Физиолого-биохимические характеристики хрусталика крыс в постнатальном онтогенезе

Князев, Дмитрий Игоревич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физиолого-биохимические характеристики хрусталика крыс в постнатальном онтогенезе
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические характеристики хрусталика крыс в постнатальном онтогенезе"

На правах рукописи

Князев Дмитрий Игоревич

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ХРУСТАЛИКА КРЫС В ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ

03.03.01 физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 О ИЮН ¿013

005061924

Нижний Новгород —2013

005061924

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России в научной проблемной лаборатории физико-химических исследований научно-исследовательского института прикладной и фундаментальной медицины

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент Иванова Ирина Павловна Официальные оппоненты: Паренко Марина Константиновна

Доктор биологических наук, доцент, заведующий кафедрой анатомии, физиологии и основ безопасности жизнедеятельности человека ФГБОУ ВПО «Нижегородский государственный педагогический университет имени Козьмы Минина» Министерства образования и науки Российской Федерации

Пахмутов Игорь Аркадьевич

Доктор ветеринарных наук, профессор кафедры анатомии, фармакологии и патофизиологии сельскохозяйственных животных ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Марийски» государственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации, г. Йошкар-Ола

Защита состоится 2 июля 2013 года в Ю00 на заседании диссертационного совета Д 220.047.01 при ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия» по адресу: 603107, Н. Новгород, пр-т Гагарина, 97

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия».

Автореферат разослан 31 мая 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Иващенко М.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Изучение механизмов функционирования и регуляций работы клеток и органов является важным вопросом физиологии. Хрусталик глаза, обеспечивая светопропускание и фокусировку света на сетчатке, обладает набором особенностей, определяющих его структуру и методы изучения. Среди них: постоянный рост в течение всей жизни, реализация метаболических процессов без непосредственного контакта с кровотоком, очень глубокая дифференцировка клеток, сопровождающаяся синтезом структурных белков и утратой органелл. Баланс между различными сигнальными и метаболическими путями, регулирующими развитие, и функционирование данного органа, реализуется в слабо- и .умеренно-дифференцированных клетках внешних слоёв хрусталика. Таким образом., хрусталик глаза является подходящей моделью для изучения молекулярных механизмов реализации физиологических функций и их поддержанияна этапах, длигельность которых сопоставима со временем жизни организма. !

В качестве основного движущего фактора старения и нарушения функций хрусталика традиционно рассматривается деструктивное действие активных форм кислорода (Truscott, 2005; Berthoud, Beyer, 2009). С другой стороны, в последние 5-10 лет всё больше внимания уделяется сигнальной функции активных форм кислорода, изучению их участия в нормальных физиологических процессах клетки — пролиферации, дифференцировке, адаптационных процессах (Wang, Lou, 2009; Cassa no et al., 2010; Ëmerling et al., 2009). Также, малоизученными остаются аспекты взаимного влияния свойств и модификаций липидов и белков хрусталика в ходе постнатального онтогенеза и их связь с реализацией оптических функций хрусталика,

Структурно-функциональное состояние белков' й липидов хрусталика обуславливает его функционирование. В связи с этим, комплексное изучение параметров белков и липидов хрусталика, а также оценка влияния свободно-радикальных процессов на структуру липидов и белков на протяжении жизни актуальны как в контексте выполнения хрусталиком своих физиологических функций, так и для исследования молекулярных и физиологических механизмов старения.

Цель и задачи исследования

Цель работы - исследование структурно-функциональных параметров, мембран, модификаций липидов и белков хрусталика крыс в постнатальном онтогенезе.

Основные задачи исследования.

1. Исследование возрастной динамики интенсивности окислительных процессов в хрусталиках крыс, ферментативных и нефермеетативных компонентов антиоксидантной защиты.

2. Исследование динамики белковых модификаций и структурных параметров протеома хрусталика в постнатальном онтогенезе крыс.

3. Оценка структурных особенностей мембран хрусталика в ходе постнатального онтогенеза крыс.

4. Анализ' взаимосвязей исследуемых параметров окислительных и структурных процессов с динамикой роста хрусталика и реализацией его оптических функций.

Научная новизна

Впервые исследована динамика интенсивности окислительных процессов в хрусталике' крыс. Установлено снижение в процессе старения интенсивности свободно-радикальных процессов в липидной фракции хрусталиков крыс. В хрусталике крыс впервые изучена возрастная динамика активности каталазьг и супероксиддисмутазы. Максимальная активность каталазы и супероксиддисмутазы наблюдается в возрасте 1 мес. и 12 мес.

'Выявлена прямая корреляция между содержанием двойных связей и уровнями лйпофильных ангиоксидантов (токоферола и ретинола) в хрусталике крыс в процессе постнатального онтогенеза.

Установлено возрастное снижение содержания фосфолипидов и увеличение доли сфингомиелинов в мембранах хрусталика крыс, что связано с замедлением темпов роста хрусталика, снижением ненасыщенности и увеличением устойчивости к окислительным процессам.

Показано, что снижение темпов роста хрусталика в возрасте 6-12 мес. сопровождается совокупными изменениями липидного состава мембран, структуры белков и интенсивности окислительных процессов.

Установлено, что баланс между окислительными и структурными процессами в липидах и белках мембран и цитозоля клеток хрусталика определяет светопропускаюцую функцию хрусталика на поздних возрастных этапах.

Теоретическая н практическая значимость работы

Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание молекулярных и физиологических механизмов развития и старения хрусталика и поддержания его оптических свойств. Совокупность полученных экспериментальных данных позволяет выявить физиолого-биохимические особенности развития хрусталика крыс на различных возрастных этапах. Полученные данные позволяют оценить роль активных форм кислорода, структуры мембран и белков, как в выполнении физиологических функций хрусталика, так и в отношении механизмов старения организма в целом.

Экспериментальные данные, полученные в настоящей работе, могут быть использованы при разработке новых подходов и методов профилактики и терапий возрастных нарушений физиологических функций хрусталика, таких как дальнозоркость и катаракта.

Новые сведения о возрастной динамике структурно-функциональных характеристик липидов и белков хрусталика могут быть включены в учебные

курсы по физиологии и биохимии при подготовке специалистов, ветеринарного и медико-биологического профиля.

Положения, выносимые на защиту

1. Интенсивный рост хрусталика (1-6 мес.) сопровождается снижением активности окислительных процессов. Структура мембран хрусталика характеризуется максимальными значениями уровня ненасыщенности и доли фосфолипидных компонентов.

2. Период замедления темпов роста хрусталика (6-12 мес.) характеризуется активацией синтеза белка, увеличением концентрации водо нерастворим о го белка, ростом интенсивности окислительных процессов и активности ферментативного звена антиоксидантной защиты.

3. В период 6-12 мес. наблюдается обогащение мембран ¡холестерином, увеличение уровня поверхностной гидрофобности-:,белков, >переход восстановленных тиолов в мочевино-растворимую фракцию. При этом активация окислительных процессов и структурных перестроек не сопровождается возникновением помутнений в хрусталике.

4. Поздний возрастной этап (12-24 мес.) характеризуется минимальными темпами прироста массы хрусталиков, что сопровождается ростом концентрации общего и нерастворимого. белка, синтезом насыщенных липидных компонентов хрусталика. Итенсивность окислительных процессов на мембранах снижается до минимальных значений, тогда как уровни белковых модификаций в цитозоле клеток хрусталика значительно возрастают.

Апробация работы XXII межрегиональная научно-практическая конференция с международным участием «Новые технологии микрохирургии глаза», Оренбург, 18 ноября, 2011; Международная заочная научно-практическая конференция «Актуальные научные вопросы: реальность и перспективы», Тамбов, 26 декабря, 2011; II Международная научно-практическая интернет-конференция "Проблемы и перспективы развития науки в начале третьего тысячелетия в странах СНГ", Украина, Переяслав-^мельницкий, 26-28 мая, 2012; XIII Международная научная конференция:^«Актуальные вопросы науки и образования», Москва, 21-23 мая, 2012; II Всероссийская научная сессия молодых ученых и студентов «Современные решения актуальных научных проблем в медицине», Нижний Новгород, 14-15 марта, 2013; 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология - наука XXI века», Пущино, 22-26 апреля, 2013.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 3 публикации в журналах рекомендованных ВАК.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов. Список цитируемой литературы включает 202 источника (8 отечественных и 194 зарубежных). Работа содержит 36 рисунков и 8 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы. В первой главе диссертации приводится обзор научных исследований по основным физиологическим и биохимическим особенностям строения и функционирования хрусталика, модификациям липидов и протеома хрусталика.

Глава 2. Материалы и методы исследования

Работа выполнена в научной проблемной лаборатории физико-химических исследований Научно-исследовательского института прикладной и фундаментальной медицины ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России.

Объектом исследования явились прозрачные хрусталики крыс Wistar 5 возрастных групп 1,3,6,12 и 24 мес. Общее количество животных - 163. Декапитацию животных проводили под эфирным наркозом. Выделенные хрусталики гомогенизировали на льду в стерильном физиологическом растворе или 50 тМ буферном растворе Tris-HCl, pH 8,0. Методы исследования и численность групп животных приведены в таблице 1.

Анализ аминокислотных последовательностей основных представителей кристалликов крыс проведен с применением базы данных NCBI Protein (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein) и программы BioEdit (www. mbio.nscu.edu/BioEdit).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Statistica 6.0. Статистическая значимость межгрупповых различий оценивалась с применением дисперсионного анализа ANOVA и post-hoc поправки Ньюмена-Кейлса. Корреляционный анализ проводился по методу Пирсона. Межгрупповые различия считались статистически значимыми при р<0,05 (Гланц, 1998).

Таблица 1

Экспериментальные группы и методы исследования

Этапы исследования Методы исследования Численность групп

Оценка свободно-радикальных процессов 1. Молекулярные продукты перекиснош окисления липидов (ПОЛ) - диеновые конъюгаты (ДК), сопряжённые кетодиены (СКД) (Shenstone, 1971), основания Шиффа (Fletcher et al., 1973), ТБК-активные комплексы (малоновый диальдегид) (Smith, Ingerman, 1976). 3. Липофильные антиоксиданты — а-токоферол, ретинол (Hewavitharana et al., 2004, Тарасюк, 2008). Пул 1: 1 мес. - 20 3 мес. -16 6 мес. -16 12 мес. -16 24 мес. - 20

4. Супероксиддисмутаза (SOD) (Nishikimi, 1972) 5. Каталаза (Aebi, 1970). Пул 2: 1,3,6,12,24 мес. — по 15

Модификации белков 1. Карбонильные производные (Дубинина и др., 1995) 2. Конечные продукты неферментативного гликозилирования (Muthenna et al., 2011) 3. Битирозиновые сшивки (Davies, 1987; Дубинина и др., 2002). 4. Концентрация тиоловых групп (Riddles et al., 1983) Пул 1

Структурные параметры протеома 1. Уровень флуоресценции триптофанила (Zhang et al., 2007) Пул 1

2. Уровень поверхностной гидрофобности (Zhang et al., 2007). Пул 2

Липидный состав, структура мембран . 1. Фосфолипидные фракции (Шаршунова и др., 1980) 2. Фракции нейтральных липидов, соотношение «нейтральные липиды : фосфолипиды» (НЛ:ФЛ), соотношение «холестерин фосфолипиды» (Хл:ФЛ) (Kishimoto et al., 2001) 3. Уровень ненасыщенпости - двойные связи (Shenstone, 197?) Пул 1,2

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1. Динамика роста и основных биохимических параметров хрусталика в процессе старения

В ходе постнатального онтогенеза наиболее значительный прирост массы хрусталиков наблюдался на интервале 1-6 мес. (табл.2). Период с 6 до 12 мес. характеризовался замедлением роста масс хрусталиков - средняя скорость увеличения массы составила -1,5 мгУмес. Далее, на интервале от 12 до 24 мес. наблюдалась минимальная скорость роста - ~0,25 мгУмес.

. ■ . ; Таблица 2 Возрастная динамика прироста массы хрусталиков, уровней общего белка! __и общих липидов.____

Возраст, мес. 1 3 6 12 24

масса, мг. 21,1±0,9* 35,0±1,2* 46,2±1,4* 55,Ш,7 ' 58,0±1,7

ОБ, гомогенат, мг/г массы 333±5* 411±9 405±9 480±14* 681±36*

ОБ, ВР, мг/г массы 270±6 258±8 2І65±7 247±7 220±21*

ОБ, ВНР, мг/г • массы 63 ±7* І'53±11 140£13 233±18* 461±42*

ОЛ, мг/г массы 2,9±0,1 2,6±0,2- 3,4±0,1*' 4,0±0,2* 6,9±0,2*

ОБ - общий1 белок, ВР - водорастворимая фракция, ВНР -г ¡водонерастворимая фракция, ОЛ - общие липиды. Статистически значимые отличия: * - от всех остальных фупп, # - от групп 1,3,6 мес.

Концентрация белка в водорастворимой фракции менялась в пределах 210-270 мг на 1 г массы хрусталика. На интервале 6-12-24 мес. прирост содержания общего белка в гомогенате хрусталиков составил ~15 mi/г массы в месяц. Наблюдаемая динамика отражает переход белков хрусталика в нерастворимую фазу. Одной из концепций катарактогенеза является предположение о выпадении в осадок высокомолекулярных белковых агрегатов. Поскольку все хрусталики были прозрачны, то можно сделать вывод о том, что собственно переход в водонерастворимую фазу не ассоциирован с возникновением помутнений.

Наиболее значительный рост уровня липидов происходил на отрезке 12-24 мес., увеличиваясь от 3,4±0,1 до 6,9±0,2 мг/г массы. По-видимому, основной вклад в возрастное увеличение количества общих . липидов вносят особенности процесса дифференцировка волокон. Так, известно,. что дифференцировка волокон хрусталиков птиц и приматов сопровождается увеличением числа выпячиваний мембран - ингердигитаций, протрузий, гофр - развивающимся как с целью.упрочнения механической сцепки между волокнами, так и интенсификации межклеточного транспорта (Biswas et al., 2009). В исследованиях морфологии волокон хрусталиков человека и крыс

также показан переход от упорядоченного расположения волокон с гексагональным сечением и «гладкими» гранями в поверхностных слоях к уплотнённой упаковке с гофрированной поверхностью волокон в переходной зоне между корой и ядром, соответствующих окончательному созреванию волокон (Lim et al., 2009; Grey et al., 2009).

3.2. Интенсивность окислительных процессов в хрусталике крыс в постнатальном онтогенезе

Возрастная динамика концентраций молекулярных продуктов свободно-радикального окисления липидов имела разнонаправленный характер. В период с 1 до 6 месяцев наблюдалось снижение концентраций первичных продуктов свободно-радикального окисления в липидной фракции хрусталиков (рис.1). Концентрация диеновых конъюгатов (ДК) составляла 144,4 ± 13,3 и 91,3 ± 7,7 нмоль/мг липидов в возрасте 1 и 6 мес. соответственно. На интервале от 6 до 12 мес. выявлено значительное увеличение уровней первичных продуктов ПОЛ до максимальных значений. Далее, в ходе старения от 12 до 24 мес. вновь наблюдался значительный спад концентраций ДК и сопряжённых кетодиенов.

а) б) * *

1 3 6 12 24 1 3 6 12 24

возраст, мес. возраст, мес.

Рис. 1. Концентрации первичных продуктов свободно-радикального окисления в липидной фракции хрусталиков крыс в постнатальном онтогенезе, а) диеновые кнъюгаты, б) сопряжённые кетодиены. * -статистически значимые отличия от групп 3,6, 24 мес.

В интервале 1-6 мес. уменьшение уровня первичных продуктов ПОЛ, по всей видимости, обусловлено следующими причинами. Во-первых, снижением концентраций гуморальных факторов, регулирующих пролиферативную активность клеток эпителия хрусталика, таких как инсулиноподобный фактор роста, тромбоцитарный фактор роста, эпидермальный фактор роста и др. (Ьоуюи й а1., 2011). Действие данных факторов опосредовано работой мембранного мультисубъединичного комплекса - НАДФН оксидазы, экспрессирующейся в хрусталиках генерирующей супероксидный анион-радикал (Лао й а1., 2004). В этом

контексте АФК выступают как физиологические регуляторы, и кратковременное повышение их концентрации ведёт к реализации митогенных сигнальных каскадов (Iyengar et al., 2006; Wang, Lou, 2009). Во-вторых, снижение концентраций ДК и СКД может быть обусловлено увеличением концентрации липофильных антиоксидантов - токоферола и ретинола —у группы 3 мес. (рис.26).

Максимальные концентрации ДК и СКД наблюдавшиеся в липидной фракции хрусталиков крыс возраста 12 месяцев, могут быть связаны: а) с НАДФН-зависимой активностью трансформирующего фактора роста; б) совпадает с периодом увеличения доли волокон, претерпевающих с активацией лизиса митохондрий в ходе окончательного созревания волокон (Bassnett, 1997).

Более чем двукратное снижение концентрации ДК и СКД в липидной фракции хрусталиков за период от 12 до 24 мес. свидетельствует об ослаблении интенсивности окислительных процессов на мембранах хрусталика, что может быть вызвано: 1) возрастанием доли липидных компонентов с насыщенными жирно-кислотными остатками; 2) изменением профиля факторов роста в водянистой влаге и стекловидном теле, вызывающим снижение активности НАДФН оксидазы.

Динамика уровня ненасыщенности мембран хрусталиков показана на рис. 2а. Выявлено более чем двукратное увеличение уровня двойных связей у группы 3 мес. по сравнению с группой 1 мес. с последующим возвращением к исходным значениям у группы 6 мес. Также в эксперименте наблюдалось статистически значимое ~50%-ое снижение концентрации двойных связей от 12 к 24 месяцам.

а)

g 20 с;

I 15

£ 10 о

-Ш

5 fi--|-|t--

Ш Ш Ж m m , m , ж , m

180 160 -J

0 140

1 120 с 100 Л 80

■I 60

g 40 20 -0

□ а-токоферол в ретинол

____**............. _

12 , мес.

3 6 12 возраст, мес.

3 6 возраст

Рис. 2. Уровень двойных связей (а) и липофильных антиоксидантов (б) в липидной фракции хрусталиков крыс. Статистически значимые отличия: * -от остальных групп. ** - от трупп 6,12 и 24 мес. # - от группы 1 мес.

Динамика уровня липофильных антиоксидантов - а-токоферола и ретинола - представлена на рисунке 26. Концентрации двойных связей и липофильных антиоксидантов менялись весьма схожим образом. Установлены прямые корреляции «а-токоферол-ДС» и «ретинол-ДС», более выраженная корреляция наблюдалась между уровнем двойных связей и ретинола: 1) «а-токоферол - ДС»: г = 0,42; р=0,0001; 2) «ретинол - ДС»: г = 0,63; р=0,0001. На основании полученных данных можно сделать предположение о том, что функция липофильных антиоксидантов состоит в поддержании определённого уровня ненасыщенности мембран хрусталиков, нежели в торможении свободно-радикальных процессов.

Рост уровня ненасыщенности мембран на этапе 1-3 мес., по-видимому, играет существенную физиологическую роль для роста волокон хрусталика. Повышение уровня ненасыщенности ведёт к снижению микровязкости, увеличению эластичности мембран для реализации процессов удлинения и увеличения площади дифференцирующихся волокон хрусталика.

В ходе работы была установлена активность ферментов антиоксидантной защиты — SOD и каталазы (рис. 3). Наблюдалось снижение активности SOD и каталазы от 1 к 3 месяцам. В возрасте от 6 до 12 мес. рост активности SOD был более выражен, нежели рост активности каталазы, так активность SOD увеличилась на 76 ± 5%, а каталазы на 28 ± 11%.

а) б)

1 3 6 12 24 1 3 6 12 24

возраст, мес. возраст, мес.

Рис. 3. Активность супероксиддисмутазы (а) и каталазы (б) в хрусталиках крыс. Статистически значимые, отличия: * - от всех остальных групп, # - от групп 3,6,24 мес.

Затем, от 12 к 24 месяцам наблюдался спад активности обоих ферментов. При этом, в возрасте 24 мес. активность SOD была выше, чем в возрасте 3-6 мес. и лишь в небольшой степени отличаясь от уровня группы 1 мес., тогда как активность каталазы в возрасте 24 мес. возвращалась на уровень сопоставимый с возрастом 3-6 мес.

В целом, динамика активностей обоих ферментов близка к динамике концентраций первичных продуктов свободно-радикального окисления в липидной фазе (рис. 1). На основании этого можно сделать два

предположения: 1) В постнатальном онтогенезе активность ферментов антиоксидантной защиты хрусталика крыс меняется в соответствии с физиологическими концентрациями супероксидного анион-радикала и пероксида водорода - с целью удержания концентраций АФК в определённых пределах, но не с целью полной элиминации акт ивных частиц; 2) Поскольку все хрусталики были прозрачны, соответственно АФК тесно задействованы в регуляции нормальных физиологических процессов клетки - пролиферации, дифференцировке, изменения структуры мембран и протеома, выступая в роли сигнальных молекул.

Как видно из табл. 2, в ходе постнатального онтогенеза хрусталика наблюдались следующие изменения: от 1 до 6 месяцев - максимальный рост массы с ~ 22%-ым увеличением содержания белка, от 6 до 24 - медленный рост массы с очень значительным (-68%) увеличением содержания белка. Соответственно, в промежутке от 6 до 12 мес. происходит перестройка ре(уляторных механизмов, приводящая к замедлению темпов роста, активации синтетического аппарата и структурным перестройкам мембран и цитозоля эпителия и волокон хрусталика.

3.3. Модификации и структурные характеристики белков хрусталика.

Концентрация вН-групп рассматривается как интегральный показатель окислительной нагрузки на протеом. Установлено снижение концентрации тисловых групп в гомогенате хрусталиков крыс от 1 к 3 месяцам с 202±6 до 116±2 нмоль/мг белка, после чего уровень оставался относительно стабильным вплоть до возраста 12 месяцев (рис.4а). Далее, к 24 месяцам концентрация тиолов снижалась до 74±6 нмоль/мг белка.

а) . б) а

200

!юо

1 50

□ ВР « МР

1 3 6 12 возраст, мес.

возраст, мес.

Рис. 4. Концентрация тиоловых групп в гомогенате (а) и двух фракциях хрусталика (б). ВР - водорастворимая фракция; МР - мочевино-растворимая фракция. Статистически значимые отличия: * - от остальных групп; # - от ірупп 3,6 мес.

Динамика уровня тиоловых групп в водорастворимой (ВР) и мочевино-растворимой (МР) фракции представлена на рис. 46. Для оценки

относительного вклада (доли) каждой фракции в общее количество тиоловых групп была проведена нормировка значений ,уровня, тиолов на 1 мг массы хрусталика-результаты, представлены в табл.3.......

В ходе постнатального онтогенезанаблюдался .спад уровня тиоловых групп в водорастворимой фракции хрусталика (рис 46). В свою очередь,, при переходе от 1 к 3 месяцам в эксперименте наблюдалось резкое обеднение 8Н-группами МР-фракции - их концентрация снижалась ~ в 10 раз, а доля в общей концентрации тиолов падала более чем в 2,5 раза - с 31,1±2,2 до 11,7±1,6% (табл. 3). На основании данных литературы (БсЫе^та е[ а!„ 2009) можно принять, что белки, растворимые исключительно в 7Гу1 мочевине, в основном ассоциированы с мембранами волокон хрусталика. Вероятным механизмом обеднения, МР-фракции сульфгидрильными группами на интервале 1-3 мес. может являться очень тесная ассоциация, вплоть до встраивания в мембрану, многочисленных компонентов цитоскелета, белков межклеточных контактов, представителей семейства у-кристаллинов, что, по-видимому, препятствует экспонированию вН-групп.

Таблица 3

Концентрация и процентное содержание тиоловых групп в водорастворимой _фракции (ВР) и фракции белков, растворимых в мочевине (МР)_

возраст, Пмес. 1 3 6 12 • 24

ВР: С(8Н-), нмоль/мг массы 45,8±0,9 41,8±0,8 42,8±1,3 28,9±1,0 17,9±2,1

МР: С(ЗН-), нмоль/мг массы 21,7±2,1 5,6±0,8 6,7±1,8 26,3±0,7 28,3±3,3

Доля ЭН-групп в ВР, % 68,9±2,2* 88,3±1,6 87,8±3,0 52,3±1,2*. 39,7±3,7*

доля БН-групп в МР, .% 31,1±2,2* 11,7±1,6 12,2±3,0 47,7+1,2* 60,3+3,7*

статистически значимые отличия от остальных фупп.

При переходе от 6 к 12 месяцам, концентрация сульфгидрильных групп в МР-фракции увеличивалась приблизительно в 2,5 раза. При этом, доля МР-фракции в общем количестве БН-групп увеличивалась - в 4 раза и достигала 48% от общего количества 8Н-групп в белках хрусталика. Таким образом, при переходе от 6 к 12 месяцам наблюдались 2 параллельных процесса -увеличение массовой концентрации 8Н-групп в МР-фракции на 19,8 нмоль/мг массы хрусталика и снижение их массовой концентрации в ВР-фракции на 13,9 нмоль/мг массы хрусталика (табл.З). Довольно близкие величины обоих показателей наряду с тем, что конценрация тиолов в гомогенате на этапе 6-12 мес. не менялась (рис. 4а), позволяют предположить, что переход протеинов хрусталика из водной фазы на отрезке 6-12. мес. не связан с окислением .ЭН-групп. Наиболее вероятными представляются гидрофобные взаимодействия, , приводящие к дальнейшей, ассоциации белков с мембранами. ,

В ходе работы была установлена возрастная динамика концентраций альдо- кетопроизводных белков водорастворимой фракции (рис. 5). Данные показатели являются маркерами как окислительной нагрузки, так и интенсивности аддукции белков с молекулами моносахаридов и продуктами ПОЛ. Максимальные уровни альдо- и кетопроизводных наблюдались у групп 1 и 3 мес. Далее, на интервале 3-6 месяцев следовало статистически значимое снижение концентрации карбонильных производных ~ на 30%. Более высокие уровни карбонильных производных в возрасте 1-3 мес. отражают интенсивность следующих процессов: а) окисления боковых радикалов аминокислот с участием АФК, б) гликирования белков посредством аддукции с моно- и олигосахаридами, в) образования адцуктов между вторичными продуктами ПОЛ (малоновый диальдегид, 4-гидроксиноненаль, акролеин и др.) с остатками лизина, гистидина, аргинина и др (Uchida et al.,

1998). 0,7 го 0,6

I 0,5

5 0,4 с 0,3

Е 0,2

1И1 i

Ж 6

»альдопроизводные » кетопроизводные

Рис. 5. Уровень карбонильных производных водорастворимых белков в хрусталиках крыс. * - статистически значимые отличия от групп 6,12,24 мес.

возраст, мес.

По данным эксперимента было установлено возрастное увеличение уровней конечных продуктов неферментативного гликозилирования и битирозиновых сшивок в водорастворимой фракции хрусталика (рис. 6). Наиболее выраженное изменение содержания данных белковых модификаций происходило от 12 до 24 мес.

а)

40 £ 35 Л 30

125 с 20

f 15

i 6 о

б)

1,2

с. <и 1

«5 0,8

с; 0,6

-8-

0,4

i 0,2

Ш Ш , т

3 6 12 возраст, мес

Рис.6. Уровень флуоресценции конечных

(

Ш- §1

jjfjfjji

1 3 6 12 возраст, мес.

продуктов неферментативного гликозилирования (а) и битирозина (б) в водорастворимой фракции

хрусталиков крыс.

■ статистически значимые отличия от остальных групп.

Среди механизмов, опосредующих накопление конечных продуктов гликирования и битирозиновых сшивок можно выделить: 1) ослабление интенсивности протеасомного и аутофагосомного аппаратов; 2) особенностями перехода модифицированных белков хрусталика в водонерастворимую фазу; 3) свободно-радикальные реакции. По-видимому, на этапе 12 - 24 мес. происходит интенсификация реакций, приводящих к образованию конечных флуоресцирующих продуктов неферментативного гликозилирования. Можно предположить, что на поздних возрастных этапах кислород и АФК, способствуя протеканию конечных стадий гликирования с образованием конденсированных продуктов, являются «мягкими» окислителями и не ведут к формированию карбонильных производных. Участие АФК и фотохимических реакций также опосредует формирование битирозиновых сшивок (Ва1а8иЬгаташап Э., Капшаг Я., 2002). В виду того, что хрусталик характеризуется низким содержанием кислорода - менее 5% в коре и менее 1% в ядре (МсЫику е1 а1., 2004; вИш е1 а1., 2006) -интенсивности реакций формирования продуктов гликирования и битирозиновых сшивок, по-видимому, не превышают критических значений и не опосредуют образование помутнений хрусталика в физиологических условиях постнатального онтогенеза.

В ходе исследования была выявлена возрастная динамика структурных параметров водорастворимых белков - уровня поверхностной гидрофобности и флуоресценции триптофана (рис. 7). Значения уровня поверхностной гидрофобности росли в ходе постнатального онтогенеза с наиболее значительным увеличением на интервале 6-12 мес. В 24 мес. уровень поверхностной гидрофобности водорастворимой фракции снижался, но был выше значений, наблюдаемых в возрасте от 1 до 6 мес. а) б)

1 3 6 12 24 1 3 6 12 24

возраст, мес. возраст, мес.

Рис. 7. Динамика уровня поверхностной гидрофобности (а) и флуоресценции триптофанила (б) в водорастворимых белках хрусталиков крыс. Статистически значимые отличия: * - от остальных групп, ** - от групп 1 и 6 мес.

Рост поверхностной гидрофобности на промежутке 6-12 мес. может быть связан с реализацией шаперонной функции а-кристаллинов, с изменением состава гомо- и гетерополимеров аА/аВ. Соответственно, предполагаемая мембранная ассоциация с участием а-кристаллинов может быть механизмом «разгрузки» цитозоля от избыточной концентрации белка для обеспечения термодинамической стабильности цитозоля и, таким образом, предотвращения неконтролируемой агрегации р- и у-кристаллинов с целью поддержания основных физиологических функций хрусталика -светопропускания и фокусировки света на сетчатке.

Другой структурный параметр - флуоресценция триптофанила - с возрастом увеличивался, при этом наиболее выраженные изменения происходили на промежутке 6-12 мес. Рост флуоресценции триптофанила может быть обусловлен изменениями третичной структуры кристаллинов, приводящими к. экспонированию остатков триптофана. Также, рост флуоресценции триптофанила может быть обусловлен изменением паттерна экспрессии структурных белков, что ведёт к обогащению водной фазы кристаллинами, содержащими остатки триптофана на поверхности молекул.

Высказано предположение о том, что остатки триптофана в составе консервативных доменов р- и у-кристаллинов несут функцию защиты сетчатки глаза от дальнего ультрафиолетового излучения (Chen et al., 2008). Таким образом, усиление флуоресценции триптофанила может отражать реализацию физиологических и молекулярных механизмов, направленных на предотвращение повреждения сетчатки и зрительного нерва.

3.4. Динамика изменений липидного состава хрусталика крыс в постнатальном онтогенезе.

■ Хл:Фл 0НЛ:Фл*

Рис. 8. а) Процентный вклад фосфолипидов в общую липидную фракцию хрусталиков крыс; б) Динамика молярных соотношений [холестерин:фосфолипиды] (Хл:Фл) и [нейтральные липидькфосфолипиды] (НЛ:Фл). Статистически значимые отличия: * - от всех остальных групп; # -от групп 1,3,6 мес.; ** - от групп 1, 12, 24 мес.

В интервале 1-6 мес. наблюдалось увеличение вклада фосфолипидов в липидную фракцию от 22,9±0,7% до 27,5±0,8% (рис. 8а). При этом, в возрасте 1 мес. в хрусталиках крыс на 1 молекулу фосфолипидов приходилось* -3,4 молекулы нейтральных лйпидов, а соотношение [холестерин : фосфолипиды] составляло (2,73±0,45) : 1. В возрасте 6 мес. молярное соотношение [нейтральные липиды : фосфолипиды] было равным (2,68±0,10): 1, а на одну молекулу фосфолипидов приходилось ~2 молекулы холестерина, (рис.86).

■ Увеличение относительного вклада фосфолипидов' обеспечивает: а) надлежащие физические свойства расширяющихся мембран - снижение микровязкости, повышение «эластичности»; б) характеристики мембран, связанные с физиологическими особенностями роста волокон хрусталика -потенциальные липидные мессенджеры, сродство к специфическим мембранным белкам. Предполагаемое влияние фосфолипидов на физиолош-биохимичеекие характеристики мембран подтверждается наличием корреляции между процентным содержанием фосфолипидов и уровнем двойных связей в мембранах хрусталиков: г = 0,37; р=0,007.

Наиболее выраженные изменения в динамике' -соотношения между фосфолйпидами и нейтральными липидами наблюдались между группами 6 и 12 мес. Доля фосфолипидов снижалась от 27,5 ± 0,8% до уровня 19,9 ± 0,3%, а молярные соотношения [нейтральные липиды : фосфолипиды] и [холестерин : фосфолипиды] составили (4,05±0,08) : 1 и (3,14-1.0,07) : 1 соответственно. Рост вклада нейтральных липидов и холестерина на этапе 624 мес., по всей видимости, играет важную роль в возрйстНьгх изменениях физиологических параметров хрусталика, таких как интенсивность межклеточной циркуляции и механическая жёсткость хрусталикам Показано избирательное распределение холестерина в межклеточные - контакты, опосредующие механическую сцепку волокон' (Biswas ct ' al.,: 2010). Увеличение доли холестерина может оказывать влияние на распределение и функциональное состояние мембрано-ассоциированных белков, способствуя снижению интенсивности межклеточного транспорта <"и перестройкам компонентов1 цитоскелета, приводящим к росту механической прочности й снижению аккомодационной способности хрусталика.

Выявленная в ходе исследования динамика фосфолипидного состава представлена' в табл. 4. Основными фосфолипидными компонентами мембран хрусталиков крыс явились фосфатидйлхолины (ФХ) и фосфатидилэтаноламины (ФЭ), в то же время, в возрасте 24 мес. сопоставимого с ними уровня достигали сфингомиелины (СМ).

Значительное увеличение доли сфингомиелинов на интервале 12-24 мес., по-видимоМу, имеет как структурное, так и физиологическое влияние на процессы в эпителии и волокнах хрусталика. Показано сфингомиелин-опосредованное угнетение свободно-радикального окисления ненасыщенных углеводородных цепей в липосомах различного состава (Oborina, Yappert, 2003). Соответственно, повышение доли сфингомиелинов от 12 к 24 мес.,

может быть напрямую ассоциировано со снижением концентраций продуктов ПОЛ на данном промежутке. Церамиды, основные продукты метаболизма сфингомиелинов, входят в число важных регуляторов клеточного цикла, инициируя торможение клеточного цикла и активацию процессов апоптоза (Pandey et al., 2007; Oskouian, Saba, 2010). В связи с этим, рост доли сфингомиелинов может иметь физиологическое значение и влиять на рост хрусталика, способствуя торможению пролиферации клеток эпителия, обусловливая, таким образом, падение темпов роста хрусталика на поздних возрастных этапах, (табл. 2).

Таблица 4

Процентное соотношение фосфолипидных фракций хрусталика крыс.

возраст, мес. 1 3 6 12 24

ЛФХ,% 1,3±0,5 0,8±0,3 1,8±0,6 1,2±0,5 2,1±0,5

СМ, % 8,3 ±1,0 11,6±0,6 14,1 ±1,0 15,7±1,3 25,8±1,4*

ФС+ФИ, % 11,8±1,2 16,2±1,2 14,1±1,0 11,2±1,7 11,4±1,3

ФХ,% 28,3±1,2 25,2±1,6 30,5±2,3 20,5±1,5& 23,9±1,2

ФЭ 50,4±1,5 45,7±1,4 38,6±1,8* 48,8 ±2,1 34,4±2,3#

ЛФХ - лизофосфатидилхолины, СМ - сфингомиелины, ФС -фосфатидилсерины, ФИ - фосфатвдилинозиты, ФХ - фосфатидилхолины, ФЭ - фосфатидилэтаноламины. Статистически значимые отличия: * - от всех остальных фупп; & - от групп 1 и 6 мес.; # - от групп 1,3 и 12 мес.

Основными компонентами нейтральных липидов в хрусталиках крыс явились холестерин и свободные жирные кислоты (табл. 5). Доля диацилглицеридов на возрастном отрезке 1-6 мес. менялась незначительно с дальнейшим статистически значимым увеличением к возрасту 24 Мес. Динамика содержания холестерина, с наблюдавшимся понижением на интервале 1-3 мес. и последующим возвращением к значениям, близким к 80%, коррелирует с динамикой соотношения холестерин:фосфолипиды (рис.8б): г=0,46; р=0,001.

Таблица 5.

Процентное содержание холестерина иегоэфиров (Хл+ХлЭф), свободных жирных кислот (СЖК) и диацилглицеридов (ДАГ) в хрусталиках крыс в _процессе постнатального развития.__

возраст, мес. 1 3 6 12 24

Хл+ХлЭф, % 81,2 ±2,7 70 ± 1,9 74 ±1,8 77,8 ±1, 2 77,5 ±0,3

СЖК, % 9,4 ±1,3 9,4 ± 0,8 10,8 ±0,8 11,1 ±1,2 11,4 ±0,9

ДАГ, % 3,7 ± 1,2 4,3 ± 0,6 4,7 ± 0,5 6,2 ±0,7 7,8 ± 1,1*

# - статистически значимые отличия от групп 1, 3, 6 мес.

Возрастная динамика уровней триглицеридов и моноацилглицеридов представлена на рис. 9. Процентное содержание триглицеридрв на промежутке 1-3 мес. увеличивалось очень значительно, достигая

максимальных значений (-10%) у группы 3 мес. Далее, наблюдалось возрастное снижение доли триглицеридов до уровня 2% в возрасте 24 мес.. Схожую с триглицеридами динамику демонстрировали моноацилглицериды, максимальный процентный вклад которых наблюдался на интервале 3-6 мес., снижаясь к 24 месяцам до 1%.

а триглицериды

і моноацилглицериды

Рис. 9. Динамика процентного содержания производных глицерина в хрусталике, крыс. Статистически , значимые отличия: * - . от всех остальных групп; # - от .групп 1,:12 и 24 мес.; & - от групп 3,12,24 мес.

возраст, мес.

Таблица 6

Корреляционные взаимосвязи с участием процентного содержания

СМ Фл Хл де токофер ол ретинол

ТГ -0,52 р=2,6-10"4 0,38 р=0,005 -0,61 р=4,24Т0"6 0,65 р=7,2Т0"5 0,38 р=0,005 0,50 р=Т0"5

МАГ -0,42 р =0,002 0,70 р=0,0001 -0,45 р=0,001 0,54 р=0,0001 0,29 р=0,037 0,64 р=10^

ТГ — триглицериды; МАГ - моноацилглицериды; СМ — сфингомиелины; Фл - фосфолипиды; Хл - Холестериніфиры холестерина; ДС -- двойные связи (уровень ненасыщенности).

Наиболее тесные прямые корреляции отмечены с уровнями двойных связей, ретинола и фосфолипидов. При этом, наблюдались обратные корреляции между триглицеридами или моноацилглицеридами и долей сфингомиелинов. Обобщая наблюдаемые корреляционные взаимосвязи, можно можно заключить, что структура и свойства мембран в постнатальном онтогенезе хрусталика меняются в сторону роста микровязкости и устойчивости к окислительным процессам, что может иметь существенное значение для поддержания светопропускающей функции хрусталика.

Заключение

Полученные в настоящей работе данные по возрастной динамике физиолого-биохимических характеристик хрусталика, позволяют оценить

роль окислительных и в регуляции нормальных физиологических процессов в клетках хрусталика. В частности, полученные результаты позволяют предположить существенную роль активных форм кислорода в реализации сигнальных и метаболических путей, контролирующих необходимый баланс между пролиферацией и дифференцировкой клеток хрусталика. Анализ полученных данных по активности ферментативного звена ангиоксцдантной защиты позволяет предположить повышение концентрации Н2О2 в хрусталиках возраста 24 мес. При этом, рост уровня пост-трансляционных модифицикаций белков на этапе 12-24 мес., обусловленный, в том числе, и активными формами кислорода (продукты гликозилирования, битирозиновые сшивки, снижение концентрации тиоловых групп в водорастворимой фракции), в не был ассоциирован с образованием помутнений. По-видимому, на этапе 12-24 мес., основная концентрация активных форм кислорода задействована в реализации сипгальных и метаболических путей, контролирующих гомеостаз хрусталика........

На основании полученных результатов, можно сделать вывод, что поддержание светопропускающей функции хрусталика определяется балансом между окислительными процессами и структурными изменениями протеома и мембран. В частности, наблюдавшиеся после 6 мес. увеличение поверхностной гидрофобности, соотношение холестерин:фосфолипиды, увеличение доли мочевино-растворимой фракции в общей концентрации тиоловых фупп, повышение содержания нейтральных липидов и сфингомиелинов - позволяют предположить возрастную интенсификацию процессов мембранной ассоциации белков хрусталика. Данный процесс может иметь существенное влияние на интенсивность свободно-радикальных процессов, архитектуру цитоскелета, интенсивность микроциркуляции, и, таким образом, выполнение хрусталиком оптических функций.

Динамика физиолого-биохимических характеристик хрусталика крыс в ностнатальном онтогенезе позволяет предположить, что изменения структуры и свойств мембран и протеома хрусталиков направлены на обеспечение максимальной устойчивости, химической инертности для выполнения хрусталиком функции светопропускания в течение максимально возможного срока, хотя при этом аккомодационная способность может в некоторой степени ухудшаться!

ВЫВОДЫ

1. Установлено снижение в процессе старения интенсивности свободно-радикальных процессов в липидной фракции хрусталиков крыс. Максимальные концентрации липофильных продуктов свободно-радикального окисления наблюдаются у возрастных групп 1 мес. и 12 мес.

2. В хрусталиках крыс в ходе постнатального развития активность антиоксидангных ферментов имеет разнонаправленный характер. Максимальная активность каталазы и супероксиддисмутазы наблюдается в возрасте 1 мес. и 12 мес.

3. В процессе постнатального онтогенеза наблюдается прямая корреляция между содержанием двойных связей (снижение на 40%) и уровнями липофильных антиоксидантов (снижение на 35% уровня токоферола и на 50% уровня ретинола). . ■. ■ •

4. Снижение темпов роста хрусталика в возрасте 6-12 мес. сопровождается изменением . структурных параметров белков (на 40% увеличивается поверхностная гидрофобность водорастворимых- белков, и на 80% содержание нерастворимых белков). Интенсивность окислительных процессов обуславливающих модификацию белков в этом периоде не изменяется.

5. На поздних возрастных этапах 12-24 мес. увеличивается выраженность окислительных процессов, определяющих модификации водорастворимых белков хрусталика. Рост уровней белковых модификаций не ассоциирован с возникновением помутнений хрусталика.

6. В процессе старения хрусталика изменяется липидный и фосфолипидный состав мембран, определяющий снижение темпов роста хрусталика и возрастание устойчивости к окислительным процессам.

7. Изменения в темпах роста хрусталика характеризуются совокупностью изменений . в структуре мембран, в протеоме и в интенсивности окислительных процессов.

8. Светопропускающая функция хрусталика на поздних возрастных этапах (12-24 мес.) определяется балансом между окислительными и структурными процессами в липидах и белках мембран и цитозоля хрусталика.

Практические рекомендации

.1. Внедрена система растворителей для фракционирования нейтральных липидов при проведении тонкослойной хроматографии.

2. Внедрен метод анализа и количественной оценки результатов тонкослойной хроматографии, основанный на использовании программного продукта NIH Image J.

3. Новые данные о структурно-функциональных характеристиках белков и мембран хрусталика могут быть использованы при разработке новых подходов для профилактики и терапии возрастных нарушений зрения в сфере ветеринарии и медицины, а также могут быть включены в программы по биохимии и физиологии при подготовке специалистов ветеринарного и медико-биологического профиля.

Список работ опубликованных по теме диссертации . Публикации в рецензируемых изданиях рекомендованных ВАК:

1. Иванова, И.П. Окисление липидов и белков в хрусталике и плазме крови крыс в процессе старения / И.П. Иванова, Д.И. Князев, Ю.В. Кудрявцева // Современные технологии в медицине. - 2011. - №3. - С. 16-20.

2. Князев, Д.И. Липоперокевдация в хрусталике крыс в процессе старения / Д И. Князев, И.П. Иванова, Ю.В. Кудрявцева // Вестник оренбургского государственного университета. - 2011. - № 14 (133). - С. 190-193.

3. Князев, ДИ. Модификации белков и липидного состава хрусталиков крыс в процессе постнаталыгого онтогенеза/ Д.И Князев, И.П Иванова // Современные технологии в медицине. - 2012. - №4. - С. 36-42. Публикации в научных журналах, сборниках научных статей, материалах конференций:

1. Князев, ДИ. Окисление липидов и состав мембран хрусталика крыс в процессе старения // Материалы II Международной научно-практической конференции «Проблемы и перспективы развития науки в начале третьего тысячелетия в странах СНГ». — Переяслав-Хмельницкий. — 2012. — С. 6-8,

2. Князев, Д И. Структурно-функциональные характеристики липидов и белков хрусталика крыс в процессе старения. // МедиАль. Электрон.журн. -2013. - №1. - С.66. Режим доступа: http://www.medial-journal.ru/uploads/common/Mediall(6)-2013_l.pdf (дата обращения 19.05.2013).

3. Князев, Д.И. Анализ окислительных процессов белков хрусталика экспериментальных-животных в процессе старения / ДИ. Князев, И.П. Иванова // Материалы научно-технической конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и курсантов. — Ч. 1. — СПб.-2012.-С. 153-155. . > -

4. ; Князев, Д.И. Возрастные изменения липидного состава мембран и белковых модификаций хрусталика, крыс- /. ДИ. Князев, И.П. Иванова // Международный журнал экспериментального образования.-2012.-№6.-С. 14.

5. Князев, ДИ. Модификации белков хрусталика-животных в процессе старения" / Д.И.'- Князев, И.П. Иванова, СВ. Трофимова // Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные научные вопросы: Реальность и перспективы». Часть 7. —Тамбов. — 2012. -С.54-56.

6: Князев, Д.И. Структурные параметры и модификации протеома хрусталиков крыс в ходе постнатального онтогенеза/ Д.И.Князев, И.П. Иванова // Материалы 17-й международной школы-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века». -Пущино. -2013. -С. 427-428.

Список сокращений : .

АФК-активные формы кислорода . ■ о, ■ —

ДК—диеновые коныогаты :

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СКД-сопряжённые кетодиены < V .

SOD - суперокЬиддисмутаза

Подписано в печать 30.05.2013 Формат 60x84 1/16. Печать офсетная Печ.л. 1 Тираж 100 экз. Заказ № 164 Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия 603107, г. Нижний Новгород, проспект Гагарина, 97

Типография НГСХА

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Князев, Дмитрий Игоревич, Нижний Новгород

ГБОУ ВПО «НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

04201360280 На^^жрукописи

Князев Дмитрий Игоревич

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ХРУСТАЛИКА КРЫС В ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ

03.03.01 физиология

диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Доктор биологических наук Иванова Ирина Павловна

Нижний Новгород 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Принятые сокращения...................................................................5

Введение....................................................................................6

Глава 1. Обзор литературы.............................................................11

1.1 Развитие хрусталика в онтогенезе, краткий обзор

морфологии и анатомии хрусталика.................................................11

1.2. Физиологические и биохимические особенности хрусталика............12

1.2.1. Кристаллины как основные структурные белки хрусталика........12

1.2.2. Межклеточный транспорт...................................................14

1.2.3. Цитоскелет.....................................................................17

1.2.4. Мембраны......................................................................18

1.2.5. Редокс-гомеостаз хрусталика..............................................24

1.3. Процессы модификации липидов и белков хрусталика

в ходе постнатального развития...................................................26

1.3.1. Окисление и деградация липидов.........................................26

1.3.2. Модификации белков хрусталика в ходе постнатального развития................................................................................28

Глава 2. Материалы и методы исследования.......................................32

2.1. Экспериментальные группы животных, подготовка проб, аппаратная база...........................................................................32

2.2. Реактивы..............................................................................33

2.3. Основные методы исследования

2.3.1. Оценка концентрации общих липидов и общих белков...............33

2.3.2. Экстракция липидов, спектральные измерения липидной фракции хрусталиков...............................................................................34

2.3.2.1 Экстракция липидов......................................................34

2.3.2.2. Определение молекулярных продуктов свободно-радикального окисления липидов и уровня ненасыщенности...........35

2.3.2.3. Анализ уровня липофильных антиоксидантов.....................36

2.3.3. Исследование концентрации ТБК-активных комплексов............36

2.3.4. Изучение структурных параметров протеома и белковых модификаций...........................................................................37

2.3.4.1. Определение тиоловых (8Н-) групп................................37

2.3.4.2. Оценка карбонильных производных................................38

2.3.4.3. Измерение флуоресценции триптофанила, КПНГ, битирозиновых сшивок..........................................................39

2.3.4.4. Анализ уровня поверхностной гидрофобности....................40

2.3.5. Исследование ферментативной активности каталазы

и супероксиддисмутазы............................................................41

2.3.6. Хроматографический анализ липидов.....................................43

2.4. Анализ аминокислотных последовательностей

кристаллинов крыс...................................................................45

2.5. Обработка данных..................................................................45

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение..............................47

3.1. Оценка основных физиологических и биохимических параметров хрусталика крыс в постнатальном развитии........................................47

3.1.1 Уровень белка в гомогенате и водорастворимой

фракции хрусталиков................................................................48

3.1.2. Уровень общих липидов....................................................51

3.2. Возрастная динамика накопления продуктов свободно-радикального окисления липидов в хрусталиках крыс...........................54

3.2.1. Концентрации первичных продуктов....................................54

3.2.2. Уровни вторичных и конечных продуктов..............................58

3.3. Динамика уровня двойных связей и накопления липофильных антиоксидантов.........................................................................62

3.4. Возрастная динамика активности каталазы и супероксиддисмутазы...66

3.5. Модификации и структурные характеристики белков хрусталика......72

3.5.1. Сульфгидрильные группы в гомогенате и водорастворимой

фракции.................................................................................72

3.5.2. Динамика концентраций карбонильных производных...............80

3.5.3. Конечные продукты неферментативного гликозилирования........84

3.5.4. Возрастной профиль изменения флуоресценции триптофана

и уровня поверхностной гидрофобности........................................87

3.5.5. Динамика уровня битирозина в водорастворимой

фракции хрусталиков крыс........................................................98

3.6. Особенности и динамика изменений липидного состава хрусталиков крыс в ходе постнатального онтогенеза...........................102

3.6.1. Соотношения фосфолипидов и нейтральных липидов..............102

3.6.2. Динамика фосфолипидного состава хрусталиков....................109

3.6.3. Состав нейтральных липидов в хрусталике крыс.....................114

Заключение..............................................................................118

Выводы....................................................................................122

Список литературы.....................................................................124

Принятые сокращения

АФК - активные формы кислорода ДАГ - диацилглицериды ДК - диеновые конъюгаты ДС - двойные связи

КПНГ - конечные продукты неферментативного гликозилирования

МАГ - монацилглицериды

МДА - малоновый диальдегид

HJI - нейтральные липиды

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СКД - сопряжённые кетодиены

СМ - сфингомиелин

ТГ - триглицериды

ФЛ - фосфолипиды

ФС - фосфатидилсерин

ФХ - фосфатидилхолин

ФЭ - фосфатидилэтаноламин

AQP0 - аквапорин О

SOD - супероксиддисмутаза

ВВЕДЕНИЕ

Изучение механизмов функционирования и регуляции работы клеток и органов является важным вопросом физиологии. Хрусталик глаза, обеспечивая светопропускание и фокусировку света на сетчатке, обладает набором особенностей, определяющих его структуру и методы изучения. Среди них: постоянный рост в течение всей жизни, реализация метаболических процессов без непосредственного контакта с кровотоком, очень глубокая дифференцировка клеток, сопровождающаяся синтезом структурных белков и утратой органелл. Баланс между различными сигнальными и метаболическими путями, регулирующими развитие и функционирование данного органа, реализуется в слабо- и умеренно-дифференцированных клетках внешних слоев хрусталика. Таким образом, хрусталик глаза является подходящей моделью для изучения молекулярных механизмов реализации физиологических функций и их поддержания на этапах, длительность которых сопоставима со временем жизни организма.

В качестве основного движущего фактора старения и нарушения функций хрусталика традиционно рассматривается деструктивное действие активных форм кислорода (Truscott, 2005; Berthoud, Beyer, 2009). С другой стороны, в последние 5-10 лет всё больше внимания уделяется сигнальной функции активных форм кислорода, изучению их участия в нормальных физиологических процессах клетки - пролиферации, дифференцировке, адаптационных процессах (Wang, Lou, 2009; Cassano et al., 2010; Emerling et al., 2009). Также, малоизученными остаются аспекты взаимного влияния свойств и модификаций липидов и белков хрусталика в ходе постнатального онтогенеза и их связь с реализацией оптических функций хрусталика.

Структурно-функциональное состояние белков и липидов хрусталика обуславливает его функционирование. В связи с этим, комплексное изучение параметров белков и липидов хрусталика, а также оценка влияния

свободно-радикальных процессов на структуру липидов и белков на протяжении жизни актуальны как в контексте выполнения хрусталиком своих физиологических функций, так и для исследования молекулярных и физиологических механизмов старения.

Цель и задачи исследования

Цель работы - исследование структурно-функциональных параметров мембран, модификаций липидов и белков хрусталика крыс в постнатальном онтогенезе.

Основные задачи исследования

1. Исследование возрастной динамики интенсивности окислительных процессов в хрусталиках крыс, ферментативных и неферментативных компонентов антиоксидантной защиты.

3. Оценка структурных особенностей мембран хрусталика в ходе постнатального онтогенеза крыс.

4. Анализ взаимосвязей исследуемых параметров окислительных и структурных процессов с динамикой роста хрусталика и реализацией его оптических функций.

Научная новизна

Впервые исследована динамика интенсивности окислительных процессов в хрусталике крыс. Установлено снижение в процессе старения интенсивности свободно-радикальных процессов в липидной фракции хрусталиков крыс. В хрусталике крыс впервые изучена возрастная динамика активности каталазы и супероксиддисмутазы. Максимальная активность каталазы и супероксиддисмутазы наблюдается в возрасте 1 мес. и 12 мес.

Выявлена прямая корреляция между содержанием двойных связей и уровнями липофильных антиоксидантов (токоферола и ретинола) в хрусталике крыс в процессе постнатального онтогенеза.

Установлено, что баланс между окислительными и структурными процессами в липидах и белках мембран и цитозоля клеток хрусталика определяет светопропускающую функцию хрусталика на поздних возрастных этапах.

Теоретическая и практическая значимость работы

Экспериментальные данные, полученные в настоящей работе, могут быть использованы при разработке новых подходов и методов профилактики и терапии возрастных нарушений физиологических функций хрусталика, таких как дальнозоркость и катаракта.

Новые сведения о возрастной динамике структурно-функциональных характеристик липидов и белков хрусталика могут быть включены в учебные курсы по физиологии и биохимии при подготовке специалистов, ветеринарного и медико-биологического профиля.

Положения, выносимые на защиту

2. Период замедления темпов роста хрусталика (6-12 мес.) характеризуется активацией синтеза белка, увеличением концентрации водонерастворимого белка, ростом интенсивности окислительных процессов и активности ферментативного звена антиоксидантной защиты.

3. В период 6-12 мес. наблюдается обогащение мембран холестерином, увеличение уровня поверхностной гидрофобности белков, переход восстановленных тиолов в мочевино-растворимую фракцию. При этом активация окислительных процессов и структурных перестроек не сопровождается возникновением помутнений в хрусталике.

4. Поздний возрастной этап (12-24 мес.) характеризуется минимальными темпами прироста массы хрусталиков, что сопровождается ростом концентрации общего и нерастворимого белка, синтезом насыщенных липидных компонентов хрусталика. Интенсивность окислительных процессов на мембранах снижается до минимальных значений, тогда как уровни белковых модификаций в цитозоле клеток хрусталика значительно возрастают.

Апробация работы

XXII межрегиональная научно-практическая конференция с международным участием «Новые технологии микрохирургии глаза»,

Оренбург, 18 ноября, 2011; Международная заочная научно-практическая конференция «Актуальные научные вопросы: реальность и перспективы», Тамбов, 26 декабря, 2011; II Международная научно-практическая интернет-конференция "Проблемы и перспективы развития науки в начале третьего тысячелетия в странах СНГ", Украина, Переяслав-Хмельницкий, 26-28 мая, 2012; XIII Международная научная конференция: «Актуальные вопросы науки и образования», Москва, 21-23 мая, 2012; II Всероссийская научная сессия молодых ученых и студентов «Современные решения актуальных научных проблем в медицине», Нижний Новгород, 14-15 марта, 2013; 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология - наука XXI века», Пущино, 22-26 апреля, 2013.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 3 публикации в журналах рекомендованных ВАК.

Объём и структура диссертации

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Развитие хрусталика в онтогенезе, краткий обзор морфологии и анатомии хрусталика.

а) Закладка в эмбриогенезе. После инвагинации и замыкания хрусталиковой плакоды хрусталик принимает вид «пузыря», или полого шара (рис.1). Эпителиальные клетки задней поверхности хрусталикового пузыря удлиняются кпереди, формируя первичные клетки волокон. Передние эпителиальные клетки делятся и «вытесняются» к экватору, где подвергаются дифференцировке - растягиваются к переднему и заднему шву, формируя вторичные волокна.

Рис.1. Стадии эмбрионального развития хрусталика (Francis et al.,1999).

б) Зрелый хрусталик - прозрачный, бессосудистый, многоклеточный орган, клетки хрусталика соединены посредством развитой системы межклеточных контактов. Монослой эпителиальных клеток располагается на передней поверхности хрусталика (рис.2). Под слоем эпителия располагаются концентрические слои клеток волокон хрусталика. Волокна, находящиеся в процессе дифференцировки, составляют поверхностные слои (кора хрусталика); зрелые волокна составляют ядро хрусталика. Процесс дифференцировки новых клеток волокон из эпителия начинается в зоне экватора, и, таким образом, новые волокна непрерывно добавляются с периферии хрусталика. Таким образом, зрелый хрусталик можно условно

разделить на 3 основных зоны: эпителий, дифференцирующиеся волокна (кора хрусталика) и зрелые волокна (ядро хрусталика).

Дифференцировка волокон сопровождается утратой всех органелл для обеспечения максимальной светопропускающей способности (Bassnett, 1997). В ходе дифференцировки происходит перестройка цитоскелета волокон, изменения морфологических и структурных особенностей мембран (Bassnett et al., 1999; Al-Ghoul et al., 2010). В процессе дифференцировки наблюдается увеличение плотности щелевых и тонких контактов, реализуемых за счёт коннексинов и аквапорина 0 соответственно (Biswas et al., 2009; Mathias et al., 2010).

Рис.2. Схема строения хрусталика грызунов (De Maria et al., 2009). 1 - эпителий; 2 - волокна в процессе дифференцировки; 3 - экватор; 4 -передний шов; 5 - задний шов; 6 - зрелые волокна (ядро взрослого); 7 -эмбриональное ядро.

1.2. Физиологические и биохимические особенности хрусталика 1.2.1. Кристаллины как основные структурные белки хрусталика Кристаллины составляют до 90% массы всех белков данного органа и обеспечивают его светопропускающую способность (Groenen et al., 1994; Han, 2006). Кристаллины представлены тремя группами - a-, Р- и у-

кристаллинами. Представители внутри каждой группы имеют высокий уровень гомологии (Bloemendal et al., 2004).

Группа а-кристаллинов объединяет два гомологичных белка - аА и аВ-кристаллин - молекулярной массой около 20 к Да,. В геноме человека данные белки кодируются отдельными генами - CRYAA и CRYAB; размеры - 173 и 175 аминокислотных остатков соответственно (Hansen et al., 2007) . а-кристаллины входят в семейство белков теплового шока (HSP, heat-shock protein). Белки этого семейства широко представлены в мозге, мышцах и лёгких. Наряду с выполнением структурной функции, а-кристаллины являются шаперонами - связываясь с повреждёнными/денатурированными белками (в т.ч. Р" и у-кристаллинами), ингибируют их преципитацию и аггрегацию - поддерживая таким образом светопропускающую способность и целостность волокон хрусталика. Также, являясь шаперонами, а-кристаллины обеспечивают надлежащий фолдинг синтезируемых белков и, что особенно важно, участвуют в сохранении правильной третичной структуры белков. По сообщению Zampigchi и коллег, аА-кристаллины, связываясь с элементами цитоскелета, образуют пространственно упорядоченные надмолекулярные комплексы, по

Информация о работе

Князев, Дмитрий Игоревич
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2013
ВАК 03.03.01

Диссертация

Физиолого-биохимические характеристики хрусталика крыс в постнатальном онтогенезе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы