Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуноферментный анализ антител к нейроспецифическим белкам в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера при патологии, сопровождающейся его прорывом

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммуноферментный анализ антител к нейроспецифическим белкам в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера при патологии, сопровождающейся его прорывом"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи УДК 616. 831. -005. 4-036.11-092.9-07

РЯБУХИН Игорь Александрович

ИШУ1ЮС£РКЕНГШЙ АНАЛИЗ АНГКГБЛ К НЕЯРОСПЕЩШЧЕСККЫ БЕЛКАМ В ОЦЕНКЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА ПРИ ПАТОЛОГИИ, СОПРОВОДДАЩЕЙСЯ ЕГО ПРОРЫВОМ

03. 00. 04 г биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Мэсквз 1993

Работа выполнена в Государственном Научном Центре Социальной и СудеСной психиатрии им. Е П. Сербского

Научный Руководитель:

#

доктор медицинских наук, профессор а П. Чехонин Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А. А. Терентьев доктор медицинских наук, профессор Л. Ф. Панченко

Ввдушдя организация - Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова

Защита состоится "____"................. 1993 г.

в .... часов на заседании Специализированного совета К 084.14.05 при РГМУ им. Н И. Пирогова

( г. Москва, уд. Островитянова , 1 )

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Университета Автореферат разослан "....".................. 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

кандидат медицинских наук Т. II Клуишна

Актуальность исследования. Специфические свойства клеток той или иной ткани определяются структурой и функдаями характерных для нее белков. В связи с этим в различных областях науки, изучающих мозг, перспективным считается исследование ней-роспецифических белков (НСБ) - биологически активных молекул, ларактеризуютихся относительной специфичностью для клеточных структур нервной ткани и органически связанных с обеспечением интегративных функций как клеток, так и мозга в целом (Moore 3. V. , 1972,Signaiu А, 1973, Полетаев А. Д 1987, Чехонин Е П. 1089).

Иммунохиммческое изучение антигенного состава ткани мозга в течение 20 лет позволило описать около 20 различных.НСБ. to следует признать, что проблема НСБ Остается открытой, причем,' как а прикладном, так и в фундаментальном аспекте. Учеными не изучены особенности метаболизма НСБ в норме и при патологии, не исследованы вопроси ангителооСразования к НСБ и возможной агрессии этих антител(AT) в мозг. Не решен окончательно вопрос о возможности использования AT к НСБ в качестве маркеров прорыва гематоэнцефаличесгаго барьера(ГЭЕ) при нервных и психических заболеваниях, нейроинфекциях, травмах и опухолях головногд мозга. Также нет однозначного ответа на вопрос о возможном применении в качестве контроля за эффективностью и качеством лечения специфических AT к НСБ. Огромный научный и практический интерес. вызывает также возможность использования специфических AT к НСБ в качестве вектора дгя доставки в мозг определенных маркеров или лекарственных препаратов. (Frikke M. J. et al. 1987., Perry & et al., 1987, Ередбери \i , 1983, Майзелис H. Я , 1986, Чехонин В. IL 1989).

Цолыз нлетояцего ¡^следования явилась разработю высокочувствительного метода иммунохимического определения AT к четырем НСБ - GFAP, альфа-Я глигеопротеину(П1) мозга, альфа-1 глобулину

иоага(ВО) 11 альфа-£ глобулину мозга(Ьб) в биологических жидкое тял Солышх нервно-психическими заболеваниями, возможность при ивиения разработанных методов для поиска этих ЛТ в биологических лидксстях больных различными нервно-психическими и соматическими заболеваниями, которые сопровождаются нарушением функции ГЭБ,' а такие исследование в эксперименте на модельных жи-вотяих возможности использования ЛТ к НОВ в качестве маркеров прорыва ГЭВ при воздействии гамма-излучения и галоперидола.

Задачи исследования:

1. Получение моноспецифических антисывороток (АС) к ОТАР, адьфа-2 ГГ1, альФа-1 ВО и алъфа-2 ва.

- 2. Получение монсспецифических АТ к ОТАР, алъфа-2 ГП, аль-фа-1 Вй и альфа-2 ВЗ на основе полученных АС.

3. Разработка и ' апробация высокочувствительного метода твердофазного ии.ууноферменпюго анализа АТ к в?АР, альфа-2 ГП, альфа-1 ВЗ и альфа-2 В6 в биологических жидкостях больных различными нерано-психическими и соматическими заболеваниями, еоп ровоздащихс!- ларушениоы функции ГЭБ.

4. Доказательство вгрс^-.-юсти проникновения АТ к НСБ в нов; при нЕОушеч!«1: фушщии ГЭБ в эксперименте на крысах.

Научная шшсша. Разработана высокочувствительная иммуно-фррмгитная тест-система для определения АТ к четырем ШБ -ОРАР, а.ифа-£ ГП, альфа-1 КЗ и альфа-2 ВО в биологических жидкостях. Проведена апробация на клиническом материале и выработаны рекомендации по научению АГ к вше перечисленным белкам при заболеваниях, соировоздащихся нарушением функции ГЭБ. Установлен феномен проникновения АТ к НСВ через поврежденный ГЭБ в направлении кровь-мовг, избирательном накоплении АТ в ткани шага, сопровождающимся развитием шспецифическлх воспалитель-шн реакций в ^каии мезга.

Практическая цошюсть. Разработаны и предложены иммунохи-«ические методы определения АТ к БРДР, альфа-2 ГП, альфа-1 КЗ и ты!»-2 К, на основе чего даны практические рекомендации при-«енения этих тестов в-клинике для комплексного 'обследования ■

I

кзльного.

Апробация диссертационного натер>зала_ Основный полокенил шссёртации были доложены на меллабораторных конференциях ВНИ-50СП им. а П. Сербского (1989-93), 10-м съезде Европейской фе-1ерации иммунологичесгах обцеств (Эдинбург, 1990), Всесоюзном :импозиуме "Химия белков" (Тбилиси, 1990), симпозиум--' "Еиоло-■ические проблема нервных и психических заболеваний" (Ростов-га- Дону, 1993).

ОЗген работы. Диссертация изложена на машинописных

границах и состоит из введения, 6 глав, выводов и Сиблиографя-[еского указателя. Диссертация иллюстрирована № рисунками и

таблицами. ...

С О л В Р И А Н К и ДИССЕРТАЦИИ

Цатериалы и методы иселедоватга. Материалом исследования вились органы, ткани и биологические жидкости человека, коро-. ы, свиньи, овцы, собаки и крысы.

Очищенные препараты НСБ были любезно предоставлены зав. лаб. ммунохимш ЕКЖССП им. 3. П. Сербского, д. м. н. , проф. В. П. Чехони-км, и научным сотрудником лаборатории, к. б. н. Е. А. КоротеевоЯ. ыворотку крови и спинномозговую жидкость больных и доноров олучали со станции переливания, крови па клиники психиатрии ШСИ м. Н. А. Семгскс, отдел?, нейрохирургии МОЮКИ им. М. Ф. Владимирского, ¿зкорсксй клиническсП психиатрической больницы N 1 им. П. й Каш,ен-

4 .

ко, клиник детской неврологии и педиатрии Российской мед. академии, клиники инфекионньус болезней ММОИ им. IL А. Семашко.

Ткань мозга человека, необходимую для приготовления экстракта, получали из моргоь при Московских городских клинически* больницах N 1 л N 65, а также из морга Ь!асковскоП клинической психиатрической 'больницы Н1 им. IL IL Каденко. Крысы и кролики для экспериментов были получены, на- вивария ШШОСЛ им. R IL Сербского. Работы по изучению воздействия на животных ионизирующего излучения проводились на базе лаборатории радиологи ШК

Еля получения актисывороток(АС) применялась иммунизация кроликов породы вшшшлла( массой 3-4 кг). При этой использовались высокоочищенные препараты GFAP, альфа-2 ГП, альфа-1 BG и альфа-2 ЕЗ с высокой степенью гомогенности.

После оценки качества АС при хорошем результате заСор крови, производили через 2-3 дня в течение 15-20 дней. Кровь получади из краевой вены уха в количестве 30-60 мл. Полученную АС консервировали 0,022 азида натрия и хранили при +4-8 С.

Каждая серия полученных АС предварительно исследовалась на присутствие в них AT к МОБ. Преципитнрующыя способность в реакции с АГ изучалась с помощью иммушдиффузного анализа, иммуноэ-лектрофорава и перекрестного иммуноэлектрофореза no Lourell С. В. При наличии дуг преципитации в реакции с АГ и при отсутствии их в реакции с сывороткой крови доноров и экстрактами из органов и тканей, АС отбирались для следующего этапа. . lia следующем этапе разрабатывалась стандартная тест-система к изучаемому АГ по методу IL И. Храмкоюй и Г. И. Абеле ва. Полученные стандартные' тест-системы проходили этап стандартизации с ранее известными НСБ и АС к ним. -,

Для выделения специфических AT к ГОБ применялся метод аффи-цой хроматографии. В качестве носителя для а4финной хроматографии использовалась циаибромироааиная сефароэу 4В с икмобилиэо-

данными на ней препаратами НОЯ

Для определения общего белка в исследуемых образцах на сталях получения АТ применялся хорошо зарекомендовавший себя метод ,о»гу 0. Н. Для определения концентрации АТ к НОВ в концентрациях >т 50 пг/мл до 1 мкг/мл нами использовались секдвич-вариант и галоночный микрореакторный вариант иммуноферментного анализа.

Результаты исследования и и обсуждение. На фоне все возрас-■аюцего интереса к определению значения и функций НСБ в организме тало развиваться новое и перспективно? направление по изучению 1эаимодействия НСБ и иммунной систекш организма при различных па-ологических состояниях, когда происходит "прорыв" ГЭБ. При этих остояниях, вызванных как различными нервными и психическими э^-олеваниями, черепно-мозговыми травмами,- различными инфекционным аболеваниями, так и воздействием фармакологических препаратов ли радиации, происходит прорыв НСБ в направлении мозг - кровь. СБ вступают в контакт с иммунско'млетентныии клетками' организма, енсибилизируот их, вызывая выработку АТ к НСБ. При некоторых па-ологических процессах эти АТ проникали через ГЭР в направлении ровьмозг. Создались предпосылки для разработки теории о заметной оли АТ к НСБ в патогенезе некоторых нервных и психических завоеваний. Но в то яе время не было известно, какие именно АТ к ка-им НСБ принимали участие в "поломке" слаленной работы организма.

9

В данной работе была предпринята попытка получения моноспе-ифических антисывороток к четырем известным и относительно хо-ого изученным НС Б-СТАР, альфа-2 ГП, альфа-1 БС и альфа-2 НЗ, аделение моноспецифических АТ из этих антисывороток и разработ-з системы иммунохимического определения АТ к НСБ в биологичес-ш жидкостях больных различными заболеваниями.

Очищенные препататы выше перечисленных НСБ были использованы , ия получения моноспецифических антисывороток. Каждая серия по-

е

лученных АС предварительно исследовалась на присутствие в них АТ к НСБ. После этого отобранные ннтиенворотки ие 'ользовапись для выделения и» них специфических АТ к М~:Б с помощью аффинной хроматографии. В качестве носителей дли аффинной хроматографии мн применяли цианбромированную сефарозу 4В о иммобилизованными на ней НСБ, АТ к которым мы собирались выделять.

Выделенные АТ в дальнейшее были использованы для создании им-муноферментных систем по определению АТ к 6ГАР, альфа-2 ГП, альфа-1 ВО и альфа-2 ВО в биологических жидкостях человека. Причем, если для определения АТ к ОГАР и альфа-? ГП был разработан классический сендвич-вариант иммуноф?рментного анализа с пределом Чувствительности 0,8 нг/мл, то в случае определения АТ к альфы-1 ВО и альфа-2 КЗ выяснилось, что твердофазный вариант иммунофермент-ного анализа недостаточно чувствителен для их определения. Это побудило нас разработать модификацию иммуноферментного анализа на основе колоночного микрореактора, что позволило за счет концентрирующего эффекта колонки снизить минимально определяемый у|ювень исследуемых АТ. Так, предел чувствительности определения АТ к аль-фа-1 ВО и альфа-2 Б(3 составил 0,35 нг/мл. Проверка'специфичности иммуноферментных систем определения АТ к выше названным НСБ выявила отсутствие' перекрестных иммунохимических реакций меаду собой, а также между .белками, сыворотка крови человека, крысы, собаки, свиньи и крупного рогатого скота и антителами к Э-ЮО, тубулину, кальмодулииу, 14-3-2. Иалибровочныэ кривые определения АТ к НСБ Представлены на рис. 2, 3.

Учитывая тот факт, что в состав структур, формирующих ГЭВ , входят астроциты и одигодендроглиациты(в состав астроцита входит белок альфа-1 КЗ, а белок альфа-2 ВСЗ определяется как в астроци-тах, так и в олигодендроглиацитах),можно использовать как сами эти НСБ, так и АТ к ним как маркеры прорыва ГЭБ.

Следующим этапом работы была апробация в клинической практике разработанных иммуноферментных тест-систем анализа аяти;ел к 6FAP,. альфа-2 ГЛ. альфа-1 BG и альфа-2 BG в спинномозговой жидкости и сыворотке крови больных различными нервно-психическими и соматическими заболеваниями, при которых мог происходить прорыв ГЭБ,а также в сыворотке крови экспериментальных животных с моделированным прорывом ГЭБ. Следует отметить, что в сыворотке крови здоровых людей AT к GFAP, альфа-2 ГП, альфа-1 BG и альфа-2 BG, используя соответствующие варианты ELISA с вышеуказанными параметрами предела чувствительности, обнаружить нэ удалось. AT к QFAP и ■ альфа-2 ГП не были найдены и в сыворотке крови крупного рогатого скота, свиньи, собаки и крысы.

Результаты иммуноферментного определения АГ к НСБ в сыворотке крови больных представлены в таблицах 3 и 4 . Необходимо . отметить, что иммуноферменгкому анализу подвергались образцы сывороток крови, в которых не были обнаружены указанные выше ЮБ.

Третьим этапом исследования было определение динамики появления НСБ и AT в сыворотке крови больных, находящихся в ургент-иом состоянии, обусловленном нейролепсией, энцефалитом и открытой черепно-мозговой травкой. Сказалось, что практически у всех больных к моменту поступления в реанимационное отделение олре-. • делялись прорыв ГЭБ и элиминация НСБ в кровь. Их уровни стремительно росли, достигая максимума к 5-8 дню от момента развития критического состояния. Параллельно с 7-10 дня в сыворотке крови вачинали определяться AT к НСБ, концентрация которых экспоненциально увеличивалась до 102-256 нг/мл к 19-22 суткам. К нормаль-иьм количественна показателям уровни НСБ возвращались к 16-22 :уткам, . а AT переставали обнаруживаться в сыворотке крови к 32-46 суткам от момента развития критического состояния. Вадио )Гметить,что образование AT к альфа-2 ГП и GFAP происходила в

том случае, если концентрация соответствующего АГ превышала 32 иг /мл, а для АТ к альфа-1 ВО и альфа-2 В8 -1,6 нг /ид. Сопоставляя количественные характеристики ДО£ и АТ к шш в сыворотке крови со стадийность» и тяжестью течения заболеваний, можно сделать вывод о том, что кризисный период в течении заболеваний, сопровождающийся массивным прорывом ГЭБ, приходится на 5-12 сутки от начала развития критического состояния. Именно в этот момент в сыворотке крови обнаруживаются максимальные концентрации НСБ и начинают определяться АТ к ним. Интенсивное появление АТ с максимумом. приходящимся на 19 -26 сутки, косвенно свидетельствует о восстановлении барьерной функции ГЭБ ( для белков с молекулярной массой выше 50 кД ) и предвещает благоприятный выход больного ив критического состояния. Напротив, отсутствие АТ в сыворотке крови к 10 суткам и Параллельное нарастание уровня НСБ лосве* но показывало на отсутствие восстановления нормальной функцш ГЗБ, прогнозируя тем самым неблагоприятный исход. В этой случае АТ к НСБ обнаруживались в спинномозговой жидкости, подтверждш цеи самым существующую гипотезу о проникновении АТ из крови I ткань мозга при нарушении функции ГЭБ. Элиминация АТ в спинномозговую жидкость была выявлена у 18 из 21 (832) пациентов, находящихся в критическом состоянии, обусловленном нейролепсией, фебрильной шизофренией, энцефалитом и открытой черепномозгово! травмой, 15 из них (В6Х) впоследствии погибли при явлениях равной степени отека иоэга.

Четвертым этапом было исследование проницаемости ГЭБ для НС] И АТ к ним. С этой целью нами использовались следующие экспериментальные воздействия: ■

1. Ионизирующее гамма-излучение.

2. Инъекции высоких кое психотропных препаратов.

Изучение влияния вышеперечисленных способов воздействия н

барьерную функцию ГЭБ проводилось при помощи иммупоферментног

/

э

метода, определяющего уровень ЛГ к GFAP и аифа-2 ГЛ, появляю-•шихся в сыгорот'ке крови после проникновения через измененный ГЭБ НСБ и контакте последних с иммунокомпетентными клетками. Эти эксперименты проводились на белых беспородных крысах массой 170-230 г. Кровь для анализа брали из хвостовой вены.

Исследование ионизирующего воздействия проводилось после однократного облучения на'установке "Луч" (Со-60) в дозах от 1 до 10 Гр, при мощности дозы 0,96 Гр/мин.

Искусственную нейролепсию вызывали путем внутрибрюшинного введения галоперидола (Гедеон, Рихтер, Венгрия) из расчета 5 мл (25 иг) на 1 кг массы животного. Оценку экспериментальной нейро-лепсии проводили общепринятым методом, разработанным Temkcv D.S.

В своих экспериментах мы применяли дозы ионизирующего воз-» действия, равные 1 и 5 Гр. Кровь забирали на 5, 8, 10 и 12 сутки после облучения в количестве 0,5 мл. Следует отметить, что после однократного .воздействия выявить AT к GFAP и альфа-2 ГЦ в. сыворотке крови 25 крыс нам не удалось, несмотря на мощную элимкла-ция в кровь самих АГ( до 102,4 нг/мл). Вторую серию эксперимента . проводили через месяц, используя дозу 1 Гр. На 5 сутки после вторичного воздействия дозой гамма-излучения, равной 1 Гр, мы обнаружили соответствуют1? AT, однако их концентрация для GFAP не превышала 6 нг / мл, а для альфа-2 ГП -7,2 нг/мл. Попытка усшить специфический иммунный ответ путем-прорыва ГЭБ .при помощи третьего гамма-облучения животных дозой 1 Гр к успеху не привела Полученные результаты не дают оснований считать, сколь-ни-будь значимой роль-AT к НСБ в патогенезе развития мозговой формы лучевой болезни.

Прорыв ГЭБ для 6FAP и альфа-2 ГП вызывали путем внутрибрю-ипшого введения беспородным белым крысам массой 200-250 г гало-перидола в доге 25 мт на 1 кг массы тела. Кровь забирали на 5, 8, 10 ч 12-е сутки после инъекции. Результаты количественного

анализа АТ к перечисленным выше НСБ после первого, второго, третьего и четвертого экспериментов по прорыву ГЭБ приведены на рис. 1, из которого видно, что первый контакт иммунной системы с НСБ приводил к сенсибилизации организма, второе моделирование нейродепсии, проведенное через месяц, позволило уже на 4-е сутки от момента инъекции обнаружить АТ к <ЗРАР и альфа-2 ГП у 181(7 из 40} экспериментальных животных. ' Третья инъекция галоперидола, проведенная месяц спустя после второй, способствовала новому кон. такту иммунокомлетеитных клеток с НСБ, в результате чего АТ к 6РАР и альфа-2 ГП были выявлены у 57Х животных. Уровни АТ от инъекции к инъекции росли, достигая максимума в четвертом эксперименте. Период полувыведения их в среднем равнялся 6-8 дням.

Анализируя полученные результаты, можно сделать вывод о том, что многочисленные осложнения, возникающие у больных при лечении их нейролептиками, нередко приводят к прорыву ГЭБ НСЕ и выработке к последним АТ. Иммуноферментный анализ АТ при такой ситуации может быть рекомендован в качестве дополнительного теста, погво-лйвдзго оценивать степень нарушения резистентности ГЭБ и контролировать дальнейшую возможность терапии тем или иным нейролептиком.

Полученные данные свидетельствовали о том, что контакт НСБ с иммунной системой вызывает сенсибилизацию иммунокомпетентных клеток и при повторном контакте стимулирует выработку соответствующих АТ. При проведении экспериментов мы не наблюдали первйч-'. иого иммуного ответа, однако вторичный иммунный ответ наблюдался нами в БСИ00% случаях. Таким образом, имеются все основания полагать, что образование АТ может сопровождать любой патологический процесс, который характеризуется прорывом ГЭБ и выходом в кровь НСБ. .. '

Пятым этапом работы было доказательство вероятности проникновения в мозг АТ к НСБ при экспериментальном прорыве ГЭБ. 'Кры-

:ам с предварительно нарушенным ГЭБ ( гамма-облучение в дозе б Гр) вводили внутривенно препарат меченых 1-125 АТ к (ТАР и альфа -2 ГЛ. Контрольную группу составляли животные с полноценным ГЭБ, г. е. необлученные, которым вводили аналогичные препараты. Животных забивали через определенные интервалы времени и сканировали внутренние органы на гамма - счетчике. Полученные при этой дан- . иыэ свидетельствовали о том, что в случае полноценного ГЭБ специфические АТ к мозговым белкам в мозговую ткань не попадает, а ■плеюааяся радиоактивность обусловливалась радиоактивность» крови з сосудах головного мозга. Но в случае с поврелданнь.»,! ГЭБ выяс-шлось, ' что'АТ к НОВ, меченые радиоактивной меткой, накопились з ткани головного мозга в количестве, превыпштам концентрацию в фугих органах почти в б^раз ( таблицы 1,2). ,

И наконец, шестым этапом настоящей ' работы было выявление юзмохлых морфологических проявлени/1 при доказанной возможности ¡роншшовения АТ к-НСБ в ткань мозга- С это Л целью крысам с "отертым" галоперидолом ГЭБ внутривенно вводили специфические АТ к !РАР и альФа-2 ГЛ, после чего лмвотиые забивались и ткань мозга юследовалась на предмет морфологических изменений. В ячестве1

I

кзнтроля'выступали жвотные с неповревденным ГЭБ. Выявлено, что г животных с нарушенным ГЭБ АТ к НСБ попали в мозговую ткань. )то проявлялось в виде набухания нейронов, отека и набухания ас-•роцитов, диффузной пролиферации олигодендроглиацитов, расшире-ше меяметочных промежутков. В контрольной группе подобных эф-ектов не наблюдалось.

с,

Таблица 1.

, ПРОЦЕНТНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ 1-125 МЕЧЕНЫХ АНТИТЕЛ К СУАР И АЛЬФА-2 ГП НА ТРЕТЬИ СУТКИ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ЭШПЕГИШГГАЛЫШ ШЙОТНЦМ.

1 Органы I Меченые 1-125' АТ, вве- 1 ........- .........— | Меченые 1-125 АТ, вве-

(по 1 г) I денные после гамма-облу- I денные нормальным

I чения дозой 5 Гр | животным

1 Швг 1 0,630+0,040 I 0,021+0,003

Сердца I 0,025+0,003 I 0,028+0,002

Кровь | : 0,120+0,020 • 1 0,800+0,040

Почки 1 0,038+0,004 | 0.022+0,004

Легкое 1 0,013*0,003 I , 0,012+0,002

Шчень I 0,110+0,008 I ' 0,080+0,009

Селезенка I 1 0,040+0,004 I ' 0,010+0,003 1

Расчет веди от общего количества вводимой радиоактивной

метки. 1

1 Таблица 2.

ПРОЦЕНТНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ 1-125 МЕЧЕНЫХ АНТИТЕЛ К АЛЬФА-1 КЗ

И АЛЬФА-2 ИЗ НА ТРЕТЬИ СУТКИ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ

/ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ЖИВОТНЫМ.

< Органы I Моченые 1-125 АТ, вве- 1 I Печеные 1-125 АТ, вве-

(по 1 г) 1 денные после гамма-облу- I денные нормальным

весу ткали 1 чения дозой 5 Гр I животным

1 Шаг I 0,031+0.005 I 0,022+0,004

Сердцэ I 0,083+0,005 I 0,028+0,003

Кровь I 0,557+0,040 1 0,836+0,010

Лчки 1 -0,033+0,006 | 0,023»0,004

Лапше | 0,039+0,002 ■ I 0,016+0,002

Печень | 0,266+0,030 1 0,082+0,030

Селеоенка ! 1 0,065+0,003 | 0,026+0,002 I ........

Расчет вели от общего количества вводимой радиоактивной

метки. ■

Таблица а

РЕЗУЛЬТАТЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ИММУНОФЕРМЕНГНОГО АНАЛИЗА АТ К ОТАР И АЛЬФА-2 ГП В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ

К-во проб Концентрация антител нг/мл

0,8-1 ,6 3,2 6.4 12 26 51 102 205

а а 6 А а а й а 0 а а а в А 0 А □ а

16 16

13 13 -

49.48 3 1 2 4 1 1 1 1 2 2

62 59 2 2 1 1 1 2 2

42 за 2 1 1 2 1 1 2 2 2

47 49 2 2 2 2 1

10 16 2 1 1 2 1 2 1

40 37 2

42 41 63 64 4 4 2 1 1 2 2 1' 2

31 28 22 20 0 б 21 19 и 11 3 2 1 2 4 1 1 1 1 1 1

39 -12 4Б 38 2 1 2 3 1 1 1 1 2 2 2

34 30 3 1 2 3 1 2 1 1 3 1 1 1 2 2

4 3 3 б 1 1

10 11 б 0

Диагноз

Периодическая шизофрения-Алкогольная энцефалопатия Ургентные сост., обусловленные: -кататонической шизофренией -острой адкогол. энцефалопатией -нейролептическим синдромом -тяжелым алкогол делирием Рассеян, склероз в фазе обострен. Рассеян, склероз в ¿пае ремиссии Инсульты: -геморрагический -трокботический Ургентные сост. , обусловл. нейро-тоскическ. синдромом при: -гриппе

-кишечной инфзк. -пневмонии -перитоните -панкреатите Бактериальный менингит: -гнойный -серозный Вирусный монинг. Энцефалит Опухоли головного мозга: -астроцитсма -олигодендро-глиома

-иейронадыша Кенингпома

В - 61 АР ; А - алы1я-2ГП

X

(+)*

Проб 3 А" О о О о

3 б 11 19 15 10 8 22 40 О 5

14 14

б 4

13 18 9 О 16 16

9 б

15 17 2 10

32 43

26 12

О О

О

о

о о

140 120 too 00 80 40 20 0

C<ne/ml)

(ншщ

иш:;п

mm

liim'ii ffituul

wv.wWj

— (jjijliijjjv-1 !

!

I v

Л t

jJ i i ( Uu I

в

Рис. 1. Графическое изображение результатов количественного анализа АТ к вГАР и альфа-2 ГП в сыво-• ■ ротке крови крьк после первого-четвертого про-, рыва ГЭВ экспериментально вызванной нейролепсии.

1, 2, 3, 4 - номер мнт^книи галоперидола А - диаграмма для АТ к СГАР В - диаграмма для АТ к альфа-2 ГП

Таблица 4.

РЕЗУЛЬТАТЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ШМУТОФЕРИЕНГЙОГО АНАЛИЗА АТ К АЛЬФА-1 Во И АЛМА-С ВО В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ

Диагноз К-ЕО проб 1 2 Концентрация антител , иг/ил

0,4-0,7 1, 4 2,8 5,6 11,2 22, 4

1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2

Непрерывнотекущая 32 32

шизофрения

Периодическая 32 32

шизофрения

Алкогольная 13 13

энцефалопатия

Ургентные сост.,

обусловленные: 19 21 $

-кататонической 4 6 1 1 1 1 1 2

шизофренией ,

-острой алкоголь. 27 32 4 2 2 1 1 2

-энцефалопатией

-нейролептическим 20 23 2 2 1 1 1 1 1 2 1

синдромом 30 31 2 1 2

-тяжелим алкогол. 4 2 1

делирием 3

Рассеян, склероз 17 18 2 2 1

в фазе обострения

Рассеян, склероз 41 41 1

в фазе ремиссии

Инсульты:

-геморрагический 16 17 2 3 1 1 3 1 2

-тромСотический £3 26 2 2 1 2 1 1 1

Ургантные сост..

обусловлен, нейро-

тоскическиу синд-

ромом лрш

ггриппе 23 30 3 4

-кишечной инфекции 22 19 2 1 1 1

-пневмонии 7 7 1 1

-перитоните 19 19 1 2 1 1 2 1 1 1

-панкреатите 8 9 О 3

Бактериальный ме-

нингит:

-гнойный 17 14 2 1' 1 1 1 1 1 1 2 2

-серозный 33 29 4 3 2 1

Вирусный менингит 33 ?л 3 3 1 1 2 1 1 1 2 2

Энцефалит 21 23 2 2 1 1 1 1 2 1 3 3

Опухоли головного

мозга:

-астроцлтома 6 7 2 1

-олигодендро- 6 5 1 2

глиома

-нейронадыше 10 10

Менингиома 4 4 альфа-

1 - 1 ВО ! 2 - ольфа-2 В6

I

(+) проб

1 г

о о о о о о

36 42 26 15 35 34 20 19 29 16 О 2

43 ЗБ 22 27

13 13

9 5 28 28 26 26 25 33

41 43 18 14 24 37

42 39

33 14 16 40

О О О О

ге

в и в о л и

1. Разработаны и апробированы в клинико-лабораторной практике высокочувствительные иммуноферментные тест-системы для определения АТ к 6РАР, альфа-1 ВС , альфа-2 НЗ и альфа-2ГП.

2. Иммуноферментные тест-системы для анализа АТ к НСБ могут Сыть использованы в качестве дополнительного метода оценки функции ГЭБ у больных с заболеваниями ПНС, в патогенезе которых имеет иесго его прорыв, а также для мониторинга эффективности проводимой терапии.

3. В эксперименте на крысах показан феномен появления АТ к НСБ в сыворотке крови животных в том случае, когда имеет место нарушение проницаемости ГЭБ при воздействии ионизирующего излучения и высокими дозами нейролептиков.

4. Экспериментально доказана возможность избирательного накопления радиоактивной метки в ткачи мозга при введении в кровоток меченых 125-J А14 к НСБ на фоне повышенной проницаемости ГЭБ.

5. Экспериментально подтвержден факт возмоигоЯ агрессии АТ к НСВ в Еаиравдеккя "кровь-мозг" с последующим повреждающим воздейстЕкем на клеточные структуры мозга.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Иммуноферменгные тест-системы для анализа АТ к НОВ могут быть использованы в комплексной диагностики и контроле за эффективностью проводимой терапией заболеваний, в патогенезе которых имеет место ^рушени* проницаемости Гяя ■

17 .

Список опубликованных работ по те диссертации

1. Способ получения иммуноадоорбента для аутоантител. -Автор, сведет, на изобретение N 1476648 (в соавторстве4 с Г, Е Морозовым, &IL Чехониным, XL А. Лэйкиным, Т.Д. Черкасовой),

2. Трансмембранчый перенос искусственно гвдрофобиаоваиюа фрагментов антител. - Биотехнология. - 1989 - Т. 4 - N. б -с. 648-651. (в соавторстве с Г. Е розовым, Е П. Чехониным, Я. А. Кашпаровым).

а Иммуноферментная детекция, специфических антигенов моэ-га ГЭВ крыс после острого гамма-облучения, - Вюлд. зкспер. би-ол. и мед. - 1989 - N.4 - с. 15-18. (в соавторстве с Г,Е Ыороаовым, RIX Чехониным).

4. Transport of artificially hydrophobized fragments of antibodies across membranes. - 10'FEBS, Rone, - 1989.- TU 384. (coauthors V. P. Chekhonin, Q. V. Morozov).

5. Иммуноферментный анализ глиоспецифических антигенов н аутоантител к ним в сыворотке крови больных с критический состоянием, обусловленным психическими заболеваниями. - "Неотложные состояния в психиатрии" - М.1989. - с. 116-120. (в соавторстве с Г.В Морозовым, EIL Чехониным, 3. И. Кекелидае, A.C. Лебедевым, Е.А. Пешковой, EU. Медведевым, Е.А. Коротее-вой).

в. Иммунохимическое научение механизмов аутоиммунной* агрессии антител к нейроспецифическим бедкам у крыс с экспериментальным прорывом ГЭЕ - Найрохимия. - 1990 - Т. 9 - N. 2. -с.241- 246. (в соавторстве с ЕЕ Чехониным, Р.Ц. Лиджиевой, A.C. Лебедевым, Б.А. Коротеевой, А.КХ Бурюшой, ЕKl Беляевой).

7. Irtmunoabsorptlon of autoantibodies to neurospeoifio proteins (NSP) during therapy of diseases accompanited by the break of blood brain barrier (BBB). - European federation of lnmunological societies. 10th Meeting Edinburg 1990. Abstract

N 21 (coauthors V. P.Chekhonin, CLV. Morozov, 5. aiitorozov, E. A. Koroteeva, A. S. Lebedev).

8. Двухцеятровыя имм/аофгриенгный анализ антител к аль-фа-1 0Q и альфа-2 BG на основе колоночной ишуносорбционной хроматографии (ДШИХ). - Биотехнология.- 199а - Т.7.с.28-30. (в соавторстве с ЕП. Чехониным, Т.К Дмитриевой, В.Е Рьиско-вш, ДТ. Ишиачртс, Л.Е. Бреусенко).

Рис.2. Калибровочные кривые КМР-иммуноферментного определения АТ к альфа-1 Вб и альфа-2 ВА. .1 - АТ к альфа-1 В6; 2 - альфа-2 В&

00

Рис. 3. Калибровочные кривые иымуноферментного определения АТ (ТАР и альфа-2 ГП. 1 - АТ к ПРАР; 2 - альфа-2 ГП.