Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Флуоресцентный лантанидный иммуноанализ гормона тироксина с использованием европиевых меток
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Флуоресцентный лантанидный иммуноанализ гормона тироксина с использованием европиевых меток"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт биохимии им. А.Н. Баха
□□30В23В7
На правах рукописи
Жердева Виктория Вячеславовна
. /а /
флуоресцентный лантанидныи иммуноанализ гормона тироксина с использованием европиевых меток
Специальность 03.00.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2007
Работа выполнена в лаборатории физической биохимии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.
Научный руководитель:
доктор химических наук, профессор
A.П. Савицкий
доктор химических наук, профессор С.А. Еремин
кандидат биологических наук
B.В. Никандров
Официальные оппоненты:
Ведущая организация: Институт экспериментальной кардиологии ФГУ Российский кардиологический научно-нроизводственный комплекс Росздрава
Диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.
Автореферат разослан « /9> ЯМИёиЛ, 2007 г.
Защита состоится «»V- 3 & —
2007 г. в 14 часов на заседании
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Флуоресцентный лантанидный иммуноанализ традиционно используется для определения гормонального статуса и занимает прочное место среди других методов (РИА, ИФА). Он базируется на принципе времяразрешенной микросекундной спектроскопии, в связи с чем, получил название «флуоресцентного иммуноанализа с временным разрешением» (ФИАВР). Европиевые метки обеспечивают большую, по сравнению с ферментативными метками, точность и чувствительность. В отличие от радиоизотопных меток, они безопасны для человека и окружающей среды.
Моноклональные антитела, благодаря таким их свойствам, как химическая гомогенность, высокая аффинность, эффективно используются в клинико- лабораторной диагностике, в том числе и в ФИАВР, для определения гормонов в сыворотке крови, в сухих пятнах крови.
Тироксин - гормон щитовидной железы - отвечает за многие обменные процессы в организме. Нарушение его обмена приводит к серьезным заболеваниям. Так, врожденный гипотиреоз у детей ведет к развитию умственной отсталости - кретинизму. Для своевременной диагностики и лечения врожденного гипотиреоза во многих странах введены программы неонатального скрининга, в связи с чем, представляет интерес разработка отечественных наборов для скрининга.
Наиболее современными направлениями в области разработки биоаналитических систем являются миниатюризация формата и мультиавалитные исследования с выходом на высокоэффективный скрининг. В связи с этим развитие флуоресцентного анализа в настоящее время происходит в основном в следующих направлениях: поиск новых способов (технологий) проведения иммунохимических реакций и разделения их компонентов, разработка новых методов детекции и обработки флуоресцентного сигнала, поиск новых высокочувствительных маркеров, в том числе на основе лантанидных хелатов и наночастиц. Поэтому актуальны разработка
иммуноанализа для определения тироксина и изучение возможности использования новых европиевых меток для этих целей.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - разработка лантанидного иммунофлуоресцентного анализа для определения гормона тироксина с использованием моноклональных антител к тироксину и европиевых меток, сопоставление разных меток в выбранной схеме иммуноанализа.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
□ получить моноклональные антитела к тироксину с высокой степенью аффинности и специфичности, охарактеризовать полученные мАт;
□ выбрать наиболее чувствительную схему диссоциативного лантанидного иммуноанализа для определения общего тироксина (Т4) в сухих пятнах крови;
а изучить свойства новой флуоресцентной метки (конъюгата Ы-шдроксисукцинимидного эфира диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ДТПА) и аминобензоилтритфторацетона (АБТФА)) и разработать недиссоциативный метод анализа с ее использованием для определения Т4;
□ разработать недиссоциативный метод анализа тироксина с использованием латексных наночастиц, содержащих европий - Р-дикетонатный комплекс.
Научная новизна. Разработан трифункциональный хелат, по чувствительности не уступающий бифункциональным хелатам, используемым в диссоциативных схемах. Разработаны методы получения коньюгатов с новой флуоресцентной меткой на основе Ы-гидроксисукцинимидного эфира ДТПА и АБТФА и изучены их флуоресцентные свойства. Впервые продемонстрировано использование латексных наночастиц, содержащих европий, в конкурентных схемах иммуноанализа.
Практическая значимость работы. Разработан диссоциативный флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением для определения общего тироксина в сухих пятнах крови для целей неонатального скрининга. Разработаны методы недиссоциативного ФИАВР с использованием новой флуоресцентной метки (конъюгата Ы-гидроксисукцинимидного эфира ДТПА и
АБТФА) и латексных европиевых наночастиц. Показано использование новой высокочувствительной недиссоциативной европиевой метки (конъюгата N-гидроксисукцинимидного эфира ДТПА и АБТФА) и европиевых наночастиц для определения тироксина с целью повышения предела детекции его в анализе.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на следующих конференциях: Российская школа-конференция молодых ученых «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 28 мая-2 июня 2000г.), I Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 14-18 октября 2002г.) , III Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 14-18 марта 2005г.).
В 2002 году автору было присуждено III место в ежегодном Конкурсе на лучшую научную работу Института биохимии им. А.Н.Баха.
Часть результатов, полученных в ходе работы, была применена в 2000-2001г.г. при выполнении межведомственной научно-технической программы «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего» по договору № 02.03.118 "Разработка иммунофлуоресцентных методов с временным разрешением для определения гормона тироксина".
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в ведущих российских журналах, 2 статьи в российском и иностранном сборниках, 3 тезиса в материалах международных и российских научных конференций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 246 ссылок.
Работа изложена на 168 страницах, содержит 31 рисунок и 10 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы и объекты исследования.
Трифторацетильное производное тироксина, конъюгат тироксина с ДТПА (Т4- ДТПА), а также N-гидроксисукцинимидный эфир конъюгата пара-аминобензоилтрифторацетона с дизтилентриаминпентауксусой кислотой (N-ГСИЭ-ДТПА-АБТФА) были получены к.х.н., с.н.с. А.В.Чудиновым (Институт молекулярной биологии им. Энгельгардта).
В работе использовали наночастицы с включенными европий - (3-дикетонатными комплексами (Seradyn, США), усиливающий раствор «DELFIA® Enhancement Solution» , «Eu-labelling reagent» (N1 -(p-изотиоцианотофенил)-диэтилентриамин- N1 N2 N3 N3 тетраацетата европия (ИТЦЦТТА-Eu) (Wallac Oy, Финляндия), салицилат натрия, L-тироксин, D~ тироксин, 3, 3', 5-трийодо-Ь-тиронин, 3, 5- дийодо-Ь-тиронин, 3, 5-дийодо-Ь-тирозин, З-йодо-Ь-тирозин, D-фенилгидантоин (ICN Biomedicals Inc., США).
Методы
Синтез конъюгатов
Конъюгаты белковых носителей с тироксином и конъюгаты европиевых наночастиц со стрептавидином получали методом активированных эфирных производных.
Синтез конъюгатов белков с производными полиаминополикарбоновых кислот производили в 0.1.М карбонатном буфере в присутствии диметилформамида на льду с последующей очисткой методом гель-фильтрации на комбинированных носителях.
Мечение антител биотином производили по восстановленным дисульфидным группам иммуноглобулинов с использованием малеимидного производного биотина с последующей очисткой на обессоливающей колонке.
Получение моноклональных антител (мАт) и их характеристика
Иммунизацию мышей линии BALB/c проводили конъюгатами тироксина с бычьим сывороточным альбумином (Т4-БСА) и соевым ингибитором трипсина (Т4-СИТ). Для слияния антителопродуцирующих клеток с клетками миеломы sp2/0 использовали 50%-ный раствор полиэтиленгликоля с молекулярным весом 6 ООО, содержащий 10%-ный диметилсульфоксид. Отбор специфических клонов осуществляли в два этапа в иммуноферментном анализе (ИФА). Для проведения экспериментов по специфичности и по определению физико-химических характеристик моноклональных антител (мАт), а также для разработки флуоресцентного иммуноанализа использовались антитела, очищенные методом аффинной хроматографии в ступенчатом градиенте рН 2.8, 4.0, 5.0.
Определение Т4 в диссоциативном ФИАВР в схеме с меченым антигеном (Т4-ДТПА-Е11) в буфере и сухих пятнах крови
Лунки полистирольного микропланшета с адсорбированными кроличьими антимышиными иммуноглобулинами (RAM) заполняли буфером для предынкубации и инкубировали на шейкере 15 минут, далее отмывали буфером для отмывки. Добавляли различные концентрации тироксина в буфере от (0 нМ до 500нМ) или выбивали по одному диску диаметром Змм в лунку из
калибровочных проб (см. ниже). В каждую лунку добавляли по 0,05 мл буфера для анализа инкубировали 1 ч на шейкере при комнатной температуре, далее добавляли по 0,05 мл буфера для анализа с выбранной концентрацией мАт и Т4-ДТПА-Еи и инкубировали 1,5 часа при комнатной температуре. Удаляли диски, промывали лунки буфером для отмывки, десорбировали европий в в усиливающий раствор и через 15 мин измеряли флуоресцентный сигнал.
Для приготовления контрольных и калибровочных проб Т_д в сухих пятнах крови использовали отмытые эритроциты группы III ЮгК Отмытые эритроциты восстанавливали 6% раствором бычьего сывороточного альбумина, до гематокрита цельной крови (52%) . По полученной после центрифугирования сыворотке устанавливалось "нулевое" значение концентрации Т 4 в крови, которое определяли по уровню флуоресцентного сигнала в конкурентном ФИАВР. В восстановленную таким образом кровь добавляли Т 4 для получения конечной концентрации его в крови 300, 150, 100, 50, 20, 0 нМ и наносили на бумагу ЗЫеШег&БсЬиН 2992.
Определение Т4 в схеме с иммобилизованным антигеном (Т4-БСА) с разными европиевыми метками
Диссоциативный с мАт-ИТШЛТА-Еи и недиссоциативный с мАт-ДТПА-АБТФА-Еи ФИАВР В лунки полистирольного микропланшета с адсорбированным в концентрации 0.33 мкг/мл конъюгатом Т4 - БСА добавляли 50 мкл Т4 стандартов и 50 мкл меченных мАт в конечной концентрации 2.5 мкг/мл. После 1.5 ч инкубации при температуре +37°С на шейкере лунки промывали буфером для отмывки. В недиссоциативном анализе флуоресценцию измеряли с поверхности дна осушенных лунок. В диссоциативном анализе добавляли по 150 мкл усиливающего раствора, после 15- минутной инкубации на шейкере измеряли флуоресценцию.
Недиссоциативный ФИАВР с наночастицами В лунки полистирольного микропланшета с адсорбированным конъюгатом Т4 -БСА добавляли по 10 мкл Т4 стандартов (0.01 - ЮОнМ), и по 40 мкл буфера для анализа, содержащего мАт, и инкубировали 2,5 часа при комнатной температуре. Далее промывали лунки буфером для отмывки, добавляли конъюгат стрептавидина с наночастицами. После 2 часов инкубации лунки планшета промывали буфером для отмывки и считывали флуоресцентный сигнал с поверхности дна лунок. Параметры регистрации флуоресценции: время задержки 0.1 мс, частота вспышки 1 мс, время считывания сигнала 0.4 мс, возбуждение на 340 нм и регистрация флуоресценции на 613 нм.
Предел детекции (ИД) аналита во всех случаях рассчитывали как среднее значение нулевой концентрации плюс два стандартных отклонения (СР. ЗНАЧ. +2 СТ. ОТКЛ.).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
I. Характеристика моноклональных антител
Были отобраны 3 клона моноклональных антител, синтезирующих антитела к тироксину, наиболее устойчивые и жизнеспособные в культуре: 6Е6Е5, 7РЗС12, 7Р305. Для определения аффинных констант был использован метод, описанный Бп§иег, 1985. Каждое из исследованных мАт давало прямую на графике Скетчарда, что свидетельствовало о гомогенности антигенсвязывающих центров антител. Значения констант диссоциации приведены в табл. 1.
Таблица 1.Основные характеристики моноклональных антител.
Название клона
6Е6Е5
7РЗС12
7РЗв5
класс/подкласс 1§С2Ь
Константы диссоциации, М
1,0Е-08
1.7Е-09
2,5Е-08
Таблица 2. Перекрестная реактивность мАт (на 50% связывания).
Перекрестные реагенты 6Е6Е5 7Р305 7РЗС12
Ь-тироксин 100% 100% 100%
О-тироксин 100% 100% 100%
3,3',5-трийодо-Ь-тиронин 2% 1% 1%
3,5-дийодо-Ь-тиронин 0% 0% 0%
3,5-дийодо-Ь-тирозин 0% 0% 0%
З-йодо-Ь-тирозин 0% 0% 0%
Б-фенилгидантоин 0% 0% 0%
Кросс-реактивность оценивали как отношение концентрации тироксина и концентрации перекрестно реагирующего лиганда, при которой происходит ингибирование связывания тироксина с моноклональными антителами на 50% в
ИФА (табл.2). Как видно из таблицы, антитела специфичны исключительно к гормону Т4, перекрестная реактивность на трийодтиронин составляет не более 1-2%. Физиологическая концентрация Т3 примерно в 4 раза ниже концентрации Т4, поэтому ошибка минимизируется до 0.2-0.5%. 100% чувствительность антител к 1)-тироксину можно объяснить тем, что у молекулы Т4 погружена в центр связывания антител только ароматическая часть и не погружен хиральный центр, Са углерод, относительное положение заместителей которого и определяет тип стереоизомера. Для разработки иммунофлуоресцентного анализа были выбраны мАт 6Е6Е5 по таким показателям: а) стабильный и устойчивый рост гибридомы; б) неизменность иммунологической активности при длительном хранении. Было установлено, что при хранении аффинно очищенных антител в морозильной камере при -20 °С не наблюдается падение титра для 6Е6Е5 в течение восьми месяцев.
II. Определение Т4 в диссоциативном ФИАВР в схеме с меченым антигеном (Т4-ДТПА-Еи) в буфере и сухих пятнах крови
Для определения низкомолекулярного аналита, каким является тироксин, подходят два типа конкурентного твердофазного анализа:
(1) за центры связывания мАт конкурируют Т4 в образце и меченый Т4 (рис.1)
(2) за центры связывания меченных мАт конкурируют Т4 и конъюгат тироксина с белковым носителем, адсорбированный на планшете (рис.4, раздел III)
При получении коньюгатов тироксина с низкомолекулярными соединениями необходимо сохранение его антигенных детерминант. Учитывая, что первичная аминогруппа тироксина не участвует в его распозновании моноклональными антителами, маркирование производили по первичной аминогруппе. Для разработки диссоциативного ФИАВР с меченым антигеном в качестве метки использовали Т4-ДТПА-Еи.
Важным моментом при разработке аналитических систем является минимизация неспецифического связывания компонентов системы, что достигается варьированием условий проведения анализа и варьированием
компонентов буферных систем данной аналитической системы. Были приготовлены буферы на основе 50 мМ Трис 0Д5М ЫаС1 рН 8,5 с добавлением разных компонентов, которые должны снять неспецифическую адсорбцию гидрофобной части тироксина и хелата в процессе проведения анализа. Состав буфера для определения гормона тироксина обычно содержит 50 мМ Трис-НС1, 0.15 М ЫаС1, 0.02% Тритон Х-100, 0.5% БСА, 0.01% 1-анилино-8-нафталинсулъфоната (АНС), рН 7,8-8.5. Стадия предынкубации с буфером, содержащим ДТПА 10"5М, Са+2 10"5М, была введена для снижения фона. При этом происходило связывание ионов тяжелых металлов, следовые количества которых влияют на проведение лантанидного анализа, и, одновременно, удаление следовых количеств лантанидов, которые содержались в воде и солях, используемых для приготовления буферов. В литературе указывается, что добавление 2мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в буфер для хранения конъюгатов европия стабилизирует активность некоторых из них. В наших экспериментах добавление 2мМ ЭДТА в буфер для хранения и в буфер для анализа приводило к минимизации фонового сигнала до фона усиливающего раствора, а добавление салицилата натрия в количестве 2 мг/мл вызывало увеличение динамического диапазона регистрации сигнала. Таким образом, для анализа тироксина был предложен буфер следующего состава: 50 мМ трис-НС1, 0.15 М КаС1, 0.02% ТритонХ-100, 0.15% СИТ, 0.01% АНС, 2мМ ЭДТА, 2 мг/мл салицилата натрия, рН 7,8.
Для определения тироксина в данной схеме анализа была выбрана концентрация метки Т4-ДТПА-Ей 0,5 нМ, при которой при концентрации антител 0,75 мкг/мл диссоциация комплекса мАт и Т<гДТПА-Еи происходит не более чем на 50%. Результаты определения тироксина в схеме с Т4-ДТПА-Еи представлены в виде калибровочной кривой (рис.2). Предел детекции тироксина составил 0,5 нМ (п=6) при коэффициенте вариации не более 10%. Диапазон определяемых концентраций (0,1-150 нМ) позволял применить данную схему для определения тироксина в сухих пятнах крови.
4
♦ Сь
Антимышиные акт и тела, адсорбированные на твердой фазе
Е.Ч
Тироксин й Тироксин, образце меченный
европием антитела к
тироксину
гЧ
Инкубация и отмывка
IV
Усиливающий ф раствор
Измерение флуоресценции
Рисунок 1. Схема конкурентного твердофазного диссоциативного ФИАВР с использованием тироксина, меченного европием, и иммобилизованными антимышиными иммуноглобулинами.
1,0-
т о,8 и
8.
о
0,6.
I
Е
к
О 0,2
0,0
- - х-'
0,1
10
вдпм
Рис.2. Калибровочная кривая для определения Т4 в конкурентном диссоциативном анализе с Т4-ДТПА-Еи. Антимышиные
адсорбированы в концентрации 5 мкг/мл.
[мАт]=- 0, 75 мкг/мл [Т4-ДТПА-Еи] =0,5 нМ.
В/В0 -отношение сигнала
флуоресценции в присутствии Т4 к ■ сигналу в отсутствии
Т4-
ПД=0,5 нМ КВ <11%
Сухие пятна крови используются для диагностики врожденных заболеваний у детей, таких как гипотиреоз (ВГ), фенилкетонурия и т.д. Использование сухих пятен крови, а не образцов сыворотки, взятых у новорожденных, более удобно. Это снимает проблему консервации крови, краткосрочности ее хранения и транспортировки.
Для диагностики ВГ в России измеряют Концентрацию тиреотропного гормона (ТТГ) в сухих пятнах крови, которая берется у доношенных новорожденных на 4-5ый день после рождения, у недоношенных детей - на 714-ый день жизни. Если во многих странах скрининг на Т4 и ТТГ проводится одновременно, то в России скрининг на Т4 проводится в случае положительного ответа на повышенный уровень ТТГ. Это требует повторного взятия крови у новорожденных, при этом определяют Т 4 не в сухих пятнах, а в сыворотке крови. Одновременное определение и ТТГ, и Т4 позволило бы избежать ложноположительных и ложноотрицательных результатов, а также многих ошибок манипулирования. Поэтому актуальной является разработка анализа на Т4 в сухих пятнах крови в качестве подтверждающего теста на ВГ.
Концентрация общего тироксина у здоровых новорожденных находится в диапазоне 190-407 нМ, у детей с подозрением на ВГ - в диапазоне 79-98 нМ. Калибровочная кривая для определения Т4 в сухих пятнах крови покрывает диапазон концентраций 10-400 нм (рис.3), достаточный для определения общего тироксина. Предел детекции тироксина в сухих пятнах составил 10 нМ (11=8) при коэффициенте вариации 15%. При проведении того же анализа исключительно в буферной системе с использованием Тгстандартов предел обнаружения Т4 составил 0,5 нМ, что соответствует пределу детекции в сухих пятнах крови с учетом разбавления образцов в 20 раз в лунке. Таким образом, десорбция тироксина в разработанном буфере для анализа протекала практически на 100%.
Рис.3.
Калибровочная кривая для определения Т4 в сухих пятнах крови.
Антимышиные IgG адсорбированы в концентрации 5 мкг/мл.
[мАт]=- 0, 75 мкг/мл [Т4-ДТГТА-Еи] =0,5 нМ.
В/В0 -отношение сигнала
флуоресценции в присутствии Т4 к сигналу в отсутствии вышеуказанного.
ПД = 10 нМ при KB < 15% (п=8)
Таблица 3. Значения истинных концентраций Т 4 в контрольных сыворотках (Уровень 1, Уровень 2, Уровень 3) набора межлабораторного контроля качества Lipochek Immunoassay Plus Control Kit ™ и концентраций T 4 (XI, X2, ХЗ) в сухих пятнах крови
Уровень 1 (XI) Уровень 2 (Х2) Уровень 3 (ХЗ)
Истинные концентрации у 35 нМ 76 нМ 150 нМ
допустимый интервал 25нМ-46нМ 61нМ-91нМ 120нМ-180нМ
Определяемые 39нМ±4нМ 82нМ±8нМ 170нМ±17нМ
концентрации
В отечественной литературе сообщали о получении мАт с Каф 3*10 М" . Предел детекции тироксина в сыворотке, определяемый в ИФА с помощью этих антител, составил 10 нг/мл (11нМ). Он соответствует пределу детекции тироксина в сухих пятнах крови в разработанном нами анализе, но с использованием антител с Каф 108М"'. Таким образом, даже при использовании
мАт с константой аффинности на порядок ниже по сравнению с опубликованной можно получить такой же предел детекции, что говорит о высокой чувствительности лантанидной метки. Для проверки достоверности анализа в качестве неизвестных проб были взяты контрольные сыворотки (Уровень 1, Уровень 2, Уровень 3) набора межлабораторного контроля качества Lipochek Immunoassay Plus Control Kit ™ ("BioRad", США). Сыворотки были предварительно нанесены на бумагу Shleiher&Schull 2992 по той же схеме, что и калибровочные пробы. Значения концентраций Т4 для диссоциативного ФИАВР, указанные в описании к набору сывороток, и значения концентраций XI, Х2, ХЗ, рассчитанные по уравнению линии тренда калибровочной кривой, представлены в табл.3. Определяемые концентрации попадали в доверительный интервал истинных концентраций. Это говорит о высокой точности метода и возможности его применения в клинической диагностике.
Ш. Определение Т4 в схеме с иммобилизованным антигеном (Т4-
БСА) с разными европиевыми метками
В качестве бифункциональных хелатирующих агентов наиболее часто используются производные поликарбоновых кислот (ПК), которые обеспечивают высокую стабильность комплексов с ионами Ей и прочное связывание с белком. Наряду с ранее предложенными изотиоцианатофенильными производными ПК в литературе описано использование более доступных, легко синтезируемых диангидридов ДТПА. Метки более нового поколения - трифункциональные - в своем составе содержат еще и сенсибилизатор флуоресценции.
В данной работе использовали новые трифункциональные флуоресцентные метки: конъюгат N-гидроксисукцинимидного эфира ДТПА и АБ'ГФА и латексные европиевые наночастицы. Выбранная схема иммуноанализа с иммобилизованным антигеном, где за центры связывания мАт к гаптену (тироксину) конкурируют свободный и конъюгированный гаптены, позволила оценить перспективу использования новых меток во флуоресцентном
анализе с временным разрешением по сравнению с бифункциональной ИТЦ ДТТА-Еи.
Диссоциативный ФИАВР с мАт- ИТЦ ДТТА-Еи
Конъюгат Т4-СИТ, Тироксин в адсорбированный образце на твердой фазе
Мышиные моноклональные антитела, меченные европием
Усиливающий + раствор
Инкубация и отмывка
* £ ; Измерение флуоресценции
Рисунок 4. Диссоциативный ФИАВР с мАт- ИТЦ ДТТА-Еи в схеме с иммобилизованным антигеном.
Количество антигена, иммобилизованного на поверхности лунок, выбирали следующим образом. Во-первых, в отсутствии тироксина концентрация антител должна быть меньше 70% от насыщающей концентрации. Во-вторых, в присутствии тироксина выбранная концентрация антител должна давать достаточный динамический диапазон (от 0 до 400нм) для определения тироксина и давать хорошее замещение на 400 нм. Было установлено, что концентрация 0.33 мкг/мл и 250 нг мАт на лунку является оптимальным. Пр едел детекции тироксина в образце в анализе с мАт- ИТЦ ДТТА-Еи составил 7нМ (п=8), КВ< 8% (рис.8).
В этой же схеме с иммобилизованным антигеном был изучен новый хелат М-ГСИЭ- ДТПА - АБТФА.
Новый хелат 1М-ГСИЭ- Д'ША - АБТФА для недиссоциативиого ФИАВР
Из структурной формулы Ы- ГСИЭ- ДТПА - АБТФА (рис.5) можно предположить, что в координации иона европия будут принимать участие три
атома азота, шесть атомов кислорода молекулы ДТПА и два атома кислорода молекулы АБТФА. Таким образом, этого количества лигандов должно быть достаточно для заполнения первой координационной сферы европия, координационное число которого составит 8-9. Это должно обеспечить хорошее удержание иона РЗЭ в составе этого хелата.
1000-кратный избыток был использован для синтеза конъюгата с БСА и с мАт. Степень мечения в этом случае составила 8-10 молекул АБТФА на молекулу БСА и 4-6 молекулы на молекулу иммуноглобулина. Профиль элюции состоял из двух пиков: с меченым белком в первом пике и непрореагировавшим хелатом во втором. Молярное соотношение АБТФА / белок рассчитывали по формуле:
АБТФА /белок= (А330/Е абтфа330) / ((А280-0,719 А330)/ ебелок28о), где о абтфам-1 сЛБТФА_ = 5000 М"1 сш'1, г.БСЛ28п = 65000 М"1 ст"1,
Спектры поглощения конъюгата БСА-ДТПА-АБТФА представлены на рис.бА. Наблюдаются две полосы поглощения: с максимумом на 280 нм, соответствующая поглощению белка, и с максимумом на 330 нм, соответствующая поглощению АБТФА. Спектры испускания представлены на рис.6 Б. Отношение величины пика на 618 нм к величине пика на 700 нм составляет 10.6 при длине волны возбуждения 340 нм.
Эти максимумы имеют лантанидное происхождение, испускание происходит благодаря резонансному переносу энергии с Р-дикетонов на европий. Очевидно, что основной вклад во флуоресценцию на 618 нм происходит при возбуждении на 340 нм.
" 331) 1 ' ÍУ^ , ° 280
Е 280
О
.СООЫ I
Г К
n □
СООН
гг %соон
^ -О
I ссшн-й У- соснгсосга n
^соон
Рис.5.М- гидроксисукцинимидный эфир коньюгата парааминобензоил-трифторацетона с диэтилен-триаминпентауксусой кислотой
При титрование БСА-ДТПА-АБТФА ацетатом европия максимум люминесценции наблюдался в точке эквивалентности для каждой концентрации и снижался с увеличением концентрации европия (рис.7). Можно предположить, что максимальная координация иона европия происходила в точке эквивалентности. Это означает, что одна молекула хелага участвует в координации одного иона европия. Увеличение концентрации европия приводило к нарушению этой упорядоченности и появлению дополнительных молекул воды в координационной сфере. Таким образом, молярное соотношение конъюгат /европий составило 1:1.
Предел детекции конъюгата составил 10"ПМ. Флуоресцирующий комплекс образовывался через 15 минут после смешивания. Для разработки анализа была выбрана область нейтральных рН как наиболее оптимальных для работы со смешанными комплексами европия. А Б
Дтпнволньцм
Рис.6. Спектры поглощения (А) и испускания при возбуждении на 340 нм (Б) конъюгата БСА-ДТПА-АБТФА в 0.05Мтрис-НС1 буфере, содержащем 0.15М1МаС1, рН 7.75
-10 MABTFA -107MABTFA
—Д— 10^MABTFA Р.00.пПп
□о o°oooo.n
У
д
^°ДДААДдДДлд
Рис.7. Кривая титрования БСА-ДТПА-АБТФА солью европия в 0.05М трис-HCl буфере, содержащем 0.15М NaCl, рН 7.75 для трех концентраций хелата (10" "М, 10"7, 10"8М) .
I ппщ 1 г I < urn) I I iniiq I | щи)—rnmq—I пищ ччтшн] i цииут i
1Е-111Е-101Е-9 1Е-8 1Е-7 1Е-6 1Е-5 1Е-4 1Е-3 [EuA3],M
Рис.8.
Калибровочные кривые для определения Т4в диссоциативном ФИАВР и соответствующий профиль вариации (-), и в недиссоциативном ФИАВР и соответствующий профиль вариации(А). концентрации Т4-БСА -0,33 мкг/мл, меченные мАт -250 нг/мл.
Ао-максимум флуоресценции, А -флуоресценция, у.е.
IgU^HM
В недиссоциативном ФИАВР иммобилизованный и свободный антигены конкурировали за связывающие центры моноклональных антител. Отличие состояло в том, что на последней стадии, после 1.5 ч инкубации и отмывки, в диссоциативном ФИАВР флуоресценция развивалась только после добавления усиливающего раствора, а в недиссоциативном анализе измерялась сразу после отмывки с поверхности дна лунки. Концентрация 0.33 мкг/мл и 125-250 нг мАт на лунку была найдена оптимальной.
Существует ряд преимуществ в использовании нового хелата. Он не требует добавления усиливающих агентов для развития флуоресценции, в частности, усиливающего раствора, который очень чувствителен к загрязнению лантанидами. Этот хелат обладает низким неспецифическим связыванием и дает возможность использовать меньшее количество антител и стандартов тироксина, т.к. флуоресценция измеряется со дна лунки. Данный анализ занимает около 1,5 часов. Динамический диапазон определяемых концентраций Т4 для анализа с мАт- ИТЦ ДТТА- Ей и для ФИАВР с мАт- ДТПА-АБТФА-Еи составляет 7-500 нМ. Чувствительность одностадийного недиссоциативного анализа такая же, как у диссоциативного ФИАВР в этой же схеме. При тех же самых условиях оба анализа дают одну и ту же чувствительность - 7нм (рис.8). Отсутствие диссоциации, малые количества антител и анализируемых компонентов, быстрота анализа (одна стадия), и, наконец, чувствительность аналогичная диссоциативному ФИАВР, позволят использовать данный трифункциональный хелат ДТПА-АБТФА-Еи в качестве альтернативы традиционным диссоциативным меткам.
Европиевые наночастицы Наряду с получением новых меток, другим направлением в химии лантанидных хелатов является увеличение чувствительности существующих. Использование европиевых наночастиц (ИР) размером 100-200 нм в флуоресцентном иммуноанализе приводит к значительному увеличению сигнала флуоресценции, т.к. каждая наночастица содержит тысячи флуоресцирующих комплексов европия с р -дикетонами. Описано применение
наночастиц для детекции предельно низких концентраций простат специфического антигена.
В данной работе использовали европиевые № диаметром 120 нм производства фирмы 8егас1уп. Наночастицы на своей поверхности содержат карбоксильные группы для ковалентного связывания. Присоединенение стрептавидина к таким наночастицам - быстрый и нетрудоемкий способ, не требующий последующей очистки конъюгата на колонках: конъюгат отмывается центрифугированием.
При разработке анализа выяснилось, что конъюгат наночастиц со стрептавидином (1ЧР-81Ау) обладает высоким неспецифическим связыванием с поверхностью лунок полистирольного иммунологического планшета. Было изучено поведение компонентов в буфере следующего состава: 0.5 М трис-НС1, 0.15 М ЫаС1, 0.5% БСА, 0.02% Тритон Х-100, 2 мг/мл натрия салицилата , 1 мМ ЭДТА, рН 7.75. Подобный состав буфера позволил снизить неспецифику и коэффицент вариации при разработке анализа с Т4 -ДТПА-Еи. Использование этого буфера, а также добавление 0.1% гетерологичных антител и 0.5 % фетальной сыворотки позволили снизить отношение специфического сигнала к неспецифическому в 100 раз (рис.9). Кривая проходит через максимум, который определяет оптимальную концентрацию конъюгата 51Ау-ЭДР для конкурентного анализа тироксина, что соответствует 10~13 М для выбранной концентрации моноклональных антител (200нг/мл).
Для европиевых наночастиц была выбрана двустадийная схема ФИАВР с иммобилизованным антигеном. Концентрация иммобилизованного на поверхности лунки антигена составила 10 мкг/мл. Для этой концентрации динамический диапазон сигнала определялся как максимальный. Т4 - стандарты добавляли перед внесением мАт в лунку. Было установлено, что концентрация -10 нг биотинилированных антител на лунку (не более 70% насыщающей)-являлась оптимальной для конкурентного анализа.
Иммобилизованный и свободный тироксин конкурировали за центры связывания биотинилированных мАт (рис.10). Для достижения равновесия в
системе было достаточно 2.5 часов. NP-StAv добавляли после отмывки в концентрации КГ13 М и инкубировали 2 ч. Флуоресценцию измеряли без усиливающего раствора с поверхности дна осушенных лунок. Предел детекции для Т4 составил 100 пикомоль/л (1 фемтомоль тироксина на 10 мкл образца) (рис.11). Коэффициент вариации исследуемого диапазона не превышал 8-10%.
Мы уже использовали аналогичную, но одностадийную диссоциативную
схему имуноанализа. с мАт-Eu -ИТЦ ДТТА-Eu (рис. 8). Хотя анализ с
наночастицами проводится в два этапа, его преимуществом является 70-
кратное увеличение чувствительности по сравнению с чувствительностью
анализа с мАт-ИТЦДТТА-Eu. Калибровочная кривая для анализа с
наночастицами покрывает диапазон концентраций 0.1-10 нМ, для анализа с мАт
-ИТЦ ДТТА-Eu этот диапазон - 7-500 нМ, т.е. в обоих случаях динамический
диапазон покрывает два порядка концентраций. В указанных пределах сигнал
флуоресценции линейно зависит от концентрации тироксина в образце (рис.12).
Рисунок 9. Влияние состава буфера на отношение специфическое (в присутствии 200 нг/мл моноклональных антител к тироксину) /неспецифическое связывание (в отсутствии мАт) NP-StAv в
(1) 2 мМ Трис, рН 7.75
(2) 0.05 М Трис-НС1 буфере содержащем 0.15М NaCl, 0.5% БСА, 0.02% Тритона Х-100, 2 мг /мл натрия салицилата, 1 мМ ЭДТА, 0.5% фетальной сыворотки, 0.1% IgG, рН 7.75
120-,
. 2
= 80-
В 1 • 2
40-
20- ..
•..........•..........•
...........■..........■..........• ..
-ч........■.........«■
I&12
JE-I1
NP-StAv, М
с?
КонъюгатТ4-СИТ, Тироксин £ адсорбированный образце на твердой фазе
ч
VI"
ЧгъЛ
Добавление наночастиц. покрытых стрептзвидином
Мышиные моноклональные антитела, меченные биотином
-1<5ИОТЖ )
Инкубация и отмывка
Отмывка, измерение флуоресценции
Рисунок 10. Схема недиссоциативного ФИАВР с использованием моноклональных антител, меченных биотином, и европиевых наночастиц, покрытых стрептавидином.
Рис.II. Калибровочная кривая для определения тироксина в
недиссоциативном ФИАВР с использованием №-81Ау Т4-БСА -10 мкг/мл, мАт-биотин -200 нг/мл, ЫР-81Ау - 10~13 М.
Б/Го -отношение сигнала флуоресценции в присутствии определяемогс аналита
(Т4) к сигналу в отсутствие вышеуказанного. Р0 = 959 948 у. е .ПД=0,1 нМприКВне более 10 % (п=8).
ю
\1 к.
к
10
Т4,нМ
100
Рис.12. Калибровочные кривые для определения тироксина в
недиссоциативном анализе с NP-StAv (1) и диссоциативном с мАт-ИТЦДТТА-Eu ФИАВР (2).
(1) концентрации Т4-БСА -10 мкг/мя, мАт-биотин -200 нг/мл, NP-StAv - 1013 М. F0 = 959 948 у.е.
ПД =0,1 нМприКВ не более 10 % (п=8).
(2) концентрации Т4-БСА -0,33 мкг/мл, мАт-ИТДДТТА Ей -250 нг/мл. F0 = 226 684 у.е.
ПД = 7 нМ при КВ не более 8-10 % (п=6).
Другое преимущество анализа с европиевыми наночастицами - это нечувствительность раствора и образца к загрязнению солями лантанидов, т.к. европиевые комплексы изолированы от окружения латексной полимерной оболочкой наночастиц. Следующее преимущество заключается в том, что для анализа можно использовать меньшее количество метки (10 мкл вместо 50 мкл для диссоциативного ФИАВР), т.к. флуоресценция измеряется с поверхности дна лунки, а не со всего заданного объема.
Таким образом, наночастицы могут использоваться для детекции тироксина в ФИАВР и позволяют определять фемтомоли исследуемого вещества с полученными мАт.
Данная технология впервые продемонстрирована для иизкомолекулярного галтена и может быть использована для целей неонатального скрининга, т.к. позволяет достигать высокой чувствительности в определении тироксина в сухих пятнах крови.
Выводы:
1) Получены моноклональные антитела к тироксину. Для разработки анализа выбраны мАт 6Е6Е5 с константой связывания 108 М"1' сохраняющие свои иммунологические свойства на протяжении длительного времени.
2) На основе полученных моноклональных антител и тироксина, меченного ДА ДТПА, разработан метод определения тироксина в сухих пятнах крови. Данный метод позволяет определять общий тироксин с пределом детекции 10 нМ и коэффициентом вариации не более 15 %.
3) Разработан трифункциональный хелат, по чувствительности не уступающий бифункциональным хелатам, используемым в диссоциативных схемах. Разработаны методы получения коньюгатов с новой флуоресцентной меткой на основе Ы-гадроксисукцинимидного эфира ДТПА и АБТФА и изучены их флуоресцентные свойства.
4) Впервые показано использование нового трифункционального хелата в иммунофлуоресцентном твердофазном гетерогенном анализе тироксина в схеме с мечеными антителами и иммобилизованным антигеном. Предел детекции тироксина составил 7нМ с коэффициентом вариации не более 10%, что соответствует чувствительности диссоциативного ФИАВР для определения тироксина в той же схеме.
5) Использование нового трифункционального комплексона сокращает время анализа, который проводится в одну стадию, исключает использование усиливающего раствора, снимает проблему загрязнения иммуноаналитической системы солями лантанидов и тяжелыми металлами.
6) Впервые продемонстрировано использование европиевых наночастиц в конкурентном анализе гаптенов, в частности, для определения тироксина. Данный анализ позволяет определять тироксин в концентрации 0,1 нМ и демонстрирует 70-кратное увеличение чувствительности по сравнению с диссоциативным флуоресцентным иммуноанализом в схеме с иммобилизованным антигеном.
список работ, опубликованных iio теме диссертации:
1. Жердева В.В.., Диденчук И.В., Савицкий А.П.., Моноклоиальные антитела к гормону тироксину. - Материалы конференции «Горизонты физико-химической биологии» ,Пущино, 2000, 28 мая-2 июня, т.2, с. 90. 2. Чудинов А.В, Жердева В.В„ Грибкова Е.В., Савицкий А.П. Новые фотолюминесцентные метки для иммуноанализа. - Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2001, т.1, с. 143-150.
3. Жердева В.В., Чудинов A.B., Савицкий А.П. Разработка иммунофлуоресцентного анализа с временным разрешением для определения гормона тироксина в сухих пятнах крови. - Материалы I Московского Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развитая».14-18 октября 2002, стр.56.
4. Жердева В.В., Володаева JI.A., Савицкий А.П. Использование европиевых наночастиц для иммунофлуоресцентного анализа тироксина. Материалы III Московского Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 14-18 марта, 2005, стр. 90.
5. Жердева В.В., Чудинов A.B., Савицкий А.П. Использование метода лантанидного флуоресцентного иммуноанализа для определения гормона тироксина в сухих пятнах крови. - Биомед. химия,. 2003, т.49, с.70-79.
6. Jerdeva V.V., Volodaeva L. A., Savitsky А. P. Using of europium nanoparticles as a reporter in thyroxin fluorescent immunoassay. - «Biotechnology in Biology and Medicine». Nova Science Publishers, Inc., New York, USA (Egorov, Ed.), 2006, p. 5-12.
7. Жердева B.B., Володаева JI.A., Савицкий А.П. Европиевые наночастицы для иммунофлуоресцентной детекции тироксина. В сборнике: Вестник научно-промышленного общества, М: «Алев-В», 2006, вып. 10, с.81-86.
8. Жердева В.В., Чудинов А.В, Носыркова Н.В., Володаева Л.А., Савицкий А.П. Использование различных флуоресцентных меток для определения тироксина в конкурентном лантанидном иммуноанализе. - Физиология и патология иммунной системы, 2006, №4, стр.9-19.
Подписано в печать 11.04.07. Заказ К» 67. Тираж 100 экз.
ООО "Фирма Печатный двор" г. Москва Лопухинский пер.,6 Тел.: 269-80-41
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жердева, Виктория Вячеславовна
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Глава 1. Флуоресцентный анализ и его применение в биоаналитических исследованиях
1.1. Флуоресцентный анализ. Флуоресцентные метки: свойства, принцип выбора.
1.2. Основные группы флуорофоров и их характеристика. Проблема фоновой флуоресценции.
1.3. Техники флуоресцентного анализа и их применение.
1.3.1. Поляризация флуоресценции.
1.3.2. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия.
1.3.3. Флуоресцентный резонансный перенос энергии.
Глава 2. Лантанидные метки. Технологии лантанидного анализа и их применение. основные тенденции развития.
2.1. Лантанидные метки.
2.1.1. Координационные свойства лантанидов.
2.1.2. Классификация комплексных соединений лантанидов.
2.1.3. Свойства хелатов РЗЭ с р-дикетонами.
2.1.4. Механизм возбуждения флуоресценции лантанидов.
2.1.5. Основные требования, предъявляемые к лантанидной метке.
2.2. Технологии лантанидного флуоресцентного анализа.
2.2.1. Принцип регистрации флуоресценции ФИАВР.
2.2.2. Диссоциативно-усиленный лантанидный флуоресцентный иммуноанализ (DELFIA).
2.2.3. FIAgen (CYBERFLUOR®) и аналогичные недиссоциативные системы.
2.2.4. Ферментативно-усиленный лантанидный иммуноанализ (EALL)
2.2.5. Гомогенный анализ, основанный на времяразрешенном флуоресцентном резонансном переносе энергии. TRACE технология
2.3. Люминесцентные частицы.
2.4. Основные тенденции развития биоанализа. Высокоэффективный скрининг и биологические микрочипы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
Глава 3. Материалы и методы.
3.1. Материалы.
3.2. Приборы и оборудование.
3.3. Синтез и характеристика конъюгатов.
3.3.1. Получение конъюгатов тироксина с белковыми носителями.
3.3.2. Синтез конъюгата мАт-ДТПА-Eu.
3.3.3.Получение конъюгата тироксина с европием.
3.3.4. Синтез конъюгата мАт-ИТЦ-ДТТА-Eu.
3.3.5. Синтез конъюгатов БСА и мАт с N-ГСИЭ-ДТПА-АБТФА.
3.3.6. Синтез мАт-биотин.
3.3.7. Получение конъюгата стрептавидина с наночастицами.
3.4. Получение моноклональных антител их очистка.
3.4.1. Иммунизация мышей.
3.4.2. Слияние, отбор, клонирование.
3.4.3. Очистка и характеристика моноклональных антител.
3.5. Проведение иммуноферментного анализа.
3.5.1. Подготовка иммуносорбента для анализа Т4.
3.5.2. Проведение твердофазного иммуноферментного анализа.
3.6. Проведение иммунофлуоресцентного анализа с временным разрешением.
3.6.1. Проведение твердофазного ФИАВР с Т4-ДТПА-Еи.
3.6.2. Приготовления контрольных и калибровочных проб Т 4 в сухих пятнах крови.
3.6.3. Проведение твердофазного ФИАВР с мАт-ИТЦ-ДТТА-Eu.
3.6.4. Недиссоциативный ФИАВР с мАт - ДТПА-АБТФА-Eu.
3.6.5. Проведение ФИАВР с наночастицами.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Глава 4. Получение и характеристика моноклональных антител к тироксину.
4.1. Тироксин. Врожденный гипотиреоз. Неонатальный скрининг.
4.2. Тироксин как низкомолекулярный гаптен. Получение и характеристика конъюгатов тироксина с белком.
4.4. Характеристика моноклональных антител.
Глава 5. Диссоциативный ФИАВР для определения тироксина в сухих пятнах крови.
5.1. Выбор схемы анализа.
5.2. Оптимизация состава буфера для определения тироксина.
5.4. Определение тироксина в сухих пятнах крови.
Глава 6. Новые лантанидные метки для определения тироксина в недиссоциативном ФИАВР.
6.1. Диссоциативный ФИАВР с использованием мАТ-ИТЦ-ДТТА-Eu.
6.2. Новый хелат на основе ДТПА и АБТФА для недиссоциативного ФИАВР.
6.2.1. Принцип выбора метода.
6.2.2. Синтез и характеристика конъюгатов.
6.2.3. Конкурентный недиссоциативный ФИАВР.
6.3. ФИАВР с использованием наночастиц, содержащих Ей - (3дикетонатные комплексы.
6.3.1. Метки-частицы в лантанидном анализе.
6.3.2.Неспецифическое связывание.
6.3.3. Иммунофлуоресцентный анализ со StAv-NP. для определения Т4.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Флуоресцентный лантанидный иммуноанализ гормона тироксина с использованием европиевых меток"
На протяжении многих лет методы иммунохимического анализа, основанные на специфическом связывании определяемого антигена антителами, занимают прочное положение среди наиболее важных биохимических методов исследования. Они нашли широкое применение в медицинской практике для диагностики инфекционных, опухолевых заболеваний, аутоиммунных и эндокринных расстройств; в лекарственном, санитарно-эпидемиологическом, экологическом мониторинге; в изучении структуры, биосинтеза и механизма действия антител, в клеточном типировании и т.д.
Среди методов иммуноанализа, различающихся системой детекции, наряду с иммуноферментным и радиоиммунным, широко используется иммунофлуоресцентный метод. Иммунофлуоресцентный метод отличает богатство и разнообразие меток, стабильных в течение длительного времени. Применение флуоресцентных меток не ограничивается только иммунофлуоресцентным анализом. Многие флуоресцентные красители в литературе и в каталогах фирм-производителей выступают под названием «molecular probes» («молекулярные зонды»). Подобное название подразумевает, что данные маркеры являются тонким инструментом для изучения огромного количества процессов in vivo и ex vivo в клеточной и молекулярной биологии, обладают высокой информативностью и чувствительностью вплоть до детектирования одиночной молекулы или единичного процесса. Приложение флуоресцентных зондов и маркеров в различных областях исследований огромно. По данным фирмы «Invitrogen» существует порядка 50 ООО литературных ссылок только на использование коммерческих зондов во флуоресцентном анализе.
До середины 80-ых годов флуоресцентные маркеры значительно уступали радиоактивным и ферментативным меткам по чувствительности. Это объяснялось значительной фоновой флуоресценцией биологического образца в области свечения наиболее широко распространенных флуоресцеиновых и родаминовых меток. Данная проблема была решена с появлением в 80-ые годы люминесцентных меток, базирующихся на принципе временного разрешения детекции флуоресцентного сигнала. Сам метод получил название метода флуоресцентного иммуноанализа с временным разрешением (ФИАВР). Принцип его заключается в том, что фоновое свечение, характеризующееся коротким временем жизни в возбужденном состоянии (наносекунды-микросекунды), затухает к моменту отсроченной регистрации люминесцентного сигнала образца.
Наиболее актуальными современными задачами современных биоаналитических систем являются миниатюризация формата и мультианалитные исследования с выходом на высокоэффективный скрининг. В связи с этим, развитие флуоресцентного анализа по настоящее время происходит в основном в следующих направлениях: поиск новых способов (технологий) проведения иммунохимических реакций и разделения их компонентов, разработка новых методов детекции и обработки флуоресцентного сигнала, поиск новых высокочувствительных маркеров, в том числе на основе лантанидных хелатов, и увеличение чувствительности существующих.
ЦЕЛЬЮ настоящей работы явилась разработка лантанидного иммунофлуоресцентного анализа для определения гормона тироксина с использованием моноклональных антител к тироксину и европиевых меток, сопоставление разных меток в выбранной схеме иммуноанализа.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: □ получить моноклональные антитела к тироксину с высокой степенью аффинности и специфичности, охарактеризовать полученные мАт; выбрать наиболее чувствительную схему диссоциативного лантанидного иммуноанализа для определения общего тироксина (Т4) в сухих пятнах крови; изучить свойства новой флуоресцентной метки (конъюгата N-гидроксисукцинимидного эфира диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ДТПА) и аминобензоилтритфторацетона (АБТФА)) и разработать недиссоциативный метод анализа с ее использованием для определения Т4; разработать недиссоциативный метод анализа тироксина с использованием латексных наночастиц, содержащих европий -дикетонатный комплекс.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Жердева, Виктория Вячеславовна
ВЫВОДЫ
1) Получены моноклональные антитела к тироксину. Для разработки анализа выбраны мАт 6Е6Е5 с константой связывания 108 М"1, сохраняющие свои иммунологические свойства на протяжении длительного времени.
2) На основе полученных моноклональных антител и тироксина, меченного ДА ДТПА, разработан метод определения тироксина в сухих пятнах крови. Данный метод позволяет определять общий тироксин с пределом детекции 10 нМ и коэффициентом вариации не более 15 %.
3) Разработан трифункциональный хелат, по чувствительности не уступающий бифункциональным хелатам, используемым в диссоциативных схемах. Разработаны методы получения коньюгатов с новой флуоресцентной меткой на основе N-гидроксисукцинимидного эфира ДТПА и АБТФА и изучены их флуоресцентные свойства.
4) Впервые показано использование нового трифункционального хелата в иммунофлуоресцентном твердофазном гетерогенном анализе тироксина в схеме с мечеными антителами и иммобилизованным антигеном. Предел детекции тироксина составил 7 нМ с коэффициентом вариации не более 10%, что соответствует чувствительности диссоциативного ФИАВР для определения тироксина в той же схеме.
5) Использование нового трифункционального комплексона сокращает время анализа, который проводится в одну стадию, исключает использование усиливающего раствора, снимает проблему загрязнения иммуноаналитической системы солями лантанидов и тяжелыми металлами.
6) Впервые продемонстрировано использование европиевых наночастиц в конкурентном анализе гаптенов, в частности, для определения тироксина. Данный анализ позволяет определять тироксин в концентрации 0.1 нМ и демонстрирует 70-кратное увеличение чувствительности по сравнению с диссоциативным флуоресцентным иммуноанализом в схеме с иммобилизованным антигеном.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жердева, Виктория Вячеславовна, Москва
1. Чард Т. Радиоиммунологические методы. М.: Мир, 1981, с.246.
2. Дзантиев Б.Б., Осипов А.П. Классификация и характеристика методов иммуноферментного анализа. В сб.: Неизотопные методы иммуноанализа. Итоги науки и техники, сер. Биотехнология, 1987, т.З.с.57-116.
3. Hage D.S. Immunoassays. Anal. Chem., 1995, v.67, p.455 - 462.
4. Kricka, L. J. Selected strategies for improving assay sensitivity and reliability of immunoassays. Clin. Chem., 1994, v.40, p.347 - 357.
5. Kabir J.S. Detection of Helicobacter pylori in faeces by culture, PCR and enzyme immunoassay. J. Med. Microbiol., 2001, v.50, p. 1021-1029.
6. Black C.M. Current methods of laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infections. Clin. Microbiol. Rev., 1997, v. 10, p. 160- 184.
7. Soini E., Hemmila I. Fluoroimmunoassay: present status and key problems. -Clin. Biochem., 1979, v.25, p.353-361.
8. Hemmila, I., Dakubu, S., Mukkala, V.-M., Siitari, H., and Lovgren, T. Europium as a label in time-resolved immunofluorometric assays. Anal. Biochem., 1984, v. 137, p. 335 - 343.
9. Савицкий А.П. Флуоресцентный анализ: иммуноанализ, гибридные ДНК, биосенсоры. Успехи биол. химии, 1990, t.XXXI, с.209-241.
10. И. Савицкий А.П. Флуоресцентный иммуноанализ. Итоги науки и техники. М.: ВИНИТИ, 1987, т.З, с.117-166.
11. Diamandis E.P. Immunoassays with time-resolved fluorescence spectroscopy: principles and applications. Clin. Biochem., 1988, v.21, p.139-150.
12. Turconi S., Bingham R., Haupts U., Pope A. Developments in fluorescence lifetime-based analysis for ultra-HTS. Drug Discovery Today, 2001, v.6, №12 (Suppl.), p.S27-39.
13. Цыпленков П.В., Морозов В.П., Рогозкин В.А. Флуоресцентный иммуноанализ белков. Биоорг. хим., 1987, т.13, № 12, с.1605 - 1618.
14. Durkop A. Fluorescent markers, probes and labels. In: 4th European Short Course on Principles & Applications of Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy. - Berlin, October 30 - November 3, 2006, http://www.picoquant.com/trfcourse.htm
15. Dandliker W.B., Ksu M.L., Levin J., Rao B.R. Fluorescence polarisation in immunochemistry. Meth. Enzymol., 1981, v.74, p.3-28.
16. Karolin J., et al. Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins. J.Am.Chem.Soc., 1994, v.l 16, p.7801.
17. Buschmann V., Weston K.D., Sauer M. Spectroscopic study and evaluation of red-absorbing fluorescent dyes. Bioconjug. Chem., 2003, v. 14, p.195-204.
18. Song L., Hennink E.J., Young I.T., Tanke H.J. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J., 1995, v.68, p.2588-2600.
19. Sjoback R., Nygren J., Kubista M. Absorption and Fluorescence Properties of Fluorescein. Spectrochim. Acta A 51, 1995, v.7, p.20.
20. Wolfbeis O.S., Koller E., Hochmuth P. The unusually strong effect of 4-cyano group upon electronic spectra and dissociation constants of 3-substituted 7-hydroxycoumarins. Bull. Chem. Soc. Jap., 1985, v.58, N2, p.731-734.
21. Sun W.C., Gee K.R., Haugland R.P. Synthesis of novel fluorinated coumarins: excellent UV-light excitable fluorescent dyes. Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, v.8, p. 3107 - 3110.
22. Hemmila I. Fluoroimmunoassay and immunofluorometric assay. Clin. Chem., 1985, v.31, N 3, p.359-370.
23. Diwu Z., Zhang C., Klaubert D.H., Haugland R.P. Fluorescent Molecular Probes VI: The Spectral Properties and Potential Biological Applications of Water-Soluble Dapoxyl™ Sulfonic Acid. J. Photochem. Photobiol. A 131, 2000, v.95, p.785-789.
24. Yguerabide J., Talavera E., Alvarez J.M., Afkir M. Pyrene-labeled DNA probes for homogeneous detection of complementary DNA sequences: poly(C) model system. Anal. Biochem , 1996, v. 241, p. 238-247.
25. Савицкий А.П., Папковский Д.Б., Пономарев T.B., Березин И.В. Фосфоресцентный иммуноанализ. Металлопорфирины альтернатива редкоземельным флуоресцентным меткам. - Докл. АН СССС, 1989, т.304, N 4, с. 1005-1008.
26. Савицкий А.П., Папковский Д.Б., Флуоресцентный иммуноанализ. Порфирины новый тип меток для иммуноанализа. - Докл. АН СССР, 1987, т.293, №3, с.744-745.
27. Kronick M.N. The use of phycobiliproteins as fluorescent labelsin immunoassays. J. Immunol. Methods, 1986, v.92, p.1-13.
28. Chudakov D.M., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends Biotechnol., 2005, v.23, N12, p.605-613.
29. Benjamin D., Colombi M., Stoecklin G., Moro C.A. GFP-based assay for monitoring post-transcriptional regulation of AREmRNA turnover. Mol. BioSyst., 2006, v.2, p.561-567.
30. Chan W.C.W. and Nie S. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection. Anal. Science, 1998, v.281, p.2016-2018.
31. Bruchez M.Jr., Moronne M., Gin P., Weiss S., Alivisatos A.P. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science, 1998, v.281, p.2013.
32. Lentz B.R. Use of fluorescent probes to monitor molecular order and motions within liposome bilayers. Chem. Phys/ Lipids , 1993, v.64, p.99-116.
33. Jameson D.M., Seifried S.E. Quantification of protein-protein interactions using fluorescence polarization. Methods, 1999, v. 19, p.222-233.
34. Jameson D.M., Sawyer W.H. Fluorescence anisotropy applied to biomolecular interactions. Methods Enzymol., 1995, v. 246, p. 283-300.
35. Dandliker W.B., De Saussure V.A. Fluorescence polarization in immunochemistry. Immunochemistry, 1970, v.7, p.799-828.
36. Dandliker W.B., Kelly R.J., Dandliker J., Farquahar J., Levin J. Fluorescence polarization immunoassay. Theory and experimental method. -Immunochemistry, 1973, v. 10, p.219-227.
37. Eremin S. A., Smith D.S. Fluorescence polarization immunoassays for pesticides. Comb. Chem. High Throuput Screen., 2003, v.6, N.3, p. 257266.
38. Owicki J.C. Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer. J. Biomol. Screen., 2000, v.5, p.297-306.
39. Tota M.R., Daniel S., Sirotina A., Mazina K.E., Fong T.M., Longmore J., Strader C.D. Characterization of a fluorescent substance P analog. -Biochemistry, 1994, v.33, p.13079-13086.
40. Parker G.J., Law T.L., Lenoch F.J., Bolger R.E. Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays. J. Biomol. Screen., 2000, v.5, p.77-88.
41. Rozema D.B., Poulter C.D. Yeast protein farnesyltransferase. pKas of peptide substrates bound as zinc thiolates. Biochemistry, 1999, v.38, p. 13138-13146.
42. Zhao G., Meier T.I., Kahl S.D., Gee K.R., Blaszczak L.C. BOCILLIN FL, a sensitive and commercially available reagent for detection of penicillin-binding proteins. Antimicrob. Agents Chemother., 1999, v. 43, p.l 1241128.
43. Schade S.Z., Jolley M.E., Sarauer B.J., Simonson L.G. BODIPY-alpha-casein, a pH-independent protein substrate for protease assays using fluorescence polarization. Anal. Biochem., 1996, v.243, p. 1-7.
44. Kido C., Murano S., Tsuruoka M. Rapid and simple detection of PCR product DNA: a comparison between Southern hybridization and fluorescence polarization analysis. Gene, 2000, v.259, p.123-127.
45. Singh K.K., Rucker Т., Hanne A., Parwaresch R., Krupp G. Fluorescence polarization for monitoring ribozyme reactions in real time. -Biotechniques, 2000, v.29, p.344-348.
46. Chen X., Levine L., Kwok P.Y. Fluorescence polarization in homogeneous nucleic acid analysis. Genome Res., 1999, v.9, p.492-498.
47. Rusinova E., Tretyachenko-Ladokhina V., Vele O., Senear D., Ross A. Alexa and Oregon Green dyes as fluorescence anisotropy probes for measuring protein-protein and protein-nucleic acid interactions. J. Anal. Biochem., 2002, v.308, N18, p.369-375
48. Krikounova V.S., Abuknesha R., Eremin S.A. Express detection of pentachlorphenol as dioxins precursor in natural water. Scientific World J., 2002, v.27, N2, p.l 132-1137.
49. Thompson N.L. Fluorescence Correlation Spectroscopy Topics in Fluorescence Spectroscopy, Lakowicz J.R., Ed. 1: Techniques, 1991, p.337-378.
50. Hess S.T., Huang S., Heikal A.A., Webb W.W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. -Biochemistry, 2002, v.41, p.697-705.
51. Moore K.J., Turconi S., Ashman S., Ruediger M., Haupts U., Emerick V., Pope A.J. Single Molecule Detection Technologies in Miniaturized High Throughput Screening: Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Biomol. Screen., 1999, v.4, p.335-354.
52. Kinjo M, Rigler R. Detection of asymmetric PCR products in homogeneous solution by fluorescence correlation spectroscopy. Nucleic Acids Res., 1995, v.23, p.l795-1799.
53. Kinjo M. Ultrasensitive hybridization analysis using fluorescence correlation spectroscopy.- Biotechniques, 1998, v.25, p.706-712.
54. Van Craenenbroeck E, Engelborghs Y. Quantitative characterization of the binding of fluorescently labeled colchicine to tubulin in vitro using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry, 1999, v.38, p.5082-5088.
55. Lakowicz J.R., Gryczynski I., Gryczynski Z. High Throughput Screening with Multiphoton Excitation. J. Biomol.Screen., 1999, v.4, p.355-362 .
56. Schwille P., Korlach J., Webb W.W. Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes. -Cytometry, 1999, v.36, p. 176-182.
57. Tjernberg L.O., Pramanik A., Bjorling S., Thyberg P., Thyberg J., Nordstedt C., Berndt K.D., Terenius L., Rigler R. Amyloid beta-peptide polymerization studied using fluorescence correlation spectroscopy. -Chem. Biol., 1999, v. 6, p.53-62 .
58. Schuler J., Frank J., Trier U., Schafer-Korting M., Saenger W. Interaction kinetics of tetramethylrhodamine transferrin with human transferrin receptor studied by fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry, 1999, v.38, p.8402-8408.
59. Widengren J., Mets U., Rigler R. Fluorescence correlation spectroscopy of triplet states in solution: a theoretical and experimental study. J. Phys. Chem., 1995, v.99, p. 13368.
60. Selvin P.R. Principles and biophysical applications of lanthanide based probes Review. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 2002, v.31, p.275-302.
61. Selvin PR. The renaissance of fluorescence resonance energy transfer Review. Nat. Struct. Biol., 2000, v.7, p.730 - 734.
62. Lakowicz, J. R. 1999. Energy transfer. In Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed. Plenum, New York. 367-394
63. Selvin PR. Fluorescence resonance energy transfer. Methods Enzymol., 1995, v.246, p.300-334.
64. Wu P, Brand L. Resonance energy transfer: methods and applications. -Anal. Biochem., 1994, v.218, p.1-13.
65. Berney C, Danuser G. FRET or No FRET: A quantitative comparison. -Biophys J., 2003, v.84, p.3992-4010.
66. Gordon G.W., Berry G., Liang X.H., Levine В., Herman B. Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys. J., 1998, v.74, p.2702-2713.
67. Matayoshi E.D., Wang G.T., Krafft G.A., Erickson. Novel fluorogenic substrates for assaying retroviral proteases by resonance energy transfer. J. Science, 1990,v.247, p.954-958.
68. Marras S.A., Kramer F.R., Tyagi S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. -Nucleic Acids Res., 2002, v.30, p. 122.
69. Tyagi S. Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat. Biotechnol., 1996, v.14, p.303-308.
70. Morrison L.E. Time-resolved detection of energy transfer: theory and application to immunoassays. Anal. Biochem., 1988, v. 174, p. 101 - 120.
71. Thelwell N., Millington S., Solinas A., Booth J., Brown T. Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection. Nucleic Acids Res., 2000, v.28, p.3752-3761.
72. Cardullo R.A., Agrawal S., Flores C., Zamecnik P.C., Wolf D.E. Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, v.85, p.8790-8794.
73. Chen X., Zehnbauer В., Gnirke A., Kwok P.Y. Fluorescence energy transfer detection as a homogeneous DNA diagnostic method. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v.94, p.10756-10761.
74. Gulnik S.V., Suvorov L.I., Majer P., Collins J., Kane B.P., Johnson D.G., Erickson J.W. Design of sensitive fluorogenic substrates for human cathepsin D. FEBS Lett., 1997, v.413, p.379-384.
75. Sammes P.G., Yahioglu G. Modern bioassays using metal chelates as luminescent probes. Nat. Prod. Rep., 1996, v. 13, N1, p. 1-28.
76. Frederick R.S. Terbium(III) and europium(III) ions as luminescent probes and stains for biomolecular systems. Chem. Rev., 1982, v.8, N5; p.541-552.
77. Полуэктов Н.С., Кононенко Л.И. Спектрофотометрические методы разделения индивидуальных РЗЭ. Киев: Наукова думка, 1968, 170 с.
78. Костромина Н.А. Комплексонаты РЗЭ. М.: Наука, 1980, 220 с.
79. Пришибл Р. Комплексоны в химическом анализе. М.: ИЛ, 1960,225 с.
80. Дятлова Н.М., Темкина В.Я., Колпакова И.Д. Комплексоны. М.: Химия, 1970,461 с.91. (3 -Дикетонаты металлов. М.: Наука, 1980,217 с.
81. Полуэктов И.С., Безлуцкая И.В., Закономерности образования разнолигандных комплексов на основе (3-дикетонатов редкоземельных элементов. В кн.: Теоретическая и прикладная химия Р-дикетонатов металлов. - М.: Наука, 1985, с. 135-142.
82. Пилипенко А.Т., Тананайко М.М. Разнолигандные и разнометальные комплексы и их применение в аналитической химии. М.: Химия, 1963,223 с.
83. Полуэктов Н.С. Смешанные комплексы редкоземельных элементов. -Хим. и хим. технология, 1973, т.5, с. 104-105.
84. Taketatsu Т. Complex formation of europium with thenoiltriflueroacetone and tri-n-octylphosphine oxide in micellar solution of nonionic surfactant. -Chem. Lett., 1981, v.107, p.1057-1058.
85. Taketatsu T. Spectrofotofluorometric determination of terbium, europium and sumarium with pivaloytriflueroacetone and TOPO. Talanta, 1982, v.29, p.397-400.
86. Ефимов И.П. Исследование процесса комплексообразования некоторых РЗЭ с b-дикетонами методом распределения. М.: Наука, 1965, с. 180.
87. Светлова И.Е., Добрынина Н.А. Смирнова Н.С. Мартыненко Л.И., Евсеев A.M., Савицкий А.П. Разнолигандное комплексообразование европия с комплексонами и дикетонами в мицеллярных растворах. -Журн. неорг. химии, 1989, т.34. с.52-59.
88. Bhaumik M.L., Telk C.L. Fluorescence quantum efficiency of rare earth chelates. J. Opt. Soc. Am., 1964, v.54, N10, p.1211-1213.
89. Тищенко M.A., Аланаева Jl.А., Полуэктов H.C. Люминесцентное определение тербия и диспрозия с помощью этилендиаминтетра ацетата и ДБСК. Укр. хим. журн., 1973, т.39, № 5, с.482 - 485.
90. Dagnell R.M., Smith R., West T.S. A specific spectrofluorometric determination of terbium as its EDTA-Sulphosalicylic acid complex. -Analist, 1967, v.92, p.358-362.
91. Серебренников В.В. Химия редкоземельных элементов. Томск: Изд-во Томск, ун-та, 1959 (1), 1961 (11), 801 с.
92. Weissman S.I. Intramolecular Energy Transfer The Fluorescence of Complexes of Europium. J. Chem. Phys., 1942, v. 10, p.214 - 217.
93. Balzani V. Photochemistry and luminescence of coordination compounds. -J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry, 1990, v.51, p.55-62
94. Hemilla I., Dakubu S. //US patent 4,565,790. 1986.
95. Pietraszkiewicz, M., Karpuik, J., Pietraszkiewicz, O. Luminescent lanthanide complexes with macrocyclic N-oxides. Spectrochimica Acta. Part A, 1998, v.54, p.2229 - 2236.
96. Mathis, G. Probing molecular interactions with homogeneous techniques based on rare earth cryptates and fluorescence energy transfer. Clin. Chem., 1995, v.41,p.l391 - 1397.
97. Chen J. and Selvin P.R . Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium. Bioconjugate Chem., 1999, v. 10, p.311 -315.
98. Ci Y-X., Yang X.-D., Chang W.-B. Fluorescence labeling with europium chelate of (3-diketones and application in time-resolved fluoroimmunoassays (TR-FIA). J. Immunol. Methods, 1995, v. 179, p.233 - 241.
99. Yuan J., Wang G., Kimura H., and Matsumoto K. Highly sensitive detection of bensulfiiron-methyl by time-resolved fluoroimmunoassay using atetradentate P-diketonate europium chelate as a label. Anal. Sciences, 1999, v.15, p.125 - 128.
100. Diamandis P., Morton R.C. Time-resolved fluorescence using a europium chelate of 4,7-bis(chlorosulfodiphenyl)-1,10-phenanthroline-2,9-dicarboxylic acid (BCPDA). J. Immunol.Methods, 1988, v.l 12, p.43 - 52.
101. Wu F.B., Han S.Q., Zhang C., He Y.F. Synthesis of a highly fluorescent beta-diketone-europium chelate and its utility in time-resolved fluoroimmunoassay of serum total thyroxine. Anal. Chem., 2002, v.74 N22, p.5882-5889.
102. Mukkala V.M., Helenius M., Hemmila I., Kankare J., Takalo H. Development of luminescent europium(III) and terbium(III) chelates of 2,2':6',2"-terpyridine derivatives for protein labelling. Helv. Chim. Acta, 1993, v.76, p.l361 - 1378.
103. Dakubu S., Ekins R.P. The fluorometric determination of europium ion concentration as used in time-resolved fluoroimmunoassay. Anal. Biochem., 1985, v.144, N1, p.20-26.
104. Papanastasiou-Diamandi A., Christopoulos Т.К. and Diamandis E.P. Ultrasensitive thyrotropin immunoassay based on enzymatically amplified time-resolved fluorescence with a terbium chelate. Clin. Chem., 1992, v.38, N4, p.545 - 548.
105. Alpha-Bazin В., Bazin H., Boissy L., Mathis G. Europium cryptate-tethered ribonucleotide for the labeling of RNA and its detection by time-resolved amplification of cryptate emission. Anal. Biochem., 2000, v.286, p. 17-25.
106. Yoshikawa K., Yuan J., Matsumoto K., Kimura H. Time-resolved fluorometric detection of DNA using a tetradentate P -diketonate europium chelate as a label. Anal. Sciences, 1999, v. 15, p. 121 -124.
107. Soini E., Lovgren T. Time-resolved fluorescence of lanthanide probes and application in biotechnology. Anal. Chem., 1987, v. 18, N2, p. 105-154.
108. Hemmila I. Time-resolved fluorometric determination of terbium in aqueus solution. Anal. Chem., 1985, v.57, p. 1676- 1681.
109. Hemmila I. Lanthanides as probes for time-resolved fluorometric immunoassays. Scand. J. Clin. Invest., 1988, v.48, p.389-400.
110. Soini E., Kojola H. Time-resolved fluorometer for lanthanide chelates a new generation of nonisotopic immunoassays. - Clin. Chem., 1983, v.29, N1, p.65-68.
111. Lovgren Т., Hemmila I., Petterson H., Eskola I.U., Bertoft E. Determination of hormones by time-resolved fluoroimmunoassay. Talanta, 1984, v.31, N108, p.909-916.
112. Toivonen E., Hemmila I., Marnieni I., Lorgenson P.N., Zeuthen I., Lovgren T. Tow-site time-resolved immunofluorometric assay of human insulin. -Clin. Chem., 1986, v.32, N4, p.637- 640.
113. Suonpaa M., Markela E., Stahlberg Т., Hemmila I. Europium-labelled streptavidin as a highly sensitive universal label. Indirect time-resolved immunofluorometry of FSH and TSH. J. Immunol. Methods, 1992, v.149, N2, p.247-53.
114. Hekim C., Alfthan H., Leinonen J. Т., and Stenman U.-H. Effect of incubation time on recognition of various forms of prolactin in serum by the DELFIA assay. Clin. Chem., 2002, v.48, N12, p.2253 - 2256.
115. Fernandes L.C., Kim S.B., Matos D. Cytokeratins and carcinoembryonic antigen in diagnosis, staging and prognosis of colorectal adenocarcinoma. -World J. Gastroenterol., 2005, v.l 1, N5, p.645-648.
116. Vihko P., Kurkela R., Ramberg I., Pelkonen I., Vihko R. Time- resolved immunofluorometric assay of human prostate specific antigen. Clin. Chem., 1990, v.36, N1, p.92-96.
117. Becker C., Piironen Т., Kiviniemi J., Lilja H., Pettersson K. Sensitive and Specific Immunodetection of HumanGlandular Kallikrein 2 in Serum. -Clin. Chem., 2000, v.46, N2, p. 198-206.
118. Suonpaa M., Lavi J., Hemilla I., Lovgren T. A new sensitive assay of human alpha-fetoprotein using time-resolved fluorescence and monoclonal antibodies. Clin. Chim. Acta, 1985, v. 145, p.341-348.
119. Chan U.A., Bellen A.C., Diamandis E.P. Time-resolved immunofluorometric assay of alfa-fetoprotein in serum and amniotic fluid, with a novel detection system. Clin. Chem., 1987, v.33, N11, p.2000-2003.
120. Maple P.A.C., Jones C.S. and Andrews N.J. Time resolved fluorometric immunoassay, using europium labelled antihuman IgG, for the detection of human tetanus antitoxin in serum. Clin. Pathol., 2001, v.54, p.812-815.
121. Meurmann O., Hemilla I., Lovgren Т., Halonen P. Time-resolved fluoroimmunoassay: a new test for Rubella antibodies. J. Clin. Microbiol., 1982, v. 16, N5, p. 920-925.
122. Siitari H., Hemilla I., Soini E., Lovgren T. Detection of hepatitis В surface antigen using time-reolved fluoroimmunoassay. Nature, 1983, v.301, p.258-260.
123. Helsingius P., Hemmila I., Lovgren T. Solid-phase immunoassay for digoxin using time-resolved fluorescence. Clin. Chem., 1986, v.32, p. 17671769.
124. Dechand H., Bador R., Claustrat F., Desuringes G., Mallin R. A new approch to competetive lanthanide immunoassay: time- resolved fluoroimmunoassay of progesteron with labelled analite. Clin. Chem., 1988, v34, N3, p.501-504.
125. Peuralahti J., Suonpaa K., Blomberg K., Mukkala V.M., Hovinen J. Labeling of steroids on solid phase. Bioconjug. Chem., 2004, v. 15, N4, p.927-930.
126. Bertoft E., Eakala I.U., Nanto V., Lovgren T. Competitive so- lid-phase immunoassay of testosterone using time-resolved fluorescence. FEBS, 1984, v.173, N1, p.213-216.
127. Sander J. and Niehaus C. Screening for congenital hypothyroidism by timeresolved fluoroimmunoassay for thyrotropin. Clin.Chem., 1986, vol.32, N6, p. 1231.
128. Saedi S. Dean H., Dent W., Stock E., Cronin C. Screening for congenital adrenal hyperplasia: the Delfia screening test overestimates serum 17hydroxyprogesterone in preterm infants. Pediatrics, 1996, v:97, N1, p. 100102.
129. Grosskopf C., Farriaux J.P., Vidailhet M., Briard M.L., Navarro J., Roussel P. National neonatal screening program for cystic fibrosis: management and organization. Arch. Pediatr., 2003, v. 10, Suppl. 2, p.364s-369s.
130. Vieira N., Carvalho E., Fonseca A. Adaptation of alpha-fetoprotein and intact human chorionic gonadotropin fluoroimmunometric assays to dried blood spots. Clin. Chim. Acta., 2005, v. 360, p.151-159.
131. Diamandis E.P. Time-resolved fluorescence immunoassay system especially siuted for research applications. Clin. Chem., 1989, v.35, p.491-495.
132. Hemmila X., Holthinen S., Petterson V., Lovgren T. Double- label time-resolved immunofluorometry of lutropin and follitropin in serum. Clin. Chem., 1987, v.33, p.2281-2283.
133. Heinonen P., Iitia A., Torresani Т., Lo'Vgren T. Simple triple-label detection of seven cysticfibrosis mutations by time-resolved fluorometry. -Clin. Chem., 1997, v. 43, N 7, p.l 142-1150.
134. Kajander V., Sjoroos M., Hukkanen M., Rehan T. Time-resolved fluorometry PCR assay for rapid detection of herpes simplex virus in cerebrospinal fluid. J. Clin. Microbiol., 2000, p. 3214-3218.
135. Evangelista R.A., Polak A. European Patent, EP 0171978,1986.
136. Evangelista R.A., Pollak A., Allore В., Templeton E.F., Morton R.C., and Diamandis E.P. A new europium chelate for protein labelling and timeresolved fluorometric applications. Clin Biochem, 1988, v.21, N3, p.l73-178.
137. Khosravi M.I., Diamandis E.P. Immunofluorometry of choriogonadotropin by time-resolved fluorescence spectroscopy with a new europium chelate as label.-Clin. Chem., 1987, v.33, p.1994-1999.
138. Diamandis E.P., Bhayana V., Conway V., Reichstein E., Papanastasiou -Diamandis A. Time-resolved fluoroimmunoassay of Cortisol in serum with a europium as label. Clin. Chem., 1988, v.34, p.l 157-1159.
139. Kakabakos S. E., Christopoutos Т. K., and. Diamandis E.P. Multianalyte Iimunoassay based on spatially distinct fluorescent areas quantifiedby laser-excited solid- phase time- resolved fluorometry. Clin.Chem., 1992, v.38, N3, p.338-342.
140. Diamandis P., Morton R.C., Reichstein, Khosran M.I. Multiplefluorescent labeling with europeum chelators. Application to time resolved fluoroimmunoassay. Anal. Chem., 1989, v.61, N7, p.48-57.
141. Sundberg M.W., Meares C.F., Goodwin D.A., Diamandis C.I. Selective binding of metal ions to macromolecules using bifunctional analogs of EDTA. J. Med. Chem., 1974, v.17, p.1304-1307.
142. WilmottN.I., Miller I.N., Tyson I.F. Potential use of a terbium-transferric complex as a label in an immunoassay for gentamicin. The Analyst, 1985, v.109, p.343-345.
143. Kankare J. PCT World Patent, ЕР 0493745A1, 1991.
144. Kropf J., Gressner A.M. Two sensitive time-resolved fluoroimmunoassays for cellular fibronectin. Anal. Biochem., 1991, v. 197, p.258-265.
145. Yang X.-O., Ci Y.-X., and Chang W.-B. Time-resolved fluorescence immunoassay with measurement of a europium chelate in solution: dissociation conditions and application for determination of Cortisol Anal. Chem., 1994, v. 66, p.2590-2594.
146. Hegele A., Heidenreich A., Kropf J., Knobloch R., Varga Z., Hofmann R., Olbert P. Plasma levels of cellular fibronectin in patients with localized and metastatic renal cell carcinoma. Tumor Biology, 2004, v.25, p. 111-116.
147. Norman H.L., Christopoulos Т.К. and Peltier J. Sandwich-type deoxyribonucleic acid hybridization assays based on enzyme amplified time-resolved fluorometry. Analyst, 1998, v.123, p.1315-1319.
148. Diamandis E.P. Time-resolved fluorometry in nucleic acid hybridization and Western blotting techniques. Electroforesis, 1993, v. 14, p.866 - 875.
149. Evangelista R.A., Pollak A., Templeton EF. Enzyme amplified lanthanideluminescence for enzyme detection in bioanalytical assays. -Anal. Biochem., 1991, v. 197, p.213-224.
150. Papanastasiou-Diamandi A., Christopoulos Т.К., and Diamandis E.P. Ultrasensitive thyrotropin immunoassay based on enzymatically amplified time-resolved fluorescence with a terbium chelate. Clin.Chem., 1992, v. 38, N. 4, p.545-549.
151. Bathrellos L.M, Lianidou E.S., Ioanno P.C. A Highly sensitive enzyme-amplified lanthanide luminescence immunoassay for interleukin 6. Clin. Chem., 1998, v.44, N6, p.1351-1353.
152. Christopoulos Т. К and. Diamandis E.P. Enzymatically amplified time-resolved fluorescence immunoassay with terbium chelates. Anal.Chem., 1992, p.342-346.
153. Templeton E.F., Wong E., Evangelista R.A., Granger Т., Pollak A. Time-resolved fluorescence detection of enzyme-amplified lanthanide luminescence for nucleic acid hybridization assays. Clin.Chem., 1991, v.37, N 9, p.l506-1512.
154. Lim C.S., Miller J.N., Bridges J.W. Energy-transfer immunoassay: a study of the experimental parameters in an assay for human serum albumin. -Anal. Biochem., 1980, v. 108, p. 176-184.
155. Mathis G. Rare earth cryptates and homogeneous fluoroimmunoassays with human sera. Clin. Chem., 1993, v.39, p. 1953-1959.
156. Rodriguz-Ubis J.-C., Alpha В., Plancherel D., Lehn J.-M. Photoactive cryptands. Synthesis of the sodium cryptates of macrobicyclic ligands containing bipyridine and phenoanthroline groups. Helv.Chim.Acta, 1984, v. 67, p. 2264-2269.
157. Lehn J. M. and Sauvage J. P. Cryptates. XVI. 2.-Cryptates. Stability and selectivity of alkali and alkaline-earth macrobicyclic complexes. J. Am.Chem.Soc., 1975, v.91, p.6700 - 6707.
158. Sabbatini N., Guardigli M. Luminescent lanthanidecomplexes as photochemical supramolecular devices. J. Coord. Chem. Rev., 1993, v. 123, N1, p.201-228.
159. Prodi L., Maestri M., Ziessel R., Balzani V. Luminescent Eu, Tb, and Gd complexes of a branched-triazocyclonane ligand containing three 2,2-bypyridine units. Inorg.Chem., 1991, v.30, p.3798-3802.
160. Sabatini N., Guardini M., Mecati A., Balzani V., Ungaro R., Ghidini E., Casnati A., Pochini A. Encapsulation of lanthanide ions in calixarene receptors. A strongly luminescent terbium(III) complex. J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1990, p.878-879.
161. Sata N., Shinkai S. Energy-transfer luminescence of lanthanide ions encapsulated in sensitizer-modified calix4.arenes. J. Chem.Soc., Perkin Trans., 1993, v.2, p.621-624.
162. Lundin K., Blomberg K., Nordstrom Т., Lindqvist C. Development of a time-resolved fluorescence resonance energy transfer assay (cell TR-FRET) for protein detection on intact cells. Anal. Biochem., 2001, v.299, p.92-97.
163. Stenroos К., Hurskainen P., Eriksson S., Hemmila I., Blomberg K., Lindqvist C. Homogeneous time-resolved IL-2-IL-2R assay using fluorescence resonance energy transfer. - Cytokine, 1998, v. 10, p.495- 499.
164. Blomberg K., Hurskainen P., Hemmila I. Terbium and rhodamine as labels in a homogeneous time-resolved fluorometric energy transfer assay of the subunit of human chorionic gonadotropin in serum. Clin. Chem., 1999, v.45, p.855-861.
165. Heyduk E., Heyduk T. Thiol-reactive, luminescent europium chelates: luminescence probes for resonance energy transfer distance measurements in biomolecules. Anal.Biochem., 1997, v.248, p.216-227.
166. Kane S.A., Fleener C.A., Zhang Y.S., Davis L.J., Musselman A.L., Huang P.S. Development of a binding assay for p53/HDM2 by using.homogeneous time-resolved fluorescence. Anal. Biochem., 2000, v. 278, p. 29 - 38.
167. Lopez-Crapez E., Bazin H., Andre E., Noletti J., Greinier J. and Mathis G. A homogeneous europium cryptate-based assay for the diagnosis of mutations by time-resolved luminescence resonance energy transfer.-Nucleic Acids Res., 2001, v.29, p.l 10.
168. Alpha-Bazin В., Bazin H., Boissy L., Mathis G. Europium cryptate-tethered ribonucleotide for the labeling of RNA and its detection by time-resolved amplification of cryptate emission. Anal. Biochem., 2000, v.286, p. 17- 25.
169. Unger M., Kartalov E., Chiu C.-S., Lester H.A., Quake S.R. Single molecule fluorescence observed with mercury lamp illumination. Biotechniques, 1999, v.27, p. 1008-1014.
170. Weiss S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science, 1999, v.283, p. 1676-1683.
171. Taylor J.R., Fang M.M., Nie S. Probing specific sequences of single DNA molecules with bioconjugated fluorescent nanoparticles. Anal.Chem.,2000, v.72, p.1979-1986.
172. Zijlmans H.J., Bonnet J., Burton J., Kardos K., Vail Т., Niedbala R.S., Тапке H J. Detection of cell and tissue surface antigens using up-converting phosphors: a new reporter technology. Anal. Biochem., 1999, v.267, p.30-36.
173. Soukka Т., Kuningas K., Rantanen Т., Haaslahti V. Lovgren T. Photochemical characterization of up-converting inorganic lanthanide phosphors as potential labels. J. of Fluorescence, 2005, v.15, N4, p.513-528.
174. Schultz S, Smith D.R., Mock J.J, Schultz D.A. Single-target molecule detection with nonbleaching multicolor optical immunolabels. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, v 97, p.996-1001.
175. Harma H. Particle technologies in diagnostics. Technology Review, 2002, v.126.- Helsinki: TEKES, 35p.
176. Azzazy H., Mansour M., Kazmierczak S. Nanodiagnostics: A New Frontier for Clinical Laboratory Medicine. Clin. Chem., 2006, v.52, p.1238-1246.
177. Bruchez M., Moronne M., Gin P., Weiss S., Alivisatos A.P. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science, 1998, v.281, p.2013-2015.
178. Chan W.C.W., Maxwell D.J, Gao X, Bailey R.E, Han M, Nie S. Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging. Curr. Opin. Biotechnol, 2002, v. 13, p 40-46.
179. Pathak S, Choi S.K., Arnheim N, Thompson M.E. Hydroxylated quantum dots as luminescent probes for in situ hybridization. J. Am. Chem. Soc,2001, v.123, p.4103-4104.
180. Sukhanova A, Venteo L, Devy J, Artemyev M, Oleinikov V, Pluot M. Nabiev I. Highly stable fluorescent nanocrystals as a novel class of labels forimmunohistochemical analysis of paraffin-embedded tissue sections. Lab. Invest., 2002, v.82, p. 1259-1261.
181. Yeh H.-C., Ho Y.-P., Shih I.-M. and Wang T.-H. Homogeneous point mutation detection by quantum dot-mediated two-color fluorescence coincidence analysis. Nucleic Acids Research, 2006, v.34, N 5, p.2- 8.
182. Vashist S.K., Tewari R., Bajpai R.P., Bharadwaj L.M. and Raiteri R. Review of quantum dot technologies for cancer detection and treatment. J. of Nanotechnology Online, 2006, v.2, p. 1-14.
183. Ekins R.P., Chu F.W. Multianalyte microspot immunoassay -microanalytical"compact disk" of the future. Clin. Chem., 1991, v.37, p. 1955-1967.
184. Ekins R.P., Chu F. Developing multianalyte assays. Trends Biotechnol., 1994, v.12, p.89-94.
185. Wians F.H., Dev J., Powell M.M, Heald J.I. Evaluation of simultaneous measurement of lutropin and follitropin with the SimulTROPIN ™ radioixnmunoassay kit. Clin. Chem., 1986, v.32, p.87-90.
186. Gow S.M., Caldwell G., Toft A.D., Beckett G.J. SimulTRAC™ simultaneous radioimmunoassay of thyrotropin and free thyroxin evaluated. -Clin. Chem., 1986, v.32, p.2191-2194.
187. Мирзабеков А.Д. Биочипы в биологии и медицине XXI века. Вестник Российской Академии Наук, 2003, т.73, №5, с.412 - 425.
188. Khrapko К., Lysov Yu., Khorlin A. et al. An oligonucleotide hybridization approach to DNA sequencing. FEBS Letters, 1989, v. 256, p. 118-122.
189. Arenkov P., Kukhtin A., Gemmell A. et al. Protein microchips: Use for immunoassay and enzymatic reactions. Anal. Biochem., 2000, v.278, p.123-131.
190. Lou L.-Y., Diamandis E.P. Preliminary examination of time-resolved fluorometry for protein array applications. Luminiscence, 2000, v.15, p.409-413.
191. Nichkova M., Dosev D., Gee S.J., Hammock B.D., and Kennedy I.M. Microarray immunoassay for phenoxybenzoic acid using polymer-functionalized lanthanide oxide nanoparticles as fluorescent labels. -Proceedings of SPIE, v.6008, p.600815.
192. Wolcke J., Ulmann D. Miniaturized HTS technologies-uHTS. Drug Discovery Today, 2001, v.6, p.637 - 646.
193. Boisclair M.D., McClure C., Josiah S., Glass S., Bottomley S., Kamerkar S., et al. Development of a ubiquitin transfer assay for high throughput screening by fluorescence resonance energy transfer. J. Biomol. Screen., 2000, v.5,p.319-328.
194. Martens C., Bakker A., Rodriguez A., Mortensen R.B., Barrett R.W. A generic particle-based nonradioactivehomogenous multiplex method for highthroughputscreening using microvolume fluorimetry. Anal. Biochem. 1999, v.273, p.20-31.
195. Gabriel D., Vernier M., Pfeifer M.J., Dasen В., Tenaillon. L., Bouhelal R. High throughput screening technologies for direct cyclic AMP measurement. Assay Drug Dev. Technol., 2003, v.l, N2, p. 291-303.
196. Beasley J.R., McCoy P.M., Walker T.L., Dunn D.A. Miniaturized, ultrahigh throughput screening of tyrosine kinases using homogeneous, competitive fluorescence immunoassays. Assay Drug Dev Technol., 2004, v.2, N 2, p.141-151.
197. Bare L.A., Trinh L., Wu S., Devlin J.J. Identification of a seriesof potent telomerase inhibitors using a time-resolved fluorescence-based assay. Drug Development Research, v.43, N2,1998, p. 109-116.
198. Moore K.J. et al. A homogeneous 384-well high throughputscreen for novel tumour necrosis factor receptonligand interactions using time-resolved spectroscopy. J. Biomol. Screening, 1999, v.4, p.205-214.
199. Zhou G. et al. Nuclear hormone receptors have distinct affinities for coactivators; characterisation by fluorescence resonance energy transfer.- Mol. Endocrinol., 1999, v. 12, p. 1594—1604.
200. Zhang, J-H. et al. A high-throughput homogeneous assay for reverse transcriptase using generic reagents and time-resolved fluorescence detection. Anal. Biochem., 2000, v.281, p.182-186.
201. Friguet В., Chaffotte A.F., Djavadi-Ohaniance L., Goldberg M.E. Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay. J. Immunol. Methods, 1985, v.77, N2, p.305-319.
202. Ogilvy-Stuart A.L. Neonatal thyroid disorders. Arch. Dis. Child. Fetal. Neonatal., 2002, v.87, p.165-171.
203. LaFranchi S. Congenital hypothyroidism: etiologies, diagnosis, and management. Thyroid, 1999, v.9, N7, p.735-740.
204. Guthrie R. The origin о newborn screening. Screening, 1992, N.l, p.5-15.
205. Pollitt R. J Newborn mass screening versus selective investigation: Benefits and costs. J. Inherit. Metab. Dis., 2001, v. 24, p. 299-302.
206. Dussault J.H., Coulombe P., Laberge C., Letarte J., Guyda H., Khoury K. Preliminary report on a mass screening program for neonatal hypothyroidism.- J. Pediatr, 1975, v.86, p.670-674.
207. Врожденный гипотиреоз у детей (ранняя диагностика и лечение) Методические рекомендации. Под ред. Дедова И.И. М: МСЗН РФ, 1999, 23 с.
208. Папковский Д.Б., Стафеева О.А., Савицкий А.П. Получение антисывороток к тироксину с высокими титрами для целей иммунологического анализа. Пробл. эндокринол., 1988, т. 34, № 1, с. 57 - 60.
209. Пономарева И.В., Савицкий А.П., Шахнина K.JL, Щеголев А.А. Флюоресцентный иммуноанализ с временным разрешением. Использование различных производных поликарбоновых кислот дляполучения конъюгатов антител с европием. Иммунология, 1989, т. 4, с. 76-78.
210. Савицкий А.П., Грибкова Е.В., Чудинов А.В. Разработка иммунофлуоресцентного анализа с временным разрешением для определения тироксина. Аллергология, астма и клиническая иммунология, 1999, т. 9, с. 151 - 153.
211. Hemmilla I.A., Mikola H.J. New complexing agents for labeling of proteins with metals. Acta Radiologica Sup., 1990, v.374, p.53 - 55.
212. Wu F., Xu Y., Хао Т., Wang Y., Han S. Time-resolved fluorescence immunoassay of thyroxine in serum: immobilized antigen approach. -Analyt.Biochem., 1999, v.276, p. 171 -176.
213. Torresanl Т., Scherz R. Thyroid screening of neonates without use of radioactivity: evaluation of time-resolved fluoroimmunoassay of thyrotropin. Clin. Chem., 1986, v.32, N6, p.1013-1016.
214. Данилова Н.П., Крупина H.B., Мертц M.B., Василов Р.Г. Получение моноклональных анител к тироксину. Биоорганическая химия, 1993, т. 19, №7, с. 704-712.
215. Bellisario R., Colinas R. J., Pass К. A. Simultenious measurements of thyroxine and thyrotropin from newborn dried blood-spot specimens using multiplexed fluorescent microsphere immunoassay. Clin. Chem., 2000, v.46, N9, p. 1422-1424.
216. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б, Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М: Высшая школа, 1991, с. 226-236.
217. Savitsky A. P., Chudinov A. V., Krylova S. Novel fluorescent chelate for Eu. Advances in Luminescence Sensing Technology II, Proceedings of SPIE, 1995, v. 2388, p. 429 - 434.
218. Peters T. Serum albumin. In: Putnam F.W. Ed. The plasma proteins. -N.Y.: Academic Press, 1975, p.133-181.
219. Harma H., Soukka Т., and Lovgren T. Europium nanoparticles and time-resolved fluorescence for ultrasensitive detection of prostate-specific antigen. Clin. Chem., 2001, v.47, p.561-568.
220. Soukka Т., Paukkunen J., Harma H., Lonnberg S., Lindroos H., and Lovgren T. Supersensitive time-resolved immunofluorometric assay of free prostate-specific antigen with nanoparticle label technology. Clin. Chem., 2001, v.47, N7, p. 1269- 1278.
-
Жердева, Виктория Вячеславовна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2007
-
ВАК 03.00.04
- Фторсодержащие β-дикарбонильные бензогетероциклические соединения для экологического анализа биозагрязнителей
- Иммуноаналитические методы определения тироксина на основе моноклональных антител
- Разработка методов иммуноанализа с использованием магнитных наномаркеров
- Биолюминесцентный молекулярный микроанализ на основе Ca2+-регулируемого фотопротеина обелина
- Разработка новых методов иммуноанализа на примере миоглобина человека
