Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуноаналитические методы определения тироксина на основе моноклональных антител

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Иммуноаналитические методы определения тироксина на основе моноклональных антител"

На правах рукописи

МЕРТЦ Марианна Владимире)!—

ИММУНОАНАЛИтаЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИРОКСИНА НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

03.00 ¿23 - биотехнология

14.00.36 ~ ишунологий:

и аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биотехнологии научно-технического Центра "Лекарственная биотехнология" (НТЦ "Лекбиотех") АО "Биотехнология".

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук, проф. Раиф Гаянович

Василов

кандидат биологических наук, с.н.с. Надежда

Петровна Данилова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, проф. Института Дружбы Народов Далии Михаил Викторович

кандидат медицинских наук,

с.н.с. ВНИИ "Генетика" Юрин Виталий Львович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биоорганической химии им,МШемякина и Овчинникова 10.^

Защита состоится "<//"«^¿<1? 1996 г. в /Аас. на

заседании диссертационного совета Д 053.34.13 в

Российском Химико-Технологическом Университете

имени Д.И. Менделеева по адресу: 125041, Москва,

Миусская пл., 9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РХТУ им.Менделеева.

Автореферат разослан "-17 "СгпрвлЯ 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических на\к / II. 11. ГУСЕВА

J

Актуальность проблемы. Достижения биотехнологии позволили современной медицине существенно расширить диагностические иозможностн. Наибольшее распространение получили

нммуноаиалнтическнс методы. Гнбрнломная технология получения антител привела к возможности создания множества диагностических тест-систем, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью. Разработка количественных лабораторных методов, экспрссс-амалнзон с использованием моноклональных антител для медицинской диагностики является важной задачей современной биотехнологии.

Для лечения эндокринных заболеваний и в частности заболеваний щитовидной железы очень важна прапнльная своевременная диагностика патологии. Очевидно, что рост этих заболеваний не п последнюю очередь связан с ухудшением экологических условий. Для полной оценки тнроиднбго статуса необходимо учесть концентрацию всех гормонов, ■1 связывающих белков, аутоантнтел И других факторов, участвующих в регуляции работы щитовидкой железы. Для первичной оценки достаточно знать концентрации в крови Тироксина и тиротропина. В настоящее время для измерения концентрации тироксина применяют в основном иммуноэналигические методы. Огромное 'значение для успеишого применения . этих методов имеет качество используемых антител. Антитела должны обладать высокой специфичностью и аффинностью к тироксину, поэтому использование моноклональных антител намного предпочтительней, чем использований-поликЛональных. Кроме того, явные преимущества имеют методы, применимые для проведения массовых анализов в клинике: они не должны быть длительными. Трудоемкими, напротив, должны быть просты в исполнении, использовать малый объем крови', не требовать предварительной обработки пробы. -

Целью данной работы является создание количественных нммунофермекгных Методов определения тироксина с использованием моноклональных антител. При выполнении работы были поставлены следующие задачи: выбор оптимальной стратегии анализа; изучение влияния гаптенной , гетеролегии на характеристики иммунометрического анализа; изучение условий, обеспечивающих разрушение комплексов тироксина со связывающими белками.

Научная повизпа. Изучены возможности использования моноклональных антител к тироксину 1В7 в твердофазных методах определения тироксина,, основанных на . принципе прямой и непрямой ELISA. Разработан нммунометрический метод определения общего тироксина в сыворотке крови на основе моноклональных антител

Изучено илпями? гперологии на чуистиигельносгь и специфичное и, нммуномсугричсскот метода. Разработан одностадийный

иммуноферментныи метод определения общего тироксин!» на оенпне моноклона чьных антител с использованием зффекта гшпешюй гетеролопш.

Практическая .значимость работы. Тема диссертационной работы является темой, утвержденной и финансировавшейся Мнннстсрстпом Эдрапоохрпнсипя и Министерством но Чрезвычайным Ситуациям "Т'1-ТЕСТ". В лшшой работе создана тест-система для количественною определения концентрации тироксина н сыворотке кроим на основе моноклопальных антител, которая позволяет пронести анализ за 30 минут, использовать малый объем кропи (достаточно. брать кровь у больных из пальца), проста и исполнении. Разработанный мегод но споим характеристикам не уступает лучшим зарубежным аналогам, япляясь при зтом более экономически выгодным. Метод опробован на банке сыпороток (80 штук), любезно предоставленном Институтом Экспериментальной Эндокринологии Эндокринологического 11аучного Центра РАМП. В настоящий момент разработаны и утверждены меднко-гехннческпе требонапня, технические условия и регламент для производства опытной парши тест-систем с келью их дальнейшего промышленного производства.

Положения, выносимые на защиту.

!. Разработка нескольких вариантов иммуноанализа тироксина <; использованием моноклональных антител 1В7.

2. Разработка оригинального метода иммуноанализа тироксина с использованием гантеннон гетсролопш.

3. Разработка метода очистки донорской сыворотки от тироксина с целыо дальнейшего приготовления стандартных разведений тироксина.

Апробация работы. Диссертация апробирована на заседании Ученого совета Института биотехнологии 24 мая 1995 г. Материалы диссертации были представлены на II Всероссийском конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1995) и V съезде специалистов по лабораторной диагностике (Москва, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 3 тезисов докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы из 105 источников. Работа изложена на 96 страницах и содержит 13 рисунков и 2 таблицы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛКДОИАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ДЛЯ пронсдишя массовых скршшшоиых измерений концентрации тироксина необходимы нрооые п исполнении и дешевые методы Наиболее отвечают этим трсГитапнич твердофазные иммунофсрменшыс методы.

Полому ми посгавилн спосН целью разработку именно таких методов для определения коннешрации обшеш тироксина н С1лк>г*гтке крови.

Основой этой работы послужили моноклинальные антитирокситшыс антитела 1117, полученные нами ранее, которые облалангг вышкой а<И>инностыо, хорошей специфичностью и относительно индифферентны к различным блокирующим aieirraM, таким как 8-анилпш)-!-' нафталснсули)>окислота, которые обычно используется в иммуноанализе тироксина.

Существует дна основных подхода к разработке твердофазного иммуноанализа гатенов - метол прямой ELISA, в котором происходит конкуренция тпепа из сыворотки и гантена, меченною ферменшм, за связывание с атнтслами, сорбированными на твердую фазу, и иммунометрический метол (непрямая ELISA), в котором rairreir, ючп.кмированный с белком и сорбированный на твердую фазу, конкурирует с тироксином из сыворотки зз снязыпанне с антителами, меченными ферментом.

Если в качестве твердой фазы использовать планшеты, то иммунометрический вариант анализа предпочтетельней, поскольку результат анализа в варианте прямой ELISA будут зависеть от скорости нанесения проб. При большом количестве проб время их юнггакга с атителами будет рагипно. что отрицательно отразится на точности измерения, ошибку вызва!шую этим фактором можно уменьшить только увеличив время инкубации до 2 ч. Если же п качестве твердой фазы использовать не планшет, а полистиролом« шприю«, которые могут быть добавлены к реакционной смеси практически одновременно, то для такой тест-системы больше подойдет вариант прямой ELISA Поэтому мы разрабатывали оба варианта анализа тироксина.

I. Характеристик* антител.

Выл слепне и очистка антител.

Выделение моноклинальных акгитсл из асцитной. жидкости проводили метолом ионоебмешюй хроматографии, используя в качестве носителя ОЕАЕ-Тоуорсаг). Антитела предварительно осаждали насыщенным раствором сульфата аммоняя, диализовалн и наносили на колонку, уравновешенную 0,01 М фосфатным буфером (рН 8), элхжровалм антитела с колонки с помощью градиента концентрации N80 (0 - 0,ЗМ) при этом антитела содержались во втором хромато графическом пике. Профиль хроматографии представлен на рисунке 1.

Рис 1. Выделение моноклональнмх антител 1В7 из мышиного асцита с помощью ионообменной хроматографии. (Пик, соответствующий фракции атител, показан штриховкой.)

Чистоту полученных препаратов антител проверяли с помощью гель-электрофореза в нолиахриламидном геле. Гель-члектрофорез препаратов моноклональных антител проводили как с предварительной обработкой пробы 2-меркаптоэтанолом, так и без нее. Гель после электрофореза обрабатывали красителем кумасси. После электрофореза антител, обработашгых 2-меркаптоэтанолом, на геле отчетливо видны только лвс полосы, соответствующие легкой и тяжелой цепи иммуноглобулинов.

По данным иммуноферме1Гпюго анализа антитела 1В7 принадлежат к нотклнл-у 1. Подкласс антител определяли с помощью кита фирмы Оасо.

О ?0 40 60 во 100 120 140 160 объем элюелта, мл

Аффинность антител.

Для создания иммуноаналитических методов крайне важной характеристикой антител является их аффинность. Чем выше аффшшость антител, тем больше возможностей для конструирования иммуноаналитических систем для определения антигена. В твердофазных иммуноаналитических методах эффективно использоваться могут только антитела с конешпой аффинности больше чем 107 М"1. Константу аффинности антител, продуцируемых гибридомой 1В7, определяли твердофазным ИФА по модифицировашюй методике, описанной Beatty. Для Моноклональных антител 1В / константа аффишгосгн

А^-ЗЮ'М1.

• I

2. Определите коппигграппя общего тпрокскн»

методом прямой ELISA

Для разработки варианта анализа, осНовашгого на прямой ELISA использовали иммобилизованные антнтела и коньюгат тирокснн-пероксидаза.

Были изучены несколько способов коныогирования' тироксина с пероксидазой - с помощью периодгтного окисления, гяутарового альдегида, через 3-фтор-ацегильную производную тироксина. Нами был выбран последний способ. Очистку конъюгата от не прореагировавших комнонентоп проводили с помощью гель-фильтрацин. Для устранения неспецифической сорбции тироксина на пероксидазу хроматографию проводили в буфере с рШ0.5.

Моноклональные антитела выделяли из асцитов ионообменной хроматографией и иммобилизовали на твердой фазе.

Рабочее разведите конъюгата определяли как разведение, при котором наблюдалось 50% связывание кшгыогата тироксин-фермет с иммобилизованными антителами.

Для проведения анализа 50 мкл пробы смешивали с 50 мхл 0,03% АНС т) веронал - мединаловом буфере в лунках планшета и затем добавляли 50 мкл конъюгата тироксин - пероксидаза в рабочем разведении; Калибровочная кривая для определения тироксина этим методом линейна ? полулогарифмических координатах в области от 10 до 400 нг/мл (Рис. 2).

Рис 2. Калибровочная кривая для определения тироксина с использованием меченного ферментом гормона.

Таким образом, показана возможность использования моноклинальных антител 1В7 в анализе тироксина, основанного на прямой ELISA. Как уже отмечалось выше, для практического применения разработанного метода в качестве твердой фазы нужно использовать не планшеты, а, например, шарики.

3. Методы измерения тироксина, основанные на непрямой EJISA.

Влияние гаптенной гетерологии.

В непрямой ELISA на твердой фазе иммобилизуется конъюгат гаптен-белок, а измерение основывается на конкуренции иммобилизованного гормона н гормона, находящегося в пробе, за связывание с меченными атителами.

Хорошо известно, что антитела' к низкомолекулярным веществам получают иммунизацией хо1гыогатами гаптен-белок. Хотя моноклинальные am тела отбирают по их способности связывать галтен, нельзя забывать о том, что связывающий нентр ашгттел обычно намного превышает размеры гаптена, гак что кроме самой молекулы гаптена на нем могут разместиться и мостиковая структура, соединяющая гантен с белком и даже прилегающие к связи участки Осте а.

По-видимому, это свойство антител к гаптенам может отразиться на их поведении в иммуноанализе, в особенности когда в . качестве метки используются не радиоактивные атомы, а такие массивные структуры как

1.4 п 12 10 0.8 0.6 04 0?

\

т//-т

\

0 25 50 100 200 400 концентрация тироксина, нг/ мл

V

флуоресцеин, фермент или белок, часто намного превышающие гаптен по молекулярному весу.

В последнее время потаилось несколько работ в которых была предпринята попытка проанализировать связь между химической структурой комплекса гаптен-метка и реактивностью антител при изучении взаимодействия антнтело-а!ГГИген или использовании антител в иммуноакализе.

Было показано, «по сочетание антитела с котюгатом гаптена, имеющим структуру, слегка отличающуюся от иммуногена, может привести к ослаблению взаимодействия антитела с гаптеном и в результате чувствительность иммуноанализа может улучшиться. Van Weernen и Schmira идентифицировали 'три типа структурной гетерологии - по связи, по месту связывания и но гаптену и показали, что любой тип гетерологии, использованный в иммуноанализе может, сам по себе или в комбинации с другим привести к повышению чувствительности. Этот принцип был использован при разработке нескольких иммушанализов. Гаптетгая гегерология позволила улучшить чувствительность люминисцентного иммуноанализа Т4 и ТЗ, и чувствительность метола определения с пободают тироксина, базирующегося на биотип -стрептавядиновой системе. Описано также повышение чувствительности определения теофкллша с гетерологичным конъюгатом кофеина. Оинакп многие из этих исследователей указывают, что гегерология по гаптену или месту связывашм может приводить к снижению специфичности анализа.

В используемой схеме иммуноанализа измерение основано на конкуренции гормона из пробы и гормона, иммобилизованного на твердой фазе в виде конъюгата с белком, за связывание с антителами, мечеными пероксидазой.

При получении антиггел 1В7 иммуногеном служил коиыогат тирокенн-гемоцианин, связывание тироксина с белком проводили с помощью глутарового альдегида. Антитела были отобраны в ELISA где в качестве антигена применяли конъюгат тироксина с БСА, гаптен присоединяли к белку 1-этил-(3-диметиламинопропнл) карбодиимидом. Этот конъюгат гетерологичен иммуногагу как по белку-носителю, так н по типу связи, однако заслуживает внимания тот факт, что связывание гагггена с белком в обоих случаях

проходило по лизшювым остаткам белка. Антитела 1В7, отобранные нами, в этой системе обнаруживали аффинность 3-10' М"' и перекрестные реакции с ТЗ 1%.

Твроксна из пробы (^тГ)

-ПО

-по

Копью гат —ПО аатитсл с псрогсидазой

/~7~7

СГу Сорбированный

/////// / / // ГОРМ0В

Луша планшета

В иммуноанализе использовался тот хе коньюгат тироксина, который применялся при отборе антитироксиновых антител. Коньюгат ТЗ-БСА был получен тем же методом., то есть отличался от Т4-БСА только по гантену.

При анализе кривых титрования антител 1В7 в твердофазном ИФА на иммобилизованных коньюгатах Т4-БСА и ТЗ-БСА прежде всего обращает на себя внимание тот факт, что значение рабочей концентрации антител для гетсрологичной кривой только в два раза ниже, чем для гомологичной (Рис. 3). Связывание с конъюгатом ТЗ-БСА, таким образом значительно превышает связывание со свободным ТЗ, которое ранее было в реакции ингибирования определено как 1%. Взаимодействие со свободными гантснами изучали по их способности ингибировать связывание шггител с иммобилизован! ш м и конъюгатами.

Кинетические параметры гомологичного и гетерологичного вариантов анализа оказались' очень близки. Используя калибраторы с нулевым содержанием Т4 мы показали, что анализ, основашшй на использовании коньюгата Т4-БСА достиг равновесия через 25 мин инкубации, в то время как в гсгерологичном варианте анализа максимальное связывание достигалось к 33 мнн ннкуОащш (Рис. 4).

1.0-

0.0

—•— / -° / 0

7 /

/I у

/

0.01 0.1 1 концентрация антител, мкг/ мл

Рис.3. Определение рабочей

К01щснтрании анттел 1В7, меченных пероксилазой, в анализе с сорбированным на плашку коиъюгагом гормон белок: - ТЗ-БСА, - Т4-БСА.

1.в 1.4

1X 1.0 0.8 Об 0.4

О 10 20 30 40 время инкубации, мин.

Рис.4. Кинетика связывания антител 1В7, меченных пероксидазой, с

иммобилизованным на платку конъюгатом гормон-белок: 1 -ТЗ-БСА, 2 - Т4-БСА

Специфичность антител.

Специфичность антител изучали твердофазным ИФА по ингибироваттю трийодгиронииом связывания антител с иммобилизованным антигеном Т4-БСА или ТЗ-БСА По данным этих экспериментов были построены кривые ингибирования и проведено их сравнение с аналогичными кривыми ллч тироксина (рис.5). Величину перекрестной реакции определяли как отноше1П1е молярных концентраций тироксина и аналога, приводящих к 50 % торможению связывания антител с иммобилизованным антигеном в твердофазном ИФА

3 0

я

2.5 2.0 1 5 1.00.5 00

Плашка: ТЗ-БСА

А,»

3.5

3.0 2.5 20 1.5 10 05 00

10 100 1000 10000 100000 кноцеитрация гормона, нг/ мл

Плашка: Т4-БСА

Хч \

х

\ X Хч \ Х

--------

10 100 1000 10000 100000 концентрация гормона, нг/ мл

Рис.5. Определение специфичности анализа общего тироксина. Кривые ингибирования связывания атитсл 1В7, меченных псроксидазой, тироксином (2) и трийодгиронином (1) с иммобилизованным на плашку коньюгатом гормон-белок.

Из ирелегавленных на рисунке данных видно, что использование шпенной гстсрсшопш позволило улучшить специфичность анализа в 2 раза: перекрестная реакция атшел 1В7 с трийодгирошшом составила 1% в гомологичном варианте и 0,5% в гетерологичном варианте анализа.

Чувстви I сльность.

Высокая чувствительность - необходимая характеристика любого количественного метода. Возможность увеличения чувствительности за счет нпючыогания 1стерологии по гатену была нашей основной задачей. Нрс сложенный нами метод измерения общего тироксина основан на конкуренции тироксина из пробы и гормона, сорбированного на твердой фазе 1.1 с"Ч)М|иние с ашше.ими, мечеными нсроксщизой. Кривые ингибирования, ере макк'ппые нд рис. бы ли построены но результатам анализа, в котором

и

объем пробы составлял 30 мкл. Чувствительность анализа рассчитывалась как минимально определяемая концентрация тироксина в пробе по формуле:

51) =

мг

п-1

ЧС]

I Jm¡r

= А-25£>

где А о - оптическая плотность пробы с пулевым содержанием тироксина, л -число измерений, 5/) - среднеквадратичное отклонение величины А0, А]¿у -оптическая плотность минимально определяемой концентрации тироксина.

2.4-, ^450 2.22.01.81.6 1.4 12 1.0 0.8

0.64--У/-

0 12.5 25 50 100 200 400 концентрация тироксина, иг/ мл

Рис.6. Онределс]шс чувствитслъности иммунометрического анализа общего тироксина в варианте с иммобилизованным на плашку кмгьюгатом ТЗ-БСА (1) и Т4-БСА (2).

Как видно из представленных данных, чувствительность метода, в котором на твердой фазе был сорбирован коньюгат ТЗ-БСА, в несколько раз выше. Это позволило нам сократить объем пробы с 30 до 10 мкл. В окончательном варнаше чувствительность метода составила 10 нг/мл Т4 (рис.6).

Таким образом, такие снойства моноклопалышх антител к гаггенам, как аффинность и специфичность, если 01Ш изучаются с использованием различных ко1гьюгатов гептсн-метка, могут в значительной степени модулироваться, вплоть до того, что антитела, отобранные в одной системе, использующей определенные коньюгаты гапген-мегка и определенный дизайн иммуноанализа, обладающие в этой системе замечательными характеристиками, могут оказаться полностью непригодными для анализа в другой системе.

Для тоги чтобы лс1че было предсказать поведение моноклональных а>гтител к гантенам, необходимо знать, какой иммунохимический метод был использован для их индукции и отбора.

4. Оптимизация параметров нммуномегрлсского анализа общего тироксина.

Сорбция коньюгагов гормон-белок на пластик.

Коныогаты ТЗ-БСА и Т4-БСА титровали в карбонат-бикарбонатном буфере и сорбировали на разные типы плашек. Оптимальной для сорбции ко1Ше!гграцией считали концентрацию коныогата, соответствующую выходу кривой титрования на плато. Эга концентрация отличалась в зависимости от типа плашек: 0,15 мкг/мл для плашек фирмы Dynatech, 0,3 мкг/мл для high so гр Costar и Maxisorp Nunc, 0,5 мкг/мл для Titcrtek.

Нлиянис АНС на результаты анализа.

Основная трудность анализа тироидных гормонов заключается в том, что большая их часть находится в связанном состоянии с тироксин-связывающими белками. Для того, чтобы измерять общее содержание тироксина в сыворотке, необходимо разрушить или вы теснить тироксин из комплекса Т4-белок-персносчик. Для этого используют различные буферные системы, например, салициловый или веронал-мединаловый буферы, иногда для разрушения комплексов тирокмша со связывающими- белками используют высокие 'значения рН, но наиболее употребимыми являются, по-видимому химические агенты тина 8-аншшно-1-иафталенсульфокислоты (АНС).

Для изучения влияния АН С на связывание моноклональннх ангигел с иммобилизованным конъюгатом тироксин-БСА АНС раститровывали в буфере для анализа (забуференный фосфатами физиологический раствор, рН-7,4 ^ 0,05% твин-20 и 0,2% БСА). Коньюгат антител с пероксидазой хрена смешивали в рабочем разведении с разными количествами АНС до конечной концентрации, от 0,2 до 0,001 % и инкубировали в течение 20 мин. Из полученных данных (рис.7) видно, что АНС до концентрации 0,025% практически не влияла на связывание антител с иммобилизованным

тироксином.

450 0.9

0.8

0.7

0.6 • 0.5 0.40.3

0.2

^50 18

1.«

14

1.210 0.8 О.в 04

0006 0.012 0 025 0 05 0 1 02 концентрация АНС, %

25 50_. 100 200 400 концентрация тироксина, нг/ мл

Рис.7. Влияние конценграции АНС на связывание антител 1В7.

Рис.8. Кривые ингибирования тироксином связывания антител 1В7, меченных пероксидазой, с иммобилизованным ТЗ-БСА для разных концентраций АНС: | -0,05 % АНС, 2 - 0,03 % АНС. 3 -0,02 % АНС, 4 - 0,01 % АНС.

На рис.1 представлены кривые ингибирования, построешше для разных концентраций АНС, не влияющих на связывание антител. В дальнейшем в качестве рабочей концентрации АНС была выбрана концентрация 0,03%, которая практически не ингибирует связывание антител с тироксином и при

0.3

этим достаточно эффективно вытесняет тироксин из комплексов с белками, Дальнейшее повышение концентрации АНС нецелесообразно, поскольку при ■ этом будет наблюдаться ингибирование связывания антител с тироксином, а эффективность вытеснения Т4 существенно не изменится. При понижении концентрации АНС степень вытеснения Т4 из белковых комплексов уменьшается, что приводит к понижению чувствительности метода.

Далее было изучено влияние состава и рН буферных систем на результаты анализа. Для этого строились зависимости ингибироаания свободным тироксином связывания антител с иммобилизованным тироксином в различных буферных системах. Изучались наиболее широко используемые буферы: ЗФР и веронал-мединаловый, влияние рН этих буферов. Оптимальная форма калибровочной кривой наблюдается при использовании веронал-мединаловоги буфера. Параметры анализа улучшаются при возрастании рН от 7,4 до 9, однако при рН больше 8,6 наблюдается уменьшение связывания антител с тироксином. Поэтому в дальнейшей работе мы применяли рабочий буфер с рН 8,2. Калибровочная кривая для определения тироксина в этом буфере линейна в логарифмических координатах в диапазоне от 10 до 1000 нг/мл.

И|гтерес1ю отмстить, что влияние АНС различно в зависимости от типа плашки. АНС способна сорбироваться на пластик или на коныогат гормон-белок, засорбированный на плашку. Разные типы плашек обладают различной сорбпионной способностью по отношению к АНС. По-видимому, это связано с разным зарядом и гидрофобностью плашек. Обычно плашка имеет небольшой отрицательный заряд. Для увеличения сорбции фирма-изготовитель иногда обрабатывает плашки специальным способом, что нейтрализует заряд. Таким образом, в зависимости от типа плашки концентрация АНС в лунке будет различной, следовательно, кривые ингибирования также будут отличаться. Коли в шпеубашготюм буфере присутствует БСА, го разница между плашками разных типов уменьшается, воз можно это связано с тем, что АНС несисцифически сорбируется на БСА, тем самым минимизируя эффект сорбции на пластик.

Возможно что наблюдающаяся в иммуноаиализе тироксина нежелательная зависимость результатов анализа от концентрации

сывороточных белков также связана с неспецифической сорбцией ЛНС не только на белки-переносчики тироксина, но также и на многие другие сывороточные белки. Этого можно избежать 'путем добавления в инкубационный буфер такого количества БСА, которое сможет нейтрализовать различия в концентрациях сывороточных белков для разных больных.

В качестве рабочей конце!гграции была выбрана концентрация 0,2% БСА Добавление в буфер такого количества БСА позволяет нивелировать различия, вызванные типом плашки и составом сыворотки.

Очистка сыворотки.

Для приготовления стандартных разведений тироксина использовался пул донорских сывороток, инактивированный и очищенный от тироксина.

Из-за высоких констант связывания тироксина с белками-носителями очистка сыворотки от находящегося в ней тироксина является довольно сложной задачей. Особенно трудно разрушить комплекс тироксина с тиреоглобулином, поскольку конешгта связывания этого комплекса сопоставима с константой связывания тироксина с антителами 1В7 ( К? М"1).

Мы изучили различные способы очистки сыворотки: с помонц.ю аффинной хроматографии - в качестве сорбента использовалась сефароза с иммобилизованными атгтителами 1В7; очистка с использованием активированного угля; ионообмешгая хроматография.

С помощью первых двух вышеперечисленных способов нам удалось очистить сыворотку -лишь частично, около 30 % тироксина оставалось в сыворотке. Полностью очистить сыворотку удалось только с помощью сильною катионообменника АО 50W - Х8. Однако оказалось, что в процессе очистки сыворотка меняет свои физико-химические свойства, а именно рН и ионный состав, что делает использование этой сыворотки для приготовления стандартов невозможным. Простого доведения рН до нейтральных значений с по мопп.ю ИаОН оказалось недостаточно для нейтрализации различий свойств сыворотки до и после очистки. Эту проблему нам удалось решить с помощью диализа очищенной сыворотки против культуральной среды Хенкса, содержащей все необходимые соли. После диализа очищенная сыворотка не отличалась пи своим свойствам от натуральной, и кривые ингибирования аттпел тироксином

в концс1гграциях 100 - 400 нг/мл, находящимся в очищенной сыворотке и в нуле, совпадали. К очищенной сыворотке добавляли известное количество L-тироксина, предварительно растворенного в слабом растворе NaOH.

После оптимизации всех параметров анализа окончательный протокол анализа выглядит следующим образом.

Для вммунометрического анализа общего тироксина мы выбрали плашки типа high sorp фирмы Costar. На плашки был сорбирован коньюгат ТЗ-БСА из кчщмгграции 0,3 мкг/мл. Анализ проводили в одну стадию: в лунки планшета наносили по 10 мкл стандартных разведений тироксина или проб сывороток больных и затем приливали по 100 мкл антител к тироксину, меченых нсроксидаэой, в рабочем буфере (ЗФР, содержащий 20 мМ всронал-мединалового буфера, 0,03% АНС, 0,2 % БСА, 0,02% твина^рН 8.2). Время инкубации составило 20 мин, при перемешивании при комнатной температуре. По. полученным данным строили калибровочную кривую, по которой определяли концентрацию тироксина в сыворотках больных (рис.9). Калибровочная кривая линейна в всем измеряемом диапазоне, чувствительность метода составляет 10 нг/мл.

450 2.2-

18 1.8 14

12 1 0 08

0F-

0 7 5 50 100 200 400

конистрапич тироксина. иг/ мл

Рис.9. Калибровочная кривая для определения кошдагтрации общего тироксина с использованием антнтел к тироксину, меченных нсроксидаэой.

Сыворотки больных в количестве 80 проб были любезно предоставлены институтом- экспериментальной эндокринологии РАМН. Конце1гграция тироксина, определенная с помощью нашего метода, соответствовала клинической картине, либо совпадала с ранее измерешюй другим метолом в инстотуге экспериментальной энпокршюлогип.

Характеристики анализа общего тироксина.

Доопределения коэффициента вариабелыюсти результатов анализа 30 проб анализировал» в десяти повторах 10- раз. Коэффициент вариабелыюсти результатов: анализа по величине поглощения, полученных с использованием планшетов, составляет 3,3 %.

Чуэстпителытость анализа определяли на основе среднего квадратичного отклонения (Я О) полученных значений концентрации тироксина в пробе с нулевым содержа! шем а1ггнтел. Чувствительность составляла 10 нг/мл тироксина в пробе.

Было изучено влияше разведения пробы на результаты анализа и подтверждена линейность разведения в интервале концентраций 25 - 400 нг/мл. Помимо этого был проведен тест на открытие: пробу смешивали со стандартным раствором тироксина, определяли концентрацию тироксина в этой смеси и рассчитывали отклонение ее от расчетной -концентрации. Получаемое значение лежало в пределах 90-110%.

Условия хранения реагентов.

Были изучены условия хранения всех реагентов. Стандартные растворы тироксина в сыворотке хорошо хранятся в лиофилиэованном виде. Концентрированные растворы юэнъюпгга антител с пероксидазой (2-4 мг/мл) в присутствии 10 мг/мл лошадиных иммуноглобулинов стабильны при 4 С в течение года, а при 37 С в течение 20 дней. Однако, растворы копъюгата в разведении 1:4000 теряют свою ангнген-связывакяцую активность довольно

о

быстро: они могут храниться не более 3 дней при 4 С.

ВЫВОДЫ:

1. Разработан одностадийный метод намерения концентрации общего тироксина, основанный на нриицинс прямой ЕЬ18Л, с использованием моноклопальнмх антител, подобраны оптимальные условия получения кот.ютата тироксина с иерокендазой.

2. Изучено влияние гапгенпой гегеролопш па чувствительность и специфичность иммуномстрнчсското анализа тироксина для данных моноклинальных антител.

3 Подобраны условия приготовления стандартных рас)воров тироксина на донорской сыворотке.

4. Разработан чувствительный и удойный иммунометрнческин метод анализа общего тироксина в сыворотке крови человека на планшетах, для которого необходимо всего лишь 10 мкл пробы, время анализа 20 мин. Для метода характерна высокая специфичность, низкая вариабельность результатов н хорошая корреляция с другими методами.

В настоящее время разработаны и утверждены меднко-тсхническис требования, лаборатернопромышлгнный регламент и технические углопил набора реагентов для анализа общего тироксина " ТЧ-тегт", в основу которого положен этот метод, идет подготовка к производству и? АСК1Г "Лнанлюг".

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мертц, Марианна Владимировна

Введение.

Глава1. Литературный обзор.

1.1. Строение и функции щитовидной железы.

1.2. Заболевания щитовидной железы, их диагностика и лечение. И

1.3. Иммуноанализ тироксина.

1.3.1. Особенности получения антител к тироксину.

1.3.2. Получение моноклональных антител к тироксину.

1.3.3. Методы иммуноанализа тироксина.

1.3.3.1. Радиоиммуноанализ.

1.3.3.2. Иммуноферментный анализ.

1.3.3.3. Использование гетерологичных конъюгатов гаптенов в иммуноферментном анализе.

1.3.3.4. Флуоресцентный и хемилюминисцентный иммуноанализ.

1.3.3.5. Метод с применением липосом.

1.3.3.6. Нефелометрический и турбодиметрический анализ.

1.3.4. Способы получения стандартных растворов тироксина.

1.4. Тенденции развития иммуноаналитических методов в медицинской диагностике.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.2. Получение конъюгированных антигенов.

2.2.1. Получение конъюгата тироксин-БСА с использованием карбодиимида в качестве сшивающего агента.

2.2.2. Получение конъюгата трийодтиронин-БСА.

2.3. Антитела.

2.3.1. Определение титра антител в твердофазном ИФА.

2.3.2. Выделение моноклональных антител ионообменной хроматографией.

2.3.3. Характеристика антител.

2.3.3.1. Определение константы связывания антител методом твердофазного ИФА.

2.3.3.2. Определение подкласса антител.

2.3.3.3. Определение специфичности антител методом твердофазного ИФА.

2.3.3.4. Электрофорез.

2.3.5. Приготовление сефарозы с иммобилизованными антитироксиновыми антителами.

2.4. Реагенты для иммуноанализа.

2.4.1. Стандартные растворы тироксина в сыворотке.

2.4.2. Конъюгирование антител с ферментом.

2.4.3. Конъюгирование тироксина с пероксидазой из хрена.

2.4.4. Иммобилизация реагентов на твердофазные носители.

2.5. Методы иммуноанализа общего тироксина.

2.5.1. Твердофазный иммунометрический анализ тироксина.

2.5.2. Прямой твердофазный иммуноферментный анализ тироксина.

2.6. Определение оптимального времени анализа.

2.7. Определение рабочей концентрации АН С.

2.7.1. Зависимость связывания антител к тироксину от концентрации АН С.

2.7.2. Зависимость ингибирования от концентрации АН С.

2.8. Определение характеристик методов.

2.8.1. Определение параметров калибровочной кривой.

2.8.2. Линейность разведения пробы.

2.8.3. Вариабельность.

2.8.4. Чувствительность.

2.8.5. Тест на открытие.

Глава 3. Результаты и обсуждение.;.

3.1. Характеристика антител.

3.2. Определение концентрации общего тироксина методом прямой ELISA.

3.3. Методы измерения тироксина, основанные на непрямой ELISA.

3.4. Оптимизация параметров иммунометрического анализа общего тироксина.

3.4.1. Сорбция конъюгатов гормон-белок на пластик.

3.4.2. Влияние АНС на результаты анализа.

3.4.3. Очистка сыворотки.

3.4.4. Характеристики анализа общего тироксина.

3.4.5. Условия хранения реагентов.

Выводы.

Список сокращений, использованных в работе.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммуноаналитические методы определения тироксина на основе моноклональных антител"

Достижения биотехнологии позволили современной медицине существенно расширить диагностические возможности. Наибольшее распространение получили иммуноаналитические методы. Гибридомная технология получения антител привела к возможности создания множества диагностических тест-систем, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью. Разработка количественных лабораторных методов, экспресс-анализов с использованием моноклональных антител для медицинской диагностики является важной задачей современной биотехнологии.

В последнее время особую актуальность приобретает проблема диагностики и лечения эндокринных заболеваний, в частности заболеваний щитовидной железы. Очевидно, что рост этих заболеваний не в последнюю очередь связан с ухудшением экологических условий. Для полной оценки тироидного статуса необходимо учесть концентрацию всех гормонов, связывающих белков, аутоантител и других факторов, участвующих в регуляции работы щитовидной железы [11, 27, 28, 81]. Для первичной оценки достаточно знать концентрации в крови тироксина и тиротропина [14, 30, 46].

В настоящее время для измерения концентрации тироксина применяют в основном иммуноаналитические методы. Огромное значение для успешного применения этих методов имеет качество используемых антител.

Антитела должны обладать высокой специфичностью и аффинностью к тироксину, поэтому использование моноклональных антител намного предпочтительней, чем использование поликлональных [54, 65]. Кроме того, явные преимущества имеют методы, применимые для проведения массовых анализов в клинике: они не должны быть длительными, трудоемкими, напротив, должны быть просты в исполнении, использовать малый объем крови, не требовать предварительной обработки пробы.

Целью данной работы является создание количественных иммуноферментных методов определения тироксина с использованием моноклональных антител.

Моноклональные антитела к тироксину были получены ранее в лаборатории молекулярной биотехнологии АО "Биотехнология".

При выполнении работы были поставлены следующие задачи, выбор оптимальной стратегии анализа; изучение влияния гаптенной гетерологии на характеристики иммунометрического анализа; изучение условий, обеспечивающих разрушение комплексов тироксина со связывающими белками; очистка донорской сыворотки от тироидных гормонов для дальнейшего получения стандартных разведений тироксина.

Научная новизна.

Изучены возможности использования моноклональных антител к тироксину 1В7 в твердофазных методах определения тироксина, основанных на принципе прямой и непрямой ELISA.

Разработан иммунометрический метод определения общего тироксина в сыворотке крови на основе моноклональных антител.

Изучено влияние гетерологии на чувствительность и специфичность иммунометрического метода.

Практическая значимость работы.

Тема диссертационной работы является темой, утвержденной и финансировавшейся Министерством Здравоохранения и Министерством по Чрезвычайным Ситуациям "Т4-ТЕСТ". В данной работе создана тест-система для количественного определения концентрации тироксина в сыворотке крови на основе моноклональных антител, которая позволяет провести анализ за 30 минут, использовать малый объем крови (достаточно брать кровь у больных из пальца), проста в исполнении. Разработанный метод по своим характеристикам не уступает лучшим зарубежным аналогам, являясь при этом более экономически выгодным. Метод опробован на банке сывороток (80 штук), любезно предоставленном Институтом Экспериментальной Эндокринологии Эндокринологического Научного Центра РАМН. В настоящий момент разработаны и утверждены медико-технические требования, технические условия и регламент для производства опытной партии тест-систем с целью их дальнейшего промышленного производства.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Мертц, Марианна Владимировна

выводы.

1. Разработан одностадийный метод измерения концентрации общего тироксина, основанный на принципе прямой ELISA, с использованием моноклональных антител, подобраны оптимальные условия получения конъюгата тироксина с пероксидазой.

2. Изучено влияние гаптенной гетерологии на чувствительность и специфичность иммунометрического анализа тироксина для данных моноклональных антител.

3. Подобраны условия приготовления стандартных растворов тироксина на донорской сыворотке.

4. Разработан чувствительный и удобный иммунометрический метод анализа общего тироксина в сыворотке крови человека на планшетах, для которого необходимо всего лишь 10 мкл пробы, время анализа 20 мин. Для метода характерна высокая специфичность, низкая вариабельность результатов и хорошая корреляция с другими методами.

В настоящее время разработаны и утверждены медико-технические требования, лабораторно-промышленный регламент и технические условия набора реагентов для анализа общего тироксина "Т4-тест", в основу которого положен этот метод, идет подготовка к производству на АОЗТ "Диаплюс".

Список сокращений, использованных в работе.

1. Т4 - тироксин

2. ТЗ - трииодтиронин

3. ГГ4 - свободный тироксин

4. ГГЗ - свободный трииодтиронин

5. ГГ41 - свободный тироксин индекс

6. ТВГ или Т11Н - тиреотропин высвобождающий гормон

7. ТТГ или ТБН - тиреотропин

8. ТВ в - тироксин связывающий глобулин или тиропексин

9. ТВРА - тироксин связывающий преальбумин или транстиретин

10. БСА - бычий сывороточнай альбумин

11. БОН - семейная дисальбуминческая гипертироксимия

12. РИА - радиоиммуноанализ

13. ИФА - иммуноферментный анализ

14. ЗФР - забуференный фосфатами физиологический раствор

15. КЬН - гемоцианин моллюска фисуреллы

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мертц, Марианна Владимировна, Москва

1. Балаболкин М.И.// Эндокринология. Москва, Медицина, 1989.

2. Свиридов О.В.// Структурные и функциональные аспекты мультикомпонентной системы белков, связывающих тироксин. Биохимия, 1993, N 6, с.57-62.

3. Старкова Н.Т. //Фармакотерапия в эндокринологии. Москва, Медицина, 1989.

4. Туракулов Я.Х. //Пути биосинтеза и механизм действия гормоновщитовидной железы в норме и патологии. Вестник АМН СССР, 1988. N7, с.54-61.

5. Abuid J„ A.H.Klein, Т.Р. Foley, P.R.Larsen. // Total and freetriiodothyronine and thyroxine in early infancy. J. Clin. End. Metab. 1974. V.39. P.263-268.

6. Anderson V.L. // Thyroid hormons alters the DNA binding properties ofchicken thyroid hormone receptors and Nucleik Acids Res. 1992. V.20. N.18. P.4803-4810.

7. Aracava, Maeda, Tsuji, Ishii. //Fluorophotometric enzyme immunoassay of

8. T4 in dried blood samples on filter paper. Bunseki Kagaki 1982, V.31, p.55-61.

9. Beaman J.,Woodhead J.S.,Liewendahl K., MahonenH. // The evaluationof a chemiluminescent assay for free thyroxine by comparison with equilibrium dialysis in clinical samples. Clin.Chem. Acta. 1989., V.189., P.83-90.

10. Beatty J.D., Beatty B.G., Vlahos W.G. // Measurement of monoclonalantibody by non-competitive enzyme immunoassay. J.Immunol.Meth., 1987, V.100, P.173-179.

11. Belgorodsky. //Evaluation of serum total T4. J. Endocrin. Invest. 1993, V.7, p. 499-503.

12. Bhagat C., Garcia-Webb P., Watson F.,Beilby J. // Interference of radioimmunoassay of total serum thyroxine and free thyroxine due to thyroxine binding autoantibodies. Clin. Chem. 1983., V.29., P. 1324-1325.

13. Bhayana V.,Y.A.Tan, A.Papanastasiou-Diamandi, M.J.Khosravi // A one-step immunoassay free-T4 by time-resolved immunofluorometry. 1990., V.36. N.6., P.1077.

14. Bianca C.,D. Hwang, B. Meriadec, M. Strasswimmer, C.Woo.//An improved, second generation method for T4 on the Technicon RA System. 1990., Clin. Chem. V.36., N.6., P. 1082.

15. Blick K.E., Michael Smith, Gillum R.L. // Apparent Lack of Concordance between Free T4 and TSH Determinations. Clin. Chem. 1991, V.37, N.6, P.943.

16. Braverman L.E.,Vagenakis A.G., Foster A.E., Ingbar S.H.// Evaluation of a simplified technique for the specific measurement of serum thyroxin concentration. J.Clin.Endoc. 1971, V.32, P.497-502.

17. Buchman D., Miller D., Koch G.// Monoclonal antibodies to digoxin, comparison of an vitro and in vivo immunization Hybridoma 1985 V.4. P.173-177.

18. Canova-Davis E., Redemann C.T., Volmer Y.P., Kung V.T.//Use of a reversed-phase evaporation vesicle formulation for a homogeneous liposome immunoassay Clin.Chem. 1986 V.32, P.1687-1691.

19. Cernosek R.M., M. Klute, M. Norden, D. Ashby, and W.Knight / / An automated solid-phase enzyme immunoassay for measurement of T-Uptake. Clin.Chem. 1990, V.36, N.6, P.1079.

20. Chang E.L., Waite B.A.// Analysis of vesicle immunolysis assays: the direct binding model J.Immun.Methods 1987 V.102, P.33-43.

21. Chen I.W., Sohnlein B., Heminger L., Sperling M. // Evaluation of a fully automated immunoassay system for thyroid function testing. Clin.Chem. 1990, V.36, N.6, P. 1080.

22. Chilcoat K.A., O Kell R., Shea R.A. // Evaluation of the SYVA EMIT thyroxine assay applied on the COBAS BIO. Clin.Chem.1990, V.36, N.6, P.1079.

23. Chooi M.K., Coates J.E.// Effect of use of a specific monoclonal antibody on radioimmunoassay results for serum cyclosporine. Clin.Chem. 1988. V.34. P.2556.

24. Churchill W.H., Tapley D.F. //Antibodies specific for thyroxine and its analogues. Nature 1964, N.202, P. 29-31.

25. Cole R. and Trundle D.S.//Evaluation of SYVA ECP thyroxine and T-Uptake reagent on the COBAS FARA 11. Clin.Chem.1991,V. 37, N.6, P. 938.

26. Collinsworth W.L. // Multicenter evaluation of CEDIA T4 and T-Uptake assays on Boehringer Mannheim/Hitachi Analyzers. Clin.Chem. 1990, V.36, N.6, P. 1078.

27. Cristofides, Nicos, Sheehan. //Multicenter evaluation of enhanced chemiluminescence labeled-antibody immunoassay (Amerlite) for T4. Clin. Chem.1995, V.l, p. 24-31.

28. De-Groot L.J. // Mechanism of thyroid hormone action. Adv. Exp.Med.Biol. 1991, V.299, P.l.

29. Delange.// Neonatal hypothyroidism. Clin. Endocrin. 1988, V.2, p. 637-652.

30. Desai R.K., Deppe W.M., Norman R.J. // The simple TRAC FT4 / TSH assay evaluated as first-line thyroid function test. Clin.Chem. 1988, V.34, P. 1488-1491.

31. Diran, Riodan, Silbert. //Effect of hapten heterology on thyroid hormone immunoassays. JIM 1990, N 2, p. 207-214.

32. Duffy P., Marshall C.M. // Performance of EMIT T4 and T-Uptake assays on the Technicon CHEM 1 ANALYSER. Clin.Chem. 1990, V.36, N.6, P. 1083.

33. Engvall E., Perlmann P.// Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G, Immunochemistry 1971, V.8, P.871-874.

34. Farid N.R., Kennedy C. // Assessment of a method of measuring serum thyroxine by radioimmunoassay, with use of polyethylene glycol precipitation. Clin.Chem. 1977, V.23, N.7, P. 1333-1335.

35. Ferrua, Genetet, Savaron, Moulin, Salard, Massaeff./ / Immunoassay of total T4 using immobilizate antibody. JIM 1986, V.87, p. 137-143.

36. Freytag J.W., Dickinson J.C., Tseng S.Y.// A highly sensitive * affinity-column-mediated immunometric assay, as exeplified bydigoxin. Clin.Chem. 1984 V.30, P.417-420.

37. Gil, Tang, Halsall, Heineman, Misiego. //Competitive heterogeneous enzyme immunoassay for theophylline. Clin. Chem. 1990, V.36, p.662-665.

38. Gonzales R. //An enzyme immunoassay for determination TT4 in human serum using an ultramicroanalitical system. Clin. Chem. Acta 1991, V.3, p. 159-170.

39. Green G., Inbar S., Meneghini F.A., Long E.W., Yamartino E.J.,, Bo wen M.S., Blackwood J.J., Padila A.J., Maretsky D., Staedter //Multilayer fluorescent immunoassay technique. Clin.Chem.(1989) 35, 1865-1868.

40. Greene H., Hwang D., Hutchins J., Johnson A. // Technicon thyroxine and thyroid binding globulin: two fully automated immunoassays for the serum. Clin. Chem. 1990, V.36, N.6, P. 1082.

41. Guin, Witty. //Molecular film fluorescence technology applied to detection of T4. Clin. Chem. 1993, v.6, p. 1163.

42. Hammila I.// Fluoroimmunoassays and immunofluorometric assays. Clin.Chem. 1985, V.31, P.359-370.

43. Hammila I., Malminen O., Micola H., Lovgren T.// Homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay of thyroxin in serum. Clin. Chem. 1988, V.34, p.2320-2322.

44. Helemus T., Liewendahl K. // Improved dialysis method for free " thyroxin in serum compared with five commercialradioimmunoassays in nonthyroidal illness and subjects with abnormal concentration of TBG. Clin. Chem. 1983, V.29, N.5, P. 816-822.

45. Helfand. //Screening for thyroid disfunction. JAMA 1993, V.270, p. 2297-2298.

46. Hoffman W. //Characterization of immune complex components by dot blot analysis. Anal. Biochem. 1992, V.l, p.44-50.

47. Hollander L., Worthy T.E. // Performance of the microgenics CEDIA T4 MAB and T-Uptake assays on the coulter electronics optichem. Clin.Chem. 1991, V.37.N. 6, P. 944.

48. Hunter M.M.,Margolies M.N.,Ju A.,Haber E. //High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glicozide digoxin. J.Immunol. 1982. V.129 P.1165-1172.

49. Jarvis S., Socqueline A. // Homology model of thyroxine binding globulin and elucidation of the thyroid hormone binding site. Protein Eng. 1992, V.5, N.l, P. 61-67.

50. Khosravi M.J. and A. Papanastasiou-Diamondi. // Hapten -heterologous conjugates evaluated for application to free thyroxine immunoassays. Clin.Chem. 1993,V.39, N.2.P.256-262.

51. Kohler G., Howe S.C., Milstein C. //Fusion between immunoglobulin secreting and non-secreting myeloma cell lines. Eur. J. Immunol., 1976, V.6, P.292.

52. Kruse V.// Production and evaluation of high-quality thyroxine antisera for use in radioimmunoassay. Scand.J. Clin. Lab. Invest. 1976, V36.P.95.

53. Kwiatkowski M., Long L., and Sickel M. // An automated chemiluminescence immunoassay test for free thyroxine (FT4) Clin. Chem. 1990, V.36, N.6, P. 1078.

54. Lenz, Helmet, Bialk (Boeringer Mannheim). //Method and standart solution for determination of T3 or T4 in serum by immunoassay. Patent DE 4,226,949. 1994.

55. Leo-Mensah A., Piran Uri, Blick M., Edgeworth D., Hayes E., Simonaitis R., Hudson T. // An automated chemiluminescence immunoassay test for total thyroxine. Clin. Chem. 1991, V.3, p. 137-140.

56. LeVinson S.S., Burch P.A. // Microparticle enzyme immunoassay (MEDYA) and fluorescence polarization (FP) for thyroid evaluation. Clin.Chem. 1991, V.37, N.6, P. 943.

57. Litchfield W.J., Freytag J.W., Adamich M.// Highly sensitive immunoassays based on use of liposomes without complement Clin.Chem. 1984. V.30, P.1441-1445.

58. Luckenbach C. et al. // Isoelectric focussing of human thyroxine binding globulin (thyropexin) and human prealbumin (transthyretin). Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem., 1992, V.30, N.7, P. 387-390.

59. Maeda Masaco, Hiroshi Ohokuma, Hidetochi Arakawa, and Akio Tsuji. / / Enzyme-linked immunosorbent assay for free thyroxin using glucose oxidase as a label enzyme. Clin. Chem., 1990, V.36, N. 6, P. 1078.

60. Marsh J.A., Johnson B.E., Lillehoj H.S., Scanes C.G. // Effect of thyroxine and Chicken growth hormone on immune function in autoimmune-thyroiditis (Obese). Proc.of the society forexper.biol.and med., 1992, V.199, N.l, P. 114-122.

61. Mitsuma T., Colcci J., Shenkman L., Hollander C.S. //Rapid simultaneous radioimmunoassay for triiodothyronine and thyroxine in unextracted serum. BBRC. 1972, V.46, N.6, P.2107- 2113.

62. Mpoko C.N., Cordon D.B., Laing I., Corbitt G., Storey C.C. //The production and characterisation of a monoclonal antibody to thyroxin. Clin.Chem.Acta, 1985, V.146, P. 215-222.

63. Murray R., Burkhardt M., Boches F. // Development of a monoclonal antibody based total T4 RIA. Clin.Chem., 1990, V.36, N.6, P. 1077.

64. Nakane P.K., Kawaoi A. // Peroxidase labeled antibody a new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem., 1974, V.72, P. 108.

65. Nantov, Suonpaci, escola, Lovgren. //Direct solid-phase fluoroassay of TT4. J. Clin. Biochem. Science, 1985, V.4, p.52-56.

66. Nelson J.C., Tomei R.T. // Direct determination of free thyroxin in undiluted serum by equilibrium dialysis/radioimmunoassay. Clin.Chem., 1988, V.34, P. 1737-1744.

67. Neto E.G., J. Schulte, E.Kreisner and R. Giugliani. // Application of a comprehensive protocol for detection and diagnosis of congenital hypothyroidism in Brazil.Clin.Chem. 1991, V.37., N.6, P.935.

68. Nishokawa T., Kubo H., Saito M.// Competitive nephelometric immunoassay of theophylline in plasma. Clin. Chim.Acta 1979, V.91, P.59-65.

69. Olberding M.L., Haven M.C., Markin R.S. //Evaluation of the reformulated TDx thyroxine assay. Clin. Chem. 1990, V.36, N.6, P. 1080.

70. Ozinscas et all. //Homogeneous model immunoassay of T4 by phase-modulation fluorescence spectroscopy. Anal. Biochem. 1993, V.2, p. 264-270.

71. Papanastasiou-Diamandi A., Bhayana V.,Diamandis E.P. //A time resolved fluoroimmunoassay of total thyroxine in serum. Ann.Clin.Biochem. 1989, V.26., P.238.

72. Plomp T.A.,Drost R.A., Thyssen J.H.N. // Evaluation of the manual enzyme immunoassay (EMIT) procedure for the determination of serum thyroxin. J.Clin.Chem.Clin.Biochem. 1979, V.17, P.315.

73. Pollack. //A fluorescence liposome immunoassay for TT4. Clin. Chem. 1993, V.6, p.1254.

74. Ratcliffe W.A., Challand G.S., Ratcliffe J.G.,// A critical evaluation of separation methods in radioimmunoassay for total triiodothyronine and thyroxine in unextracted human serum. Ann. Clin. Biochem. 1974, V.ll, P.224.

75. Ratcliffe W.A., Ratcliffe J.G., McBridge A.D.// The radioimmunoassay of thyroxine in unextracted serum. Clin. Endocrinol. 1974. V.3.,P.481.

76. Ritter D., Stott R., Grant N., Moon H. Nahm // Endogenous antibodies that interfere with thyroxine fluorescence polarization assay but not with radioimmunoassay or EMIT. Clin. Chem. 1993, V. 39, N.3, P.508-511.

77. Robins B., Soltys R., Dowben R., Alford M., Shriver B. // Development of a fluorescence polarization immunoassay for total T4. Clin.Chem.1993. V.39/6.P.1169.

78. Sapin R. // In vitro and in vivo effects of increased »concentrations of free fatty acids on free thyroxinmeasurements as determined by five assays. Clin.Chem. 1990, V.36, N.4, P.611-613.

79. Sapin, Remy, Gasser, Francoise. //Spuriously high concentration of serum FT4 due to anti-T3 antibody. Clin. Chem. 1995, V.l, p. 117-118.

80. Schmitt Cheril A. and A. A. McDonough. / / Thyroid hormone regulates and isoforms of Na,K - ATPase during development in neonatal rat brain. J.Biol.Chem. 1988, V.263, N.33, P. 176-178.

81. Schroeder H.R., Yeager F.M., Boguslaski R.C., Vogelhut P.O. // Immunoassay for serum thyroxin monitored by chemiluminescence. J.Immunol. Methods, 1979, V.25, P.275-282.

82. Sestoft L. //Metabolic aspects of the calorigenic effect of thyroid hormone in mammals. Clin.Endocrin.,1980,V.13,P.489

83. Shall, Fraser, Hansen. //A sensitive manual enzyme immunoassays for T4. Clin. Chem. 1990, V.2, p. 933-938.

84. Siebert G.R., Raleigh N.C., Armstrong J. // Monoclonal antibodies recognizing L-thyroxine. United States Patent 1989, N. 4,888,296.

85. Sqoutas D., Annie Love, Fredricks M. // Comparison of the TOSOH AIA 1200, ABBOT TDx and Pharmacia DELFIA methods for the determination of serum thyroxine. Clin.Chem. 1991,V.37, N.6, P.942.

86. Sturgess M.L., Ian Weeks, C.N. Mpoko. // Chemiluminescent labeled-antibody assay for thyroxin in serum, with magnetic separation of the solid phase. Clin.Chem., 1986, V.32, N.3, P.532-535.

87. Surks M.I., Hupart K.H., Pan C. // Normal free thyroxine in critical nonthyroidal illnesses measured by ultrafiltration of undiluted serum and equilibrium dialysis. J.Clin.Endocrinol.Metab. 1988, V.67, P.1031-1039.

88. Taimela, Aalto, Mijia.// Clinical laboratory studies of fluorescence immunoanalisis of TT4. Clin. Chem. 1993, V.4, p.679-682.

89. Thede-Reynolds K.R., Johnson G.F. // Antibody suitability for two stage free thyroxin assay. Clin.Chem. 199,1 ,V.37, N.6, P. 1044.

90. Tillotson, Lartic. //Plasma total Thyroxine. J. Clin. Pathology, 1992, V.9, p. 818-820.

91. Tuuminen T., Kaepyaho K. // Determination of thyrotropin, thyroxine and free thyroxine in dried blood samples by enzyme FIA. Eur.Pat.App.EP 1991, N.460,650.

92. Velasques, uphan, Philipp, Altaffer.// ELISA T4 assay compared to fluorescence polarisayion. Clin. Chem. 1993, V.39, p. 1209.

93. Wallase, Aitken, Duffy, Fraser.// Measurement FT4 by using Magnetic Ab-containing Microcapsules. Clin.Chem. 1990, V74, p. 614-619.

94. Wang L., Hexter C.S., Inbar M. // Monoclonal antibodies to thyroid hormones anti-thyroxine and anti-triiodothyronine in

95. Monoclonal antibodies and T cell Hybridomas. Eds: Hammerling G.I., Hammerling G.H.,Kearney J.F. Elsevier, Amsterdam, 1982. P.357.

96. Weerasecera, Kim, Barnard.// Measurement of T4 by solid phase chemiluminescence. Clin. Biochem. 1993, V.l, p. 100-104.

97. Welby M. //Clinical chemistry of thuroid function testing. Adv. Clin. Chem. 1990, V.28, p. 81-92.

98. Wilson M., Hitchcock K.R., De-Lellis R.A. // Immunohistochemical localization of thyroid hormone in rat thyroid gland. J. Histochem.Cytochem. 1978, V.26. P.1121.

99. Yaoita Y., Brown D.D. // Xenopus laevis and thyroid hormone receptors. PNAS, 1990, V.87, P. 7090-7094.

100. Yatscoff R.W., Hayter J.// Competitive nephelometric inhibition immunoassay of theophylline with use of monoclonal reagents: comparison with EMIT procedures -Clin.Chem. 1983. V.29, P. 1857-1858.

101. Zuk, Rowky.// Flurescence protection: a new homogeneous assay technique. Clin. Chem. 1989, V.5, p. 1554-1560.