форм в-казеина на его структуру и мицеллизацию

Спектры кругового дихроизма нативного и рекомбинантных казеинов имеют типичную для неструктурированных белков форму, свидетельствующую о наличии небольшого количества а-спиралей и (3-слоев. Разложение спектров на составляющие для получения информации о влиянии димеризации и мицеллизации на вторичную структуру р-казеина проводили с помощью К2Б Интернет-ресурса (http://www.embl-heidelberg.de/~andrade/k2d/). Поскольку данный метод предназначен для структурированных белков, применять его для количественной оценки вторичной структуры развернутых белков следует с осторожностью, трактуя результаты скорее как показатель качественных изменений и тенденций. На Рис. 3 представлено разложение спектров КД для мономерных (при 10°С) и мицеллярных (при 38°С) форм нативного и рекомбинантных (3-казеинов. Несмотря на приблизительность количественной оценки, можно сказать, что димеризация и полимеризация приводит к увеличению содержания а-спиралей в структуре белка для всех мутантных форм в немицеллярном состоянии. Одновременно снижающееся количество Р-слоев указывает на то, что не происходит структуризации по амилоидному типу, для которой характерно их повышение. При повышении температуры до 38°С равновесие между мономерной и мицеллярной формой смещается в сторону мицелл. На Рис. 3 можно видеть, что в мицеллярной форме соотношение количества элементов вторичной структуры у мутантных белков близко к нативной форме р-казеина.

3 40 о.

ь20

а- 10 о

I 1

альфа - спираль бета - слой неструктур.участки

40 30 20 10 0

Натив. Ш С4 С208С4-208

Натив. т С4 С208 С4-208

Рис. 3. Разложение КД спектров разных форм Р-казеина в немицеллярной (слева) и в мицеллярной (справа) форме

С помощью метода динамического лазерного светорассеяния было изучено влияние димеризации на формирование казеином мицелл.

Гидродинамический диаметр мономеров казеина составляет около 7 нм, а диаметр образующихся мицелл составляет примерно 24-26 нм (Рис. 4).

Можно видеть, что отсутствие фосфорилирования у рекомбинантного (3-казеина практически не отражается на способности к мицеллизации, незначительно увеличивая температуру перехода в мицеллярное состояние. 1\[-концевой мутант С4 демонстрирует отсутствие влияния димеризации на кривую мицеллизации.

При этом димеризация по С-концевому остатку цистеина (мутант С208) приводит к ощутимому облегчению мицеллизации по сравнению с диким типом. Эффект снижения температуры мицеллизации снимается добавлением р-меркаптоэтанола.

Двойной мутант эффективно полимеризуется, обнаруживая на электрофорезе различные олигомеры. При этом кривая его мицеллизации значительно сдвинута в сторону меньших температур; фактически с 10-15°С белок представлен в растворе в виде самоассоциатов.

- Нативный -\Л/Т

- И/Т + ЬМЕ

Температура, °С

-ш

С4 - С4+ЬМЕ

Температура, С

2 15 I

X о 10

. "

Щ—

-Ш С208

С208 +ЬМЕ

+-ЩХ

♦......С4-208

с— С4-208 + ЬМЕ

20 30 40 50

Температура, °С

Температура, С

Рис. 4. Кривые мицеллизации (3-казеинов, полученные с помощью метода динамического лазерного светорассеяния.

3. Исследование действия гомоцистеинтиолактона на нативные а81-, В- и к-казеины

Полученные мутанты (3-казеина с внедренными остатками цистеина не демонстрировали склонности к агрегации, поэтому чтобы исследовать влияние образования дисульфидных связей на агрегацию, мы использовали модификацию гомоцистеинтиолактоном. Такая модификация г - аминогрупп лизина в белке гомоцистеинтиолактоном приводит к внедрению гомоцистеина

в последовательность белка. Особенности гомоцистеинилирования естественно развернутых белков были исследованы нами в данной части работы, в том числе, на примере трех основных молочных казеинов: ctSl-, к- и ß-казеинов. С одной стороны, все три исследованных нами казеина относятся к группе белков с частично неупорядоченной структурой (Thorn et al., 2008; Tompa, 2002), а с другой - представляют три принципиально разных класса неупорядоченных белков: aSl-казеин не образует мицелл, к-казеин хотя и не образует мицелл, но может димеризоваться или олигомеризоваться за счет присутствия сульфгидрильных групп, а ß-казеин формирует мицеллы благодаря своей амфифильности (Ноше, 2002), а также считается "реоморфным", то есть подстраивающим структуру под окружение, белком (Holt and Sawyer, 1988). Таким образом, использование трех разных классов естественно развернутых белков позволяет оценить вклад структурной организации белковых и надбелковых структур в формирование агрегатов.

При гомоцистеинилировании нативных aSl-, к- и ß-казеинов на электрофореграмме (Рис. 5) можно видеть образование различных олигомеров, в том числе крупных агрегатов, едва входящих в концентрирующий гель. При этом практически весь белок обнаруживается в осадке. Поскольку эффект снимается добавлением ß-меркаптоэтанола, можно сказать, что наблюдаемая агрегация вызвана образованием дисульфидных связей. В процессе модификации раствор становится опалесцирующим, при этом не происходит беспорядочной агрегации по типу преципитации. Полученные частицы имеют размер несколько микрометров, что несколько выходит за рабочий диапазон прибора, используемого для измерения ДЛС (данные не показаны).

А Б В

кДа ЦЦ

66 Н ■

кДа

66 <

45 Й: _-

24 ,

кДа

66 <

45 36 -

29 • 24 ' ж' ■'■ШШ

20 ■

14 -mm

^4 'ABdí Я^йя

1 2 3 4 М 1 2 3 4

Рис. 5. Гомоцистеинилирование aSl-казеина (А), р-казеина (Б), к-казеина (В) было проведено инкубацией казеинов (1 мг/мл) в 25 мМ фосфатном буфере, рН 7,5, с гомоцистеинтиолактоном в течение 24 часов. 1: контрольные казенны, 2: казенны, модифицированные 10-кратным избытком (в расчете на остаток лизина) гомоцистеинтиолактона, 3: казенны, модифицированные 100-кратным избытком (в расчете на остаток лизина) гомоцистеинтиолактона, 4: казенны, модифицированные 100-кратным избытком (в расчете на остаток лизина) гомоцистеинтиолактона с последующим восстановлением р-меркаптоэтанолом (720 мМ).

Определение количества остатков гомоцистеина, включенных в р-казеин после 120 минутной инкубации с 100-кратным избытком гомоцистеинтиолактоном, проводили с помощью титрования сульфгидрильных групп ДТНБ. Для этого модифицированный р-казеин обрабатывали 8М гуанидингидрохлоридом, затем подвергали обессоливанию на колонке РБ-10 для удаления остатков свободного гомоцистеина и непрореагировавшего тиолактона. Полученный белок инкубировали в присутствии 2 мМ р-меркаптоэтанола в течение часа при температуре 40°С для восстановления сульфгидрильных групп остатков гомоцистеина, и снова подвергали обессоливанию.

Было показано, что в этих условиях при гомоцистеинилировании р-казеина в среднем на молекулу белка приходится 1,5 + 0,1 БН-группы, что свидетельствует о включении около 1,5 остатков гомоцистеина на мономер казеина. Однако, на самом деле эффективность включения может быть несколько выше, так как часть агрегатов не растворяется даже в 8М гуанидингидрохлориде и не может быть проанализирована в этом эксперименте.

Полученные с помощью разных флуоресцентных методов данные также указывают на то, что гомоцистеинилирование приводит к изменениям в структуре казеинов.

Казенны имеют остаток триптофана в С-концевой области (Р-казеин -один в 157 положении, к-казеин - один в 97 положении, -казеин - два остатка, в 179 и 214 положении), что делает возможным измерение максимума длины волны свечения триптофана (Тгр Хмакс). Таким образом, можно наблюдать структурные изменения, связанные с поведением белка в процессе агрегации: смещение в синюю область указывает на изменения в окружении триптофана, которое становится более гидрофобным.

Для анализа влияния мицеллизации на характер модификации было проведено гомоцистеинилирование р-казеина при разных температурах (10°С -мономер, 50°С - мицеллы). Препараты а81- и к-казеинов не образуют мицелл, но измерение также проводили при двух температурах. аБ1-Казеин использовали в качестве контроля, а к-казеин - с целью более однозначной интерпретации данных по индустриальному Р-казеину, содержащему примесь к-казеина.

Было показано, что в случае а81-казеина сдвиг максимума флуоресценции практически отсутствует при обеих температурах. Для исходного очищенного р-казеина характерно более гидрофильное окружение остатков триптофана, что свидетельствует об их экспонировании в раствор, а при гомоцистеинилировании наблюдается сдвиг максимума флуоресценции в

синюю область (Рис. 6), особенно при высокой температуре, способствующей мицеллообразованию и формированию крупных агрегатов.

aSl-казеин [3-казеин pi-казеин к-казеин

Рис. 6. Расположение максимума собственной флуоресценции триптофана в гомоцистеинилированных казеинах.

В препаратах к-казеина триптофан исходно находится в более гидрофобном окружении, чем в двух других казеинах, а введение гидрофильных остатков гомоцистеина приводит к выраженному сдвигу в красную область. Таким образом, гомоцистеинилирование приводит к изменению окружения триптофана у aSl- и |3-казеинов на более гидрофобное.

Флуоресцентный краситель тиофлавин Т является маркером амилоидогенных структур, однако также считается, что он способен связываться с мицеллярными формами белков (Kumar et al., 2008). При гомоцистеинилировании казеинов наблюдается значительное увеличение интенсивности флуоресценции связанного с белком тиофлавина Т (спектры не приведены). Центрифугирование и последующий анализ фракций показывает, что связанная форма значительно преобладает в осадке, то есть в полученных агрегатах, так как интенсивность флуоресценции в супернатанте незначительно отличается от контрольной.

Для связавшегося тиофлавина Т при взаимодействии с амилоидными [3-структурами наблюдается характерный красный сдвиг, причем у казеинов максимум сдвигается сильнее в красную область, по сравнению с известным для амилоидных белков сдвигом максимума флуоресценции до 480 нм (Ban et al., 2003). Полученные с помощью флуоресценции тиофлавина Т данные косвенно свидетельствуют об амилоидоподобном изменении структуры агрегатов казеина при образовании дисульфидных связей.

Известно, что при связывании ароматического хромофора 1-анилино-8-нафталенсульфоната (ANS) с неполярными областями белка его спектр сдвигается в синюю область и интенсивность флуоресценции значительно возрастает (Matulis et al., 1999; Slavik, 1982). Сильное сродство ANS к белку в состоянии расплавленной глобулы обусловлено потерей третичной структуры (Semisotnov et al., 1991). Из приведенных на Рис. 7 данных следует, что для нативных казеинов наиболее значительное увеличение интенсивности флуоресценции ANS происходит в присутствии нативного aSl-казеина. Гомоцистеинилирование всех исследованных казеинов приводит к выраженному увеличению интенсивности флуоресценции ANS и синему сдвигу максимума испускания (Таблица 2), что свидетельствует о повышении доступности для красителя неполярных областей, и, соответственно, об увеличении вероятности агрегации казеинов. Таблица 2. Сдвиги максимумов флуоресценции ANS при связывании с

гомоцистеинилированными казеинами.

Максимум флуоресценции ANS после связывания с гомоцистеинилированными казеинами.

Хпах ANS + контрольный казеин, нм Li ANS + модиф. при 50°С казеин, нм

aSi-казеин 508.4 ±0.3 500.3 ±0.3

ß- казеин 527.8 ±0.1 504.3 ± 0.2

ßi- казеин 524.5 ±0.1 505.6 ±0.2

к-казеин 519.6 ± 0.1 512.5 ±0.2

: 2.50Е+06

5.2.00Е+06

ш 1,50Е+06

| 5,00Е+05 -

aSl-казеин ß-казеин ßi-казеин к-казеин Рис. 7. Значение интенсивности флуоресценции свободного и казеин-связанного ANS при длине волны 480 нм (не максимум).

Известно, что спектр поглощения красителя Конго Красного изменяется при взаимодействии с амилоидными фибриллами - максимум поглощения сдвигается от 498 нм в красную сторону на 40-50 нм (Рпс! е1 а1., 2007; РисМег

and Sweat, 1965). Мы исследовали образцы всех казеинов после модификации гомоцистеинтиолактоном.

Было показано, что у всех гомоцистеинилированных в описанных выше условиях казеинов пик свободного Конго Красного пропадает, однако выраженных изменений спектральных характеристик выявить не удается.

Исключением является к-казеин, для которого ранее была показана способность к формированию амилоидных фибрилл (Ecroyd et al., 2008; Lencki, 2007). В течение нескольких часов после начала модификации к-казеина гомоцистеинтиолактоном не удается выявить выраженных изменений спектра поглощения Конго Красного. Однако более длительная модификация (24 часа) к-казеина приводит к появлению четко выраженного пика поглощения с максимумом около 540 нм (Рис. 8), что указывает на. постепенное формирование амилоидных структур.

■ — свободный Конго красный - — контрольный к-казеин + Конго красный

----к-казеин модиф. 3 часа + Конго красный

к-казеин модиф. 24 часа + Конго красный

Рис. 8. Спектры поглощения Конго Красного при связывании с гомоцистеинилированным к-казеином.

400 450 500 550 600 650 700

Длина волны,нм

Для исследования морфологии полученных после гомоцистеинилирования агрегатов казеинов была использована флуоресцентная микроскопия в присутствии тиофлавина Т и электронная микроскопия.

В случае aSl- и ß-казеинов наблюдаются практически только крупные частицы правильной сферической формы, диаметром 2-3 микрометра (по данным флуоресцентной микроскопии). У к-казеина характер агрегации несколько другой: популяция агрегатов более разнородна, наряду с крупными встречаются также более мелкие агрегаты неправильной формы (данные флуоресцентной микроскопии, Рис. 9А). На Рис. 9Б-9Д показаны результаты электронной микроскопии для гомоцистеинилированного к-казеина. В данном случае можно видеть разную степень агрегации, от пучка фибрилл длиной несколько сотен нанометров до более крупных агрегатов.

Эти данные позволяют сделать заключение, что агрегация к-казеина идет по амилоидному пути, что согласуется с отсутствием сдвига максимума собственной флуоресценции триптофана для этого типа казеина и с данными о

формировании после гомоцистеинилирования амилоидных фибрилл (по данным об изменении спектров поглощения Конго Красного).

Рис. 9. Флуоресцентная (А) и электронная (Б-Е) микроскопия гомоцистеинилированного к-казеина после 24-часовой реакции с гомоцистеинтиолактоном при 37°С. А-Д - гомоцистеинилированные препараты, Е - контрольный препарат.

4. Исследование действия_различных концентраций

фосфатнднлинозитола на мономерную и олигомерную форму приона

В данной части работы мы попытались исследовать, по какому пути идет агрегация в .случае термообработки и при взаимодействии прионов с фосфолипидами.

Из литературы известно, что при определенных условиях термообработки должны образовываться промежуточные малые олигомеры приона, проявляющие нейротоксичные свойства (Silveira et al., 2005; Simoneau et al., 2007). С помощью метода ДЛС было показано, что при термообработке при в течении часа бОмкМ раствора приона в 20мМ MOPS буфере, рН 7,2, образуются термоагрегаты размером около 7,5 нм (Рис.10, слева).

Гидродинамический диаметр, нм

Рис. 10. Характеристика используемых малых олигомеров приона. Показаны гидродинамический диаметр (слева, ДЛС) и спектры флуоресценции тиофлавина Т (справа) условных единицах) для нативного (пунктирная линия) и термоагрегированного при 65°С в течении часа бОмкМ приона в 20мМ MOPS буфере, рН 7,2.

Как уже было сказано, одним из методов, свидетельствующих об амилоидогенности белка, является флуоресценция связанного тиофлавина Т. На Рис. 10 можно видеть, что термоагрегированные малые олигомеры приона связывают тиофлавин Т и вызывают его флуоресценцию.

Для исследования взаимодействий приона и липидов' был выбран фосфатидилинозитол, заметно стимулирующий агрегацию приона. Было исследовано влияние концентрации фосфатидилинозитола на размеры таких агрегатов. Было установлено, что 0,5 мкМ ФИ не изменяет размер олигомеров. Инкубация приона с 5 или 500 мкМ фосфатидилинозитола вызывает увеличение размера частиц до 200 и 250 нм, соответственно (рис. 11). Инкубация с 500 мкМ ФИ приводит к существенному росту наблюдаемого размера мицелл с 8,7 до 50 нм (рис. 11). Таким образом, при инкубации с высокими концентрациями фосфатидилинозитола образуются смешанные мицеллы, предохраняющие прион от избыточной агрегации.

Прион + 50 мкМ ФИ (осадок)

■А Прион + 5 мкМ ФИ Прион + 0,5 мкМ ФИ

■* Прион + 500 мкМ ФИ

|> 500 мкМ ФИ Прион

60 90 Время, мин

> Прион + 50 мкМ ФИ ' Прион + 5 мкМ ФИ

< Прион + 500 мкМ ФИ Прион + 0,5 мкМ ФИ

Прион олигомер

Прион мономер"

7500 мкМ ФИ

40 60 80 100 120 Время, мин

Рис. 11. Гидродинамический диаметр частиц, образующихся при взаимодействии нативного мономера приона (слева) и малых олигомеров приона (справа) с фосфатидилинозитолом (ФИ) в разных концентрациях.

Изучение вторичной структуры агрегатов приона показало практически полное сохранение а-спиральных структур в крупных агрегатах, получаемых

при взаимодействии приона с 0,5 или 5 мкМ фосфатидилинозитола. Напротив, небольшие агрегаты, получаемые в присутствии 500 мкМ ФИ демонстрируют повышенное содержание р-структур (Таблица 3), характерное для амилоидных форм приона. Таким образом, обширная агрегация в случае применения 0,5 или 5 мкМ фосфатидилинозитола ингибирует образование элементов Р-структуры, либо дестабилизирует ее. Образование элементов р-структуры более эффективно происходит в небольших агрегатах. Это может быть общим свойством приона, поскольку такой же структурный переход наблюдается у небольших агрегатов приона, связанных с медью (ТБ^о^шкот а]., 2006). Таблица 3. Характеристическое для р-слоев соотношение 0218нм/02О7нм Для системы прион - фосфатидилинозитол.__

Концентрация фосфатидилинозитола, мкМ 0218нм/02О7нм

0 0,97

0,5 0,92

5 1,02

500 1,38

Полученные результаты показывают, что в зависимости от концентрации, фосфолипиды могут совершенно по-разному влиять на образование амилоидных структур.

5. Модификация приона гомоцистеинтиолактоном

В данной части работы перед нами стояла задача проверить, вызывает ли гомоцистеинилирование амилоидогенную агрегацию приона, а также изучить влияние образования дисульфидных связей на агрегацию приона.

I Рис. 12. Электрофореграмма фракций приона

при гомоцистеинилировании 100-кратным избытком тиолактона.

45 ц.,,»,^,»«,. лши» 1 - нативный прион до модификации,

,, ...., - ■ -.. 2 - супернатант после модификации,

3 - осадок после модификации,

4 - осадок после модификации при обработке 2«им»Ш0* р-меркаптоэтанолом

' -1. ...

12 3 4

Нами было показано, что при добавлении гомоцистеинтиолактона к раствору приона происходит его агрегация, проявляющаяся в увеличении мутности раствора. На Рис. 12 можно видеть, что при анализе осадка с помощью ДСН-электрофореза по Лэммли в невосстанавливающих условиях (дорожка 3) прион обнаруживается в виде мономеров, димеров и других олигомеров. В то же время, в супернатанте прион остается в такой же мономерной форме, как и в контрольном образце. Эти данные свидетельствуют

о том, что при гомоцистеинилироваиии приона происходит ассоциация белковых молекул за счет образования дисульфидных связей между SH-группами включенных в состав белка остатков гомоцистеина. В аминокислотной последовательности приона насчитывается 10 остатков лизина, следовательно, можно предполагать множественное гомоцистеинилирование. Все полученные эффекты исчезают при добавлении в пробы для электрофореза (З-меркаптоэтанола.

Было показано, что в этих условиях при гомоцистеинилироваиии приона в среднем на молекулу белка приходится 1,9+0,1 SH-группы, что свидетельствует о включении около 2 остатков гомоцистеина на мономер казеина. Однако, на самом деле эффективность включения может быть несколько выше, так как часть агрегатов не растворяется даже в 8М гуанидингидрохлориде и не может быть проанализирована в этом эксперименте. Проведение аналогичных манипуляций с контрольным немодифицированным прионом показало, что восстановление 5 мМ Р-меркаптоэтанолом не приводит к восстановлению внутренней дисульфидной связи между двумя собственными цистеинами в составе приона.

Для подтверждения включения гомоцистеина в молекулы приона был проанализирован димерный продукт реакции гомоцистеинилирования в сравнении с контролем методом масс-спектрометрического анализа (MALDI-TOF). Результаты анализа представлены на Рис.13. Для модифицированного приона после расщепления трипсином предполагали наличие пептидов с массой, отличающейся от такого же контрольного на массу гомоцистеина.

23 LCjfepKPGGGWNTGGSi&PGQGSPGGNi&PPQGGGGWGQPHGGGWGQ 70

PHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGGWGQGGSKSQWNKESKPKT 110

Mtffl^lVAGAAAAGAWGGLGGYMbGSVMSRPLIHFGHDYED 150

MYlilNMYQYPNQVYYRPVDRYSNQNNFVHDCVNITVKQH 190 TVTTTT^GENFTETDI^iMERWEQMCITQYQ^SQAYYQiiGAS

234

Рис. 13. Подтверждение наличия модификации с помощью масс-спектрометрии. Анализ последовательности овечьего приона (база данных SwissProt, № Р23907) [www.expasy.org] с помощью полученных после MALDI-TOF фрагментов. Все возможные сайты расщепления трипсином указаны стрелками. Лизины отмечены серым цветом, модифицированный 197 остаток лизина обведен. Последовательность 41-159 а.о., недоступная для анализа вследствие ограничений данного метода, подчеркнута.

В связи с ограничениями метода, из присутствующих в прионе 10 остатков при данном методическом подходе можно определить гомоцистеинилирование только 5 остатков - 26, 29 и 188, 197, 207.

Нами было обнаружено гомоцистеинилирование по 197,207 и, возможно, 188 остаткам лизина, причем модификации подвергалась только часть остатков в популяции молекул приона. Очевидно, что такая модификация является достаточной для образования димеров, которые были подвергнуты анализу. Возможно, что более крупные ассоциаты гомоцистеинилированных прионов подвергаются более полной модификации.

Агрегацию приона исследовали методом ДЛС. На Рис. 14. можно видеть, что модификация в условиях 100-кратного избытка гомоцистеинтиолактона на остаток лизина белка ведет к образованию крупных (с гидродинамическим диаметром около 1000 нм) агрегатов приона. Образование агрегатов не является следствием изменения окружения белковых молекул, так как использование в качестве контроля аналогичных количеств цистеина не привело к увеличению размера частиц (данные не показаны). При использовании более низких концентраций (50-кратный избыток гомоцистеинтиолактона на остаток лизина белка) реагента, размер агрегатов несколько уменьшается (до нескольких сотен нанометров), а при использовании 25-кратного избытка в кинетике реакции появляется лаг-период, то есть агрегаты начинают появляться только после часа инкубации с реагентом.

При исследовании поведения приона в условиях 10-кратного избытка реагента на остаток лизина, было показано, что в таких условиях не происходит

Рис. 14. Гидродинамический диаметр гомоцистеинилированного при разных концентрациях гомоцистеинтиолактона (1 -10-кратный избыток в расчете на остаток лизина белка, 2 - 25-кратный, 3 - 50-кратный, 4 - 100-кратный) приона, полученный с помощью метода динамического светорассеяния.

6. Исследование амилоидогенной конверсии. вызванной гомоцистеинилированием

Для детекции изменений в структуре модифицированного приона был использован метод инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (Рис. 15). В спектре белка анализировали первую амидную полосу 16101690 см"1, которая соответствует колебаниям связи С=0. Из полученных

• • •........•.....

■Л-4—.Л 1

20 . 40 60 80 100

С ЛЛНА ими

спектров видно, что нативный прион дает широкий пик с максимумом на 1650 см"1, что соответствует наличию а-спиралей и неорганизованной структуры.

На спектре гомоцистеинилированного приона появляются две полосы, расположенные на 1617 и 1678 см"1, которые показывают наличие антипараллельных (3-слоев. В то же время интенсивность полосы, характеризующей а-спирали и неорганизованную структуры, снижается.

Расположение пика ниже 1620 см'1 говорит о формировании более сильных водородных связей в межмолекулярных (3-слоях, что является характеристичным признаком для амилоидных структур (КПббоп, 2004).

Модификация 10-кратным избытком гомоцистеинтиолактона ведет к значительным изменениям во вторичной структуре белка.

длина волны /см'1

& 2,0x10'

■&

Л 1,0x10'

Термоагрегированный прион /' ч

100-кратный реагент

-кратный реяйцт

, ' . Приор. . ~ - „

460 480 500 520 540 560 580 600

длина волны /см'1

Рис. 15. Характеристика амилоидогенных изменений в структуре гомоцистеинилированного приона. Показаны ИК-спектры (слева, модифицированный прион показан толстой линией) и спектры флуоресценции тиофлавина Т (справа) для нативного и модифицированного приона.

На Рис. 15 (справа) представлены спектры флуоресценции тиофлавина Т гомоцистеинилированных белков при возбуждении светом с длиной волны 435 нм. В случае модификации приона 100-кратным избытком гомоцистеинтиолактона в расчете на остаток лизина можно видеть интенсивность флуоресценции, сопоставимую с контрольной, то есть можно сделать вывод, что гомоцистеинилирование приводит к амилоидогенной конверсии белка.

Протеолиз протеиназой К является одним из индикаторов перехода приона в патологическую конформацию, так как обогащенная (3-слоями форма демонстрирует повышенную устойчивость к расщеплению этим ферментом. Мы исследовали активность расщепления протеиназой К гомоцистеинилированного приона в сравнении с термоагрегированным, также как в случае измерения флуоресценции тиофлавина Т. Было показано, что модификация приона приводит к заметному увеличению устойчивости белка (Рис. 16)

97 «»»«а»_Контроль_Гомоцисгеинилированный Термоагр.

66 прион прион

■ 45

О 5' 10' 40' 0 5' 10' 40' 0 5' 15'

Рис. 16. Устойчивость гомоцистеинилированного приона к расщеплению протеиназой К

При анализе трехмерной структуры структурированной части последовательности приона обнаружено, что все остатки лизина экспонированы в раствор и доступны для модификации. Два из них участвуют в поддержании структуры белка - лизин 207 образует солевой мостик с глутаматом 207, повышая стабильность 3-ей спирали (Рис. 17). Лизин 197 взаимодействует с глутаматом 199, поддерживая конформацию петли. Сравнив структуры мономерной и димерной формы приона, можно предположить, что при димеризации изменяется конформация именно этой петли. Таким образом, модификация лизина 197 должна приводить к дестабилизации нативной конформации приона и облегчать ее переход в патологическую форму.

Учитывая важность 197 и 207 лизинов в поддержании нативной структуры приона и полученные масс-спектрометрические данные, подтверждающие наличие модификации 197 и 207 лизинов, можно предположить, что возможный механизм перехода приона в амилоидную форму при гомоцистеинилировании включает участие этих остатков.

Рис. 17. Трехмерная структура структурированного участка приона (РОВ Ш luwЗ)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе было охарактеризовано влияние образования дисульфидных связей на агрегацию и структуру естественно развернутых белков приона и казеина.

В экспериментах с очищенными препаратами рекомбинантных форм (3-казеина было показано, что при внедрении цистеина Р-казеин приобретает способность к димеризации, причем С-концевой мутант димеризуется легче, чем М-концевой. Использование гомоцистеинилирования, как инструмента для внедрения большего количества цистеинов, позволило выявить особый характер агрегации казеинов, являющихся представителями группы естественно развернутых белков. Так, при гомоцистеинилировании к-казеин демонстрирует амилоидный тип агрегации и формирует фибриллы.

Для рекомбинантного овечьего приона было проведено исследование агрегации под действием таких факторов, как температура, различные концентрации фосфолипидов и гомоцистеинилирование. Данное исследование позволило установить, что, в зависимости от концентрации, фосфолипиды способны направлять агрегацию приона по разным путям: как с патологическим изменением структуры, так и без возникновения изменений такого рода.

выводы

1. При введении остатков цистеина в (3-казеин он приобретает способность к димеризации, причем С-концевой мутант С208 димеризуется более эффективно, чем N-концевой С4.

2. Гомоцистеинилирование нативных aSl- и р-казеинов приводит к формированию крупных сферических агрегатов, содержащих казенны с измененной структурой, а гомоцистеинилированный к-казеин демонстрирует амилоидоподобные свойства и формирует фибриллы.

3. Термоагрегация приона приводит к амилоидогенной трансформации через образование малых олигомеров.

4. В зависимости от концентрации, фосфатидилинозитол может либо приводить к амилоидогенной агрегации приона в случае мицеллярных концентраций (500 мкМ), либо вызывать образование крупных аморфных агрегатов с неизмененной структурой для концентраций 0,5 - 50 мкМ.

5. Гомоцистеинилирование приона приводит к агрегации, сопровождающейся изменениями структуры амилоидогенного характера.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ТО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Tsiroulnikov К., Shchutskaya Y., Muronetz V., Chobert J.M., Haertle Т. (2009). Phospholipids influence the aggregation of recombinant ovine prions. From rapid extensive aggregation to amyloidogenic conversion. Biochim Biophys Acta, 1794(3), 506-511.

Yousefi R., Shchutskaya Y.Y., Zimny J., Gaudin J.C., Moosavi-Movahedi A.A., Muronetz V.I., Zuev Y.F., Chobert J.M., Haertle T. (2009). Chaperone-like activities of different molecular forms of beta-casein. Importance of polarity of N-terminal hydrophilic domain. Biopolymers, 91(8), 623-632.

Gaudin J.C., Le Pare A., Castrec В., Ropers M.H., Choiset Y., Shchutskaya J., Yousefi R„ Muronetz V.I., Zuev Y., Chobert J.M., Haertle T. (2009). Engineering of caseins and modulation of their structures and interactions. Biotechnol Adv, 27(6), 1124-1131.

Щуцкая Ю.Ю., Эртле Т., Муронец В.И. Гомоцистеинилирование как физиологическая модификация приона с амилоидогенным эффектом. (2009) Тезисы IV Российского симпозиума «Белки и пептиды», Казань, с. 367.

Заказ№ 77-а/10/10 Подписано в печать 13.10.2010 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1

, ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Стройлова (Щуцкая), Юлия Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Механизм агрегации белков.

Естественно развернутые белки.

Агрегация, как причина прионных заболеваний.

Структура и свойства казеинов.

-казеин. а82-казеин. р-Казеин. к-Казеин.

Образование мицелл.

Гомоцистеинилирование как физиологическая посттрансляционная модификация белков.

Гомоцистеин, его свойства и метаболические превращения в клетке.

Гипергомоцистеинемия и ее роль в патологических процессах.

Пути гомоцистеинилирования белков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы.

Получение разных форм приона.

Экспрессия.

Очистка.

Экстракция.

Аффинная хроматография.

Хранение.

Термоагрегация приона.

Агрегация приона при взаимодействии с фосфатидилинозитолом.

Гомоцистеинилирование приона.

Получение разных форм казеинов.

Разделение нативных а81, р, к-казеинов молока с помощью анионобменной хроматографии.

Получение разных форм рекомбинантного Р-казеина.

Экспрессия рекомбинантного Р-казеина.

Очистка.

Экстракция белков.

Хроматографическая очистка.

1) Обратнофазовая хроматография.

2) Анионобменная хроматография.

3) Повторная обратнофазовая хроматография.

Димеризация мутантных форм рекомбинантного Р-казеина.

Протеолиз пепсином и трипсином.

Гомоцистеинилирование нативных казеинов.

Методы исследования структуры белков и их агрегатов.

ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле.

Гель-фильтрация.

Метод динамического лазерного светорассеяния (ДЛС).

Круговой дихроизм.

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (ИКспектроскопия).

Флуоресцентная спектроскопия.

Абсорбционная спектроскопия с Конго красным для выявления амилоидов.

Количественный анализ включения гомоцистеина с помощью метода определения БН-групп по Эллману.

Масс-спектрометрия методом ионизации в электроспрее.

Масс-спектрометрия МА1ЛЭ1 ТОБ.

Электронная микроскопия.

Атомно-силовая микроскопия.

Флуоресцентная микроскопия.

Расщепление протеиназой К.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение агрегации казеинов.

Получение препаратов:. а) разделение казеинов молока. б) получение и очистка цистеинилированных мутантов.

Масс-спектрометрия.

Исследование свойств мутантов.

Димеризация К- и С-концевых мутантов казеина.

Мультимеризация двойного мутанта С4-208.

Изучение влияния димеризации на процесс образования мицелл методом ДЛС.

Изучение влияния димеризации и мицеллизации на вторичную структуру казеина методом кругового дихроизма (КД).

Протеолиз трипсином.

Расщепление пепсином.

Гомоцистеинилирование нашивных казенное молока.

Характеристика использованных препаратов казеина.

Изменение агрегационного состояния казеинов после гомоцистеинилирования.

Количественное определение содержания остатков гомоцистеина в препаратах ß-казеина.

Измерение собственной триптофановой флуоресценции и использование флуоресцентных зондов для выявления структурных изменений казеинов при гомоцистеинилировании.

Флуоресценция ANS.

Взаимодействие казеинов с красителем Конго Красным.

Изучение морфологии гомоцистеинилированных агрегатов казеинов с помощью флуоресцентной микроскопии.

Трансмиссионная электронная микроскопия гомоцистеинилированных казеинов.

Изучение агрегации приона.

Получение и выделение рекомбинантного овечьего приона.

Исследование термоагрегации приона, получение и характеризация свойств малых патологических олигомеров.

Электронная микроскопия агрегатов приона.

Исследование влияния липидов на амилоидогенную конверсию.

Размер прион-липидных агрегатов.

Вторичная структура агрегатов приона.

Исследование амилоидогенной конверсии, вызванной гомоцистеинилированием.

Подтверждение и качественное определение модификации.

Количественный анализ эффективности включения гомоцистеина в прион.

Анализ наличия гомоцистеина в составе модифицированного приона методом масс-спектрометрии.

Агрегация приона в процессе гомоцистеинилирования.

Изучение изменений во вторичной структуре гомоцистеинилированного приона.

Амилоидогенная конверсия модифицированного приона.

Повышение устойчивости гомоцистеинилированного приона к действию протеиназы К.

Морфология агрегатов гомоцистенилированного приона.

Трансмиссионная электронная микроскопия гомоцистеинилированного приона.

Роль некоторых лизинов приона в обеспечении устойчивости его структуры.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль агрегации и образования дисульфидных связей в формировании амилоидных структур естественно развернутыми белками: прионом и казеином"

В течение долгого времени процесс агрегации белков практически не исследовали, считая ее скорее неприятным препятствием, возникающим при изучении белков, однако сейчас ситуация изменилась. Основной причиной всплеска интереса к этим процессам является то, что накопление белковых агрегатов в клетке ведет к развитию нейродегенеративных заболеваний.

В последние годы стало известно, что белки могут быть функционально активны не только в глобулярном, но и в частично или полностью развернутом состоянии.

Глобулярную структуру в нативном состоянии имеют в основном ферменты - белки, функция которых строго детерминирована. Белкам, взаимодействующим с большим числом партнеров, для функционирования требуется гораздо большая лабильность, и макромолекулы таких белков в нативном состоянии частично или полностью не структурированы.

Компактные глобулярные белки образуются в том случае, если полипептидная цепь обеспечивает существование сильных внутримолекулярных взаимодействий.

Многие частично или полностью неупорядоченные белки могут образовывать компактную структуру в комплексах со своими партнерами, которые образуются за счет межмолекулярных взаимодействий атомов полипептидной цепи белка и его партнера.

Межмолекулярные взаимодействия белковых молекул между собой могут приводить к образованию ассоциатов, аморфных агрегатов, амилоидоподобных и амилоидных фибрилл. Для возникновения таких контактов необходимо наличие гидрофобных участков полипептидной цепи, экспонированных растворителю. Поэтому агрегация частично или полностью неупорядоченных белков более вероятна по сравнению с глобулярными белками и представляет особый интерес в связи с изучением амилодных заболеваний.

Патологическая агрегация приона и его переход в амилоидную форму вызывают прионную болезнь, а некоторые казенны, в частности, к-казеин, в определенных условиях также способны к образованию амилоидных фибрилл. Таким образом, казенны являются удачной модельной системой для исследования агрегации неструктурированных белков.

Перед нами стояли следующие задачи:

- Исследовать влияние температуры и образования дисульфидных связей на мицеллизацию и структуру казеина;

- Исследовать амилоидогенную агрегацию приона под действием температуры и фосфолипидов;

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Механизм агрегации белков

Процесс агрегации белков в настоящее время является популярным объектом исследований^ так как агрегаты являются одним из важных природных состояний белка (Fink, 1998, Horwich, 2002). Например, экспрессия рекомбинантных белков ведет к образованию так называемых тел включения, и выход получаемого белка снижается из-за его агрегации (Маркосян и Курганов, 2004). Также увеличение количества исследований, посвященных агрегации, было вызвано открытием особых белков -шаперонов, способных ее предотвращать. Их синтез увеличивается в случае теплового шока, вызывающего агрегацию белков клетки, а основная функция - обеспечение правильного сворачивания белков, фолдинга. Исследования, посвященные агрегации модельного белка в присутствии " белка, ее предотвращающего, дают информацию как о самой агрегации, так и о механизмах работы шаперонов (Bumagina е/ <з/., 2010, Khanova et al., 2007, Khanova et al., 2005, Markossianet al:, 2009, Markossian et al., 2009).

Но основной причиной интереса к этому процессу является то, что накопление определенных белковых агрегатов в клетке ведет к развитию нейродегенеративных заболеваний. Такие типы агрегатов называют амилоидными, и они обладают сходной структурой даже несмотря на то, что они могут состоять из различных белков (Mazzola and Sirover, 2003).

Тепловая денатурация обычно сопровождается агрегацией белковых молекул. Такая агрегация является результатом взаимодействий между несвернутыми молекулами белка, ведущих к образованию агрегатов неправильной формы путем «неверных» слипаний. Денатурация белков сопровождается экспонированием гидрофобных остатков, то есть движущей силой агрегации являются гидрофобные взаимодействия.

Белковые агрегаты обладают повышенной способностью к рассеиванию света по сравнению с исходными мономерами, поэтому за кинетикой агрегации белков удобно следить по изменению светорассеяния в видимой части спектра (Со1иЬ е/ а/., 2009). Согласно литературным данным, строгая пропорциональность между оптической плотностью и количеством агрегировавшего белка наблюдается только в стадии роста уже сформировавшихся агрегатов (Курганов, 2002).

Принято считать, что что агрегация это необратимая реакция, в которую вступают п молекул неагрегировавшего белка: где Paggr — агрегированное состояние белка, а к — константа скорости 11-ого порядка.

Для множества белков на кривой агрегации можно наблюдать период запаздывания. Это означает, что этап разворачивания предшествует стадии агрегации.

N->и

Где N - нативное состояние белка, а и - развернутое состояние белка с повышенной склонностью к агрегации.

К настоящему моменту охарактеризованы два возможных механизма роста агрегатов. Первый заключается в прилипании денатурированных молекул белка к сформировавшемуся агрегату. С помощью анализа кинетических кривых было показано, что существует стадия, когда мономер белка исчезает со скоростью, пропорциональной концентрации белка в 1 степени.

Этот процесс можно описать с помощью модели ассоциации белков, которая включает стадию формирования ядра ассоциации - этап нуклеации, а также две обратимых стадии: стадию нуклеации пМ <г±Мп

М— мономер, Мп - ядро ассоциации) и стадию роста ассоциата: м,. + М «-» Мм

С другой стороны, увеличение размера агрегатов происходит путем слияния уже сформированных.

В определенной степени форма кинетических кривых агрегации зависит от концентрации белка. Для белка оболочки вируса табачной мозаики было показано, что в зависимости от концентрации белка отличаются лимитирующие стадии (ЯаАкоуа е/ а1, 2003). Для относительно низких концентраций такой стадией является стадия роста агрегата, а для более высоких - стадия предшествующей денатурации белка. Интересно, что размер агрегатов не зависит от концентрации белка, что было продемонстрировано в случае алкогольдегидрогеназы (Курганов е? а1., 2002).

Какие факторы могут влиять на процесс агрегации? Можно сказать, что к ним можно отнести все изменения в конформации белка, приводящие к экспонированию гидрофобных участков на поверхности белка. Например, изменение таких параметров среды, как рН, ионная сила или температура, могут провоцировать агрегацию белков. Часто, достаточно лишь небольшого изменения концентрации молекул, чтобы вызвать агрегацию. В случае патологических процессов агрегации, происходящих в живых клетках, изучение влияния различных параметров может дать важную информацию для понимания их механизмов.

Естественно развернутые белки

В 1962 году Джон Коудери Кендрю вместе с Максом Перуцем за исследование структуры глобулярных белков были удостоены Нобелевской премии по химии. Кендрю обнаружил нечто, чего никто ранее не видел, - это была трехмерная структура молекулы белка во всей ее сложности. Наиболее поразительной особенностью этой молекулы была ее упорядоченность и полное отсутствие симметрии.

Сейчас все больше данных говорят о том, что существуют белки, не обладающие хоть какой-то упорядоченной структурой. Их называют «белками с разупорядоченной третичной структурой» ("intrinsically disordered proteins", ГОР). Анализ белковой базы данных Swiss Protein Database показывает, что более 15 тысяч белков из этой базы могут содержать неупорядоченные регионы с длиной более 40 аминокислотных остатков. Более тысячи из этих белков по предсказанию имеют высокий показатель неупорядоченности (Dunker et al., 1998). Интересно, что в процессе эволюции эукариотические организмы «приобрели» больше ГОР, чем прокариоты. Так, в исследовании Дункера с соавторами было изучено 29 геномов и показано, что более 30% эукариотических белков содержат неупорядоченные участки протяженностью более 50 аминокислотных остатков (Dunker et al., 2001).

При использовании различных денатурирующих агентов или условий (таких, например, как температура) были определены четыре разные конформации глобулярных белков: нативная (полностью упорядоченная), расплавленная глобула ("molten globule") (Ptitsyn, 1995), ее предшественник -пред-расплавленная глобула ("pre-molten-globule state") (Ptitsyn, 1995, Uversky and Ptitsyn, 1996) и полностью развернутая конформация.

Расплавленная глобула характеризуется отсутствием выраженной кооперативно плавящейся третичной структуры, однако белок в этом состоянии продолжает сохранять глобулярную структуру, как было показано, например, на лактальбумине с использованием малоуглового рентгеновского рассеяния (Kataoka et al., 1997). Кроме того, было установлено, что в состоянии расплавленной глобулы происходит увеличение гидродинамического радиуса на 15% по сравнению с нативным состоянием, что соответствует увеличению объема на -50% (Uversky, 2002).

Белки в состоянии пред-расплавленной глобулы (или «перерасплавленой» глобулы, если анализировать не сворачивание белка, а обратный процесс — его разворачивание) обладают менее компактной структурой, чем белки в состоянии расплавленной глобулы, но более компактной, чем в развернутом состоянии. При сравнении с нативным состоянием, гидродинамический объем белков в состоянии «перерасплавленой» глобулы возрастает в 3 раза, а в полностью развернутом состоянии - в 12 раз (Uversky, 2002).

В состоянии «перерасплавленой» глобулы белки продолжают взаимодействовать с гидрофобным зондом ANS, однако слабее, чем в состоянии расплавленной глобулы (Ptitsyn, 1995). В данном состоянии уже не идет речь о глобулярной структуре белка, поскольку разрушается часть гидрофобных кластеров, связывавших ANS.

Четыре состояния белка различаются по степени неупорядоченности структуры и их можно достаточно легко отличить друг от друга, используя некоторые физико-химические методы, перечисленные ниже (Uversky, 2002): Кристаллография (участки, которые не разрешаются данным методом, являются неструктурированными).

Гетероядерный ЯМР в нескольких измерениях. Круговой дихроизм (КД) в ближнем УФ.

7 f

КД в дальнем УФ.

Гидродинамические параметры, полученные с помощью гель-хроматографии, седиментационного анализа, вискозиметрии или динамического светорассеяния (ДЛС).

Флуоресцентные характеристики белка.

Повышенная доступность протеолизу.

Иммунохимические методы (антитела на разные состояния белка).

Дифференциальная сканирующая калориметрия (наличие или отсутствие кооперативных тепловых переходов на термограмме).

Применяя несколько из перечисленных выше методов и подходов, можно доказать наличие частично свернутых интермедиатов белка.

Остановимся кратко на терминологии, употребляемой для белков с частично или полностью неупорядоченной структурой. Термин «естественно денатурированный белок» ("natively denatured protein") был введен Швирзом в 1994 году для того, чтобы отличать Тау белки, обладающие повышенной гибкостью и подвижностью углеродного скелета, от глобулярных белков с упорядоченной третичной структурой (Schweers et al., 1994). Два года спустя в работе Вейнреба появился термин «естественно развернутый белок» ("natively unfolded protein") для описания а-синукпеина, представленного в растворе при физиологических условиях как развернутый белок (Weinreb et al., 1996). Существуют также альтернативные термины - «внутренне деструктурированные белки» ("intrinsically unstructured proteins" (Wright and Dyson, 1999)) и "внутренне неупорядоченные белки» ("intrinsically disordered proteins" (Dunker et al., 2001)). В случае синонимов следует проявлять некоторую аккуратность, т. к. термины «денатурированный» (denatured) и «неупорядоченный» (disordered) могут быть использованы как синонимы и описывать набор характеристических конформаций полипептидной цепи,

16 включающий конформации с разной степенью свернутости: расплавленная глобула, пред-расплавленная глобула и развернутая конформация. Термины «деструктурированный» (unstructured) и «развернутый» (unfolded) также являются синонимами, однако применяться они могут только в качестве характеристики отсутствия какой бы то ни было (или почти какой бы то ни было) упорядоченной структуры.

Отсутствие у белков выраженной упорядоченной структуры при физиологических условиях может отражать особенности их аминокислотной последовательности. Было установлено, что разупорядоченные области демонстрируют некоторые общие особенности первичной структуры, и более 15000 белков из белковой базы данных SwissProt наделены этими особенностями (Romero et al., 1998). Одной из таких особенностей является наличие большого количества нескомпенсированных зарядов при нейтральных рН и низкое содержание гидрофобных аминокислотных остатков (Gast et al., 1995, Hemmings et al., 1984):

В соответствии с определением Танфорда, молекула полимера обладает полностью разупорядоченной конформацией тогда, когда вокруг каждой отдельно взятой связи полимера возможно свободное вращение, свойственное для подобной связи в низкомолекулярном соединении. Результаты исследований белков в 6М гуанидингидрохлориде показали, что в этих условиях белки могут быть описаны, как не имеющие упорядоченной структуры (Uversky, 2002). Однако даже в таких условиях глобулярные белки сохраняют некоторое количество остаточной структуры, т.е. полипептидная цепь не достигает полностью развернутой конформации (Pappu et al., 2000). Исходя из названия, белки с разупорядоченной структурой характеризуются отсутствием какой бы то ни было (или почти какой бы то ни было) упорядоченной структуры. Однако, учитывая вышесказанное (а именно то, что глобулярные белки даже в жестких

17 денатурирующих условиях не всегда достигают полностью развернутого состояния), возникает резонный вопрос: насколько развернуты ГОР? В структурном аспекте ГОР отличаются от глобулярных белков большим гидродинамическим радиусом, низким содержанием упорядоченной вторичной структуры и высокой внутримолекулярной подвижностью, что следует из данных, полученных с помощью КД, РТ1Я, ЯМР, ДЛС, гель-хроматографии и многих других методов. Однако данные ЯМР четко показывают, что ГОР не образуют единую группу. Так, наряду с белками, не содержащими упорядоченной вторичной или третичной структуры, есть примеры белков, содержащих динамическую, подвижную структуру (в основном а-спиральную или р-складчатую) и даже белков, содержащих упорядоченные части (иуегеку, 2002).

Наиболее точной определяющей характеристикой конформационных состояний являются гидродинамические параметры. Зависимости гидродинамического объема от длины полипептидной цепи для разных состояний белка (нативное состояние, расплавленная глобула, пред-расплавленная глобула, белки, денатурированные 8М мочевиной или 6М гуанидингидрохлоридом, а также естественно разупорядоченные белки со структурой, подобной пред-расплавленной глобуле или с полностью неупорядоченной структурой) описываются линейными зависимостями и заметно отличаются одна от другой.

Денатурированная полипептидная цепь характеризуется довольно специфичной формой спектра КД в дальней ультрафиолетовой области. В области 200 нм (преимущественно неупорядоченные структуры и частично Р-складки) наблюдается значительный отрицательный максимум молярной эллиптичности, а в области 222 нм (преимущественно а-спирали) молярная эллиптичность приближается к нулю (Цуегэку е/ я/., 1999). Оказалось, что очень удобным способом для разделения ГОР на подклассы является

18 построение зависимости молярной эллиптичности при 200 нм против молярной эллиптичности при 222 нм. Такого рода построение позволяет разделить белки на 2 дискретных поля, одно из которых содержит ШР в полностью развернутом состоянии (coil-like), а второе (PMG-like) - IDP в состоянии, подобном пред-расплавленой глобуле.

В.Н. Уверским был проведен подобный анализ 100 белков, относящихся к семейству IDP, из них для 23 белков были известны гидродинамические параметры. Оказалось, что для IDP в полностью развернутом состоянии значения молярной эллиптичности составляют [0Ъоо = -189ОО±28ОО град*см *дмоль' и [0]222 = -170Ш:700 град*см2*дмоль~1 в то время как в состоянии, подобном пред-расплавленой глобуле, [0]2ОО = -Ю700±1300 град*см*дмоль~' и [9]222 = -3900±1100 град*см2*дмоль-1. Эти данные были сопоставлены с результатами, полученными с использованием гидродинамических методов, для подтверждения предложенного способа разделения IDP на два подкласса (Uversky, 2002). Вывод, который можно сделать, используя подобное построение, говорит о том, что семейство IDP делится на группу с практически полностью денатурированной структурой (состояние, подобное полностью денатурированному состоянию глобулярного белка) и на группу с остатками вторичной или третичной структуры (состояние, подобное пред-расплавленной глобуле). Этот вывод подтверждается данными измерений гидродинамических параметров и данными ЯМР.

Функциональная роль IDP может быть связана с необходимостью пластичности молекулы белка для эффективного узнавания молекул-партнеров (Dunker et al., 2001). Для некоторых IDP было показан переход из неупорядоченного состояния в упорядоченное в процессе функционирования (Dunker et al., 2001). Представляется вполне возможным, что существование белков с разупорядоченной третичной структурой можно объяснить

19 выгодной подвижностью структуры во время перехода таких белков из неупорядоченного состояния в упорядоченное по сравнению с глобулярными белками (Dunker et al, 1998, Dunker et al, 2001, Romero et al, 1998, Wright and Dyson, 1999). Среди выгод, которые могут обеспечить подобные особенности строения, можно выделить следующие: способность взаимодействовать с несколькими разными партнерами (Dunker et al, 2001, Wright and Dyson, 1999); возможность обойти стерические ограничения при связывании с партнером и значительно увеличить область контакта по сравнению с белками, обладающими жесткой структурой (Dunker et al, 2001, Meador et al, 1992); точный контроль и простая регуляция термодинамики связывания (Dunker et al, 2001, Wright and Dyson, 1999); повышенный уровень специфической, макромолекулярной ассоциации (Dunker et al, 2001); сниженное время жизни IDP в клетках и, следовательно, дополнительный механизм регуляции важных клеточных каскадов (Wright and Dyson, 1999).

В работе П. Томпы отмечается, что ШР не обладают энзиматической активностью, т.к. для ее проявления необходимо плотно свернутое состояния участков активного центра (Тошра, 2002). Автор выделяет 5 функциональных классов IDP:

Энтропийные цепи. Например, линкерная область белка SNAP-25, выполняющая функцию объединения в белке.

Эффекторы. Например, кальпастатин, который ингибирует кальпаин при проведении сигналов, опосредованных ионами Ca2f.

Мусорщики». Например, казенны, которые формируют кластеры, депонирующие кальций, и предотвращают сворачивание молока.

Сборщики». Например, кальдесмон, ускоряющий полимеризацию актина.

Неупорядоченные участки белков, играющие определенную роль в различных регуляторных процессах (таких, как протеолитическое расщепление белков по этим участка или их фосфорилирование).

Следует, однако, отметить, что выделение ферментативного функционального класса все-таки вполне возможно, т.к. есть данные относительно лизоцима, у которого около половины молекулы является неупорядоченной, а также ДНК-топоизомеразы I, которая, как и лизоцим, принадлежит к семейству ГОР. Не исключено, что со временем будут описаны и другие ГОР, обладающие ферментативной активностью.

Особенности, которые демонстрируют белки с разупорядоченной третичной структурой, вероятнее всего закладываются в их первичной структуре (Uversky, 2002). Было выяснено, что ГОР содержат значительно большее количество пролина, лизина, серина, глутамина и глутаминовой кислоты, чем глобулярные белки. В то же время, содержание таких аминокислот, как триптофан, тирозин, фенилаланин, цистеин, изолейцин, лейцин и аспарагин, сильно снижено в ГОР по сравнению с глобулярными белками (Тошра, 2002). Такого рода дисбаланс в аминокислотном составе как раз и объясняет отличия ГОР от глобулярных белков. Анализ аминокислотного состава напрямую показывает, что ГОР действительно содержат меньшее количество гидрофобных аминокислот. Следовательно, белковая глобула не стабилизируется гидрофобными взаимодействиями, а избыточный заряд еще сильнее дестабилизирует структуру подобных белков.

Таким образом, важным признаком ГОР являются высокий заряд молекулы и относительно низкая гидрофобность; однако надо отметить, что именно эти их особенности обеспечивают некоторые дополнительные

21 свойства IDP, а именно способность предотвращать агрегацию различных белков-субстратов (Uversky et al., 2000). Как указывалось выше, IDP содержат повышенное количество пролина и глутамина. Эти аминокислоты препятствуют образованию вторичной структуры, будь то ß-складки или а-спирали. Однако именно для белков с высоким содержанием пролина было показано формирование специфической вторичной структуры - левозакрученная полипролиновая спираль второго типа (Ш12) (Williamson, 1994). Подобная структура была описана для белка тау, синуклеина и казеина (Syme et al., 2002). Данная конформация предпочтительна и важна для молекулярного узнавания, т.к. в ней отсутствуют внутрицепочечные водородные связи и она легко переходит в другие конформации. Кроме того, пролин довольно часто вовлекается в белок-белковые взаимодействия (Williamson, 1994). Однако, в этой «сильной стороне» IDP скрывается и немалая опасность, поскольку конформация ПП2 довольно легко переходит в ß-складчатую структуру, а также склонна к образованию амилоидов (Wright and Dyson, 1999), что было показано, в частности, для белка тау (von Bergen et al., 2000).

В завершение этого раздела обзора литературы следует отметить, что условия, при которых исследуются IDP, крайне важны, т.к. даже небольшие изменения состава среды могут приводить к значительным изменениям свойств белка. Так, например, протимозин а и а-синуклеин частично сворачиваются в присутствии ионов двухвалентных металлов (Zn ) (Uversky, 2002, Uversky et al., 2002). Подобные эффекты можно наблюдать при повышении ионной силы, изменении pH и т.д.

Агрегация, как причина прионных заболеваний

Известна связь прионов и их агрегатов с хроническими нейродегенеративными заболеваниями, такими как скрейпи у овец, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота, а также куру, болезнь Крейцфельда-Якоба, синдром Герстманна-Штройслера-Шейнкера и хроническая семейная бессонница у человека.

Прионные заболевания были известны с начала XVIII столетия и описаны одновременно, и как наследственные, и как инфекционные. К числу инфекционных заболеваний относятся такие болезни, как куру, скрейпи и губчатая энцефалопатия коров, тогда как синдром Крейцфельда-Якоба и синдром Герстманна-Штройслера-Шейнкера в большинстве случаев имеют наследственную основу. Сейчас известно, что большинство прионных болезней человека и животных имеют, экзогенный и генетический компоненты, то есть иметь одновременно как наследственное, так и инфекционное происхождение (Покровский, 2004).

На данный момент все нейродегенеративные заболевания прионной природы являются неизлечимыми и, в конце концов, неминуемо ведут к смерти больного.

Прорыв в понимании природы данных заболеваний произошёл только в начале 80-х гг. прошлого века, когда было установлено, что инфекционный агент, вызывающий эти нейродегенеративные болезни является белком РгР (Oesch et al., 1985, Prusiner, 1994, Prusiner and DeArmond, 1991, Prusiner et al., 1998). РгР является некрупным белком с молекулярной массой всего 23 кДа и длиной 254 аминокислотных остатка.

Функции белков РгР до конца не установлены. Некоторые исследователи указывают на способность РгР связывать ионы меди и других двухвалентных металлов (Aguzzi and Polymenidou, 2004). Высказываются также предположения, что РгР может участвовать в сигнальных каскадах индукции апоптоза (Aguzzi and Polymenidou, 2004). У мышей, лишенных кодирующего этот белок гена (PRNP) не отмечено изменений в поведении и репродуктивной активности, вместе с тем на энцефалограмме проявляются нарушения долговременных потенциалов и дефекты в подавлении активности GABA-зависимых потенциалов. Кроме этого, у таких мышей описаны электрофизиологические изменения в области гиппокампа (Kawahara et al., 2000).

В клетках РгР, как и большинство белков, синтезируется в виде предшественника, подвергающегося в последующем протеолитическому расщеплению и посттрансляционной модификации. В процессе созревания от белка предшественника. РгР последовательно отщепляются N-концевая сигнальная последовательность и С-концевой гидрофобный сегмент, после чего присоединяется- гликофосфатидилинозитол, который интегрируется в липидный бислой и выполняет функцию мембранного якоря РгР. Белок РгР может существовать в виде двух конформеров. РгР - нормальный белок, и PrPSc - его инфекционная форма. Попадая в организм, PrPSc каким-то, ещё до конца не установленным образом, переводит постоянно присутствующий в норме в клетках и тканях РгРс в его инфекционную форму PrPSc, а также увеличивает продукцию белка РгР в клетке (Sabuncu et al., 2003). В результате этого происходит накопление патогенного PrPSc, молекулы которого агрегируют, вызывая дегенерацию тканей мозга.

На настоящий момент пространственная структура неинфекционной формы РгР подробно изучена, хотя, с момента открытия белка она долго оставалась нерасшифрованной. Низкий уровень экспрессии РгР в различных системах, а также его плохая растворимость долгое время делали невозможной расшифровку его пространственной структуры методом рентгеноструктурного анализа. В 1993-1995 гг. в лаборатории S.B. Prusiner

24 был проведён детальный анализ вторичной структуры прионов и их клеточных гомологов с применением инфракрасной и Фурье-спектроскопии. В этих ранних экспериментах было показано, что инфекционный PrPSc

С* р отличается от нормального РгР преобладанием (3-структур (в РгР они занимают всего 3% от общей длины последовательности, в то время как в PrPSc на (3-структурные участки приходится до 43%) (Huang et al., 1994, Huang et al., 1995). Использование данных ЯМР-спектроскопии позволило Z. Huang с соавт. (1995) (Huang et al., 1995) достоверно показать, что до 43% последовательности РгРс представлено устойчивой а-спиральной структурой. В последующие годы методом ЯМР спектроскопии были получены трёхмерные модели РгРс многих видов млекопитающих, в том числе и человека (Lysek et al., 2005). К настоящему моменту методом рентгеноструктурного анализа получены пространственные структуры с высоким разрешением некоторых прионных белков (Haire et al., 2004, Knaus et al., 2001, Sawaya et al., 2007).

На Рисунке 1 представлены современные данные о пространственной организации прионных белков. Структура РгР млекопитающих сильно консервативна и представлена двумя принципиально различающимися структурными доменами: N-концевым - неструктурированным (остатки 23 -128), и С-концевым, обладающим стабильной вторичной и третичной структурами (остатки 134 - 231) (Riek et al., 1997). В состав неструктурированного N-концевого домена входят два консервативных участка последовательности. Первый состоит из октапептидных повторов (51 - 90) (Riek et al., 1997). Предполагается, что этот мотив участвует в известном для прионных белков взаимодействии с ионами меди, а также возможно вовлечён в процесс конверсии и образования амилоидных структур (Brockes, 1999). Второй участок представляет собой высоко консервативный гидрофобный кластер (111-134).

Сайты гидролиза протеиназой К птиды

23 51

М-концевая сигнальная посоедовательность

Заряженный кластер

Гидрофобный кластер 90 111 134

Сайты гликозилирования

I I I

Устойчивый к протеиназе К участок

ГФИ

С-концевой гидрофобный сегмент

231 254

179

Неструктурированный И-концевой домен

Структурированный С-концевой домен

Рис. 1 Структуры прионных белков (Aguzzi е/ а1, 2008, Ргазшег, 1998)

A. Структура а-спиральной неинфекционной формы рекомбинантного РгР (90 - 231) сирийского хомячка по данным ЯМР спектроскопии. Отмечены а-спирали Н1, Н2 и НЗ, (3-тяжи 81 и Б2. Между спиралями Н2 и НЗ обозначена дисульфидная связь (Суз179 - Су8214). Красным цветом обозначен консервативный гидрофобный участок.

Б. Схематичное изображение строения молекулы РгР(29-231). Участок белка представленный остатками 90 - 231 построен по координатам структуры с рисунка (А). Остальная последовательность (29 - 90) достроена вручную, исключительно в целях иллюстрации. Цветом обозначен уровень подвижности структуры. Синим - наиболее стабильные участки, красным -наиболее подвижные.

B. Схема первичной структуры РгР. На схеме обозначены положения основных характерных консервативных сайтов в последовательности прионного белка и участки его посттрансляционных модификаций.

Изначально предполагалось, что эта область является трансмембранным доменом, однако в настоящее время это утверждение остаётся спорным (Aguzzi et al., 2008).

Структурированный С-концевой домен представлен тремя а-спиралями (HI, Н2 и НЗ), и небольшим антипараллельным (3-листом. Последний образован двумя Р-тяжами S1 и S2, которые по своему положению в последовательности лежат по разные стороны от первой а-спирали HI. Тяж S2 и а-спираль Н2 соединены длинным петлевым участком, который обладает крайне высокой тепловой подвижностью. Согласно некоторым предположениям (Bujdoso et al., 2005, Gossert et al., 2005), эта петля также играет значительную роль в процессе конверсии РгР в его инфекционную форму. Вторичная структура С-концевого домена в значительной степени подвижна и сильно зависит от рН, температуры, ионной силы и других условий среды (Huang et al., 1994, Huang et al., 1995, Prusiner, 1994, Prusiner, 1998). Наиболее стабильными в отношении вторичной структуры являются два последних а-спиральных участка Н2 и НЗ, связанные между собой дисульфидным мостиком.

Из ранних работ по анализу вторичной структуры прионов (Huang et al., 1994, Huang et al., 1995) известно, что при переходе из неинфекционной в инфекционную конформацию РгР утрачивает первый а-спиральный участок HI, который полностью переходит в p-структуру. Также в ряде экспериментов по получению укороченных прионных белков были установлены границы амилоидогенного участка приона, который, видимо, целиком принимает участие в формировании p-структурного мотива (приблизительно 88-145 остатки) (Ghetti et al., 1996, Kaneko et al., 2000, Kitamoto et al., 1993, Supattapone et al., 1999). Однако до настоящего времени пространственная организация инфекционной формы прионов PrPSc всё ещё остаётся неизвестной. Полная нерастворимость агрегатов PrPSc делает

27 невозможной расшифровку их пространственной структуры ни одним существующим на данный момент методом (воуэейБ е/ а/., 2004).

Тем не менее, в последние годы начала появляться информация, касающаяся некоторых подробностей структуры амилоидных агрегатов РгР3с. Всё больше новых данных свидетельствуют о том, что амилоидные фибриллы различных амилоидогенных белков, скорее всего, представлены параллельными ^-структурами (Оег-8агк18з1ап et а/., 2003, Petkova е/ а1, 2002). Так же стало известно, что в амилоидных фибриллах РгР3с (З-тяжи ориентированы перпендикулярно оси фибриллы (ОоЬэоп, 2001, Бипёе е/ а1., 1997).

Недавно в лаборатории Ргиятег <& а1. (СоуаейБ et а1., 2004) была предложена модель, согласно которой амилоидная фибрилла РгР8с представляет собой трёхгранную структуру, состоящую из трёх левозакрученных параллельных Р-спиралей. Отдельные мономеры РгР5с свёрнуты подобно белкам представителям семейства бактериальных трансфераз и представлены двумя доменами: Р-структурным, и а-спиральным (Рис. 2). В-структурный домен представляет собой короткую правозакрученную Р-спираль, образованную фрагментом цепи (89-174). Данный участок соответствует участку неструктурированного 1Ч-концевого л домена РгР , включающему в себя гидрофобный кластер, а также первому а-спиральному участку Н1 и обоим Р-тяжам 81 и 82 С-концевого домена. А-спиральный домен представлен спиралями Н2 и НЗ, соединёнными дисульфидной связью, не претерпевшими никаких серьёзных конформационных перестроек.

Подобно вышеупомянутым представителям семейства бактериальных о трансфераз, мономеры РгР могут тримеризоваться, контактируя боковыми сторонами р-спиральных доменов. В свою очередь, тримеры, стыкуясь друг с другом основаниями Р-спиральных доменов, соединяются в фибриллу, подобно монетам в стопке. В-спиральные домены образующих её тримеров сливаются в три непрерывные Р-спирали, представляющие собой её структурную основу. Несмотря на то, что окончательно подобная модель организации амилоидной фибриллы прионных белков не является доказанной, она хорошо согласуется с данными, полученными методами электронной микроскопии, ЯМР-спектроскопии и рентген-структурных исследований.

Рис. 2 Гипотетическая модель строения амилоидной фибриллы РгР (ОоуаейБ е/ а/., 2004)

A. Предполагаемая пространственная структура инфекционного мономера укороченного мутантного РгР. Участок, соответствующий остаткам 89 - 174, формирует левозакрученную |3-спираль. А-спиральные участки Н2 и НЗ не претерпевают значительных конформационных изменений.

Б. Предполагаемая структура тримера РгРЯс

B. Предполагаемая структура амилоидной фибриллы РгР8с Е

Так же, до сих пор является невыясненным и механизм конверсии нормального белка в его инфекционную форму. В работах большого числа исследователей на протяжении последних 15-ти лет высказывалось множество гипотез относительно механизма конверсии РгР и организации инфекционного агента PrPSc. Для удобства их рассмотрения стоит выделить три основных направления, к которым, по сути, сводятся все остальные: 1) модель матричной сборки (template assembly) 2) гетеродимерная модель (heterodimer, or templatedirected refolding model) (Gajdusek, 1988, Prusiner and DeArmond, 1990), и 3) модель некаталитической нуклеации (noncatalytic nucleated polymerization model, NNP) (Come et al., 1993).

Согласно модели матричной сборки (рис 3, А), инфекционным агентом является зародыш амилоидной фибриллы PrPSc, с которым взаимодействуют нормальные или частично развёрнутые формы клеточного РгР. После связывания фибриллы с молекулой прионного белка в нём происходят структурные изменения, в результате чего он сам переходит в инфекционную форму и становится частью растущей фибриллы (Kelly, 2000).

Гетеродимерная модель (рис. 3, Б) утверждает, что PrPSc связывается с нормальным клеточным РгР или с частично развёрнутой формой РгР*, образуя гетеродимер. В образовавшейся паре

PrP*-PrPSc, PrPSc направляет сворачивание частично развёрнутого РгР* по пути образования себе подобного Р-структурно насыщенного белка. Вновь образованный после такого взаимодействия PrPSc в свою очередь может сам выступать в качестве катализатора конверсии РгР* в инфекционную форму. Возможным источником частично развёрнутых интермедиатов фолдинга РгР* многие исследователи считают молекулярные шапероны (Aguzzi et al., 2008). Согласно этой гипотезе в процессе конверсии важна кинетическая составляющая. Высокий активационный барьер в норме не позволяет

30 происходить этому процессу спонтанно со сколь - либо заметной скоростью. Образование гетеродимерного комплекса понижает энергию активации на пути к образованию нового РгР8с, увеличивая скорость конверсии.

Модель матричной сборки

Зародыш ^^^ инфекционной фибрилы

I t

JÄ*.

О °

РгР° %

Процесс конверсии происходит после связывания РгР° с фибриллой

Гетеродимерная модель

Инфекционный мономер

РгРс

Конверсия протекает а составе гетеродимера Г

Формирование агрегатов v — —ч ^^ vupmuyi

Диссоциация

Модель нуклеации

1 а Л

Зародыш инфекционном фибрилы О и ф

Равновессие между РгРс и РгР*= О

О J г\

V: о

Связывание с фибрилой стабилизирует инфекционную форму РгР

Модель конформационной конверсии

Коиформационно подвижные олигомеры

Рис. 3. Четыре основные модели конверсии прионных белков (Kelly, 2000)

Напротив, модель некаталитической нуклеации (рис. 3, В) предполагает, что в процессе конверсии решающей является термодинамическая составляющая. В рамках этой гипотезы, переход из РгРс в PrPSc является обратимым, однако равновесие сильно смещено в сторону образования РгР . Инфекционный РгР может стабильно существовать только в виде строгоупорядоченных агрегатов. Появление в системе небольшого фрагмента такого агрегата запускает процесс присоединения к нему спонтанно образующихся мономеров PrPSc, а это в свою очередь приводит к сдвигу динамического равновесия в сторону образования новых инфекционных форм. Таким образом, в рамках этой гипотезы инфекционным агентом выступают фрагменты амилоидных фибрилл PrPSc.

Отдельного внимания заслуживает также альтернативная модель, недавно предложенная Jeffery W. Kelly (Kelly;.2000) (рис: 3 Г), основанная на исследованиях кинетики конверсии прионного белка дрожжей sup35. Решающую роль в процессе конверсии W. Kelly отводит формированию некрупных олигомерных интермедиатов. Согласно предложенной модели структурно подвижные некрупные агрегаты прионных белков в определённых условиях способны либо спонтанно образовывать в себе ядра - зародыши амилоидной структуры (в случае спонтанного процесса конверсии), либо связываясь с уже существующей амилоидной структурой, претерпевать конформационные перестройки и становиться частью растущей фибриллы. Лимитирующей стадией этого процесса может быть как образование структурно подвижных олигомеров так и их взаимодействие с упорядоченным ß-структурным зародышем, и меняться в зависимости от условий (например, концентрации белка или ионной силы раствора). Автор предполагает, что подобные олигомерные агрегаты могут представлять собой мицеллоподобные структуры.

Несмотря на то, что модель W. Kelly основана на исследованиях дрожжевого прионного белка, её основные положения могут быть экстраполированы и на прионный белок млекопитающих РгР. Так в группе Н. Rezaei при нагревании овечьего РгР в кислых условиях были получены 2 типа олигомерных агрегатов (Eghiaian et al., 2007, Rezaei et al, 2005), для которых методом малоуглового рассеивания было установлено, что они являются 12-ти и 36-ти мерами РгР. Кратность количества мономеров в таких агрегатах 3-м довольно неплохо согласуется с моделью амилоидной фибриллы РгР, предложенной Prusiner.

В более поздней работе было установлено, что при переходе РгР в олигомеризованное состояние происходит частичная денатурация упорядоченного С-концевого домена прионного белка: утрачивается первый a-спиральный участок HI, и разрушаются водородные контакты, соединяющие тяжи S1 и S2, сильные конформационные изменения претерпевает петля, соединяющая S2 и Н2. Тесты с тиофлавином Т демонстрируют повышенное содержание ß-структур в таких агрегатах по сравнению с нативным РгР. Для крупных агрегатов при повышении их концентрации показана возможность их трансформации в амилоидные фибриллы.

Существует ряд работ, в которых высказывается предположение, что различные молекулярные шапероны, в норме предназначенные для правильного сворачивания белков и предотвращения их агрегации, могут участвовать в развитии прионных заболеваний (Bukau and Horwich, 1998, Carrell and Lomas, 1997). Актуальным и нерешенным является вопрос о том, как прионо- амилоидогенные белки избегают действия протеаз и шаперонов. Предполагается, что либо в процессе фолдинга таких белков образуются структуры, не узнаваемые шаперонами, либо агрегация амилоидных форм белков происходит значительнее быстрее, чем процесс, в результате которого

33 они могли бы быть исправлены или деградированы (Wickner et al., 1999). С другой стороны, свойство шаперонов стабилизировать интермедиа™ фолдинга может способствовать процессу перехода нормального белка в его патогенную форму (Welch and Gambetti, 1998). Такая гипотеза впервые была высказана Prusiner at al. (Prusiner et al., 1998) в качестве объяснения феномена наблюдавшегося в исследованиях Telling et al. (Telling et al., 1994) no заражению трансгенных мышей человеческим PrPSc. Мыши, экспрессирующие одновременно и мышиный, и человеческий прионные белки, оказывались устойчивыми к заражению человеческим PrPSc, в то г-* время как мыши, экспрессирующие только человеческий РгР были восприимчивы к заражению. Из этих результатов следовало, что присутствие р Р мышиного РгР ингибирует переход РгР человека в инфекционную форму. В качестве возможного объяснения Prusiner at al. (Prusiner et al., 1998) предположил, что конверсия человеческого РгР в организме мыши, происходит посредством некоего мышиного белка X, являющегося, по-видимому, молекулярным шапероном. Белок X, вероятно, блокируется мышиным прионным белком, если таковой экспрессирован у мыши, поскольку мышиный РгР имеет более высокое сродство к мышиному белку X, чем человеческий прион. В результате чего, конверсия человеческого приона в его инфекционную форму оказывается невозможной.

Предположение, что белок X, участвующий в конверсии нормального прионного белка в его инфекционную форму, является молекулярным шапероном, косвенно подтверждается нарушениями активации Heat-shock/stress ответа при высокой концентрации PrPScB клетке (Ptitsyn, 1995).

В популяции овец среди множества существующих однонуклеотидных полиморфизмов в гене PRNP, кодирующем прионный белок, только три полиморфизма имеют заметную фенотипическую выраженность. Эти полиморфизмы проявляются в транслируемом белке в трёх позициях: 136, 154 и 171 (Рис.4.). В позиции 136 может стоять Ala или Val (A136V), в позиции 154 Arg или His (R154H), а в позиции 171 Gin, Arg или His (Q171R/H). В основном они встречаются в следующих комбинациях в виде 5-ти аллелей (из возможных 12-ти) именуемых соответственно ARQ, ARR, AHQ, ARH и VRQ. Особи, гомозиготные по аллелю ARR, практически полностью устойчивы к заражению скрейпи, в то время, как гомозиготы по аллелю VRQ, напротив, в значительной степени восприимчивы к заражению.

Рис. 4. Пространственная структура С-концевого домена РгР овец. Изображена скрейпи-подверженная изоформа VRQ. Синим отмечены три фенотипически значимых полиморфизма.

Л136V

W \ ^J

Признак устойчивости к скрейпи наследуется по принципу неполного доминирования (Baylis and Goldmann, 2004), что говорит о зависимости восприимчивости животного к скрейпи от соотношения концентраций продуктов этих двух аллелей в клетках и тканях его нервной системы. Остальные аллели, ARQ, AHQ и ARH, ассоциированы с неполной восприимчивостью к скрейпи. В ряду ARR, AHQ, ARH, ARQ, VRQ восприимчивость к скрейпи возрастает, однако она также сильно зависит от штамма инфекционного PrPSc (Baylis and Goldmann, 2004).

Полиморфизмы, влияющие на восприимчивость к трансмиссивным энцефалопатиям, или на длительность их инкубационного периода, также были обнаружены в популяциях мышей и человека, однако стоит подчеркнуть, что только в, популяции овец встречается аллель полной невосприимчивости к скрейпи, что делает овец уникальным объектом исследования механизмов лежащих в основе развития прионных заболеваний.

С точки зрения исследования механизмов патогенеза прионных заболеваний, представляется важным установить принципиальную разницу между этими двумя группами изоформ овечьего прионного белка. Поэтому, на данный момент, множество исследований направлено на выявление различий в физико-химических свойствах между этими изоформами и возможных отличий в механизме их конверсии в инфекционную форму (Bujdoso et al., 2005, Rezaei et al., 2002, Thackray et al., 2004, Wong et al., 2004).

Подробные сравнительные исследования аллельных вариантов прионного белка овец были проведены национальном институте агрономических исследований, Франция.

В экспериментах Е. Sabuncu at al. на культуре эпителиальных клеток Rov было показано, что клетки, экспрессирующие прион VRQ, после

36 добавления инфекционного РгРЭс начинали активную продукцию прионного белка, в то время как клетки, экспрессирующие АЯЯ, никак не реагировали на заражение (ЭаЬипси et а1., 2003). Таким образом, одним из возможных объяснений механизма устойчивости носителей аллеля АКК к заражению скрейпи, может быть низкий уровень экспрессии приона АЯЯ в ответ на появление в клетке инфекционного РгР8с.

Н. Яегае! дЛ. а1. (Яегае! <?/ а1., 2002) были детально изучены пути денатурации и рефолдинга четырёх изоформ прионного белка овец (УЯ(2, АЯС^, АНР и АЯЯ) в широком спектре рН целым набором различных методов, включающих в себя дифференциальную сканирующую калориметрию, снятие спектров кругового дихроизма, исследование динамики образования р-структур по изменению флуоресценции тиофлавина Т. В этих исследованиях было показано, что в диапазоне рН от 4,5 до 6,0 денатурация и рефолдинг всех четырёх изоформ представляет собой одностадийный процесс, в то время как за пределами этого промежутка при температурах от 65 - 80°С наблюдается появление стабильных интермедиатов фолдинга.

Как ни странно, изоформы УЯС) и АЯС), ассоциированные с восприимчивостью к скрейпи, демонстрировали большую термостабильность и более высокую энергию активации на пути к формированию интермедиатов фолдинга, чем АН(2 и АИЛ, при всех значениях рН. Также, получаемые в этих экспериментах интермедиаты фолдинга различались по вторичной структуре. Интермедиаты УЖ} и А 11(2 отличались преобладанием Р-структур, в то время как интермедиаты АН(2 и АИЛ по структуре представляли собой неупорядоченный клубок. При рН 4,0 изоформы, ассоциированные с восприимчивостью к скрейпи (УЯ(2 и АЯ(2) демонстрировали более высокую скорость образования интермедиатов фолдинга, чем ассоциированные с устойчивостью (АНС2 и АЛЛ).

Охлаждение интермедиатов фолдинга до 20°С вызывало формирование амилоидных фибрилл, с высоким содержанием Р-структур. Строение полученных фибрилл, содержание в них Р-структур, а также скорость их образования были практически одинаковыми для всех четырёх аллельных вариантов.

В своей недавней работе Н. Яегае! at а1. (ТэихтЫкоу et а1., 2006) исследовали взаимодействие двух изоформ овечьего прионного белка УЯС) и АИЛ с ионами меди и цинка. В этих экспериментах было показано, что оба прионных белка в комплексе с ионами меди формируют растворимые протеазорезистентные олигомеры с повышенным содержанием Р структур. В присутствии ионов цинка УЯС) и АЯЯ образуют а-спиральные растворимые олигомеры, тоже протеазорезистентные. Никаких отличий в поведении двух белков в этих опытах выявлено не было.

В другой аналогичной работе (ВщёоБо а1., 2005) была обнаружена заметная разница в интенсивности образования Р-структур двумя вариантами УЫС> и АЯЯ при взаимодействии с ионами меди. Так прион АЛЕ. практически не претерпевал никаких заметных конформационных изменений, а для УЯС) наблюдалось интенсивное образование Р структур. Противоречивость этих данных может быть связана с тем, что исследователи проводили эти эксперименты при разных температурных условиях.

Несмотря на существование большого количества работ, в которых исследуются физико-химические характеристики разных аллельных вариантов приона овец при взаимодействии с различными индукторам агрегации, и актуальность такого рода исследований, ясного представления о том, чем и как вызывается спорадическая форма заболевания, на данный момент не существует.

Структура и свойства казенное

Основные белки молока по структуре и функциям можно разделить на две основные группы:

- казенны, организованные в мицеллярную суспензию;

- растворимые сывороточные белки (альбумины и глобулины).

Сывороточные белки составляют 15-28% от всех белков коровьего молока, имеют более компактную структуру и большую устойчивость к действию протеаз по сравнению с казеинами, а также денатурируют при нагревании до 100°С. Эта группа включает а-лактальбумин и р-лактоглобулин, сывороточный альбумин, иммуноглобулины, лактоферин, а также такие ферменты, как каталаза, плазмин, лизоцим, лактопероксидаза, щелочная фосфатаза, протеазы и липазы.

Казеиновая фракция (78% от белка молока) выпадает в осадок при закислении молока до рН 4,6. Коровье молоко содержит 4 типа казеинов (aSl, aS2, р, к), кодируемых каждый своим геном. Гены казеинов объединены в общий регион на 6 хромосоме, организация которого достаточно консервативна (Ferretti et al., 1990, Gallagher et al., 1994). Для всех типов казеина описано множество генетических вариантов.

Три гена, кодирующих казенны со способностью связывать кальций (aSl, aS2, Р), произошли от общего предка через внутреннее и межгенное дублирование, а также обмен экзонов (Groenen et al., 1993). В отличие от них, ген, кодирующий к-казеин, не имеет такой эволюционной связи, но при этом имеет аналогичную схему экспрессии и необходим для образования мицелл.

Казенны секретируются клетками молочной железы, поэтому все они синтезируются в виде предшественников, а сигнальный пептид отщепляется при переносе в комплекс Гольджи.

В натуральном молоке казенны формируют надмолекулярные структурные комплексы диаметром около 180 нм, называемые казеиновыми мицеллами.

Для казеинов можно выделить несколько общих характеристик, определяющих функциональные свойства: высокая степень гидрофобности, причем гидрофильные и гидрофобные остатки расположены неравномерно; наличие фосфосериновых кластеров (последовательность SerP-SerP-SerP-Glu-Glu) для фиксации фосфатами кальция; высокое содержание равномерно расположенных пролинов, препятствующих сворачиванию в а-спирали и р-слои приводит к естественно развернутой структуре. aSl-козеин aSl-казеин (Рис.5.) составляет около 40% от всей казеиновой фракции и представлен двумя формами. Они имеют одинаковую аминокислотную последовательность (Grosclaude et al., 1973, Mercier et al., 1971) и отличаются степенью фосфорилирования. Самый распространенный вариант В aSl-казеина состоит из 199 аминокислот и имеет молекулярную массу порядка 23 кДа. Последовательность включает 8 фосфосериновых остатков, локализованных в области 43-80 а.о., причем в этом сегменте также располагаются 12 дополнительных карбоксильных группы. То есть в данной области пептидная цепь имеет значительный отрицательный заряд и сильно полярный характер. Пролиновые остатки распределены по всей цепи и, очевидно, это существенно мешает образованию упорядоченной структуры. Во вторичной структуре по данным Рамановской спектроскопии и моделирования преобладают бета-повороты: 15% - альфа-спирали, 22%

40 бета-слои, 45% - бета-повороты (Ву1ег е/ а1, 1988, РаггеН а1, 2001). То есть всего около 30% последовательности считают структурированной. Аминокислоты в области 100-199 преимущественно неполярны и, видимо, ответственны за склонность белка к ассоциации, которая, с другой стороны, ограничена силами отталкивания фосфатных групп. В присутствии ионов кальция, в концентрациях, характреных для молока, аБ1-казеин образует нерастворимую кальциевую соль.

Рис.5. Структура аБ1-казеина. Гидрофобные области показаны овальными, полярные - прямоугольными. Фосфосерины и лизины в последовательности выделены. а32-казеин

Этот казеин составляет всего 8% от всей казеиновой фракции, состоит из 207 аминокислот имеет молекулярную массу около 25 кДа. Его последовательность, по сути, представляет собой "диполь", у которого в 14-концевой части сосредоточены отрицательно заряженные групы, а в С-концевой - положительно заряженные. Он содержит 11 фосфосериновых остатков (Swaisgood, 1993) и 2 цистеина. а82-казеин способен преципитировать при еще более низких концентрациях кальция по сравнению с а81-казеином. Благодаря наличию двух цистеинов, этот казеин способен к образованию димеров (Яазтиззеп е/ а1, 1992). fi-Казеин

Р-казеин (Рис.6.) составляет 45% от общего содержания казеинов аминокислот и имеет молекулярную массу порядка 24 кДа. Он обладает средней гидрофобностью, при этом самой высокой по сравнению с другими типами казеинов. Его можно считать поверхностно-активным веществом вследствие наличия гидрофильной «головы» и гидрофобного хвоста, получающихся за счет распределения аминокислот.

К-концевой участок 1-41 очень гидрофилен и отрицательно заряжен, что объясняется в основном наличием 5 фосфосерильных остатков, локализованных в области 1-40 а.о. Участок 49-209, наоборот, очень гидрофобен и содержит большое количество нейтрально-заряженных аминокислот (Swaisgood, 1993). Это позволяет (3-казеину ассоциировать с другими типами казеинов путем гидрофобных взаимодействий (Китозтзк!

Рис.6. Структура Р-казеина. Гидрофобные области показаны овальными, полярные - прямоугольными. Фосфосерины и лизины в последовательности выделены.

Исследователи Creamer et al. (Creamer et al., 1981) и Caessens et al. (Caessens et al., 1999) подтвердили с помощью различных методов структурного анализа, что Р-казеин содержит небольшие в процентном отношении участки, организованные в виде а-спиралей и р-слоев. Однако белок содержит относительно большое количество пролиновых остатков (35

Farrell et al., 2004). Наиболее распространенный вариант А состоит из 209 etal., 1993). из 209, т.е. 17%), достаточно часто образующих цепочки Pro-Pro или Рго-Х-Рго, что приводит к многочисленным p-поворотам во вторичной структуре белка.

Таким образом можно сказать, что Р-казеин является малоструктурированным белком, и можно предположить его способность, как реоморфного белка, к подстраиванию своей структуры к окружающим условиям (Livney et al., 2004). Также Р-казеин легко подвержен деградации при действии протеолитических ферментов.

Несмотря на то, что третичная структура этого белка еще неизвестна, можно предположить влияние многочисленных Р-поворотов. Действительно, Kumosinski et al (Kumosinski et al, 1993) предложили модель, представляющую Р-казеин в виде «краба с двумя клешнями». Эти «клешни» являются гидрофильными участками, образованными за счет полипролиновых кривых, с одной стороны, и за счет комбинаций р-слоев, а-спиралей и Р-поворотов с другой стороны. Тело «краба» представляет собой достаточно жесткую гидрофобную структуру. Такая модель до сих пор остается гипотетической, хотя она хорошо согласуется с результатами многочисленных экспериментальных данных.

Гидрофобные взаимодействия играют первостепенную роль в структурировании и денатурации белков, равно как и в образовании белковых гелей. Химическое и нехимическое изменение параметров среды чрезвычайно сильно влияет на структуру белка. С другой стороны, конформационные преобразования белков и их способность к агрегации часто являются результатом образования новых дисульфидных связей. Образование и разрыв таких связей влияют на такие свойства белков, как способность к эмульгированию и пенообразованию (Okumura et al., 1990). К тому же дисульфидные связи осуществляют присоединение типа белокбелок, что приводит к образованию геля на поверхности раздела фаз вода/л ипиды.

Благодаря своим амфифильным свойствам, Р-казеин обладает способностью к самоассоциации в форме мицелл. Такая ассоциация осуществляется за счет гидрофобных взаимодействий, с одной стороны, и электростатических связей, с другой (Ноте, 1998).

Между Р" и aSl казеинами возможно взаимодействие через кальциево-фосфатные мостики, вследствие сильной гомологии соответственно в участках 13-21 и 62-70, богатых фосфосеринами (Mercier et al., 1971). Казеин Р не способен формировать дисульфидные связи по причине отсутствия цистеинов, в отличие от а82-казеина, который обладает способностью к димеризации в определенных y^OB^x(Rasmussen et al., 1992), а также к-казеина.

Предложены две модели формирования мицелл: эллипсоидной формы с сердцевиной из слабоуплотненных гидрофобных С-концевых участков с наружной «шевелюрой» из N-терминальных участков (Kajiwara et al., 1988); и сферических мицелл с плотно упакованными самыми гидрофобными С-концевыми участками внутри (Leclerc and Calmettes, 1997). к-Казеии

Наиболее распространенный вариант В состоит из 169 аминокислот и имеет молекулярную массу около 18 кДа. Этот казеин имеет всего один остаток фосфосерина и 2 остатка цистеина (Рис.7.), реактивность цистеиновых остатков такова, что мономер можно обнаружить только в восстанавливающих условиях. В нативном состоянии к-казеин существует в форме тримера или более сложного олигомера, которые, по всей видимости, образуются за счет дисульфидных связей (Pepper and Farrell, 1982, Vreeman et al., 1977). Это единственный из казеинов, который гликозилирован, причем степень гликозилирования и состав гликозильных остатков неоднороден (Doi et al., 1979, Pujolie et al., 1966, Vreeman et al., 1977, Woychik et al., 1966). В среднем, в составе белка обнаруживается около 1% галактозы, 1,2% галактозамина, 2,4% сиаловой кислоты, которые присоединены через 131, 133, 135 или 136 остатки треонина.

Рис.7. Структура к-казеина. Гидрофобные области показаны овальными, полярные - прямоугольными. Остатки фосфосеринов и лизинов в последовательности выделены.

На электрофорезе к-казеин разделяется на множество компонентов, которые имеют одинаковый аминокислотный состав, но отличаются по гликозилированию, то есть на одну молекулу белка может приходиться 0-3 моль Ы-ацетилнейраминовой кислоты, 0-4 моль галактозы и 0-3 моль галактозамина. Один из возможных вариантов гликозилирования показан на Рис. 8. В двух других вариантах гликозилирования отсутствует по одному остатку сиаловой кислоты в каждом случае.

Рис.8. Пример углеводной цепи к-казеина. к-казеин является единственным из казеинов, который остается растворимым в присутствии существующих в молоке концентраций ионов кальция. Таким образом, он предотвращает коагуляцию а81- и Р-казеинов, формируя вместе с ними стабильные комплексы и мицеллы.

Некоторые свойства используемых в данной работе а81-, Р- и к-казеинов собраны в Таблице 1.

Таблица 1. Краткая характеристика казеинов

Р-казеин aSl-казеин к-казеин

Мол. масса, кДа 24 23 19

Длина, а.о. 209 199 169

Pi 5.13 4.91 5.93

Коэффициент гидрофобности, кДж/моль 6.82 4.48 4.69

Pro, доля 35 16% 17 8% 20 12%

Lys 11 14 9

Cys - - 2

Посттрансл. модиф. Фосфорилирование - Ser 30, 32, 33, 34, 50, £ 5 Фосфорилирование -Ser 56, 61, 63, 79, 81, 82, 83, 90, 130, Thr 68, ЕЮ Фосфорилирование -Ser 148, 170, £2 О-гликозилирование - Thr 142, 152, 154, 157, 163, 186, ЕО-4 Пироглутамат - Gin 22 S-S связь - 11-88

Вторичная а-спираль 7-16% 13-22% 14-23% структура ß-слой 17-26% 7-20% 17-31%

-поворот 15-31% 34% 14-24%

Функции Играет важную роль в определении поверхностных свойств казеиновых мицелл Определяет способность молока связывать и транспортировать фосфат кальция. Стабилизирует образование мицелл, предотвращая преципитацию казеинов в молоке.

Образование мицелл

Только 10% от всей казеиновой фракции находятся в состоянии мономеров. Их обычно называют сывороточными казеинами и их соотношение относительно постоянно. Основная доля казеинов формирует казеиновые комплексы и мицеллы. Основные факторы, влияющие на это равновесие, показаны на Рис.9.

Мономеры (растворимые казенны)

-Н+, -Са2+ + Цитрат +Фосфат Понижение температуры

Н+, +Са2+ - Цитрат -Фосфат Повышение ^ температуры

Казеиновые комплексы

-Н+, -Са2+ + Цитрат +Фосфат Понижение температуры

Н+, +Са2+ - Цитрат -Фосфат Повышение | температуры

Мицеллы казеинат кальция + фосфат кальция)

Рис.9. Факторы, влияющие на образование казеиновых комплексов и мицелл.

Диаметр казеиновых мицелл (Рис. 10.) в молоке варьирует от 50 до 300 нм, пик распределения частиц приходится на 150 нм (Banon and Hardy, 1992, Wade and Beattie, 1997). Если считать диаметр равным 140 нм, то объем

6 3 7 8 мицеллы составляет 1,4 х 10 нм , а вес частицы будет порядка 10-10 Да, что составляет порядка 25000 мономеров на мицеллу. Казеиновые частицы значительно меньше липидных глобул, диаметр которых составляет 0,1 - 10 мкм. Мицеллы не плотно упакованы и имеют вариабельную плотность, то есть скорее обладают пористой структурой.

Мономеры ассоциированы друг с другом за счет следующих факторов:

- Гидрофобные взаимодействия, достигающие минимальной силы при температуре ниже 5°С.

- Электростатические взаимодействия, в основном между кальцием или фосфатом кальция с фосфосериновыми и глутаматными остатками.

- Водородные связи.

Точная структура и организация казеиновой мицеллы до сих пор не определена, однако существует несколько моделей (Banon and Hardy, 1992, Morr, 1967, Shimmin and Hill, 1964, Waugh et al., 1970).

Рис. 10. Электронная микрофотография казеиновых мицелл в обезжиренном молоке (Цит. по Webb, 1974). Мицеллы зафиксированы глутаровым альдегидом и затем окрашены фосфомолибденовой кислотой.

Гомоцистеинилирование как физиологическая посттрансляционная модификация белков

Гомоцистеин, его свойства и метаболические превращения в клетке

Гомоцистеин является природной небелковой аминокислотой, которая образуется в метаболических путях превращений серосодержащих соединений. Так, основной путь биосинтеза гомоцистеина происходит через деметилирование метионина. Существует три основных пути дальнейшего превращения гомоцистеина: реметилирование до метионина, вхождение в процесс синтеза цистеина и высвобождение во внеклеточную среду. Основные метаболические пути превращений гомоцистеина показаны на Рис. 11. Перенос метальных групп осуществляется во многих реакциях биосинтеза. Основным донором метальных групп является S-аденозилметионин, который при переносе метальной группы превращается а S-аденозилгомоцистеин. При гидролизе S-аденозилгомоцистеина ферментом S-аденозилгомоцистеингидролазой образуются гомоцистеин и аденозин.

Для реметилирования гомоцистеина метальная группа переносится с 5-метилтетрагидрофолата с помощью метионинсинтазы или 5-метилтетрагидрофолат-гомоцистеинметилтрансферазы, использующий витамин Bj2 в качестве кофактора. Недавно был предложен еще один путь реметилирования гомоцистеина в метионин (Antonio et ai, 1997), включающий образование гомоцистеинтиолактона (Jakubowski, 1999). Одним из источников метионина, а, следовательно, и гомоцистеина, является высвобождающийся во многих случаях N-концевой метионин синтезирующихся белков.

Транссульфирование гомоцистеина в цистеин происходит при участии витамин Вб-зависимой цистатион-Р-синтазы, которая катализирует конденсацию с серином до цистатионина. Это критический этап метаболического пути, поскольку при физиологических условиях эта реакция необратима. На последнем этапе синтеза происходит расщепление цистатионина у-цистатионазой, тоже витамин В6-зависимым ферментом, до цистеина и 2-оксоглутарата.

ТГФ

Серии Нг н

СООН H2N-CH / н I соон

ОН Нг

COCW

Метилен-ТГФ он CHj

ДУЧ^

Метил-ТГФ

HjC-C-C-COOH 2-оксобутират

CHC-SH н, Цистенн

Гомоцнстеинтиолактон

Рис. 11. Основные метаболические превращения гомоцистеина (Цит. по (Medina et al., 2001))

Гипергомоцистеинемия и ее роль в патологических процессах

Гипергомоцистеинемия является фактором риска для многочисленных патологий, включая сердечно-сосудистые заболевания (Anderson et al., 2000, Cavalca et al., 2001, Lawrence de Koning et al., 2003, Spence et al., 2005), инсульт (Yoo and Lee, 2001) и тромбозы (den Heijer et al., 1996). Повышенный уровень гомоцистеина также играет роль при дефектах нервной трубки (Mills et al., 1996), повышает вероятность развития осложнений при беременности (Kumar et al., 2003, Nelen et al., 1997) и коррелирует с развитием

51 нейродегенеративных болезней, таких как деменция, болезни Паркинсона и Альцгеймера (Mattson and Shea, 2003, Obeid and Herrmann, 2006, Seshadri, 2006).

Нормальный метаболизм гомоцистеина требует наличия витаминов Вб и В12, поэтому дефицит этих витаминов приводит к гипергомоцистеинемии (Brosnan et al., 2004).

В крови человека гомоцистеин присутствует в свободной или связанной с белком форме. Основная фракция гомоцистеина в крови это N-связанный с белком гомоцистеин, доли ассоциированного с гемоглобином и альбумином составляют 75 и 22%, соответственно, из общего гомоцистеинилированного белка в крови человека (Jakubowski, 2006). Небольшое количество гомоцистеина находится в свободной восстановленной форме, также обнаруживаются дисульфиды, гомоцистин и цистеинилгомоцистеин (Mudd et al., 2000). Гомоцистеинтиолактон, другой метаболит гомоцистеина, составляет порядка 0,29% от всего гомоцистеина в плазме и 28% в моче.

Уровень гомоцистеина в плазме определяется рядом факторов, таких как недостаток витаминов группы В и фолатов, генетические дефекты метаболизма гомоцистеина, половые и гормональные особенности, старение, диабет, почечная недостаточность, токсические воздействия, связанные с курением. Концентрация гомоцистеина в плазме здорового взрослого человека находится в пределах 5-15 мкМ. В настоящее время принято деление гипергомоцистеинемии на умеренно выраженную (содержание Нсу в сыворотке от 16 до 30 мкмоль/л), средней выраженности (31 — 100 мкмоль/л) и тяжелую (Нсу более 100 мкмоль/л).

Концентрация гомоцистеина в сыворотке крови является ранним и чувствительным маркером нарушений умственной деятельности. (Gottfries et al, 1993) Показано, что у больных со старческой деменцией и болезнью

Альцгеймера концентрация гомоцистеина превышает норму. Одним из описанных механизмов нейротоксичности гомоцистеина и его производных является взаимодействие с глутаматными рецепторами (Boldyrev A.A., Johnson P., 2007). Уже при средней гипергомоцистеинемии у пациентов проявляются нервно-сосудистые болезни, а также нарушения периферического кровообращения.

Пути гомоцистеинилирования белков

Некоторые аминоацил-тРНК-синтетазы (метионил-, лейцил-, изолейцил-тРНК-синтетазы) способны активировать гомоцистеин присоединением АТР, ошибочно принимая эту аминокислоту за свой субстрат. На следующем этапе вместо переноса гомоцистеин-аденилата на тРНК фермент превращает активированный гомоцистеин в гомоцистеинтиолактон (Jakubowski, 1997, Jakubowski, 2001, Jakubowski and Fersht, 1981, Jakubowski, 1995). За счет энергии ангидридной связи гомоцистеинаденилата образуется высокоэнергетическая тиоэфирная связь гомоцистеинтиолактона. Таким образом, гомоцистеинтиолактон способен к образованию пептидных связей с аминогруппами лизинов белков (Рис. 12) (Jakubowski, 1999). Эта модификация приводит к уменьшению положительного заряда белка, а появление SH-группы увеличивает вероятность олигомеризации через образование дисульфидных связей.

Гомоцистеин способен активироваться путем превращения в гомоцистеинил-тРНК. Почему же он способен активироваться и присоединяться к тРНК, не являясь протеиногенной аминокислотой? В настоящее время считается, что гомоцистеин является предпочтительной аминокислотой для аминоацилирования инициирующей тРНК в эукариотах. Фермент, активирующий гомоцистеин, напоминает бактериальную метионил-тРНК синтетазу: оба этих фермента ацилируют только инициирующую тРНК млекопитающих, и оба же способны модифицировать ацилированную инициирующую тРНК. По сути, гомоцистеинил-тРНК быстро метилируется до метионил-тРНК с помощью фактора метилирования аналогично тому, как происходит превращение бактериальной метионил-тРНК в формилметионил-тРНК. Это объясняет, почему активированный гомоцистеин не встречается в белках. Предполагается, что гомоцистеинтиолактон образуется при нарушениях метилирования гомоцистеинил-тРНК, которые могут наблюдаться в некоторых злокачественных клетках с нарушениями метаболизма метионина (Jakubowski and Goldman, 1993). Таким образом, новые данные показывают, что образование гомоцистеинтиолактона является знаком не ошибочной активации гомоцистеина, а нарушения метилирования гомоцистеинил-тРНК до метионил-тРНК (Antonio et al., 1997). С другой стороны, благодаря своей структурной схожести с метионином, изолейцином и лейцином, гомоцистеин может активироваться метионил-, изолейцил- и лейцил-тРНК синтетазами in vivo. Однако, корректирующие механизмы данных синтетаз, превращающих ошибочно активированный гомоцистеин в тиолактон, как правило не допускают трансляционного включения гомоцистеина в белок. Если бы боковой радикал гомоцистеина был модифицирован небольшой молекулой, улучшающей его связывание с сайтом специфичности и предотвращающей коррекцию, гомоцистеин мог бы включаться в белок при трансляции. Якубовский (Jakubowski, 2000) показал, что S-нитрозогомоцистеин включается в состав белка при трансляции как в E.coli, так и в ретикулоцитах кролика. Включение гомоцистеина в белок, опосредованное S-нитрозилированием, может происходить в клетке при нормальных условиях, внося вклад в гомоцистени-индуцированный патогенез.

Гомоцистеинтиолактон содержит внутримолекулярную высокоэнергетическую тиоэфирную связь. Являясь очень реакционноспособной молекулой, он способен ацилировать свободные аминогруппы боковых радикалов аргинина и лизина. Недавно было показано, что различные белки плазмы легко гомоцистеинилируются, в основном по боковым цепям лизина и цистеина (Jakubowski, 1999). Рисунок 12 иллюстрирует образование гомоцистеинтиолактона из гомоцистеинил-тРНК и гомоцистеинилирование белков. Гомоцистеинилирование модельных белков, таких как трипсин, привело к полной потере их ферментативной активности. Различные модификации белков ранее неоднократно связывали с развитием патологических процессов (Booth et al, 1997, Harrington and Colaco, 1994). Гомоцистеинилирование является новым примером повреждения белка, приводящего к патологии. Фибриллин-1 - один из белков внеклеточной соединительной ткани - очень чувствителен к гомоцистеинилированию. Присутствие большого количества EGF-подобных доменов в фибриллине и других внеклеточных белках, участвующих в коагуляции и транспорте липопротеинов, которые нарушаются при гипергомоцистеинемии, показывает, что эти домены могут быть местами предпочтительного гомоцистеинилирования (Krumdieck and Prince, 2000). Недавно было показано, что гомоцистеинтиолактон является важным компонентом метаболизма гомоцистеина в клетках сосудистого эндотелия, в которых гомоцистеин включается в белки, и масштаб образования тиолактона и гомоцистеинилирования белков зависит от внеклеточных концентраций гомоцистеина, фолиевой кислоты и ЛПВП (Jakubowski et al., 2000). Эти данные поддерживают гипотезу о том, что метаболическое превращение гомоцистеина в тиолактон и модификация белков последним могут играть значительную роль в гомоцистеин-индуцированном повреждении сосудов. Кальций-зависимая гомоцистеинтиолактонгидролаза, связанная с липопротеином высокой плотности в плазме человека, потенциально представляет собой защитный механизм, предотвращающий гомоцистеинилирование (1акиЬо\¥81а, 2000).

У-ОН

HS- Cys

Hey ю

Донор метальной группы

Ме( 3

Hcy-tRNA Л сН 0 с NH? Ь3

Wet-tRNA

Гомоцистеинтиолактон

Lys-NH2

Ацилированный белок

Рис. 12. Схема образования гомоцистеинтиолактона и реакций гомоцистеинилирования белков. (Цит. по (Medina et al., 2001))

В последнее десятилетие было показано, что гомоцистеинтиолактон, способный «сшивать» белки за счет взаимодействия с их лизиновыми остатками и последующего образования дисульфидных связей между введенными свободными сульфгидрильными группами, вовлечен в развитие ряда сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний (Jakubowski,

2008, Lawrence de Koning et al., 2003, Mattson and Shea, 2003, Obeid and

Herrmann, 2006, Seshadri, 2006, Spence et al., 2005, Suszynska et al., 2010).

Большинство работ такого рода основано на выявлении корреляции между концентрациями гомоцистеинтиолактона, гомоцистеина, активностями ферментов, вовлеченных в их метаболизм, содержанием

56 гомоцистеинилированных белков, с одной стороны, и теми или иными патологическими проявлениями с другой (Jakubowski, 2008, Lawrence de Koning et al., 2003, Mattson and Shea, 2003, Obeid and Herrmann, 2006, Seshadri, 2006, Spence et al., 2005, Suszynska et al., 2010). Существует также небольшое количество работ, в которых in vitro изучали влияние модификации гомоцистеинтиолактоном изолированных белков на их агрегационное состояние и другие свойства (Jakubowski, 1999, Paoli et al., 2010). Немногочисленные последние работы (Jakubowski, 1999, Jakubowski, 2008, Paoli et al., 2010) свидетельствуют о том, что даже при небольшом выходе модификации структура и функция белка могут значительно меняться. Так, гомоцистеинилирование приводит к агрегации таких белков, как БСА и другие белки крови и пр. (Paoli et al., 2010). Именно на основании результатов, полученных с помощью этих двух подходов, был сделан вывод о том, что патологическое воздействие гомоцистеинтиолактона обусловлено стимулированием агрегации и формированием крупных агрегатов. Однако существующие работы описывают этот эффект в основном на глобулярных белках со строго определенной третичной структурой (Paoli et al, 2010). До последнего времени не было работ, посвященных гомоцистеинилированию естественно неструктурированных белков, хотя прежде всего, именно они вовлечены в формирование амилоидных структур (Thorn et al., 2008, Tompa, 2002). Эти белки составляют значительную часть протеома и играют важную роль в множестве биологических процессов, включая нейродегенеративные и сердечно-сосудистые заболевания (Dunker et al., 2008, Galea et al., 2008, Raychaudhuri et al, 2009).

Патологическое влияние гомоцистеина и гомоцистеинтиолактона через N-гомоцистеинилирование белков изучено в меньшей степени вследствие "трудноуловимости" эффекта in vivo. Короткая жизнь и невысокие концентрации гомоцистеинтиолактона затрудняют количественное

57 определение и эффект модификации. Однако, для долгоживущих белков возможна кумулятивность, когда идет накопление модификации. Тем более, что в случае так называемых конформационных болезней, патологическая конверсия одной молекулы белка приводит к переходу в такое состояние нормальных белков. В нашем случае как модельные белки были использованы овечий прион и казеин.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

В работе были использованы липиды, гомоцистеинтиолактон, Трис, ДТТ, ß-меркаптоэтанол, глицерин, MOPS, ЭДТА, кумасси бриллиантовый синий, ДСН, коктейль ингибиторов протеаз, протеиназа К, гуанидин гидрохлорид, тиофлавин Т, ANS, Конго красный, мочевина, СаС12, КН2Р04 фирмы Sigma.

ГАФД из мышц кролика была выделена по классической методике (Scopes and Stoter, 1982). Используемые культуры с плазмидами рекомбинантных белков были предоставлены лабораторией функциональных исследований белков молока государственного института агрономических исследований в городе Нант.

Все растворы готовили на бидистиллированной воде.

Получение разных форм приона

Экспрессия

Продукцию вариантов ARR и VRQ приона осуществляли согласно методике, описанной (Rezaei et al, 2000), используя бактериальную культуру BL21 DE3 E.coli с плазмидой рЕТ 22Ь+. Для возобновления культуры 100 мл бактериальной среды LB (Luria Broth, Sigma), содержащей 100 мкг/мл ампициллина, заражали замороженной культурой и растили в течение ночи при 37°С и перемешивании 250 об/мин. Для продукции к 700 мл бактериальной среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 0,7% глицерина, добавляли прекультуру до оптической плотности 0,05 при 600 нм. Примерно через 4 часа, когда оптическая плотность достигала значения 2, к культуре добавляли 700 мл бактериальной среды и индуцировали экспрессию белка с помощью IPTG (до конечной концентрации 1 мМ). После продукции в течение ночи, культуру центрифугировали 12 минут при 4000g и температуре 4°С. Осадок, содержащий бактерии, промывали буфером (50 мМ Трис-НС1, 0.5 М NaCl, pH 7.4), а затем замораживали до температуры -80°С.

Эксперименты по верификации и оптимизации продукции производили в конечном объеме 100 мл.

Очистка

Экстракция

Бактериальные осадки суспендировали в лизирующем буфере (50 мМ Трис-HCl, содержащий 0,5 мг/мл лизоцима, 10 мМ ЭДТА, 0,1% Triton XI00, pH 8, набор ингибиторов протеаз (Sigma)) и инкубировали в течение 15 минут при температуре 37°С и перемешивании. Затем бактерии разрушали с помощью ультразвуковой обработки (Fisher Bioblock, Iiikirch, Франция) 10 импульсами по 10 секунд при максимальном напряжении 130 В. Лизаты центрифугировали при 10000g в течение 12 минут при 6°С.

Осадок, содержащий прион в нерастворимых телах включения, промывали трижды буфером (50 мМ Трис-HCl, pH 8,0), а затем солюбилизировали в буфере, содержащем 6 М гуанидинхлорид (50 мМ Трис-HCl, 0,5 М NaCl) в течении ночи при 4°С при перемешивании. После центрифугирования в течении 20 минут со скоростью 10000 g супернатант хранили при 4°С до проведения хроматографической очистки.

Аффинная хроматография

Хроматографические очистки вариантов приона осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на системе Akta Purifier с программным обеспечением Unicorn Control (Amersham Biosciences, Piscatway, США).

Фракции собирали с помощью автоматического коллектора. Колонки и носители использовали производства Amersham (GE Healthcare).

Разделение белков в данном случае происходит благодаря наличию в последовательности рекомбинантного белка гистидинового участка, обладающего высоким сродством к ионам никеля. Колонку заполняли носителем Chelating Sepharose FF (20 мл), а затем насыщали раствором NiSCV6H20 (0.2М). Непрочно связавшиеся ионы удаляли, промывая колонку 20 мМ ацетатным буфером, рН 4,0, уравновешивали колонку буфером (20 мМ Трис-НС1, 0,5 М NaCl, 10 мМ имидазол, 8 М мочевина, рН 7,4). Лизаты, после фильтрации через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, наносили на колонку. После промывания колонки буфером до выхода оптической плотности на постоянный уровень осуществляли этап ренатурации («рефолдинга») с помощью промывания колонки буфером, содержащим 20 мМ Трис-НС1, 0,3 М NaCl, 20 мМ имидазол, рН 7,4. Белок элюировали 1 М имидазольным буфером, рН 7,4, который замещает белок, связанный с ионами никеля. Хроматографию проводили со скоростью 2 мл/мин. Фракции собирали в объеме 3 мл.

Наличие приона во фракциях, полученных при выходе пика, анализировали путем ДСН-электрофореза.

Хранение

Для хранения прион переводили в 15 мМ ацетат-аммонийный буфер, рН 5,0 с помощью диализа, затем лиофилизировали.

Термоагрегация приона

Перед агрегацией пробы приона переводили в 20 мМ цитратный буфер, рН 3,4. Термическую агрегацию производили, используя аппарат для ПЦР (Techne) в диапазоне температуры между 45 и 90°С.

Агрегация приона при взаимодействии с фосфатидилинозитолом

Фосфатидилинозитол готовили в стоковой концентрации 10 мг/мл, растворяя в смеси метанол-хлороформ.

Гомоцистеинилирование приона

В большинстве экспериментов, если не указано иное, для гомоцистеинилирования использовали 10- и 100-кратный молярный избыток гомоцистеинтиолактона в расчете на содержание остатков лизина в белке. Гомоцистеинилирование проводили с 20 мкМ раствором приона (вариант VRQ) в 20 мМ MOPS буфере, рН 7,5. Свежеприготовленный раствор гомоцистеинтиолактона добавляли к раствору белка, затем контролировали рН, добавляя NaOH при закислении. Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течении 20-24 часов, из литературных данных известно, что за это время непрореагировавший тиолактон полностью гидролизуется.

Для имитации "физиологических" условий в течение месяца к раствору трижды добавляли гомоцистеинтиолактон до конечной концентрации 100 мкМ, инкубируя при 37°С. При этом использовали 42 мкМ раствор приона в том же буфере, содержащем 0,03% азида натрия.

Получение разных форм казеинов

Разделение нашивных aSl, /3, к-казеинов молока с помощью анионобменной хроматографии

Казеиновую фракцию коровьего молока растворяли в 50 мМ Трис-НС1 буфере, содержащем 8 М мочевины, 20 мМ ДТТ, рН 8, в концентрации 100 мг/мл, а затем центрифугировали со скоростью 10 000 g в течении 10 минут.

Белок наносили на колонку HR 10/10, заполненную носителем Source 15Q и уравновешенную 25 мМ Трис- НС1 буфером, 4 М мочевина, 5 мМ ДТТ, рН 8,2. Элюцию проводили градиентом от 0 до 0,3 М NaCl в том же буфере, со скоростью 3 мл/мин, измеряя оптическую плотность раствора при 280 нм.

Полученные фракции анализировали с помощью ДСН-электрофореза, фракции, содержащие чистые Р- и к-казеины трехкратно диализовали против воды, а затем доводили рН до 8 и лиофилизировали.

Для разделения aSl- и а82-казеинов использовали катионобменную хроматографию на носителе MonoS по описанной в литературе методике (Thorn et al., 2008).

Получение разных форм рекомбинантного fi-казеина

Экспрессия рекомбинантного fi-казеина

Для возобновления культуры 100 мл бактериальной среды LB (Luria Broth, Sigma), содержащей 100 мкг/мл ампициллина, заражали замороженной культурой и растили в течение ночи при 37°С и перемешивании 250 об/мин. Для продукции в 4 л ферментер (Bio Console ADI 1025, управляемый Bio

Controller ADI 1010, Applikon, Нидерланды), содержащий 2 л бактериальной среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 0,7% глицерина, добавляли прекультуру до оптической плотности 0,1 при 600 нм и 200 мкл жидкости, предотвращающей пенообразование (Sigma, Steinheim, Германия). На протяжении всего времени роста культуру оксигенировали сжатым воздухом со скоростью 4 л/мин при температуре 37°С и скорости перемешивания 600 об/мин. Когда оптическая плотность достигала значения 0,6, к культуре добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ для индукции экспрессии.

После продукции в течение 3 часов, культуру центрифугировали 12 минут при 4000g и температуре 4°С. Осадок, содержащий бактерии, промывали буфером (50 мМ Трис-НС1, 0.5 М NaCl, рН 7.4), а затем замораживали до температуры -80°С.

Очистка

Экстракция белков

Бактериальный осадок суспендировали в лизирующем буфере (25 мМ Трис-HCl, рН 8, 8 М мочевина). Бактерии разрушали с помощью ультразвуковой обработки 10 импульсами по 10 секунд при максимальном напряжении 130 В. Затем рН лизата доводили до 2 с помощью концентрированной соляной кислоты для преципитации нуклеопротеиновой фракции. Лизаты центрифугировали при 10000g в течение 25 минут при 6°С. Полученный супернатант, содержащий Р-казеин и внутриклеточные белки, хранили при 4°С до хроматографической очистки.

Хроматографическая очистка

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Стройлова (Щуцкая), Юлия Юрьевна

выводы

1. При введении остатков цистеина в (З-казеин он приобретает способность к димеризации, причем С-концевой мутант С208 димеризуется более эффективно, чем 1Ч-концевой С4.

2. Гомоцистеинилирование нативных а81- и Р-казеинов приводит к формированию крупных сферических агрегатов, содержащих казенны с измененной структурой, а гомоцистеинилированный к-казеин демонстрирует амилоидоподобные свойства и формирует фибриллы.

3. Термоагрегация приона приводит к амилоидогенной трансформации через образование малых олигомеров.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Стройлова (Щуцкая), Юлия Юрьевна, Москва

1. Б. И. Курганов. (2002) Кинетика агрегации белков. Количественная оценка шаперонной активности в тестах, основанных на подавлении агрегации белков. Биохимия, 67(4): 409-422.

2. Б. И. Курганов, Э. Р. Рафикова, Е. Н. Добров. (2002) Кинетика тепловой агрегации белка оболочки вируса табачной мозаики. Биохимия, 67(5): 525-533.

3. К. А. Маркосян и Б. И. Курганов. (2004) Фолдинг, неправильный фолдинг и агрегация. Образование телец включения и агресом. Биохимия, 69(9): 971-984.

4. В. Покровский, И., Киселев, 0.,И., Черкасский, Б.,Л. (2004) Прионы и прионные болезни. Издательство РАМН, стр. 141-143.

5. A. Aguzzi and M. Polymenidou. (2004) Mammalian prion biology: one century of evolving concepts. Cell, 116(2): 313-327.

6. A. Aguzzi, C. Sigurdson and M. Heikenwaelder. (2008) Molecular mechanisms of prion pathogenesis. Annu Rev Pathol, 3(11-40.

7. C. M. Antonio, M. C. Nunes, H. Refsum and A. K. Abraham. (1997) A novel pathway for the conversion of homocysteine to methionine in eukaryotes. Biochem J, 328 ( Pt 1)(165-170.

8. T. Ban, D. Hamada, K. Hasegawa, H. Naiki and Y. Goto. (2003) Direct observation of amyloid fibril growth monitored by thioflavin T fluorescence. J Biol Chem, 278(19): 16462-16465.

9. S. Banon and J. Hardy. (1992) A Colloidal Approach of Milk Acidification by Glucono-Delta-Lactone. Journal of Dairy Science, 75(4): 935-941.

10. A. Barth and C. Zscherp. (2002) What vibrations tell us about proteins. Q RevBiophys, 35(4): 369-430.

11. M. Baylis and W. Goldmann. (2004) The genetics of scrapie in sheep and goats. CurrMolMed, 4(4): 385-396.

12. A. A. Booth, R. G. Khalifah, P. Todd and B. G. Hudson. (1997) In vitro kinetic studies of formation of antigenic advanced glycation end products (AGEs). Novel inhibition of post-Amadori glycation pathways. J Biol Chem, 272(9): 5430-5437.

13. J. P. Brockes. (1999) Topics in prion cell biology. Curr Opin Neurobiol, 9(5): 571-577.

14. J. T. Brosnan, R. L. Jacobs, L. M. Stead and M. E. Brosnan. (2004) Methylation demand: a key determinant of homocysteine metabolism. Acta BiochimPol, 51(2): 405-413.

15. R. Bujdoso, D. F. Burke and A. M. Thackray. (2005) Structural differences between allelic variants of the ovine prion protein revealed by molecular dynamics simulations. Proteins, 61(4): 840-849.

16. B. Bukau and A. L. Horwich. (1998) The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell, 92(3): 351-366.

17. Z. M. Bumagina, B. Y. Gurvits, N. V. Artemova, K. O. Muranov, I. K. Yudin and B. I. Kurganov. (2010) Mechanism of suppression of dithiothreitol-induced aggregation of bovine alpha-lactalbumin by alpha-crystallin. Biophys Chem, 146(2-3): 108-117.

18. D. M. Byler, H. M. Farrell, Jr. and H. Susi. (1988) Raman Spectroscopic Study of Casein Structure. Journal of Dairy Science, 71(10): 2622-2629.

19. P. W. Caessens, H. H. De Jongh, W. Norde and H. Gruppen. (1999) The adsorption-induced secondary structure of beta-casein and of distinct parts of its sequence in relation to foam and emulsion properties. Biochim Biophys Acta, 1430(1): 73-83.

20. R. W. Carrell and D. A. Lomas. (1997) Conformational disease. Lancet, 350(9071): 134-138.

21. V. Cavalca, G. Cighetti, F. Bamonti, A. Loaldi, L. Bortone, C. Novembrino, M. De Franceschi, R. Belardinelli and M. D. Guazzi. (2001) Oxidative stress and homocysteine in coronary artery disease. Clin Chem, 47(5): 887-892.

22. B. Chesebro, M. Trifilo, R. Race, K. Meade-White, C. Teng, R. LaCasse, L. Raymond, C. Favara, G. Baron, S. Priola, B. Caughey, E. Masliah and M.

23. Oldstone. (2005) Anchorless prion protein results in infectious amyloid disease without clinical scrapie. Science, 308(5727): 1435-1439.

24. J. H. Come, P. E. Fraser and P. T. Lansbury, Jr. (1993) A kinetic model for amyloid formation in the prion diseases: importance of seeding. Proc Natl AcadSci USA, 90(13): 5959-5963.

25. L. K. Creamer, T. Richardson and D. A. Parry. (1981) Secondary structure of bovine alpha si- and beta-casein in solution. Arch Biochem Biophys, 211(2): 689-696.

26. M. den Heijer, T. Koster, H. J. Blom, G. M. Bos, E. Briet, P. H. Reitsma, J. P. Vandenbroucke and F. R. Rosendaal. (1996) Hyperhomocysteinemia as a risk factor for deep-vein thrombosis. N Engl J Med, 334(12): 759-762.

27. A. Der-Sarkissian, C. C. Jao, J. Chen and R. Langen. (2003) Structural organization of alpha-synuclein fibrils studied by site-directed spin labeling. J Biol Chem, 278(39): 37530-37535;

28. C. M. Dobson. (2001) Protein folding and its links with human disease. Biochem Soc Symp, 68): 1-26.

29. H. Doi, F. Ibuki and M. Kanamori. (1979) Heterogeneity of Reduced Bovine {kappa}-Casein. Journal of Dairy Science, 62(2): 195-203.

30. A. K. Dunker, C. J. Oldfield, J. Meng, P. Romero, J. Y. Yang, J. W. Chen, V. Vacic, Z. Obradovic and V. N. Uversky. (2008) The unfoldomics decade: an update on intrinsically disordered proteins. BMC Genomics, 9 Suppl 2(S1.

31. H. Ecroyd, T. Koudelka, D. C. Thorn, D. M. Williams, G. Devlin, P. Hoffmann and J. A. Carver. (2008) Dissociation from the oligomeric state isthe rate-limiting step in fibril formation by kappa-casein. J Biol Chem, 283(14): 9012-9022.

32. G. L. Ellman. (1959) Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys, 82(1): 70-77.

33. H. M. Farrell, P. X. Qi and V. N. Uversky. (2006) New Views of Protein Structure: Applications to the Caseins: Protein Structure and Functionality. Advances in Biopolymers, A.S.C. Symposium series, 935(52-70.

34. L. Ferretti, P. Leone and V. Sgaramella. (1990) Long range restriction analysis of the bovine casein genes. Nucleic Acids Res, 18(23): 6829-6833.

35. D. Fink. (1998) Against medical advice. AssiaJew Med Ethics, 3(2): 36-47.

36. P. Frid, S. V. Anisimov and N. Popovic. (2007) Congo red and protein aggregation in neurodegenerative diseases. Brain Res Rev, 53(1): 135-160.

37. D. C. Gajdusek. (1988) Transmissible and non-transmissible amyloidoses: autocatalytic post-translational conversion of host precursor proteins to beta-pleated sheet configurations. JNeuroimmunol, 20(2-3): 95-110.

38. C. A. Galea, Y. Wang, S. G. Sivakolundu and R. W. Kriwacki. (2008) Regulation of cell division by intrinsically unstructured proteins: intrinsic flexibility, modularity, and signaling conduits. Biochemistry, 47(29): 75987609.f.

39. D. S. Gallagher, C. P. Schelling, M. M. A. Groenen and J. E. Womack. (1994) Confirmation that the casein gene cluster resides on cattle Chromosome 6. Mammalian Genome, 5(8): 524-524.

40. K. Gast, H. Damaschun, K. Eckert, K. Schulze-Forster, H. R. Maurer, M. Muller-Frohne, D. Zirwer, J. Czarnecki and G. Damaschun. (1995) Prothymosin alpha: a biologically active protein with random coil conformation. Biochemistry, 34(40): 13211-13218.

41. A. D. Gossert, S. Bonjour, D. A. Lysek, F. Fiorito and K. Wuthrich. (2005) Prion protein NMR structures of elk and of mouse/elk hybrids. Proc Natl AcadSci USA, 102(3): 646-650.

42. C. Govaerts, H. Wille, S. B. Prusiner and F. E. Cohen. (2004) Evidence for assembly of prions with left-handed beta-helices into trimers. Proc Natl AcadSci USA, 101(22): 8342-8347.

43. M. A. M. Groenen, R. J. M. Dijkhof, A. J. M. Verstege and J. J. van der Poel. (1993) The complete sequence of the gene encoding bovine alphas-casein. Gene, 123(2): 187-193.

44. F. Grosclaude, M. F. Mahe and B. Ribadeau-Dumas. (1973) Primary structure of alpha casein and of bovine beta casein. Correction. Eur J Biochem, 40(1): 323-324.

45. Gryczynski, Z. Gryczynski and J. R. Lakowicz. (1999) Polarization sensing with visual detection. Anal Chem, 71(7): 1241-1251.

46. L. F. Haire, S. M. Whyte, N. Vasisht, A. C. Gill, C. Verma, E. J. Dodson, G. G. Dodson and P. M. Bayley. (2004) The crystal structure of the globular domain of sheep prion protein. J Mol Biol, 336(5): 1175-1183.

47. C. R. Harrington and C. A. Colaco. (1994) Alzheimer's disease. A glycation connection. Nature, 370(6487): 247-248.

48. C. Holt and L. Sawyer. (1988) Primary and predicted secondary structures of the caseins in relation to their biological functions. Protein Eng, 2(4): 251259.

49. D. S. Home. (1998) Casein interactions: Casting light on the black boxes, the structure in dairy products. Int Dairy J, 8(3): 7.

50. D. S. Home. (2002) Casein structure, self-assembly and gelation. Current Opinion in Colloid & Interface Science, 7(5-6): 456-461.

51. A. Horwich. (2002) Protein aggregation in disease: a role for folding intermediates forming specific multimeric interactions. The Journal of Clinical Investigation, 110(9): 1221-1232.

52. Z. Huang, J. M. Gabriel, M. A. Baldwin, R. J. Fletterick, S. B. Prusiner and F. E. Cohen. (1994) Proposed three-dimensional structure for the cellular prion protein. Proc Natl Acad Sci USA, 91(15): 7139-7143.

53. Z. Huang, S. B. Prusiner and F. E. Cohen. (1995) Scrapie prions: a three-dimensional model of an infectious fragment. FoldDes, 1(1): 13-19.

54. H. Jakubowski and A. R. Fersht. (1981) Alternative pathways for editing non-cognate amino acids by aminoacyl-tRNA synthetases. Nucleic Acids Res, 9(13): 3105-3117.

55. H. Jakubowski and E. Goldman. (1993) Synthesis of homocysteine thiolactone by methionyl-tRNA synthetase in cultured mammalian cells. FEBS Lett, 317(3): 237-240.

56. H. Jakubowski. (1997) Metabolism of homocysteine thiolactone in human cell cultures. Possible mechanism for pathological consequences of elevated homocysteine levels. J Biol Chem, 272(3): 1935-1942.

57. H. Jakubowski. (1999) Protein homocysteinylation: possible mechanism underlying pathological consequences of elevated homocysteine levels. FASEBJ, 13(15): 2277-2283.

58. H. Jakubowski. (2000) Translational incorporation of S-nitrosohomocysteine into protein. J Biol Chem, 275(29): 21813-21816.

59. H. Jakubowski. (2000) Calcium-dependent human serum homocysteine thiolactone hydrolase. A protective mechanism against protein N-homocysteinylation. J Biol Chem, 275(6): 3957-3962.

60. H. Jakubowski, L. Zhang, A. Bardeguez and A. Aviv. (2000) Homocysteine thiolactone and protein homocysteinylation in human endothelial cells: implications for atherosclerosis. Circ Res, 87(1): 45-51.

61. H. Jakubowski. (2001) Translational accuracy of aminoacyl-tRNA synthetases: implications for atherosclerosis. JNutr, 131(11): 2983S-2987S.

62. H. Jakubowski. (2006) Pathophysiological consequences of homocysteine excess. JNutr, 136(6 Suppl): 1741S-1749S.

63. H. Jakubowski. (2008). The pathophysiological »hypothesis of homocysteine thiolactone-mediated vascular disease. J Physiol Pharmacol, 59 Suppl 9(155-167.

64. H. Jakubowski, G. H. Boers and K. A. Strauss. (2008) Mutations in cystathionine beta-synthase or methylenetetrahydrofolate reductase gene increase N-homocysteinylated protein levels in humans. FASEB J, 22(12): 4071-4076.

65. J. Jakubowski. (1995) Blood supply, blood flow and autoregulation in the adenohypophysis, and altered patterns in oestrogen-induced adenomatous hyperplasia. Br J Neurosurg, 9(3): 331-346.

66. K. Kajiwara, R. Niki, H. Urakawa, Y. Hiragi, N. Donkai and M. Nagura. (1988) Micellar structure of beta-casein observed by small-angle X-ray scattering. Biochim Biophys Acta, 955(2): 128-134.

67. M. Kataoka, K. Kuwajima, F. Tokunaga and Y. Goto. (1997) Structural characterization of the molten globule of alpha-lactalbumin by solution X-ray scattering. Protein Sci, 6(2): 422-430.

68. J. W. Kelly. (2000) Mechanisms of amyloidogenesis. Nat Struct Biol, 7(10): 824-826.

69. T. Kitamoto, R. Iizuka and J. Tateishi. (1993) An amber mutation of prion protein in Gerstmann-Straussler syndrome with mutant PrP plaques. Biochem Biophys Res Commun, 192(2): 525-531.

70. K. J. Knaus, M. Morillas, W. Swietnicki, M. Malone, W. K. Surewicz and V. C. Yee. (2001) Crystal structure of the human prion protein reveals a mechanism for oligomerization. Nat Struct Biol, 8(9): 770-774.

71. C. L. Krumdieck and C. W. Prince. (2000) Mechanisms of homocysteine toxicity on connective tissues: implications for the morbidity of aging. J Nutr, 130(2S Suppl): 365S-368S.

72. S. Kumar, A. K. Singh, G. Krishnamoorthy and R. Swaminathan. (2008) Thioflavin T displays enhanced fluorescence selectively inside anionic micelles and mammalian cells. JFluoresc, 18(6): 1199-1205.

73. T. F. Kumosinski, E. M. Brown and H. M. Farrell, Jr. (1993) Three-dimensional molecular modeling of bovine caseins: an energy-minimized beta-casein structure. J Dairy Sci, 76(4): 931-945.

74. U. K. Laemmli. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(5259): 680-685.

75. A. B. Lawrence de Koning, G. H. Werstuck, J. Zhou and R. C. Austin. (2003) Hyperhomocysteinemia and its role in the development of atherosclerosis. Clin Biochem, 36(6): 431-441.

76. E. Leclerc and P. Calmettes. (1997) Structure of beta.-casein micelles. Physica B: Condensed Matter, 241-243(1141-1143.

77. R. W. Lencki. (2007) Evidence for fibril-like structure in bovine casein micelles. J Dairy Sci, 90(1): 75-89.

78. Y. D. Livney, A. L. Schwan and D. G. Dalgleish. (2004) A study of beta-casein tertiary structure by intramolecular crosslinking and mass spectrometry. J Dairy Sci, 87(11): 3638-3647.

79. K. A. Markossian, N. V. Golub, S. Y. Kleymenov, K. O. Muranov, M. V. Sholukh and B. I. Kurganov. (2009) Effect of alpha-crystallin on thermostability of mitochondrial aspartate aminotransferase. Int J Biol Macromol, 44(5): 441-446.

80. K. A. Markossian, I. K. Yudin and B. I. Kurganov. (2009) Mechanism of suppression of protein aggregation by alpha-crystallin. Int J Mol Sci, 10(3): 1314-1345.

81. M. P. Mattson and T. B. Shea. (2003) Folate and homocysteine metabolism in neural plasticity and neurodegenerative disorders. Trends Neurosci, 26(3): 137-146.

82. D. Matulis, C. G. Baumann, V. A. Bloomfield and R. E. Lovrien. (1999) 1-anilino-8-naphthalene sulfonate as a protein conformational tightening agent. Biopolymers, 49(6): 451 -458.

83. J. L. Mazzola and M. A. Sirover. (2003) Subcellular alteration of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in Alzheimer's disease fibroblasts. J Neurosci Res, 71(2): 279-285.

84. W. E. Meador, A. R. Means and F. A. Quiocho. (1992) Target enzyme recognition by calmodulin: 2.4 A structure of a calmodulin-peptide complex. Science, 257(5074): 1251-1255.

85. M. Medina, J. L. Urdíales and M. I. Amores-Sanchez. (2001) Roles of homocysteine in cell metabolism: old and new functions. Eur J Biochem, 268(14): 3871-3882.

86. J. C. Mercier, J. L., Maubois, S. Poznanski and B. Ribadeau-Dumas. (1968) Preparative fractionation of caseins from cattle and sheep by chromatography on D.E.A.E. cellulose using urea and 2-mercaptoethanol. Bull Soc Chim Biol (Paris), 50(3): 521-530.

87. J. C. Mercier, F. Grosclaude and B. Ribadeau-Dumas. (1971) Primary structure of bovine si casein. Complete sequence. Eur J Biochem, 23(1): 41-51.

88. J. L. Mills, J. M. Scott, P. N. Kirke, J. M. McPartlin, M. R. Conley, D. G. Weir, A. M. Molloy and Y. J. Lee. (1996) Homocysteine and neural tube defects. JNutr, 126(3): 756S-760S.

89. C. V. Morr. (1967) Effect of Oxalate and Urea upon Ultracentrifiigation Properties of Raw and Heated Skimmilk Casein Micelles. Journal of Dairy Science, 50(11): 1744-1751.

90. W. L. Nelen, E. A. Steegers, T. K. Eskes and H. J. Blom. (1997) Genetic risk factor for unexplained recurrent early pregnancy loss. Lancet, 350(9081): 861.

91. M. R. Nilsson. (2004) Techniques to study amyloid fibril formation in vitro. Methods, 34(1): 151-160.

92. R. Obeid and W. Herrmann. (2006) Mechanisms of homocysteine neurotoxicity in neurodegenerative diseases with special reference to dementia. FEBSLett, 580(13): 2994-3005.

93. B. Oesch, D. Westaway, M. Walchli, M. P. McKinley, S. B. Kent, R. Aebersold, R. A. Barry, P. Tempst, D. B. Teplow, L. E. Hood and et al. (1985) A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell, 40(4): 735746.

94. K. Okumura, Y. Miyake, H. Taguchi and Y. Shimabayashi. (1990) Formation of stable protein foam by intermolecular disulfide cross-linkages in thiolated .alpha.sl-casein as a model. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 38(6): 1*303-1306.

95. A. Okuno; M. Kato and Y. Taniguchi. (2006) The secondary structure of pressure- and temperature-induced aggregates of equine serum albumin studied by FT-IR spectroscopy. Biochim Biophys Acta, 1764(8): 1407-1412.

96. P. Paoli, F. Sbrana, B. Tiribilli, A. Caselli, B. Pantera, P. Cirri, A. De Donatis, L. Formigli, D. Nosi, G. Manao, G. Camici and G. Ramponi. (2010) Protein N-Homocysteinylation Induces the Formation of Toxic Amyloid-like protofibrils. J Mol Biol,

97. R. V. Pappu, R. Srinivasan and G. D. Rose. (2000) The Flory isolated-pair hypothesis is not valid for polypeptide chains: implications for protein folding. Proc Natl Acad Sci USA, 97(23): 12565-12570.

98. L. Pepper and H. M. Farrell, Jr. (1982) Interactions Leading to Formation of Casein Submicelles. Journal of Dairy Science, 65(12): 22592266.

99. S. B. Prusiner and S. J. DeArmond. (1990) Prion diseases of the central nervous system. Monogr Pathol, 32): 86-122.

100. S. B. Prusiner and S. J. DeArmond. (1991) Molecular biology and pathology of scrapie and the prion diseases of humans. Brain Pathol, 1(4): 297-310.

101. S. B. Prusiner. (1994) Neurodegeneration in humans caused by prions. West J Med, 161(3): 264-272.

102. S. B. Prusiner. (1998) Prions. Proc Natl Acad Sci USA, 95(23): 13363-13383.

103. S. B. Prusiner, M. R. Scott, S. J. DeArmond and F. E. Cohen. (1998) Prion protein biology. Cell, 93(3): 337-348.

104. O. B. Ptitsyn. (1995) Molten globule and protein folding. Adv Protein Chem, 47(83-229.

105. H. Puchtler and F. Sweat. (1965) Congo red as a stain for fluorescence microscopy of amyloid. JHistochem Cytochem, 13(8): 693-694.

106. J. Pujolie, B. Ribadeau-Dumas, J. Gamier and R. Pion. (1966) A study of k-casein components : I Preparation. Evidence for. a common C-terminal sequence. Biochemical and Biophysical Research Communications, 25(3): 285-290.

107. E. R. Rafikova, B. I. Kurganov, A. M. Arutyunyan, S. V. Kust, V. A. Drachev and E. N. Dobrov. (2003) A mechanism of macroscopic (amorphous) aggregation of the tobacco mosaic vims coat protein. Int J Biochem Cell Biol, 35(10): 1452-1460.

108. L. K. Rasmussen, P. Hojrup and T. E. Petersen. (1992) Localization of two interchain disulfide bridges in dimers of bovine alphaS2-casein. European Journal of Biochemistry, 203(3): 381-386.

109. S. Raychaudhuri, S. Dey, N. P. Bhattacharyya and D. Mukhopadhyay. (2009) The role of intrinsically unstructured proteins in neurodegenerative diseases. PLoS One, 4(5): e5566.

110. H. Rezaei, Y. Choiset, F. Eghiaian, E. Treguer, P. Mentre, P. Debey, J. Grosclaude and T. Haertle. (2002) Amyloidogenic unfolding intermediates differentiate sheep prion protein variants. J Mol Biol, 322(4): 799-814.

111. R. Riek, S. Hornemann, G. Wider, R. Glockshuber and K. Wuthrich. (1997) NMR characterization of the full-length recombinant murine prion protein, mPrP(23-231). FEBS Lett, 413(2): 282-288.

112. P. Romero, Z. Obradovic, C. R. Kissinger, J. E. Villafranca, E. Garner, S. Guilliot and A. K. Dunker. (1998) Thousands of proteins likely to have long disordered regions. Pac Symp Biocomput, 437-448.

113. E. Sabuncu, S. Petit, A. Le Dur, T. Lan Lai, J. L. Vilotte, H. Laude and D. Vilette. (2003) PrP polymorphisms tightly control sheep prion replication in cultured cells. J Virol, 77(4): 2696-2700.

114. O. Schweers, E. Schonbrunn-Hanebeck, A. Marx and E. Mandelkow. (1994) Structural studies of tau protein and Alzheimer paired helical filaments show no evidence for beta-structure. J Biol Chem, 269(39): 2429024297.

115. R. K. Scopes and A. Stoter. (1982) Purification of all glycolytic enzymes from one muscle extract. Methods Enzymol, 90 Pt E(479-490.

116. G. V. Semisotnov, N. A. Rodionova, O. I. Razgulyaev, V. N. Uversky, A. F. Gripas and R. I. Gilmanshin. (1991) Study of the "molten globule" intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent probe. Biopolymers, 31(1): 119-128.

117. S. Seshadri. (2006) Elevated plasma homocysteine levels: risk factor or risk marker for the development of dementia and Alzheimer's disease? J Alzheimers Dis, 9(4): 393-398.

118. P. D. Shimmin and R. D. Hill. (1964) An electron microscope study of the internal structure of casein micelles. Journal of Dairy Research, 31(01): 121-123.

119. J. R. Silveira, G. J. Raymond, A. G. Hughson, R. E. Race, V. L. Sim, S. F. Hayes and B. Caughey. (2005) The most infectious prion protein particles. Nature, 437(7056): 257-261.

120. J. Slavik. (1982) Anilinonaphthalene sulfonate as a probe of membrane composition and function. Biochim Biophys Acta, 694(1): 1-25.

121. J. D. Spence, H. Bang, L. E. Chambless and M. J'. Stampfer. (2005) Vitamin Intervention For Stroke Prevention* trial: an efficacy analysis. Stroke, 36(11): 2404-2409.

122. N. Sreerama and R. W. Woody. (2004) Computation and analysis of protein circular dichroism spectra. Methods Enzymol, 383(318-351.

123. M. Sunde, L. C. Serpell, M. Bartlam, P. E. Fraser, M. B. Pepys and C. C. Blake. (1997) Common core structure of amyloid fibrils by synchrotron X-ray diffraction. JMol Biol, 273(3): 729-739.

124. J. Suszynska, J. Tisonczyk, H. G. Lee, M. A. Smith and H. Jakubowski. (2010) Reduced homocysteine-thiolactonase activity in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis, 19(4): 1177-1183.

125. H. E. Swaisgood. (1993) Review and update of casein chemistry. J Dairy Sci, 76(10): 3054-3061.

126. A. M. Thackray, S. Yang, E. Wong, T. J. Fitzmaurice, R. J. MorganWarren and R. Bujdoso. (2004) Conformational variation between allelic variants of cell-surface ovine prion protein. Biochem J, 381(Pt 1): 221-229.

127. P. Tompa. (2002) Intrinsically unstructured.proteins. Trends Biochem Sci, 27(10): 527-533.i

128. V. N. Uversky and O. B. Ptitsyn. (1996) Further evidence on the equilibrium "pre-molten globule state": four-state guanidinium chloride-induced unfolding of carbonic anhydrase B at low temperature. J Mo I Biol, 255(1): 215-228.

129. V. N. Uversky, J. R. Gillespie and A. L. Fink. (2000) Why are "natively unfolded" proteins unstructured under physiologic conditions? Proteins, 41(3): 415-427.

130. V. N. Uversky. (2002) Natively unfolded proteins: a point where biology waits for physics. Protein Sci, 11(4): 739-756.

131. H. J. Vreeman, P. Both, J. A. Brinkhuis and C. Van Der Spek. (1977) Purification and some physicochemical properties of bovine kappa.-casein. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Protein Structure, 491(1): 93-103.

132. T. Wade and J. K. Beattie. (1997) Electroacoustic determination of size and zeta potential of fat globules in milk and cream emulsions. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 10(2): 73-85.

133. D. F. Waugh, E. K. Creamer, C. W. Slattery and G. W. Dresdner. (1970) Core polymers of casein micelles. Biochemistry, 9(4): 786-795.

134. P. H. Weinreb, W. Zhen, A. W. Poon, K. A. Conway and P. T. Lansbury, Jr. (1996) NACP, a protein» implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry, 35(43): 13709-13715.

135. W. J. Welch and P. Gambetti. (1998) Chaperoning brain diseases. Nature, 392(6671): 23-24.

136. S. Wickner, M. R. Maurizi and S. Gottesman. (1999) Posttranslational quality control: folding, refolding, and degrading proteins. Science, 286(5446): 1888-1893.

137. M. P. Williamson. (1994) The structure and function of proline-rich regions in proteins. Biochem J, 297 ( Pt 2)(249-260.

138. E. Wong, A. M. Thackray and R. Bujdoso. (2004) Copper induces increased beta-sheet content in the scrapie-susceptible ovine prion protein PrPVRQ compared with the resistant allelic variant PrPARR. Biochem J, 380(Pt 1): 273-282.

139. J. H. Woychik, E. B. Kalan and M. E. Noelken. (1966) Chromatographic isolation and partial characterization of reduced kappa-casein components. Biochemistry, 5(7): 2276-2282.

140. P. E. Wright and H. J. Dyson. (1999) Intrinsically unstructured proteins: re-assessing the protein structure-function paradigm. J Mol Biol, 293(2): 321-331.

141. J. H. Yoo and S. C. Lee. (2001) Elevated levels of plasma homocysteine and asymmetric dimethylarginine in elderly patients with stroke. Atherosclerosis, 158(2): 425-430.

Информация о работе

Стройлова (Щуцкая), Юлия Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Роль агрегации и образования дисульфидных связей в формировании амилоидных структур естественно развернутыми белками: прионом и казеином - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы