Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимический анализ кристаллинов и бе..ков цитоскелета в процессе дифференцировки эпителиальных клеток в волокна хрусталика ...

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимический анализ кристаллинов и бе..ков цитоскелета в процессе дифференцировки эпителиальных клеток в волокна хрусталика ..."

ЙХУЯаШДЯ АШЕКЯ HAÏK ИНСТИТУТ ШОЛСГЛ РАЗВИТИЯ îRtsBJi П. '.. КОЛЬЦОВА

Нз. лрпсах ругсеш:си

АЛЕЙНИКОВА Харт:а C5::e-c::n

УДК 591

КЯШЮХШЧЕШЙ АНАЖЗ ЖСГАЛЯйНОВ л БЕСКОВ ЩШШИШ В ПРОЦЕССЕ ДШЕРЕЩйРОВКИ ШЭТЕаИАЖЫХ КЛЕТОК Е ЕОКЖМ ХРУСТАЛИКА AW ;

(03,00.11 - зкбрко.^огия, г!1стояог1П1, цитология)

АВТОРЕФЕРАТ дисссртацтп: на соискание учз::ой степгни

'/л'ЯХг'/

Работа выполнена в Институте биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН (директор - академик РАН, Н. Г. Хрупов)

Баучкай руководитель: доктор биологических наук А. Т. Шихайлов

Офицвадьшг орпоБснта: доктор биологических наук Г. Г. Гаузе доктор биологических наук, профессор Б. Б. Конюхов

Вздуаее учрегдзшзз: Биологический факультет ЖГУ им. П. В. Ломоносова

Заяита состоится \TvTT. в, .. 1932 г. в У.А..чэ,с.

на заседании специализированного совета Д 002, 85. 01 по защите диссертаций па соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте биологии развития км. Н. К. Кольцова РАН, Яоскза, ул. Вавилова 26, конференц-зал.

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития ни, Н. К. Кольцова РАК (Москва, ул. Вавилова 25).

Автореферат разослан .. . 1992 г.

Учетам секретарь специализированного совета, канд. 5иол. наук Е. Н. Протопопова

'-'V i

.-а.1, »преть пробдспи. г."--г г.гчге.'х козтсаоч-

шс.ютал a''.i;í6'-::í, ™rço::o яепод&.'устся s : '/'¡г.рпсЛ б;со-рзззггшя иг.:: !<ол:зыгм объект. Svc. '.-^устг'.яопо следу:';-глки ociiCBHbnsK пр:?п*закя: I) хрустал;::: «тгтеяг гез ядетоп только одного даврзвления дш^ренцкрезки; 2) яроцесс ропзхфоьзея глеток ошпедйя хрустал:?«. s ?одс:га нропеходк? на npoT2îts:i!Ci зеей хкззк осой:-,, что позволяет тгучгть нехаияз-кн кяеточлой ди^&рггцгфОБКз: зо взрослом состоянии (см. ; Pialigorsky, ISSI; BloffEeudal, ÍS32; Нкхаиэтз и др., Î98B) ; 3} клетки» язходяслася па развкх этапах ай^фгражшрозкк, соз-розалия :: старешся, закм=:зт я хрустал^е строго определенные эони (р:«е. I). Б&'деляя части хрусталика, нохко иссле-

довать огдеяькко зтгл^ дк^зрзяцнрогка ого -гяеток с жжегь» 6îîoxm3î42Cîchx и агмусохккическкх кгтодез (ci:. : Bio£?.ei)<îai, 1377, 1981). Анализ зкспрессго: разга-ккых 6s;coa в разках зо-прл де^лштисясго хрустдлшга ярог?одклся s оспозном у лслегсопк-тлвЕбгх. Взрослкв гкфкбгос пе бьли. изучены в это?? аекохто. В то :¿o зрэкя хрусталкя гк^ибзй йвляется унобккм с5ъс-кгс-< для исс-ледозадаз пехсякзкоз дэйстшта разнообразны;-: дт;ф*эреяцкроз очных tsKTopos. Кроме того, у некоторых «нло» ^faôjcï хрусталик способен регенерирсвагь кг радуяки (вои>фо5с;;ая рзгечергиия; ск. : Лозгяов. Строэаа, ISC3; Rayer, 1377; Tacada, 1377) или рогс21;аы (?гео<дНТ;, 1963; Скг,грсг'--й, IS32). лзучец:!? био-.см:мес;сц>: тхгтзнсз этих прог;<?ссоз необход?::о зказить карьер:*, поззелиззеге ичектиЗ-ищфозать хрусталжзае клыки к определять отдельное этгга их дкф^рездярозки г конкретных экспериментальна* условиях. Тз<";й кзркер»! occícinro пгсбходлмы üjVH ярозздвнкй опкгсй in vitro, когда s культурах форкгруэтея аткакчзжв хрусталики (т. н. лезтетьг) зля зоззжадт едкн::чнз:е хрустая œcoeas клетки, плохо кдентк'&гйяруекка исрфологичес-:CC!Î урезке.

;i i^ïû próovr.:. 0пь'г.-5!-г.') цель яг^зго исслздзг.агт:,! zzamsr.ncb в жпзйъиа:-паркера эта-

пов дкг^с-ййнцг.роглсг, сезрзззгчл к стара::;;:; гзусталтаознх кле-70" у s.-:pcc.¡í.!x oi>íííg.'ftí Роя зга:: зн;пч'спг.*« í:*.to сколас-лтркро-ч> т:а анализе двух rpysn белхог.: I) Т1:2зес:гаицХ«чео:з»х во-

Ría I. СЬеема сттшш (плева) и шдасекия (пгряза) тазаич&дс зон хрусталика R tsapararia

Клетки здагеяиа зрусга.2£а (i! йпеет^грэр^от, ое.'закэт se кьазад

в асааг-а псаа^ссиас:" esees "tefe" (2!. SpsajsD etíí&psEiBqxsaicüs ваясЕза ytjfceesasr юктемниг «¡pa. апесдояок ылуЗъ Зфустадкгг, ебшз^а гяу&киг «ai "ксуа* Í3Í. В ssexgo расшдсжа сгааз «лерьв жшззз "я^н* здаюяеа (4), офараровевке в айржгиаззе

1а - цагграяьнаг область зшп&низ. ¿¡фяшв& 1б - злагеляй щеягаои Шяеяяаак зам здешюа заярпшаш

дорастЕорямых йепков Ьфистал лилов); 2) ¡¡елхсв аитоскедсга; Длг. того, чтобы оцешггь пригодность каждого из изучептох белков для маркирования хрусталиковей ниффереииирсактн, ксслсяо-валл кх;

а) распределение и ссдергеане в разных частях грусгалжса;

б) скятез в разных частях хрусталика; б) локаякзаца в хяетках хрусталика.

Помигно этих основных задач, в процессе работы было необходимо вьщелить очяденные фракции кяистэдливоз для получение

соответствуйте ангпсызорогок, изучить гкснезую специфичность таксопссггсцифического ро-кристаллгаа, а тзкзе исследовать процесс глшсозилирозания белков хрусталика пгфкбий.

Научная яосизка и практическая ценность работы. Проведено исследование расиределения, синтеза к клеточной локализации спектра. ткзпесяецифических и цитоскелетянх белков, что позволило вигшить маркера отдельных этапов лифтзренцировки и соз-репакип хрусталшсозых клеток. Подобного рода исследования проведены на хрусталике амфибий впервые, а но количеству изученных белков работа превосходит аналогичны» огштн, выполненные на хрусталике высших позвоночных. Оснозкая часть полученных данккх носит приоритетом или орипотальяый характер. Наиболее сукестзенете результаты следующие:

I) показано, что каждый изученный кристаллин или белок ци~ тосхелята шеет индивидуальный характер распределения в хрусталике. Эти данные позволяют использовать отдельные кристал-лины в качестве маркеров ранних зтапов, а шггсскялетвые белки - в качестзе маркеров терминальных зтгноз дкффэренцкровки и созревания хрусгаликовых клеток;

21 продемонстрировано, что в ходе яийе^экцировкп клеток эпителия хрусталика в волокна происходит последовательная активация синтеза разных тьаяеспецифмэсгсвс грист&ллкяоз,- причем она отличаетсп от таковой в змРриопгльнск: хрусталике:

3) устзлозлено, что ро-кр.четаллин гмфя£:Л (ск. : Сайге е1 а1., 1585) жеэг кирокое тканевое распределение, однако его пшерзкспр&ссия наблюдается только в хрусталике к сетчатке глаза.

4) впервые идентифицировал водсрзстзорпзй полнпептид с колекулярней массой 23 кД», спеаифичтгя дяз хрусталика акфи-бкй, по ко птиь ръ:3 к илекошпаеткх. '¿тот солкпептид обнаружен не только в хрусталике, где он лехалдаозан в зхпггелик и волокнах кс\:Ы, но к в сетчатке глаза;

5) вяекезд в хруетзлюсз «фЛяй изучено распределение четырех цитоскйлотних белков. Ваасулнн и аитсг?р?.тчм 3 обаару-¿ек! в хрусталике позссно-пкх Еиарзые.

Результата раЗоти когут быть псяользозана в разнообразных

исследованиях по изучению молекулярных и клеточных механизмов диффереяцировкн, в которых хрусталик глаза слузсит кодельшм объектом.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на: Советско-фиплянхасих симпозиумах со биологии развития ("Клеточная дифферещирозка и экспрессия геноз",. Ташкент, 1988; "Сигнальные молекулы и клеточная дифференцировка", Суздаль, 1331} ¡ European Symposium on the Biology oí the Cytoskeleion (Helsinki, Finland, ÍS89); Ilth International Congress of International Society of Developmental Biologists (Utrecht, The Netherlands, 1989); Рабочем совещании по биологии развития "Стволовые кгетки в развитии и ди$ференцировке" (йосква, 1990); 9th International Congress of Eye Research (Helsinki, Finland, 1990); European Developmental Biology Congress (Jerusalem, Israel. 1931).

Апробация диссертации проведена на заседании объединенного семинара по гистология и цитолог га Института биологии раззк-тия им. Н.К. Хамцова РАН 23 марта Í992 г.

Публикации. По теме диссертации овубликовгно 14 печатных работ.

Структура и оаьем работа, Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и иэтопов, двух глав экспври-' ментальной часта заключения, з: зыводое. Работа изложена на 170 страницах, икл»чая ¡II с границ машинописного текста, иллюстрировала 34 рксуиками,' 6 таблицами. Список цитированной литературы включает 34 работы отечественных и ISS - иностранных авторов.

ШЕРЗМ 1\ ПЕТОПЯ

Исследояанка проводили на взрослых лягуихсах, Р.ада temporaria L, кз которьх вцделкли хрусталж, сетчатку, роговицу, сосудистую оболочку, радужку, пзчепн, семенники, почни, селезенку, легкое, желудок, кишечник, скелетную казцу, сердце, головной иозг к сваоротку геровк. В работе использовали хрусталики других Eiaioc акрибии, а такхе тунца, г.уклада, мыли,

крысы и сшса. Хрусталик R, temporaria разделяли на несколько частей (рис, I): центральную область зпитсляз, передний эпителий целиком, волокна поверхностного слоз "коры", волокна глубокого слоя "коры", волокна "ядра".

Биохимические метода

Приготовление экстрактов. Ткани гомогенизировали и экстрагировали: а) трис-HCl буфером (50 пй, рй7, б); б) трис-НС1 буфером, сояерхзлим 10 2 моченикы; в) стартсзьм буфером для SDS-электрофореза (Laeirali, 1370).

Электрофорез в 1У.-ном агароаом гелэ проводили в трие-ЭДТА-боратяой (ТЭ'В) буферной системе (0,1 Н; рН 8,S) при градиенте напряжения 4,5 В/си в течение 90 мин (Иихашсв, 1978).

S3)S - з л сктрофорез в пол.такриламидиеи геле проводили в 6.5/.-, Ш- и 15Й-еых разделяющих гелях (Lacrali, 1970).

Гель-фкльтрацгао проводили на улътрогеле АсА 34 в трис-КС1 буфере (100 иН, рН 7,3) при комнатной температуре.

Ионообменную хроматографии выполнял!! ra DEAE-Toyopearl 650 И в трис-HCl (о мН, рН 9, 0) или фосфатяс: буфере (25 мй, plí 5,7) при 4°С. Фракции злвироваяи линейся градиентом концентраций НаС1 (0-500 мН).

Конкаяавалиа (кон) А-пероксидазнуа методику (Kijiraoto-Üc-hiai et al., 1985) использовали для вкязлеяк! ксн А-сзязываю-щих фракций хрусталика на нитроцеллюлозных {зльтрах.

Яоацгятрахгио белка определяли: а) по Яс^ри {Lov>r j et al., 1951); б) на китроделлшозяон фильтре дот-кетодом (Науег, Wslker, T5S7).

Ейиунохзмнчзсгшз метода

Иммунизация хивогаух. Антигенный ттзрлам (табл. I) сме-пшваяк с полный адьювантом Фрешда (1:1) й вводили кроликам водкохео 2-3 раза (Еихайдов, Барабанов, IS7SJ.

ЙозиклоналиЕЭ антисиворотки (АЦ) и иоЕсташалыше антитела (ИТ). В работе использовали мзжгдязйГйцае АС к: альфа-крксгаллшган быка; бета-кристаяяизаи кур." агзеи бета- и гам-ма-кристаллкнсз R. temporaria; гаима-кряс-мгннам R. temporaria; ро-кристаллику R. tc-nporaria; 23 кйа- вкипептиду R, tem-

Таблица 1, Получение препаратов кристаллкнов для икмунизации

Кристаллика Вид животного Кетод получения

альфа Бык гель-фильтрация + ионообменная хроматография

бета Курица кшунопреципитация. в геле

бета + гамма Травяная лягушка электрофорез в агаровом,геле

гамма _ я электрофорез в агарозоа геле; монообмевиая хрокатография

ро и гедь-фнльтрация + хелатная аффинная хроматография + изозлехтрофо<сускрсчд.1:-:в, (см.: Етюхов, Сгздйоскнн, itöS)

poraria. ЕА1 к екаентиау (клон 4В5) и вктсулкну (дисс: F3) предоставлены преф. JL Виртаяеном (Хельсинкский Университет, Финляндия); к цкгокераткну 8 (клоны Е2 и Е7) лредостазлеш д. б.н. Г. А. Башаглаък (ШШ канцерогенеза ЕОНЦ, Ьосква); к фодрияу (клон 101 Мб) предоставлена лроф. В, -В. Дехто (Университет г. Оулу, Финляндия).

Икнуноаффиня^з очистку антител выполняли ка нятроцеллмсз-кых фильтрах iSaith, Fisher, 1984).

ИмиуподкФуузиа яроводики на пластинках IX-ного агарового геля (Гусез, ISS-')}. Ставили таххе: а) "перекрестное" реакции сравнения; б) "задержу" иннуиодиффузионных реакций in situ (Сшшрскш и др.» IS89).

Радиальную геауыодкффузию проводили на пластинках I''.-ного агарового геля по З&шчиыи (I-Iancini et al., IS65).

Одномерный к&уноздектрофорэз проводили в 1И-ном агаровой геле (Цветков, ISS3) б ТЗБ-буферной системе (г-Н 0,6).

11мяуколот-аке.."дз выполняли по методике Хаукса и соаст. (Hav/kes ei al., I3S2).

КимуноСл от - анализ проводили но методу Таубюза и соаат. (Towbin et al., 1972} с некоторыми модификация.,.«.;: (Vir tauen st

Рил 2. Схека проведена иаука1?тореш1огй5^«еазо: исследований

Хрустаа-гспеянхи (I) и/и юогафаганай зпигегка (Л) культивировали б првутетия. Здавшяг {III, Г/). Кзчмей гшаювй и хрусталик, пргд-еавягеяет радввйгаяй на <$гипйнш (\Г), гнглизирссаяи ш*укгазторэйио-грефмесзд (та : Сдаирсккй к др., 1991)

I - этггаям листажа. (1а - центральная сб.тзсты 16 - весь эгоете-яй); 2 - всаеряюгткгз слш "керн" хрусталаа; 5 - глу&язгэ слои '!ксры" хруспгаса; 4 - ''ягро" хруехэдгеа

а1., 1932; Михайлов, Сюягросии, 1991).

Иающс^сся^ак»' (ей.: Янхаилов, Сикирсяой, 1991). В качестве сорСгяУСБ.'Кйгользовакй; а) ацетоновые лоретки тканей и сргслоз (Энгельгарят, . 1955); 5) б'а&сн, ^мобилизованные ка яягроа&глоззгкзч фттрв.

^Р"-- 2), Хрусталияа и изолирочаанкй

эпителий культивировали in vitro в присутствии 3=,5-метиони-на; экстракты из разных частей хрусталика затем исследовали в одномерном имкувоэлекгрсфорезе с последующей авторадиографией. В некоторых случаях использовали вариант иммуноавтора-диографии с "носителем* (Абелев, Бакиров, 1968).

Для определения полипептидного состава радиоактивно меченых антигенов из окрашенных и высушенных иммуноэлектрофорег-рамм вырезали дуги преципитации и подвергали их SDS-электро-форезу (Симирскии и др., IS85). Электрофоретические фракции переносили на нлтроцеллюдозный фильтр, который исследовали авторадиографичесхи (Нихайлов, Симирский, 1931). •

йммукогистохгешя. Использовали непрямой метод флуоресцирующих антител на парафиновых срезах (Энгельгардт, 1968; Нихайлов, Барабанов, 1975).

ЭКСПРЕССИЯ ТКАЕЕСПЕЦЙФЯЧЕСНВХ БОЯОРАСТБОРИШ БЕЖОВ ШШШШОВ) В РАЗНЫХ ЧАСТЯХ ХРУСТАЛИКА

Исследовали канонические (альфа-, бета- и гамма-) и таксо-коспэцифический (ро-) кристаллинм (рис. 3). Экспрессию этих белков изучали с помошью иммувоэлзктроблотинга и имыукоэлект-рофореза; для изучения их синтеза использовали кммуцоэзтора-диографический анализ; клеточку» локализацию определяли икму-когисгохиаичепюи.

Альфа-аристалаины. С номодь» иммуноэлектроблотинга и имму-ноэлектрофореза гльфа-крксталлитш обнаружены, в эпителии, ''хоре" и "ядре" хрусталика (табл. 2). При этом, однако, реакции на альфа-крясталлины с эхстрактаки из центральной области эпителия и '"ядра" хрусталика были значительно слабее, чем с экстрактами из нелого эпителия и ''корь:" хрусталика. Следует отметить, что при экстракция в присутствии мочевины ал=-фа-крюталлияы tast:- выявлялись во всех частях хрусталика, но в "ядре" их содержание 5ъшо значительно вмме, чем при водно-солевой зкстрзхции. Очевидно, большая часть альфа-кристал-ликоз в "ядре" хрусталика находится в водонерастзоригюк состоянии.

В центральной области эпителия хрусталика синтез аль-

КОА

43 ~ сэ

30 — 20 — ■ММВЕ» К»1""»«« и 1 ы

I 2 3 4 5

Ркс. 3. Исследования? классы кристалликов

I - элекгрсфзреграта водно-солевого экстракта из волокск хрусггали-1а (ЗСб-эленпрофсзрез в ГЕК-нок ПМП шрадаваже куиасси ярмо-голу-й-250) ; 2-5 - гемуноблот-реакции с АС к кржтгллинам: алъфэ- (2), бета (3), гаша- (4) и ро- (Б)

фа-крксталлинсв был следоаын. Более штенскгкый синтез аль-фа-кристалл?£йоз наблюдали в поверхностных и глубоких слоях "коры" хрусталика. В "ядре" хрусталика синтез альфа-кристалликов не выявлялся. Для того,, чтобы выясгкть, одна или обе цепи альфа-кристадлинов синтезируются в эпителии и "коре", соответствуйте радиоактивно меченые иккуашреципитаты подвергали ЗЙЗ-элактрофоразу. Анализ автограф» электрофорети-чегнкх фракций показал, что как в зпителет, так и в "коре" синтезируются алъфа-А- и альфа-В-крисгаллкла.

По данам икпуногистохимнк алъ-крясталлгсш неравномерно распределены в эпителии хрусталика: клетза его центральной области не "содержат альфа-крнстадлипсв; слабая иммукофлуорес-центная реакция впервые обнаруживалась п клетках по периферии

Таблица 2. Распределение кристаллинов в разных пастях хрусталика (данные иммуноэлектроблотинга)

Кристаллш Еол. касса, кДа Ушу. у к с 5 л о т - р е акции с

эпителием корой ядром

альфа А 21 +/- и. +/-

бета 1 30 н- +

бета 2 28 + +

бата 3 27 - +/- +

бета 4 25 + +/-

бета 5 23 + +

галла 13-22 - + +

ро > 35 + А -+

Прюзчэние. - интенсива» скраииззике; •- слабое или сле-дсеое скраклиние; - сярвииззшщ етсутстЕовало

эпителия; интенсивную флуоресцеици» паблк-аади в удлиненных клетках эпителия в экваториальной области хрусталика.

Бета-кристаллит;. С помогал кмиунсэлектрсблотимга бэта-кристаляины сбнарухеш г эпителии, "коре" и "ядре" хрусталика (табл. 2). При этсм в эпителии гыявяевы только три полкпе-птида с колекуларисй кассой 27, 28 к 30 кДа, а в волокнах "кори" и "ядра" обнаруживались еаз дга полипептида (23 и 25 к£а). Видимо, процесс волоккообразозанля сопровождается активацией (усилением) синтеза бета-кристаллкнов с молекулярной кассой 23 и 25 кДа.

Синтез бета-кристаллияов обнаружен во г.сгх исследованных частях хрусталика» но б "йдр?" ок был следовал.

йжуногиггохзиически бёта-кристаллины обкаругека только б огделылх клетках ка периферии эпителия хрусталика. Интенсивная к-гиунофлуоресценткая метка обнаружена в удлиненных зпитг-паль них клетках к п "молодых" волокнах экваториальной области хрусталика.

Ганна-кристаллины. Гамма-кристаллшш, в отличие от альфа-и бета-кристаллзтов, не обнаружены в эпителии хрусталика. Они присутствуют только в волокнах "коры" и "ядра" (табл. 2), причем в ходе дифференцирсвки и созревания волокон хрусталика содержание гамма-кристаллшов увеличивается. По данным радиальной иммунодиффузии содержание гамма-кристаллинов составляло в волокнах поверхностной "корн" - 14/., глубокой "коры" - 37'/, а в "ядре" - 67/, от обоего водорастворимого белка хрусталика .

Гамма-кристаллита синтезируются только в волокнах "коры" и "ядра" хрусталика (в "ядре" синтез гамма-кристаллиноз был следовым)."

йммуногистохкиический анализ подтвердил отсутствие гамма-кристалликов во всех клетках эпителия, к в "молодых" волокнах экваториальной области хрусталика. Гамма-кристаллшта впервые обнаруживались в дифференцированных волокнах поверхностных слоев ''корм" хрусталика.

Ро-кристаллин. Б отличие от других кристаллинов, ро-кристалл;« обнаружен на только в хрусталике, ко тагсге в других тканях и органах (сетчатка, печень, семенник, почка, селезенки, легкое, ледудсх, кще'-пшк, сердце, скелетная кшаа). Однако, 2ысс::се сэ.чоряаниэ ро-кристаллкаг характерно только для хрусталика (¿С-12К) и сетчатки (1-2/0; в остальных органах (печень, семенник, кочке, сердце и др. } око ее превкаало О, 00-5-0, С1?' от обсего зсдорастворкчсго белка,

С пометь» иикунезлектроблотж^а ро-кристгллин обнаружен го всех частях хрусталика; ь эпителии, "коре" и "ядре" (табл. 2). По данным радиальной иммунодиффузии содержание ро-кристаллина в этих частях хрусталика примерно одинаковое.

Ро-кристаллин сзатезкруется во всех исследованных "компар-тментах", ко в "ядре" хрусталика его синтез значительно снижен.

Иниуногистохимический анализ показал, что ро-кристаллин присутствует во всех клетках эпителия хрусталика, вклкчал и его центральную область, а такзге в волокнах "коры" и "ядра".

23 кДа-полипептид. Этот полилоятяд характерен для амфибий, в хрусталике некоторых млекопитающие, птиц и рыб он отсутствует. V R. temporaria 23 кДа-полипептид, кроме хрусталика, обнарухек в сетчатке, но не е других органах и тканях.

С помощью иммунозлектроблотинга 23 кДа-полипептид выявлен во всех частях хрусталика (в "ядре" - в следовых количествах). Иммуногистохимически 23 кДа-полилептид обнаружен во всех клетках эпителия и в волокнах "коры". Б слегка удлиненных эпителиальных клетках экваториальной области хрусталика более интенсивно светилась" область цитоплазмы, прилегающая ¡с плазматической мембране.

Г лик о зил яров ание кристаллинов. Использовали кон А, специфически связывающийся с остатками глюкозы и маннозы. В эпителии хрусталика кон А свызызал только один полипептид с молекулярной массой 25 кДа. В "коре" хрусталика с кон А "реагировали" 4 полипептида (21, 23, 24 и 25 кДа), сходные по молекулярной массе с альфа-, бета-, и. гамма-крксталлинаки. В "г.дре" хрусталика очень интенсивно связывали кон А фракции с молекулярной массой от 18 до 25 кДа.

Эти результаты позволили предположить, что способность некоторых кркстаялкноз связывать кон А'проявляется с началом волозснообразования и усиливается в ходе созревания и. старения волокон хрусталика.

ЭКСПРЕССИЯ ЕЕМОВ ЩГОСЙЕША В РАЗВШ ЧАСТЯХ ШгСТАША R, TE8P0BARIA

Дифференцироька клеток эпителия хрусталика в волокна, их созревание и старение сопровождается: изменениями формы клеток, типа и количества кехклеточных контактов, площади плазматических мембран, утратой элементов цитоскелета (см. : Haisel, Al cala, 1980), Эти процессы сопровождаются изменениями в спектре белков цитоскелета (см.: Haisel, Ellis, 1984; Beebe, Cerrelli, 1989; Ireland, Haisel, IS89).

Вы исследовали: белки промежуточных филаментсв (вшентия и цитокератин 8) и белки, ассоциированные с плазматической мембраной (фодрин к витсулин) (рис. 4).

кОа

240

130 о

57 ! -

■43 в }

35 •

30 е i 2 3 4 5

Рис. 4. йссждсеанные белтсг шгоскелета

I - злегярсфореграяа белка эпителия хрусталика зкстегирозатаяс мо-чеяшсй (оЙЗ-элэзарсфзрез з 15Х-нш ПААР; аф-ззгазниэ куглсси ярко-го-лубя« й-250; ёрагояж с молекулпркй кассой ниже 3) ¡с&а по показаны); 2-5 - к^гунсйпст-реахции с М4Т к 5йлх?ч цитоскелета: вижнтину '2), юто-жергаяу (3), синкуяяу (4) и фзврау (5)

Виигнтин. С помоаъ» имиуиоз лектроблотинга з эпителии хрусталика обнаружено 4 тгояипептала с молекулг.рчсй кассой 43, 51, 54 и 57 кДа ¡табл. 3). Пва высокомолекулярных полнпеп-тида (54 и 57 кДа) дазали кнтенсизнке, а г.за других (-43 и 51 кОа}, которые чвляэтсл продуктами протеолиткчесхок деградации 57 кЯз-пол:шептида, - слабь:е инмукоблот-реакиил. В поверхностных- я глубоких слоях "коры" г.ияЕЛзка только одна фор--на викентина с молекулярной массой 57 кйа. В "ядре" хрусталика зиментин ке обнаружен.

Цитокератин 8. Б имчуноэлбктроблотикге антитела к цитоке-ратину 8 реагировали только с эпителием хрусталика. При ¿том

Таблица 3. Распределение белков цитоскелета в разных частях хрусталика (данные иммуноэлектроблотинга!

Иолипептид Иол. масса, кДа йшуноблот-реакции с

эпителием корой ядром

Виментин 57 + - + _

54 + _ _

51 _ -

43 + /- - -

Цитокератик 8 57 +/- - -

Фодрин 230 + + -

150 +/- + т

Винкулин 115 f +/- -

Пртзчэше. "+" - интенсивное скгесивакие; "+/-" - слабое или сяе-дсвое сарееавакие; - - свранкваниг отсутствовало

выявлялся чодиа полипептид с молекулярной кассой 57 кДа. В "коре" и "ядре" хрусталика цитокератш 3 не обнаружен. Книу-ногистохиаически цитокераткн 8 выявлен во всех клетках эпителия хрусталика. В "коре" и "ядре" хрусталика иммукофлуоргс-центнак реакция отсутствовала. Следует отметить, что цнтоке-ратин В впервые обнаружен в хрусталике позвоночных.

Фодркн (аналог слэктрида) представлен в эпителия хрусталика полкпептидом с молекулярной кассой 240 кДа. В поверхностных к глубоких слоях "icopii" хрусталика выявлен« дса по^ипеп-тида с коле::улкр;:он кассой 240 кДа и 150 кДа. Пог^едиий является, по-Е'/акио:;у, продуктом сротеолитической деградация 240 кДа-фракции. В "ядре" хрусталика присутствовала только 150 кйа-(!ра::ш1?. фодр;ц:а.

Вкш:уг.ш1 пргдстаплан в галтслни и "пор:" хрусталика одним полидептидо;; с иэла;;улвргой кассой 115 кДа. Содержание вин-кулкна в зшп'элии значительно eise, чем в "коре" хрусталика. В "ядре" xpvcTamca вигисулин не обнаружен.

ЗШШММЕ

На сспоэе представленных данных охарактеризуем биохимически катщый из изученных клеточных "кокпарткентов" хрусталика.

Эшгтелзй хрусталика (содержит стволовые и клоногешше клетки). В унлодекнггх клетках центральной области эпителия хрусталика оЗнэругев только один из изученных кристаллинсв - так-соп оспецн ¡яческуЯ ро-кристаллип, которьй характеризуется отроки« распространением з тканях и органах. Кроме того, в этих ге клетках выявлялся и 23 кДа-полшэптид. специфичный для хрусталика и сетчатки глаза амфибия. Вместе с тем, клетки этой области не содержат канонические (альфа-, бета- и гамма) 1фисталлкны. Альфа-кристаллины апергие выявляются в кубических клетках на периферии эпителия хрусталика. Бэта-кристаллика ойягюу:з-лагзтся в отдгльпнх эпителиальных клетках, прилеха-1чих к экватору хрусталика. Гамма-крхсгаллипы не детектировались ни в одной из областей эпителия хрусталика (ск. рис. 5). 15л яредлолоткли, что начало дифферекшуовки эпителиальных клеток в волокла крустглкка сопровождается активацией синтеза сначала альфе-» ззтзм бета- л, наконец, гаша-кркстаяликов.

В дзкзок кгеточяоч "жокнаргае-вте" обнаружены все иселедо-вагюа белк'-; цктоейелет?. (зимеят?®:, цягокератгги 8, фодркк и £ инсулин).

ПодзгУ-ггостньге слои "ко-сы" :<рустал:жа (акффэрешхируювиеся волскна). 3 отек "еившерлих-тс* *.гр»;сутству»т и екнтезнруэтея агьфа-А- и альфа-В-^гзталлинн, плть бэт?.-крнсталл;шсзнх по-липгптидоз (23, 25, 27, .23 и 30 гДа), гаука-, ро-крисгалллнм и 23 кДа-полипептид. Таким образов, поздние этапы дифферезщи-розюи хрусталнкозых волокон сопровождаются активацией синтеза гамма-крясталлшоз и бета-кристаллинсв с молекулярной кассой 23 и' 25 кДа.

Из цитосжелетных белхсз з данном клеточном "хомпарт.ченте" обнзрулкэавтея виментии, зкнкулин и фодрин. Цитокератия 8 к с выявляется в волокнах; следовательно его мохно рассматривать в качестве "негативного" маркера дифференцирояки эпителиальных клеток в волокна хрусталика.

1С

б

Риз. 5. Схема распределения разньк классов кдзсгаллинов в эпителии хрусталика (по дзияьк »щтотсгтохтт)

а - вдсталис; б - гшгелчй хрусталика. Области пояснительного ямку-Еофяусрэсцеатаого "сигшла" заштрихованы

Глубокие слои "корм" хрусталика (теркинально дифференцированные, лишенные ядер волокна). В этой области обнаружены все изученные кристаллипы и 23 кДа-полкпептид.

Кз белков шгтоскелета только фодргш продолхает экспресси-роватъся на том хе уровне, что и в эпителии и поверхностной "коре" хрусталика. Ешентин и винкулин содержатся в волокнах глубоких слоев "коры" в следовых количествах.

"Ядро" хрусталика (волокна, сформированные в эмбриональном и раннем постличиночиол развитии).

Выявлены все исследованные классы кристалликов, причем гамма-кристаллины составляют основну» массу (около 707,) от" белка "ядра" хрусталика.

Ишуноавторадиографячески в этом "компартненте" обнаружен синтез бета-, гамма- и ро-кристаллинов, однако, интенсивность включения метки в кямунопрсциштаты была иного нихе, чем при аналогичном исследовании экстрактов из "кори" хрусталика.

- Из цитоскелетных белков в "ядре" хрусталика обнаружен только фодрин.

Представленные результаты ©трахают "статичную" картину наличия и синтеза изученных белков в разных частях хрусталика взрослых Н. 1етрогаг1а. Однако, каждая: из исследованных областей хрусталика содержит клети!, находяииеся на определенных этапах диЭДеренцировки, созревания и старзния. Это позволяет предполохить следующую динамику изменений синтеза и накопления специфических белков,

В центральной области эпителия хрусталика не выявляются тканеспецифические белки (альфа-, бета- и гамма-кристаллины), но зкспрассируэтся белки цитоскелета и не обладающий строгой тканей ей специфичность» ро-кристаллтга. Зти данные косвенно свидетельствуют в пользу првдполохения (см.: Симирский и др,, 1951), что инзгоо е этой области эпителия локализованы стволовые (клопогонные) клетки, еде ке ямеюзие признаков ткакэс-пэшйнчэскей дх^еренцирошг*.

Начало яиффчреишфозки эпителиальных клеток ззрослого хрусталика сопропогдаетоп последовательной актигацией (и/или рэзкнм усилением) иир:з аль*«-, бета- и гамма-кристаллгжоз. В экбриояэяьяом.развитии 8. ¿еауо:-аг1а (см.: Иихайлов и др., 1984, 1385) последовательность появления кристалшноз з дкф-ферекцируэдихся волокнах хрусталика иная: верными обнаруживаются ганка- и бета-, а затем - альфа- и ро-кристаллинк. Вероятно, оди! я тот -14 Д1;фр&рэ1ш><ровоин1п: процесс (образование волокон хрусталика) сопровождается у зародышей и ззрослых животных разни/и программами акткзацик синтеза тканеспгнифичес-ких белков.

Все кристаллины экспресскрувтся * волокнах "кора" и "ядра" хрусталика, однако, в последнем обнаружен лига, следовой синтез некоторых г-ажеталдкнов.

Как и огндалосъ, экспрессия исследозашшх цитоскелетиых

белков скисается по мере длфферэшшровки к созревания волокон хрусталика. При этом исчезновение {или ослабление) положительных иммуноблот-реакций на цитокератин 8 совпадает с периодом образования волокон хрусталика, а реакции на вименткп и в;шкулин - с процессом созрезапкя этих клеток,

Таким образом, в результате проведенной работы выявлен комплекс биохимически и нкмуяохимически определяемых признаков, которые позволяют маркировать разные этапы дифференцировал, созревания и старения хрусгалкковых клеток,

ЕШЗШШ

1. Альфа-кристаллины присутствуют во всех частях хрустадк-ка. В эпителии хрусталика альфа-кристаляиЕЫ распределены неравномерно: они отсутствует- б центре эпителия и начинают обнаруживаться в клетках, локализованных на его периферии. Аль-' фа-кристаллин» синтезируются в эпителии и волокнах "коры" хрусталика. В "ядре" хрусталика синтез альфа-кркеталлквоз не заявлен.

2. Вета-крксталлкны присутствуют и синтезируются во вссх частях хрусталика. В эпителии хрусталика они не вина лень» в центральной области и обнаруживаются только б удлиненных эпителиальных клетках на экваторе хрусталика. В зпигелии хрусталика бвта-кркстадякш предстазяенк тргкя г.олшмятидамк с молекулярной кассой 27, 23 и 30 кДа. В водокпах ''кора* к "ядра" начинают экспрессирозатьск езе два хюякзептгшг с колекугйряой кассой 23 :: 25 кДа.

3. Гшаш-кристаллинм не обаарухепи в эпителии хрусталика (включая его периферическую область, прклехащу» к экватору хрусталика). до приоутствуат в зояокаах "кора*-и "ядра".- Волокна поверхностного слоя содэрг.ат 14%, глубокого ело;; "коры" - 37У. и "икра"' - 67л гга:га-к??кгга.кя:яс<з ¡от общего водорастворимого белка). Гзкка-кристеллиад с;а:тезкруэтея только в воложках "кори" к "кара*.

4. Ро-;л;-:ста/.лл; заевдел по ¡всех слоях хрусталик? примерно ка одкнбкоьо;« уровне. В эг;-;телии хрусталика он раепределс-г;

равномерно во всех клетках. Ро-кристаллин синтезируется з эпителии хрусталика и в дифференцированных волокнах поверхностного слоя "коры"; его синтез резко спилен б терминально дифференцированных волокнах глубокого слоя "коры" и "ядра" хрусталика.

5. На основании полученных данных мозно предположить еле-дусту» ¿последовательность активации синтеза ткалеспецифичес-ких белков ¡кристалликов) в процессе дифференцировки эпителиальных клеток хрусталика в волокна у взрослых лягушек. Клетки центральной области эпителия хрусталика не содержат и не синтезируют канонические (альфа-, бэта- и гамма-) кристаллины. Б процессе дифференцировки волокон в них активируется синтез сначала альфа-, затем бета- и, в последяю» очередь, гам-ка-кригталяшгов.

6. Впервые идентифицирован водорастворимый полипептид с молекулярной массой 23 icGa, которой, кроме хрусталика, обнаружен з сетчатке глаза R. toirpcraria. 23 кДа-полкяептиа присутствует з освозяом я зпителич (во всех клетках/ и "коре" хрусталика; в "ядро" его содержание резко chkssho. Он специфичен для хрусталптса аифкйин » из с&гаругеи ч хрусталиках ис-слвдозагллс яявоз тт?«, рмб к илеюолитзглях.

7. Бпмачтш? r.ps петая в хрусталике- язумл осяозньгми фор-ь'э>.-!.' 54 агфиЗии) к 07 з-'Дч (обкак для зссх псягдоигах). Лс«5ой;- -'v~í ?с"чг-''зстзо зянзнтиш об;пру:геио

3 з^.толг'л :''>vcr;..rr.::ai ';;ч< уг.сиьтабтся р bo.-:ok¿;.4X

4 хори", а п лрус'.алж- егч.скт.тя не выявляется,

8. £дер5нз покагско наличие ъ хрусталике аналога дито^рч-тина 8, спехвфячного для простых олителиез млегелтавд^х В небольших холичестгах он зяачлва в зпителт а в "trops* и "ядре" хрусталика цитокератан 3 отсутствует, Цнтокератгга 8 мохно использовать в качеств "негативного" маркера начала дк'фферзацирозки эпителиальных клеток г волокна хрусталика.

9. В клетках эпителия л "коры" хрусталика обнаружен Щедрин (аналог саектрота) с молекулярной массой 240 кВа. В "коре" выявляется дополнительная фракция с иолекуляркой массой 150 кДа, которая Ьо-видниоку, является продуктом протеолити-ческой деградации. В "ядре" хрусталика фодрик представлен

только 150 кДа-фракцией.

10. ВиерБце продемонстрировано наличие в хрусталике винку-лина. В наибольшем количестве он выявлен в эпителии, в "кора1"' его содержание уменьшается, а в "паре" хрусталика оюжулял не обнаруживается.

Список работ, опубликованных по тепе диссертации

1. Алейникова К.С., Сикирстяа! В.й., Вкргачен К., Егшкгкс-ц Г. А., Еихайлов А. Т. Исследование- экспрессах вшектпла и щгтс-кератикоз з тканях глаза амфибий с попоцьг- миунозлектро-олотанга и иококлекзльннх антител // Онтогенез. IS3S. Т. ГЗ. G. 434.

2. Áleinihova К. 2., Simirslíy Y. К., Virtaaen !,, Bannifcov G. А., Hitíiailov A.I. The immnobloi analysis of virientiii aad cjtokeratin expression in amphibian eje tissues v.'itn Konoslonal antibodies // Sov. -Finn. Sjmp. on Dave?.. Biol, "Cell differentiation and gene expression" (Tashkent. 1986). Ábáli-, С. 15.

3. Сшпрскик В. H., Алейникова К. С , Брохоз П. L , Нкхайаов А. Т. 35 кДа-йОйяектнды яягузш: Rana teapci-aria: преккуцест-вскаос содерлание б хрусталике и иотчатке глаза // Докл. АН СССР. 1989. Т. 309, О. 207-210,

4. Б. Н., Алейп:с:о5а Е С., Виртанен it, Банников Г. А.ЗЬггаЗлог А. Т. Х&рскгеркг-пзз. белков Еродегу точных фкла-кетп-сз тканей П:~ы<г. еп'4к5!п: с попоив кскоклональнж' ал^итс-л И Докл. АН CÜCP. Т. S3Ü, С. ШМ482,

5. Siwipskj V. П., Aieir.jy.ova I'. 5., Vir-tanen I., Kihhailo? й. Т. Tr.y eic'jtroJtlot of Jess ¿iíferentistioa ir» ad-jll fres;, P.--V ici:?erari¿, a.'.i¿i-vir...-itíin anJ anti-cy-tcAs-iv.tiri 5 ar.tiVocUe." ccr,c?.r.'-\Tolin А-ркг-oíi^ase // F.-j'O':, '.7v..-, -vi i1;:.- '0:olc?s c- ib: ÜyÍG,-U ; l.noí.. HeJsirM, Г, A •::•:". ,LV;b-, 33,

ü. Si^ir-I-.;- "-II , Ai cii'-iiuiva К, S., Viv.-viilov Л. Т. '.the pattern of h:n.s 33 í'Iq vclvpb'f'üce expr^ídoc :,.ч r-üi:;^ o.': Rii.i cc^dü ¿i^i adV'.t .'rejo f¡ 0!;il civí Develop. Hi. 27. 5i:,J;Í, P, S20P.

7. Алейникова К. С., Симирский В. Н., Нихайлов А. Т. Дифференциальная экспрессия крисгаллинов и конканавалин А-связыва-кяих белков в различных клеточных "кокпартментах" хрусталика глаза амфибий // Докл. АН ССОР. 1990. Т. 312. С. 1497-1500.

8. Симирский В. Н., Алешжкога К. С., Нихайлоз А. Т. 35 кДа-полкпептид хрусталика глаза травяной лягушки: биохимические свойства, тканевая специфичность, возникновение в процессе развития /•/ Онтогенез. IS90. Т. 21. С. 487-495.

9. .llikhailov ' А. Т., Simirshy Y. II, Aleinikova К. S., Eli-zarov S.Ii., Yirtanen I. Crystallins, crtoskeletal proteins and casein kinase of aaphibian eye lens: expression in -epithelium and- different fiber cell "compartments" // Proc. Intern. Soc, for Ejo Res, ISSO. Yoi, 6. P. 269.

10. Simirsky V. U., Aleinikova K. S., Mikhailov A. T. Taxcn-specific 35 kDa-polypeptide (P35) in amphibian lens shows high level of ■ expression ia the neural retina // Pros. Intern. Soc. for Eye Res. 1990. Vol. 6. P. 273.

11. Сибирский B.H., Алейникова К. CL , йяхайлов A. T, Бионический анализ дяффереицировки , стволовых клеток эпителия хрусталика глаза амфибий // Онтогенез. 1991. Т. 22. С. 204-212.

12. Симирский В. Н., Фгяцова Н. Г., Алейникова К. С., Еихай-лоз А, Т. Синтез и локализация зфкеталлинов в различных клеточных "гоипартмеЕтазг" хрусталика глаза взрослых лягушек: т-муноавторадиогуафетеское и иыиунофлуоресцентнсе исследований // Онтогенез. 1991. Т. 22. G. 381-333.

. 13. Sinursky V. 1L , Alaiabora S. S., Fedtsova H. G., Yirta-nen I., Lehto V.-P., HikhailoY A. T. Insmnochenicai analysis of fiber cell differentiation, maturation and aging in the amphibian eye lens // Europ. Develop. Biology- Congr. Jerusalem, Israel. Abstr. 1991. P. 176.

14. Simirsky Y. H., .Aleinikova K. S., Fedtsoya N. G., Yirta-nen I., Lehto Y.-P. , HiJthailov A. T, Fiber cell differetiation from epithelial precursor cells in the amphibian eje lens: immunochemical and biochenical study // Sor. -Finn. Syup. on Devel. Biol. "Signal molecules and cell differentiation". (Suzdal, 1991). Онтогенез. IS3I. Т. 22. G. 405-406.