Молекулярные механизмы поддержания и нарушения прозрачности хрусталика глаза

Муранов, Константин Олегович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы поддержания и нарушения прозрачности хрусталика глаза
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы поддержания и нарушения прозрачности хрусталика глаза"

На правах рукописи

МУРАНОВ Константин Олегович

005007422

Молекулярные механизмы поддерживания и нарушения прозрачности хрусталика глаза

03.01.02-биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2011

1 2 ЯНВ 2012

005007422

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор, академик РАН М.А. Островский

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук

Каламкаров Григорий Рафаэльевич

Доктор физико-математических наук Галзитская Оксана Валериановна Доктор биологических наук,

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, факультет фундаментальной медицины, кафедра медицинской биофизики.

Защита состоится 15 февраля 2012 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 002.039.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: г. Москва ул. Косыгина, д.4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химической физики им. H.H. Семёнова РАН

профессор

Рощупкин Дмитрий Иванович

Автореферат разослан

Ученый секретарь

Диссертационного совета 002.039.01 канд. хим. Наук

Мазалецкая Л.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Хрусталик млекопитающих и, в частности, человека представляет собой уникальное образование. Клетки его центральной (ядерной) области, которые образуются из зачатка эктодермы на стадии закладки глаза в онтогенезе, служат в течение всей жизни организма. Белки цитоплазмы клеток, составляющих ядро хрусталика, так же не обмениваются в течение жизни. Это ставит хрусталик на особое положение среди других органов и тканей - поврежденные клетки, которые, даже в таком консервативном органе как мозг, могут заменяться, не говоря об обмене белков - важнейшем процессе, обеспечивающем жизнедеятельность организма.

По современным представлениям, эти особенности морфологии и физиологии призваны обеспечивать прозрачность оптической среды хрусталика как фокусирующей линзы. Однако молекулярные механизмы поддержания в течение жизни прозрачности хрусталика известны лишь в общих чертах и являются предметом исследования биологической науки. При этом исследование молекулярных механизмов поддержания прозрачности хрусталика тесно смыкается с важным медицинским аспектом проблемы — исследованием нарушения работы этих механизмов, то есть возникновением помутнения хрусталика (катаракты). Катаракта или помутнение хрусталика одна из основных причин ослабления зрения в мире. Несмотря на огромные успехи в хирургическом лечении катаракты, эта операция иногда сопровождается серьезными осложнениями. Побочные эффекты и последствия оперативного вмешательства стимулируют поиск лекарственных средств для профилактики и лечения катаракты.

Физическая основа возникновения помутнения хрусталика до сих пор остается неизвестной. В качестве рабочей гипотезы принято, что причиной помутнения могут быть как морфологические изменения хрусталика (на клеточном и субклеточном уровнях), так и изменения на молекулярном уровне (Ло-гай и Леус, 2002). Литературные данные по этому вопросу достаточно противоречивы. Например, нарушение упаковки волоконных клеток кортикальной зоны хрусталика принято считать причиной возникновения кортикальных помутнений (\Vorgul, е1 а1., 1989). С другой стороны сравнительные исследования ультраструктуры волоконных клеток прозрачных и мутных участков катаракталь-ного хрусталика не нашли между ними принципиальных отличий (Соз1е11о е1 а1, 1992),

Высокий уровень освещенности, проникновение кислорода, повышение с возрастом в крови уровня глюкозь: и т.д. приводят к посттрансляционным изменениям белков хрусталика, нарушению их нативной конформации и агрегации. Появление поврежденных белков и их агрегатов в хрусталике приводит к усилению флуктуаций концентрации белков. В результате этого на границе раздела объемов с высокой и низкой концентрацией белка возникает градиент коэффициента преломления, именно это граница и служит точкой возникновения светорассеяния, то есть помутнения (Вепес1ек, 1971).

Начиная с 90 годов прошлого века, успешно развивается идея о том, что один из основных растворимых белков хрусталика а-кристаллин, препятствуя агрегации поврежденных белков, поддерживает прозрачность хрусталика (Нотокг, 1992). Однако молекулярные механизмы, обеспечивающие шаперо-ноподобные свойства а-кристаллин, остаются большей частью неизвестны и служат целью интенсивных исследований.

Таким образом, изучение механизмов поддержания прозрачности хрусталика с одной стороны представляется проблемой общебиологической. Действительно, возможно в хрусталике реализуется необычный механизм поддерживания структуры и функции, основанный не на удалении поврежденных молекул или клеток, а на максимально возможной репарации и стабилизации белковых молекул в клетке. С другой стороны, понимание причин и механизмов нарушения работы системы поддержания прозрачности хрусталика, может указать новые пути для преодоления такого недуга старости, как катаракта.

Цель и задачи исследования

Целью исследования было изучить основные механизмы поддержания и нарушения прозрачности хрусталика. В качестве основного метода исследования нами был выбран сравнительный анализ процессов в прозрачном и помутневшем хрусталике. При этом был использован комплексный подход, включающий различные методы исследования от прижизненных биомикроскопических исследований состояния хрусталика ш-угуо, до изучения процессов на молекулярном уровне в условиях ¡п-уИго.

Для достижения цели исследования были решены следующие задачи: 1) Изучены изменения хрусталика на различных уровнях его организации (от клеточного и субклеточного до молекулярного) в процессе формирования экспериментальных катаракт: радиационной, ультрафиолетовой и старческой.

2) Исследован молекулярный механизм агрегации белков хрусталика.

3) Изучен молекулярный механизм торможения агрегации белков в присутствии а-кристаллина.

4) Исследованы молекулярные механизмы торможения агрегации белков в присутствии низкомолекулярных соединений.

5) Изучена возможность торможения развития ультрафиолетовой катаракты под действием низкомолекулярных соединений.

Научная новизна

Впервые показано, что воздействие важнейших видов катарактогенных факторов (возраст, ультрафиолет, радиоактивное излучение) вызывает возникновение одинаковых по локализации и структуре помутнения хрусталика. При исследовании морфологических изменений в хрусталике впервые показано, что возраст, ультрафиолет и радиация вызывают изменения, специфические лишь для возрастных изменений ткани: гибель и перерождение эпителиальных клеток, набухание и вакуолизация волоконных клеток. Впервые в рамках одного эксперимента проведены сравнительные исследования изменений белкового состава хрусталика при формировании возрастной, радиационной, ультрафиолетовой и комбинированной (радиация+ультрафиолет+возраст) катаракты. При этом показано, что указанные факторы не вызывают существенных и специфических изменений в составе основных белков хрусталика.

Таким образом, впервые показано, что формирование помутнений хрусталика различного генеза не сопровождается специфическими изменениями ни на морфологическом, ни на молекулярном уровне организации хрусталика. Полученные результаты указывают на то, что в основе помутнения хрусталика лежат структурные изменения на уровне упаковки белковых молекул цитоплазмы волоконных клеток хрусталика, возникающие вследствие накопления агрегированных форм кристаллитов.

В работе впервые было показано, что кинетика тепловой, химической и ультрафиолетовой агрегация может быть описана в рамках кластер-кластерного взаимодействия, что позволяет количественно оценивать процесс агрегации.

Впервые показано, что ультрафиолет вызывает денатурацию белков хрусталика, в частности, рь-кристаллина по одноударному механизму. Молекула белка при действии ультрафиолета сначала накапливает внутренние повреждения, сохраняя неизменной форму, но по достижении определенного уровня по-

вреждения происходит быстрая конформационная перестройка молекулы, приводящая к ее денатурации.

Впервые показано, что в условиях близких к физиологическим при взаимодействии шапероноподобного белка хрусталика а-кристаллина и поврежденного ультрафиолетом Р-кристаллина образуются стабильные водорастворимые комплексы, как большого так и малого размера. Исследование комплексов показало, что большая часть поврежденных молекул Р-кристаллина входит в состав низкомолекулярных (~ 75 кДа) комплексов, тогда как в состав высокомолекулярных комплексов (> 800 кДа) встраивается не более 5% поврежденного белка. Предложена новая схема, описывающая шапероноподобную активность а-кристаллина.

Впервые показано, что в условиях близких физиологическим (температура, ионная сила, рН) агрегация белка может быть блокирована добавкой низкомолекулярных гистидин содержащих дипептидов (М-ацетил карнозина и анзерина). При этом пептиды, исполняют роль микрошаперонов (термин предложен нами). То есть указанные соединения встраиваясь в денатурирующую под действием ультрафиолета молекулу Р-кристаллина, замедляют денатурацию и агрегацию белка.

Впервые показано, что в основе усиления шапероноподобных свойств а-кристаллина в присутствии татрамида пантетина (бисИ-пантетониламидоэтил) лежит разрыхление структуры а-кристаллина и увеличение количества мест связывания для денатурированных молекул белка. Таким образом, с помощью введения в систему низкомолекулярных соединений оказывается возможным тормозить процесс агрегации белков хрусталика воздействуя как на агрегирующие молекулы, так и усиливая шапероноподобные свойства а-кристаллина.

Впервые показано, что смесь гистидин содержащего пептида Ы-ацстил карнозина и пантетина способна эффективно тормозить развитие ультрафиолетовой катаракты. На применение смеси Ы-ацетил карнозина и пантетина в качестве нового лекарственного препарата, препятствующего развитию катаракты, получен патент (ГШ 2352352 С1).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Агрегация белков хрусталика - основной механизм нарушения прозрачности хрусталика.

а. Развитие помутнения хрусталика на модели радиационной, ультрафиолетовой и старческой катарактой не сопровождается специфическими изменениями на уровне клеток, органелл и белкового состава хрусталика, что указывает на ведущую роль структурированности белковой компоненты цитоплазмы клеток хрусталика.

2. Важнейшим механизмом поддерживающих прозрачность хрусталика является процесс противодействия агрегации белков, обусловленные специфическими свойствами основных белков хрусталика.

a. В основе ультрафиолетовой агрегации белков лежит одноударный механизм.

b. а-кристаллин, в условиях близких физиологическим тормозит УФ индуцированную агрегацию поврежденных белков.

c. Молекулярный механизм торможения а-кристаллином агрегации белков поврежденных ультрафиолетом реализуется через образование комплексов с поврежденным белком.

й. Высокомолекулярный комплекс а-кристаллина с поврежденным белком нестабилен и распадается на низкомолекулярный комплекс, содержащий основную массу поврежденного белка и высокомолекулярный комплекс, содержащий небольшое количество поврежденного белка.

3. Низкомолекулярные соединения способны тормозить процесс агрегации белков хрусталика

a. Молекулярный механизм торможения агрегации гистидин-содержащими пептидами основан на взаимодействии с поврежденным белком и предупреждении его денатурации.

b. Усиление шапероноподобных свойств а-кристаллина в присутствии панте-тина происходит за счет разрыхления структуры молекулы и увеличения количества мест связывания поврежденных белков.

4. Экзогенные низкомолекулярные соединения способны тормозить развитие катаракты и могут послужить основой создания нового класса антикатарактальных препаратов шапероноподобного действия.

Практическая значимость

Результаты работы указывают на то, что в основе развития помутнения хрусталика (катаракты) разной этиологии может лежать единый механизм - агрегация белков цитоплазмы волоконных клеток хрусталика. Это означает, что

для профилактики и лечения этого заболевания, отличающегося разнообразной этиологией, может быть разработан единый способ, основанный на предотвращении процесса агрегации белка.

Результаты исследования in-vitro и in-vivo показывают, что возможно создание нового класса фармакологических препаратов, способных предупреждать развитие катаракты. В основе действия этих препаратов лежит противодействие денатурации и агрегации белков по механизму, аналогичному шапероноподоб-ному действию а-кристаллина. Авторами исследования разработан новый комплексный препарат, который способен эффективно тормозить развитие катаракты (Соустов, Челноков, Битюрин, Немов, Аветисов, Полунин, Шеремет, Карпова, Муранов and Островский, 2009).

Апробация работы состоялась на заседания семинара по биофизике ИБХФ РАН им. Н.М. Эмануэля 20 июня 2011 г. Результаты работы доложены и обсуждены на Российских и международных конференциях и симпозиумах: Круглый стол. Актуальные вопросы радиационной безопасности длительных космических полётов (к 50-летию первого полёта человека в космос) (Дубна, 26-28 апреля 2011); 5th International Conference «Physics of liquid matter: modern problems» (Kiev, Ukranian, May 21-24, 2010); Международный симпозиум. «Радиационное старение. Механизмы естественного и индуцированного старения» (Москва 22-24 мая 2009); VI Национальная конференция по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии» (Москва, 12-14 ноября 2009); Научно-практическая конференция «Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры» (Москва, 28-29 сентября 2007); Научная конференция «Фундаментальные науки - медицине» (Москва 12-13 марта 2007); Научная конференция "Фундаментальные науки - медицине" (Москва 14-16 ноября 2006); Научная конференция "Фундаментальные науки -медицине" (Москва 14-15 декабря 2005), Международный симпозиум "Молекулярные механизмы регуляции функции клетки" (Тюмень 12-16 сентября 2005); «Научная конференция "Фундаментальные науки - медицине» 2-3 декабря 2004.

Личный вклад автора

В цикле исследований, составляющих диссертационную работу, автору

принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке

экспериментальных подходов, в анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад автора заключается в непосредственном участии во всех этапах исследования - от постановки задачи и проведения экспериментов, до анализа, обсуждения и оформления полученных результатов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 45 печатных работ, из которых 28 статей в российских и международных журналах, 16 тезисов докладов и материалов конференций и 1 патент Российской федерации.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, трех экспериментальных глав, каждая из которой содержит обзор литературы, представления и обсуждение результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, а также общего заключения. Диссертация изложена на 289 странице и содержит 103 рисунка и 21 таблиц. Библиография включает 287 источник.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении с общебиологических позиций рассмотрен феномен зрения, в частности различные типы «устройств» используемых Природой для фокусировки изображения. Проанализированы морфологические и физико-химические особенности хрусталиков различных таксонометрических групп, которые обеспечивают функцию хрусталика как фокусирующей линзы, так функцию защиты сетчатки глаза от повреждения синим светом.

Дано обоснование актуальности выбранной темы исследований, которое основано не только на последних данных ВОЗ о распространенности заболевания катарактой, но и на общебиологической значимости специфических особенностей функционирования систем поддержания прозрачности хрусталика. Сформулированы цели и задачи исследования.

В первой главе проанализированы существующие представления о физических основах возникновения феномена помутнения хрусталика. Изложены методические особенности постановки эксперимента по комплексному изучению формирования катаракты при действии важнейших катарактогенных факторов - возраста, ультрафиолета и радиоактивного излучения. Представлены результаты, которые показывают, что среди возможных причин развития по-

мутнения хрусталика главную роль играет нарушение белок-белковых взаимодействий основных растворимых белков хрусталика: а-, Р-, и у- кристаллитов.

Во второй главе рассмотрен один из основных механизмов поддержания прозрачности хрусталика - шапероноподобная функция а-кристаллина. Описаны модельные системы используемые для изучения шапероноподобной активности белков. Представлены, разработанные в исследовании, методы анализа кинетики процесса агрегации белков, которые позволяют не только количественно измерять шапероноподобную активность белков-шаперонов, но и исследовать молекулярный механизм агрегации белков. Представлены результаты по разработке новой методики проведения ультрафиолетовой агрегации белков в условиях близких к физиологическим. С помощью разработанной методики показано, что осуществление шапероноподобной функции а-кристаллина в физиологических условиях происходит за счет образования как высоко, так и низкомолекулярных комплексов белок-шаперон — поврежденный белок.

В третьей главе исследованы механизмы торможения агрегации белков в присутствии короткоцепочечных пептидов производных гистидина и пантоте-новой кислоты. Показано, что эти соединения способны эффективно тормозить процесс агрегации кристаллинов, действуя по различным механизмам. Производные гистидина - Ы-ацетил карнозин и анзерин - блокируют процесс денатурации белка, а пантетин - производное пантотеновой кислоты - активирует шапероноподобную активность а-кристаллина.

На модели пролонгированной индуцированной ультрафиолетом катаракты у крыс показано, что смесь К-ацетил карнозина и пантетина эффективно тормозит развитие помутнения хрусталика.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование процесса катараю-огенеза ш-у1уо

1. Индукция катаракты

a. УФ индуцированная катаракта. Мыши (самцы Р1, С57В1аск /СВА) или крысы ^Ыаг) облучались ежедневно в течение 15 мин ультрафиолетом А. Мощность ультрафиолета составляла 51+7 Вт/м2.

b. Радиационная катаракта. Облучение у- лучами проводили однократно в дозе 2 Гр на установке «РОКУС-М» (Россия). В качестве источника излучения использовали 60Со. Облучению подвергли все тело животного, величина изодозы равнялась 90%.

2. Степень помутнения хрусталика оценивали как с помощью метода экспертных оценок, так и с помощью графического анализа фотографий оптических срезов хрусталика.

3. Морфологические исследования хрусталика проводили на полутонких срезах и на препаратах распластанного эпителия, окрашенных стандартными методами. При этом оценивали общую гистологическую картину и проводили подсчеты количества основных морфологических дефектов.

4. Исследование белкового состава хрусталиков проводили методом разностного электрофореза. В качестве образцов были использованы хрусталики животных, катаракта которых соответствовала медиане группы, а степень помутнения правого и левого хрусталиков оценивалась одинаково.

5. Торможение образования ультрафиолетовой катаракты под действием комбинированного препарата Ы-ацетил карнозина и пантетина исследовали в течение 9 месяцев, препараты использовали ежедневно как в виде инсталляций, так и в виде внутрибрюшинных инъекций.

Эксперименты проводили согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных комитетом по этике

ИБХФ РАН им. Н.М. Эмануэля.

Исследование процесса агрегации белков и его торможения в условиях ш-

укго

1. Методы выделения белков. В работе использовались белки хрусталика глаза молодых особей крупного рогатого скота, выделенные с помощью гель-фильтрации и ультрафильтрации, чистота препаратов оценивалась с помощью №-Дс электрофореза.

2. УФ повреждение белков проводили с помощью специальной установки, позволяющей контролировать дозу ультрафиолета и температуру процесса. Средняя мощность светового пучка в диапазоне 260 - 305 нм составляла 5.8+0.1 мВт/см2.

3. Кинетику процесса агрегации белка исследовали методами статического и динамического светорассеяния.

4. Анализ продуктов, образующихся в процессе УФ облучения, а также в результате процесса агрегации белков проводили методами эксклюзионной хроматографии, электрофореза, спектральными методами, методом динамического светорассеяния, рентгеновского малоуглового рассеяния и аналитического центрифугирования.

5. Исследование размеров молекул а-кристаллина проводили методом динамического светорассеяния, эксклюзионной хроматографии и рентгеновского малоуглового рассеяния.

6. Исследование способности а-кристаллина к связыванию гидрофобных субстратов - вычисление константы связывания и количества мест связывания -проводили с помощью флуоресцентного зонда бис-АНС (1,1'-би(4-анилин)-нафталин-5,5'-дисульфоновая кислота).

Статистический анализ результатов

Статистический анализ результатов проводили методами описательной статистики и непараметрическими методами: ранговый однофакторный анализ Краскела-Уоллиса, критерий Коновера, ранговая корреляция Спирмана, U-критерий Манна-Уитни. Аппроксимацию экспериментальных данных с помощью различных функций проводили методом наименьших квадратов (Статистический пакет «Attestat», И.П. Гайдышев, © 2002-2010).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Комплексное сравнительное исследование влияния различных повреждающих факторов на хрусталик.

Существующие литературные данные не давали прямой ответ на вопрос -существуют ли специфический особенности развития катаракты, индуцированной действие различных повреждающих факторов? Поэтому необходимо было сравнить развитие помутнений хрусталика различного генеза на разных уровнях организации хрусталика (тканевом, клеточном, молекулярном). Эксперимент был поставлен на рандомизированных группах животных (мыши), помутнение хрусталика индуцировалась раздельным или совместным действием важнейших катарактогенных факторов: возраста, облучением ультрафиолетом и у-лучами.

1.1. Исследования формирования катаракты под действием возраста, ультрафиолета и у-лучей.

80 двухмесячных мышей-самцов Fl (С57В1хСВА) со здоровыми глазами, были разделены на 4 рандомизированные группы. Животных трех групп подвергали следующим воздействиям: ежедневное облучение ультрафиолетом (УФ); однократное облучение у-лучами в дозе 2 Гр (у-лучи) всего тела животного; однократное облучение у-лучами в дозе 2 Гр + ежедневное облучение

ультрафиолетом (у-лучи +УФ), четвертая группа служила контролем старческих изменений хрусталика (К).

На седьмой месяц после начала эксперимента в хрусталиках облученных животных (УФ; у-лучи; у-лучи +УФ) были обнаружены различные виды помутнений: диффузные и локальные (точечные, игольчатые и др.) (рис. I.1A, Б). На 10 месяц степень помутнений существенно возросла, при этом катаракты были обнаружены и в группе контрольных животных. Степень помутнения хрусталиков для исследованных групп, оцененная в баллах, представлена на рисунке 1.2, а результаты статистического анализа показаны в таблицах 1.1 и 1.2.

Хорошо видно, что возникновение типа помутнения (диффузное или локальное) не зависит от действующего фактора, но степень помутнения оказалась с ним связана.

Рис. 1.1. Биомикроскопическая картина хрусталиков мышей с диффузными (А) и локальными (Б) помутнениями. 1 - диффузные помутнения в ядре хрусталика; 2 - локальные точечные по-

мутнения.

Б то

i Диффузные помутмбиил s Локальные ломутнвння

Т г

I...........M

Контроль УФ y-лучи у-лучи+УФ

Контроль УФ у-лучи у-лучи+УФ

Рис. 1.1.2. Степень выраженности помутнений хрусталика (медиана, 98% квантиль) у мышей с возрастом, под действием УФ и радиации, а также комбинации этих факторов на 7 (А) и 10 (В) месяцы после начала эксперимента.

Таким образом, можно заключить, что процесс старение как эндогенный фактор и ультрафиолетовое (УФ) или/и радиационное облучение как экзогенные физические факторы вызывают формирование одинаковых видов помутнений хрусталика. При этом специфичность воздействия этих факторов выражается лишь в степени noli

вреждения хрусталика. По степени повреждающей способности исследованные нами факторы могут быть расположены в следующий возрастающий ряд: возраст -» УФ —> радиация —> радиация + УФ.

Таблица 1.1.1. Анализ достоверности различий (значение Р) помутнений хрусталика с помощью рангового однофакторного анализа Краскела-Уоллиса.

7 месяц 10 месяц

Диффузные помутнения Локальные помутнения Диффузные помутнения Локальные помутнения

< 0.0004 <0.01 <0.0001 < 0.003

Таблица 1.1.2. Анализ достоверности различий диффузных и локальных помутнений хрусталика в группах контроля, УФ, радиации и комбинированного воздействия УФ и радиации с помощью post hoc теста Коновера.

Дата обследования 7 месяц 10 месяц

Тест Коновера, значение Тест Коновера, значение

Группы для сравнения Р Р

Диффузные Локальные Диффузные Локальные

помутнения помутнения помутнения помутнения

Контроль УФ <0.0001 0.300 <0.0001 0.02

Контроль у-лучи+УФ <0.0001 0.003 <0.0001 0.001

Контроль у-лучи 0.008 0.018 <0.0001 0.0002

УФ у-лучи+УФ 0.1 0.008 <0.0001 0.07

УФ у-лучи+УФ 0.02 0.048 0.2 0.01

у-лучи+УФ у-лучи 0.0007 0.2 0.003 0.2

1.2. Морфологические исследования изменений хрусталика под действием возраста, ультрафиолета и у-лучей.

При исследовании микроскопических препаратов во всех экспериментальных группах, по сравнению с молодыми 3-х месячными животными, обнаружены неспецифические изменения, связанные со старением животных: появление в цитоплазме волоконных клеток микровакуолей, уплощение клеток эпителия, вакуолизация и дефрагментация их ядер, набухание и слияние клеток кортикальных слоев, как в передней, так и задней субкапсулярной областях.

На рисунке 1.2.1А показан участок эпителия периферической области нормального хрусталика. Хорошо видны ячеистая структура расположения клеток, а также меридиональные ряды клеток. Ядра имеют примерно одинаковый размер и форму. Эпителий хрусталика без явных дефектов и чужеродных включений. Препарат на рисунке 1.2.1Б демонстрирует полиморфизм ядер эпителия. Образование пустот в слое клеток свидетельствует о гибели и элиминировании клеток. На рисунках 1.2.1В и 1,2.1Г показаны многослойные структуры из фибробласто-подобных клеток на срезе и распластанном препарате. Вакуолизация ядер, которая представлена на рисунке 1.2.1Д, - начальный этап некротической гибели клеток. Десквамация клеток (Рис. 1.2.1Е), то есть вытеснение клеток из эпителиального пласта, указывает на усиленную пролиферацию клеток.

Таким образом, исследованные качественные показатели патологических изменения эпителия хрусталика указывают на: (1) процессы повреждения клеточного ядра - это нарушение нормальных процессов клеточного деления, деградацию ядер и клеток; (2) усиление процессов пролиферации - появление делящихся клеток; (3) запуск процессов перерождения ткани - образование фибробласто-подобных клеток.

Анализ данные по количественной оценке характеристик эпителия (количество митозов на мм2, количество ядер с вакуолями на мм2, количество клеток с вакуолизированной цитоплазмой на мм2) в хрусталике с помощью теста Крас-кела-Уоллиса свидетельствуют о наличии достоверных различий между групп-пами только в количестве ядер с вакуолями. Исследование с помощью теста Коновера показало, что облучение у-лучами вызывает достоверное снижение количества клеток с вакуолизированными ядрами, а действие УФ облучения напротив увеличивает их количество.

При исследовании влияния исследуемых факторов на плотность клеток в центре и на периферии эпителиального слоя обнаружено снижение плотности клеточного слоя только при воздействии у-лучей.

Исследование влияния исследуемых факторов на размер ядер в центре и на периферии эпителиального слоя показало, что, эффект как старения, так и УФ облучения выражается в уменьшении площади ядер (тест Коновера Р < 0.0001). Действие у-лучей зависит от пролиферативной активности клеток: клетки центральной области увеличиваются в размерах, а клетки на периферии уменьшаются (тест Коновера Р < 0.0001).

Рис. 1.2.1. Препараты эпителия хрусталика (окраска гематоксилен -эозин). А - Препарат нормального эпителия молодого животного. Б -полиморфизм ядер эпителия и образование пустот в слое клеток. Ядра различаются по размеру и степени окраски в несколько раз. В и Г - фибробласто-подобные клетки. Вид на срезе и распластанном препарате, соответственно. Д - вакуолизация ядер. Е - десквамация клеток. Стрелка указывает на вытесненную из монослоя индивидуальную клетку.

Обнаружено, что в группе контроля с 7 по 10 месяц количество ядер с вакуолями не меняется. По сравнению с этой группой в группе животных, получавших УФ облучение, зафиксировано увеличение, а в группе животных облученных у-лучами уменьшение количества таких ядер. В группе животных, получавших комбинированное воздействие, значение параметра заняло среднее положение между группой УФ и радиации. Вероятно, найденные различия указывают на разные пути клеточной гибели, по которым идут клетки эпителия при старении и действии УФ или/и радиации.

Исследование размеров ядер показало, что с возрастом и при действии УФ происходит уменьшение их размеров, тогда как при действии у-лучи размеры ядер увеличивается. При этом происходит не только увеличение средних размеров ядер, но увеличивается их дисперсия. Этот эффект обнаружен в центральной области хрусталика. Полученные данные по увеличению, как размеров ядер, так и дисперсии значений этого параметра при действии радиоактивного излучения подтверждаются литературными данными (У/о^и! е1 а1., 1982). Природа данного явления объясняется повреждением генетического аппарата клетки при действии радиации. Однако, этот эффект не имеет принципиального

значения для развития помутнения, главное происходит нарушение правильной миграции клеток и появлению не полностью дифференцированных клеток в кортикальных слоях хрусталика (Pendergrass et al., 2005).

Таким образом, в результате нашего исследования было показано, что действие: возраста, ультрафиолета и радиации на мышей (F1 С57В1хСВА) не вызывает специфических микроскопических изменений хрусталика мышей.

1.3. Исследование изменений белкового состава хрусталиков под действием возраста, ультрафиолета и у-лучей.

Влияние УФ- и гамма-облучения на белковый состав хрусталика мыши было проанализировано с использованием двумерного дифференциального гель-электрофореза.

Рис. 1.3.1. Разностный электрофорез фракций растворимых (А) и нерастворимых (В) белков хрусталика мышей, получавших комбинированное воздействие гамма-облучения и УФ относитель-но образцов здоровых необлученных животных. По горизонтали - значения pl, по вертикали -молекулярная масса (кДа).

На рисунке 1.3.1 представлены изображения геля, после разделения образцов водорастворимой и водонерастворимой фракций белков хрусталика из групп контроля и УФ облучения - пятна как водорастворимой, так и водонерастворимой фракции белков оказались окрашены в желтый цвет. Аналогичные результаты были получены при разделении смесей «К - у-лучи»; «К - УФ»; «К - у-лучи+УФ»; «у-лучи - УФ»; «у-лучи - у-лучи+УФ» Это согласно принципу метода разностного электрофореза означает, что данные пары образцов не отличаются по составу белков.

Таким образом, длительное воздействие небольших доз УФ, однократное облучение гамма-лучами в дозе 2 Гр и комбинированное воздействие УФ и радиации не вызывают значимых изменений белкового состава как растворимой, так и нерастворимой фракции хрусталика мыши по сравнению возрастными изменениями. Известно, что при старении организма или/и образовании катаракты в хрусталике обнаруживаются модифицированные белковые молекулы

(Harrington et a., 2004; Harrington et a., 2007; Ueda et a., 2002). Однако количество таких изменённых молекул невелико по сравнению с количеством основных растворимых белков хрусталика. В данном же исследовании мы изучали мажорные белки, поскольку полагаем, что вклад мажорных белков в структуру упаковки белка более существенен, чем белков минорных. Действительно, основные различия между прозрачным и помутневшим хрусталиками находят среди именно мажорных белков, а также продуктов их взаимодействия (Asomugha et а., 2010).

Таким образом, результаты проведенного нами сравнительного исследования свидетельствуют о том, что в процессе старения, ультрафиолетового или/и радиационного облучения в хрусталике на всех уровнях организации возникают аналогичные изменения. Специфичность реакции хрусталика выражается только в степени воздействия. Указанные факторы по эффективности воздействия можно расположить в возрастающий ряд:

старение -> УФ -» радиация -» радиация +УФ

Заключение 1 части

Действие достаточно различных по своей природе катарактогенных факторов, таких как возраст, ультрафиолет или воздействие радиацией вызывают образование помутнений в хрусталике, но не вызывают образования специфических изменений на всех уровнях организации от строения органа до уровня молекул.

Полученные результаты находят подтверждение в литературе. Показано, что действие радиоактивного излучения можно рассматривать как фактор старения хрусталика (Pendergrass et а., 2010). Кроме того, в эксперименте на мела-ноцитах и фибробластах было подсчитано, что облучение ультрафиолетом В в дозе 10 кДж/м2 эквивалентно дозе ультрафиолета А в дозе 150 кДж/м2, что в свою очередь равно по эффективности 0.6 Гр g-лучей (Emri et а., 2000).

II. Исследование молекулярных механизмов агрегации белков.

Представленные в предыдущей главе данные указывают, что основным механизмом помутнения хрусталика служит денатурация и агрегация белка. Поэтому важнейшим элементом системы поддержания прозрачности хрусталика является система предупреждающая агрегацию белков в хрусталике.

II. 1. Тепловая агрегация.

Нагревание раствора белка вызывает быструю денатурацию молекул. Разворачивание белковой молекулы приводит к экспонированию наружу гидрофобных остатков и вследствие гидрофобных взаимодействий молекулы необратимо слипаются друг с другом. В течение нескольких минут раствор рь-кристаллина после достижения 60° С остается прозрачным, затем раствор быстро мутнеет (Рис. II. 1.1).

Радиус, образующихся в растворе агрегатов белка, может быть измерен в реальном масштабе времени методом динамического рассеяния света (ДРС). Согласно данным ДРС распределение агрегатов денатурированного при 60° С Р^-кристаллина по значению гидродинамическому радиусу (Я0 остается унимодальным вплоть до точки начала преципитации агрегатов (Рис. 11.1.2), т.е. в каждый момент времени в растворе преобладают частицы одного радиуса.

Рис. II. 1.1. Кинетика тепловой агрегации Р[,-кристаллина при 60°С, зарегистрированной по увеличению светорассеяния раствора при 405 нм. Концентрация белка: 0,2 (1), 0,4 (2), 1,0 (3) и 2,0 мг/мл (4).

Рис. И.1.2. Тепловая агрегация pL-кристаллина (0.4 мг/мл) при 60 °С. Распределения частиц по размерам при разном времени инкубации 1-15; 2-20; 3-30; 4-50 min.

Построение зависимости интенсивности светорассеяния от (Рис. 11.1 .ЗА) показывает, что увеличение светорассеяния раствора начинается при каком-то отличном от 0 значении Ль. Это означает, что во время латентной фазы процесса в растворе формируются агрегаты, получившие название «стартовые» (термин предложен нами (КИашуа Л а1., 2005)).

Размер стартовых агрегатов (/?ь,о) может быть определен как отрезок на оси абсцисс (ось Ль) отсеченный линией, зависимость интенсивности светорас-

сеяния от (рис. Н.1.З.). Длительность латентной фазы (/0), во время которой происходит образование стартовых агрегатов, вычисляется как отрезок на оси абсцисс (ось времени), отсеченный линией, аппроксимирующей начальный участок зависимости величины Ль от времени. Следует отметить, что значение Ль,о оставалось постоянным при различных концентрациях Рь-кристаллина, тогда как величина /0 уменьшалась с ростом концентрации белка.

Рис. 11.1.3. Характеристика латентной стадии тепловой агрегации Рь-кристаллина. Зависимость интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса агрегатов белка при различных концентрациях Рь-кристаллина: 1 - 0 .025; 2 - 0.05; 3 - 0.1; 4 - 0.2; и 5 -0.4 мг/мл.

Мы полагаем, что образование стартовых агрегатов из отдельных денатурированных молекул может быть представлено в виде процесса кооперативной ассоциации в соответствии с принципом все-или-ничего.

Рост интенсивности светорассеяния, регистрируемый во время агрегации, есть результат слипания стартовых агрегатов. Зависимость величины Ль от времени на начальном участке аппроксимируется линейной зависимостью.

(II.1.1)

где Ль,о - гидродинамический радиус исходных частиц, участвующих в агрегации, и ¡гк - интервал времени, на протяжении которого гидродинамический радиус достигает значения 2Ль,о- Параметр 12к характеризует скорость процесса агрегации, - время лаг периода агрегации.

Однако свыше определенного времени (/ зависимость Л/, от времени описывается степенным законом.

(II.1.2)

где Ль - гидродинамический радиус, К\ - константа /0 - время лаг периода агрегации, ф - фрактальный размер.

Фрактальный размер - это структурная характеристика агрегатов, которые образуются в результате беспорядочных взаимодействий (стохастическая

агрегация). Масса агрегата, который при этом образуется (М) - связана с эффективным радиусом (R) следующим соотношением M ~ К'!.

Зависимость такого рода характерна для кластер-кластерной агрегации,, ограниченной диффузией (Lin et al., 1989). То есть, процесс агрегации ограничен только диффузией, в результате любого столкновении стартовых агрегатов происходит их слипание. Схема такого процесса изображена на рисунке II. 1.4.

денатурация , f *

> *" > •А • - *

. ' V .У t

. V, I , 7, Р '

стартовый i (

агрегат

фрактальный агрегат

Рис. 11.1.4. Схема тепловой агрегации Рь-кристаллина

11.1.1. Торможение тепловой агрегации а-крнсталлнном

На рисунке II. 1.1.1. представлена зависимость радиусов частиц, образующихся при тепловой агрегации р-кристаллина в присутствие а-кристаллина. Кривая 1 - агрегация р-кристаллина в отсутствие а-кристаллина. Его добавление подавляет агрегацию, однако, в определенный момент времени / (см. Рис. 11.1.1.1) в системе появляются более крупные частицы, размер которых быстро растет. При этом динамика нарастания крупных агрегатов совпадает с таковой для Р-кристаллина в отсутствие а-кристаллина. Это означает, что к моменту времени Г происходит полное насыщение а-кристаллина денатурированным р-кристаллином и избыточный денатурированный р-кристаллин агрегирует со скоростью, близкой к той, которая наблюдается в отсутствие а-кристаллина. Увеличение количества а-кристаллина сдвигает появление популяции крупных

Рис. 11.1.1.1. Подавление агрегации кристаллина (0,4 мг/мл) в присутствии а-кристаллина: 1 - Зависимость Кь от времени для агрегации р^-кристаллина в отсутствие а-кристаллина, 2 и 3 - Зависимость /4 от времени для агрегации (¡[.-кристаллика в присутствии 0,1 и 0,15 мг/мл а-кристаллина соответственно.

агрегатов на более поздние сроки.

В таблице II. 1.1.1 представлены характеристики латентной стадии (лаг фазы) тепловой агрегации смеси а- и Рь-кристаллина при 60° С. Значения Я^о, и /о вычислены на основании анализа зависимости I от Ли. Хорошо видно, что добавление в инкубационную смесь а-кристаллина уменьшает размер стартовых агрегатов и увеличивает время лаг фазы агрегации.

Таблица 11.1.1.1. Влияние а-кристаллина на параметры латентной стадии теп-

ловой агрегации Зь-кристаллина (0,4 мг/мл) при 60° С.

Концентрация ^крит. х.крит1 Rh.ll, (о,

а-кристаллина, мин Нм нм мин

мг/мл

0 н.о. н.о. 81 ±3 10.1 ±0.1

0.025 н.о. н.о. 31+3 17.0 ±0.3

0.05 25 250 31+2 16.3 ±0.3

0.1 65 250 25 ±1 15.7 ±0.5

0.15 80 35 21 + 1 23.0 ±3

(крим - время появления крупных агрегатов Кырчт - радиус агрегатов к моменту времени I, н.о. - значение не определяли

На рисунке II. 1.1.2. представлены зависимости от времени тепловой агрегации рь-кристаллина в присутствие возрастающих концентраций а-кристаллина. Добавление в систему а-кристаллина изменяет кинетический режим процесса. Если начальный участок агрегации р^кристаллина (см. Рис. II. 1.3.) мог быть описан линейной зависимостью (Я2 = 0.96) (см. уравнение ПЛ. 1), то в присутствии а-кристаллина начальный участок описывается экспо-нентой (И2 = 0.98).

1п2

Л*=Ял.о{®Ч>[—С-Ш (II. 1.3)

2 Я

где Ям - гидродинамический радиус исходных частиц, участвующих в агрегации, и - интервал времени, на протяжении которого гидродинамический радиус достигает значения 2Яь,о- Параметр характеризует скорость процесса агрегации, Г0 - время лаг периода агрегации.

Такой тип агрегации называют кластер кластерным взаимодействием, ограниченным скоростью взаимодействия. Другими словами процесс ограничен

способностью кластеров к взаимодействию. Это возможно в случае, когда часть липких концов стартового агрегата заблокирована молекулами а-кристаллина. Схема такого процесса изображена на рисунке II. 1.1.3.

а?

зооо

2500 2000 1500 1000 500 0

3000 2600 2000 1500 1000 500 0

20 40

80 100 120 140

M / 1« Ос ■<оо ! о ? • 1 .А У !

«о 200 »о <оэ aw еао ((min) ♦ff t.f f S* < !» £ S.

20 40

80 100 120 140

¿f

Время (мин)

40 60 80 100 120 140

Время (мин)

Рис. 11.1.1.2. Подавление тепловой агрегации рь-кристаллина (0,4 мг/мл) в присутствии а-кристаллина при 60° С. Значения гидродинамического радиуса агрегатов получены при различных соотношениях а- и PL-кристаллина: А - 1:16; Б -1:4; В — 1:2.6; Г - 2:1. Линия пунктиром показывает агрегацию рь-кристаллина в отсутствие а-кристаллина. Врезки на графиках показывают увеличенный участок кривой. Непрерывная линия на рисунках А и Б - экстраполяция данных с помощью уравнения (II. 1.5).

Рис. II. 1.1.3. Схема тепловой агрегации рь-кристаллина в присутствии а-кристаллина. Стартовые агрегаты, в обведенные кругом не пока не смогли прореагировать с фрактальным агрегатом вследствие блокирования «липких концов» а-кристаллином

При соотношении а- и pL-кристаллина 2:1 и более (см. рисунок II.1.1.2) агрегация блокирована полностью, а расщепления частиц в растворе на две популяции не происходит Это может означать, что все денатурированные молекулы рь-кристаллина связаны а-кристаллином и не участвуют в агрегации. В

'W /тл

m Ф О*

Ш u С* ■ - т

денатурация X

стартовый Ш *

агрегат фрактальный

агрегат

этом случае мы можем говорить о том, что агрегация блокирована только за счет образовании комплекса а-кристаллина и поврежденного белка. При относительно высокой концентрации белка (4мг/мл) образуется множество высокомолекулярных продуктов с массой большей 1500 кДа, тогда как образующийся комплекс при нагревании разбавленного раствора (0.04мг/мл) имеет небольшую степень дисперсности. Характеристики такого комплекса представлены в таблице II. 1.1.2.

Таким образом, добавление а-кристаллина изменяет кинетику процесса тепловой агрегации Рь-кристаллина кластер-кластерная агрегация ограниченная диффузией становится кластер-кластерной агрегацией ограниченной скоростью взаимодействия. В условиях избытка белка-субстрата (Рь-кристаллина) изменение кинетики процесса происходит вследствие встраивания молекул а-кристаллина в состав стартовых агрегатов, что препятствует их слипанию и образованию агрегатов высшего порядка. При снижении соотношения белок-субстрат:а-кристаллин менее чем 1:1 основным механизмом торможения агрегации белка является образование высокомолекулярного комплекса поврежденного белка и а-кристаллина. Формирование комплекса существенно зависит от концентрации белка: при высоких концентрациях (4 мг/мл) образуется целый спектр продуктов с молекулярной массой большей 1500 кДа, при низких концентрациях (0,04 мг/мл) образуется преимущественно комплекс с молекулярным весом около 1500 кДа.

Содержание в комплексе поврежденного белка (Рь-кристаллина) невелико и не превышает 10%. С учетом того, что при нагревании раствора рь-кристал-лина до 64 0 С основная масса белка (99%) денатурирует в течение нескольких минут, необходимо сделать вывод о том, что формирование высокомолекулярного комплекса не исчерпывает механизм шапероноподобного действия а-кристаллина.

Модель тепловой агрегации обладает серьезным недостатком - нагреву вместе с белком-субстратом Р[,-кристаллином подвергается и сам а-кристаллин, что существенно влияет как на его структуру (см. таблицу II. 1.1.2.), так и на шапероноподобные свойства (Burgio et al., 2000). Поэтому для исследования механизма шапероноподобного действия а-кристаллина в физиологических условиях необходима другая модельная система.

Таблица 11.1.1.2. Характеристика высокомолекулярного комплекса, образованного при прогревании разбавленной смеси (0.04 мг/мл) а- и Рц-кристаллипа в соотношении 2:1 (по массе)

МВ, кДа, А'±ст Диаметр, нм, 37 0 С Х±о Расчетный объем сферы, нм Содержание кристаллина %

Комплекс а- и рь-кристаллина 1490 + 22 15.9+0.1 1187.0 10

а-кристаллин 693 + 55 11.8+0.4 478.8 -

а-кристаллин прогретый при 64 0 С 1142 + 40 14.6+0.4 913.6 -

Х- среднее значение

<т - стандартная ошибка среднего

П.2. УФ агрегация

Ультрафиолет является важнейшим катарактогенным фактором, поэтому используется для исследования агрегации белков хрусталика. Однако исследование кинетики процесса агрегации затруднено, так как в процессе уже начавшейся агрегации происходит дополнительное облучение и повреждение белка. Поэтому нами был разработан новый метод УФ агрегации. На рисунке 11.2.1. представлены кривые агрегации р^кристаллина, который был облучен ультрафиолетом в различных условиях. Кривая 1 представляет агрегацию белка при облучении при температуре 37° С. Кривая 2 представляет агрегацию при облучении при температуре 10° С. Хорошо видно, что процесс агрегации в этом случае начинается при многократно большей дозе ультрафиолета. Кривая 3 показывает, что если при некоторой дозе ультрафиолета облучение прекратить, а

370 С - начинается процесс агрегации.

Рис. 11.2.1, Агрегация раствора ЬЬкристаллина (1 мг/мл) индуцированная ультрафиолетом. 1 - агрегация при 37° С; 2 - агрегация при 10° С; 3 - агрегация при 37° С, стрелка указывает момент прекращения ультрафиолетового облучения; 4 - температура в инкубационной смеси после прекращения ультрафиолетового облучения.

температуру в среде поднять до

Полученные данные означают, что в результате облучения белка ультрафиолетом при низкой температуре в растворе накапливаются поврежденные молекулы, которые начинают агрегировать только при повышении температуры среды. Таким образом, оказывается возможным изучать процесс агрегации при условиях близких к физиологическим (ионная сила раствора, температура).

II.2.1. Характеристика продуктов, образующихся при УФ облучении раствора рь-кристаллина при 10° С.

Хроматографическое разделение интактного и облученного ультрафиолетом при 10° С ßL-кристаллина показало, что УФ облучение вызывает уширение пика и снижение его молекулярной массы. Зависимость высоты пика от дозы ультрафиолета подчиняется экспоненциальному закону:

Y)im + (1 - Yy,m)e.kD, (И.2.1.1)

Где Y - значение параметра (относительная высота пика), Уцт предельное значение параметра при дозе ультрафиолета D -> оо и к — константа. Значения Y\\mи к- представлены в таблице II.2.1.1.

Деконволюция данных с помощью программного пакета RECOVERY позволяет обнаружить на хроматограмме пики с молекулярной массой как большей, так и меньшей массы основного пика ßL-кристаллина масса которого М — 40.3 кДа. Количество таких пиков увеличивается с дозой УФ. Кроме пиков с молекулярной массой около 44-50 кДа, которые являются димерами ßL-кристаллина, на хроматограммах выявляются пики с большей массой: 58, 70, 82,103,125,148,173 and 194 кДа.

Данные NaDS ПААГ электрофореза показывают, что при УФ облучении снижается количество основных полипептидов с массами 23.0, 26.5, 27.4 кДа и появляются полосы с массой в интервале 45-55 кДа, а так же с массой большей 200 кДа. Зависимость относительного объема полос нативного белка от дозы ультрафиолета также подчиняется экспоненциальному закону (уравнение II.2.1.1, таблица II.2.1.1). Основываясь на данных электрофореза, мы полагаем, что пики на хроматограммах с массой в интервале 58-194 кДа являются комплексами облученного ßL-кристаллина и продуктов его фотолиза, образованных за счет гидрофобных и иных нековалентных связей.

Интенсивность триптофановой флуоресценции падает при освещении УФ по экспоненциальному закону (уравнение II.2.1.1, таблица II.2.1.1). При этом

положение максимума пика триптофановой флуоресценции (Л=331 nm) остается неизменным. Это свидетельствует о том, что УФ облучение не вызывает разворачивания молекулы Рь-кристаллина.

На рисунке II.2.1.1 представлены ДСК профили исходного и УФ облученного Рц-христаллина. Площадь под кривой показывает общую энергию, необходимую для денатурации белка (Qd)- Эта величина пропорциональна количеству нативного белка. Облучение ультрафиолетом уменьшает площадь под кривой, что предполагает уменьшение количества нативного белка. Количество нативного белка может быть рассчитано как отношение Qd/Qo, где Qa - общая энергия денатурации исходного Рц-кристаллин, а Qu соответственное значение для облученного белка. Зависимость QrJQo от дозы УФ (D) также описывается экспоненциальным законом (уравнение II.2.1, табл. II.2.1).

Рнс. II.2.1.1. Денатурация облученного Рь-кристаллина. (А) ДСК профили ин-тактного и УФ облученного ßL-кристаллина Дозы УФ облучения: (1) - О, (2) - 5.2, (3) - 10.4, (4) - 20.1 и (5) - 31.3 Дж/см2. (В) Зависимость относительной величины теплоемкости QiJQo УФ облученного белка от дозы УФ облучения (ßo и Ои общая энергия денатурации для исходного и УФ облученного белка, соответственно. Точки аппроксимированы уравнением (11.2.1.1).

Форма ДСК профиля и положение главного максимума (Ггпах = 63.0 ± 0.1 °С) практически не зависит от дозы УФ.

Значение параметра Qi/Qo стремится к нулевому значению (Таблица II.2.1.1), то есть при D -» оо происходит полное разрушение вторичной структуры белка. Для облучения белка мы использовали свет в диапазоне 260-310 нм, в результате фотохимических преобразований ароматические аминокислоты, присутствующие в белке, образуют целый спектр флуоресцирующих продуктов. Именно по этой причине значение /¿Д» стремится к 0.18.

Таблица П.2.1.1. Аппроксимация экспонентой (уравнение 11.2.1.1) данных гель-фильтрации (относительная высота пика), электрофореза (относительный объем полос 23.0 - 27.4 кОа) триптофановой флуоресценции (относительная интенсивность) и ДСК (относительная энергия денатурации белка) облученного ультрафиолетом Рь-кристаллина. Уровень значимости: 95.0% (а!рЬа=0.05)

Параметр Y/im К R*

(Дж/см2)-1

Гель-фильтрация, Но/На 0.32 + 0.1 0.027 + 0.006 0.996

Электрофорез, Vr/V0 0.57 + 0.02 0.159 + 0.030 0.978

Флуоресценция, 0.18+0.07 0.051 +0.009 0.988

Энергия денатурации, QiJQo 0.01+0.02 0.100+0.007 0.998

Относительная высота хроматографического пика Яд/Яо стремится к 0.32. Это свидетельствует о том, что, несмотря на полное разрушение вторичной структуры, молекула УФ поврежденного белка сохраняет свою гидродинамическую форму.

Таким образом, облучение Рь-кристаллина ультрафиолетом вызывает до-зо-зависимое повреждение вторичной структуры белка, разрушение ароматических аминокислот, фотолиз молекулы, сопровождающийся образованием диме-ров, сшитых ковалентными связями, а также комплексов продуктов фотолиза, образованных за счет нековалентных связей.

УФ облученный Рь-кристаллин содержит денатурированный белок, а так же смесь нативного и поврежденного белка. Для описания денатурации УФ облученного Рь-кристаллин может быть предложена схема: N->N*->U* (II.2.1.2)

В этой схеме N— нативная форма белка, N* - УФ облученный белок, сохранивший нативную структуру и U* - денатурированная форма белка. Можно предположить, что происходит накопление повреждений белковой молекулы без деструкции её нативной структуры (/V N*). Однако по достижении критического значения количества таких повреждений происходит переход N* в денатурированную форму U*.

Таким образом, УФ повреждение рь-кристаллина может быть описано в рамках одноударного механизма (Setlow et al., 1957). Поглощение кванта света

вызывает цепь фотохимических превращений, которые, однако, не изменяют общую конформацию молекулы, т.е. внутримолекулярные силы поддерживают ее и молекула выглядит нативной. Однако после поглощения еще одного кванта света молекула разом теряет структуру, т.е. денатурирует.

Н.2.2. Исследование кннетнкн агрегации облученного ультрафиолетом при 10° С раствора Рь-кристаллина (УФ-Р^-крнсталлнн).

Назовем препарат облученного ультрафиолетом при низкой температуре (10° С) раствора р^кристаллина УФ-рь-кристаллин. На рисунке Н.2.2.1 показаны зависимости гидродинамического радиуса агрегатов белка от времени при 37 °С. Начальный участок кривой зависимости от времени следует экспоненте, а затем расщепляется на два компонента. Используя зависимость интенсивности светорассеяния (/) от Яь (Рис. Н.2.2.2), мы рассчитали гидродинамический радиус стартовых агрегатов который оказался равен 20.6 ± 1.0 пт.

Время(мин)

Рис. Н.2.2.1 Зависимость гидродинамического радиуса агрегатов облученного ультрафиолетом Рь-кристаллина от времени при 37 °С. Дозы облучения и концентрация белка в образце: (А) 20,1 Дж/см2 и 0,25 мг/мл; (Б) 20,1 Дж/см2 и 0,5 мг/мл; (В) 31,3 Дж/см2 и 0,5 мг/мл. Аппроксимация уравнением П.2.2.1.

Зависимость величины Яь от времени следует экспоненте и расщепляется на два компонента (кривая 1 и 2). Начальный участок кривой зависимости Ль от времени описывается уравнением:

К = К<> 1 ехР

1п2

С- 'о)

сп.2.2.1)

где Я/, - радиус агрегатов, 10 - время латентной фазы процесса, Ья - время удвоения диаметра агрегата, которое характеризует скорость процесса.

Это означает, что агрегация идет в режиме кластер-кластерной агрегации ограниченной скоростью реакции. Зная Я^0 мы рассчитали остальные два пара-

метра уравнения. Значения t0 and 1//2r (характеристика скорости) представлена в таблице II.2.1.

Рис. 11.2. Зависимость между значением гидродинамического радиуса (Rh) агрегатов белка от интенсивности светорассеяния (!) для агрегации при 37 °С облученного ультрафиолетом рь-кристаллина. Концентрация белка: 0,25 (1); 0,5 (2) и 0,5 мг/мл (3); дозы ультрафиолета: 20,1 (1); 20,1 (2) and 31,3 Дж/см2 (3).

Зависимость /?h от I бала использована для измерения гидродинамического радиуса стартовых агрегатов. Размер стартовых агрегатов оказался одинаков для разных концентраций и доз ультрафиолета

Из данных таблицы II.2.1 следует, что увеличение концентрации УФ-рь-кристаллина ведет к снижению длительности лаг периода кинетической кривой (т.е. уменьшается значение Г0) и увеличению скорости агрегации (т.е. увеличению параметра 1/?2r), как для быстро, так и медленно агрегирующей компоненты. Аналогичные изменения наблюдаются при увеличении дозы облучения.

Таблица Н.2.1. Параметры агрегации УФ-рь-кристаллина при 37 °С. Доверительный интервал 95.0% (а!рЬа=0.05).

Доза УФ PL- кристал- R2 to (мин) *±95% ДИ 1//2к (мин"') Х±95% ДИ

(J/cm2) лин (мг/мл) кривая 1 кривая 2 кривая 1 и 2 кривая 1 кривая 2

20.9 0.25 0.583 0.888 17.0±1.9*** 0.012±0.002*** 0.022+0.002**

20.9 0.5 0.765 0.925 7.1+0.6*** 0.021+0.002*** 0.03210.002**

31.3 0.5 0.823 0.953 6.0±0.2*** 0.03610.004*** 0.060+0.004**

ДИ- доверительный интервал; ** — р < 0.01; *** — р < 0.001

Таким образом, принципиальная разница между исследованными моделями агрегации заключается в том, что тепловая агрегация проходит в режиме кластер-кластерной агрегации, ограниченной диффузией, тогда как тогда как режим агрегации УФ-рь-кристаллина при 37° С это - кластер-кластерная агрегация, ограниченной скоростью реакции.

В основе этого явления лежит следующий механизм. Пусть в единицу времени происходит N актов столкновения молекул. Поскольку при тепловой агрегации практически весь белок находится в денатурированном состоянии, то все N столкновений приводят к слипанию молекул между собой (вероятность слипания = 1) - возникает режим ЭЬСА. При агрегации УФ облученного белка количество денатурированного белка много меньше. Например, для Рь-кристаллина облучение в дозе 20 Дж/см2 приводит к повреждению только 30% белка. Пусть соотношение количества денатурированных молекул к нативным равно 1/3. Тогда при тех же N актов столкновений вероятность встречи двух денатурированных молекул или стартовых агрегатов уменьшается и, в нашем случае, равняется 1/5. Таким образом, возникает режим ЯЬСА.

П.З. Торможение УФ индуцированной агрегации а-кристаллином

На рисунке П.З. 1 показаны кривые агрегации рь-кристаллина в присутствие а-кристаллина, что полностью соответствует данным литературы (Вогкшап уе а1., 1996; СЫгоУэку е1 а1., 2002). В этих опытах УФ облучению подвергали смесь а- и р!_- кристаллина. В присутствие разных концентраций а- кристалли-на агрегация Рь-кристаллина тормозится, а при соотношении белков по массе

Рис. Н.3.1. Агрегация Рь-кристаллина в присутствие разных количеств а- кристаллина.

А - Агрегация смеси а- и Р^кристаллин при освещении УФ при 37° С. В - Агрегация при 37° С смеси а- и УФ поврежденного при 10° С Рь-кристаллина

На рисунке II.3.1.В представлено влияние а- кристаллина на агрегацию УФ-Рь-кристаллина. Процесс агрегации также тормозится в зависимости от соотношения а- и Рь-кристаллина (рис. II.3.2.2).

Таким образом, при использовании двух методов инициации агрегации -облучение ультрафиолетом при 37° С и облучение ультрафиолетом при 10° С и последующей инкубацией при 37° С - наблюдаются похожие процессы.

На рисунке 11.3.2. показана хроматограмма разделения продуктов, образованных в смеси белков после облучения ультрафиолетом в дозе 20.8 Дж/см2. Количество вещества с молекулярным весом, равным весу исходного а-кристаллина существенно увеличено. Фракции были исследованы методами рентгеновского малоуглового рассеяния и электрофореза. Оказалось, что размеры и форма частиц присутствующих во фракциях практически одинаковы (средний радиус инерции 6,3 + 0,1 нм, функции распределения по расстояниям совпадают). Полипептидный состав по данным электрофореза несколько различается — в образце облученной УФ смеси содержатся полипепитиды с массой около 45 кДа, которые представляют собой сшитые ковалентными связями молекулы полипептиды а- и Рь-кристаллина, количество этих полипептидов не превышает 15% относительно а-кристаллина.

Рис. П.3.2. Хроматограммы растворов контрольной (1) и облученной ультрафиолетом (2) смеси а- и р^-кристаллина. На врезке результаты электрофореза а-кристаллина (1) и облученной ультрафиолетом (2) смеси

а- и |\-кристаллина.

Врсмх уж[>Ж)Ма1№Я. «МИ

При облучении ультрафиолетом раствора Р^кристаллина белок повреждается и выпадает в осадок. В связи с этим возникает важный вопрос: - где же находится поврежденный белок?

Для ответа на этот вопрос было исследовано взаимодействие нативного а-кристаллина с УФ-Рь-кристаллином. Препарат облученного ультрафиолетом при 10° С Рь-кристаллина инкубировали с а-кристаллином в соотношении 1:2 по массе 37° С в течение 2 часов. Затем смесь разделяли с помощью эксклюзи-онной хроматографии (Рис. II.3.3).

Рис. Н.3.3. Разделение продуктов взаимодействия УФ-р!.-кристаллина и а-кристаллина при различных дозах облучения с помощью эксклюзионной хроматографии. Зертикальные пунктирные линии и цифры обозначают собранные фракции. А - разделение смеси УФ-Pl-кристаллина и а-кристаллина с помощью Sephacryl S200. Контрольный образец - смесь PL-кристаллина и а-кристаллина инкубировался 2 часа при 37 0 С при рН 7. Линии черного, красного и синего цветов обозначают образцы для контроля, 100 и 180 Дж/см2, соответственно. Б — разделение фракции 1 с помощью TSK HW55f. Линии непрерывная, штрих пунктиром и пунктиром обозначают образцы для 20, 100 и 180 Дж/см2, соответственно.

Данные свидетельствуют о том, что при инкубации УФ-рь-кристаллина и а-кристаллина образуется новый пик с молекулярным весом, равным 75 кДа, а также возрастает количество высокомолекулярных продуктов с молекулярными весами 750 и более 1500 кДа.

Полипептидный состав фракций был исследован с помощью NaDs электрофореза (Рис. II.3.4), а размеры частиц в высокомолекулярных фракциях были измерены методом ДРС. Содержание поврежденного белка (УФ-Pl-кристаллин) относительно а-кристаллина, и их размеры представлены в таблице II.3.1. Хорошо видно, что основная масса поврежденного белка связана с низкомолекулярной фракцией.

Полученные данные существенно отличаются от результатов исследования Wang и Spector, которые показали, что при тепловой денатурации содержание поврежденного p-кристаллина доходит до 100% по отношению к а-кристаллину (Wang et al., 1994 ). Авторы использовали 50 мМ фосфатный буфер с рН=8. Известно, что снижение ионной силы раствора уменьшает скорость агрегации белка, а повышение рН усиливает шапероноподобные свойства а-кристаллина.

г-Р! !

те

Бремя уде^иванми (мин)

à ,'Н

! \

! :Т I i il f

/¡(А

ihv

¡/К,

/ ! \ ¡v ¡ i\

ti I fù

ч-Л ! ¡Y

Время удерживания (мкм)

Поэтому мы исследовали взаимодействие УФ-рь-кристаллина с а-крис-таллином при таких же условиях. Анализ продуктов показал, что основная часть поврежденного белка также входит в состав низкомолекулярного комплекса (табл. II.3.3).

Рис. II.3.4. Полипептидный состав фракций полученных при разделении смеси УФ-ßi,-кристаллина а-кристаллина с помощью экс-клюзионной хроматографии (см. рис. 1А). Трек 1 - водонерастворимая фракция, трек 2 - пик № 1, трек 3 - пик № 2, трек 4 - пик № 3. А - изображение геля, колонка цифр слева -положение белков-стандартов. Б - Профили оптической плотности. На профилях I, III, IV - 1 - димеры, 2 - ßL-кристаллин, 3 и 4 - а-кристаллин. На профиле II - 1 - ßL-кристаллин, 2 и 3 - а-кристаллин, 4 - продукт протеолиза а-кристаллина. Данные свидетельствуют: поврежденный белок присутствует только во фракции 2 (75 кДа, профиль III, трек 3) и во фракции нерастворимых белков (профиль I, трек 1).

Полученные результаты позволяют нам предложить новую схему взаимодействия денатурированных молекул и шапероноподобного белка а-кристаллина. В случае, когда количество денатурированных молекул невелико относительно количества молекул а-кристаллина происходит следующее (Рис. II.3. 5) - сначала денатурированные молекулы, способные к агрегации (сферы красного цвета), образуют с а-кристаллином (серая сфера) комплекс, при этом связанные молекулы теряют возможность слипаться (это показано изменением цвета). На следующей стадии комплекс распадается, при этом образуются молекулы высокомолекулярного комплекса, содержащие небольшое количество повреждённого белка (добавление синего цвета в этом случае показывает, что белки утратили способность к агрегации) и молекулы низкомолекулярного комплекса (се-

20 > '

14 >

2 3 4

6?> 45 >

29 >

'....... ................ ~~f\

.......J,

.......

0.0............6.2 0.4 ~"0.6""".....0.8...... 1.0

Значение rf

ро-синие сферы), которые содержат значительное количество повреждённого белка.

Предложенная схема (Рис. П.3.5) подразумевает, что а-кристаллин способен образовывать низкомолекулярные водорастворимые комплексы с дестабилизированными белками. Такая способность была показана ранее в исследовании Ношкг и сотр., которые обнаружили, что а-кристаллин в виде тетрамеров обладает шапероноподобной активностью (Но^ХЪг et а1., 2004). Однако, образование низкомолекулярного комплекса в результате взаимодействия нативного а-кристаллина и денатурированного белка была показана нами впервые.

Рис. 11.3.5. Схема шапероноподобной активности а-кристаллина в условиях когда количество денатурированных молекул невелико относительно количества молекул а-кристаллина. а-кристаллин (большая серая сфера) образует комплекс с денатурированным белком (малые сферы), затем происходит диссоциация комплекса с образованием двух популяций стабильных водорастворимых молекул: крупных (800 кДа) - большая серая сфера с черно-серыми вкраплениями и среднего размера (75 кДа) - серо-белые сферы.

Таблица П.3.1. Характеристика продуктов, образованных при инкубации нативного а-кристаллина с УФ-р^-кристаллином

Фракция № 1А Фракция № 1Б Фракция № 1В Фракция №2 Фракция №3

Молекулярный вес, кДа > 1500 880 750 75 45

Диаметр, нм 40+10* 23+1 18+2 - 5.5+0.9

Содержание УФ-Рь-кристаллина % 45* 5.1 2.5 200 -

* Значение вычислено для дозы 180 Дж/см2

Таблица II.3.3. Содержание УФ-рь-кристаллина в продуктах инкубации

Высокомолекулярный комплекс % Низкомолекулярный комплекс %

Контроль 3.14 0

рНб 8.17 133.04

рН7 2.26 224.32

рН8 6.22 525.11

Низкая ионная сила, рН 7 9.22 250.44

В случае, когда количество поврежденных молекул превышает некоторый предел, происходит «склеивание» образовавшихся высокомолекулярных комплексов между собой с образованием очень больших комплексов с массой более 1500 кДа.

Количество УФ-р^кристаллина, входящее в состав низкомолекулярного комплекса, для рН 7 составляет 224 % (см. табл. П.З.З.). Учитывая, что молекулярный вес полипептидов Рь-кристаллина примерно на 25% больше, чем у а-кристаллина, можно предположить, что на 1 субъединицу шаперона приходится 2 молекулы УФ-Рь-кристаллина. Это означает, что минимальный молекулярный вес такого комплекса должен равняться примерно 20+20+25 = 65 кДа, что хорошо совпадает с молекулярным весом комплекса определенным методом эксклюзионной хроматографии (табл. II.3.1.).

III. Торможение агрегации пептидами

Выявление ключевой роли агрегации белка в развитии помутнения хрусталика указало на возможность целенаправленного поиска соединений, которые могли бы тормозить процесс агрегации. Такие соединения могли бы послужить основой для создания нового класса препаратов, предупреждающих развитие катаракты (Аветисов и др. 2008; Kumar et al., 2009).

В качестве кандидатов на эту роль были выбраны гистидин-содержащие дипептиды и тетрамид пантетин, поскольку эти соединения способны тормозить развитие катаракты, при этом молекулярный механизм их действия, в общем, остается неизвестным (Болдырев, 2000; Clark et al., 1996).

III. 1. Исследование влияние гистндин-содержащнк днпептндов на агрегацию (ЗЬ-кристаллипа.

Для исследования был использован ряд соединений с возрастающей гидрофоб-ностыо, а именно: карнозин, анзерин и Ы-ацетилкарнозин (Рис. Ш.1.1). В качестве моделей агрегации была УФ индуцированная агрегации Рь-кристаллина, поскольку, условия протекания агрегации наиболее приближены к физиологическим.

Рис. 111.1.1. Структурные формулы карнозина, Ы-ацетил карнозина и анзерина.

Кривая зависимости светорассеяния раствора при агрегации от времени имеет Б-образную форму. Участок кривой агрегации после перегиба может быть аппроксимирован уравнением реакции первого порядка:

Это позволяет получать следующие количественные параметры, описывающие процесс помутнения раствора: (1) t„ - время лаг-фазы процесса, которое отражает скорость денатурации рь-кристаллина и образование стартовых агрегатов под действием ультрафиолета; (2) к, - (псевдо)константа скорости реакции, которая описывает скорость взаимодействия стартовых агрегатом; (3) Атах - максимальная мутность инкубационной смеси, которая отражает глубину процесса.

В таблице III.1.1 представлены параметры кривых УФ-индуцированной агрегации рь-кристаллина в присутствии карнозина, N-ацетил карнозина и анзерина, рассчитанные по уравнению (III.1), серым цветом в таблице отмечены концентрации, при которых наблюдается максимальный эффект соединения. Увеличение длительности лаг-фазы (величины /„) под действием дипептидов может свидетельствовать как о защите молекул белка от УФ повреждения, так и о торможении процесса их денатурации. Уменьшение значения к, может свидетельствовать как о снижении количества стартовых агрегатов, так и снижении скорости их взаимодействия.

Карнозин

N-ацетил карнозин Анзерин

(III.1)

Исследование влияние дипептидов на агрегацию Рь-кристаллина, предварительно облученного ультрафиолетом при низкой температуре, позволило выявить стадию процесса, на которой действуют эти соединения. При добавлении дипептидов после облучения белка и непосредственно перед повышением температуры смеси, то есть запуском агрегации, Ы-ацетил карнозин ускорял агрегацию, в то время как анзерин в той же концентрации увеличивал лаг-фазу и снижал скорость процесса агрегации. При добавлении как М-ацетил карнозина, так и анзерина до облучения белка ультрафиолетом наблюдали торможение агрегации белка. Это означает, что №ацетилкарнозин и анзерин действуют на стадии образования стартовых агрегатов.

Таблица ШД.1. Влияние гистидин-содержащих дипептидов на УФ-индуцированную агрегацию Рь- кристаллина.

Инкубационная Смесь Концентрация дипепти-да, мМ Параметры уравнения реакции первого порядка^-+ °>

Длительность лаг- фазы процесса агрегации, /„, мин Скорость процесса агрегации, ¿.„мин"1 Глубина процесса агрегации, А„,ахОЕ

Рь-кристаллин 0 12,50 ±0,02 0,142 ±0,003 1,08 ±0,03

Рь-кристаллин + карнозин 20 12,10 ±0,03* 0,185 ±0,004* 1,06 ±0,03

40 11,90 ±0,02* 0,198 ±0,003* 1,05 ±0,02

Рь-кристаллин + Ы-ацетил карнозин 10 12,90 ± 0,04* 0,118 ±0,002* 1,08 ±0,02

20 19,20 ±0,01* 0,035 ± 0,003* 1,32 ±0,02*

40 13,96± 0,05* 0,102 ±0,002* 1,13± 0,01*

Рь-кристаллин + анзерин 10 12,77 ±0,01* 0,165 ±0,002* 0,89 ± 0,02*

20 12,86 ±0,01* 0,134 ±0,003* 0,97 ± 0,02*

40 15,38 ±0,02* 0,120 ±0,002* 0,91 ±0,02*

Х- среднее значение; о - стандартная ошибка среднего; * различия достоверны для р < 0.001, ^критерий, сравнение с параметрами агрегации Р^кристаллина

Исследованные дипептиды не влияли на окисление белка, индуцированное ультрафиолетом, поэтому эффект торможения УФ-индуцированной агрега-

ции рь- кристаллина в присутствии дипептидов нельзя объяснить их антирадикальной активностью.

На рисунке III. 1.2. представлено распределения частиц по размерам в растворах р[.-кристаллина: контрольном, облученном ультрафиолетом, и растворе, облученном ультрафиолетом в присутствие дипептидов. Гидродинамический диаметр частиц в растворе Р^-кристаллина при 15° С варьирует от 2,33 до 15,7 нм, со значением моды 5,62 нм. Добавление дипептидов к нативному р^-кристаллину не влияет на размеры ассоциатов - распределения не отличаются друг от друга.

Но облучение ультрафиолетом Рь-кристаллина (рисунок III. 1.2.) вызывает образование популяции более крупных частиц, размером порядка 20 — 50 нм (пунктирная кривая). Мы полагаем, что эти частицы образуются при слипании нескольких сотен молекул Рь-кристаллина. Облучение же ультрафиолетом рь-кристаллина в присутствие дипептидов предотвращает образование таких крупных частиц. Средний диаметр частиц в случае добавки анзерина или М-ацетилкарнозина оказывается равным 6,89 и 6,27 нм соответственно.

Рис. III.].2. Распределение частиц по размерам в растворе Рь-кристаллина при 15°С. 1 - Р[,-кристаллин (сплошная линия); 2 - Рь-кристаллин + ультрафиолет 60 мин (пунктирная линия); 3 - р^ кристаллин + 20 мМ И-ацетилкарнозина + ультрафиолет 60 мин (линия точками); 4 - Р1_-кристаллин + 20 мМ анзерина + ультрафиолет (линия штрих-пунктиром).

Мы полагаем, что причиной торможения УФ-индуцированной агрегации Рь- кристаллина в присутствии дипептидов может быть встраивание дипептидов в поврежденную ультрафиолетом молекулу р^ кристаллина. Косвенным указанием справедливости нашего предположения является корреляция между гидрофобностыо соединений (0'1!)о\ус1 а1., 1988) и их антиагрегаторной ак-тивностью(см. таблицу III.1.1), которые усиливаются в ряду карнозин - анзерин - Ы-ацетилкарнозин.

Таким образом, можно заключить, что гистидин-содержащие дипептиды обладают способностью предупреждать агрегацию белков, выполняя функцию своеобразного микрошаперона.

Гидродинамический диаметр, нм

III.2. Торможение агрегации смеси а- и ßL- кристаллина под действием пантетина

Экспериментальные исследованиях на животных показано, что тетрамид пантетин (Рис. III.2.1) способен предупреждать развитие некоторых видов экспериментальных катаракт (Clark, Livesey and Steele, 1996b;Hiraoka, Clark, LI and Thurston, 1996).

Рис. 111.2.1. Строение молекулы пантетина

Ранее было показано, что пантетин способствует торможению тепловой агрегации алкогольдегидро-геназы (Clark and Huang, 1996). Однако тепловая агрегация не является адекватной моделью процессов агрегации белков, происходящих в условиях in-vivo. Поэтому нашей целью было изучить in-vitro механизм торможения УФ индуцированной агрегации в условиях близких к физиологических.

III.2.1. Влияние пантетина на агрегацию смеси ßL- и а-кристаллина.

На рисунке III.2.1.1 представлены кинетические кривые агрегации смеси ßL- и а- кристаллина в соотношении по массе 16:1, индуцированной ультрафиолетом, в присутствии пантетина (от 5 до 25 мМ). Хорошо видно, что добавка пантетина вызывает дозо-зависимое увеличение лаг периода и уменьшение скорости процесса.

При постоянной скорости образования денатурированных молекул ßL-кристаллина вновь образованные денатурированные молекулы ßL-кристаллина, связываются а-кристаллином, до тех пор, пока не насытятся все центры связывания. После этого начинается агрегация. Таким образом, увеличения времени лаг-фазы в присутствии пантетина свидетельствует об увеличении способности а-кристаллина связывать денатурированный белок (ßL-кристаллин).

Добавка пантетина тормозит агрегацию одного Рь-кристаллина (рис. III.2.1.2), однако при этом он влияет только на скорость процесса. Этот эффект связан со светофильтрующими свойствами пантетина, который имеет достаточно высокий коэффициент экстинкции при Л.=254 нм (270 л/моль*см). Действительно, если кювета с раствором пантетина располагается перед кюветой с раствором белка, наблюдается даже более эффективное торможение агрегации, чем когда пантетин находится в той же кювете с белком (Рис. III.2.1.3.).

/ л / / '

I/ / / / ' Ч / /

?0 80 90 100

Умин

и р^крист.

- ^-фИСГ.« П8МГ

- р^христ.* пантетин ~ р^-фист.» пантетин

- ^-крист.* пантетин

Рис. 111.2.1.1. УФ индуцирован агрегация смеси [ЗЬ- и а- кристаллина в соотношении 16:1 по массе в присутствии пантетина. По оси ординат светорассеяние при ¡1=450 нм в относительных единицах, по оси абсцисс время в мин. (1) - смесь Рь- и а- кристаллина; (2) - смесь Рх,- и а- кристаллина + пантетин 5мМ; (3) - смесь Рь- и а- кристаллина + пантетин ЮмМ; (4) -смесь рь- и а- кристаллина + пантетин 20мМ; (5) - смесь Рь- и а- кристаллина + пантетин 25мМ.

Рис. III.2.1.2 УФ индуцированная агрегация Рь-кристаллина в присутствии пантетина. По оси ординат светорассеяние при А.=450 нм в относительных единицах, по оси абсцисс время в мин. (1) Р^кристаллина; (2) рь-кристаллина + пантетин 5мМ; (3) Р1_-кристаллина + пантетин ЮмМ; (4) р1.-кристаллина + пантетин 15 мМ; рь-кристаллина + пантетин 25мМ.

Рис. Ш.2.1.3. УФ индуцированная агрегация р[.-кристаллина. Раствор пантетина находится в отдельной кювете толщиной 4 мм, расположенной перед кюветой с раствором белка. Стрелка указывает момент, когда кювета с раствором пантетина (25 мМ) убирается с пути луча ультрафиолета. По оси ординат светорассеяние при Х=450 нм в относительных единицах, по оси абсцисс время в мин.

Таким образом, можно заключить, что действие пантетина на агрегацию смеси кристаллинов связано как с активацией шапероноподобных свойств а-кристаллина, так и светофильтрующими свойствами молекулы.

Таблица Ш.2.1.1. Значения константы диссоциации комплекса флуоресцентного зонда бис-АНС и альфа-кристаллина в присутствии пантетина.

Концент- а- а- а- а- а-

рация кристал- кристал- кристал- кристал- кристал-

белка, лин лин + пан- лин + пан- лин + пан- лин + пан-

мг/мл тетин 5 тетин тетин тетин

мМ ЮмМ 20мМ 25мМ

0.05 0.7 1.4 1.3 1.3 1.4

0.5 1.1 1.4 1.6 1.2 1.6

1.0 0.5 0.5 0.7 0.5 0.7

Влияния пантетина на связывание денатурированных белков а- кристаллином было изучено на модели связывание флуоресцентного зонда бис-АНС. В таблице II.5.2.1. представлены значения константы диссоциации для комплекса флуоресцентного зонда бис-АНС и а- кристаллита в присутствии пантетина, а на рисунке III.2.1.3 зависимость числа центров связывания зонда на молекуле этого белка.

Рис. Ш.2.1.3. Влияние пантетина на число центров связывания зонда бис-АНС на молекуле а-кристаллина.

Как видно из представленных данных пан-тетин практически не оказывает влияние на константу диссоциации, но существенно увеличивает число мест связывания зонда.

Добавление пантетина к а- кристаллину вызывало увеличение радиуса молекулы. При увеличении концентрации пантетина от 0 до 25 мМ диаметр молекулы увеличивается от 14.76 нм до некоторого предельного значения, равного 15.76 нм. Зависимость хорошо описывается экспоненциальной зависимостью У = а (1- еЬх) (г=0.996, Р<0.01).

Таким образом, механизм влияния пантетина на агрегацию смеси а- и РЬ-кристаллина, индуцированную ультрафиолетом включает два независимых процеса: (1) торможение агрегации РЬ- кристаллина за счет светофильтровых свойств пантетина и (2) активация шапероноподобных свойств а- кристаллина, вследствие изменения структурно-функциональных свойств молекулы.

О 10 20 30 _С/мМ

Ш.З. Торможение катаракты in-vivo

В главе III.2 мы показали: (1) Гистидин-содержащие пептиды способны тормозить агрегацию PL-кристаллина, выполняя функцию своеобразного «мик-рошаперона»; (2) тетрамид пантетин тормозит агрегация смеси а- и Рь-кристал-лина активируя шаперон-подобные свойства а-кристаллина. Таким образом, смесь этих двух соединений может тормозить агрегацию белков одновременно по двум путям - предупреждать агрегацию белка-субстрата и активировать действие эндогенного шаперона - а-кристаллина. Это означает, что смесь N-ацетил карнозина и пантетина может оказаться более эффективным препаратом, противодействующим развитию помутнения хрусталика. Данные представленные в первой главе, показывают, что ультрафиолет вызывает у мышей образование катаракты схожей по основным параметрам с возрастной катарактой. Специальный эксперимент показал, что облучение ультрафиолетом вызывает образование аналогичной катаракты и у крыс. (Аветисов, Полунин, Шеремет, Муранов, Макаров, Федоров, Карпова and Островский, 2008;Муранов, Карпова, Логинова, Шеремет, Полунин and Островский, 2006). На рисунке III. 1 показаны микрофотографии глаз крыс с разной степенью по-

Рис III.1. Помутнения хрусталика крыс, возникающие при ежедневном облучении ультрафиолетом А и Б. Номер фотографии соответствует баллам шкалы оценки помутнения хрусталика, использованной для анализа данных методом экспертных оценок. На рисунке соответствующим 5 баллам обозначены зоны, выделяемые для анализа: 1 передняя капсула; 1-2 передняя кора6:2-3 - переднее ядро; 3-4 - среднее ядро; 4-5 - заднее ядро; 5-6 - задняя кора

Эксперимент был проведен на крысах-самцах линии Wistar, животные были разделены на 3 рандомизированных групп. Первую группу (УФ) составили животные, которым инициировали формирование УФ катаракты, но не вводили комбинированный препарат; Вторую (контрольную) группу составили крысы, которые не подвергались воздействию УФ излучения и не получали препарат. В третьей группе (УФ5%) облучаемые животные получали комбинированный препарат N-ацетил карнозина и пантетина в виде инстилляций в глаз. Однократные инстилляции проводили ежедневно в течение всего периода наблюдения. Динамика развития помутнений представлена на рисунке III.2.

мутнения хрусталика.

Рис. Ш.2. Влияние комбинированного препарата (ежедневные инсталляции 5% раствора) на помутнение хрусталика в средних ядерных слоях хрусталика, измеренное в относительных единицах с помощью графического анализа. Данные представлены в виде среднего по группе с указанием 95% доверительного интервала.

Статистически достоверные различия между 1-й (облучение) и 2-й (контроль) группой были выявлены через месяц после начала облучения. Достоверность различия между этими группами сохранялись в течение всего периода наблюдения. К концу эксперимента в облучаемой группе наблюдалось формирование однородного облакоподобного помутнения хрусталика более выраженного в ядерной области (суммарная оценка катаракты двух глаз - 195 + 11 единиц), в контрольной группе хрусталик в значительно большей степени сохранял свою прозрачность (суммарная оценка катаракты двух глаз - 117+13 единиц). В группе, получавшей комбинированный препарат на фоне УФ облучения, скорость нарастания помутнений в хрусталиках была значительно медленнее. Различие между группами (тест Коновера) УФ облученных животных и УФ облученных животных, получавших комбинированный препарат, было достоверно, начиная с 82 дня эксперимента (р < 0.01), в дальнейшем достоверность различия существенно и к концу эксперимента на 313 день была меньше 0.00002). При этом достоверность различия между группами контроля и УФ облученных животных, получавших комбинированный препарат, в начале эксперимента составлявшая 0.00001 к концу эксперимента стала недостоверной (р > 0.2),что говорит о том, что степень помутнения хрусталиков животных облученных УФ и получавших препарат сравнялась со степенью помутнения хрусталиков животных контрольной группы.

Таким образом, применение комбинированного препарата, состоящего из смеси пептидов (N-ацетил карнозин и D-пантетин) в соотношении 1:1 в виде инстилляций в глаза позволило существенно замедлить процессы формирования ультрафиолетовой катаракты in vivo.

иТ

''Ща i .gr-Vii

¡rí * • УФ облучение

о Контроль

▼ УФ облучение + капли

О 100 200 300

Облучение УФ светом, дни

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование с использованием возрастной, ультрафиолетовой, радиационной и комбинированной экспериментальных катаракт показало отсутствие специфических изменений при образовании помутнений хрусталика на уровне: органа, клетки, субклеточных элементов и молекулярном уровне. Это указало на то, что основной причиной возникновения помутнений хрусталика является нарушение белок - белковых взаимодействий, вызванное денатурацией и агрегацией белков кристаллинов в цитоплазме волоконных клеток.

Разработка специальных методов исследования агрегации белка, в условиях близких к физиологическим, позволило доказать, что а-кристаллин - один из основных белков хрусталика - тормозит процесс агрегации белка, образуя с денатурированными белками водорастворимые комплексы двух типов. Первый тип комплекса это молекула а-кристаллина в структуру которой входят и поврежденные белки, так что размеры комплекса не отличаются от размеров самой молекулы а-кристаллина. Второй тип комплекса имеет молекулярный вес около 75 кДа и представляет собой конгломерат из субъединиц а-кристаллина и полипептидов поврежденного белка.

Логическим продолжением работы явилось попытка усилить шаперон-подобную активность а-кристаллина. Было показано, что экзогенные низкомолекулярные соединения (пантетин) способны усиливать шапероноподобные свойства а-кристаллина, а некоторые гистидин-содержащие пептиды в физиологически значимых концентрациях способны непосредственно тормозить процесс агрегации. Применение смеси Ы- ацетил карнозина и пантетина в условиях ¡п-уК'о показало, что такое сочетание препаратов эффективно предупреждает развитие УФ индуцированной катаракты. Таким образом, полученные в работе результаты указывают на новое направление для поиска антикатарактальных препаратов. То есть препаратов, предупреждающих развитие помутнения хрусталика, путем торможения агрегации белков хрусталика.

ВЫВОДЫ

1. Радиоактивное и ультрафиолетовое облучение, старение сопровождаются однотипными изменениями на всех уровнях организации хрусталика: тканевом, оцениваемом по величине и локализация помутнений, клеточном, оцениваемом по микроскопической картине, и молекулярном, оцениваемом методом

разностного электрофореза водорастворимых и водонерастворимых белков. Отсутствие специфических изменений указывает на существование единого механизма, поддерживающего прозрачность хрусталика, нарушение функции которого приводит к его помутнению (катаракте).

2. Методами гель-фильтрации, электрофореза, флуоресцентной спектроскопии, дифференциальной сканирующей калориметрии показано, что денатурация белков хрусталика, под действием окислительного стресса, вызванного действием ультрафиолета, проходит по одноударному механизму.

3. Методом динамического светорассеяния показано, что молекулярный механизм агрегации белков хрусталика - главной причины помутнения хрусталика - описывается в рамках кластер-кластерного взаимодействия

4. Методами гель-фильтрации, электрофореза и ультрафильтрации установлено, что образование водорастворимого комплекса дестабилизированных белков и шапероноподобного белка а-кристаллина - основного механизма поддержания прозрачности хрусталика - является динамическим процессом. Комплекс быстро распадается на водорастворимые высокомолекулярный и низкомолекулярный комплекс, комплексы содержат, соответственно, от 2% до 5% и от 200% до 250% поврежденного белка.

5. С помощью методов динамического и статического светорассеяния показано, что низкомолекулярные соединения (N-ацетил карнозин и пантетин) способны тормозить агрегацию белка как предупреждая процесс денатурации белка, так и активируя шапероноподобные свойства а-кристаллина.

6. Смесь низкомолекулярных соединений (N-ацетил карнозин и пантетин) способна тормозить развитие УФ индуцированной катаракты в опытах in-vivo на крысах.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в Российских научных журналах

1. Кривандин A.B., Муранов К.О. Сравнительное исследование надмолекулярной структуры кристаллинов в хрусталиках карпа, лягушки и крысы методом малоуглового рассеяния рентгеновских лучей. //Биофизика 1999.- Том 44, С.1088-1093.

2. Косарев Е.Л., Муранов К.О. Хроматография сверхвысокого разрешения.// Приборы и техника эксперимента 2001.- № 5.- С.74-79

3. Кривандин A.B., Муранов К.О., Островский М.А. Рентгеновское малоугловое исследование комплексообразования в растворах а- и рь-кристаллинов при нагревании. // Доклады академии наук 2004,- Том 394, № 1.- С.112-115.

4. Кривандин A.B., Муранов К.О., Островский М.А. Исследование комплексообразования в растворах а- и ßL-кристаллинов при 60°С. // Молекулярная биология 2004.- Том 38, № 3.- С.532-546.

5. Кривандин А.В, Муранов К.О., Потураева И.Д., Полянский Н.Б., Островский М.А. Исследование комплексообразования а- и Рь-кристал-линов при УФ облучении. // Доклады академии наук 2006,- Том 409, № 4,- С.550-554.

6. Меремьянин A.B., Еронина Т.Б., Чеботарева H.A., Клейменов С.Ю., Юдин И.К., Муранов К.О., Островский М.А., Курганов Б.И. Влияние -кристаллина на тепловую агрегацию гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика. // Биохимия 2007.- Том 72, № 5.- С.642-654.

7. Аветисов С.Э., Полунин Г.С., Шеремет Н.Л., Макаров И.А., Федоров A.A., Карпова O.E., Муранов К.О., Тимофеева А.К., Соустов Л.В., Челноков Е.В., Битюрин Н.М., Сапогова Н.В., Немов В.В., Болдырев A.A., Островский М.А. Поиск шаперон-подобных антикатарактальных препаратов-антиагрегантов кристаллинов хрусталика глаза. Сообщение четвёртое: Изучение воздействия смеси ди- и тетра-пептидов на «пролонгированной» модели ультрафио-лет-индуцированной катаракты у крыс. // Вестник офтальмологии 2008,-Том 124, №2,- С.12-16.

8. Аветисов С.Э., Полунин Г.С., Шеремет Н.Л., Муранов К.О., Макаров И.А., Федоров A.A., Карпова O.E., Островский М.А. Поиск шаперон-подобных антикатарактальных препаратов-антиагрегантов кристаллинов хрусталика глаза. Сообщение третье: Возможности динамического наблюдения за процессами катарактогенеза на «пролонгированной» модели ультрафиолет-индуцированной катаракты у крыс. // Вестник офтальмологии 2008.- Том 124, №2,- С.8-12.

9. Муранов К.О., Тимофеева А.К., Болдырев A.A., Карпова O.E., Шеремет Н.Л., Полунин Г.С., Аветисов С.Э., Островский М.А. Поиск шаперон-подобных антикатарактальных препаратов-антиагрегантов кристаллинов хрусталика глаза. Сообщение первое: Шаперон-подобное действие дипепти-да N-ацетил карнозина: исследование in vitro на модели УФ-индуцированной агрегации bL-кристаллина. // Вестник офтальмологии 2008.- Том 124, № 2,- С.3-6.

Ю.Кривандин А., Муранов К.О., Яковлев Ф.Ю., Полянский Н.Б., Вассерман JI.A., Островский М.А. Исследование повреждающего действия УФ света на структуру альфа-кристаллина хрусталика глаза быка. // Биохимия 2009.- Том 74, №6,- С.779-791.

11. Дижевская А.К., Болдырев А.А., Полянский Н.Б., Муранов К.О., Островский М.А. Молекулярный механизм действия гистидин-содержащих дипеп-тидов на агрегацию (5ь-кристаллина. Молекулярная медицина 2010,- № 1.-С.33-37.

12.Кривандин А.В., Муругова Т.Н., Куклин А.И., Муранов К.О., Полянский Н.Б., Аксёнов В .Л., Островский М.А. // Исследование структуры альфа-кристаллина методом малоуглового рассеяния нейтронов с вариацией контраста. Биофизика 2010,- Том 75, № 11.- С.1499-1507.

13. Муранов К.О., Дижевская А.К., Полянский Н.Б., Додонова С.В., Островский М.А. Короткоцепочечные пептиды как перспективный класс антиката-рактальных препаратов шаперон-подобного действия: молекулярный механизм торможения агрегации кристаллинов хрусталика пантетином. // Известия академии наук.Серия химическая. 2010.- № 1.- С.221-227.

14. Муранов К.О., Полянский Н.Б., Курова B.C., Рябоконь A.M., Шеремет Н.Л., Федоров А.А., Банник К.И., Абросимова А.Н., Островский М.А. Сравнительное исследование старения, ультрафиоле-тового и радиационного облучения на возникновение и развитие катаракты. // Радиационная биология и радиоэкология 2010.- Том 50, № 3.- С.276-285.

Статьи в международных научных журналах

1. Kosarev E.L., Muranov К.О. Chromatography plus RECOVERY = superresolution chromatography. Nuclear Instruments & Methods in Physics Research Section A- Accelerators Spectrometers Detectors and Associated Equipment 2003.-V. 506.- № 1-2,- P.203-206.

2. Kosarev E.L., Muranov K.O. Chromatography plus RECOVERY = superresolution chromatography. Nuclear Instruments & Methods in Physics Research Section A- Accelerators Spectrometers Detectors and Associated Equipment 2003.-V. 502.-№2-3.-P.764-767.

3. Muranov K., Poliansky N„ Winkler R., Rieger G., Schmut O., Horwath-Winter J. Protection by iodide of lens from selenite-induced cataract. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 2004.- V.242.- № 2,- P.146-151.

4. Markossian, K. A., Kurganov, B. I., Levitsky, D. I., Khanova, H. A., Chebo-tareva, N. A., Samoilov, A. M., Eronina, T. V , Fedurkina, N. V , Mitskevich, L. G, Merem'yanin, A. V , Kleymenov, S. Yu., Makeeva, V F., Muronetz, V I., Naletova, I. N., Shalova, I. N., Asryants, R. A., Schmalhausen, E. V , Saso, L., Panyukov, Yu. V , Dobrov, E. N., Yudin, I. K., Timofeeva, A. C., Muranov, K. O., and Ostrovsky, M. A. MECHANISM OF THE CHAPERONE-LIKE ACTIVITY. Tony R.Obalinsky. Protein Folding: New Research. 89-171. 2006. New York, USA, Nova Science Publishers, Inc.

5. Khanova H.A., Markossian K.A., Kurganov B.I., Samoilov A.M., Kleimenov S.Y., Levitsky D.I., Yudin I.K., Timofeeva A.C., Muranov K.O., Ostrovsky M.A. Mechanism of Chaperone-like Activity. Suppression of Thermal Aggregation of beta(L)-Crystallin by alpha-Crystallin. Biochemistry 2005.- V. 44,- № 47.-P.15480-15487.

6. Khanova H.A., Markossian K.A., Kleimenov S.Y., Levitsky D.I., Chebotareva N.A., Golub N.V, Asryants R.A., Muronetz V.l., Saso L., Yudin I.K., Muranov K.O., Ostrovsky M.A., Kurganov B.I. Effect of alpha-crystallin on thermal dena-turation and aggregation of rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biophys.Chem. 2007,- V. 125,-№ 2-3.- P.521-531.

7. Markossian K.A., Golub N.V., Khanova H.A., Levitsky D.I., Poliansky N.B., Muranov K.O., Kurganov B.I. Mechanism of thermal aggregation of yeast alcohol dehydrogenase I Role of intramolecular chaperone. Biochim.Biophys.Acta. 2008.- V.1791.-№ 9,- P.1286-1293.

8. Markossian K.A., Golub N.V., Kleymenov S.Yu., Muranov K.O., Sholukh M.V., Kurganov B.I. Effect of alpha-crystallin on thermostability of mitochondrial aspartate aminotransferase. Int.J.Biol.Macromol. 2009.- V.44.- № 5.- P.441-446.

9. Golub N.V., Markossian K.A., Sholukh M.V., Muranov K.O., Kurganov B.I. Study of kinetics of thermal aggregation of mitochondrial aspartate aminotransferase by dynamic light scattering: protective effect of alpha-crystallin. Eur. Bio-phys. J. 2009.- V.38.- № 5.- P.547-556.

10. Bumagina Z.M., Gurvits B.Y., Artemova N.V., Muranov K.O., Yudin I.K., Kurganov B.I. Mechanism of suppression of dithiothreitol-induced aggregation of bovine alpha-lactalbumin by alpha-crystallin. Biophys.Chem. 2010.- V.146.- № 2-3,- P.108-117.

11. Bumagina, Z.M., Gurvits B.Y., Artemova N.V, Muranov, K. O., Kurganov, B. I. Paradoxical acceleration of dithiothreitol-induced aggregation of insulin in the presence of a chaperone. Intern. J. Mol. Sei. 2010,- V.ll.- №11.- P.4556-4579.

12.Markossian K.A., Golub N.V., Chebotareva N.A., Asryants R.A., Naletova I.N., Muronetz V.l., Muranov K.O., Kurganov B.I. Comparative Analysis of the Effects of alpha-Crystallin and GroEL on the Kinetics of Thermal Aggregation of Rabbit Muscle GIyceraIdehyde-3-Phosphate Dehydrogenase. Protein J. 2010.- V. 29.-№ 1.- P.ll-25.

13. Muranov K.O., Poliansky N., Kurova V C., Riabokon A.M., Sheremet N.L., Fe-dorov A.A., Bannik K.I., Abrosimova A.N., Ostrovsky M.A. Comparative Study on Aging, UV Treatment, and Radiation on Cataract Formation. Biophysycs 2010.- V. 55.- № 5,- P.870-877.

14. Muranov K.O., Maloletkina O.I., Poliansky N.B., Markossian K.A., Kleimenov S.Y., Rozhkov S.P., Goryunov A.S., Ostrovsky M.A., Kurganov B.I. Mechanism of aggregation of UV-irradiated betaL-crystallin. Exp.Eye Res. 2011.- V.92.- № 1,- P.76-86.

Патенты

1. Соустов, Jl. В., Челноков, E. В., Битюрин, H. М., Немов, В. В., Аветисов, С. Э., Полунин, Г. С., Шеремет, Н. JL, Карпова, О. Е., Муранов, К. О., Островский, М. А. Фармакологическая композиция для профилактики и лечения начальной стадии возрастной катаракты (варианты). Институт прикладной физики РАН. 2007144339/15, 03.12.2007[RU 2352352 С1], 1-14. 20-4-2009. Российская федерация. 3-12-2007.

Подписано в печать:

12.10.2011

Заказ №6127 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Муранов, Константин Олегович

Список сокращений.

Введение и постановка задачи.

Физиология и патология хрусталика.

Глаз и восприятие света в природе.

Строение и формирование хрусталика.

Основные функции хрусталика.

Механизмы аккомодации хрусталика.

Молекулярный состав хрусталика и его рефрактивные свойства.

Механизмы, обеспечивающие прозрачность хрусталика.

Механизмы нарушения прозрачности хрусталика.

Механизмы, поддерживающие прозрачность хрусталика.

Цель исследования.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные механизмы поддержания и нарушения прозрачности хрусталика глаза"

111.2.2. Торможение развития УФ индуцированной катаракты с помощью комбинированного препарата пантетина и N-ацетил карнозина.247

111.2. Заключение.254

111.3. Выводы.255

111.4. Материалы и методы.256

III.4.1. Эксперимент in-vitro.256

HI.4.2. Эксперимент in-vivo.258

111.5. Список литературы.262

Заключение.270

Проблема прозрачности хрусталика:.270

Проблема возникновения помутнения хрусталика.273

Противодействие повреждению белков.276

Альфа-кристаллин.277

Предупреждение катаракты экзогенными веществами.284

Выводы.288

Список сокращений

Активные формы кислорода АФК

Глицеральдегид-З-фосфат-дегидрогеназа ГАФД

Динамическое лазерное рассеяние ДЛР

Додецил сульфат натрия NaDs

Индекс полидисперсности (Polydispersity index) PDI кластер кластерное взаимодействие, ограниченное диффузией DLCA diffusion-limited cluster-cluster aggregation); кластер кластерное взаимодействие, ограниченное скоростью RLCA реакции (reaction-limited cluster-cluster aggregation

Крупнорогатый скот КРС

Показатель оптической плотности ПОП

Полиакриламидный гель ПААГ

Ультрафиолетовый свет УФ

Фосфатный буфер ФБ

Введение и постановка задачи.

Физиология и патология хрусталика. Глаз и восприятие света в природе

Самая простая и эволюционно древняя реакция на свет в животном царстве среди живых организмов это - фототаксис, который отчетливо проявляется у подвижных микроорганизмов в виде двигательной реакции в ответ на световой стимул. Однако никаких специализированных структур, отвечающих за фоторецепцию у микроорганизмов нет. Фоторецепторные структуры появляются на более поздних стадиях эволюции в виде светочувствительных клеток, например, у кишечнополостных (Рис. 1А). С ходом эволюционного процесса строение таких структур усложнялось, и сейчас в живой природе можно выделить четыре типа строения органов, обеспечивающих восприятие света. Это уже упомянутые светочувствительные (фоторецепторные) клетки, имеющие различное строение и которые также могут быть объединены в группы. Затем глазные ямки (pinhole) глаза, обладателями которых являются головоногие моллюски, например, представители рода Nautilus (Рис. 1Б). Фасеточными глазами обладают многие представители типа членистоногих (Рис. 1В). Представители типа хордовых обладают глазом, содержащим фокусирующую линзу и собственно орган зрения - сетчатку, содержащую фоторецепторные клетки (Рис. 1Г). Следует указать, что корреляция между строением фоторецепторной системы и положением организма на эволюционном древе достаточно условна. Например, строение оптической системы глаза осьминога (головоногого моллюска) принципиально не отличается от таковой у млекопитающих и человека.

На рисунке 2 представлены схемы устройства перечисленных выше светочувствительных органов зрения. Группы светочувствительных клеток у самых примитивных организмов напрямую передают фоторецепторный сигнал нервным клеткам (Рис. 2А), то есть животное может различать свет и тень.

Рис. 1. Представители основных типов световосприятия в живой природе. (А) группы светочувствительных клеток - гидра, (Б) глазная ямка (pinhole) глаз - моллюск Nautilus; (В) фасеточный глаз - стрекоза; (Г) глаз с хрусталиком и сетчаткой - кошка.

В процессе эволюции глаз формировался как орган зрения, способный формировать изображение. Так глазная ямка (pinhole) уже позволяет определять границы объекта (Рис. 2Б). Фасеточные глаза насекомых способны формировать получать достаточно резкие изображения предметов на небольшом расстоянии. Получение резких изображений в фасеточном глазу создаётся с помощью двух альтернативных подходов. Первый - это широко распространенный среди насекомых метод создания изображения с помощью светочувствительного элемента с собственной линзой и группой светочувствительных клеток (Рис. 2В). Второй, менее распространенный, - метод фокусировки за счет отражения (Рис. 2Г). Наружная часть глаза омаров и других десятиногие ракообразных, рачков и креветок состоит из квадратных призм микронного размера. Стороны этих призм представляют собой плоские зеркала, и благодаря их точному геометрическому расположению параллельные лучи света фокусируются на слое фоторецепторных светочувствительных клеток.

На рисунке 2Д представлено строение глаза, в котором фокусировка изображения производится с помощью линзы (хрусталика), а светочувствительным элементом является сетчатка, содержащая слой фоторецепторных клеток. Такой тип строения глаза является, по всей видимости, вершиной эволюции органа зрения, поскольку позволяет получать изображение объекта, находящегося на разных расстояниях - от нескольких сантиметров до сотен метров.

Рис. 2. Схемы строения светочувствительных органов. (А) группы светочувствительных клеток, фокусировка отсутствует; (Б) Глазная ямка (pinhole), фокусировка через микроотверстие; (В) фасеточный глаз, фокусировка микролинзами; (Г) фасеточный глаз, фокусировка за счет отражения; (Д) глаз млекопитающих, фокусировка с помощью линзы переменной кривизны

Строение и формирование хрусталика

На рисунке 3 представлена схема строения глаза млекопитающих. Фокусирующая изображение линза - хрусталик «подвешен» с помощью цинно-вой связки непосредственно за радужной оболочкой, которая разделяет глаз на переднюю и заднюю камеры. С помощью сокращения круговой цилиар-ной мышцы кривизна хрусталика изменяется, за счет чего глаз может фокусироваться на предметы, находящиеся на разном расстоянии.

Рис. 3. Схема глаза позвоночных млекопитающих.

Образование хрусталика в онтогенезе начинается на ранних стадиях эмбрионального развития (Рис. 4). На схеме (стадия I) представлены микрофотографии глаза мыши на десятый (левое изображение) и одиннадцатый (правое изображение) дни внутриутробного развития. Хорошо видно, что на десятый день к участку формирующейся сетчатки (1) примыкает участок эктодермы (2), который на следующий одиннадцатый день замыкается в пузырек - зачаток хрусталика (стадия II). Под воздействием ростовых факторов сетчатки (стадия III), примыкающие к ней эпителиальные клетки зачатка начинают вытягиваться и образуют слой первичных волоконных клеток - образуется первичное ядро (стадия IV). В дальнейшем по периферии клетки эпителия, которые образуют замкнутый круг (указан черными стрелками), начинают интенсивно делиться и постепенно сдвигаться к экватору хрусталика. В процессе этого движения клетки выстраиваются в меридиональные ряды (Рис. 5). Клетки, находящиеся в экваториальной зоне начинают вытягиваться и образуют вторичные волоконные клетки. На схеме слой таких клеток обозначен красным цветом. Постепенно образуются все новые и новые волокна, которые окружают ядро хрусталика все новыми и новыми слоями.

Рис. 4. Схема развития хрусталика млекопитающих. Стадия I - микрофотографии глаза мыши на 10 (левое изображение) и 11 (правое изображение) дни внутриутробного развития. К участку формирующейся сетчатки (1) примыкает участок эктодермы — зачаток хрусталика (2). Стадия II - образование эпителиального пузырька. Стадия III и IV - образование первичных волоконных клеток под воздействием ростовых факторов сетчатки. Стадии V -VIII - формирование вторичных волоконных клеток. Красным цветом обозначен слой эпителиальных клеток, которые образуют первый слой вторичных волоконных клетое. Впоследствии они окружаются все новыми и новыми слоями, вторичных волоконных клеток. Микрофотография: http://www.med.unc.edu/embryoimages/unit-eye/eyehtms/eye009.htm

Рис. 5. Участок эпителиального слоя хрусталика. Стрелки указывают делящиеся клетки, в верхней части микрофотографии хорошо видны меридиональные ряды клеток. (Окраска гематоксилин-эозином, Х200)

Окончательное формирование волоконных клеток происходит в процессе их «движения» к ядерной области хрусталика, образованной первичными волоконными клетками. Во время этого «движения» клетки постепенно теряют органеллы. В результате центральная часть хрусталика, через которую и проходит основной световой поток, свободна от органелл. Это является важным фактором, уменьшающим светорассеяние в ткани хрусталика. На рисунке 6 представлена микрофотография участка сагиттального среза хрусталика цыплёнка, где показана резкая граница между зонами хрусталика, еще содержащей органеллы (зеленым цветом окрашены митохондрии, красно-оранжевым ядра) и свободной от них.

Интенсивные метаболические процессы, сопровождающие формирование хрусталика требуют интенсивного обмена, поэтому при внутриутробном развитии хрусталик окружен специальной сосудистой оболочкой. К моменту прорезывания глаза хрусталик, в основном уже сформирован, и питающая его кровеносная система рассасывается. Остатки сосудистой оболочки можно наблюдать, например, у крысят в течение 1-2 дней после прорезывания глаз с помощью щелевой лампы.

Рис. 6. Зоны хрусталика содержащая и свободная от органелл. Микрофотография участка сагиттального среза хрусталика цыплёнка. Зеленым цветом окрашены митохондрии, красно-оранжевым ядра. (Из работы Ваэзпеи е1 а1.,

На рисунке 7 показано строение полностью сформированного хрусталика. В нем выделяют ядерную зону, состоящую в основном из первичных волоконных клеток. Ядерная зона окружена корковой или кортикальной зоной, состоящей из вновь сформированных волокон. При этом в кортикальной зоне или кортексе выделяют два вида волоконных клеток - без органелл и содержащих клеточные органеллы.

1992)

Передний полюс

Эпителий хрусталика

Задний полюс

Капсула

Рис. 7. Строение хрусталика млекопитающих

Снаружи хрусталик покрыт гликопротеиновой оболочкой - капсулой, которая продуцируется клетками хрусталика. Капсула по передней поверхности изнутри выстлана клетками плоского кубического эпителия.

Основные функции хрусталика

Хрусталик в глазу выполняет две основные функции. Это функция аккомодации и функция защиты сетчатки от повреждающего воздействия света ультрафиолетового и сине-фиолетового диапазона. Механизмы аккомодации будет подробно описаны далее, а здесь коротко остановимся на светофильт-рующей функции хрусталика (Hains et al., 2006b)

Хрусталики многих животных, ведущих дневной образ жизни, содержат вещества, поглощающие свет в области 300-400 nm (Van, 1971b; Van, 1971с). Хромофорами служат соединения различных химических групп. Так в хрусталиках у рыб содержатся микоспорино-подобные аминокислоты, которые рыбы получают с пищей из водорослей (Shick et al., 2002). В хрусталика дневного геккона (Lygodactylus picturatus) содержится 3,4-дидигидрофенол, связанный с кристаллинами (Werten et al., 2000). У приматов, серых белок (Spermophilus tridecemlineatus), и рыбок гурами (Trichogaster) в качестве УФ фильтров используются производные триптофана (Truscott et al., 1992; Van, 1971a; Van, 1971b). При этом хрусталики лабораторных животных, таких как крысы, кролики, мыши, а также крупнорогатого скота и кур не содержат УФ фильтров. Морская свинка содержит высокий уровень NADPH, который также как и кинуренин может выступать в роли УФ фильтра (Truscott, 2005). На рисунке 8 представлены фотографии хрусталиков морской свинки и серой белки.

Представленные данные показывают, отсутствие явной корреляции между видовой принадлежностью животных или средой обитания и наличием или отсутствием хромофоров в хрусталике. Более того, не всегда понятен смысл присутствия хромофоров в хрусталике. Например, если, обитающей в прозрачной и неглубокой воде рыбке гурами, необходимо защищаться от воздействия ультрафиолета, то для чего окрашенный кинуренином хрусталик

11 морской глубоководной рыбе Stylephorus chordatus остается загадкой. Тем не менее, можно считать доказанным, что у дневных сухопутных животных окрашенный хрусталик выполняет функцию светофильтра, защищающего сетчатку от опасности повреждающего действия ультрафиолетового и сине-фиолетового света (Cuthbertson et al., 2009; Meyers et al., 2004; Nolan et al., 2009; Wu et al., 2006).

Рис. 8. Хрусталик морской свинки (А) и серой белки (Б), (из работы (Hains et al., 2006)

На рисунке 9 представлена фотография хрусталика человека пятидесяти лет. Хорошо видно, что центральная часть хрусталика окрашена в желтый цвет. Помимо этого видно, что в этой области хрусталика отсутствуют опти

Рис. 9. Возрастное пожелтение хрусталика человека. Представлен хрусталик 50-летнего человека (из работы Таксой, 2005).

Однако желтое окрашивание появляется в хрусталике не сразу. Более того, хрусталик новорожденных прозрачен и для ультрафиолета. На рисунке 10 представлены спектры пропускания хрусталиков детей разного возраста. Можно видеть, в области 300 - 350 нм имеется повышенное оптическое пропускание - так называемое "ультрафиолетовое окно". У новорожденных оно весьма велико и составляет около 20%. С возрастом пропускание в этой области спектра уменьшается и примерно к 20 годам исчезает (Федорович и др., 1994).

Длина волны (пт)

Рис. 10. Спектры пропускания хрусталиков глаза детей разного возраста: 1 -новорожденных; 2-5 месяцев; 3-8 лет; 4-14 лет (из работы Федорович и др., 1994).

В видимой области спектра оптическое пропускание практически не меняется до 30-летнего возраста. После 30 лет процесс пожелтения хрусталика ускоряется, происходит смещение спектра его пропускания в длинноволновую область видимой области спектра.

Скорость пожелтения для разных хрусталиков весьма индивидуальна. Это следует из рисунка 11, на котором представлено положение спектральной точки 50%-ного пропускания для индивидуальных хрусталиков для разных возрастов. Видно, что даже в зрелом возрасте спектры пропускания хрусталиков иногда близки к спектрам пропускания "молодых" хрусталиков (Зак и др., 1995; Островский и др., 1994).

60 50 40

Ч о

Н 30 о со о.

3 20 ш ю о

Рис. 11. Положение спектральной точки 50%-ного пропускания для индивидуальных хрусталиков для разных возрастов. (Из работы Зак и др., 1995)

Необходимо отметить высокую вариабельность этого параметра. Даже в зрелом возрасте спектры пропускания хрусталиков иногда близки к спектрам пропускания "молодых" хрусталиков. Поэтому авторы исследования сгруппировали спектры пропускания индивидуальных хрусталиков по принципу близкого положения спектральных точек их 50%-ного пропускания (Рис. 11). В результате удалось получить серию усредненных спектров пропускания хрусталиков, характеризующих их возрастное пожелтение (Рис. 12). Исходя из этого, М.А. Островским и соавторами еще в 80х годах прошлого века был разработан искусственный желтый хрусталик "Спектр", имитирующий окраску хрусталика человека 40 - 50-летнего возраста. Тогда же производство таких хрусталиков было налажено в МНТК «Микрохирургии глаза». Анализ отдаленных результатов имплантаций более 1 миллиона 300 тысяч таких хрусталиков показал, что они надежно защищают сетчатку и пигментный эпителий от опасности фотоповреждения и заметно улучшают качество зрительного восприятия (Тахчиди и др., 2007)

Длина волны (нм)

Рис. 12. Усредненные спектры пропускания хрусталиков глаза человека, сгруппированные по принципу близкого положения спектральной точки их 50%-ного пропускания: 1 - < 415 нм (11 глаз); 2 - 415 - 420нм (15 глаз); 3 -420 - 430 нм (16 глаз); 4 - 430 - 450 нм (13 глаз); 5 - 450 - 470 нм (6 глаз); 6 ->470 нм (6 глаз). (Из работы Зак и др., 1995).

Пожелтение хрусталика у человека является результатом фотохимических превращений триптофана с образованием кинуренина, 3-ОН-кинуренина и 3-ОН-кинуренина-О-гликозида (Рис. 13). Эти соединения хорошо поглощают свет в диапазоне 300-400 нм.

В хрусталиках молодых людей основным соединением, поглощающим свет в диапазоне 300 - 400 нм, является 3-ОН-кинуренин. С помощью флуоресцентной спектроскопии высокого временного разрешения было показано, что время жизни возбужденного состояния этого вещества очень мало и составляет пикосекунды. Это означает, что в результате взаимодействия молекулы в возбужденном состоянии с окружающей его средой происходит быстрое рассеяние поглощенной энергии в тепло. Иными словами 3-ОН-кинуренин, поглощая световую энергию в диапазоне 300-400 нм, во-первых, защищает сетчатку от фотоповреждения и, во-вторых, защищает белки самого хрусталика, так как вследствие быстрой диссипации энергии вероятность образования активных форм кислорода под действие света резко снижается (Dillon et al., 1990).

ОН

3-ОН-кинуренин

Рис. 13. Триптофан и его фотопроизводные: кинуренин, 3-ОН-кинуренин и 3 -ОН-кинуренина-О-гликозид

Показано, что в хрусталике радиоактивно меченый триптофан быстро превращается в кинуренин (КУ), 3-гидроксикинуренин (ЗГКУ) и 3-гидроксикинуренина гликозид (ЗГКУГ), а также в О-гликозид 4-(2-амино -3-гидроксифенил)-4-оксобутановой кислоты. Удаляются эти соединения из хрусталика за счет прямой диффузии через капсулу. Время полужизни ЗГКУГ в хрусталике составляет от 7 до 40 часов. (Truscott et al., 1994; Wood et al., 1993).

Концентрация в хрусталике ЗГКУГ с возрастом падает, происходит его связывание с белками - образуются так называемые желтые белки. Такие соединения продолжают отфильтровывать сине-фиолетовый свет, но вследствие иммобилизации хромофора у них резко снижается способность рассеивать поглощенную световую энергию и возрастает способность индуциро

16 вать образование активных форм кислорода (Мажуль и др., 2004). При освещении смеси ЗГКУГ с альфа-кристаллином образуются продукты по своим характеристикам сходные с белками из старых хрусталиков (Dillon et al., 1999).

Таким образом, пожелтение хрусталика у дневных животных можно рассматривать как физиологически целесообразный, приспособительный процесс, обеспечивающий оптическую, светофильтрующую защиту сетчатки от опасности повреждающего действия света сине-фиолетовой области спектра. При этом наличие хромофоров в хрусталике, которые могли бы вызывать фотохимическое повреждение белков хрусталика, компенсируется коротким временем жизни возбужденных состояний молекул хромофоров и практически отсутствием кислорода в ткани хрусталика (McNulty et al., 2004)

Механизмы аккомодации хрусталика

У большинства животных аккомодация производится внутриглазными мышцами. Мышцы могут осуществлять перемещение хрусталика вдоль оптической оси глаза или способствовать изменению кривизны хрусталика, меняя, таким образом, его оптическую силу. В некоторых случаях сокращение внутриглазных мышц изменяет кривизну роговицы. Встречается и комбинация всех трех механизмов. Перемещение хрусталика вдоль оптической оси глаза обеспечивает аккомодацию у рыб и амфибий. У амниот (пресмыкающиеся, птицы и млекопитающие) в аккомодации ведущую роль играет изменение кривизны поверхности хрусталика. Цилиарная мышца у этой группы животных прикреплена хрусталику по экватору с помощью специального ресничного тела. Интересно, что у птиц и рептилий цилиарная мышца разделена на две части - передняя часть управляет кривизной роговицы, задняя управляет кривизной хрусталика (Ott, 2006).

При расслабленной цилиарной мышце циннова связка растягивает хрусталик по экватору, хрусталик уплощен и глаз сфокусирован на бесконечность. При сокращении цилиарной мышцы натяжение волокон цинновой

17 связки ослабляется - хрусталик начинает за счет его собственной упругости -самопроизвольно округляться, то есть происходит «наводка резкости» на близлежащие предметы. Такая схема фокусировки для глаза человека была разработана еще Гельмгольцем, но, строго говоря, не полностью описывает этот процесс. Например, за рамками схемы остается следующее обстоятельство: если увеличение кривизны хрусталика зависит только от механических свойств самого хрусталика, то непонятно каким образом люди со старческой дальнозоркостью, у которых способность хрусталика увеличивать кривизну ограничена, способны фокусировать глаза на близкие предметы, напрягая мышцы глаза.

Пределы, в которых может происходить аккомодация, у разных видов существенно варьируют. Например, у некоторых нырковых уток пределы аккомодации составляют - 70-80 диоптрий (Sivak et al., 1985), а у большинства домашних животных пределы аккомодации довольно ограничены и, в общем, не превышают 2-3 диоптрии у собак, 4 диоптрии у кошек и менее 2 диоптрии у лошадей. Предел аккомодационной способности у человека составляет 15 диоптрий. С возрастом она падает на 2-3 диоптрий к 40 годам, а после 50 -60 лет падение аккомодационной способности равняется 1 диоптрии в год .

Результаты исследований на приматах (человек, павиан) показали, что структура и организация волокон является ключевым компонентом механизма аккомодации, поскольку от этого зависят упругие свойства хрусталика. Оказывается именно форма и распределение волоконных клеток кортекса определяет способность хрусталика к деформации, а значит и аккомодации. В серии работ Kuszak и соавт. было проведено моделирование строения хрусталиков животных разных таксономических групп. На рисунке 14 отображены базовые стадии такого исследования.

С помощью анализа растрового электронно-микроскопического изображения хрусталика получают значения его основных размеров, в том числе его диаметр, толщину, радиус кривизны передней и задней поверхностей, измеряют и размеры волоконных клеток - их длину, а также профили ширины и толщины. На основании полученных размеров строится 3-х мерное изображение хрусталика, на котором показано взаимное расположение вторичных волоконных клеток, поскольку именно они, являются основным участниками процесса аккомодации. С помощью этого метода, были построены модели четырех видов строения хрусталика, различающиеся по способу сращивания долей хрусталика - точечного (или пупочного - umbilical), линейного, Y и звездчатого сращения (Рис. 15).

Рис. 14. Моделирование строения хрусталика птицы на основе растровых электронно-микроскопических изображений. (А) Хрусталик взрослой курицы, увеличение 30 раз. (Б) При увеличении в 300 раз видны отдельные концы волокон, достигающие точки сращения. Синим цветом показан угол (5 °) под которым сужаются волоконные клетки. (В) Компьютерная модель расположения волоконные клеток у птиц (по материалам Киэгак е1 а1., 2006).

В норме сращение долей хрусталика оптически прозрачно, но в некоторых случаях, как например, при возникновении помутнения хрусталика, становится хорошо видимым. Так звездчатое сращение хорошо различимо на фотографии глаза человека с наследственной катарактой (Рис. 15).

Как следует из приведенных фактов, способы упаковки волоконных клеток хрусталиков животных разных таксонометрических групп похожи между собой. Возникает вопрос: если строение хрусталика, похоже, но не идентично между видами, то не исключено может быть, что различия в степени аккомодации являются результатом различий в организации и структуре волокон?

В этой связи была количественно изучена структура и организация волокон в хрусталиках животных часто используемых в экспериментальных исследованиях (мышей, крупного рогатого скота (КРС), лягушек, кроликов и кур) (Кизгак е1 а1., 2006).

Линейное сращение: кролики и амфибии

У - сращение: грызуны, кошачьи, псовые, свиньи, парно и непарнокопытные

Точечное (пупочное) сращение: птицы и рептилии

Звёздчатое сращение: приматы (человек)

Рис. 15. Модели формирования 4 видов хрусталиков на основе различных видов сращения долей хрусталика, образованных вторичными волоконными клетками. Верхний ряд - точечное или «пупочное» сращение (птицы, рептилии). Второй ряд сверху - линейное сращение (кролик, амфибии). Третий ряд сверху - У-сращение (грызуны, кошачьи, псовые, свиньи, парно и непарнокопытные). Нижний ряд - звёздчатое сращение (высшие обезьяны, человек). (Из работы: Киэгак е1 а!., 2004)

Рис. 15. Звездчатое сращение долей хрусталика глаза человека хорошо видно при возникновении аутосомальной доминантной наследственной катаракты у представителей китайской семьи Хан. (А) левый и (Б) правый глаз, (из работы Zhang et al., 2004)

Оказалось, что в хрусталиках с точечным (пупочным) сращением (птицы) вторичные волоконные клетки развиваются с почти полным сужением переднего (антериорного) конца (85-90% сужение ширины и толщины на полюсе по отношению к ширине и толщине на экваторе). В хрусталиках с линейным сращением (лягушки, кролики) вторичные волокна сужаются только на 50 - 60%. В хрусталиках же с Y сращением (мыши, КРС) сужение самое маленькое - 25-40%. Сужение заднего (постериорного) конца у всех видов составляло 15 - 20%. Таким образом, способность хрусталика к аккомодации оказывается прямо связано с количественной разницей в структуре волокон и организацией их сращения (тип сращения). Напомним, что предел аккомодации у птиц (точечное или пупочное сращение) равен 70-80 диоптрий, а у домашних животных он не превышает 3-4 диоптрий. Это совпадает с тем фактом, что при аккомодации преимущественно изменяется кривизна передней поверхности хрусталика.

Молекулярный состав хрусталика и его рефрактивные свойства

Первые биохимические исследования хрусталика, упомянутые в литературе относятся к концу 19 века, когда Морнером были выделен растворимый белок хрусталика, названный кристаллином (цитируется по TROKEL,

1962). В пятидесятых годах прошлого века сначала В.Н. Орехович с сотрудниками, а потом Я.А. ЯеБпИс выделили из растворимых фракции белков хрусталика три фракции разного молекулярного веса, которые были названы аР- и у-кристаллины (ОгекЪоуюЬ, е1 а1., 1955; ЯЕЗШК, 1957).

На рисунке 16 представлена хроматограмма разделения водорастворимых белков гомогената кортекса хрусталика КРС с помощью эксклюзионной хроматографии. Хрусталик позвоночных содержит около 35 % белков, 1% липидов и 64% воды.

Рис. 16. Профиль элюции растворимых белков кортекса хрусталика КРС (колонка 2,5x90 см, Toyopearl HW55 fine).

1 - высокомолекулярные продукты (> 1000 кДа), 2 - а-кристаллин (700 кДа), 3 - Рн-кристаллин (160 кДа), 4 - рь-кристаллин (46 кДа), 5 - у-кристаллин (20 кДа).

Белки хрусталика принято разделять на водорастворимые (BP) и водо-нерастворимые (ВН), а водонерастворимые в свою очередь разделяются на белки растворимые и нерастворимые в мочевине (ВН-МР) и (ВН-МН) соответственно. Большая часть ВН-МР белков представлена полипептидами с массой в диапазоне 20 - 30 кДа. По данным масс-спектрометрии (ES-MS/MS) это в основном смеси аА- и аВ- кристаллина с Р- кристаллинами или смеси а- и (3-кристаллинов с белками цитоскелета - винментином и филензином, сшитые ковалентными связями. В свою очередь (ВН-МН) представляет собой смеси индивидуальных белков: как аА- и аВ- кристаллина, так и |3-кристаллина с винментином и филезином, также сшитые ковалентными связями (Harrington et al., 2007). Более 90% растворимых белков хрусталика приходится на долю а-, (3-, и у-кристаллинов (Bloemendal, 1977).

3- и у-кристаллины структурно близки между собой, и входят в суперсемейство, родственное стрессовым белкам прокариот, в то время как а-кристаллин принадлежит к семейству малых белков теплового шока (Bloemendal et al., 2004с). Соотношение а, [3, и у- кристаллинов в ткани хрусталика меняется с возрастом, что обусловлено преобладанием синтеза разных типов белков в онтогенезе (Zigler, Jr., 1978). Кроме кристаллинов, клетки хрусталика содержат белки цитоскелета, мембранные белки и цитоплазмати-ческие ферменты.

3-кристаллины - структурные белки, преобладающие по содержанию в хрусталике (до 60% всех кристаллинов) и специфичные для его ткани. (3-кристаллины - комплексная группа олигомерных белков. Субъединицы Р-кристаллинов комбинируются в разных сочетаниях с образованием гомо- и гетероолигомеров. у-кристаллины, имеющие молекулярный вес около 20 кДа, представлены семью изоформами и обозначаются латинскими индексами от А до F, а также индексом S. В процессе выделения с помощью эксклюзионной хроматографии у-кристаллины выходят одним пиком, а разделение их на отдельные полипептиды возможно с помощью ион-обменной хроматографии, у-кристаллины существуют только в виде мономера (Bloemendal et al., 1991; Sharma et al., 2009).

Молекулы p/y-кристаллинов имеют двухдоменную структуру. Каждый из доменов содержит по два гомологичных мотива «греческого ключа», составленного из 4 антипараллельных Р-структур, образующих клиновидный

Р-сэндвич с двусторонней симметрией. В отличие от у-кристаллинов, (3-кристаллины имеют удлиненные N-концевые и С-концевые последовательности - «руки», которые играют важную роль в олигомеризации (3-кристаллинов (Sergeev et al., 2004). а-Кристаллин - олигомерный белок, присутствующий в хрусталике всех позвоночных животных. Содержание а-кристаллина в хрусталике составляет не менее 35% массы водорастворимых белков (Bloemendal et al., 2004b). а-кристаллин хрусталика КРС состоит из двух типов субьединиц аА (Mr 19.8 kDa, 173 аминокислотных остатка ) и аВ (Mr 20,1 kDa, 175 аминокислотных остатков). В хрусталике аА- и аВ-субъединицы содержатся в соотношении 3:1.

Многочисленные исследования а-кристаллина in-vitro показали, что в физиологических условиях а-кристаллин представляет собой полидисперсную популяцию молекул, содержащих от 10 до 40 и более субъединиц (Aquilina et al., 2003). Было предложено несколько моделей четвертичной структуры а-кристаллина, однако по последним сведениям молекула представляет собой ажурную конструкцию с открытой внутренней полостью (Рис. 17) (Кривандин и др., 2010; Peschek et al., 2009b).

Рис. 17. ЗЭ реконструкция рекомбинантного аВ-кристаллина. (А) Общий вид. (В) ЗО модель на разрезе. (Из работы РезсЬек е1 а1., 2009).

Оптическая сила линзы зависит как от ее формы (радиусов кривизны), так и способности преломлять свет, то есть рефракции. Для изучения рефракции хрусталика используют, специальные препараты глаза, состоящие из фрагмента глазного яблока с радужной оболочкой и хрусталика с мышечным и связочным аппаратом.

Подвергая цилиарную мышцу электрической стимуляции, вызывают процесс аккомодации. Ход лучей исследуют с помощью плоскопараллельных лазерных пучков (Рис. 18). Рассмотрим, как изменяются параметры хрусталика у животных разных видов.

Форма и размер хрусталика широко варьируют, но при этом не коррелируют, ни с размерами глаза, ни с размерами самого животного. Например, относительный размер хрусталика глаза человека существенно меньше хрусталика глаза крысы, который практически полностью заполняет глазное яблоко. Точно так же сильно варьирует и распределение значений коэффициента преломления у животных разных видов. Изучение размера, формы, распределения значений коэффициента преломления среды, механических и иных свойств хрусталика показало, что эти изменения служат для адаптации животного к его среде обитания. Рассмотрим это на конкретных примерах.

Хрусталик рыб представляет собой сферу с очень крутым градиентом коэффициента преломления, это необходимо для обеспечения необходимой рефрактивной мощности линзы с минимумом сферических аберраций. В целом, хрусталик рыб обладает большей оптической силой, чем хрусталик сухопутных животных, потому что рыбам необходимо компенсировать снижение оптической силы передней камеры глаза, которое возникает вследствие небольшой разницы между коэффициентами преломления воды и роговицы.

Хрусталик крысы также близок по форме к сфере и имеет самый крутой градиент коэффициента преломления среди исследованных животных: от 1.38 на краю до 1.5 в центре. Такое изменение наблюдается на очень коротком расстоянии, равным всего 2 мм.

Рис. 18. Прохождение световых лучей с длинной волны 633 нм (а) и 532 нм (В) через хрусталик свиньи в экваториальной плоскости (из работы Р1ег8сюпек еХ а1., 2005).

Максимальная величина коэффициента преломления хрусталика в районе главной оптической оси крысы равняется коэффициенту преломления чистого белка, то есть раствору белка с содержанием воды, стремящимся к нулю. Поэтому хрусталик крысы очень тверд и практически не обладает способностью к аккомодации. Действительно, в ориентации грызунов в пространстве ведущую роль играют осязание и обоняние.

Градиенты коэффициентов преломления в хрусталиках свиньи или крупного рогатого скота совпадают и хорошо описываются полиномом второй степени (Рис. 19) (Р1ег8сюпек, 1989; Р1егзсюпек ег а1., 2005).

Рис. 19. Профиль градиента коэффициента преломления в направлении от главной оптической оси к краю хрусталика для света с длинной волн (а) 633 пгп и (b) 532 nm (из работы Pierscionek et al., 2005).

Яркой иллюстрацией того, что градиент коэффициента преломления и, соответственно, оптическая сила хрусталика зависит от белкового состава слоев клеток, образующих хрусталик, служит работа Кеепап и соавторов (Keenan et al., 2008). Авторы исследования послойно, с помощью мягкого вращения в буфере, снимали ткани хрусталика свиньи и анализировали полученные фракции. Оказалось, что по направлению от наружных к внутренним слоям уменьшается количество а- и [3-кристаллина, в то время как количество у-кристаллина и нерастворимых белков увеличивается (Таблица 1). Поскольку у-кристаллин обладает наивысшим значением инкремента коэффициента преломления среди всех кристаллинов (Pierscionek et al., 1987), то ясно, что градиент коэффициента преломления формируется за счет роста количества у-кристаллина по отношениею к а- и (3-кристаллинам.

Таблица 1. Содержание ос-, Р- и у-кристаллина и нерастворимых белков по отношению к общему белку в наружных и внутренних слоях хрусталика (из работы Кеепап е1 а1., 2008).

Наружные слои Внутренние слои

-кристаллин - 45% а-кристаллин - 35% у-кристаллин - 12% Нерастворимые белки - 8% ß-кристаллин - 35% а-кристаллин - 22% у-кристаллин - 18% Нерастворимые белки - 25%

Градиент коэффициента преломления хрусталика человека и приматов присутствует только в кортикальном слое. Этим хрусталик существенно отличается от хрусталиков животных остальных исследованных видов. В ядерном отделе градиент коэффициента преломления практически неизменен, небольшая вариация от 1.39 до 1.41 получена для двух длин волн света, использованного для исследования. Этот результат совпадает с данными по величинам градиентов концентрации белка и воды, а также акустическим градиентом в хрусталике человека (De Körte et al., 1994; Fagerholm et al., 1981; Siebinga et al., 1991).

На рисунке 20 представлена зависимость коэффициента преломления хрусталика от расстояния от его передней поверхности, эта зависимость описывается полиномом 4 степени (Pierscionek, 1997).

Информация о градиенте коэффициента преломления хрусталиков других приматов достаточно скудна: так для одного образца хрусталика гиббона получено значение градиента коэффициента преломления аналогичное хрусталику человека. Как известно, гиббоны принадлежат к семейству обезьян наиболее близких к человеку, условия обитания и образ жизни которых определяют их зрительные потребности, которые достаточно близки зрительным потребностям человека. По всей видимости, такое устройство хрусталика приматов необходимо для точной и быстрой аккомодации хрусталика . А I х

Л X ш

X няз о.

•е 0) о.

1.10-1 1.402 1.4 1

1.34

53 года 1 1 » 0 со но ф 3

01 ш ш о

X >> О

400 300 200

О (1.5 1 1.5 : 3 3.5 -1 4.5

Расстояние от передней поверхности (мм)

-3 -2 -I 0

Радиус экватора (мм)

Рис. 20. Распределение коэффициентов преломления и содержания белка в хрусталике. А - Зависимость коэффициента преломления хрусталика 53х-летнего человека от расстояния от его передней поверхности, (из работы Р1ег8сюпек, 1997). Б - Распределение количества белка вдоль оси экватора хрусталика человека (из работы Аи§из1еуп, 2010).

Таким образом, строение хрусталика представляет возможность тонкой регулировки его оптических свойств для достижения максимальной адаптации зрительной системы к среде обитания организма.

Механизмы, обеспечивающие прозрачность хрусталика

Первые попытки подойти к вопросу о молекулярных основах прозрачности хрусталика были предприняты в 1962 (Тгоке1, 1962). Б. Тгоке1 на основе исследования оптических свойств изолированного хрусталика кролика разделил физические явления, влияющие на прозрачность хрусталика на две группы: (1) явления отражения и преломления света на больших частицах и (2) Реллеевское светорассеяние на малых частицах.

Первая группа проявляется в дифракции и отражении света. Так свидетельством дифракции света в хрусталике является хрусталиковое хало, обнаруженное еще в середине 19 века. Впоследствии было показано, что радиальная дифракционная решетка моделирует возникновение этого явления. Отражение света происходит, в основном, на мембранах кортикальных клеток (Рис.21).

4 ч / гт /

Клеточная стенка

Цитоплазма волоконной клетки

Рис. 21. Отражение и рассеяние света на мембранах клеток хрусталика.

На гладких поверхностях происходит зеркальное отражение, а на нерегулярных структурах происходит диффузное отражение. Мы полагаем, что в ядерной области отражение света сведено к минимуму, так как большая часть волоконных клеток ядерной зоны расположены параллельно главной оптической оси хрусталика. При этом место сращения долей ядра хорошо видно благодаря иррегулярным интердигитальным мембранным контактам клеток (см. Рис. 15). Интенсивность Реллеевского светорассеяния, которое можно было бы ожидать от раствора белка в такой высокой концентрации, оказалось неизмеримо мало. Поэтому 8. Тгоке1 высказал идею о паракристалличе-ской упаковке растворимых белков цитоплазмы волоконных клеток хрусталика. То есть белки хрусталика образуют структуру чем-то, похожую на кристалл. Позднее О.В. Вепеёек разработал теоретические основы прозрачности хрусталика, в основе которых лежало представление о молекулах кристалли-нов как о твердых сферах разного диаметра (Вепеёек, 1971). При этом оказалось, что паракристаллическое состояние белков хрусталика не является необходимым для обеспечения прозрачности хрусталика. Минимальное светорассеяние концентрированного раствора белка, которым и является цитоплазма клеток хрусталика, может быть обеспечена пространственным упорядочением близлежащих молекул белка, которое в свою очередь является результатом белок-белковых взаимодействий.

В своей, ставшей уже классической работе, М. Delaye и A. Tardieu (Delaye et al., 1983), с помощью метода малоуглового рассеяния рентгеновских лучей показали, что кривая рассеяния кортикальной области хрусталика имеет локальный максимум. Наличие такого максимума свидетельствовало о наличии периодичности в концентрации белка. Важным результатом исследования оказалось то, что расстояние между двумя максимумами концентрации совпадало с диаметром молекулы альфа-кристаллина. Измерение интенсивности рассеяния экстракта из кортекса хрусталика при концентрации белка, равной 510 мг/мл, то есть концентрации растворимого белка в хрусталике, показало, что кривая имеет точно такой же максимум как и кортекс хрусталика. При разведении раствора величина пика уменьшалась, а при концентрации, меньшей 100 мг/мл пропадала. Это означало, что при разведении ближний порядок упаковки белка пропадал. Зависимость интенсивности рассеяния от концентрации белка имела кол околообразную форму: до концентрации 150 мг/мл наблюдался рост интенсивности рассеяния, при дальнейшем увеличении концентрации интенсивность рассеяния падала.

Таким образом, интенсивность рассеяния при концентрациях, равных 3 и 510 мг/мл, оказывалась одинаковой. Авторы предположили, что в разведенном растворе, когда расстояние между молекулами больше чем их диметр, флуктуации концентрации приводят к тому, что рефрактивный индекс сильно варьирует (от значения для чистого растворителя, до значения до чистого белка), а значит, на таких флуктуациях усиливается светорассеяние. Если же расстояние между молекулами уменьшается, то флуктуации концентрации и, соответственно, флуктуации коэффициента преломления становятся меньше, и светорассеяние уменьшается.

F.A. Bettelheim и E.L. Siew проанализировав поведение модельной системы, состоящий из сфер растворенных в среде с другим коэффициентом преломления, показали, что такая модель адекватно описывает экспериментальные данные Delaye и Tardieu (Bettelheim et al., 1983). Таким образом, две независимые исследовательские группы нашли, что интенсивность светорассеяния увеличивается с увеличением концентрации белка как в реальном растворе, так и в модельной системе, до 13% по объему, а затем уменьшается так, что рассеяние 60% раствора равняется рассеянию 1% раствора. Полученные данные означали, что при концентрациях выше 150 мг/мл оптическая среда становится более однородной и это происходит по причине снижения флуктуаций концентрации белка.

F.A. Bettelheim и A. Chen, измеряя зависимость интенсивности светорассеяния растворов кристаллинов от угла, концентрации и температуры, показали, что при смешивании а-, Р~, и у- кристаллинов в тех же соотношениях, как и в хрусталике, наблюдаются отрицательное изменение энтальпии и энтропии, это означает «стабилизацию» раствора, иными словами при смешивании а-, и у- кристаллинов происходит взаимодействие белков с образованием некоторой структуры (Bettelheim et al., 1998). В недавнем исследовании проведенным с помощью рассеяния нейтронов и молекулярной динамики, было показано, что физической основой такого взаимодействия являются слабые взаимодействия (Stradner et al., 2007).

Проведенные нами исследования методом малоуглового рассеяния рентгеновских лучей супрамолекулярных структур образцов кортекса и ядра целого хрусталика животных разных классов (рыбы, земноводные, млекопитающие) показали, что близкий порядок упаковки белков присутствует в кортексе хрусталиков всех изученных животных: карпа (Cyprinus Carpió), лягушки (Rana Temporaria), белых беспородных крыс (Кривандин и др., 1999). Анализ ядерной области хрусталика крысы показал отсутствие ближнего порядка в упаковке белков, тогда как у карпа и КРС ближний порядок присутствовал. Следует отметить, что при исследовании только что выделенного целого хрусталика лягушки ближний порядок в упаковке белков не был обнаружен, однако после хранения хрусталика при 4 0 С в течение двух дней было отмечено появление характерного максимума, свидетельствующего о появлении ближнего порядка в упаковке кристаллинов (Кривандин, 1997). Это означает, что при хранении в хрусталике происходят какие-то изменения, возможно, это перераспределение кристаллинов по отделам хрусталика.

Недавние исследования А. Mirarefi и сотр. подтвердили, полученные нами результаты (Mirarefi et al., 2010). Был исследован эффект состава и концентрации кристаллинов на микроструктуру интактных хрусталиков КРС (37 °С) в сравнении с хрусталиками трех видов антарктических рыб (- 2 °С) и субтропического большеглазого тунца (18 °С). Оказалось, что в кортикальном отделе хрусталиков всех исследованных животных упаковка белка имеет ближний порядок, тогда как характерный пик малоуглового рассеяния рентгеновских лучей в ядерной области отсутствует, что свидетельствует об отсутствии ближнего порядка в упаковке белка. Работа была проведена на срезах хрусталиков, что позволило более точно, чем в нашем исследовании, позиционировать исследуемый отдел хрусталика. При микрохирургическом выделении образца ткани, использованное нами, существует вероятность загрязнения его другими тканями, поэтому мы полагаем, что этот фактор, а также использование замороженных образцов хрусталика КРС объясняет различия в результатах.

Как для хрусталиков КРС так и для хрусталиков рыб наличие характеристического пика в кортикальном отделе было соотнесено с плотной суспензией а-кристаллина.

Отсутствие пика рассеяния в ядерном отделе свидетельствовало об отсутствии характеристического расстояния между двумя флуктуациями плотности белков, несмотря на наличие жидкокристаллического порядка в упаковке кристаллинов.

Хрусталик рыб имеет концентрацию белка около 900 мг/мл, а значит и меньшую подвижность молекул белка. Это должно влиять как на размер флуктуации плотности белка. Действительно в работе Mirarefi и сотр. эта величина равна 18 нм при 37 °С для КРС, для большеглазого тунца Thunnus obesus - 13 nm при 18 °С и для антарктической рыбы Pagothenia borchgrevinki - 12 nm при -2 °С.

Mirarefi и сотр. высказали для объяснения обнаруженного феномена две гипотезы. Первая - поскольку белки в ядерной области образованы на ранних стадиях развития организма, то можно ожидать, что у них вследствие посттрансляционных модификаций увеличена склонность к агрегации, а наличие агрегатов уширяет распределение по размерам рассеивающих частиц. Наличие в ядре хрусталика модифицированных белков, действительно было показано в целом ряде работ (Andley, 2007; Lampi et al., 2002; MacCoss et al., 2002; Ueda et al., 2002).

Вторая гипотеза - увеличение полидисперсности может быть и результатом изменений локальной упаковки белков. Иными словами в ядре отсутствуют флуктуации концентрации, поэтому отсутствует и характеристический пик рассеяния. Вторая гипотеза - основана на факте увеличения относительной концентрации у-кристаллина по отношению к а/(3- кристаллинам (см Pierscionec). Молекулы у-кристаллина, занимая все свободное пространство между молекулами а-кристаллина, не допускают флуктуации плотности белка. Действительно, исследование хрусталиков методом ДЛС показано, что, несмотря на высокую концентрацию 400 мг/мл, объем белковой фракции составляет П-0.29 (плотность белка =1.35 г/мл). Поэтому белки остаются подвижными и диффундируют со скоростью, пропорциональной их размеру (Ansari et al., 2001; Latina et al., 1987).

С нашей точки зрения более правдоподобной является вторая гипотеза, поскольку количество модифицированного белка относительно нативного белка в хрусталике несравнимо мало (см. цитированные выше работы).

Таким образом, наличие флуктуаций концентраций белка отличает кортикальную часть хрусталика от ядерной. Это должно проявляться в увеличенном светорассеянии кортекса по сравнению с ядром. Действительно, светорассеяние хрусталика целиком существенно превосходит светорассеяние его ядерной области (Nomura et al., 2000).

Конечно, в клетки кортикальной области содержат клеточные органел-лы, которые могут вносить свой вклад в светорассеяние, но часть кортекса, находящаяся в передней и задней зонах хрусталика в районе ядра, и свободная от органелл, также превосходит светорассеяние ядра (Yaroslavsky et al., 1994).

Подводя итог сказанному можно сказать, что полученные в последние годы сведения в какой-то мере возрождают идею паракристаллической упаковке белка в хрусталике, высказанную около 50 лет назад S. Trokel.

Механизмы нарушения прозрачности хрусталика

Помутнение хрусталика или катаракта является основной причиной слабовидения и слепоты в мире (WHO, 2005) Помутнения хрусталика принято классифицировать как по локализации помутнения (Рис. 22), так и по этиологической причине - возрастная, диабетическая, радиационная и т.д.

Свет Ш: v vf^'

Ядерная Задне- Передне-кортикальная Диффузная

Рис. 22. Классификация помутнений хрусталика (катаракты) по локализации.

Однако вопрос, - «какие именно структуры в хрусталике являются центрами светорассеивания?» - долгое время оставался открытым. Пути решения этой задачи наметились лишь в последнее десятилетие. Это связано со специфическими особенностями предмета исследования. Например, при исследовании помутневших хрусталиков обнаружено множество гистологических изменений в ткани: набухание волоконных клеток, гибель эпителия и т.д., однако, соотнести локализацию таких изменений с местом помутнения затруднительно. Вероятно поэтому, в качестве рабочей гипотезы принято, что светорассеяние хрусталика определяется комплексом изменений на уровне архитектуры клеток, на уровне субклеточных структур и молекулярном уровне организации.

В литературе описаны различные морфологические изменения хрусталика, сопровождающие развитии катаракты того или иного генеза. В частности, изменение архитектуры клеток в виде образования большого количества набухших волоконных клеток находят при диабетической катаракте (Клпо-БЬка, 1974). Нарушение упаковки волоконных клеток кортикальной зоны хрусталика, происходящее вследствие гибели клеток эпителия - зачатков волоконных клеток, принято считать причиной возникновения помутнений при радиационной катаракте (\¥о^и1 е1 а1., 1989).

Массированный распад клеток с потерей цитоплазмы накоплением продуктов распада - кластеров глобул и агрегатов мембранных фрагментов сопровождает развитие задней субкапсулярной катаракты у человека (Сге1§Ь-гоп ег а1., 1978; БШеу & а1., 1976).

Однако точно соотнести локализацию помутнения и изменения гистологической картины хрусталика в большинстве случаев пока не представляется возможным. Исключение составляет работа Соз1е11о и сотр (Соз1е11о е1 а1., 1992). Авторы с помощью электронной микроскопии исследовали морфологию клеток в хрусталиках с ядерным помутнением. При сравнении образцов ткани прозрачных и помутневших участков одного и того же хрусталика оказалось, что между ними не существует различий ни в архитектуре ткани, ни в структуре, составляющих её клеток. Тем не менее, было обнаружено различие в морфологии ткани прозрачного и помутневшего участка хрусталика, которое можно действительно связать с возникновением помутнения.

ОПШапс! и сотр обнаружили в волоконных клетках хрусталика микроскопические объекты, которые они назвали мультиламеллярными телами (ОПШапс! е1 а1., 2001). Мультиламеллярные тела представляют собой белковые включения в цитоплазму волоконных клеток, окруженные несколькими фосфолипидными слоями, диаметром около 1 мкм. Количество мультила-меллярных тел в помутневшем хрусталике было превышено по сравнению с прозрачным хрусталиком примерно в 10 раз. С использованием теории светорассеяния Ми, авторы показали, что обнаруживаемое при помутнении хрусталика количество мультиламеллярных тел может обеспечить достаточный уровень светорассеяния (Costello et al., 2010; Gilliland et al., 2008; Gilliland et al., 2004).

В 1971 году Benedek предположил, что агрегация белка, появление кластеров высокомолекулярных продуктов в хрусталике и, как следствие, флуктуации концентрации белка - главная причина помутнения хрусталика. Молекулярный вес и диаметр таких агрегатов был рассчитан теоретически и равнялся 50 МДа и 50 нм, соответственно (Benedek, 1971). Действительно, агрегаты таких размеров найдены в стареющих и катарактальных хрусталиках (Jedziniak et al., 1973). Поэтому основной причиной возникновения агрегации белка в хрусталике были названы посттрансляционные модификации белков, которые во множестве были обнаружены в как в стареющих, так и помутневших хрусталиках (Takemoto, 1996; Takemoto et al., 2000; Takemoto, 1997; Tsur et al., 2005; Ueda et al., 2002)

Вместе с тем, оценить непосредственно уровень флуктуаций концентрации белка в клетках хрусталика и соотнести его с уровнем светорассеяния долгое время не удавалось. Однако, уже упомянутой группе исследователей под руководством профессора Joseph Costello удалась провести соответствующее исследование S. (Metlapally et al., 2008). В связи с тем, что полученные результаты дают прямой ответ на вопрос о наличии в цитоплазме клеток хрусталика флуктуаций белка, рассеивающих свет. Рассмотрим эту работу подробнее.

Было проведено исследование связи светорассеяние и текстуры цитоплазмы клеток из ядерной области прозрачных и хрусталиков с выраженным ядерным помутнением. При этом был использован следующий подход. Состояние белка цитоплазмы, то есть пространственное распределение белковых молекул, было зафиксировано с помощью ковалентных химических связей, а затем полученная структура была исследована с помощью электронного микроскопа. Для этого с помощью вибратома были изготовлены сагиттальные срезы хрусталика толщиной 200 мкм. Срезы были зафиксированы с помощью смеси глютарового альдегида, параформальдегида и таниновой кислоты. Для придания электронной плотности структуре была использована обработка четырех окисью осмия с последующей обработкой ацетатом урана, который количественно связывается молекулами белка. Срезы импрегниро-вали эпоксидной смолой и из полученных образцов готовили ультратонкие срезы (50 нм) перпендикулярные оптической оси хрусталика. Препараты были исследованы с помощью электронного микроскопа при относительно небольшом увеличении (Х6500). Среди множества фотографий были отобраны фотографии без явных препаративных дефектов и свободные от мембран. Типичные образцы фотографий представлены на рисунке 23, где показаны фотографии участков цитоплазмы клеток из прозрачного и помутневшего хрусталика человека, а так же хрусталиков крысы катарактальной линии ОХУБ и белой беспородной крысы. Хорошо видно, что текстура цитоплазмы, отражающая количество белка в каждой точке изображения, в образцах прозрачных хрусталиков более гладкая. Необходимо отметить, что цитоплазма клеток прозрачных хрусталиков крысы является более гомогенной, чем цитоплазма клеток хрусталика человека. Это связано с тем, что концентрация белка в хрусталике крысы существенно превосходит концентрацию белка в хрусталике человека (см. выше).

Светорассеяние участков электронно-микроскопических фотографий, было рассчитано с помощью теории БеЬуе-ВиесЬе, которая связывает интенсивность светорассеяния со значением среднеквадратичных флуктуаций рефрактивного индекса оптически негомогенной среды. Как видно из кривых светорассеяния (Рис. 24), уровень текстуры цитоплазмы прямо связан с уровнем светорассеяния среды. Это означает, что именно флуктуации концентрации белка являются причиной светорассеяния в цитоплазме хрусталика.

Рис. 23. Текстура цитоплазмы клеток ядра хрусталика. А - Ядерная возрастная катаракта человека. Б - прозрачный хрусталик человека; В - хрусталик крысы линии ОХУ8; Г - прозрачный хрусталик крысы. Линия масштаба 0,5 мкм. (из работы Ме1:1ара11у еХ а1., 2008).

Рис. 24. Расчет светорассеяния хрусталиков на основе данных по текстуре плотности белка цитоплазмы с помощью теории Debye-Bueche (из работы Metlapally et al., 2008).

Таким образом, представленные данные указывают на существование двух типов центров светорассеяния в мутнеющем хрусталике. Это мультила-меллярные тела и флуктуация концентрации белка цитоплазмы.

Механизмы, поддерживающие прозрачность хрусталика

В предыдущей главе мы показали, что структура белка цитоплазмы имеет ключевое значение для обеспечения прозрачности хрусталика, а нарушение этой структуры ведет к увеличению светорассеяния в хрусталике и, в конечном итоге, к образованию помутнения хрусталика, то есть катаракте. Главной причиной нарушения структуры белка цитоплазмы является нарушение «правильных» белок-белковых взаимодействий, которое в свою очередь является результатом появления химически модифицированных белков.

Образование химически модифицированных белков - результат различных посттрансляционных преобразований, в частности окисления, деами-дирования, гликирования, протеолиза и т.д. (Hains et al., 2007; Lampi et al., 1997; Ma et al., 1998; Zhang et al., 2007a). При этом существует одно очень важное обстоятельство - белки хрусталика практически не обмениваются (Bloemendal et al., 2004). Это означает, что белки, которые были синтезированы еще на стадии эмбрионального развития глаза, во время образования эмбрионального ядра хрусталика, то есть самого центра хрусталика, должны служить в течение жизни организма. Поэтому в хрусталике функционируют мощные механизмы, которые противодействуют процессам посттрансляционных модификаций белков или блокируют их негативное воздействие. Эффективность таких механизмов доказывается тем фактом, что в природе жизнь животного оказывается, как правило, короче, чем время необходимое для развития катаракты. Отдельные исключение составляют человек и окружающие его домашние животные (собака, кошка, лошадь, попугай и т.д.), вследствие создания искусственной среды обитания или крупные морские млекопитающие (киты), практически, не имеющие врагов.

В общем случае систему защиты хрусталика можно разделить на три блока. Во-первых, это системы препятствующие возникновению посттрансляционных модификаций, которые включают в себя системы антиоксидант-ной защиты (Cui et al., 1993; Ganea et al., 2006; Leske et al., 1995; McCarty et al., 1996; McNeil et al., 2004; Wolf et al., 2005). Во-вторых, это система, лик

40 видирующая последствия влияния посттрансляционных модификаций, на конформацию белка, то есть шапероноподобная активность а-кристаллина (Horwitz et al., 1999; Horwitz, 2003). И в-третьих, это система элиминации поврежденных белков - юбиквитин-зависимый протеолиз (Shang et al., 2004; Zhang et al., 2007). Но, вероятно, самым начальным уровнем защиты хрусталика от повреждающего действия кислорода можно назвать само строение хрусталика. Отсутствие кровоснабжения органа и, как следствие, значимого метаболизма в ядерной области проводит к тому, что концентрация кислорода в ядерной области хрусталика не превышает 2 мм ртутного столба (McNulty et al., 2004).

Контроль уровня процессов свободно-радикального окисления - важнейшего фактора повреждения белков - происходит за счет мощной антиок-сидантной защиты, которая включает в себя как повышенное по сравнению с другими тканями содержание антиоксидантов, так и активные антиоксидант-ные ферментные системы: комплекс ферментов глютатионового цикла, ката-лазыа супероксид дисмутаза и антиоксидатный белок (Netto et al., 1996; Ohrloff et al., 1984a; Ohrloff et al., 1984b; Stadtman, 1990).

Важно отметить специфическую особенность хрусталика - система юбиквитинового протеолиза, которая в клетке удаляет поврежденные белки, ингибируется в условиях окислительного стресса (Shang et al., 1995; Shang et al., 1997; Shang et al., 2004). По предположению авторов это связано с тем, что основная задача при преодолении последствий окислительного стресса в хрусталике не удаление всех поврежденных белков, как в других тканях, а максимальная их репарация. Такая репарация осуществляется шаперонопо-добным и одновременно основным структурным белком - а-кристаллином (Horwitz, 1992). Более подробное изложение современных знаний о роли а-кристаллина в поддержании прозрачности хрусталика будет изложено далее, а здесь мы представим лишь общую характеристику действия этого белка.

Существуют две точки зрения на механизм действия а-кристаллина. Согласно одной точки зрения, а-кристаллин является шапероноподобным белком и его активность реализуется посредством образования стабильных комплексов с поврежденными белками. В результате этого количество денатурированных белков снижается, снижается и вероятность встречи денатурированных молекул, поэтому они не имеют возможности образовывать агрегаты. Согласно альтернативной точки зрения, а-кристаллин является истинным шапероном и при взаимодействии с поврежденным белком восстанавливает его нативную конформацию.

Важным элементом развития помутнения хрусталика является исчерпание способности а-кристаллина противодействовать агрегации поврежденных белков в хрусталике (Bloemendal, 2004). Происходит это, по существующим представлениям, вследствие того, что, во-первых, сам а-кристаллин подвергается посттрансляционным изменениям, в результате которых его шаперонная способность падает, и, во-вторых, по причине того, что количество мест связывания для поврежденных белков не бесконечно и когда-то они полностью заполняются. Поэтому неудивительно, что появилась идея «подхлестнуть» шаперонные способности этого белка с помощью воздействия низкомолекулярных веществ и таким путем задержать развитие помутнения хрусталика. Опубликовани несколько исследований, в которых изучается такая возможность (Аветисов et al., 2008; Clark et al., 1996; Kumar et al., 2009),

Цель исследования

Работа направлена на изучение механизмов поддержания прозрачности хрусталика глаза. При этом основной упор в исследовании делается на:

1. Выявление ключевого механизма нарушения прозрачности хрусталика.

2. Изучение молекулярных механизмов агрегации белков хрусталика, как основного процесса приводящего к возникновению помутнения хрусталика.

3. Исследование исследовании механизма торможения агрегации белков а-кристаллином, как важнейшего механизма поддержания прозрачности хрусталика.

4. Исследование механизма торможения агрегации белков некоторыми низкомолекулярными соединениями как возможными представителями нового класса антикатарактальных препаратов.

5. Изучении способности смеси гистидин содержащего дипептида (Ы-ацетил карнозина) и тетрамида (пантетина) тормозить развитие ультрафиолетовой катаракты у крыс.

Список литературы

Аветисов С.Э., Полунин Г.С., Шеремет H.JL, Макаров И.А., Федоров

1 A.A., Карпова O.E., Муранов К.О., Тимофеева А.К., Соустов JI.B., Челноков Е.В., Битюрин Н.М., Сапогова Н.В., Немов В.В., Болдырев A.A., Островский М.А. Поиск шаперон-подобных антикатарактальных пре-паратов-антиагрегантов кристаллинов хрусталика глаза. Сообщение четвёртое: Изучение воздействия смеси ди- и тетра-пептидов на «пролонгированной» модели ультрафиолет-индуцированной катаракты у крыс. Вестник офтальмологии 2008.- V.124, № 2,- С.12-16.

2 Зак П.П., Островский М.А. Желтизна оптических сред глаза в физиологии и патологии человеческого зрения. Сенсорные системы 1995.- V.9, № 1.- С.9-21.

3 Кривандин A.B., Муранов К.О. Сравнительное исследование надмолекулярной структуры кристаллинов в хрусталиках карпа, лягушки и крысы методом малоуглового рассеяния рентгеновских лучей. Биофизика 1999,- V.44, С.1088-1093.

4 Кривандин A.B., Муругова Т.Н., Куклин А.И., Муранов К.О., Полянский Н.Б., Аксёнов В.Л., Островский М.А. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ АЛЬФА-КРИСТАЛЛИНА МЕТОДОМ МАЛОУГЛОВОГО РАССЕЯНИЯ НЕЙТРОНОВ С ВАРИАЦИЕЙ КОНТРАСТА. Биофизика 2010,- Y.75, № 11.- С.1499-1507.

5 Логай, И. М. and Леус, Н. Ф. Биофизическая и биохимическая характеристики хрусталика. Веселовская, 3. Ф. Катаракта. 54-79. 2002. Киев, Книга плюс.

6 Мажуль В.М., Зайцева Е.М., Щербин Г., Чекина А.Ю., Голуб О.М. Фосфоресцентный анализ ткани хрусталика в норме и при катаракте. Белорусский Офтальм.Журн. 2004.- № 3.- С.16-21.

7 Островский М.А., Федорович И.Б., Елчанинов В.В., Кривандин А.В. Опасность повреждающего действия света на структуры глаза. Хрусталик как естественный светофильтр и объект фотоповреждения. Сенсорные системы 1994.- V.8, № 3-4,- С. 135-146.

8 Тахчиди Х.П., Линник Л.Ф., Островский М.А., Зак П.П. Отдаленные результаты наблюдений после имплантации искусственного хрусталика «Спектр» с естественной спектральной характеристикой. Офтальмохи-рургия 2007.- № 1,- С. 18-21.

9 Федорович И.Б., Зак П.П., Островский М.А. Повышенное УФ-пропускание хрусталика глаза в раннем детстве и его возрастное пожелтение. Доклады РАН 1994.- V.336, № 6.- С.835-837.

10 Andley U.P. Crystallins in the eye: Function and pathology. Prog.Retin.Eye Res. 2007,- V.26, № 1,- C.78-98.

11 Ansari R.R., Suh K.I., Dunker S., Kitaya N., Sebag J. Quantitative molecular characterization of bovine vitreous and lens with non-invasive dynamic light scattering. Exp.Eye Res. 2001,- V.73, № 6.- C.859-866.

12 Aquilina J.A., Benesch J.L., Bateman O.A., Slingsby C., Robinson C.V. Polydispersity of a mammalian chaperone: mass spectrometry reveals the population of oligomers in alphaB-crystallin. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2003,- V.100, № 19,- C.10611-10616.

13 Augusteyn R.C. On the growth and internal structure of the human lens. Exp.Eye Res. 2010,- V.90, № 6.- C.643-654.

14 Bassnett S., Beebe D.C. Coincident loss of mitochondria and nuclei during lens fiber cell differentiation. Dev.Dyn. 1992,- V.194, № 2.- C.85-93.

15 Benedek G.B. Theory of transparency of the eye. Appl.Opt. 1971.- V.10, № 3.- C.459-473.

16 Bettelheim F.A., Chen A. Thermodynamic stability of bovine alpha-cry stallin in its interactions with other bovine crystallins. Int.J.Biol.Macromol. 1998.- V.22, № 3-4,- C.247-252.

17 Bettelheim F.A., Siew E.L. Effect of change in concentration upon lens turbidity as predicted by the random fluctuation theory. Biophys.J. 1983.- V.41, № 1,- C.29-33.

18 Bloemendal H. The vertebrate eye lens. Science. 1977.- V.197, № 4299.-C.127-138.

19 Bloemendal H., De Jong W., Jaenicke R., Lubsen N.H., Slingsby C., Tardieu A. Ageing and vision: structure, stability and function of lens crystallins. Prog.Biophys.Mol.Biol. 2004.- V.86, № 3,- C.407-485.

20 Bloemendal H., de Jong W.W. Lens proteins and their genes. Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol. 1991.- V.41, C.259-281.

21 Clark J.I., Huang Q.L. Modulation of the chaperone-like activity of bovine alpha-crystallin. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1996.- V.93, № 26,- C. 1518515189.

22 Costello M.J., Johnsen S., Metlapally S., Gilliland K.O., Frame L., Balasubramanian D. Multilamellar spherical particles as potential sources of excessive light scattering in human age-related nuclear cataracts. Exp.Eye Res. 2010,- .

23 Costello M.J., Oliver T.N., Cobo L.M. Cellular architecture in age-related human nuclear cataracts. Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 1992,- V.33, № 11.-C.3209-3227.

24 Creighton M.O., Trevithick J.R., Mousa G.Y., Percy D.H., McKinna A.J., Dyson C., Maisel H., Bradley R. Globular bodies: a primary cause of the opacity in senile and diabetic posterior cortical subcapsular cataracts? Can.J.Ophthalmol. 1978,- V.13, № 3.- C.166-181.

25 Cui X.L., Lou M.F. The effect and recovery of long-term H202 exposure on lens morphology and biochemistry. Exp.Eye Res. 1993.- V.57, № 2.- C.157-167.

26 Cuthbertson F.M., Peirson S.N., Wulff K., Foster R.G., Downes S.M. Blue light-filtering intraocular lenses: review of potential benefits and side effects. J.Cataract Refract.Surg. 2009.- V.35, № 7. C. 1281-1297.

27 De Korte C.L., Van Der Steen A.F., Thijssen J.M., Duindam J.J., Otto C., Puppels G.J. Relation between local acoustic parameters and protein distribution in human and porcine eye lenses. Exp.Eye Res. 1994.- V.59, № 5.-C.617-627.

28 Delaye M., Tardieu A. Short-range order of crystallin proteins accounts for eye lens transparency. Nature. 1983,- V.302, № 5907,- C.415-417.

29 Dilley K.J., Bron A.J., Habgood J.O. Anterior polar and posterior subcapsular cataract in a patient with retinitis pigmentosa: a light-microscopic and ultrastructural study. Exp.Eye Res. 1976,- V.22, № 2,- C.155-167.

30 Dillon J., Atherton S.J. Time resolved spectroscopic studies on the intact human lens. Photochem.Photobiol. 1990.- V.51, № 4,- C.465-468.

31 Dillon J., Skonieczna M., Mandal K., Paik D. The photochemical attachment of the O-glucoside of 3-hydroxykynurenine to alpha-crystallin: a model for lenticular aging. Photochem.Photobiol. 1999,- V.69, № 2,- C.248-253.

32 Fagerholm P.P., Philipson B.T., Lindstrom B. Normal human lens - the distribution of protein. Exp.Eye Res. 1981,- V.33, № 6.- C.615-620.

33 Ganea E., Harding J.J. Glutathione-related enzymes and the eye. Curr.Eye Res. 2006,- V.31, № 1.- C.l-11.

34 Gilliland K.O., Freel C.D., Johnsen S., Craig F.W., Costello M.J. Distribution, spherical structure and predicted Mie scattering of multilamellar bodies in human age-related nuclear cataracts. Exp.Eye Res. 2004.- V.79, № 4.-C.563-576.

35 Gilliland K.O., Freel C.D., Lane C.W., Fowler W.C., Costello M.J. Multilamellar bodies as potential scattering particles in human age-related nuclear cataracts. Mol.Vis. 2001,- V.7, C.120-130.

36 Gilliland K.O., Johnsen S., Metlapally S., Costello M.J., Ramamurthy B., Krishna P.V., Balasubramanian D. Mie light scattering calculations for an Indian age-related nuclear cataract with a high density of multilamellar bodies. Mol.Vis. 2008,- V.14, C.572-582.

37 Glasser, A and Kaufman, P. L. Accommodation and presbyopia. Kaufman, P. L. and Aim, A. Adler's Physiology of the Eye. 10, 197-233. 2003. St Louis, Mosby.

38 Hains P.G., Simpanya M.F., Giblin F., Truscott R.J. UV filters in the lens of the thirteen lined ground squirrel (Spermophilus tridecemlineatus). Exp.Eye Res. 2006,- V.82, № 4. C.730-737.

39 Hains P.G., Truscott R.J. Post-Translational Modifications in the Nuclear Region of Young, Aged, and Cataract Human Lenses. J.Proteome.Res. 2007.-V.

40 Harrington V., Srivastava O.P., Kirk M. Proteomic analysis of water insoluble proteins from normal and cataractous human lenses. Mol.Vis. 2007.-V.13:1680-94., C.1680-1694.

41 Horwitz J. Alpha-crystallin can function as a molecular chaperone. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1992,- V.89, №21.- C. 10449-10453.

42 Horwitz J. Alpha-crystallin. Exp Eye Res 2003,- V.76, № 2,- C. 145-153.

43 Horwitz J., Bova M.P., Ding L.L., Haley D.A., Stewart P.L. Lens alpha-crystallin: function and structure. Eye 1999.- V.13, № Pt 3b.- C.403-408.

44 Jedziniak JA, Kinoshita JH, Yates EM, Hocker LO, Benedek GB On the presence and mechanism of formation of heavy molecular weight aggregates in human normal and cataractous lenses. Exp Eye Res 1973; 15:185-92)

45 Keenan J., Orr D.F., Pierscionek B.K. Patterns of crystallin distribution in porcine eye lenses. Mol.Vis. 2008,- V.14:1245-53., C.1245-1253.

46 Kinoshita J.H. Mechanisms initiating cataract formation. Proctor Lecture. Invest Ophthalmol. 1974,- V.13, № 10.- C.713-724.

47 Kumar P.A., Reddy G.B. Modulation of alpha-crystallin chaperone activity: a target to prevent or delay cataract? IUBMB.Life. 2009.- V.61, № 5.- C.485-495.

48 Kuszak J.R., Mazurkiewicz M., Jison L., Madurski A., Ngando A., Zoltoski R.K. Quantitative analysis of animal model lens anatomy: accommodative range is related to fiber structure and organization. Vet.Ophthalmol. 2006.-V.9, №5,- C.266-280.

49 Kuszak J.R., Zoltoski R.K., Tiedemann C,E. Development of lens sutures. Int.J.Dev.Biol. 2004.- V.48, № 8-9.- C.889-902.

50 Kuszak, J. R. and Zoltoski, R. K. The mechanism of accommodation at the fiber level. Ioseliani, O. R. Focus on Eye Research. 117-132. 2006. New-York.

51 Lampi K.J., Ma Z., Shih M., Shearer T.R., Smith J.B., Smith D.L., David L.L. Sequence analysis of betaA3, betaB3, and betaA4 crystallins completes the identification of the major proteins in young human lens. J.Biol.Chem. 1997.- V.272, № 4,- C.2268-2275.

52 Lampi K.J., Shih M., Ueda Y., Shearer T.R., David L.L. Lens proteomics: analysis of rat crystallin sequences and two-dimensional electrophoresis map. Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 2002,- V.43, № 1,- C.216-224.

53 Latina M., Chylack L.T., Jr., Fagerholm P., Nishio I., Tanaka T., Palmquist B.M. Dynamic light scattering in the intact rabbit lens. Its relation to protein concentration. Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 1987.- V.28, № 1,- C.175-183.

54 Leske M.C., Wu S.Y., Hyman L., Sperduto R., Underwood B., Chylack L.T., Milton R.C., Srivastava S., Ansari N. Biochemical factors in the lens opacities. Case-control study. The Lens Opacities Case-Control Study Group. Arch.Ophthalmol. 1995,- V.l 13, № 9.- C.l 113-1119.

55 Ma Z., Hanson S.R., Lampi K.J., David L.L., Smith D.L., Smith J.B. Age-related changes in human lens crystallins identified by HPLC and mass spectrometry. Exp.Eye Res. 1998.- V.67, № 1,- C.21-30.

56 MacCoss M.J., McDonald W.H., Saraf A., Sadygov R., Clark J.M., Tasto J.J., Gould K.L., Wolters D., Washburn M., Weiss A., Clark J.I., Yates J.R., III Shotgun identification of protein modifications from protein complexes and lens tissue. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2002.- V.99, № 12.- C.7900-7905.

57 McCarty C.A., Taylor H.R. Recent developments in vision research: light damage in cataract. Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 1996.- V.37, № 9.- C.1720-1723.

58 McNeil J.J., Robman L., Tikellis G., Sinclair M.I., McCarty C.A., Taylor H.R. Vitamin E supplementation and cataract: Randomized controlled trial. Ophthalmology 2004.- V.lll, № 1,- C.75-84.

59 McNulty R., Wang H., Mathias R.T., Ortwerth B.J., Truscott R.J., Bassnett S. Regulation of tissue oxygen levels in the mammalian lens. J.Physiol. 2004,- V.559, № Pt 3.- C.883-898.

60 Metlapally S., Costello M.J., Gilliland K.O., Ramamurthy B., Krishna P.V., Balasubramanian D., Johnsen S. Analysis of nuclear fiber cell cytoplasmic texture in advanced cataractous lenses from Indian subjects using Debye-Bueche theory. Exp.Eye Res. 2008,- V.86, № 2,- C.434-444.

61 Meyers S.M., Ostrovsky M.A., Bonner R.F. A model of spectral filtering to reduce photochemical damage in age-related macular degeneration. Trans.Am.Ophthalmol.Soc. 2004,- V.102:83-93; discussion 93-5., C.83-93.

62 Mirarefi A.Y., Boutet S., Ramakrishnan S., Kiss A.J., Cheng C.H., Devries A.L., Robinson I.K., Zukoski C.F. Small-angle X-ray scattering studies of the intact eye lens: effect of crystallin composition and concentration on microstructure. Biochim.Biophys.Acta. 2010.- V.1800, № 6.- C.556-564.

63 Netto L.E.S., Chae H.Z., Kang S.W., Rhee S.G., Stadtman E.R. Removal of hydrogen peroxide by thiol-specific antioxidant enzyme (TSA) is involved with its antioxidant properties. TSA possesses thiol peroxidase activity. J.Biol.Chem. 1996.- V.271, № 26,- C.15315-15321.

64 Nolan J.M., O'Reilly P., Loughman J., Stack J., Loane E., Connolly E., Beatty S. Augmentation of macular pigment following implantation of blue light-filtering intraocular lenses at the time of cataract surgery. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 2009,- V.50, № 10.- C.4777-4785.

65 Nomura H., Shimokata H., Niino N., Ando F., Sugita J., Miyake Y. Estimation of anterior nucleus of lens by Scheimpflug image before and after pupil dilatation. Jpn.J.Ophthalmol. 2000.- V.44, № 6,- C.682-685.

66 Ohrloff C., Hockwin O. Superoxide dismutase (SOD) in normal and catarac-tous human lenses. Graefes Arch.Clin.Exp.Ophthalmol. 1984a.- V.222, № 2.-C.79-81.

67 Ohrloff C., Hockwin O., Olson R., Dickman S. Glutathione peroxidase, glutathione reductase and superoxide dismutase in the aging lens. Curr.Eye Res. 1984b.- V.3, № 1,- C.109-115.

68 Orekhovich, V. N., Firfarova, K. F., and Shpikiter, V. O.: Physicochemical characteristics of the soluble proteins of the crystalline lens, Ukr. Biokhim. Zh. 27: 355, 1955

69 Ott M. Visual accommodation in vertebrates: mechanisms, physiological response and stimuli. J.Comp Physiol A Neuroethol.Sens.Neural Be-hav.Physiol. 2006,- V. 192, № 2,- C.97-111.

70 Peschek J., Braun N., Franzmann T.M., Georgalis Y., Haslbeck M., Weinkauf S., Buchner J. The eye lens chaperone alpha-crystallin forms defined globular assemblies. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2009.- V.106, № 32,-C.13272-13277.

71 Pierscionek B., Smith G., Augusteyn R.C. The refractive increments of bovine alpha-, beta-, and gamma-crystallins. Vision Res. 1987.- V.27, № 9.-C.1539-1541.

72 Pierscionek B.K. Growth and ageing effects on the refractive index in the equatorial plane of the bovine lens. Vision Res. 1989.- V.29, № 12.- C.1759-1766.

73 Pierscionek B.K. Refractive index contours in the human lens. Exp.Eye Res. 1997,-V.64,№ 6,-C.887-893.

74 Pierscionek B.K., Belaidi A., Bruun H.H. Refractive index distribution in the porcine eye lens for 532 nm and 633 nm light. Eye (Lond). 2005.- V.19, № 4,- C.375-381.

75 Pierscionek, B. K. GRADIENT INDEX OPTICS IN THE EYE. Bass, M, Enoch, J. M., and Lakshminarayanan, V. HANDBOOK OF OPTICS. Volume III. Vision and Vision Optics. THIRD EDITION[19]. 2010. New York, Chicago, San Francisco, Lisbon, London, Madrid, Mexico City, Milan, New Delhi, San Juan, Seoul, Singapore, Sydney, Toronto, McGray-Hill.

76 RESNIK R.A. Lens proteins. I. Alpha crystallin of calf lens. Am.J.Ophthalmol. 1957.- V.44, № 5, Part 2.- C.357-362.

77 Sergeev Y.V., Hejtmancik J.F., Wingfield P.T. Energetics of DomainDomain Interactions and Entropy Driven Association of beta-Crystallins. Biochemistry 2004,- V.43, № 2.- C.415-424.

78 Shang F., Gong X., Taylor A. Activity of ubiquitin-dependent pathway in response to oxidative stress. Ubiquitin-activating enzyme is transiently up-regulated. J.Biol.Chem. 1997,- V.272, № 37,- C.23086-23093.

79 Shang F., Taylor A. Function of the ubiquitin proteolytic pathway in the eye. Exp.Eye Res. 2004.- V.78, № 1.- C.l-14.

80 Shang F., Taylor A. Oxidative stress and recovery from oxidative stress are associated with altered ubiquitin conjugating and proteolytic activities in bovine lens epithelial cells. Biochem.J. 1995.- V.307, № Pt 1,- C.297-303.

81 Sharma K.K., Santhoshkumar P. Lens aging: Effects of crystallins. Bio-chim.Biophys.Acta. 2009.- V.1790, № 10,- C. 1095-1108.

82 Shick J.M., Dunlap W.C. Mycosporine-like amino acids and related Gadu-sols: biosynthesis, acumulation, and UV-protective functions in aquatic organisms. Annu.Rev.Physiol. 2002,- V.64:223-62., C.223-262.

83 Siebinga I., Vrensen G.F., De Mul F.F., Greve J. Age-related changes in local water and protein content of human eye lenses measured by Raman mi-crospectroscopy. Exp.Eye Res. 1991.- V.53, № 2,- C.233-239.

84 Sivak J.G., Hildebrand T., Lebert C. Magnitude and rate of accommodation in diving and nondiving birds. Vision Res. 1985.- V.25, № 7.- C.925-933.

85 Stadtman E.R. Metal ion-catalyzed oxidation of proteins: biochemical mechanism and biological consequences. Free Radic.Biol.Med. 1990.- V.9, № 4.- C.315-325.

86 Stradner A., Foffi G., Dorsaz N., Thurston G., Schurtenberger P. New insight into cataract formation: enhanced stability through mutual attraction. Phys.Rev.Lett. 2007,- V.99, № 19.- C.198103.

87 Takemoto L. Increase in the intramolecular disulfide bonding of alpha-A crystallin during aging of the human lens. Exp.Eye Res. 1996.- V.63, № 5.-C.585-590.

88 Takemoto L., Boyle D. Increased deamidation of asparagine during human senile cataractogenesis. Mol.Vis. 2000,- V.6:164-8., C. 164-168.

89 Takemoto L.J. Disulfide bond formation of cysteine-37 and cysteine-66 of beta B2 crystallin during cataractogenesis of the human lens. Exp.Eye Res. 1997,- V.64, № 4.- C.609-614.

90 TROKEL S. The physical basis for transparency of the crystalline lens. Invest Ophthalmol. 1962,- V.l:493-501., C.493-501.

91 Truscott R.J. Age-related nuclear cataract-oxidation is the key. Exp.Eye Res. 2005.- V.80, № 5.- C.709-725.

92 Truscott R.J., Carver J.A., Thorpe A., Douglas R.H. Identification of 3-hydroxykynurenine as the lens pigment in the gourami Trichogaster trichop-terus. Exp.Eye Res. 1992.- V.54, № 6,- C.1015-1017.

93 Truscott R.J., Wood A.M., Carver J.A., Sheil M.M., Stutchbury G.M., Zhu J., Kilby G.W. A new UV-filter compound in human lenses. FEBS Lett. 1994,- V.348, № 2,- C.173-176.

94 Tsur D., Tanner S., Zandi E., Bafna V., Pevzner P.A. Identification of post-translational modifications by blind search of mass spectra. Nat.Biotechnol. 2005,- V.23, № 12,- C.1562-1567.

95 Ueda Y., Duncan M.K., David L.L. Lens proteomics: the accumulation of crystallin modifications in the mouse lens with age. Invest Ophthal-mol.Vis.Sci. 2002.- V.43, № 1.- C.205-215.

96 Van H.R. Fluorescent derivatives of 3-hydroxy-L-kynurenine in the lens of man, the baboon and the grey squirrel. Biochem.J. 1971a.- V.123, № 4.-C.30P-31P.

97 Van H.R. Fluorescent glucoside in the human lens. Nature. 1971b.- V.230, № 5293,- C.393-394.

98 Werten P.J., Roll B., van Aalten D.M., de Jong W.W. Gecko iota-crystallin: how cellular retinol-binding protein became an eye lens ultraviolet filter. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2000,- V.97, № 7,- C.3282-3287.

99 Wolf N., Penn P., Pendergrass W., Van Remmen H., Bartke A., Rabinovitch P., Martin G.M. Age-related cataract progression in five mouse models for anti-oxidant protection or hormonal influence. Exp.Eye Res. 2005.- V.81, № 3,- C.276-285.

100 Wood A.M., Truscott R.J. UV filters in human lenses: tryptophan catabo-lism. Exp.Eye Res. 1993,- V.56, № 3,- C.317-325.

101 Worgul B.V., Merriam G.R., Jr., Medvedovsky C. Cortical cataract development—an expression of primary damage to the lens epithelium. Lens Eye Toxic.Res. 1989.- V.6, № 4,- C.559-571.

102 World Health Organization. Prevention of avoidable blindness and visual impairment. // Provisional agenda item 4.9. - EB117/35. - 117th Session. -22 December 2005.

103 Wu J., Seregard S., Algvere P.V. Photochemical damage of the retina. Surv.Ophthalmol. 2006,- V.51, № 5,- C.461-481.

104 Yaroslavsky I.V., Yaroslavsky A.N., Otto C., Puppels G.J., Vrensen G.F., Duindam H., Greve J. Combined elastic and Raman light scattering of human eye lenses. Exp.Eye Res. 1994,- V.59, № 4,- C.393-399.

105 Zhang Q., Guo X., Xiao X., Yi J., Jia X., Hejtmancik J.F. Clinical description and genome wide linkage study of Y-sutural cataract and myopia in a Chinese family. Mol.Vis. 2004.- V. 10:890-900., C.890-900.

106 Zhang X., Dudek E.J., Liu B., Ding L., Fernandes A.F., Liang J.J., Horwitz J., Taylor A., Shang F. Degradation of C-terminal Truncated {alpha}A-crystallins by the Ubiquitin Proteasome Pathway. Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 2007.- V.48, № 9. C.4200-4208.

107 Zigler J.S., Jr. Age-related changes in the polypeptide composition of beta-crystallin from bovine lens. Exp.Eye Res. 1978.- V.26, № 5.- C.537-546.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Муранов, Константин Олегович

1.4. Вывод

Радиоактивное и ультрафиолетовое облучение, старение сопровождаются однотипными изменениями на всех уровнях организации хрусталика: тканевом, оцениваемом по величине и локализация помутнений, клеточном, оцениваемом по микроскопической картине, и молекулярном, оцениваемом методом разностного электрофореза водорастворимых и водонерастворимых белков. Отсутствие специфических изменений указывает на существование единого механизма, поддерживающего прозрачность хрусталика, нарушение функции которого приводит к его помутнению (катаракте).

1.5. Материалы и методы Экспериментальные животные

Для эксперимента были отобраны, после обследования с помощью ручного офтальмоскопа, 80 мышей-самцов П (С57В1аск /СВА) в возрасте 2-х месяцев без видимых патологических изменений глаза. Животные были разделены на 4 рандомизированные группы. Животных трех групп подвергали следующим воздействиям:

• 1-я группа - ежедневное УФ облучение (УФ);

• 2-я группа - однократное облучение у-лучами в дозе 2 Гр всего тела животного (у-лучи); 3-я группа - однократное облучение у-лучами в дозе 2 Гр + ежедневное УФ облучение (у-лучи+УФ),

• 4-я группа контроль возрастных изменений хрусталика (К).

Индукция катаракты

Радиационную катаракту индуцировали с помощью облучения у-лучами всего тела животного. Для чего мышей в количестве 5 штук в специальной клетке помещали на расстоянии 70 см от источника излучения. Облучение у-лучами проводили однократно в дозе 2 Гр на установке «РОКУС-М» (№104, 1984, Санкт - Петербург) без применения фильтров. В качестве источника излучения использовали 60Со., мощность дозы составляла 0.641 Гр/мин, величина изодозы равнялась 90%.

Ультрафиолетовую катаракту индуцировали ежедневным ультрафиолетовым облучением. В качестве источника ультрафиолета были использованы два излучателя ОУФК-01, спектр излучения которых в УФ диапазоне приближен к солнечному свету (рис 1.5.1.). УФ облучение проводили в специальной клетке, в течение 15 мин. Во время облучения, чтобы животные не сбивались в кучу, их периодически беспокоили. Средняя мощность облучения на уровне пола контролировалась с помощью спектрорадиометра Аргус и составляла в диапазоне 280 - 390 нм 57+7 Вт/м .

5 о т о 1.0 л н о

5 1.5 т

0.0 ■

200 250 300 350 400

Длина волны, нм

Рис. 1.5.1. Спектр излучения использованного УФ излучателя ОУФК-01, приближен к солнечному свету.

Биомикроскопическое обследование животных

Биомикроскопию, то есть прижизненное обследование состояния глазных сред, выполняли на щелевой лампе Ор1:оп 8Ь-75 (Ор1:оп, Германия), снабженной видеокамерой Мтйоп МТУ-62\^1Р (Тайвань) на 7 и 10 месяцы после начала эксперимента. Развитие катаракты оценивали методом экспертных оценок с использованием следующих шкал: А) шести бальная шкала для оценки диффузных помутнений:

• 0 баллов - прозрачные кортикальные и ядерные структуры хрусталика

• 1 балл - незначительное уплотнение под передней капсулой хрусталика, сохранение оптической прозрачности кортикальных слоев и ядра;

• 2 балла - слабовыраженное диффузное помутнение в ядре, появление зернистости в передних и задних кортикальных слоях;

• 3 балла - умеренно выраженное диффузное помутнение в ядре, однородное слабовыраженное помутнение в передних и задних кортикальных слоях, незначительное увеличение плотности передней капсулы хрусталика;

• 4 балла - более выраженное помутнение в области ядра с развитием слоистоподобного помутнения, незначительное увеличение однородного помутнения в передних и задних кортикальных слоях;

• 5 баллов - выраженное облакоподобное помутнение ядра средней степени выраженности, менее выраженное однородное помутнение в передних и задних кортикальных слоях.

Б) трех бальная шкала для оценки локальных (ограниченных) помутнений:

• 1 балл - единичные мелкие ограниченные помутнения;

• 2 балла - среднее количество ограниченных помутнений различной формы;

• 3 балла - множественные ограниченные помутнения различной формы и размеров с тенденцией к образованию более крупных конгломератов.

Оценка степени помутнения проводилась слепым методом. В качестве окончательной оценки повреждения глаз животного диффузной или локальной катарактой, принимали сумму баллов соответствующей оценки помутнения левого и правого глаз.

Морфологические исследования

В работе применяли: этанол 96%, хлороформ, глицерин, уксусная кислота (РЕАХИМ, Россия), ксилол, эозин, BioMon, гематоксилин Майра (Sigma-Aldrich, США),

На 10 месяц мыши были забиты с помощью ингаляции паров хлороформа и глаза извлечены для последующего анализа. Для изготовления полутонких срезов, глаза фиксировали в 2 % глютаровом альдегиде и монтировали в эпон (Ероп 812). Серийные сагиттальные срезы изготавливали на микротоме (Ultratome Nova, LKB, Швеция). Срезы окрашивали полихромным красителем (метиловый синий - основной фуксин) по стандартной методике.

Для изготовления распластанного препарата эпителиальных клеток, глаза фиксировали в жидкости Карнуа, затем через понижающиеся концентрации этилового спирта (96 %, 70%) препараты переводили в 70% этиловый спирт в котором хранили препараты глаз до использования. Через понижающиеся концентрации этилового спирта (70%, 50%, 30%) глаза переводили в дистиллированную воду. Хрусталик извлекали через боковой разрез, обмывали в дистиллированной воде и на несколько минут помещали в 4% уксусную кислоту. Затем под стереомикроскопом (Opton SV-8, Opton, Германия) с хрусталика снимали капсулу, которую после промывки в дистиллированной воде распластывали на предметном стекле эпителиальным слоем вверх. Препараты эпителия окрашивали гематоксилин эозином по стандартной методике и заключали в синтетическую смолу BioMount (Bio-Optica, Италия).

Панорамные снимки эпителия, изготовленные с помощью микроскопа Axio Imager A2/M2/Z2/D2 с моторизованным столиком, исследовали независимо два эксперта при этом оценивали общее строение ткани, а также, наличие следующих патологических изменений: появление ядер с вакуолями и макроядер; пустоты в эпителиальном пласте; появление многослойных структур, образованных перерожденными эпителиальными клетками; наличие десквамированных клеток, появление клеток с вакуолями в цитоплазме.

Для количественной оценки дефектов эпителия хрусталика использовали следующие параметры:

1) Плотность клеточного слоя в центральной и периферической области эпителия. Параметр выражали в количестве клеток на мм .

2) Митотический индекс - количество митозов на мм .

3) Вакуолизация ядер - количество ядер с вакуолями на мм .

4) Вакуолизация цитоплазмы - количество клеток с вакуолями на мм2.

5) Количество макроядер на мм .

Для обработки изображений использовали графический пакет Image J 1.41 (NIH, США).

Протеомный анализ методом разностного электрофореза (DIGE)

В работе применяли: NaCl, Na2HP04, Na2HP04, ЭДТА, азид натрия производства Sigma-Aldrich, реактивы для проведения двумерного электрофореза производства BioRad (США), флуоресцентные красители Су-3 и Су-5 производства BioDye (Россия).

Хрусталики животных, забитых на 10 месяц после начала эксперимента, хранились до анализа в течение 1 недели при - 20 0 С. Для исследования изменений белкового состава хрусталика применяли метод разностного электрофореза. В качестве образцов были использованы хрусталики животных, катаракта которых соответствовала медиане группы, а степень помутнения правого и левого хрусталиков оценивалась одинаково.

Хрусталики гомогенизировали в натрий-фосфатном буфере (40 мМ Na2HP04, 40 мМ NaH2P04, 100 мМ NaCi, 3 мМ NaN3, 1 мМ ЭДТА, pH 6.8). Гомогенат центрифугировали при 20000 g 20 мин (4° С). Осадок отмывали еще два раза, объединяя супернатанты. Осадок и объединенный супертанант диализовали против деионизованной воды и лиофилизировали на установке Alpha 2-4 LD plus (MartinChrist GmbH, Германия).

Образцы водорастворимых и водонерастворимых белков хрусталика, растворяли в лизирующем буфере (8 М мочевина, 2 М тиомочевина, 4% (w/v) CHAPS, 0.5% (w/v) NP-40, 10 mM Tris-HCl pH 8.3). Для анализа использовали следующие пары образцов: «К-у-лучи»; «К-УФ»; «К - у-лучи+УФ»; «улучи - УФ»; «у-лучи - у-лучи+УФ»; при этом один из образцов пары был окрашен флуоресцентным красителем Су-3 (А,ех/ет=532/580), а другой Су-5 (^ех/ет=633/680). После разделения на оборудовании для двумерного электрофореза (BioRad, США) гель сканировали с помощью лазерного сканера Typhoon 9410 (GE Healthcare). На изображении геля белки, представленные в обоих образцах пары, окрашены в желтый, а белки, присутсвующие только в одном образце, в зеленый (Су-3) или красный (Су-5) цвета. Изображения анализировали с помощью программы DeCyder (GE Healthcare).

Статистический анализ

Статистический анализ результатов проводили методами описательной статистики и непараметрическими методами: ранговый однофакторный анализ Краскела-Уоллиса, критерий Коновера, U тест Манна и Уитни (Свободно-распространяемый статистический пакет «Attestat», И.П. Гайдышев, © 2002-2010).

Эксперименты проводили согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», разработанным комитетом по этике Института биохифической физики РАН им. Н.М. Эмануэля.

1.3. Заключение

Проведенное исследование на моделях возрастной, ультрафиолетовой, радиационной и комбинированной катаракты показало, что образование помутнения хрусталика не сопровождается возникновением специфических изменений на уровне: органа, клетки, субклеточных элементов и молекулярном уровне. Полученные данные позволили заключить, что эффект светорассеяния, лежащий в основе помутнений хрусталика, которые были сформированы действием различных этиологических факторов, имеет единую молекулярную основу. Это позволило нам использовать в качестве рабочей гипотезы утверждение, что основной причиной возникновения помутнений хрусталика является нарушение белок - белковых взаимодействий, вызванное денатурацией и агрегацией белков кристаллинов в цитоплазме волоконных клеток.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Муранов, Константин Олегович, Москва

1. Колосова Н.Г., Лебедев П.А., Фурсова А.Ж., Мороскова Т.С., Гуса-ревич А.Г. Преждевременно стареющие крысы OXYS как модель се-нильной катаракты человека. // Успехи геронол. 2003.- №.12.- С. 143148.

2. Мальцев Э.В. Хрусталик.// М.: Медицина, 1988, С.102

3. Петров, Р. В., Головастиков, И. Н., and Жабина, М. И. Сравнительная радиочувствительность мышей разных инбредных линий. // Вопросы общей радиобиологии. Москва, Атомиздат. 1966.- С. 123-125.

4. Федоренко Б.С., Абросимова А.Н., Смирнова O.A. Влияние ускоренных заряженных частиц высоких и релятвистских энергий на хрусталик глаза экспериментальных животных. Физика элементарных частиц и атомного ядра 1995.- Том.26, № 5.- С. 1373-1407.

5. Asomugha C.O., Gupta R., Srivastava O.P. Identification of crystallin modifications in the human lens cortex and nucleus using laser capture microdissection and CyDye labeling. Mol.Vis. 2010,- V.16.- P.476-494.

6. Benedek G.B. Theory of transparency of the eye. // Appl.Opt. 1971.-V.10.- № 3.- P.459-473.

7. Beswick H.T., Harding J.J. High-molecular-weight crystallin aggregate formation resulting from non-enzymic carbamylation of lens crystallins: relevance to cataract formation. // Exp.Eye Res. 1987.- V.45.- № 4,-P.569-578.

8. Bron A.J., Vrensen G.F., Koretz J., Maraini G., Harding J.J. The ageing lens. // Ophthalmologica. 2000,- V.214.- № 1.- P.86-104.

9. Costello M.J., Johnsen S., Gilliland K.O., Freel C.D., Fowler W.C. Predicted light scattering from particles observed in human age-related nuclear cataracts using mie scattering theory. // Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 2007.- V.48.- № 1,- P.303-312.

10. Costello M.J., Oliver T.N., Cobo L.M. Cellular architecture in age-related human nuclear cataracts. // Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 1992.- V.33.- № 11.- P.3209-3227.

11. Cucinotta F.A., Manuel F.K., Jones J., Iszard G., Murrey J., Djojonegro B., Wear M. Space radiation and cataracts in astronauts. // Radiat.Res. 2001,- V.156.- № 5 Pt 1,- P.460-466.

12. Dhir P., Akhtar N.J., Sun T.-X., Liang J. Photooxidized Products of Recombinant aA-Crystallin and W9F Mutant. // Photochem.Photobiol. 1999,- V.69.- № 3.- P.329-335.

13. Dillon J., Roy D., Spector A., Walker M.L., Hibbard L.B., Borkman R.F. UV laser photodamage to whole lenses. Exp.Eye Res. 1989.- V.49, № 6.-P.959-966.

14. Dong X., Soderberg P.G., Ayala M., Lofgren S. The Effect of Exposure Time on Maximum Acceptable Dose for Avoidance of Ultraviolet Radiation-Induced Cataract. Ophthalmic Res. 2005,- V.37, № 4,- P. 197-201.

15. Emri G., Wenczl E., Van E.P., Jans J., Roza L., Horkay I., Schothorst A.A. Low doses of UVB or UVA induce chromosomal aberrations in cultured human skin cells. J.Invest Dermatol. 2000.- V.115, № 3,- P.435-440.

16. Fagerholm P.P., Philipson B.T. Human lens epithelium in normal and ca-taractous lenses. Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 1981,- V.21, № 3.- P.408414.

17. Firfarova K.F., Kedrova E.M. Changes in crystalline lens proteins in experimental radiation cataract. // Vopr.Med.Khim. 1961,- V.7.- P.285-291.

18. Fisher R.F. Human lens fibre transparency and mechanical stress. // Exp.Eye Res. 1973,- V.16.-№ 1.-P.41-49.

19. Gilliland K.O., Freel C.D., Johnsen S., Craig F.W., Costello M.J. Distribution, spherical structure and predicted Mie scattering of multilamellar bodies in human age-related nuclear cataracts. // Exp.Eye Res. 2004.-V.79.- № 4.- P.563-576.

20. Gilliland K.O., Freel C.D., Lane C.W., Fowler W.C., Costello M.J. Multilamellar bodies as potential scattering particles in human age-related nuclear cataracts. //Mol.Vis. 2001.- V.7.- P. 120-130.

21. Graw J. Congenital hereditary cataracts. // Int.J.Dev.Biol. 2004,- V.48.-№8-9.- P. 1031-1044.

22. Graw J. Mouse models of cataract. J.Genet. 2009.- V.88, № 4,- P.469-486.

23. Hains P.G., Truscott R.J. Post-Translational Modifications in the Nuclear Region of Young, Aged, and Cataract Human Lenses. // J.Proteome.Res. 2007.- V. 6.- №10,- P.3935-3943

24. Hanson S.R., Hasan A., Smith D.L., Smith J.B. The major in vivo modifications of the human water-insoluble lens crystallins are disulfide bonds, deamidation, methionine oxidation and backbone cleavage. // Exp.Eye Res. 2000,- V.7L- № 2,- P.195-207.

25. Harrington V., Srivastava O.P., Kirk M. Proteomic analysis of water insoluble proteins from normal and cataractous human lenses. // Mol.Vis. 2007,- V.13.- P.1680-1694.

26. He W., Li S. Congenital cataracts: gene mapping. // Hum.Genet. 2000.-V.106.- № 1,- P.l-13.

27. Hejtmancik J.F. Congenital cataracts and their molecular genetics. // Semin.Cell Dev.Biol. 2008,- V.19.- № 2.- P. 134-149.

28. Hejtmancik J.F., Kantorow M. Molecular genetics of age-related cataract. // Exp.Eye Res. 2004,- V.79, № 1.- P.3-9.

29. Hightower K.R. The role of the lens epithelium in development of UV cataract. // Curr.Eye Res. 1995.- V.14.- № 1.- P.71-78.

30. Hightower K.R., Reddan J.R., McCready J.P., Dziedzic D.C. Lens epithelium: a primary target of UVB irradiation. // Exp.Eye Res. 1994.- V.59.-№5,- P.557-564.

31. Hockwin O., Kojima M., Sakamoto Y., Wegener A., Shui Y.B., Sasaki K. UV damage to the eye lens: further results from animal model studies: a review. // J.Epidemiol. 1999,- V.9.- № 6 Suppl.- P.S39-S47.

32. Hodge W.G., Whitcher J.P., Satariano W. Risk factors for age-related cataracts. // Epidemiol.Rev. 1995,- V.17.- № 2,- P.336-346.

33. Holsclaw D.S., Merriam G.R., Jr., Medvedovsky C., Rothstein H., Worgul B.V. Stationary radiation cataracts: an animal model. // Exp.Eye Res. 1989,- V.48.- № 3,- P.385-398.

34. Hook D.W., Harding J.J. Inactivation of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase by sugars, prednisolone-21-hemisuccinate, cyanate and other small molecules. // Biochim.Biophys.Acta. 1997.- V.1362.- № 2-3.-P.232-242.

35. Hook D.W., Harding J.J. The effect of modification of alpha-crystallin by prednisolone-21-hemisuccinate and fructose 6-phosphate on chaperone activity. // Dev.Ophthalmol. 2002,- V.35.- P.150-160.

36. ICRP, 1990 Recommendations of the International Commission on Radiological Protection. Publication 60, Annals of the ICRP, Vol. 21, Elsevier, Amsterdam, 1991,- P. 19.

37. ICRP, The 2007 Recommendations of the International Commission on Radiological Protection. Publication 103, Annals of the ICRP, Vol. 37, Elsevier, Amsterdam, 2007.- P.22

38. Javitt J.C., Kendix M., Tielsch J.M., Steinwachs D.M., Schein O.D., Kolb M.M., Steinberg E.P. Geographic variation in utilization of cataract surgery. // Med.Care. 1995,- V.33.- № 1,- P.90-105.

39. Javitt J.C., Taylor H.R. Cataract and latitude. // Doc.Ophthalmol. 1994,-V.88.- № 3-4,- P.307-325.

40. Jose J.G. Posterior cataract induction by UV-B radiation in albino mice. // Exp.Eye Res. 1986,- V.42.- № 1.-P.11-20.

41. Kannabiran C., Rogan P.K., Olmos L., Basti S., Rao G.N., Kaiser-Kupfer

42. M., Hejtmancik J.F. Autosomal dominant zonular cataract with sutural opacities is associated with a splice mutation in the betaA3/Al-crystallin gene. Mol.Vis. 1998.- V.4:21., P.21.

43. Klein B.E., Klein R., Lee K.E. Incidence of age-related cataract over a 10-year interval: the Beaver Dam Eye Study. Ophthalmology. 2002.-V.109, № 11.- P.2052-2057.

44. Korlimbinis A., Hains P.G., Truscott R.J., Aquilina J.A. 3-Hydroxykynurenine oxidizes alpha-crystallin: potential role in cataracto-genesis. //Biochemistry. 2006,- V.45.- № 6.- P. 1852-1860.

45. Li D.Y., Borkman R.F. Photodamage to calf lenses in vitro by excimer laser radiation at 308, 337, and 350 nm. // Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 1990,- V.31.- № 10,- P.2180-2184.

46. Linetsky M., James H.L., Ortwerth B.J. The generation of superoxide anion by the UVA irradiation of human lens proteins. // Exp.Eye Res. 1996.-V.63.- № 1.- P.67-74.

47. Lofgren S., Michael R., Soderberg P.G. Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat. Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 2003,- V.44.-№ 4.- P.1629-1633.

48. Long A.C., Colitz C.M., Bomser J.A. Apoptotic and necrotic mechanisms of stress-induced human lens epithelial cell death. // Exp. Biol. Med. (Maywood.). 2004.- V.229.- № 10,- P. 1072-1080.

49. Lou M.F., Dickerson J.E., Jr., Garadi R. The role of protein-thiol mixed disulfides in cataractogenesis. // Exp.Eye Res. 1990.- V.50.- № 6.- P.819-826.

50. Ma Z., Hanson S.R., Lampi K.J., David L.L., Smith D.L., Smith J.B. Age-related changes in human lens crystallins identified by HPLC and mass spectrometry. // Exp.Eye Res. 1998.- V.67.- № 1.- P.21-30.

51. Marsili S., Salganik R.I., Albright C.D., Freel C.D., Johnsen S., Peiffer R.L., Costello M.J. Cataract formation in a strain of rats selected for high oxidative stress. // Exp.Eye Res. 2004,- V.79.- № 5,- P.595-612.

52. McCarty C.A., Taylor H.R. A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. // Dev.Ophthalmol. 2002.- V.35.-P.21-31.

53. Merriam G.R., Jr. A clinical study of radiation cataracts. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 1956,-V.54.-P.611-653.

54. Merriam G.R., Jr., Worgul B.V. Experimental radiation cataract—its clinical relevance. // Bull.N.Y.Acad.Med. 1983,- V.59.- № 4,- P.372-392.

55. Meyer L.M., Dong X., Wegener A., Soderberg P. Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD(2.3:16)) for UVR 300 nm-induced cataract in C57BL/6J mice. // Exp.Eye Res. 2008.- V.86.- № 2.- P.282-289.

56. Michael R., Barraquer R.I., Willekens B., van M.J., Vrensen G.F. Morphology of age-related cuneiform cortical cataracts: the case for mechanical stress. // Vision Res. 2008.- V.48.- № 4,- P.626-634.

57. Michael R., Vrensen G.F., van Marie J., Gan L., Soderberg P.G. Apop-tosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. // Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 1998.- V.39.- № 13,- P.2681-2687.

58. Miesbauer L.R., Zhou X., Yang Z., Yang Z., Sun Y., Smith D.L., Smith J.B. Post-translational modifications of water-soluble human lens crystal-lins from young adults. // J.Biol.Chem. 1994.- V.269.- № 17,- P. 1249412502.

59. Pendergrass W., Penn P., Possin D., Wolf N. Accumulation of DNA, nuclear and mitochondrial debris, and ROS at sites of age-related cortical cataract in mice. // Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 2005,- V.46.- № 12,-P.4661-4670.

60. Pendergrass W., Zitnik G., Tsai R., Wolf N. X-ray induced cataract is preceded by LEC loss, and coincident with accumulation of cortical DNA, and ROS; similarities with age-related cataracts. // Mol.Vis. 2010.-V.16.- P.1496-1513.

61. Puk O., Ahmad N., Wagner S., Hrabe de A.M., Graw J. First mutation in the {beta}A2-crystallin encoding gene is associated with small lenses and age-related cataracts. Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 2011.- Vol.52.- №5.-P.2571-2586.

62. Rini F.J., Worgul B.V., Merriam G.R., Jr. Scanning electron microscopic analysis of radiation cataracts in rat lenses. I. X-radiation cataractogenesis as a function of dose. // Ophthalmic Res. 1983.- V.15.- № 3.- P.146-159.

63. Sasaki K., Karino K., Kojima M., Sakamoto Y., Takizawa A., Zeinuddin D., Katou N. Cataract survey in the local area using photographic documentation. // Dev.Ophthalmol. 1987.- V.15.- P.28-36.

64. Schey K.L., Fowler J.G., Shearer T.R., David L. Modifications to rat lens major intrinsic protein in selenite-induced cataract. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1999,- V.40.- № 3,- P.657-667.

65. Shearer T.R., Ma H., Shih M., Hata I., Fukiage C., Nakamura Y., Azuma M. Lp82 calpain during rat lens maturation and cataract formation. // Curr.Eye Res. 1998.- V.17.-№ 11.-P.1037-1043.

66. Shih M., Lampi K.J., Shearer T.R., David L.L. Cleavage of beta crystal-lins during maturation of bovine lens. // Mol.Vis. 1998.- V.4.- P.4.

67. Sidjanin D., Zigman S., Reddan J. DNA damage and repair in rabbit lens epithelial cells following UVA radiation. // Curr.Eye Res. 1993.- V.12.-№ 9.- P.773-781.

68. Siebinga I., Vrensen G.F., De Mul F.F., Greve J. Age-related changes in local water and protein content of human eye lenses measured by Raman microspectroscopy. //Exp.Eye Res. 1991,- V.53.- № 2,- P.233-239.

69. Sliney D.H. Geometrical assessment of ocular exposure to environmental UV radiation—implications for ophthalmic epidemiology. // J.Epidemiol. 1999.- V.9.- № 6 Suppl.- P.S22-S32.

70. Sliney D.H. UV radiation ocular exposure dosimetry. // Doc.Ophthalmol. 1994,- V.88,- № 3-4,- P.243-254.

71. Spector A. Oxidative stress-induced cataract: mechanism of action. // FASEB J. 1995.- V.9.-№ 12,- P.l 173-1182.

72. Spector A., Roy D. Disulfide-linked high molecular weight protein associated with human cataract. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1978.- V.75.- № 7,- P.3244-3248.

73. Srivastava O.P., Kirk M.C., Srivastava K. Characterization of covalent multimers of crystallins in aging human lenses. // J.Biol.Chem. 2004.-V.279.- № 12.- P.10901-10909.

74. Takemoto L. Increase in the intramolecular disulfide bonding of alpha-A crystallin during aging of the human lens. // Exp.Eye Res. 1996.- V.63.-№ 5.- P.585-590.

75. Takemoto L. Increase in the intramolecular disulfide bonding of alpha-A crystallin during aging of the human lens. // Exp.Eye Res. 1996c.- V.63.-№ 5.- P.585-590.

76. Takemoto L., Boyle D. Increased deamidation of asparagine during human senile cataractogenesis. // Mol.Vis. 2000.- V.6.- P.164-168.

77. Takemoto L.J. Disulfide bond formation of cysteine-37 and cysteine-66 of beta B2 crystallin during cataractogenesis of the human lens. // Exp.Eye Res. 1997,- V.64.- № 4.- P.609-614.

78. Tao F., Powers-Risius P., Alpen E.L., Medvedovsky C., David J., Worgul B.V. Radiation effects on late cytopathological parameters in the murine lens relative to particle fluence. // Adv.Space Res. 1994.- V.14.- № 10.-P.483-491.

79. Taylor V.L., al-Ghoul K.J., Lane C.W., Davis V.A., Kuszak J.R., Costello M.J. Morphology of the normal human lens. // Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 1996,- V.37.- № 7.- P.1396-1410.

80. Taylor V.L., Costello M.J. Fourier analysis of textural variations in human normal and cataractous lens nuclear fiber cell cytoplasm. // Exp.Eye Res. 1999,- V.69.- № 2,- P.163-174.

81. Truscott R.J. Age-related nuclear cataract-oxidation is the key. // Exp.Eye Res. 2005.- V.80.- № 5,- P.709-725.

82. Tsur D., Tanner S., Zandi E., Bafna V., Pevzner P.A. Identification of post-translational modifications by blind search of mass spectra. Nat.Biotechnol. 2005,- V.23, № 12,- P.1562-1567.

83. Ueda Y., Duncan M.K., David L.L. Lens proteomics: the accumulation of crystallin modifications in the mouse lens with age. // Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 2002.- V.43.- № 1.- P.205-215.

84. Van Boekel M.A., Hoenders H.J. In vivo glycation of bovine lens crystal-lins. Biochim. Biophys. Acta. 1992.- V.1159.- № p.99-102.

85. Vrensen G., Willekens B. Biomicroscopy and scanning electron microscopy of early opacities in the aging human lens. // Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 1990,- V.31.- № 8.- P.1582-1591.

86. Vrensen G.F. Aging of the human eye lens~a morphological point of view. // Comp Biochem.Physiol A Physiol. 1995,- V.lll.- № 4,- P.519-532.

87. Vrensen G.F. Early cortical lens opacities: a short overview. // Acta Ophthalmol. 2009,- V.87.- № 6,- P.602-610.

88. Vrensen G.F. UV-B and early cortical and nuclear changes in the human lens. // Doc.Ophthalmol. 1994,- V.88.- № 3-4.- P.255-261.

89. Vrensen G.F., Duindam H.J. Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations. // Ophthalmic Res. 1995,- V.27 Suppl 1,- P.78-85.

90. Weinreb O., Dovrat A. Transglutaminase involvement in UV-A damage to the eye lens. // Exp.Eye Res. 1996,- V.63.- № 5,- P.591-597.

91. Winkler C., Denker K., Wortelkamp S., Sickmann A. Silver- and Coomassie-staining protocols: detection limits and compatibility with ESI MS. //Electrophoresis. 2007,- V.28.- № 12,- P.2095-2099.

92. WHO 2007: Global initiative for the elimination of avoidable blindness: action plan 2006-2011.

93. Wolf N., Pendergrass W., Singh N., Swisshelm K., Schwartz J. Radiation cataracts: mechanisms involved in their long delayed occurrence but then rapid progression. //Mol.Vis. 2008.- V.14.- P.274-285.

94. Wolf N., Penn P., Pendergrass W., Van Remmen H., Bartke A., Rabino-vitch P., Martin G.M. Age-related cataract progression in five mouse models for anti-oxidant protection or hormonal influence. // Exp.Eye Res. 2005,- V.81.- № 3.- P.276-285.

95. Wolf N.S., Li Y., Pendergrass W., Schmeider C., Turturro A. Normal mouse and rat strains as models for age-related cataract and the effect of caloric restriction on its development. // Exp.Eye Res. 2000.- V.70.- № 5.-P.683-692.

96. Wolff S.P. Cataract and UV radiation. // Doc.Ophthalmol. 1994,- V.88.-№ 3-4.- P.201-204.

97. Worgul B.V., Low S., Merriam G.R., Jr. The lens epithelium and radiation cataract. III. The influence of age on the nuclear fragmentation of the meridional row cells following X irradiation. // Radiat.Res. 1982.- V.91.-№ 1.-P.181-185.

98. Worgul B.V., Merriam G.R., Jr., Medvedovsky C. Cortical cataract development—an expression of primary damage to the lens epithelium. // Lens Eye Toxic.Res. 1989.- V.6.- № 4,- P.559-571.

99. Wu B., Medvedovsky C., Worgul B.V. Non-subjective cataract analysis and its application in space radiation risk assessment. // Adv.Space Res. 1994,- V.14.- № 10.- P.493-500.

100. Wu K., Shui Y.B., Kojima M., Murano H., Sasaki K., Hockwin O. Location and severity of UVB irradiation damage in the rat lens. //Jpn. J. Ophthalmol. 1997,- V.41.- № 6,- P.381-387.

101. Yaroslavsky I.V., Yaroslavsky A.N., Otto C., Puppels G.J., Vrensen G.F., Duindam H., Greve J. Combined elastic and Raman light scattering of human eye lenses. // Exp.Eye Res. 1994,- V.59.- № 4,- P.393-399.

102. Zigman S., Paxhia T., McDaniel T., Lou M.F., Yu N.T. Effect of chronic near-ultraviolet radiation on the gray squirrel lens in vivo. // Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 1991.- V.32.- № 6,- P. 1723-1732.

103. Zintz C., Beebe D.C. Morphological and cell volume changes in the rat lens during the formation of radiation cataracts. // Exp.Eye Res. 1986.-V.42.- № 1.- P.43-54.

104. Глава II. Исследование молекулярных механизмов агрегации белков хрусталика

105. П.1.Введение. Молекулярные механизмы агрегация белков

106. Таким образом, можно ожидать, что молекулярные механизмы, поддерживающие прозрачность хрусталика это, прежде всего, механизмы, предупреждающие возникновение нарушение упорядоченности белковой структуры цитоплазмы.

107. Рассмотрим подробнее основные причины, которые могут приводить к нарушениям конформации белковых молекул и их последующей агрегации.

108. Агрегацией называют взаимодействие развернутых белковых молекул, которое приводит к образованию конгломератов произвольной формы вследствие «ошибочных» межбелковых взаимодействий (Jaeniske R, 1995, цит. по Курганову, 2002).

109. Для исследования шапероноподобной функции а-кристаллина обычно используют четыре модели.

110. Гидродинамический радиус частиц (К) может быть вычислен в дальнейшем с помощью формулы Стокса-Эйнштейна:где /св константа Больцмана, Т - температура и г| - сдвиговая вязкость растворителя.

111. Семь последовательностей, связанных с шаперонной функцией, перекрываются с идентифицированными ранее доменами, обеспечивающими взаимодействие субъединиц при сборке олигомера (Ghosh et al., 2005).

112. Тем не менее, мутантные белки, неспособны к образованию олигоме-ров, как правило, не обладают и шапероноподобной активностью (Derham et al., 2002).

113. Таким образом, для формирования высокомолекулярного комплекса а-кристаллина и белка-субстрата требуется не только денатурированный белок, но и сам а-кристаллин должен быть активирован воздействием либо тепла, либо ультрафиолета или АФК.

114. И.1.3.2. Альфа-кристаллин in vivo

Информация о работе

Муранов, Константин Олегович
доктора биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.00.02

Диссертация

Молекулярные механизмы поддержания и нарушения прозрачности хрусталика глаза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно