Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение поли- и моноклональных антител к тироксину и их использование в иммуноанализе

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение поли- и моноклональных антител к тироксину и их использование в иммуноанализе"

о г

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОЕКТНО-КОНСТРУКТОРСКИЙ ИНСТИТУТ ПРИКЛАДНОЙ БИОХИМИИ

На правах рукописи

КРУПИНА Надежда Васильевна

ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ТИРОКСИНУ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ИММУНОАНАЛИЗЕ

03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

Работа выполнена в лаборатории гибридом А/О «Биотехнология»

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ :

кандидат биологических наук Н. П. Данилова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Института биохимии им. Баха А. Н. — Дзантиев Б. Б.

Доктор медицинских: наук, профессор, зав. лаборатории фундаментальных проблем иммунофармакологии А/О «Биотехнология» — Ковалев И. Е.

на заседании специализированного совета Д 098.09.01 в Научно-исследовательском проектно-конструкторском институте прикладной биохимии по адресу:

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского проектно-конструкторского института прикладной биохимии.'

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова

Защита состоится

125299, Москва, ул. Клары Цеткин, д. 4/6

Автореферат разослан «

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

И. И. ГУСЕВА

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Диагностика н лечение заболевания, связанних с наруыэшт-1-21 функшш митопндноп «елезы япляется одной из центральных проблем соирвмонноп эндокринологии. Правильная л своевременная ¿до. гностика этш: заболевания очень сложна: необходимо оценить сс-етояиие всех звеньев сисгеми гипоталамус-гипофиз-ыито.чидлая кодоэа. Для этого нужно учесть концентрацию псах гормоноп, участвующих п регуляции работы ыитоиилнся аолозы: тиротрошш В!.:сьоЗоадаюмаго гормона, тиротротта, тринодтнронина н тироксина, конкентрацпи СЕИзываюцлх белков, наличие аутоактнтял г< ткакпм хелезм и отдельным гормонам и другие факторы. Однако как паказывл>от ясслгднио исследования для яерпичной оценк!; ти-роидзтого статуса достаточно измерять в крова уровни тиротропи-

п свободного тироксина.

Концентрации тироксина в настоящее Бремя изкерсмт ярекму-костзеино кммуяоаналцтическнми методами. Эффективность этих погодой и огромной степени зависит от качества используемых антител. Антитела должны обладать высокой специфичностью и вф-«риияоеть» к тироксину, особенно а мэтосах прямого оиоэделоиня свободного 74. Поляююнальные сияоротки гэтерогоинн п часто икэят 1!л:{ недостаточную аффинность или тнтр. Низкий тптр аитн-сывороткн мояет объясняться наличием у яммукязпровлдаяас хпаот-яих эндогенного тироксина, которця заминает часть свизьтгиовдх яеитров на псшЗолаэ афрттпых антителах. Зта обычяал проблема при получении антител к эндогенным соединениям нозвт Сыть рв-ыека только с переходом на использование и пммукоаяолиэо гю-ноклоиалышх антител.

ЦЕЛЬ II ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цальч» данной работы является получение эысокооффшших н вмеокоспеиифичяых моиоклоиальных аптиггал к тироксину п изучение воэкоапостеП создания ко их основа количественных Е'ммуиоаналитпчэских методов. При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1. Синтез конъюгатоп тиронсии-белоя для получения антител к тироксину и выбор оптимальной химической структуры иммуногена;

2. Получение гнбридомы, продуцирующей высокоаффинные я специфичные моиоклонэльныз антитела к тироксину;

3. Характеристика антител ( специфичность, константа аффин-

- 2 -

кости}, подбор условий их выделения и очистки;

4.Изучение возможности разработки на базе полученных аигитол твердофазных имнуноферментных методов определения тироксина.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Изучено влияние структуры имиуно-гспа на специфичность и аффинность образуюичхся антител, по-доСрша пара коньюглтов тироксин-белок для иммунизации животных к длп тестирования антител в твердофазном иммуноферментиом саал!:зе. На базе этих коньигатов разработай иовьш метод анализа тироксина, основанный ка принципе быстрой фильтрации имму-нореагептоп через мембрану с иммобилизованным антигеном.

Впервые п отечественной практике получены моноклональныэ антитела к тироксину, обладающие высокой аффинностью н специфичностью.

Изучена возможность использования полученных моноклональ-ных антител з различных нммуноаналнтических методах определения тироксина.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. В данной работе впервые в наыей стране получини высокоспецифичкые н высокоаффинныв ноно-клоиалькыо антитела к тироксину, показана возможность их использования в конкурентном твердофазном имнунофермеитном анализе для количественного определения тироксина. Впервые предложен удобный мсниструментальныя экспресс-метод для определения ткро-ксияа основанный на Быстрой фильтрации пробы и антител, меченных ферментом, через мембрану, на которой сорбирован коныогат тироксин-белок.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЦНТУ 1. Подбор оптимальной химической структуры конъюгнрованных антигенов тироксин-белок для иммунизации животных и тестирования антисывороток в твердофазном Г<ФА. 2. Получение гибридомы, продуцирующей высокеаффинные моноклональные антитела к тироксину . 3. Изучение возможности использования полученных монокло-нальных антител в твердофазных чммуноферменткых методах определения тироксина. 4. Разработка метода иммунофилътрацни для экспресс-анализа тироксина.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Диссертации апробирована на заседании секции молекулярной и клэточной биотехнологии НПО "Биотехнология" 23 декабря 1932г. Материалы диссертации били представлена на семкнарах отдела кедпшгаских диагностикумоо и на Всесоюзной кокфэроншш "Соврегтеичые направления развития биотехнологии " (Москва,1991).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 1 тезиси доклада. Подана заявка па патент на получение моноклоиаяьных антител к тироксину (регистрационный помор заявки 93-018323/13 }.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литератури, результатов м их обсуждения, экс-пэрименталыюя части, выводов к списка литературы нэ 115 работ. Работа изложена на страницах, содержит рисунков и таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Синтез коныогированных антигенов тироксин - белок.

Для получения мококлоналыгых антител к тироксину необходима решить несколько задач, прежде всего выбрать способ синтеза кокьгогата тироксин-белок, обеспечивающий получение максимально интенсивного и специфичного иммунного отпета на гаптак. Известно, что характер иинункого ответа на гаптек определяется как свойствами белка-носителя, так и типом химической связи г аптек-белок. В качестве белков-нссителея ми использовали бычий сывороточный альбумин (БСА) и гемоцианин из моллюска фиссурел-лы (КЬН) . Было получено несколько коньмгнрованнызс антигенов тироксина, отличающихся как характером бвлка-ноентеля, так и типом химической связи гаптен-белок. Ковалентноо связывание тироксина с белком осуществляли с помощью глутарового альдегида или водорастворимого карбодиимнда (Рис.1).Кокъпгат, полученный с помоиью глутарового альдегида, отличался от аналогичного кон-ъмгата, синтезированного с помочью карбодиимида, типом связи н наличием более длинной ножки между гаптеном и белком.

1)0-СН(СНа)3СН-0

_ _. СООН 2) КаВН^

X. НО-/(^)УСН^-СН-К^ + Н2Н-6влок

^—. ^,соон

белок

синтез коныогата Т4 - белок с помоиью глутаральдогнда

3,_ э»

2-

СН-СООН + ЯМ-ОМ»' + Н.Г-бедок

но

СНхСН-СОЫН-белок + ННМСЫЙН * » II

нн„

синтез коныогата ТЧ - белок с помомью карбодиимнда где И - С11}СЦ, я' - (СИ2 )1>1<с"1)2-

Рис 1. Синтез ионьюгатоп гормон-белок.

Влияние химической структуры нмиуногеиа на аффинность и специфичность образующихся антител изучалось на кроликах и мы-ыах. Поскольку из литературных данных известно, что гемоинанин является более иммуногенньт носителем, чем БСА, для иммунизации животных применяли только коньюгаты на гемоцианиновом носителе: Т4-Г/а-КЬН и Т4-к/д-КШ.

Первичная иммунизация кроликов проводилась подкожно в несколько мест, мьшея иммунизировали внутрибрюиинно и подкожно по 500 мкг коныогата тирокгин-^рпок нл кролин.* и П'"* ЬО мкг нл мьшь, с полным сзльювантом V [:' ч и л .1 ПАР).

Иммуяиых отвэт у животных изучали методом твердофазного имнупофермвнтного анализа. В качества антигена в НФА использовали коньигдт Т4-к/д-БСА, который сорбировали на полистироловые 96-луночныэ планшеты для мнхротитроваикя. Связавшее« с пластиком специфические антитела определяли с помощью кроличьих аитктел против мышиных иммуноглобулинов. Тнтр актнеивороткл определяли как раэведениа при котором разультируюнип сигнал составлял 50 % от максимального. Аффинность оценивали в рэак-ции кнгибкрозання свободным тироксином связывания антител с коньпгатом тирокевя-бэлок. Оказалось, что максимальный иммунный ответ достигался у кроликов, имму-пизирооакных кояывгатом Т4-г/а-К1Л (рис 2). Сыворотки всех животных, иммунизированных этим коиъигптом титровались гораздо кьша в ИФЛ, средний тнтр в этой группе составлял 1 5 10000 в то время как титр еыворотои кроликов, иммуккзяроа&кинх коньмгатом Т4-к/д-КьН, ке «ровиаля 1 : <1000 ,-несмотря ка то, что в НФ& в качестве антигена пепояъзоаали кояьюгат Т4-к/д-БСА с таким хе типом химической свези гаптек-балок как к в иммуногенез.

Рис 2. Титрование в твердофазном ИЭА сывороток кроликов кммункзя-роваякых разными кокыогатами: 1,2,3 - коныогптом ТЛ-г/а-КШ; 4,5,6 - коньпгатом Т4-к/Д-КЬН, 7 - неиммуниая сыворотка.

Влияние длительности иммунизации

Наиболее эффективно!! оказалась схема иммунизации с болылим (но мансо б недель) интервалом найду первой и второй нммукиэа-щшми и последующими инъекциями имиупогеиа раз в месяц в течение 5-8 чеспиев. Ва рис з продемонстрировано, как измонпагс« аффинность а;п-ит.эл в процессе разяктия иммунного ответа. Кровь у кролика, иммунизированного кокьюгатом Т4 -г/е- К1.Н, Срала посла второй иммунизации (7 недель) и после ялтол (30 недель). Как видно иэ полученных кривых ннгибяровання, аффинность антител гначаталыю возрастает в процессе иммунизации(концентрация тироксина,- вызывавшая 50 % торможение связывания антител с и-.шобаяиэоаышым антигеном, значительно меньше для сыворотки после 5-ой иммунизации, чем после второй).

А^дкм 2,0'

1,5

1,0

0,5

0,1 1 10 100 1000 Т4 КГ Дм

концентрация свободного тироксина

Рис 3. Влияние длительности иммунизации кролика на характер кривых ннгибировання в твердофазном ПФА:

1 - сыворотка кролика после вгороЯ иммунизации(7 недель)

2 - сыворотка кролика после пятой иммунизации (30 недель)

- 7 -

Иыбор ¡vuañ дла гнЗрвднэоим

При изучоил.ч ммуиного отвота на «оньвгати тироксина с Валкой у ?<мьк;й,Сыло оеяорухоно,чго коиъетгат T4-r/a-KLH,. опаэаа-tciítcu нолболоо ИММУИОГОННЫМ для кроликов, выл Оолвв У.ХИГрЮГЪ-коя а для :aiuart, Дяаяяэ сывороток пшгупиюс ниыва я тпврдофаз-аом КСА, пока зал, что ниит, дшю в попуяяиич гекетнчоскк одко-родсызс зизотпых. оччкь гатвроганпы го нммупкому ответу нл роксил (pite 4).

разведение сыворотки Рис. 4 Гетерогенность иммунного ответа у мыыап:

1-9 сыворотка мышей иммунизированных Т4-г/а-КШ 10 - контрольная кэммнуиная сыворотка мыши

- а -

Эта гетерогенность может зависеть как от того, с какими нмму-ногенами встречалось животное в процессэ своего инливилульного развития, так и от его тлрокдного статуса. Особенно интересно, что мши различались не только титром антисыворотки, ко и специфичность» образующихся антител. . На рис 5 приведены кривые хнгибкрсвахкя для сывороток от двух мьшея. Реакции связывания антител с иммобилизованным кокыогатом тироксин.- белок икгиби-розалась тироксином и трнйодтг.ронином. Как видно нэ кривых зш-гнбированик, у одной из мыцэа наблюдался гораздо более специфичный ответ к тироксину, чем у второй. Мыыи, предназначенные для гибридизации, отбирались на основании такого анализа сывороток, взятых после второй или третьей иммунизации.

Динамика иммунного ответа у пыыэй была сходна с таковоп для кроликов, то есть для достижения максимального иммунного ответа животных ккмушгэнросали длительно, ив менее 4-5 мвся-

I

ясв, перед гибридизацией Делали перерст, не менее 4 недель, за 3 дня до слиянпа мышам внутрибрюшино вводили 100 мкг копьюги-рованиого антигена тирокскк-белок без адызванта.

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

1 10 100 ЮООнг/мл 1 10 100 юоонг/мл концентрация ингибитора: тироксина <Т4) н трииодтиронина <ТЗ]

А"й1 Т*

1,1! 1,0.

0,9 0,8 0,1 0,6

Рис.5 Тестирование сывороток мышей, иммунизированных ' кокыогатом Т4-г/а~КШ, в .твердофазном ИФА.

Гибридизация

Слияние и клонирование проводилось обыэпрннятым.ч методами. Селезеночные клетки иммунной мы'ля видоляли в асептических условиях и отмывали бессыворогочиой средой ЙРКГ-1640. В качестве нчвломного партнера использовали несакретнруюцую клеточную линия P3-.463-Ag8.653. Миеломмые к латки культивировали а среде ЙРМ1 1640, сод&ршаией 10* эмбриональной телячьей сыворотки, перед слиянием их также отмывали бессивороточной средой. Миэ-ломные н солвзеночкыо клетки смеиивали в сооткоыыении 1:1. В качестве сливающего агента использовали 50* -ныя полиэтиявнг-лмколь - 4000. После слиянии клетки отмывали, ресуспондировала а среде, содержащей гипоксаитян, амииоптерин я тимидии и рассовали в полисткроловые планшеты, содерааютэ фиадериыл слой ЫЫИ1ШЫХ макрофагов. В результате одной гибридизации обычно образовывалось около 400-500 клонов. Примерно через 10 диэй су-порнатакт из лукок, содержащих активно растуцие клоны, проверяли на наличие антител к гаятеиу.

Отбор положительных клоков

Ключевым этапом в получении гибридомы является отбор положительных клонов. Для этого можно использовать различные мвто-' ды: РИА, метод поляризации флуоресценции, ИФА на планшетах с иммобилизованным антигеном и др. Твердофазный ИФА представлялся наиболее эффективным методом, и мы использовали его для скрининга моноклоиальиых антител. Для того, чтобы отобрать мо-ноклональные аититела принадлежащие только к 1д<3 классу, мы применяли для отбора положительных гибридом меченные аитивидо-выэ антитела, полученные к Хдб мьши. Для того, чтобы избежать поках со стороны гибридом, которые секретирунт аититела, специфичные к белку-носителю и коиьюгированиому, а не свободному гаптену, мы применяли для скрининга в твердофазном И<РА коньи-гат Т4-к/д-БСА, отличаюыийся от коиыогата Т4-г/а-КЬН использованного для иммунизации ие только белком-иосителем, но и типом химической связи гаптен-белок. Этот кокьюгат был ранее подобран для тестирования поликлональкых антител.

- 10 -

Отбор клопов гибридом, стабильно секретирушдах одтитэяа » тироксину,, проводился в даз стадак. На порзой стадии отбирали клетки, продуцирующие антитела, которые связывались с коагыога-ток Т4-к/д~БСА, сорбированным на твердой фаза, так что в НФА наблюдаясь сигнал, «¡в itaxiae чей в 10 раз преЕьыызиий фснссый. Тсжнм образок, в одном елкпшш било выбрано 29 подоят-ольных клопов «:э 400. Отобранные положительные клони ДЕй~ли клоннро-паг.и методом лнмитнруюишх разведения. Часть клэтоя эякораянва-лп в среде, содержащей S0% лошадиной сыворотки п 10% ДМС0. На втором этапе пероклокнрованкь'в г«6рад::ые клеточные яяпви наращивали в культуре к антитела тестировали на способность взои-модействопать непосредственно со свободны» тироксином. Сродство антител к тироксину определяли со ингибирозинню свободны» тироксином связывание антител с иммобилизованным антнгоиом. Выло отобрано 6 клонов, активно секретирусынх лятчтеле. к тироксину. Остальные антитела,, хотя и хороио связывалась с икио-бадкэоааяным коныегатом, но или ко узнавали свободный тироксян vins se на низких концентрациях давали даже усиление связывания ("fiook"- эффект). По-видкмому, для эффективного азоикэсеяствия евязываюмнх центров этих антител с тироксином необходимо также присутствие участка белковой молекулы.

Отобразите гибридомы хорошо росли в виде аевнтных опухолей в ныыах BALB/c.

Спзцнфичность антител

Специфичность полученных антител изучали твердофазным ИФА по икгиоированио трийодтиронином связывания антител с иммобилизованным антигеном Т4-к/д-БСА. По данным этих экспериментов были построены кривые ингкбиросания и проведено их сравнение с аналогичной кривой для тироксина. Как видно из представленных на рас.6 данных по 4 наиболее аффинным антителам, все антитела хорошо связываются с тироксином, но сильно отличаются по сродству к трийодтиронину. Наиболее специфичными являются антитела 1В7, перекрестная реакция с трнйодтиронином составляет 1% от реакции с тироксином. Величину перекрестной реакции определяли как отношение молярных концентраций тироксина и аналога, при-водяинх к 50 1 торможению связывания антител с иммобилизованным антигеном.

Т9

1В7

10

100

1000 кг/мл

10

100 1000 НГ/мл

2Е10

2Г9

10 100 1000 нг/пл 10 100

концентрация ингибиторов

1000 иг/мл

Рис.6 Ингибнропанко тироксином (• ) и триподтиронииом (♦)

связывания моноклоиальнмх антител продуцируемых гибри-домамн ТЧ, 1П7, 2Е10, с иммобилизованным антигеном

Т4-к/л-БСЛ п твордофазном 11<ТА.

йффннность антител

Для создания ¡¡ммуноаналитнческих методов крайне вахноя характеристикой антител валяется их аффинность. Чом выше аффинность антител, тем больио возксаностея для конструирования кммукоаналятических систем для определения антигена. В творл<>~ фазных иммуноаналитических методах эффективно использоваться

о

могут только антитела с константой аффинности больше чем 10 И. Константы аффинности антител, продуцируемых иамими гибридомами, били определены твордофазным ИРА по методике, олксанной Beatty Для антител 1В7 константа аффинности равна 3*10S М.

Выделение « очистка антител.

Выделение полученных антител методой ионообменной хроматографии проводили, используя в качества носителя DEAE-Toycpearl.

Для выделения антител из кроличьей сыворотки их предварительно осаждали насыщенным раствором сульфата аммония н наносили на колонку, уравновешенную 0,01М фосфатным буфлром(рН 6), элгагроаалл тем *:е буфером, собирая антитела в свободном объеме.

Мышжыа антитела элюировали с колонки с помощью градиента концентрации хлористого натрия в 0,01И фосфатном буфере(рН 8,0) при этом антитела содержались во втором хроматографнчоском пико.

Чистоту полученных препаратов антител проверяли с т.омоцью гель-электрофореза в полиакриламидхом геле.' Гель-электрофорез препаратов моноклокальных антител проводили как с предварительной обработкой пробы 2-меркаптоэтаколом, так и без нее. Гель после электрофореза обрабатывали красителем кумасси. После электрофореза антител, обработанных 2-меркаптоэтанолом, на геле отчетливо видны только две полосы, соответствующие легкой и тяжелой цепи иммуноглобулинов.

По данным нммунофермеитного анализа антитела 1В7 принадлежат к подклассу IgGl. Подкласс антител определяли с помощью кита фирмы Daсо.

Итак, на данном этапе работы нами были подобраны условия для повышения специфичности и аффинности поликлональных антител к тироксину (структура иммуногана, схема иммунизации), получена гнбрндома 1В7, которая продуцирует высокоаффинные и специфичные моноклональные антнтнроксиновые антитела, разработаны методы тестирования антител в твердофазном ИФА и подобраны условия 1IX очистки.

- 13 -

Изучение возможностей использования получениях антитол в иммуноамали.зо тироксина.

Изучались возможности использования полученных антител в двух вариантах конкурынтного твердофазного анализа общего тироксина: непрямой ELISA (иммуноматрцческий метод ) с использованием коньюгата антитело-фермент и прямой ELISA с использованием коньюгата гормон-фермент.

В первом варианта на твердой фазе сорбируют конъюгировакиый антиген гантен-белок, н цэмеренио основано аа конкуренции гаптека из пробы и иммобилизованного гаптезна эа связывание с антигаптешшми антителами, мечеными ферментом.

So втором варианте на твердой фаза сорбируют антитела к гаптеку, а s реакционной смеси находится гапток иэ пробы и коиьюгат гаптека, ковалеятно связанного с ферментом.

Непрямая Еъ15А

Яле разработки этого варианта анализа хокыогированный антиген 74-к/д-БСА, содержащий, по данным спектрофотомэтрни, 17 молекул гаптеяа на молекулу белка иммобилизовали на полистиро-ловке иланывты для млкротитровония. Коноклональные антитнрок-сиковые антитела выделяли из асцитов и коньюгировали с перок-сидазой хрена. Определяли рабочее разведение антител, как раз-каяенио, при котором наблюдалось 50% связывание с иммобилизованным тироксином. Анализ проводили инкубируя смесь 50 мкл проВы с 50 мкл антител в рабочем разведения в лунках с иммобилизованным антигеном. Концентрацию тироксина'в пробе определяли измеряя ферментативную активность, ассоциированную с твердо^ фазой.

Основная трудность анализа тирондиых гормонов заключается в том, что большая их часть находится в связанном состоянии с тироксин-связываюапми белками. Для того, чтобы измерять обыее содержание тироксина в сыворотке, необходимо разрумить или вытеснить тироксин иэ комплекса Т4-белок-переносчик. Для этого используют различные буферные системы, например, салициловый или веронал-мединаловый буферы, иногда для раэруыения комплекс сов тироксина со спязываюьшмн белками используют высокие значения pH, но наиболее употребимым являются, по-видимому, химические агенты типа В-анилнно-1-нафталенсуль<)>окислот1! {АЛС).

Дай взучекяя влияния ЛЯС па СБПоыиаик? ноиоклоналышх антител с ктюбялизоаакиин капъюпатом тпрог.сп-л-ЕСЛ АКО раститроом-вяля в буфера для анализа. ( эабуфвракцый (фосфатами физиолога-чвсяия раствор, рН-7,4 , О,035 тбйк-20 я 0,2% БСД). Коаыггат ашктвл, с иерокснлаэсй хреиа,' б рабочем разседенсзс смоаяаил;« о разными разведениями АЙС, от 0,2 до 0,001 £ к иккуОироваяи в течение 45 мни. Из яояучениах дешшх (рис 7 ) видно, что АЯС до коияент'раши 0,0252 пракгичасте не влияла на саязыадика еи-тктэя с кмкобилиэоогишым тироксином. Концентрация ЛНС 0,05% а дальнейшем била выбрана как рабочая. Лучине результаты бьиш получены в случае, когда проба перед анализом подвергалась кратховрэмелкол прединкуОпции с АНС, Лщим 1,1 1,0 о,» 0,6 0,7 .0,6 0,5 0,4 0,3 .0,2 0,1

0,0068 0,0125 0,025 0,05. 0,1 0,2 АКС % Рсс 7. Влияние концентрации AlfC на связывание антител 1В7 с иммобилизованным антигеном 74-к/д-БСА в ИФА.

Долее было изучено влияние состава и значения pli буферных скстем на . результаты анализа. Для этого строились зависимости иигибироааиия свободным тироксином связывания антител с иммобилизованным тироксином в различных буферных системах. Изучались наиболее широко используемые буферы: ЗФР и веронал-меди-каловый; ялняккз pli этих буферов. Как видно иэ представленных на pue S кривых иигибировакия оптимальная форма калибровочной кривой наблюдается при использовании веронал-медикалового бу-

фара. Параметры анализа улучиамтся пря возрастании рИ от 7,4 до 9. В длльнапыоЯ работа мы применяли равочил буфер с рК а, 6 <■ Калибровочная кривая для определения тироксина в этом буфера лккспна а. логарифмических координатах в диапазоне ст 10 до 1000 нг/.мл.

15 30 60 120 240 - 4S0 960* HT/МЛ Т4 концентрация свободного тироксина Рис S. Влияние состава и pif буфера прн постоянной концентрации АНС = 0,05% ка иигибироаакке тироксином связывании антител 1В7 с иммобилизованным антигеном!

1 - ЗЧ>Р рН 7,4 • 2 - 50 мИ веронал-медикаловыЯ буфер рН 7,4 3-50 мМ Ееронал-медннйловыа буфер рН 8,6 4 - ЗФР рН 9,0

Изучалось влияние длительности инкубации на результаты анализа. На рис 9 приведены значения поглощения, полученные для концентрация тироксина 40 нг/мл при розной длительности анализа. Как видно из полученных результатов увеличение длительности анализа более 45 мин не сказывается на интенсивности коночного сигнала. Полное оремя анализа составляет 1 час.

А од хм 2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

10 20 30 40 50 60

90

120 мин.

Рис 9. Влияние длительности инкубации на связывание антител 1В7 с иммобилизованным антигеном в твердофазном [ГОЛ, при измерении пробы с концентрацией Т4 » 40 иг/мл.

Итак, показана принципиальная возможность использование подученных мококлональных антител для разработки конкурентного иммуноматрического метода ¿нализа тироксина.

Прямая ЕЫЗЛ

Для разработки варианта анализа.основанного на прямой Е1ЛБЛ, использовали иммобилизованные антитела н коныэгат, твроксин-пероксидаза.

Для конъюгирования ткроксика с пероксидазой из храпа пос леди»» окисляли перйодатом натрия и смэюшали с раствором ткроксика в слабом растворе мелочи в соотношении 1:1 по весу. Через 3 часа кокъюгдг восстанаалив&ли боргидрпдом натрия и отделяли от непрореагировавшх продуктов гель-фильтрацией.

Монокдокальные антитела 'выделяли из аецктоа ионообменной ш аффпякос хроматографией л иммобилизовали на твердой фазе.

Рабочее разгедеяке кокъюгата определяли как разведение, при котором наОлюдалось 50 % связывание коньвгята тироксии-фармеит с нм;гобнлизованными антителами.

Яла проведения анализа 50 мкл пробы смеыивалн с 50 мил 0,05% _ АЯС в зероиал - меднналовом буфере в лунках плаииэта и затем добавляли 50 мкл коиьюгата тироксин - лсроксидаза в рабочем разведении. Калибровочная кривая для определения тироксина этим методом также линейна в полулогарифмических координатах в области от 10 до 1000 нг/мл (Рис. 10).

Ашнм

концентрация тироксина, »..'/мл

Рис 10. Халкбропочкна кривые для определения тироксина полученные а твердофазном 1№А:

1-е использованием меченных ферментом антител? 3 - с использованием меченного ферментом гормона.

Таким образом, полученные нами нааоклональиые антитела могут быть использованы для анализа тироксина а обоих вариантах ELISA.

Метод иммунофильтрзцил

В последние годы интенсивно развиваются методы анализа, не требуюыио лорогого приборного оенвнокия, которые позволяют проводить аналнз, ипнрннер, а кабинете врача. Нами предложен (ШмунофермснгчмА од для олроделони» тироксина н

сыворотке, основанный на быстрой фильтрации снеси оятитиракск-KOBLix антител мечаных пероксидаэой хрена и образца через мембрану с иммобилизованным коныоготом белок-тироксик. Концентра" ция тироксина a сыворотке обратно пропорциональна активности фермента, свизавиегося с мембраной.

Рабочее разведение антител определили по кривой титрования В качестве рабочего било выбрано разведение ísioo, при котором каСлюдается около 50% от интенсивности максимального ркраыива-шгя мембраны.

Лучыие результаты были получены при использовании коньюгатов гаптек - белок с замвцеиием ю - 17 моль гаптена на «эль белка. Оптимальная концентрация каньагатов для сорбции на менбраяе была экспериментально подобрана и составила 200 мкг/мл.

Обьам образна подбирали таким образом, чтобы достигнуть наибольшего угла наклона кривой кнгибированкя в области физиологических концентраций тироксина. Оптимальный обьом образца составлял 100 мкл.

Интенсивность образующегося окрашенного пятна на мембране ■ при фильтрации субстратного буфера с 4-хлор-1-кафтолои зависит от количества каченных ферментом антител связавшихся с антигеном на мембране и обратно пропорциональна концентрации тироксина в сыворотке.

Результаты могут быть проанализированы визуально или с помомью фотометра (рис.11). Полученная калибровочная кривая линейна в области физиологических концентраций.

Точность и правильность измерения оценивали анализируя несколько сывороточных контроле« с известной концентрацией в повторах, 20 раз. Коэффициент вариабельности составлял менее 5% .

Разработанный метод позволяет проводить анализ за 2-3 мик. к пожат использоваться в лабораториях, не имеющих специального оборудования.

-

Рис 11. Калибровочная кривая для определения тироксина методом иммунофильтрации.

В Еерхней части рисунка приведен профиль оптической

плотности окрещенных пятен иа мембране:

пик 1 - соответствует нолевому стандарту

пик 2 - стандарт с концентрацией тироксина 1000 иг/мл

пик 3 - стандарт с коицонтращгой 300 нг/ыл

пик 4 - стандарт с кояцэнтрацяей 50 иг/т

пик 5 - стандарт с концентрацией 10 нг/мл

пик 6 - стандарт с концентрацией 1 нг/мл.

ШВОДЫ.

1. Нзучоим возможности повышения аффинности и специфичности антитнрокснновых «короток: подобран копью;-вт тисокс::н-6ол-ОК; мшачоскоэ строеюо которого обаспйчнаа^т наилучиий ро-эудьтат яри использовании его в качество аимуиогонл; оптимизирован а схема иммункзашш животных.

2. Biiepnua в страде получена гибридома, продуцпрулася высоко-аффяниыа к специфичные моноклоиальниэ антитело к тирокслиу.

3. Подученные мопоклоиалышэ антитела сиделепы я »характер:;-зеваны - (константа оффшиюстп 3*10*9; перекрестили реакция с тршгодтнрокшгом 14).

4. Показана крзниипислыгл« возможность использования лояу-;о;:-аьа: мзкоклояалы:нх аг.тцтел г двух вариантах туордофазного »тмуисфзрм&нтного мзтсда количественного определении тирок-сии& в сыворотке крова человека.

5. Нреддояаи иозыя эксирасс-метоа для определения концентрации тироксина и сыжэрстке, основанный на иммупофальтраццн через витроцелдалезиу» мэкСраяу с иммобилизованным алткгваом, но-заодяювдш определять концентрацию тироксина в пробе за 3-8 мвиут.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАНТ;!! S

X.Kpyniiita Н.В., Данилова И.П., Вас-.г.лов Р.Г. / Определение тироксина методом кнмуиофильтрацни.//иХим.фарм. куриал".-1993 Г.- К 4,- стр. 24-26.

2.Дакилоаа Н.П., Крупица К.В., Иергц Н.В., Василов Р.Г./ Получение мококлояадькых антител к тироксину.//"Биоорга-пачоская химия0.- 1993 г.- Н 7,- стр. 704-712.

3.Крупица H.H., Данилова Н.П., Василов Р.Г. / Твердофазный нммунофориенгний метод определения трииодтироиина.//Тезисы докладов "Современные направления развития биотехноло-

гии". - Москва, 10-12 дек. 1991 г.- стр.27