Диссертации » Физико-химическая биология » Биохимия

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммуномодулирующее действие внеклеточных дезоксирибонуклеиновых кислот
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммуномодулирующее действие внеклеточных дезоксирибонуклеиновых кислот"

На правах рукописи

ЧЕРЕПАНОВА АННА ВИТАЛЬЕВНА

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВЫХ

КИСЛОТ

03.01.04 — биохимия

Автореферат диссертации иа соискание учёной степени кандидата биологических наук

7 ФЕВ 2013

Новосибирск - 2013

005049346

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

к.б.н. Лактионов Павел Петрович

Официальные оппоненты:

Карпенко Лариса Ивановна, д.б.н., доцент Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, зав. лабораторией.

Бунева Валентина Николаевна, д.б.н., профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г.н.с.

Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН

Защита состоится «15» февраля 2013 г. в 10:00 часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан «11» января 2013 г.

Ведущая организация:

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Вирусные и бактериальные нуклеиновые кислоты активируют врожденный иммунитет млекопитающих, взаимодействуя с паттерн-распознающими рецепторами. Распознавание экзогенных нуклеиновых кислот осуществляется за счет специфических химических и структурных особенностей, характерных для ДНК и РНК патогенов, например, неметилированных цитозинов в составе СрО динуклеотидов бактериальной ДНК пли двуцепочечной структуры вирусных РНК. Однако в целом структура эндогенных и прокариотических нуклеиновых кислот отличается незначительно, поэтому сигналом для активации может быть нетипичная локализация нуклеиновых кислот, например, присутствие дцДНК в цитоплазме. Одним из примеров неканонической локализации нуклеиновых кислот является их присутствие во внеклеточной среде, причем если в норме внеклеточные нуклеиновые кислоты (внНК) активно элиминируются из биологических жидкостей и их концентрация невысока, то при некоторых патологических состояниях концентрация внНК значительно возрастает, что может приводить к активации иммунной системы. Примером индукции иммунного ответа на ДНК являются аутоиммунные заболевания, такие как системная красная волчанка и ревматоидный артрит, при которых ДНК выступает основным аутоантигеном.

Исследование роли внеклеточных ДНК в реакциях врожденного иммунитета позволит установить их значение для нормального функционирования организма и развития иммунопатологических состояний, сопровождающихся повышенным уровнем внеклеточных нуклеиновых кислот.

Цель работы. Целью работы является исследование иммуномодули-рующего действия внеклеточных дезоксирибонуклеиновых кислот и поиск клеточных мишеней иммуномодулирующей ДНК. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: 1) исследовать влияние геномной и внеклеточной ДНК (внДНК) на продукцию провоспалительных интерлейкинов клетками, участвующими в генерации врожденного иммунного ответа; 2) исследовать костимулирующее действие ДНК с лигандами ТЬИЗ и ТЫ14 - ро1у(1:С) и липополисахарида (ЛПС), а также его зависимость от внутриклеточной локализации ДНК и костимуляторных молекул; 3) провести поиск потенциальных клеточных мишеней иммуномодулирующих ДНК при помощи выявления и идентификации белков, формирующих прочные комплексы с иммуномодулирующими олигодезоксирибонуклеотидами (ОДН).

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведено исследование иммуномоцулирутощего действия внДНК in vitro в культурах первичных клеток человека - эндотелиоцитов и фибробластов, в результате которого показано, что ДНК из различных источников (бактериальная, эукариотическая геномная, свободная и связанная с поверхностью клеток внДНК) не активирует клетки, несмотря на экспрессию в них ДНК-распознающих рецепторов. Показано, что ДНК ингибирует poly(I:C)-индуцированную продукцию интерлейкинов, причем наиболее эффективным ингибитором является связанная с поверхностью клеток ДНК (скпДНК). Ингибирующее действие зависит от последовательности ДНК; были выявлены ОДН - эффективные ингибиторы ро1у(1:С)-индуцированной продукции интерлейкинов, которые могут послужить основой препаратов для терапии воспалительных процессов, вызванных вирусными инфекциями, а также НК-ассоциированных иммунопатологии. Показано, что ДНК не ингибирует транспорт poiy(I:C) в клетки, что свидетельствует о взаимодействии иммуномодулирующих ДНК с внутриклеточными мишенями - посредниками poly(I:C) зависимой активации иммунного ответа. Исследовано взаимодействие иммуномодулирующих ОДН с белками мембранно-цитозолъных экстрактов первичных эндотелиоцитов. Формирующие комплексы с ОДН белки были выделены и идентифицированы методом MALDI TOF масс-спекгрометрии как компоненты ДНК-ПК комплекса Ки70 и Ки80. Высокое сродство мембранно-цитозольной формы Ки комплекса к внДНК позволяет предположить, что Ки может быть напрямую вовлечен в процесс активации клеток под воздействием двуцепочечной РНК (дцРНК) или выполнять вспомогательные функции, например, определять клеточную локализацию или транспорт ДНК. Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы. Материалы диссертации были доложены на международных конференциях: «CNAPS-VI», Гонг Конг, 2009; «Фундаментальные науки -медицине», Новосибирск, 2010; 36th FEBS Congress "Biochemistry for tomorrow's medicine", Турин, Италия, 2011; «Физико-химическая биология», Новосибирск, 2011; «CNAPS-VII», Мадрид, Испания, 2011.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Результатов и их обсуждения, Выводов и Списка цитированной литературы. Работа изложена на 108 страницах, содержит 27 рисунков и 4 таблицы. Библиография включает 210 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Клетки для исследования иммуномодулирующего действия ДНК и условия их культивирования

В качестве моделей для исследования иммуномодулирующего действия внеклеточных ДНК были выбраны первичные эндотелиоцнты из пупочной вены человека (НиУЕС) и десневые фибробласты (вИ). Эти клетки экспрессируют основные паттерн-распознающие рецепторы и отвечают на компоненты бактерий и вирусов экспрессией провоспалительных интерлейкинов, интерферонов и молекул адгезии. В качестве маркеров активации клеток были выбраны интерлейкины ИЛ-6 и ИЛ-8, которые активируются на ранних этапах воспаления, секретируются НиУЕС и вР и регулируются факторами транскрипции №-кВ и АР-1.

Для исследования иммуномодулирующего действия ДНК были подобраны оптимальные условия культивирования клеток. Поскольку даже небольшие примеси бактериального липополисахарида (ЛПС) могут активировать клетки и влиять на продукцию провоспалительных интерлейкинов, с помощью ЛАЛ-теста содержание ЛПС (не более 2.5 х 10"3 ЕЭ/мл) контролировали во всех реагентах и растворах, контактирующих с клетками, включая среду 1МОМ, эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), ферменты, а также препараты ДНК, которые добавляли к клеткам. Клетки культивировали в присутствии 10 % инактивированной прогреванием (30 мин, 56 °С) ЭТС, что позволило в два раза снизить базовый уровень продукции интерлейкинов по сравнению со стандартной ЭТС (01Ьсо). Кроме того, прогревание ЭТС инактивирует сывороточные ДНКазы и существенно повышает стабильность ДНК в культуральной среде.

Одним из определяющих факторов в развитии воспаления является активация секреции провоспалительных цитокинов клетками через взаимодействие компонентов патогенов с паттерн-распознающими рецепторами, например, связывание вирусных дцРНК с ТЬЮ и ЛЮ-Г-Нке рецепторами, бактериального липополисахарида (ЛПС) с ТЬЯ4 или СрО-богатой бактериальной ДНК с ТЬЯ9. Первичные фибробласты и эндотелиоцнты отвечают значительным повышением продукции провоспалительных интерлейкинов в ответ на ЛПС и дцРНК, однако роль ДНК в стимуляции этих клеток остается неясной. Из литературы известно, что мРНК гена ТЬЯ9 нарабатывается в десневых фибробластах, однако нет данных об экспрессии ТЬЯ9 в НиУЕС.

Методом ОТ-ПЦР была исследована экспрессия мРНК ГЬК9 в НиУЕС (Рис. 1). В качестве отрицательного контроля использовали РНК клеток эмбриональной почки человека НЕК 293, в которых ТЬЯ9 не экспрессируется.

вАРОН

Т1_Р!9 ЭР и НЕК293

ПРО НиУЕС

РНК*(*Ма5е

ё §

— —■ —

— '-Ь

200

100

РНК РНК'ЯМа«!

* ^ о

и. и. ш и. ш V М О О X СЭ X I

4x211 X а. пг а а

Рис. 1. Экспрессия гена Т1.Г<9 в ШУЕС, ОР и НЕК293. Электрофоретический анализ продуктов амплификации генов ТЬЯ9 и вАРОН после обратной транскрипции (8% ПААГ, 0.00005 % бромид этидия). При обработке образца РНК РНКазой А (РНК+КШэе) до реакции обратной транскрипции не образуется продукта ПЦР, что свидетельствует о том, что матрицей для ПЦР служит РНК.

Показано, что ген ТЬЯ9 транскрибируется в первичных эндотелиальных клетках и фибробластах. Таким образом, эти клетки могут служить моделью для исследования иммуномодулирующих свойств дезоксирибонуклеиновых кислот.

2. Исследование иммуномодулирущего действия ДНК различного происхождения

2.1. Влияние очищенных препаратов ДНК и олигодезоксирибонуклеотидов на продукцию провоспалительных интерлекинов первичными фибробластами и эндотелиоцитами Была исследована продукция провоспалительных интерлейкинов в НиУЕС и ОР под воздействием эндогенных дезоксирибонуклеиновых кислот, а также бактериальной геномной и плазмидной ДНК. Эндогенная ДНК может находиться во внеклеточной среде в свободном (внДНК) и связанном с поверхностью клеток (скпДНК) состоянии. Геномная ДНК, свободная внДНК и скпДНК были выделены из ядер, супернатантов и из трипсинового элюата первичных клеток, соответственно, и протестированы на наличие примесей ЛПС с помощью ЛАЛ-теста. Показано, что скпДНК на электрофорезе представляет собой набор фрагментов в диапазоне 500-20000 п.н., в то время как внеклеточная ДНК преимущественно представлена фрагментами длиной

100-500 п.н. (Рис. 2), что согласуется с ранее опубликованными данными

Рис. 2. Электрофоретический анализ (1 % агарозный гель, 0.0005 % бромид этидия) плазмидной ДНК pDNA-TCI (плДНК), геномной ДНК (генДНК), связанной с клеточной поверхностью ДНК (скпДНК), фрагментированной рестриктазой Trull геномной ДНК (Trull ДНК), свободной внеклеточной ДНК (внДНК) фибробластов. Образцы были также обработаны ДНКазой I. М1, М2 - маркеры молекулярного веса.

Для исследования иммуномодулирующего действия препаратов внеклеточной и геномной ДНК был выбран диапазон концентраций ДНК от 10 нг/мл до 1 мкг/мл, поскольку по литературным данным концентрация внДНК в биологических жидкостях не превышает 1 мкг/мл [Rykova et ей., 2012]. В качестве контроля индукции неспецифического иммунного ответа, клетки инкубировали в присутствии лигандов TLR3 и TLR4 - poly(l:C) и ЛПС. Концентрацию ИЛ-6 и ИЛ-8 измеряли в супернатантах клеток после 24 ч инкубации клеток с препаратами ДНК. Поскольку в экспериментальных образцах наблюдалась прямая корреляция (коэффициент корреляции Пирсона г= 0.98, Р < 0.0001) между концентрацией ИЛ-6 и ИЛ-8, для большинства экспериментов представлены данные для одного из интерлейкинов.

Было показано, что эндогенная ДНК (геномная, внеклеточная и связанная с поверхностью клеток) сама по себе не влияет на продукцию интерлейкинов в GF и HUVEC в широком диапазоне концентраций (Рис. 3, данные представлены для GF и максимальной концентрации ДНК). Длина ДНК также не оказывает влияния, поскольку обработанная рестриктазой Trull геномная ДНК, и ОДН различной длины в диапазоне концентрация 0.01-1 мкМ не изменяют продукцию провоспалительных интерлейкинов первичными фибробластами и эндотелиоцитами.

Неметилированная CpG-богатая бактериальная ДНК (геномная ДНК Е coli и плазмидная ДНК), равно как и CpG-богатые ОДН 2006 и ОДН ТМ66, не активируют GF и HUVEC, несмотря на экспрессию в них гена TLR9. Добавленные во внеклеточную среду эндогенные геномная, свободная

[Morozkin et at, 2004].

внеклеточная и связанная с поверхностью клеток ДНК не активируют секрецию провоспалительных цитокинов. Отсутствие иммуностимулирующей активности у эукариотической ДНК объясняется пониженной частотой встречаемости CpG динуклеотидов (только 23 % от статистически ожидаемой) и метилированием существенной части (70-80%) CpG динуклеотидов, а также о наличии ингибирующих мотивов/последовательностей в геномной ДНК, в частности теломерного гексамера TTAGGG - наиболее распространенной последовательности в геноме человека [Stacey et al, 2003].

Как было показано ранее, TLR9 функционально неактивен в GF, несмотря на экспрессию мРНК; по-видимому, аналогичная картина наблюдается и в HUVEC [Mahanonda et al, 2007]. Отсутствие ответа в GF и HUVEC к CpG-богатой ДНК может быть связано с особенностями транспорта ДНК в эти клетки. Основным путем проникновения ДНК в клетки является эндоцитоз, что позволяет ДНК связаться с эндосомальными рецепторами, однако в ряде исследований было показано, что ДНК может проникать в клетки альтернативными путями, которые приводят к появлению ДНК в цитоплазме. Известно, что двуцепочечная ДНК активирует иммунную систему, взаимодействуя с цитоплазматическими рецепторами (DAI, AIM2, RNA Pol III), причем это взаимодействие не зависит от последовательности ДНК и статуса метилирования CpG динуклеотидов и приводит к активации продукции провоспалительных интерлейкинов, интерферонов первого типа и гибели клеток [Hornung et al, 2010]. Однако трансфекция одноцепочечных и двуцепочечных ОДН длиной 21-36 н. для исследованных количеств ОДН (0.550 пкмоль на 6 х 103 клеток) не приводила к гибели клеток или повышению продукции провоспалительных интерлейкинов. Вероятно, концентрация трансфицированных ОДН в клетках или их размер не обеспечивают взаимодействия с внутриклеточными рецепторами ДНК. Кроме того, трансфекция ДНК с использованием разных реагентов, приводит к накоплению ДНК в различных клеточных компартментах и, как следствие, к разным эффектам.

Таким образом, иммунный ответ на нуклеиновые кислоты зависит от типа клеток; а первичные эндотелиоциты и фибробласты не секретируют провоспалительные интерлейкины в ответ на обработку чистыми препаратами эндогенной и бактериальной свободной ДНК или ДНК в составе липокомплексов.

2.2. Влияние ДНК на активацию клеток под действием ро1у(1:С) или ЛПС

Для исследования иммуномодулирующего действия ДНК на ОР и НиУЕС клетки инкубировали в присутствии ДНК и лигандов ТЬЯЗ и ТЬЯ4 - ро1у(1:С) и ЛПС, которые активируют продукцию провоспалительных интерлейкинов в вР и НиУЕС (коэффициент стимуляции, измеренный как отношение продукции интерлейкина в стимулированных клетках к нестимулированным, в среднем, составляет 20 и варьирует между экспериментами в зависимости от донора клеток в диапазоне 15-30).

Р°М1С) ЛПС

Рис 3. Продукция интерлейкинов фибробластами, инкубированными с ДНК и ЛПС/ро1у(1:С). ДНК из различных источников (плазмидную ДНК (плДНК), геномную ДНК Е. coli (генДНКбак), геномную ДНК (генДНК), обработанную Trull рестриктазой геномную ДНК (Trull ДНК), связанную с поверхностью клеток ДНК (скпДНК) и внеклеточную ДНК (внДНК)) добавляли к интактным и ЛПС (100 нг/мл) или poly(I:C) (100 мкг/мл) -стимулированным GF. Звездочками отмечена предварительная обработка препаратов ДНК ДНКазой I. Концентрации ИЛ-6 и ИЛ-8 нормированы на концентрацию ИЛ в контрольных клетках без добавлений (IMDM), которые составили 480 пкг/мл и 1530 пкг/мл, соответственно. Концентрации ДНК представлена в мкг/мл. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Несмотря на то, что ДНК из различных источников не меняет продукцию провоспалительных интерлейкинов в интактных и ЛПС-стимулированных клетках, ДНК ингибирует ро1у(1:С)-индуцированную секрецию ИЛ-6 и ИЛ-8. Все исследованные ДНК в той или иной степени обладают интибирующим действием, причем эффект зависит от длины, концентрации и источника ДНК (Рис. 3). Предварительная обработка образцов ДНК ДНКазой I отменяет

обнаруженный эффект. ДНК и poly(I:C), добавленные одновременно или по отдельности к клетками, не влияют на жизнеспособность клеток (>95 % живых клеток по результатам теста EZ4U), т.е. ингибирование poly(I:C)-индуцированной продукции ИЛ не может быть объяснено гибелью клеток.

Эффективность ингибирования ро1у(1:С)-индуцированной секреции интерлейкинов GF под действием геномной ДНК и CpG-богатой неметилированной геномной ДНК Е. coli, а также плазмидной ДНК практически совпадают (ДНК в 2 раза ингибирует ро1у(1:С)-индуцированную секрецию интерлейкинов в концентрации 1 мкг/мл), таким образом, способность ДНК ингибировать дцРНК-индуцированную секрецию интерлейкинов не зависит от CpG-состава и статуса метилирования ДНК.

Степень фрагментации ДНК влияет на эффективность ингибирования poly(I :С)-индуцированной секреции интерлейкинов: обработанная эндонуклеазой рестрикции Trull геномная ДНК (диапазон длин фрагментов составляет преимущественно 100-500 п.н.) эффективнее ингибирует poly(I:C)-индуцированную секрецию интерлейкинов, чем геномная ДНК (размер фрагментов после выделения составляет 7-20 т.п.н.) в той же концентрации (1 мкг/мл). В связи с этим, для корректного сравнительного исследования эффективности иммуноингибирующего действия внДНК и скпДНК, свободную внеклеточную ДНК, представленную преимущественно низкомолекулярной ДНК с длиной фрагментов не более 1000 п.н., сравнивали с гидролизованной эндонуклеазой рестрикции Тги 11 геномной ДНК, а более высокомолекулярную скпДНК (2-20 т.п.н.) сравнивали с геномной ДНК. Было показано, что эффективность ингибирующего действия свободной внДНК не отличается от действия обработанной рестриктазой геномной ДНК. Однако poly(I:C)-индуцированная секреция цитокинов под действием скпДНК в концентрации 100 нг/мл ингибируется, по меньшей мере, в три раза эффективнее, чем под действием геномной ДНК в той же концентрации, и в два раза эффективнее, чем под действием фрагментированной геномной ДНК.

Аналогичные данные об ингибировании ро1у(1:С)-индуцированной продукции интерлейкинов были получены на HUVEC, для которых также было показано, что наиболее эффективным ингибитором секреции интерлейкинов является скпДНК.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в составе скпДНК присутствуют специфические структуры/последовательности, обладающие

более выраженным ингибирующим действием, по сравнению с геномной ДНК. Действительно, ранее было показано, что связанная с поверхностью клеток ДНК отличается по своему составу от геномной ДНК [Morozkin et al, 2012]. Вероятно, повышенная концентрация определенных последовательностей в составе скпДНК позволяет ей более эффективно связываться с клеточной поверхностью и далее взаимодействовать с внутриклеточными медиаторами иммунного ответа, что может определить более высокую удельную ингибирующую активность ДНК из трипсинового элюата клеток.

2.3. Олигодезоксирибонуклеотиды сиквенс-специфично ингибируют poly(I:C)-нндуцированный иммунный ответ

Для исследования зависимости ингибировання ро1у(1:С)-индуцированной продукции интерлейкинов от последовательности ДНК, были использованы одноцепочечные и двуцепочечные ОДН различной длины и последовательности, содержащие 5-9 нуклеотидные мотивы, которые, как ранее было показано, обеспечивают связывание ДНК с белками поверхности клеток [Mal'shakova et al, 2008]. Кроме того, было исследовано действие описанных в литературе CpG-богатых ОДН 2006 и ОДН ТМ66, а также 32-звенных гомоолигонуклеотидов ОДН рС, ОДН рА и ОДН рТ и их дуплексов (таблица 1). Для повышения стабильности 3' конец ОДН содержал три межнуклеотидных фосфоротиоатных группы.

Было показано, что большинство олигонуклеотидов обладают ингибирующим действием на ро1у(1:С)-индуцированную секрецию ИЛ-6, в случае, когда клетки инкубируются одновременно с poly(I:C) и ОДН, при этом эффективность ингибировання зависит от последовательности и концентрации ОДН (Рис. 4).

Наиболее выраженным действием обладают ОДН 10, ОДН 14, ОДН ТМ66 и ОДН ТМ66к. Напротив, для гомоолигонуклеотидов ОДН рА, ОДН рТ и ОДН р(АТ) не наблюдалось значимого эффекта ни при 0.2 мкМ, ни при 1 мкМ концентрациях ОДН. ОДН рС относительно слабый ингибитор poly(I:C)-индуцированного иммунного ответа по сравнению с большинством исследованных ОДН специфической последовательности (коэффициент ингибировання 2 в концентрации 1 мкМ). Ингибирующим действием обладают как CpG-богатые ОДН (10, ТМ66, 2006), так и ОДН, не содержащие в своем составе CpG (ОДН 14), что подтверждает данные о том, что наблюдаемый эффект не зависит от CpG состава ДНК.

Таблица 1. Олигодезоксирибонуклеотиды, использованные в работе. Фосфоротиоатные

остатки выделены курсивом.

ОДН 1|»с.1словя1с.1Ы1ос1ь (5'—'3') .мина

рл рАЛАЛЛЛАААААЛЛЛАЛААААЛЛААЛЛЛААЛ.'Ы 32

рТ рТГГГГГПТГ 1 1 1 1 Г 1ТГГПТГТТТПТ77Т 32

р(' рСССССССССССССССССССССССССССССССС 32

2006 рТСОТСОТТТГОТСОТТТ1ШССГГ77Т 26

ТМ6,. рТСГ.ТС.ТТСОТГ.ТТСОТСПТССт^ТТС'ОТОТТСС^бТ 36

10 Г(ТЛС(1ТСЧ;ЛТСКСПСГТГССС;ТАСТТЛСЧ;ТС7Т 32

12 рАТАСС;Т«;ЛТССАЛТАСОТСК!ЛТСС/ЧЛТЛТО'7Т 32

13 рОАТССААТАССТСЮАТССААТАССТСЮАТССЛГ 32

14ро рСТССЛТССАТТТССТТСТОСАТТССАСХПТХЗАТ 32

14р* РСТСК:АТСИ:АТТТС:С7ТСТОСАТТССАССТОС/1Г 32

145 рСТОСАТОСАТТТССТТСТОС-.Ч тт 23

2006с рАЛЛЛС'(;ЛС ЛАЛЛСС|АС'ЛЛАА1Ч;Л( 0/1 26

ТМ6„с рЛ<Л{(;ДЛ(АС(1ЛЛСЛСОААГАСС1АЛ(Л('С;ЛЛСЛСО.-( 36

10с Р,\А(;АССТЛСК,ТЛССК:,ЛАСАСС|САТСС;АС'С,7',1С 32

12с рЛС АТЛ1КК ,ЛТСС АСЧ ПАГ1( К'.АТСС ЛСХ! ТА Т 32

13с рАТСЮАТС С ЛССТАТГОС'.ЛТСС АСОТАТТССЫ тс 32

14с рТС'С'АСгСТГгГ,ААТОСАС1ААСК:1ЛЛЛТОС'АТС.С/(6' 32

ро1у(1 С)

Рис. 4. Зависимость продукции ИЛ-8 в ро1у(1:С)-стимулированных фибробластах от концентрации и последовательности ОДН. Концентрацию ИЛ-8 измеряли через 24 ч после одновременного добавления к клетками ро1у(1:С) (100 мкг/мл) и одноцепочечных (оц), комплементарных (к) и двуцепочечных (дц) ОДН (0.2 и 1 мкМ). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

При исследовании иммуноингибирующего действия коротких (5-9 н.) ОДН (5'—>3') К1 (ТАСвТ), К2 (ОАТССА), КЗ (ССАТССАТТ), К4 (САТССАОО) было показано, что они не ингибируют ро1у(1:С)-индуцированную продукцию ИЛ в концентрациях 1 и 5 мкМ (Рис. 5), что позволяет предположить, что иммуноингибирующее действие ОДН зависит от их длины. Действительно, укороченный ОДН 14 длиной 21 н. (ОДН Ив) ингибирует ро1у(1:С)-индуцированную секрецию интерлеикинов в 2.6 раз слабее, чем ОДН 14 (Рис. 5). Полученные результаты согласуются с ранее опубликованными

данными о зависимости эффективности взаимодействия ОДН с клеточными мишенями от длины ОДН [Roberts et al, 2009; Hanss et al, 1998].

7000 -^ 6000 5000

С

- 4000

°P

§ 3000 2000 1000

□ IMDM

□ poiy(l:C)

□ poly(l:ChOflH

I

i

Л

14s 14 po 14/64

Рис. 5. Зависимость продукции ИЛ-8 в ро1у(1:С)- и ОДН-стимулированных ОР от структуры ОДН. Концентрация ИЛ-8 в среде через 24 часа после добавления ро1у(1:С) (100 мкг/мл) и ОДН (1 мкМ): ОДН 14 (14), укороченного ОДН 14 (14в), полностью фосфодиэфирного ОДН 14ро, а также коротких фосфодиэфирных (5'—>-3') ОДН К1 (ТАСОТ), К2 (ОАТССЛ). КЗ (ССАТССАТТ), К4 (ОАТССАОО) в концентрации 5 мкМ. Столбец 14/6ч соответствует добавлению ОДН 14 через 6 часов после ро1у(1:С). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Таким образом, практически все исследованные ДНК в той или иной степени ингибируют ро1у(1:С)-индуцированную секрецию ИЛ: одноцепочечные и двуцепочечные ДНК, как СрО-богатыс (ОДН ТМ66), так и не содержащие СрО-сайтов (ОДН 14), высокомолекулярные ДНК и олигонуклеотиды. Обнаруженный эффект, тем не менее, зависит от последовательности ДНК: наряду с олигонуклеотидами, обладающими выраженным эффектом, были выявлены ОДН, практически не изменяющие концентрацию ИЛ в супернатантах ро1у(1:С)-стимулированных клеток.

Причины сиквенс-специфичности ингибирующего действия ОДН до конца не изучены. Возможно, эффективность ингибирования напрямую определяется эффективностью транспорта ОДН в клетки. С другой стороны, ОДН могут ингибировать ро1у(1:С)-индуцированную активацию клеток за счет ингибирования транспорта ро1у(1:С) в клетки, который необходим для взаимодействия ро1у(1:С) с паттерн-распознающими рецепторами. 2.4. Влияние ДНК на транспорт ро!у(1:С) в клетки

Для исследования транспорта ро1у(1:С) в клетки был получен препарат ро1у(1:С), модифицированный остатками родамина (ро1у(1:С)-ЯЬ). По данным флуоресцентной микроскопии ро1у(1:С)-1111 в концентрации 10 мкг/мл эффективно проникает и накапливается в клетках через 3 ч после добавления в культуральную среду. Для того чтобы выяснить, могут ли ДНК и ОДН ингибировать транспорт ро1у(1:С), клетки инкубировали с ро1у(1:С)-КЬ в присутствии геномной ДНК О Г пли ОДН 14 и затем оценивали интенсивность флуоресцентного сигнала в клетках, интегрируя флуоресцентный сигнал в 50

произвольно выбранных клетках при помощи микроскопа Axiovert 200 и

программного пакета Axiovision (Zeiss, Германия) и определяли удельную

флуоресценцию poly(I:C)-Rh в клетке. Инкубация GF с poly(I:C)-Rh в

присутствии геномной ДНК или ОДН 14 не приводит к уменьшению

интенсивности флуоресценции, а значит, не влияет на эффективность

транспорта poly(I:C) в клетки (Рис. 6).

А. Б.

контроль ро1у():С) ро!у(1:С)+генДНК ро1у(1:С)+ОДН

Рис. 6. А. Флуоресцентные (Родамин) и фазово-контрастные (Фаза) изображения интактных GF (контроль) и GF после 3 ч инкубации с меченой родамином poly(I:C) (poly(I:C)) в присутствии 1 мкг/мл геномной ДНК GF (генДНК) или 1 мкМ оцОДН 10 (ОДН). Изображения были получены с помощью 10х объектива A-Plan Carl Zeiss и набора фильтров FS00: BP 530-585, LP6I5, FT 600. Б. Данные количественного определения средней флуоресценции клеток были получены при помощи программного обеспечения Automatic Measure Zeiss AxioVision 4.8. Значение интенсивности флуоресценции определено в 50 произвольно выбранных клетках. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Таким образом, ингибирование ро1у(1:С)-индуцированной продукции интерлейкинов не связано с нарушением транспорта poly(l:C) в клетки: ингибирование наблюдается даже в том случае, когда ОДН добавлен к клеткам спустя 6 ч после poly(I:C) (Рис. 5). По-видимому, эффект ингибирования также не связан с конкуренцией ДНК за связывание с паттерн-распознающими рецепторами дцРНК: концентрация ДНК, при которой наблюдается достоверное ингибирование продукции интерлейкинов ( 100 нг/мл для скпДНК) в 103 раз меньше, чем концентрация poly(I:C) (100 мкг/мл).

2.5. Олигодезоксирибонуклеотиды ингибкруют ро1у(1:С)-индуцированную продукцию интерлейкинов после трансфекции poly(I:C) и ОДН в клетки

Для выяснения роли цитоплазматических рецепторов двуцепочечной РНК (RIG-1 и MDA5) в ДНК-зависимом ингибировании ро1у(1:С)-индуцированной продукции интерлейкинов, мы исследовали эффект после трансфекции ОДН и poly(I:C) в клетки.

Трансфекция ро1у(1:С) в первичные фибробласты и эндотелиоциты приводит к повышению продукции провоспалительных интерлейкинов уже при 10 нг ро1у(1:С) в лунку 48-луночного планшета, причем при добавлении того же количества ро1у(1:С) в культуральную среду не наблюдалось изменения в продукции ИЛ-6. Совместная трансфекция ОДН и ро1у(1:С) приводит к ингибированию ро1у(1:С)-индуцированной продукции интерлейкинов в зависимости от последовательности ОДН (Рис. 7).

Ингибирующее действие трансфицированных олигонуклеотидов специфической последовательности отличается от такового для тех же олигонуклеотидов, инкубированных с клетками и ро1у(1:С) без трансфицирующих реагентов (Рис. 4, 7).

16X0 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

□ оцОДН а оцОДНк и дцОДН

МЭМ ро№Ч рС

рА

ОДН+ро1у(1:С)

Рис. 7. Продукция ИЛ-6 в первичных фибробластах после совместной трансфекции ОДН и ро1у(1:С) в клетки. Концентрацию ИЛ-6 измеряли в культуральной среде йР через 24 часа после трансфекции ро1у(1:С) (10 нг на 104 клеток в лунке 48-луночного планшета), или одновременной трансфекции с помощью реагента Унифектин (Русбиолинк) ро1у(1:С) и одноцепоченых, комплементарных им оцОДН, и двуцепочечных ОДН (таблица 1). В качестве контроля в клетки трансфицировали среду 1МОМ; трансфекция ОДН не влияет на продукцию интерлейкинов.

Так, наибольшим ингибирующим действием обладают трансфицированные двуцепочечные ОДН: все исследованные дуплексы полностью ингибировали ро1у(1:С)-индуцированный ответ вне зависимости от последовательности и эффекта, вызываемого одноцепочечными ОДН. Эффективность ингибирующего действия одноцепочечных ОДН зависит от их последовательности: гомоолигонуклеотиды ОДН рС, ОДН рТ и ОДН рА обладают относительно слабым ингибирующим действием, что согласуется с данными полученными при добавлении этих ОДН в среду. Однако ОДН ТМ66, ОДН ТМ66к, ОДН 10, которые по сравнению с другими исследованными ОДН эффективно

ингибируют продукцию ИЛ при совместной инкубации с клетками и ро1у(1:С) в свободном виде, являются малоэффективными ингибиторами иммунного ответа после трансфекции в фибробласты. Эффективность иммуноингибирующего действия не зависит от СрО-состава ДНК, поскольку не содержащие Срв динуклеотидов ОДН 14, ОДН 14к и дцОДН 14 являются одними из наиболее эффективных ингибиторов.

Методом количественного 8УВК-Сгееп ОТ-ПЦР мы исследовали экспрессию гена ИЛ-6 при совместной стимуляции/трансфекции первичных фибробластов ро1у(1:С) и олигонуклеотидами. Полученные данные согласуются с данными о концентрации интерлейкинов в супернатантах клеток (Рис. 9).

ро1у(!:С)

Рис. 9. Экспрессия гена ИЛ-6 в ОР через 3 часа после стимуля-ции (А) и трансфекции (Б) ро1у(1:С) и ОДН. Уровень индук-ции ИЛ-6 мРНК нормирован на уровень экспрессии гена в АРОН методом 2"ААС\

Таким образом, ингибирование продукции интерлейкинов наблюдается на уровне экспрессии мРНК, и, по-видимому, является результатом нарушения активации транскрипционных факторов (№кВ и АР1), регулирующих экспрессию провоспалительных интерлейкинов.

Для ингибирования ро1у(1:С)-индуцированной продукции интерлейкинов под действием ДНК и ОДН необходимо взаимодействие ингибиторов с мишенями - посредниками передачи активирующего сигнала. Для выявления таких мишеней была предпринята попытка выделить и идентифицировать белки, связывающие иммуноингибирующие ОДН.

3. Поиск клеточных белков - мишеней иммуномодулирующих олигонуклеотидов

3.1. Связывание олигодезоксирибонуклеотидов с белковыми факторами живых клеток и клеточных экстрактов Для поиска клеточных мишеней иммуномодулирующих ДНК был выбран ОДН 14, который эффективно ингибирует ро1у(1:С)-индуцированную

продукцию иитерлейкинов как при траисфекции, так и при добавлении в культуральную среду.

Для того, чтобы выявить белки, формирующие прочные комплексы с ОДН, живые клетки инкубировали со свободным одно- и двуцепочечным [32Р]-меченым ОДН 14 или с ОДН в комплексе с Унифектином 1 и 4 ч. После инкубации клетки лизировали и исследовали наличие нуклеопротеиновых комплексов в мембранно-цитозольной (МЦ) фракции клеток методом задержки в геле (ЕМ8А). Было показано, что как при траисфекции, так и при добавлении в культуральную среду ОДН 14 образует комплекс с биополимерами МЦ экстракта НиУЕС (Рис. 10). А Б

Экстракт + ОДН трансфиц ОДН трансфиц ОДН свободный ОДН

оц дц" оц дц" оц' оц' дц' дц' дц' дц' оу' оу' ду' ду' оу' оц'

ф РЧЦИР» ч*

Рис. 10. Радиоавтограф геля после электрофореза комплексов оц- и дцОДН 14 (отмечен стрелками) с белками НиУЕС в 6.5 % ПААГ в Трис-глициновом буфере, рН 8.4. А. Экстракт+ОДН, [32Р]-оц- и [32Р]-дцОДН 14 (0.05 мкМ, оц и дц) инкубировали с МЦ экстрактами НиУЕС; образцы оцт и дцт были обработаны трипсином. Трансфиц ОДН, в клетки (5 х К)4) трансфицировали 20 пкмоль [32Р]-меченых оц- и дцОДН 14 (оц1, дц1, оц4, дц4 соответствуют 1- и 4 ч инкубации); с последующим ЕМ8А экстрактов. В. ОДН-белковые комплексы МЦ экстрактов клеток, инкубированных со свободными оц- и дцОДН 14 (0.2 мкМ) или трасфицированных как описано (А).

Как оцОДН, так и дцОДН образуют комплексы, причем дцОДН связывается с биополимерами, по крайней мере, в два раза более эффективно, чем оцОДН, как при траисфекции ОДН в клетки, так и при инкубации ОДН с МЦ экстрактом. Свободные ОДН формируют комплексы с белками живых клеток менее эффективно, чем трансфицированные, вероятно из-за менее эффективного проникновения в клетки.

Исходя из зависимости эффективности формирования комплекса от концентрации ОДН (Рис. 11 А) были определены константы диссоциации олигонуклеотид-белковых комплексов мембранно-цитозольного экстракта

НиУЕС, которые составляют 6 ±0.8* Ю"10М и 4±0.5х 10 10М для оц- и дцОДН 14, соответственно.

А Б В Г

г оцОДН , дцОДН , ° 6 СА-фракции

X Рм О О ¡5

* О ют Р .

« ^ г V + # # #

8 8 § см3888 Ъ'ззз * о о о о МЦ Ц М

о о о о о о о о бочсх О сч <о ®

> 1000 I э

ш

■ ■

а

О 2 0.4 0* 01 1 о 02 О.* 0* 10

Кониемтряция ОДН, м«М Концентрация ОДН мкМ

Рис. 11. Исследование ОДН-связывающих белков Н11УЕС методом задержки в геле. Радиоавтограф геля после электрофореза в 6.5 % ПААГ в Трис-глициновом буфере, рН 8.4. А. Зависимость эффективности связывания оц- и дцОДН 14 с белками экстракта НиУЕС. Б. Анализ конкуренции 0.05 мкМ [32Р]-оц- и [32Р]-дцОДН 14 (оц* и дц*) в присутствии 10х молярного избытка немеченого ОДН (оц и дц). В. Связывание мембранно-цитозольного экстракта Н1ГУЕС и его сульфат-аммонийных (СА) фракций с [32Р]-дцОДН 14. Г. Аналнз связывания 0.05 мкМ [32Р]-дцОДН 14 с мембранно-цитозольным (МЦ) экстрактом НиУЕС, а также с цитозольными (Ц) и мембранным (М) экстрактами, полученными ультрацентрифугированием мембранно-цитозольного экстракта.

В экспериментах с использованием немеченых ОДН в качестве конкурентов было показано, что оц- и дцОДН связываются с одним и тем же ДНК-связывающим белком (Рис. 11 Б). При помощи ультрацентрифугирования МЦ экстракта при 100,000 было показано, что ОДН-связывающий белок присутствует в мембранной и в цитозольной фракциях НиУЕС (Рис. 11 Г).

Ступенчатое фракционирование экстракта сульфатом аммония позволило обогатиться по исследуемому белку (осаждается 60 % от насыщения сульфатом аммония) (Рис. 11 В), что облегчило работу по его выделению и идентификации.

3.2. Выделение и идентификация олигонуклеотид-связывающих белков

ОДН-связывающие белки выделяли из мембранно-цитозольных экстрактов Ни\'ЕС с помощью стрептавидин-сефарозы и дцОДН 14-Ыо, состоящего из [32Р]-меченого ОДН 14 и биотинилированного по З'-концу ОДН 14к. После формирования комплексов дцОДН 14-Ыо с экстрактом и его сульфат-

аммонийными фракциям, добавляли стрептавидин-сефарозу, отмывали от неспецифически сорбированных белков, денатурировали комплекс кипячением в буфере для нанесения на БОБ-О^С-электрофорез и разделяли белки

Рис. 12. Выделение ОДН-связывающих белков. МЦ экстракт НиУЕС (Э) и сульфат-аммонийные фракции экстракта (20, 40, 60, 80 %) инкубировали с [32Р]-дцОДН 14-Ыо и выделяли комплексы на стрептавидин-сефарозе. Выделенные

рамкой белки были идентифицированы методом МА 1.1)1 ТОР. Электрофорез в градиентном (10-20%) 8Э8-ПААГ с последующим переносом на нитро-целлюлозную мембрану и окрашиванием коллоидным серебром. М - маркер молекулярного веса, кДа.

Было показано, что ОДН-связывающий белок, ориентировочный молекулярный вес которого составляет 70 кДа, выделяется из 60 % сульфат-аммонийной фракции экстракта. В контрольных образцах (фракции экстракта, инкубированные с дцОДН 14 без биотина или без ОДН, а затем с сорбентом) исследуемого белка не наблюдается. В элюате стрептавидин-сефарозы 40 % фракции экстракта, инкубированного с дцОДН 14-bio, присутствует белок с молекулярным весом около 15 кДа, который предположительно соответствует нижней полосе в экспериментах по задержке ОДН-белковых комплексов в геле.

Исследуемые белки были выделены из геля после препаративного SDS-диск-электрофореза и идентифицированы методом Maldi-TOF масс-спектрометрии сотрудником Международного томографического центра СО РАН Татьяной Григорьевной Дужак. Высокомолекулярные белки из 60 % фракции были идентифицированы как белки ДНК-протенн-киназного комплекса Ки70 и Ки80 (score 65 и 78, соответственно), а белок из 40 % сульфат-аммонийной фракции -оцДНК-связывающий белок (SSB, score 85), который локализован в митохондриях и участвует в репликации митохондриальной ДНК. 3.3. Ки белок как основная мишень иммуномодулирующих ДНК

Данные масс-спектрометрического анализа были подтверждены в экспериментах с использованием моноклональных антител против Ки70.

электрофорезом в ПААГ (Рис. 12).

дцОДН-bio Контроль

з? g ^ V? чО ч? чО о- О- о4 о4

о ^ ^ § 8 О <N ° § СО м

ЯИГ

- 130 100 •т 70

Специфическое связывание антителами против Ки70 наблюдалось с факторами, обладающими той же электрофоретической подвижностью, что и исследуемый комплекс как после связывания ОДН с МЦ экстрактом HUVEC, так и живыми клетками (Рис. 13 Б, дорожки 4,5).

Рис. 13. Подтверждение природы ДНК-связывающего комплекса с помощью антител против Ки70. А. Окрашивание Ки70 с помощью специфических антител (электрофорез белков МЦ экстракта HUVEC в 15 % SDS-ПААГ с последующим электроблотгингом). 1, контроль (антивидо-специфические антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена); 2, Вестерн-блот гибридизация с использованием антител против Ки70; 3, окрашивание нитроцеллюлозной мембраны

коллоидным серебром; М, маркер молекулярного веса (кДа). Б. Анализ задержки комплексов МЦ экстракта HUVEC с [32Р]-дцОДН 14 с последующим электроблоттингом: 1, радиоавтограф нитроцеллюлозной мембраны; 2, окрашивание мембраны коллоидным серебром; 3, контроль (вторичные антитела); 4,5, Вестерн-блот гибридизация с антителами против Ки70 (4, МЦ экстракт HUVEC и 5, экстракт клеток, в которые предварительно был трансфицирован ОДН). Электрофоретическая подвижность совпадает для ОДН-белкового и Ки70-содержащего комплексов (отмечены стрелками). В. Задержка в геле комплекса 0.05 мкМ [32Р]-оц- и [32Р]-дцОДН 14 (оц и дц) с МЦ экстрактом HUVEC в присутствии 10 нг антител против Ки70.

Добавление антител в образец после формирования комплекса ОДН с белком мембранно-цитозольного экстракта HUVEC приводит к уменьшению электрофоретической подвижности комплекса как для оцОДН, так и для дцОДН (Рис. 13 В), что подтверждает наличие Ки70 в составе ДНК-связывающего комплекса. Таким образом, мембранно-цитозольная форма К и белка прочно связывает оц- и дцОДН - аналоги скпДНК, а значит, может регулировать эффекты, вызываемые внеклеточными ДНК.

Ранее считалось, что Ки является исключительно ядерным белком, где в составе ДНК-ПК комплекса участвует в репарации ДНК, V(D)J рекомбинации, и поддержании стабильности теломер [Collis et al., 2005]. Однако недавние исследования показали, что Ки70 и Ки80 присутствуют как в цитоплазме, где регулирует Вах-ассоциированный апоптоз, так и на поверхности клеток,

участвуя в клеточной адгезии. Кроме того, недавно было показано, что Ки70 является одним из патгерн-распознающих рецепторов дцДНК в цитоплазме, регулируя секрецию интерферона третьего типа ИФН >.1 [Zhang et al., 201 J].

Высокая степень сродства Ku белка к ДНК позволяет этому белку связывать ДНК как на поверхности, так и внутри клеток, и, таким образом, влиять на транспорт, локализацию и внутриклеточные взаимодействия внДНК. Значение взаимодействия свободных и связанных с клеточной поверхностью внеклеточных ДНК с Ku белком может возрастать при патологических состояниях, которые сопровождаются повышением концентрации внДНК. С другой стороны, внДНК, как лиганд, может влиять на неядерные функции Ku.

Тот факт, что связывание осуществляется как с оцОДН, так и с дцОДН, добавленными в культуральную среду и трансфицированными в клетки, а также широкий спектр функций Ku белка в клетке делают его потенциальной мишенью иммуномодулирующих ДНК.

Дополнительные исследования покажут, вовлечен ли Ku комплекс напрямую в процесс активации клеток под воздействием дцРНК, либо выполняет вспомогательные функции, например, определяя клеточную локализацию или транспорт ДНК.

ВЫВОДЫ

1. Свободные от эндотоксина очищенные препараты бактериальных и эндогенных ДНК (геномной, свободной внеклеточной и связанной с поверхностью клеток), а также одно- и двуцепочечные олигодезоксирибонуклеотиды различной последовательности (свободные и в комплексах с трансфицирующими реагентами) не активируют продукцию провоспалительных интерлейкинов ИЛ-6 и ИЛ-8 в первичных эндотелиоцитах и фибробластах в широком диапазоне концентраций, несмотря на экспрессию в клетках рецептора TLR9.

2. ДНК не влияют на ЛПС-индуцированную секрецию провоспалительных интерлейкинов, однако ингибируют ро1у(1:С)-индуцированную секрецию ИЛ-6 и ИЛ-8. Ингибирующее действие ДНК не связано с метилированием CpG пар и зависит от степени фрагментации ДНК. Внеклеточная ДНК, связанная с поверхностью клеток, является более эффективным ингибитором ро1у(1:С)-индуцированной секреции провоспалительных интерлейкинов по сравнению с геномной и свободной внеклеточной ДНК.

3. Добавленные в кулиуральную среду или трансфицированные в клетки одноцепочечные и двуцепочечные олигодезоксирибонуклеотиды ингибируют ро1у(1:С)-индуцированную секрецию интерлейкинов, а также экспрессию их генов. Эффективность ингибирования зависит как от последовательности, так и от концентрации олигонуклеотидов и не связана с ингибированием транспорта poly(I:C) в клетки.

4. Инкубация первичных эндотелиошггов и их мембранно-цитозольных экстрактов с одноцепочечным и двуцепочечным ОДН14 (аналогами связанной с клеточной поверхностью ДНК) приводит к формированию нуклеопротеиновых комплексов с константами диссоциации 6 ± 0.8 х Ю"10 М и 4 ± 0.5 х Ю"10 М, соответственно. ОДН-связывающие белки были выделены из мембранно-цитозольного экстракта клеток и идентифицированы методом MALDI-TOF масс-спектрометрии как белки Ки70 и Ки80. С помощью моноклональных антител к Ки70 показано, что Ки белок является основной клеточной мишенью иммуномодулирующих ОДН и, таким образом, может принимать участие в регуляции иммуномодулирующего действия ДНК.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Cherepanova, A.V., Bushuev, A.V., Vlassov, V.V., Laktionov, P.P. Cell-surface-bound DNA inhibits poly(I:C)-activated IL-6 and 1L-8 production in human primary endothelial cells and fibroblasts // Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. Ed. Gahan P.B. Springer. -2011. -P. 207-211.

2. Cherepanova, A.V., Bushuev, A.V., Duzhak, T.G., Zaporozhchenko, 1.А., Vlassov, V.V., Laktionov, P.P. Ku protein as the main cellular target of cell-surface-bound circulating DNA // Expert Opin. Biol. Ther. -2012. -V. 12. -P. S35-S41.

3. Cherepanova, A.V., Bushuev, A.V., Kharkova, M.V., Vlassov, V.V., Laktionov, P.P. DNA inhibits dsRNA-induced secretion of pro-inflammatory cytokines by gingival fibroblasts // Immunobiology. -2013. -V. 218. -P. 272-280.

4. Малыпакова B.C., Черепанова A.B., Бушуев A.B., Лактионов П.П., Власов В.В. Способ селекции фрагментов ДНК, прочно связанных с белками клеточной поверхности и обладающих иммуномодулирующей активностью. Патент РФ на изобретение № 2393230. Приоритет от 17 марта 2009 года.

Подписано в печать 10.01.2013 Формат 60x84 1\ 16 Усл. печ. л. 1.5 Объем 24 стр. Тираж 130 экз. Заказ № 15 Отпечатано Омега Принт 630090, г. Новосибирск, пр. Ак.Лаврентьева,6 email: omegap@yandex.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Черепанова, Анна Витальевна

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Иммуностимулирующие эффекты нуклеиновых кислот

1.2. Активация врожденного иммунитета олигонуклеотидами

1.3. Паттерн-распознающие рецепторы нуклеиновых кислот

1.3.1. Toll-like рецепторы

1.3.2. RIG-1-like рецепторы

1.3.3. NOD-like рецепторы

1.3.4. Рецепторы двуцепочечной ДНК

1.4. Внеклеточные нуклеиновые кислоты

1.4.1. Циркулирующие НК-содержащие комплексы

1.4.2. Связанные с поверхностью клеток нуклеиновые кислоты

1.4.3. Происхождение и состав циркулирующих нуклеиновых кислот

1.4.4. Внеклеточные ДНК в норме и при патологиях

1.5. Роль эндогенных внеклеточных нуклеиновых кислот в активации иммунной системы человека

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Реактивы и материалы

2.1.1. Реактивы

2.1.2. Олигонуклеотиды

2.1.3. Клетки и условия их культивирования

2.2. Методы

2.2.1. Гель-электрофорез нуклеиновых кислот и белков

2.2.2. Получение двуцепочечных олигонуклеотидов

2.2.3. Получение и очистка 32Р-меченых олигонуклеотидов

2.2.4. Исследование стабильности олигонуклеотидов при инкубации с культивируемыми клетками

2.2.5. Получение фракций, содержащих внеклеточные ДНК

2.2.6. Выделение ДНК из клеточных фракций и определение ее концентрации

2.2.7. Выделение геномной ДНК и получение фрагментированной геномной 45 ДНК

2.2.8. Анализ содержания бактериального эндотоксина в реагентах, 46 контактирующих с клетками

2.2.9. Стимуляция клеток под действием свободных и 46 трансфицированных НК

2.2.10. Количественный анализ жизнеспособности клеток

2.2.11. Иммуноферментное определение концентрации интерлейкинов

2.2.12. Получение меченой родамином ро!у(1:С) (ро1у(1:С)-11Ь)

2.2.13. Приготовление слайдов и микроскопия

2.2.14. Выделение РНК из клеток

2.2.15. Реакция обратной транскрипции

2.2.16. Полимеразная цепная реакция

2.2.17. Получение клеточных фракций

2.2.18. Ступенчатое фракционирование белков мембранно-цитозольного 51 экстракта сульфатом аммония

2.2.19. Формирование комплексов ОДН с белками экстрактов клеток с ^ последующей задержкой олигонуклеотид-содержащих комплексов в геле при электрофорезе (ЕМ8А)

2.2.20. Определение величин констант диссоциации (Кй) олигонуклеотид- ^ белковых комплексов

2.2.21. Выделение олигонуклеотид-связывающих белков

2.2.22. Масс-спектрометрия

2.2.23. Изготовление конъюгата антител с пероксидазой хрена

2.2.24. Идентификация взаимодействующих с ОДН белков мембранно- 54 цитозольного экстракта при помощи Вестерн-блот гибридизации

2.2.25. Статистика

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Клетки для исследования иммуномодулирующего действия ДНК и ^ условия их культивирования

3.1.1. Условия культивирования клеток

3.1.2. Экспрессия ТЫ19 в ШУЕС и ОБ

3.2. Исследование шшуномодулирущего действия ДНК различного происхождения

3.2.1. Влияние очищенных препаратов ДНК и олигодезоксирибонуклеотидов 62 на продукцию провоспалительных интерлекинов первичными фибробластами и эндотелиоцитами

3.2.2. Влияние ДНК на активацию клеток под действием ро1у(1:С) или ЛПС

3.2.3. Олигодезоксирибонуклеотиды сиквенс-специфично ингибируют 69 ро1у(1:С)-индуцированный иммунный ответ

3.2.4. Влияние ДНК на транспорт ро1у(1:С) в клетки

3.2.5. Олигодезоксирибонуклеотиды ингибируют ро1у(1:С)-индуцированную 76 продукцию интерлейкинов после липофекции

3.2.6. Олигодезоксирибонуклеотиды ингибируют ро1у(1:С)-индуцированную 79 экспрессию мРНК генов, активируемых при воспалении

3.3. Поиск клеточных белков - мишеней иммуномодулирующих олигонуклеотидов

3.3.1. Связывание олигодезоксирибонуклеотидов с белковыми факторами 83 живых клеток и клеточных экстрактов

3.3.2. Выделение и идентификация олигонуклеотид-связывающих белков

3.3.3. Ки белок как основная мишень иммуномодулирующих ДНК

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммуномодулирующее действие внеклеточных дезоксирибонуклеиновых кислот"

В соответствии с современными представлениями эндогенные нуклеиновые кислоты (НК) иммунологически инертны и не вызывают иммунных реакций в физиологически нормальном состоянии у млекопитающих. Однако, при определенных условиях «неузнавание» нуклеиновых кислот иммунной системой может быть нарушено, в результате чего в крови больных появляются антитела против эндогенных нуклеиновых кислот и их комплексов. Общеизвестными примерами аутоиммунных заболеваний, при которых собственная ДНК выступает аутоантигеном, являются системная красная волчанка и ревматоидный артрит.

В отличие от эндогенных НК вирусные и бактериальные НК активируют врожденный иммунитет млекопитающих, взаимодействуя с паттерн-распознающими рецепторами (РШ^). Врожденный иммунитет является эволюционно более ранним и консервативным механизмом защиты, направлен на узнавание общих структур патогенов и активирует развитие адаптивного иммунного ответа. Распознавание экзогенных нуклеиновых кислот РШ^ осуществляется за счет специфических химических и структурных особенностей, характерных для вирусных и бактериальных ДНК и РНК. К числу таких особенностей относятся преимущественное содержание неметилированных цитозинов в составе СрС динуклеотидов бактериальной ДНК и двуцепочечная структура вирусных РНК. Однако, в отличие от специфических структурных компонентов иммуногенов, таких как липид А или О-антиген бактериального липополисахарида, структура эндогенных, иммунологически инертных и прокариотических иммуностимулирующих нуклеиновых кислот отличается незначительно, а сигналом для активации иммунной системы служит нетипичная локализация нуклеиновых кислот, например, присутствие дцДНК в цитоплазме. Одним из примеров неканонической локализации нуклеиновых кислот является их присутствие во внеклеточной среде, где они могут появляться в результате процессов некроза, апоптоза и активной секреции клетками и находятся в свободной форме, в составе нуклеопротеиновых комплексов и мембранных структур, или в составе комплексов, связанных с поверхностью клеток. В норме концентрация НК во внеклеточной среде невысока, они быстро деградируют и элиминируются из биологических жидкостей, однако ряд патологий сопровождается ростом концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот, что может приводить к образованию нехарактерных низкоаффинных комплексов, неканонической внутриклеточной локализации НК и индукции иммунных реакций. С другой стороны, внеклеточные НК в норме могут конкурировать с экзогенными НК модулируя их действие на иммунокомпетентные клетки. Исследование роли внеклеточных ДНК в реакциях врожденного иммунитета позволит установить их значение для нормального функционирования организма и развития иммунопатологических состяний, сопровождающихся повышенным уровнем внеклеточных нуклеиновых кислот. Представленная работа посвящена исследованию иммуномодулирующих эффектов внеклеточных дезоксирибонуклеиновых кислот, а также поиску потенциальных мишеней внеклеточных ДНК в клетках, взаимодействие с которыми опосредует их иммуномодулирующее действие.

Таким образом, целью работы является исследование иммуномодулирующего действия внеклеточных дезоксирибонуклеиновых кислот и поиск клеточных мишеней иммуномодулирующей ДНК.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- исследовать влияние геномной и внеклеточной ДНК на продукцию провоспалительных интерлейкинов клетками, участвующими в генерации врожденного иммунного ответа;

- исследовать костимулирующее действие ДНК с лигандами ТЬЮ и ТЫ14 - ро1у(1:С) и липополисахарида (ЛПС), а также его зависимость от внутриклеточной локализации ДНК и костимуляторных сигналов;

- провести поиск потенциальных клеточных мишеней иммуномодулирующих ДНК при помощи выявления и идентификации белков, формирующих прочные комплексы с иммуномодулирующими олигодезоксирибонуклеотидами (ОДН).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Черепанова, Анна Витальевна

Выводы

1. Свободные от эндотоксина очищенные препараты бактериальных и эндогенных ДНК (геномной, свободной внеклеточной и связанной с поверхностью клеток), а также одно- и двуцепочечные олигодезоксирибонуклеотиды различной последовательности (свободные и в комплексах с трансфицирующими реагентами) не активируют продукцию провоспалительных интерлейкинов ИЛ-6 и ИЛ-8 в первичных эндотелиоцитах и фибробластах в широком диапазоне концентраций, несмотря на экспрессию в клетках рецептора Т1Л9.

2. ДНК не влияют на ЛПС-индуцированную секрецию провоспалительных интерлейкинов, однако ингибируют ро1у(1:С)-индуцированную секрецию ИЛ-6 и ИЛ-8. Ингибирующее действие ДНК не связано с метилированием СрС пар и зависит от степени фрагментации ДНК. Внеклеточная ДНК, связанная с поверхностью клеток, является более эффективным ингибитором ро1у(1:С)-индуцированной секреции провоспалительных интерлейкинов по сравнению с геномной и свободной внеклеточной ДНК.

3. Добавленные в культуральную среду или трансфицированные в клетки одноцепочечные и двуцепочечные олигодезоксирибонуклеотиды ингибируют ро1у(1:С)-индуцированную секрецию интерлейкинов, а также экспрессию их генов. Эффективность ингибирования зависит как от последовательности, так и от концентрации олигонуклеотидов и не связана с ингибированием транспорта ро1у(1:С) в клетки.

4. Инкубация первичных эндотелиоцитов и их мембранно-цитозольных экстрактов с одноцепочечным и двуцепочечным ОДН14 (аналогами связанной с клеточной поверхностью ДНК) приводит к формированию нуклеопротеиновых комплексов с константами диссоциации 6 ± 0.8 х 10-10 М и 4 ± 0.5 х 10-10 М, соответственно. ОДН-связывающие белки были выделены из мембранно-цитозольного экстракта клеток и идентифицированы методом МАЦЛ-ТОБ масс-спектрометрии как белки Ки70 и Ки80. С помощью моноклональных антител к Ки70 показано, что Ки белок является основной клеточной мишенью иммуномодулирующих ОДН и, таким образом, может принимать участие в регуляции иммуномодулирующего действия ДНК.

Заключение

В представленной работе впервые проведено исследование иммуномодулирующего действия внеклеточных ДНК in vitro в культурах первичных эндотелиоцитов и фибробластов. Было показано, что ДНК из различных источников (бактериальная, геномная, свободная и связанная с поверхностью клеток внДНК) не активирует клетки, несмотря на экспрессию ДНК-распознающих рецепторов, в частности TLR9.

Отсутствие иммуностимулирующей активности эукариотической ДНК имеет важное биологическое значение, более того, эндогенная ДНК должна обладать иммуноингибирующим действием. Действительно, концентрация цирДНК может существенно возрастать при «стерильных» повреждениях, таких как травма, инфаркт, и, ингибирующие последовательности в составе цирДНК должны предотвращать активацию иммунных клеток. Обнаруженный эффект ингибирования ро1у(1:С)-индуцированной продукции провоспалительных медиаторов под воздействием ДНК из различных источников свидетельствует о возможной роли цирДНК в регуляции неспецифического противовирусного иммунного ответа. Все исследованные препараты ДНК в той или иной степени обладают эффектом, который не зависит от CpG состава и статуса метилирования ДНК, однако зависит от длины и последовательности ДНК. Наиболее эффективным ингибитором ро1у(1:С)-индуцированного иммунного ответа является скпДНК, что свидетельствует о присутствии в ее составе специфических структур или последовательностей, обладающих более выраженным ингибирующим действием, по сравнению с фрагментированной геномной ДНК. Действительно, ранее было показано, что ДНК, связанная с поверхностью клеток отличается по своему составу от геномной ДНК [128]. Вероятно, повышенная концентрация определенных последовательностей в составе ДНК из трипсинового элюата клеток позволяет ДНК более эффективно связываться с клеточной поверхностью и далее взаимодействовать с внутриклеточными медиаторами иммунного ответа. Поскольку концентрация скпДНК, обладающей эффектом (100 нг/мл) близка к физиологической концентрации внеклеточных ДНК в крови человека (10-500 нг/мл), скпДНК может обладать эффектом не только in vitro, но и in vivo, регулируя противовирусный иммунный ответ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черепанова, Анна Витальевна, Новосибирск

1. Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity // Cell. 2006. V. 124. P. 783-801.

2. Isaacs, A., Cox, R., Rotem, Z. Foreign nucleic acids as the stimulus to make interferon // Lancet. 1963y V. 7299. P. 113-116.

3. Rotem, Z., Cox, R., Isaacs, A. Inhibition of virus multiplication by foreign nucleic acid // Nature. 1963. V. 197. P. 564-566.

4. Field, A.K., Tytell, A.A., Lampson, G.P., Hilleman, M.R. Inducers of interferon and host resistance. II. Multistranded synthetic polynucleotide complexes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967. V. 58. P. 1004-1010.

5. Wang, Q., Carmichael, G. Effect of length and location on the cellular response to double-stranded RNA // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. V. 68. P. 423-452.

6. Krieg, A., Yi, A., Matson, S., Waldschmidt, T., Bishop, G., Teasdale, R., Koretxky, G., Klinman, D. CpG DNA motifs in bacterial DNA trigger B-cell activation // Nature. 1995. V. 374. P. 546-549.

7. Krieg, A.M. Mechanisms and applications of immune stimulatory CpG oligodeoxynucleotides /1 Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1489. P. 107-116.

8. Hornung, V., Latz, E. Intracellular DNA recognition // Nature Rev. Immunol. (2010) V. 10. P. 123-130.

9. Bortoluci, K., Medzhitov, R. Control of infection by pyroptosis and autophagy: role ofTLR and NLR // Cell. Mol. Life Sci. 2010. V. 67. P. 1643-1651.

10. Krieg, A. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects // Annu. Rev. Immunol. 2002. V. 20. P. 709-760.

11. Stein, C., Subasinghe, C., Shinozuka, K., Cohen, J. Phisico-chemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. // Nucleic Acid Res. 1988. V. 16. P. 3209-3221.

12. Suzuki, K., Mori, A., Ishii, K.J., Saito, J., Singer, D.S., Klinman, D.M., Krause, P.R., Kohn, L.D. Activation of target-tissue immune-recognition molecules by double-stranded polynucleotides // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999. V. 96. P. 2285-2290.

13. Krieg, A., Wu, T., Weeranta, R., Efler, S., Love-Homan, L., Yang, L., Yi, A., Short, D., Davis, H. Sequence motifs in adenoviral DNA block immune activation by stimulatory motifs II Microbiology. 1998. V. 95. P. 12631-12636.

14. Pisetsky, D., Reich, C. Inhibition of murine macrophage IL-12 production by natural and synthetic DNA // Clin. Immunol. 2000. V. 96. P. 198-204.

15. Lenert, P., Rasmussen, W., Ashman, R., Ballas, Z. Structural characterization of the inhibitory DNA motif for the type A(D)-CpG-induced cytokine secretion and NK-cell lytic activity in mouse spleen cells // DNA Cell. Biol. 2003. V. 22. P. 621-631.

16. Peter, M., Bode, K., Lipford, G., Eberle, F., Heeg, K., Dalpke, A. Characterization of suppressive oligodeoxynucleotides that inhibit Toll-like receptor-9-mediated activation of innate immunity // Immunology. 2007. V. 123. P. 118-128.

17. Gursel, I., Gursel, M., Yamada, H., Ishii, K., Takeshita, F., Klinman, D. Repetitive elements in mammalian telomeres suppress bacterial DNA-induced immune activation // J. Immunol. 2003. V. 171. P. 1393-1400.

18. Krieg, A. Development ofTLR9 agonists for cancer therapy II J. Clin. Invest. 2007. V. 117. P.1184-1194.

19. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signaling // Nat. Rev. Immunol. 2004. V. 4. P. 499-511.

20. Jin, M.S., Kim, S.E., Heo, J.Y., Lee, M.E., Kim, H.M., Paik, S.G., Lee, H., Lee, J.O. Ciystal structure of the TLR1-TLR2 heterodimer induced by binding of a tri-acylated lipopeptide // Cell. 2007. V. 130. P. 1071-1082.

21. Guan, Y., Ranoa, D.R., Jiang, S., Mutha, S.K., Li, X., Baudry, J., Tapping, R.I. Human TLRs 10 and 1 share common mechanisms of innate immune sensing but not signaling I I J. Immunol. 2010. V. 184. P. 5094-5103.

22. Park, B.S., Song, D.H., Kim, H.M., Choi, B.S., Lee, H., and Lee, J.O. The structural basis of lipopolysaccharide recognition by the TLR4-MD-2 complex // Nature. 2009. V. 458. P.1191-1195.

23. Hayashi, F., Smith, K.D., Ozinsky, A., Hawn, T.R., Yi, E.C., Goodlett, D.R., Eng, J.K., Akirak, S., Underbill, D.M., Aderem, A. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5 // Nature. 2001. V. 410. P. 1099-1103.

24. Alexopoulou, L., Holt, A., Medzhitov, R., Flavell, R. Recognition of double-stranded RNA and activation ofNF-kappaB by Toll-like receptor 3 // Nature. 2001. V. 413. P. 732-738.

25. Matsumoto, M., Kikkawa, S., Kohase, M., Miyake, K., Seya, T. Establishment of a monoclonal antibody against human Toll-like receptor 3 that blocks double-stranded RNA-mediated signaling II Biochem. Biophysl. Res. Commun. 2002. V. 293. P. 1364-1396.

26. Matsumoto, M., Funami, K., Oshiumi, H., Seya, T. Toll-like receptor 3: a link between Toll-like receptors, interferon and viruses // Microbiol. Immunol. 2004. V. 48. P. 147-154.

27. Liu, L., Botos, I., Wang, Y., Leonard, J.N., Shiloach, J., Segal, D.M., Davies, D.R. Structural basis of toll-like receptor 3 signaling with double-stranded RNA // Science. 2008. V. 320. P. 379-381.

28. Heil, F., Hemmi, H., Hochrein, H., Ampenberger, F., Kirschning, С., Akira, S., Lipford, G., Wagner, H., Bauer, S. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8 // Science. 2004. V. 303. P. 1526-1529.

29. Karikô, К., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Tolllike receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA // Immunity. 2005. V. 23. P. 165-175.

30. Krieg, A., Vollmer, J. Toll-like receptors 7, 8, and 9: linking innate immunity to autoimmunity // Immunol. Rev. 2007. V. 220. P. 251-269.

31. Takeuchi, O., Itagaki, S., Kumar, N. Toll-like receptor 9 mediates innate immune activation by the malaria pigment hemozoin I I J. Exp. Med. 2005. V. 201. P. 19-25.

32. Ewaschuk, J., Backer, J., Churchill, T., Obermeier, F., Krause, D., Madsen, К. 2007. Surface expression of Toll-like receptor 9 is upregulated on intestinal epithelial cells in response to pathogenic bacterial DNA // Infect. Immun. V. 75. P. 2572-2579.

33. Rutz, M., Metzger, T., Geliert, T., Luppa, P., Lipford, G., Wagner, H., Bauer, S. Toll-like receptor 9 binds single-stranded CpG-DNA in a sequence- and pH-dependent manner // Eur. J. Immunol. 2004. V. 34. P. 2541-2550.

34. Kim, Y.M., Brinkmann, M.M., Paquet, M.E., and Ploegh, H.L. UNC93B1 delivers nucleotide-sensing toll-like receptors to endolysosomes // Nature. 2008. V., 452. P. 234-238.

35. Lamphier, M., Sirois, C., Verma, A., Golenbock, D., Latz, E. TLR9 and the recognition of self and non-self nucleic acids. Ann. N. Y. Acad. Sei. 2006. V. 1082. P. 31-43.

36. Черепанова, A.B., Тамкович, C.H., Власов, B.B., Лактионов, П.П. Активность дезоксирибонуклеаз крови в норме и при патологии // Биомед. Хим. 2007. V. 53. Р. 488-496.

37. Lee, H.K., Lund, J.M., Ramanathan, B., Mizushima, N., and Iwasaki, A. Autophagy-dependent viral recognition by plasmacytoid dendritic cells // Science. 2007. V. 315. P. 1398-1401.

38. Kagan, J.C., Medzhitov, R. Phosphoinositide-mediated adaptor recruitment controls Tolllike receptor signaling // Cell. 2006. V. 125. P. 943-955.

39. Takeuchi, O., Akira, S. Pattern recognition receptors and inflammation // Cell. 2010. V. 140. P. 805-820.

40. Xia, Z.P., Sun, L., Chen, X., Pineda, G., Jiang, X., Adhikari, A., Zeng, W., Chen, Z.J. Direct activation of protein kinases by imanchored polyiibiquitin chains // Nature. 2009. V. 461. P. 114-119.

41. Kagan, J.C., Su, T., Horng, T., Chow, A., Akira, S., Medzhitov, R. TRAM couples endocytosis of Toll-like receptor 4 to the induction of interfer on-bet a // Nat. Immunol.2008. V. 9. P. 361-368.

42. Pobezinskaya, Y.L., Kim, Y.S., Choksi, S.,Morgan,M.J., Li, T., Liu, C., Liu, Z. The function of TRADD in signaling through tumor necrosis factor receptor I and TRIF-dependent Toll-like receptors II Nat. Immunol. 2008. V. 9. P. 1047-1054.

43. Annane, D., Bellissant, E., Cavaillon, J.M. Septic shock // Lancet. 2005. V. 365. P. 63-78.

44. Kobayashi, K., Hernandez, L.D., Galán, J.E., Janeway, C.A., Medzhitov, R., Flavell, R.A. IRAK-M is a negative regulator of Toll-like receptor signaling II Cell. 2002. V. 110. P. 191-202.

45. Préle, C.M., Woodward, E.A., Bisley, J., Keith-Magee, A., Nicholson, S.E., Hart, P.H. SOCS1 regulates the IFNbut not NFkappaB pathway in TLR-stimulated human monocytes and macrophages // J. Immunol. 2008. V. 181. P. 8018-8026.

46. Wald, D., Qin, J., Zhao, Z., Qian, Y., Naramura, M., Tian, L., Towne, J., Sims, J.E., Stark, G.R., Li, X. SIGIRR, a negative regulator of Toll-like receptor-interleukin 1 receptor signaling II Nat. Immunol. 2003. V. 4. P. 920-927.

47. Zhang, Y.B., He, F.L., Fang, M., Hua, T.F., Hu, B.D., Zhang, Z.H., Cao, Q., Liu, R.Y. Increased expression of Toll-like receptors 4 and 9 in human lung cancer // Mol. Biol. Rep. 2009. V. 36. P. 1475-1481.

48. Hedayat, M., Takeda, K., Rezaei, N. Prophylactic and therapeutic implications of toll-like receptor ligands // Med. Res. Rev. 2012. V. 32. P. 294-325.

49. Takeuchi, O., Akira, S. Innate immunity to virus infection // Immunol. Rev. 2009. V. 227. P. 75-86.

50. Okabe, Y., Sano, T., Nagata, S. Regulation of the innate immune response by threonine-phosphatase of Eyes absent // Nature. 2009. V. 460. P. 520-524.

51. Michallet, M.C., Meylan, E., Ermolaeva, M.A., Vazquez, J., Rebsamen, M., Curran, J., Poeck, H., Bscheider, M., Hartmann, G., König, M., Kalinke, U., Pasparakis, M., Tschopp,

52. J. TRADD protein is an essential component of the RIG-like helicase antiviral pathway // Immunity. 2008. V. 28. P. 651-661.

53. Ishikawa, H., Barber, G.N. STING is an endoplasmic reticulum adaptor that facilitates innate immune signalling I I Nature. 2008. V. 455. P. 674-678.

54. Franchi, L., Warner, N., Viani, K., Nunez, G. Function of Nod-like receptors in microbial recognition and host defense // Immunol. Rev. 2009. V. 227. P. 106-128.

55. Ting, J.P., Duncan, J.A., Lei, Y. How the noninflammasome NLRs function in the innate immune system // Science. 2010. V. 327. P. 286-290.

56. Sabbah, A., Chang, T.H., Harnack, R., Fröhlich, V., Tominaga, K., Dube, P.H., Xiang, Y., Bose, S. Activation of innate immune antiviral responses by Nod2 // Nat. Immunol. 2009. V. 10. P. 1073-1080.

57. Stetson, D.B., Medzhitov, R. Recognition of cytosolic DNA activates an IRF3-dependent innate immune response 11 Immunity. 2006. V. 24. P. 93-103.

58. Chiu, Y.H., Macmillan, J.B., Chen, Z.J. RNA polymerase III detects cytosolic DNA and induces type I interferons through the RIG-I pathway 11 Cell. 2009. V. 138. P. 576-591.

59. Ablasser, A., Bauernfeind, F., Hartmann, G., Latz, E., Fitzgerald, K.A., Hornung, V. RIG-I-dependent sensing of poly(dA:dT) through the induction of an RNA polymerase Ill-transcribed RNA intermediate // Nat. Immunol. 2009. V. 10. P. 1065-1072.

60. Zaros, C., Thuriaux, P. Rpc25, a conserved RNA polymerase III subunit, is critical for transcription initiation // Mol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 104-114.

61. Muruve, D.A., Petrilli, V., Zaiss, A.K., White, L.R., Clark, S.A., Ross, P.J., Parks, R.J., Tschopp, J. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response // Nature. 2008. V. 452. P. 103-107.

62. Fernandes-Alnemri, Т., Yu, J.W., Datta, P., Wu, J., Alnemri, E.S. AIM2 activates the inflammasome and cell death in response to cytoplasmic DNA // Nature. 2009. V. 458. P. 509-513.

63. Hornung, V., Ablasser, A., Charrel-Dennis, M., Bauernfeind, F., Horvath, G., Caffrey, D.R., Latz, E., Fitzgerald, K.A. AIM2 recognizes cytosolic dsDNA and forms a caspase-1-activating inflammasome withASC// Nature. 2009. V. 458. P. 514-518.

64. Pawlotsky, J.M., Bastie, A., Lonjon, I. What technique should be used for routine detection and quantification of HBV DNA in clinical samples? // J. Virol. Methods. 1997. V. 65. P. 245-253.

65. Silva, J.M., Dominguez, G., Garcia, J. Presence of tumor DNA in plasma of breast cancer patients: clinicopathological correlations // Cancer Res. 1999. V. 59. P. 3251-3256.

66. Sozzi, G., Conte, D., Mariani, L., Vullo S., Roz, L., Lombardo, C., Pierotti, M., Tavecchio, L. Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during follow-up of lung cancer patients // Cancer Res. 2001. V. 61. P. 4675-4678.

67. Holdenrieder, S., Stieber, P., Bodenmüller, H., Busch, M., Von Pawel, J., Schalhorn, A., Nagel, D., Seidel, D. Circulating nucleosomes in serum // Ann. N. Y. Acad. Sei. 2001. V. 945. P. 93-102.

68. Holdenrieder, S., Stieber, P., Chan, L.Y., Geiger, S., Kremer, A., Nagel, D., Lo, Y.M. Cellfree DNA in serum and plasma: comparison of ELISA and quantitative PCR // Clin. Chem. 2005. V. 51. P. 1544-1546.

69. Holdenrieder, S., Stieber, P., Bodenmüller, H., Fertig, G., Fürst, H., Schmeller, N., Untch, M., Seidel, D. Nucleosomes in serum as a marker for cell death // Clin. Chem. Lab. Med. 2001. V. 39. P. 596-605.

70. Chelobanov, B.P., Laktionov, P.P., Vlasov, V.V. Proteins involved in binding and cellular uptake of nucleic acids I I Biochemistry (Mose). 2006. V. 71. P. 583-596.

71. Zhang, W., Wu, J., Qiao, В., Xu, W., Xiong, S. Amelioration of lupus nephritis by serum amyloid P component gene therapy with distinct mechanisms varied from different stage of the disease // PLoS One. 2011 V. 6. P. e22659.

72. Radic, M., Herrmann, M., van der Viag, J., Rekvig, O.P. Regjdatoiy and pathogenetic mechanisms of autoantibodies in SLE // Autoimmunity. 2011. V. 44. P. 349-356.

73. Krasnorutskii, M.A., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. DNase, RNase, and phosphatase activities of antibodies formed upon immunization by DNA, DNase I, and DNase II // Biochemistry (Mose). 2011. V. 76. P. 1065-1072.

74. Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R.J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication //J Proteomics. 2010. V. 73. P. 1907-1920.

75. Fietta, P. Many ways to die: passive and active cell death styles // Riv. Biol. 2006 .V. 99. P. 69-83.

76. Vlassov, V.V., Laktionov, P.P., Rykova, E.Y. Extracellular nucleic acids // Bioessays. 2007. V. 29. P. 654-667.

77. Juckett, D.A., Rosenberg, B. Actions of cis-diamminedichloroplatinum on cell surface nucleic acids in cancer cells as determined by cell electrophoresis techniques // Cancer Res. 1982. V. 42. P. 3565-3573.

78. Belyaev, N.D., Budker, V.G., Dubrovskaya, V.A., Khristoljubova, N.B., Kiseleva, E.V., Matveeva, N.M., Sukojan, M.A. Membrane-mediated changes in the structure of chromosomes // Chromosoma. 1985. V. 92. P. 193-199.

79. Aggarwal, S.K., Wagner, R.W., McAllister, C.K., Rosenberg, B. Cell-surface-associated nucleic acid in tumorigenic cells made visible with platinum-pyrimidine complexes by electron microcopy // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 928-932.

80. Chan, T.M., Frampton, G., Cameron, J.S. Identification of DNA-bindingproteins on human umbilical vein endothelial cell plasma membrane // Clin. Exp. Immunol. 1993. V. 91. P. 110-114.

81. Frampton, G., Hobby, P., Morgan, A., Staines, N.A., Cameron, J.S. A role for DNA in anti-DNA antibodies binding to endothelial cells // J. Autoimmun. 1991. V. 4. P. 463-478.

82. Irache, J.M., Merodio, M., Arnedo, A., Camapanero, M.A., Mirshahi, M., Espuelas, S. Albumin nanoparticles for the intravitreal delivery of anticytomegaloviral drugs // Mini Rev. Med. Chem. 2005. V. 5. P. 293-305.

83. Bergsmedh, A., Ehnfors, J., Kawane, K., Motoyama, N., Nagata, S., Holmgren, L. DNase II and the Chkl DNA damage pathway form a genetic barrier blocking replication of horizontally transferred DNA // Mol. Cancer Res. 2006. V. 4. P. 187-195.

84. Mal'shakova, V.S., Pyshnyi, D.V., Bondar, A.A., Vlassov, V.V., Laktionov, P.P. Isolation and sequencing of short cell-surface-bound DNA // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2008. V. 1137. P. 47-50.

85. Raptis, L., Menard, H. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus // J. Clin. Invest. 1980. V. 66. P. 1391-1399.

86. Pisetsky, D., Fairhurst, A. The origin of extracellular DNA during the clearance of dead and dying cells // Autoimmunity. 2007. V. 40. P. 281-284.

87. Su, K.Y., Pisetsky, D.S. The role of extracellular DNA in autoimmunity in SLE // Scand. J. Immunol. 2009. V. 70. P. 175-183.

88. Kolodny, G., Culp, L., Rosenthal, L. Secretion of RNA by normal and transformed cells II Experimental Cell. Res. 1972. V. 73. P. 65-72.

89. Stroun, M., Anker, P., Beljanski, M., Henri, J., Lederrey, C., Ojha, M., Maurice, P. Presence of RNA in the nucleoprotein complex spontaneously released by human lymphocytes andfrog auricles in culture // Cancer Res. 1978. V. 38. P. 3546-3554.

90. Anker, P., Stroun, M., Maurice, P. Spontaneous Extracellular synthesis of DNA released by human blood lymphocytes // Cancer Res. 1976. V. 36. P. 2832-2839.

91. Morozkin, E.S., Babochkina, T.I., Vlassov, V.V., Laktionov, P.P. The effect of protein transport inhibitors on the production of extracellular DNA 11 Ann. N. Y. Acad. Sei. 2008. V. 1137. P. 31-35.

92. Beck, J., Urnovitz, H.B., Riggert, J., Clerici, M., Schütz, E. Profile of the circulating DNA in apparently healthy individuals I I Clin. Chem. 2009. V. 55. P. 730-738.

93. Valgardsdottir, R., Chiodi, I., Giordano, M., Rossi, A., Bazzini, S., Ghigna, C., Riva, S., Biamonti, G. Transcription of Satellite III non-coding RNAs is a general stress response in human cells // Nucleic Acids Res. 2008. V. 36. P. 423-434.

94. Kopreski, М., Vorhees, С., Zhang, J. Detection of tumor mRNA in the serum of patients with malignant melanoma // Clin. Cancer Res. 2001. V. 36. P. 6584-6588.

95. Chen, X., Deshusses, J., Cattaneo, A., Henri, J. Telomerase RNA as a detection marker in the serum of breast cancer patients // Clin. Cancer. Res. 2006. V. 56. P. 3823-3826.

96. Dasi, L. Lam K., Chan, K., Luk, J. Real-time quantification in plasma of human telamerase reverse transcription mRNA: a simple blood test to monitor disease in cancer patients // Lab. Invest. 2001. V. 6. P. 3823-3829.

97. Silva, J., Pandey, S., Walker, P. Detection of epithelial mRNA in the plasma of breast cancer patients is associated with poor prognosis tumor characteristics // Clin. Cancer Res. 2001. V. 7. P. 282-295.

98. Lo, K., Lo, Y., Leung, S., Tsang, Y., Chan, L., Johnson, P., Hjelm, N., Lee, J., Huang, D. Analysis of cell-free epshtein Bar virus assosiated RNA in the plasma of patients nonsopharingeal carcinoma // Clin. Chem. 1999. V. 59. P. 3251-3566.

99. Calvet, J., Pederson, T. Secondary structure of heterogenous nuclear DNA: two classes of double-stranded RNA in native ribonucleoprotein // Proc. Nat. Acad. Sei. 1977. V. 74. P. 3705-3709.

100. Kumar, M., Carmichael, G. Antisense RNA: function and fate of duplex RNA in cells of higher eukaryotes // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62. P. 1415-1434.

101. Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response // Nature. 2007. V. 449. P. 819-826.

102. Rifkin, I., Leadbetter, E., Busconi, L., Viglianti, G., Marshak-Rothstein, A. Toll-like receptors, endogenous ligands, and systemic autoimmune disease // Immunol. Rev. 2005. V. 204. P. 27-42.

103. Napirei, M., Holger, K., Zevnik, В., Stephan, H., Mannherz, H., Moroy, T. Features of systemic lupus erythematosus in DNAsel deficient mice // Nature. 2000. V. 25. P. 177181.

104. Huck, S., Deveaud, E., Namane, A., Zouali, M. Abnormal DNA methylation and deoxycytosine-deoxyguanine content in nucleosomes from lymphocytes undergoing apoptosis IIFASEB J. 1999. V. 13. P. 1415-1422.

105. Lunec, J., Herbert, K., Blount, S., Griffiths, H., Emery, P. 8-Hydroxydeoxyguanosine: a marker of oxidative DNA damage in systemic lupus erythematosus // FEBS J. 1994. V. 348. P. 131-138.

106. Pisetsky, D. The role of nuclear macromolecules in innate immunity II Proc. Am. Thorac. Soc. 2007. V. 4. P. 258-262.

107. Bell, D., Morrison, В., VandenBygaart, P. Immunogenic DNA-related factors // J. Clin. Invest. 1990. V. 85. P. 1487-1496.

108. Kariko, K., Ni, H., Capodici, J., Lamphier, M., Weissman, D. mRNA is an endogenous ligandfor Toll-like receptor 3II J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 12542-12500.

109. Christensen, S., Kashgarian, M., Alexopoulou, L., Flavell, R., Akira, S., Shlomchik, M. Toll-like receptor 9 controls anti-DNA autoantibody production in murine lupus II J. Exp. Med. 2005. V. 202. P. 321-331.

110. Deng, G., Nilsson, I., Verdrengh, M., Collins, L., Tarkovsky, A. lntra-articularly localized bacterial DNA containing CpG motifs induce arthritis // Nature. 1999. V. 5. P. 702-705.

111. Wagner, H. The immunobiology of the TLR9 subfamily // Trends Immunol. 2004. V. 25. P. 381-386.

112. Pisetsky, D., Drayton, D., Wu, Z. Specificity of autoantibodies to bacterial DNA in the sera of healthy human subjects and patients with SLE/f J. Reumatol. 1999. V. 26. P. 1934-1938.

113. Ronaghy, A., Prakken, В., Takabayashi, K., Firestein, G., Boyle, D., Zvailfler, N., Roord, S., Albani, S., Carson, D., Raz, E. Immunostimiilatory DNA sequences influence the course of adjuvant arthritis // J. Immunol. 2002. V. 168. P. 51-56.

114. Jaffe, E.A., Nachman, R.L., Becker, C.G., Minick, C.R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria // J. Clin. Invest. 1973. V. 52. P. 2745-2756.

115. Schiigger, H. Tricine-SDS-PAGE // Nature Protocols. 2006. V. 1. P. 16-23.

116. Kovarik, A., Ondrkalova, M., Prachar, J., Stofko, J. Rapid and sensitive colloidal silver staining on cellulose acetate membranes // Clin. Chim. Acta. 1992. V. 208. P. 137-139.

117. Karran, P. Lindahl, T. Enzymatic excision of free hypoxanthine from polydeoxynucleotides and DNA containing deoxyinosine monophosphate residues // J. Biol. Chem. 1978. V. 253. P. 5877-5879.

118. Maniatis, Т., Fritsch, E.F., Sambrook, J. Molecular cloning. A laboratory manual. 2nd ed. // Cold Spring Harbor, N.Y. 1989.

119. Лактионов, П.П., Тамкович, C.H., Симонов, П.А., Рыкова, Е.Ю., Власов, В.В. Способ выделения дезоксирибонуклеиновых кислот // Патент на изобретение № 2232768. Приоритет от 02.10.2002.

120. Livak, K.J., Schmittgen, T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method /I Methods. 2001. V. 25. P. 402-408.

121. Scopes, R.K. Protein purification: principles and practice. 3rd ed ed. 11 Springer-Verlag, New York. 1994.

122. Laktionov, P.P., Dazard, J.E., Vives, E., Rykova, E.Y., Piette, J., Vlassov, V.V., Lebleu, B. Characterisation of membrane oligomicleotide-binding proteins and oligonucleotide uptake in keratinocytes // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 2315-2324.

123. Speicher, K.D., Kolbas, O., Harper, S., Speicher, D.W. Systematic analysis of peptide recoveries from in-gel digestion for protein identifications in proteome studies H J. Biomol. Tech. 2000. V. 5. P. 74-86.

124. Chen, C., Manning, A. TGF-beta 1, IL-10 and IL-4 differentially modulate the cytokine-induced expression of IL-6 and IL-8 in human endothelial cells // Cytokine. 1996. V. 8. P. 58-65.

125. Uehara, A., Takada, H. Functional TLRs and NODs in Human Gingival Fibroblasts // J. Dent. Res. 2007. V. 86. P. 249-254.

126. Kiszel, P., Mako, V., Prohaszka, Z., Cervenak, L. Interleukin-6 174 promoter polymorphism does not influence IL-6 production after LPS and IL-ip stimulation in human umbilical cord vein endothelial cells // Cytokine. 2007. V. 40. P. 17-22.

127. Nyhlen, K., Gautam, C., Andersson, R., Srinivas, U. Modulation of cytokine-indiced production of IL-8 in vitro by interferons and glucocorticosteroids // Inflammation. 2004. V. 28. P. 77-88.

128. Huschtscha, L., Noble, J., Neumann, A., Moy, E., Barry, P., Melki, J., Clark, S., Reddel, R. Loss of pi 6INK4 expression by methilation is assosiated with life expansion of human mammary epithelial cells // Cane. Res. 1998. V. 58. P. 3508-3512.

129. Cockerill, G., Meyer, G., Noak, L., Vadas, M., Gamble, J. Characterisation of spontaneously transferred human endothelial cell line // Lab. Invest. 1994. V. 71(4). P. 497-509.

130. Hanagata, N. Structure-dependent immunostimulatoiy effect of CpG oligodeoxynucleotides and their delivery system // Int. J. Nanomedicine. 2012. V. 7. P. 2181-2195.

131. Sester, D.P., Naik, S., Beasley, S.J., Hume, D.A., Stacey, K.J. Phosphorothioate backbone modification modulates macrophage activation by CpG DNA // J. Immunol. 2000. V. 165. P. 4165^1173.

132. Peddada, L.Y., Harris, N.K., Devore, D.I., Roth, C.M. Novel graft copolymers enhance in vitro delivery of antisense oligonucleotides in the presence of serum // J. Control. Release. 2009. V. 140. P. 134-140.

133. Mahanonda, R., Sa-Ard-Iam, N., Montreekachon, P., Pimkhaokham, A., Youngvanichit, K., Fukuda, M., Pichyangkul, S. IL-8 and IDO expression by human gingival fibroblasts via TLRs II J. Immunol. 2007. V. 178. P. 1151-1157.

134. Nonnenmacher, C., Dalpke, A., Zimmermann, S., Flores-De-Jacoby, L., Mutters, R., Heeg, K. DNA from periodontopathogenic bacteria is immunostimidatory for mouse andhuman immune cells // Infect. Immun. 2003. V. 71. P. 850-856.

135. Bailas, Z., Rasmussen, W., Krieg, A. Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motifs of oligodeoxynucleotides and bacterial DNA // J. Immunol. 1996. V. 157. P. 1840-1845.

136. Morozkin, E.S., Laktionov, P.P., Rykova, E.Y., Vlassov, V.V. Extracellular nucleic acids in cultures of long-term cultivated eukaryotic cells // Ann. N. Y. Acad. Sei. 2004. V. 1022. P. 244-249.

137. Stacey, K.J., Young, G.R., Clark, F., Sester, D.P., Roberts, T.L., Naik, S., Sweet, M.J., Hume, D.A. The molecular basis for the lack of immunostimulatoiy activity of vertebrate DNA //J. Immunol. 2003. V. 170. P. 3614-3620.

138. Lenert, P., Goeken, A.J., Ashman, R.F. Extended sequence preferences for oligodeoxyribonucleotide activity /I Immunology. 2006. V. 117. P. 474-481.

139. Wu-Pong, S., Weiss, T.L., Hunt, C.A.Antisense c-myc oligonucleotide cellular uptake and activity // Antisense Res. Dev. 1994. V. 4. P. 155-163.

140. Hanss, В., Leal-Pinto, E., Bruggeman, L.A., Copeland, T.D., Klotman P.E. Identification and characterization of a cell membrane nucleic acid channel II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. V. 95. P. 1921-1926.

141. Overhoff, M., Sczakiel, G. Phosphorothioate-stimidated uptake of short interfering RNA by human cells II EMBO Rep. 2005. V. 6. P. 1176-1181.

142. Opitz, В., Eitel, J., Meixenberger, К., Suttorp, N. Role of Toll-like receptors, NOD-like receptors and RIG-I-like receptors in endothelial cells and systemic infections // Thromb. Haemost. 2009. V. 102. P. 1103-1109.

143. Кочетков H.K., Будовский Э.И., Свердлов Е.Д., Симукова H.A., Турчинский М.Ф., Шибаев В.Н. Органическая химия нуклеиновых кислот // «Химия». Москва. 1970.

144. Rädler, J.O., Koltover, I., Salditt, Т., Safinya, C.R. Structure of DNA-cationic liposome complexes: DNA intercalation in multilamellar membranes indistinct interhelical packing regimes // Science. 1997. V. 275. P. 810-814.

145. Froy, O. Regulation of mammalian defensin expression by Toll-like receptor-dependent and independent signalling pathways // Cell Microbiol. 2005. V. 7. P. 1387-1397.

146. Zhuravel, E., Shestakova, T., Efanova, O., Yusefovich, Y., Lytvin, D., Soldatkina, M., Pogrebnoy, P. Human beta-defensin-2 controls cell cycle in malignant epithelial cells: in vitro study H Exp. Oncol. 2011. V. 33. P. 114-120.

147. Downs, J.A., Jackson, S.P. A means to a DNA end: the many roles of Ku // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2004. V. 5. P. 367-78.

148. Blier, P.R., Griffith, A.J., Craft, J., Hardin, J.A. Binding of Ku protein to DNA. Measurement of affinity for ends and demonstration of binding to nicks // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 7594-7601.

149. Collis, S.J., DeWeese, T.L., Jeggo, P.A., Parker, A.R. The life and death of DNA-PK // Oncogene. 2005. V. 24. P. 949-961.

150. Paupert, J., Dauvillier, S., Salles, B., Muller, C. Transport of the leaderless protein Ku on the cell surface of activated monocytes regulates their migratory abilities // EMBO Rep. 2007. V. 8. P. 583-588.

151. Monferran, S., Paupert, J., Dauvillier, S., Salles, B., Muller, C. The membrane form of the DNA repair protein Ku interacts at the cell surface with metalloproteinase 9 // EMBO J. 2004. V. 23. P. 3758-3768.

152. Lucero, H., Gae, D., Taccioli, G.E. Novel localization of the DNA-PK complex in lipid rafts. A putative role in the signal transduction pathway of the ionizing radiation response ü J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 22136-22143.

153. Subramanian, C., Opipari, A.W. Jr., Bian, X., Castle, V.P., Kwok, R.P. Ku70 acetylation mediates neuroblastoma cell death induced by histone deacetylase inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 4842-4847.

154. Rathaus, M., Lerrer, B., Cohen, H.Y. DeubiKuitylation: A novel DUB enzymatic activity for the DNA repair protein, Ku70 // Cell. Cycle. 2009. V. 8. P. 1843-1852.

Информация о работе
  • Черепанова, Анна Витальевна
  • кандидата биологических наук
  • Новосибирск, 2013
  • ВАК 03.01.04
Диссертация
Иммуномодулирующее действие внеклеточных дезоксирибонуклеиновых кислот - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Иммуномодулирующее действие внеклеточных дезоксирибонуклеиновых кислот - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы