Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фторсодержащие β-дикарбонильные бензогетероциклические соединения для экологического анализа биозагрязнителей

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Фторсодержащие β-дикарбонильные бензогетероциклические соединения для экологического анализа биозагрязнителей"

005014849

сгп

КОСТРЮКОВА Татьяна Сергеевна

ФТОРСОДЕРЖАЩИЕ р-ДИКАРБОНИЛЬНЫЕ БЕНЗОГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА БИОЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ

Специальность 03.02.08 - Экология (химические науки)

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 2 [.1ДР ¿012

Москва 2011

005014849

Диссертационная работа выполнена на кафедре общей и аналитической химии ГОУ ВПО «Московский государственный областной университет» и в отделе микроанализа Федерального государственного унитарного предприятия "Государственный научно-исследовательского институт биологического приборостроения" МЗ РФ

Научный руководитель: доктор химический наук,

профессор

Васильев Николай Валентинович

Официальные оппоненты: доктор химический наук,

профессор Мартынов Борис Иванович

кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Румянцева Валентина Дмитриевна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский педагогический государственный университет»

Защита диссертации состоится 22 марта в часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.155.13 при Московском государственном областном университете по адресу: 141014, Московская обл., г. Мытищи, ул. Веры Волошиной, д. 24,628 ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного областного университета.

Отзывы на автореферат, заверенные печатью учреждения, просим присылать по адресу: Диссертационный Совет Д 212.155.13 при Московском государственном областном университете по адресу: 141014, Московская обл., г. Мытищи, ул. Веры Волошиной, д. 24,627а ауд.

Автореферат разослан ^февраля 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук

Снисаренко Т.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований.

Обнаружение опасных биологических загрязнителей - прионов, вирусов, риккетсий, бактерий, грибов, простейших и других биологических инфекционных загрязнителей, а также токсинов у инфицированных людей, животных, растений, в объектах окружающей среды следует рассматривать как важный элемент системы обеспечения экологической безопасности. Одно из основных направлений анализа, наиболее интенсивно развивающееся последние годы, это иммунофлуоресцентный анализ (ФИА), в основе которого находится регистрация реакций биоспецифического взаимодействия люминесцирующими реагентами - маркерами. На первоначальных этапах развития в различных вариантах флуоресцентного иммуноанализа применялись олигобензоциклические и гетероциклические соединения, которые относятся к ряду ксантена, нафталина, антрацена, пирена, кумарина, порфирина и т.д. Многие из них успешно используются и в настоящее время. Наибольшее значение в последние десятилетия получили методы ФИА, основанные на использовании комплексов металлов. Среди них наиболее известны порфириновые комплексы благородных металлов (К, Р(1), и комплексы лантанидов (Ей, ТЬ, 8т, и т.д.). Существенным преимуществом этих реагентов являются большие времена жизни в возбужденном состоянии (-0,04-1,0 мс), что позволяет реализовать методики регистрации флуоресценции с временной задержкой и исключить фоновое влияние биологического материала проб (белка) и материалов подложки (пластика планшета). В результате пороговый уровень детекции люминесцентных меток повышается в 100-1000 раз. Аналитические методы, основанные на применении лантанидных комплексов сгруппированы в методе ЛИФА - лантанидом иммунофлуоресцентном анализе, технологии которого базируются на детектировании комплексов фторированных р-дикетонов с лантаноидом. Наиболее часто используются комплексы Еи3+. В настоящее время чувствительность методик ЛИФА достигает 10"14 моль/л, однако для многих целей экологического анализа даже такая чувствительность не является удовлетворительной. В частности, многие патогены, токсины, а также и абиотические экотоксиканты представляют опасность и в меньших концентрациях, особенно при продолжительных воздействиях. Таким образом создание новых эффективных комплексообразующих реагентов ряда фторированных р-дикетонов, увеличивающих чувствительность экологического анализа биологических загрязнителей, является актуальным. Актуальность темы исследования проистекает из следующих причин. Во-первых, для практического использования люминесцентных методик в экологическом анализе целесообразным

является применение дешевых источников возбуждения, что может быть достигнуто при реализации методик с применением хромофоров с длинноволновым возбуждением (360-400 нм). Метки, содержащие такие хромофоры, в методе ЛИФА и других люминесцентных методиках с временной задержкой разработаны недостаточно. Во-вторых, целесообразно увеличить устойчивость комплексов Еи3+ в сравнении с используемыми в настоящее время (~10'7 М"1), что должно привести к симбатному увеличению чувствительности экологического анализа. В-третьих, диссоциативные варианты иммунофлуоресцентного анализа, в частности реализованный в клиниках метод «Déifia», предполагают использование стадии перекомплексообразования ионов лантаноидов и не пригодны для многих методик прямого мечения и, в том числе, для мультикомпонентного определения экотоксикантов в одной пробе. В связи с этим перспективна разработка реагентов, имеющих возможность для последующего конъюгирования с белковыми молекулами посредством активных функциональных групп, отделенных от хромофорной части специальной инертной "ножкой" - спейсером. Эти же реагенты могут стать чрезвычайно полезными для создания флуоресцирующих частиц нанопараметрового размера.

Настоящая работа посвящена разработке фторсодержащих Р-дикарбонильных бензогетероциклических соединений как аналитических реагентов, которые могут использоваться в экологическом анализе биологических загрязнителей.

Целью настоящего исследования является разработка фторсодержащих p-дикарбонильных бензогетероциклических реагентов, удовлетворяющих требованиям современного иммунофлуоресцентного анализа биозагрязнителей.

В соответствии со сформулированной целью в работе были поставлены следующие задачи:

1. На основе обзора литературных сведений, касающихся современного состояния люминесцентного анализа, выбрать объекты изучения среди аналитических реагентов с оптимальным комплексом свойств, определяющих перспективы их дальнейшего практического использования.

2. Исходя из анализа литературы, а также экспериментально, определить оптимальные условия получения фторсодержащих р-дикарбонильных бензогетероциклических соединений, осуществить синтез известных ранее и новых представителей этого ряда. Изучить особенности их строения и физико-химические свойства.

3. Изучить комплексообразование полученных комплексонов с лантанидами и ионами других металлов, представляющих интерес в экологическом плане, оценить люминесцентно-спектральные свойства образующихся комплексов. Разработать методы получения

фторсодержащих ß-дикарбонильных бензогетероциклических синтонов, имеющих активные функциональные группы, пригодные для создания флуоресцирующих наночастиц и для введения в белковые молекулы.

4. Провести мечение белковых молекул фторсодержащими ß-дикарбонильными бензогетероциклическими соединениями и оценить возможности использования полученных конъюгатов для иммунофлуоресцентного анализа биоспецифических взаимодействий.

5. Разработать методы получения флуоресцирующих частиц нанопараметрового размера на основе ковалентного и сорбционного принципов введения разрабатываемых флуорогенов или их комплексов. Оценить люминесцентно-спектральные свойства дисперсий наночастиц, выбрать наиболее перспективные из них для последующего мечения белковых молекул. Определить возможности конъюгации разрабатываемых наночастиц с белками и их применимость для целей иммунофлуоресцентного анализа биологических загрязнителей.

Научная новизна результатов исследований.

1. В результате систематического изучения реакций конденсации, приводящих к получению фторированных бензо- и дибензогетероциклических 1,3-дикарбонильных соединений, оптимизированы методики получения ранее известных соединений, а также получены новые представители тетракетонов, дикетоэфиров и тетракетодиэфиров этого ряда.

2. Изучение люминесцентно-спектральных свойств и процессов комплексообразования показало, что большинство из изученных веществ образует стабильные, длительно люминесцирующие комплексы с европием, сравнимые или превышающие по своим характеристикам комплексы применяющегося в практике реагента - 2-нафтоилтрифторацетона (HTA). Полученные реагенты имеют, как правило, длинноволновые максимумы возбуждения - 360-395 нм. При этом комплексы дибензогетероциклических соединений люминесцируют несколько более интенсивно, чем комплексы бензогетероциклических соединений, однако и те и другие перспективны в качестве реагентов в иммунофлуоресцентном анализе с временным разрешением.

3. Предпринятое исследование влияния фосфорсодержащих синергистов на люминесценцию изучаемых комплексов и ее устойчивость во времени показало, что все изученные синергисты менее эффективны в сравнении с триоктилфосфиноксидом (ТОФО). Более объемный синергист трифенилфосфиноксид (ТФФО) менее эффективен, однако препятствует медленно развивающимся процессам стейкинг-взаимодействия плоских бензогетероциклических лигандов, в результате чего люминесценция комплексов в его присутствии падает медленно.

4. Разработка методов получения наночастиц ковалентным введением флуорогенов в матрицы и сорбционными способами привела к

получению активно флуоресцирующих дисперсий частиц нанопараметрового размера, содержащих флуорогены ряда фторсодержащих Р-дикарбонильных бензогетероциклических соединений. При изучении методов допирования по сорбционному механизму удалось получить более перспективные нанодисперсии на основе поливинилкарбазола и полистирол-дивинилбензола.

5. При апробации разработанных конъюгатов показана возможность проведения иммуноанализа в системе кроличья сыворотка -анти^О кролика, меченного наночастицами, при этом надежно регистрируется люминесцентный сигнал при определении в

концентрации 2х10'13 г/мкл.

Практическое значение результатов исследований.

Разработаны препаративные методы получения ряда фторированных бензо- и дибензогетероциклических 1,3-дикарбонильных соединений, которые могут находить применения в различных вариантах иммунофлуоресцентного анализа.

Маркированием белковых молекул стрептавидина и иммуноглобулина получены новые реагенты для иммунофлуоресцентного анализа биоспецифических взаимодействий, содержащие фторированные р-дикарбонильные бензогетероциклические соединения.

Результаты иммуноанализа холерного токсина, проведенного с захватывающими антителами, находящимися на поверхности микрочастиц, нагруженных комплексом копропорфирина с Р1 (II) (РьКП), и проявлением иммунокомплекса с биотинилированными антителами стрептавидином, меченым комплексом Ей, показывают применимость разработанных меток для обнаружения биозагрязнений в экологическом анализе.

Основные положения, выносимые на защиту:

На защиту выносится совокупность сведений по методам получения фторированных бензо- и дибензогетероциклических 1,3-дикарбонильных соединений.

Результаты изучения люминесцентно-спектральных свойств комплексов фторированных бензо- и дибензогетероциклических 1,3-дикарбонильных соединений, а также допированных ими наночастиц.

Методы получения и оценка свойств флуоресцирующих нанодисперсий.

Оценка разработанных реагентов в иммунофлуоресцентном анализе биологических загрязнений.

Достоверность результатов исследований и обоснованность выводов основываются на экспериментальных данных, полученных с применением комплекса современных физико-химических методов анализа, с использованием стандартных и аттестованных методик.

Корректность результатов подтверждается их сходимостью при повторных экспериментах, обработанных методами математической статистики.

Личный вклад. Автором, с учетом рекомендаций руководителя, сформулированы цель и задачи исследования, выбраны методические подходы к их решению; в течение 2007-2011 гг. получены и интерпретированы экспериментальные результаты.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международных научных конференциях "Актуальные проблемы биоэкологии" (МГОУ, 2008; МГОУ, 2010), Международной конференции "Органическая химия для медицины" (Черноголовка, 2008), VIII Всероссийской конференции "Химия фтора" (Черноголовка, 2009), Международном симпозиуме "Экология арктических и приарктических территорий" (Архангельск, 2010), 2-ой научной региональной конференции с международным участием "Химия 2011. Физическая химия. Теория, эксперимент, практика" (Коломна, 2011), VIII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоанапитика 2011" (Архангельск, 2011), XI Международной конференции «Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах» (Иваново, 2011), научной конференции преподавателей, аспирантов и молодых ученых Московской области, посвященной 300-летию М.В. Ломоносова и 80-летию МГОУ (Москва, 2011), а также на заседаниях и научных семинарах кафедры общей и аналитической химии МГОУ.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 10 печатных работах, из них 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы (204 источника, из них 118 иностранных). Работа включает 177 страниц машинописного текста, 27 рисунков, 27 таблиц, 59 схем.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю, д.х.н. Н.В.Васильеву, к.х.н. Н.П.Ивановской, д.б.н. Н.С.Осину, Г.В.Затонскому, к.х.н. Н.Д.Свердловой, к.х.н. Д.В.Парамонову за постоянную поддержку и ценные рекомендации, а также всем сотрудникам кафедры общей и аналитической химии МГОУ и отдела микроанализа ГосНИИБП за доброжелательное отношение и помощь в работе.

Содержание работы

Порядок изложения диссертационной работы, список оформления литературных источников соответствуют правилам оформления, принятым для работ, публикующихся в ведущих отечественных и зарубежных журналах синтетического направления.

Глава 1. Анализ литературных сведений

Диссертационная работа включает в себя исследования, выполненные методами органической химии, физико-химическими и биохимическими методами, а также содержит элементы нанохнмических технологий; в связи с этим аналитический обзор посвящен основным работам в области флуоресцентного иммуноанализа, а также методам получения и основным свойствам фторированных р-дикетонов. Необходимые литературные сведения приводятся также и в начале других разделов, предваряя обсуждение экспериментальных результатов.

Глава 2. Обсуждение результатов исследования 2.1 Разработка методов получения фторированных р-дикарбонильных бензогетероциклических соединений 2.1.1 Получение бензогетероциклических фторированных (3-дикетонов. В подразделе обсуждаются методы синтеза бензогетероциклических фторированных Р-дикетонов. В качестве основных агентов для проведения конденсации по Кляйзену были изучены метилат натрия, гидриды натрия и лития. Обнаружено, что конденсация ацетилпроизводных бензофурана и индола с метилтрифторацетатом в присутствии метилата натрия осуществляется более эффективно, а для получения бензотиофенильного производного предпочтительным является использование гидрида лития.

п - о о

X в л

СНз+р3с^Ч>СН3--1 Д СН2 СР3

В =МаОСН3, N34, ин х=0 (1). в (2), НН (3)

Рис.1. Общая схема получения бензогетероциклических фторированных р-дикетонов

Контроль над осуществлением этих реакций, а также других изучаемых превращений, осуществлялся при помощи тонкослойной хроматографии. Окончание реакции фиксировалось по исчезновению исходных ацетилгетероциклических соединений. Ни один из бензогетероциклических фторированных р-дикетонов не формирует устойчивых хроматографических зон на коммерчески доступных пластинах «БПибЛ». Чистота и индивидуальность продуктов реакции подтверждались методом ЯМР 'Н, 19Р, а также элементным анализом.

Изучена конденсация ацетилбензогетероцикпических соединений с диэфирами перфтордикарбоновых кислот. Известно, что в таких реакциях могут образовываться соединения ряда дикетоэфиров, которые содержат активные функциональные группы, отделенные дифторметиленовой "ножкой" - спейсером; они представляют особую ценность в качестве метки в иммунном анализе, а также для создания нано- и микрочастиц.

Показано, что для получения гетероциклических дикетоэфиров 4-6 предпочтительно использование гидрида лития в качестве основания.

О 0 0 -/->«. ООО

СН3 + н3С0 Аср^осн, ос,

В=ИаН, ин

Х=0 (4). Э (5), ЫН (в)

СНз ■ XX:к. ГГ^сЛЛ.

II ) +Н3СО^(СРг-СОСНз

Рис.2. Общая схема получения бензогетероциклических фторированных дикетоэфиров 4-6 и тетракетона 7 При применении гидрида натрия в реакции конденсации ацетилбензофурана был выделен и охарактеризован тетракетон 7. 2.1.2 Получение дибензогетероциклических фторированных дикетонов. В подразделе обсуждаются методы синтеза дибензогетероциклических фторированных р-дикетонов. Использование гидридов металлов позволило существенно сократить время проведения реакции и повысить выходы тетракетонов 8-10.

2 ^ О ..11 11

^ .. ЧАЛУ

в-тн.ин *

Х=0 (в). Б (9). МН (10)

Рис.3. Общая схема получения дибензогетероциклических фторированных р-дикетонов 8-10 Достаточно сложным оказался вопрос о возможностях получения дибензогетероциклических тетракетодиэфиров 11-13. Ацилирование диметилперфторадипинатом диацетилдибензофурана и

диацетилдибензотиофена с лучшими выходами осуществляется при применении гидрида натрия.

Р о ООО ООО

Х=0(11). Б (12). МН (13)

Рис.4. Общая схема получения бензогетероциклических фторированных тетракетодиэфиров 11-13 Реакция конденсации диацетилкарбазола в присутствии гидрида натрия также осуществляется, однако при этом происходит побочная реакция - метилирование ЫН - группы, что удалось зафиксировать по появляющемуся сигналу с химическим сдвигом ЯМР13С (30 м.д.), который соответствует метальной группе у «пиррольного» азота конденсированных циклов. Наличие ЫСНз-группы в соединении 13Ь однозначно доказано в

эксперименте двойного резонанса *Н - 13С, ее образование, возможно, происходит по внутримолекулярному механизму.

н

Рис.5. Общая схема ацшшрования диацетилкарбазола При использовании гидрида лития был получен тетракетодиэфир на основе карбазола 13, данные ЯМР 1 Н, 13С указывают на наличие только СН30- групп в этом соединении.

Для получения ковалентно связанных наночастиц на основе матриксов, содержащих функциональные группы, проведена модификация тетракетодиэфира 13 путем превращения сложноэфирных групп в хлорангидридные. Полученный хлорангидрид 13с использовался для введения флуорогенных комплексообразующих центров в полимерные матриксы без выделения.

ЛаС'

й

■ОСНа

н 13с

Рис.6. Схема получения хлорангидрида тетракетодиэфира 13 Таким образом, в результате проведения синтетических исследований изучены и оптимизированы методы получения известных ранее 1,3-дикарбонильных соединений 1-3 и 8-10, а также получены новые соединения этого ряда 4-7 и 11-13.

2.2 Люминесцентно-спектральные свойства фторированных р-дикетонов и их комплексов.

2.2.1 Комплексы с европием. Первоначально осуществлялась попытка выделения комплекса Еи3+ с одним из наиболее перспективных среди изучаемых комплексонов - тетракетоном на основе карбазола 10. При проведении синтеза был выделен комплекс 10а, соответствующий по данным элементного анализа комплексу состава НЁиЬ4. Известно, что для европия характерно координационное число 8, и, таким образом, при образовании этого комплекса тетракетон 10 использует только одну Р-дикетонатную группу, то есть выступает как бидентатный.

Вместе с тем, при изучении комплексообразования тетракетона с Еи3+ флуоресцентным методом в водных растворах был получен другой результат. Исследование проводилось при постоянной концентрации комплексообразователя и синергического реагента триоктилфосфиноксида (ТОФО). Концентрация лиганда в исследуемых растворах изменялась с шагом 0,25 относительно концентрации Еи3+. Интенсивность флуоресценции европейных комплексов измерялась на длине волны 615 нм, то есть при максимуме люминесценции, характерном для европия. С учетом полученной зависимости, а также литературных сведений, был определен наиболее вероятный состав комплекса, обладающего максимальной люминесценцией: Еи3+ - 1,5 лиганд 10 -2ТОФО (рис. 7). Некоторое превышение количества лиганда связано с необходимостью концентрационного вытеснения избытка ТОФО. Длина волны возбуждения в эксперименте составляла 380 нм (шах), временная задержка (td) 0,1 мс и время регистрации сигнала (tg) 1,0 мс. Время комплексообразования составляло около двух часов. За это время устанавливается максимальная интенсивность люминесценции исследуемого раствора.

Рис.7. Зависимость интенсивности люминесценции от соотношения Еи3+: 10 (концентрация Еи3+ в растворе 5х10"6 моль/л, концентрация ТОФО

5x10"5 моль/л)

Люминесцентно-спектральные свойства комплексов всех изученных бензо- и дибензогетероциклических 1,3-дикарбонильных соединений с Еи3+ приведены в табл. 1 и 2 соответственно (Хпога и >.во,в- длина волны поглощения/возбуждения люминесценции комплекса при регистрации эмиссии на 615 нм, I - интенсивность люминесценции в максимуме возбуждения и регистрации в относительных единицах td - 0,1мс, tg - 1 мс, х - время жизни люминесценции; слиганда=10"5 моль/л, стофо-5х10"5 моль/л). Большинство соединений (за исключением соединений ряда индола 3, 6) образуют длительно люминесцирующие комплексы с Еи3+ в нейтральных и кислых средах, времена жизни люминесценции составляют ~500-^800 мкс, что достаточно для большинства аналитических методик люминесцентного анализа.

Таблица 1 - Люминесцентно-спектральные характеристики комплексов

бензосодержащих ß-дикетонов - Лиганд:Еи3+= 3:1 _(флюориметр Perkin Elmer LS-5B)_

Соединение ^■потл.. е, хЮ"4, ^•возб., ImaxXlO3, т, мкс

нм моль"1 л см'1 нм отн.ед

358 4,61 355 36,6 625,1±21,0

^ ААо:, 340 3,13 350 23,9 801,7±14,7

См 2

360 1,31 358 3,9 695,9±22,4

w 3

СХ^^АА* 4 355 2,02 360 38,0 606,1±4,9

kAsJl 5 340 1,24 350 48,5 807,6±4,0

340 1,08 355 0,1 526,8±76,9

H О

350 2,54 350 28,2 645,6±15,3

См хо7

ео^ 340 1,54 340 37,5 745,3±16,9

Эталонный ß-дикетон: HTA

Таблица 2 - Люминесцентно-спектральные характеристики комплексов дибензосодержащих ß-дикетонов - Лиганд:Еи3+= 3:2 _(«Varioscan Flash» фирмы «Thermofisher Scientific»)

Соединение ^погл., нм Е^СЮ"4, моль"1 л см"1 ^возб., нм ImaxXlO5, отн.ед т, мкс

8 350 3,8 350 16,6 619±25,3

350 3,9 356 17,9 592±14,2

н 10 340, 380 2,7 340, 380 19,9 586±17,5

хл К3СО iCF^/^ -(CFj), OCH, •ОцА^ и 350 3,4 350 14,8 570±18,3

HjCO^ICF^-^V554»)-rj^ijf^^ (CF^OCHj uvu1 12 355 3,8 356 16,2 615±13.4

XЛААЛ HjOO^tCF^/^'^Y^ -/у4/ <CF,)4 OCH, " 13 340, 380 2,9 385400 15,9 578±10,5

При сравнении люминесцентных свойств комплексов лигандов 4,10, 13 с комплексом HTA, который используется в качестве основного компонента "усиливающего раствора" в анализе по методу "DELFIA", обнаружено, что при определении европия достигается аналогичный порядок чувствительности при более длинноволновом максимуме возбуждения -360 -390 нм против 340 нм (рис. 8).

Рис.8. Спектр поглощения соединения 10 и комплексов на его основе: черный - исходный лиганд 10; красный - 10 +Еи3+; синий - 10 +Еи3++ТОФО

Комплексы лигандов 10 и 13 могут эффективно возбуждаться без применения УФ- источников обычными светодиодными элементами. 2.2.2 Влияние фосфорсодержащих синергистов на люминесценцию комплексов и устойчивость во времени. В подразделе рассматривается влияние синергистов на процессы комплексообразования и люминесценции. В качестве синергистов комплексообразования были изучены следующие фосфорсодержащие вещества: ТОФО, ТФФО, триэтилфосфат, гексаметапол и фосфорная кислота. Наиболее эффективным синергистом является ТОФО, что определяется его гидрофобностью. Другие синергисты, хотя и проявляют донорные свойства, не обладают достаточной гидрофобностью для эффективного вытеснения воды из сфер комплексообразования. Выявлено, что люминесценция при применении

ТФФО имеет свою особенность - большую временную устойчивость люминесценции комплекса (рис.9), что может быть объяснено более объемным и конформационно жестким строением молекул. По-видимому, объем и жесткость молекул ТФФО препятствует медленно развивающимся процессам стейкинг - взаимодействия плоских карбазольных лигандов.

141)000

II ЭДН» пц

. (00000 ИВ

* 80000 ^В

■ ■ ■

■ _ : I I I I

0,1 I 14 я 0.1 t 14 35

Су пен Сутки

а б

Рис. 9. Сравнительная устойчивость комплекса в присутствии ТОФО (а) и ТФФО (б) 2.2.3 Комплексообразование дибензогетероциклических

тетракетонов с металлами. В подразделе дана сравнительная оценка спектральных свойств и комплексообразования дибензосодержащих тетракетонов с ионами Eu3+, Sm3+, Tb3+, Dy3+. Комплексообразование лигандов осуществляется со всеми изученными ионами, что проявляется в характерных изменениях спектров их поглощения (существенное увеличение оптической плотности и длинноволновый сдвиг их максимумов). Однако люминесценция наблюдается только в случае образования комплексов Еи3+ и Sm3+, люминесценция ТЬ3+и Dy3+ незначительна или отсутствует.

2.3 Разработка методов получения люминесцирующих микро- и нанодисперсий на основе р-дикетонов. В разделе обсуждаются реализованные направления разработки реагентов на основе люминесцирующих микро- и наночастиц. Известно, что мечение одного акта биоспецифического взаимодействия множественными люминесцирующими центрами, находящимися в частице, приводит, при правильном молекулярном конструировании, к существенному увеличению чувствительности. Кроме того, на основе частиц чрезвычайно удобно формировать биочипы мультианалитного типа путем введения разных люминесцентных меток. Реализация различных модификаций иммуноанализа с использованием элементов нанотехнологий позволяет достичь уровней чувствительности 10"19 - 10' 21 моль/л. Такая чувствительность позволит определять 100-1000 копий молекул нуклеиновой кислоты, единичные клетки возбудителей инфекционных заболеваний, а молекулярные антигены (токсины, лекарства, пестициды и т.п.) - на уровне нг/л.

Для формирования наночастиц использовались синтезированные фторированные ß-дикарбонильные соединения бензогетероциклического и дибензогетероциклического рядов, содержащие метоксикарбонильные заместители, отделенные от флуорохромной части молекулы дифторметиленовыми цепочками. В работе использовались известные матриксы, в том числе и полимерные, при этом осуществлялось исследование ковалентного введения меток ß-дикарбонильного типа и сорбционное допирование полимерных веществ.

2.3.1 Ковалентное введение фторированных ß-дикарбонильных фрагментов в готовые матриксы. В подразделе изучены ковалентные методы получения наночастиц, сформированных из матриц, содержащих гидроксильные группы, по которым осуществлялось введение гетероциклических 1,3-дикарбонильных групп. В качестве таких матриц изучались следующие полимерные и полифункциональные соединения: поливиниловый спирт, декстран, пентаэритрит и молекулы цилиндрической и конической симметрий - ß-циклодекстрин и каликс[8]арен. Изучена также модификация полимерных матриц, в которых пришивка достигается при взаимодействии по аминогруппам: полилизином и поливиниламинокарбазолом. Ковалентное связывание комплексонов осуществлялось в безводных растворителях - смеси диметилсульфоксида и тетраметиленсульфона (сульфолана). Модификация полимерных матриксов, содержащих гидроксильные группы, проводилась с использованием хлорангидрида 13с. Все дисперсии после их синтеза фильтровались через фильтр ~1 мкм, и, таким образом, полученные суспензии содержали только частицы ультрамикро- и нанопараметрового размера. В ряде случаев дисперсии наночастиц изучены при помощи электронной микроскопии (электронные фотографии выполнены д.б.н. Маныкиным A.A.)

Рис.10. Фрагмент наночастиц, образованной модификацией декстрана (а) и поливинилового спирта (б) хлорангидридом фторированного тетракетокарбазола 13с Модификация полимерных матриксов, содержащих аминогруппы, проводилась с использованием тетракетодиэфира 13, поскольку амидные

а

б

связи достаточно быстро образуются из эфиров полифторкарбоновых кислот,

Рис. 11. Фрагмент наночастиц, образованной модификацией полилизина (а) и аминополивинилкарбазола (б) тетракетодиэфиром 13 Различия в люминесцентно-спектральных свойствах полученных нанодисперсий достаточно существенны: значения интенсивности люминесценции находятся в интервале от 152 отн.ед. (циклодекстриновый матрикс) до 2250 отн.ед. (поливиниловый спирт), в то время как комплекс «неподшитого» лиганда, в аналогичной концентрации имеет значение -1060 отн.ед. Введение в дисперсии неионногенного ПАВа - Тритона Х-100 приводит к неоднозначным результатам: так, в случае пентаэритрита и каликс[8]арена, происходит увеличение интенсивности (с 653 по 832 и с 992 по 1389 отн.ед. соответственно), а в случае поливинилового спирта -падение (с 655 по 378 отн.ед.).

Люминесценция практически всех частиц, полученных методами ковалентного связывания, существенно падает с течением времени. Этот эффект хорошо прослеживается на графиках (рис. 12), которые являются типичными для дисперсий ковапентносвязанных частиц. Комплекс «неподшитого» лиганда 13 в аналогичной концентрации ведет себя по-другому: 80% люминесценции сохраняется в течение 15 суток. Быстрое падение люминесценции частиц косвенно подтверждает механизм связывания лиганда в частицах, однако ограничивает перспективы их применения в иммунофлуоресцентном анализе методиками прямого мечения.

а

б

Рис.12. Изменение интенсивности люминесценции в дисперсии, образованной модификацией каликс[8]арена в присутствии (черный) и отсутствии (зеленый) Тритона Х-100 2.3.2 Сорбционное введение фторированных р-дикарбонильных фрагментов и комплексов в готовые матриксы. В подразделе рассматривается формирование частиц, содержащих маркирующие бензо- дибензогетроциклические фторированные р-дикарбонильные фрагменты, не связанные ковалентными связями. Допирование осуществлялось на матрицах полистирольного и поливинилкарбазольного типов.

Разработка полистирольных нанодисперсий была построена на двух принципиально различающихся методах: методе эмульсионной полимеризации стирола (восходящий метод) и диспергирования готового полистирола в водной фазе (нисходящий метод).

При получении частиц методом эмульсионной сополимеризации стирола с дивинилбензолом в присутствии тетракетона на основе карбазола оказалось, что полученная дисперсия не может быть в дальнейшем использована, поскольку при прибавлении к ней раствора хлорида европия проходит активная коагуляция. Причины этого явления неясны.

При получении полистирольных частиц методом диспергирования смесь полимера и комплекса тетракетодиэфира 13 вводилась из раствора ТГФ в воду через тонкий капилляр (0,05 ±0,01 мм). В результате образовывалась полидисперсная суспензия частиц сферовидной формы 65-200 нм. Люминесценция образованной дисперсии достаточно высока (Wb =2,27х105), однако в течение нескольких суток существенно снижается, а затем фиксируется на значении 1400615 1,3x104 отн.ед., которое не изменяется в течение длительного времени (8 месяцев).

Методика прямого допирования полистирольных частиц была реализована на готовых частицах полистирол-дивинилбензол предварительно обработанных тетрагидрофураном ТГФ. Готовую

дисперсию частиц размером ~40 нм обрабатывали комплексом состава 4:Еи3+:ТОФО, после обработки дисперсия подвергалась диализу.

Полученная дисперсия обладает высокими значениями люминесценции - Ьбо615= 5,6x106 отн.ед., высокой устойчивостью во времени (в течение трех месяцев падение интенсивности люминесценции составило менее 10%). Показано, что в условиях осуществленного исследования (прибор Varioscan Flash) может быть выявлено 2,12x106 наночастиц в 0,1 мл и, таким образом, чувствительность определения при использовании частиц, допированных комплексом лиганда 4, составляет 3,5 хЮ14 моль/л, что превышает возможности определения европия при использовании чистого комплекса лиганда на три порядка.

Сорбционное допирование наночастиц на основе

поливинилкарбазола также имеет свои перспективы. Введение комплекса лиганда 4 в матрицу осуществляется эффективно, и образованная дисперсия состоит из достаточно однородных частиц среднего размера 25±4 нм. Интенсивность люминесценции нанодисперсии достигает 134о6|5=3,2х10б и обладает достаточной устойчивостью при хранении. В течение трех месяцев люминесценция частиц уменьшается на 12%, а в течение полугода на 30%.

2.4 Оценка возможности использования фторированных бензогетероциклических 1,3-дикарбонильных реагентов в иммунофлуоресцентном анализе. До середины 80-х годов методики иммунофлуоресцентного анализа уступали методикам ферментного и радиоизотопного анализов по чувствительности и, как следствие, иммунофлуоресцентный анализ был менее востребован в практике. Это объясняется тем, что фоновая люминесценция биологических образцов и анализируемых сред маскирует основной сигнал применявшихся меток. С появлением новых люминесцентных меток, отличающихся от используемых большим стоксовым сдвигом и длительным временем жизни, был разработан принцип регистрации люминесценции с временным разрешением - так называемый иммунофлуоресцентный анализ с временной задержкой. Метки с длительным временем жизни люминесценции позволяют существенно повысить чувствительность метода, предоставляют возможность автоматизации процесса анализа. Именно к таким меткам относятся разработанные реагенты.

Определение принципиальных возможностей применения разрабатываемых реагентов в иммуноанализе биологических загрязнений могло быть осуществлено на примере соединений, которые имеют в своем составе метоксикарбонильные группы, отделенные от хромофорной и лигандной частей молекул дифторметиленовыми ножками - спейсерами (СРг)4. Известно, что алкоксикарбонильные группы полифторированных кислот энергично взамодействуют с аминами даже на холоде с образованием амидных групп. В связи с такой особенностью эфиров

фторированных кислот оказалось возможным использовать полученные соединения и наночастицы для конъюгирования с белковыми молекулами, которые при рН 7 и более содержат несвязанные аминогруппы, вступающие в химические взаимодействия с электрофильными реагентами.

о

и

+ Н3С-0 {CF2)4

о II

NHC-(CF2)4-

Рис.13. Взаимодействие метки на основе эфира фторированной кислоты с аминогруппой белка В качестве маркера белковых молекул использовался тетракетодиэфир на основе карбазола 13, имеющий люминесцентно -спектральные характеристики, позволяющие регистрировать его в приборах с возбуждением в области 380 нм и более.

Для получения конъюгатов белков (стрептавидин, а также иммуноглобулин G) с тегракетодиэфиром 13 использовали избыток лиганда. Реакция осуществлялась в течение 2 часов при комнатной температуре в натрий-фосфатном буфере pH 8,0. После проведения реакции конъюгирования отделяли несвязавшуюся метку от образовавшегося конъюгата с помощью гель-хроматографии. Полученные в результате разделения фракции оценивались по спектрам поглощения, и на основе значений оптической плотности белка и флуорохрома в основных максимумах поглощения рассчитывали степень мечения фракций (F/P, отношение концентраций флуорохрома к белку).

Таблица 3 - Люминесцентно-спектральные характеристики конъюгата стрептавидина с хелатом европия на основе 13 («Varioscan

№ фракции Сбсдка, мкМ г ^лиганда, мкМ F/P 13806'5, отн.ед., при соотношении лиганд:Еи:ТОФО

1:1:- 1:1:2 1:1:2+Тритон Х-100 1:4:* 1:8:*

1 1,5 5,3 3,53 10 450 600 3700 5000

2 6,1 9,8 1,60 20 220 700 24000 26000

3 4,2 13,7 3,26 50 2160 1300 10200 9700

4 1,2 1,7 1,42 н/о н/о н/о 100 2300

фон - - - 65 38 - 93 1897

получены на Varioscan Flash при A.B0,6 385 нм, ХэМ 615 нм, tjOJ ме, tg 1,0 мс

Оптимум люминесценции выявляли для каждой фракции конъюгатов, варьируя концентрации Еи3+ и синергического агента ТОФО.

Соответствующие данные для конъюгата стрептавидина приведены в табл. 3, выход по белку составил -100%, выход по лиганду -7,6%.

Люминесценция комплексов полученных конъюгатов достаточно высока и свидетельствует о существовании в них ковалентного связывания метчика с белком. Полученные конъюгаты по своим свойствам могут применяться для маркирования биоспецифичных взаимодействий, и такое аналитическое определение было проведено на примере фракции 3 стрептавидинового конъюгата с максимальной степенью мечения и достаточным уровнем люминесценции.

Конъюгат был апробирован в методике иммунологического анализа холерного токсина, проведенного с захватывающими антителами, находящимися на поверхности микрочастиц, нагруженных комплексом копропорфирина с Р1 (II) (1Ч-КП). и проявлением иммунокомплекса с биотинилированными антителами стрептавидином, меченым комплексом Ей (в проведении эксперимента участвовала н.с. ГосНИИБП Смирнова В.Г.). Схема анализа приведена на рис.14,

Рис. 14. Схема иммуноанализа

На рисунке 15 приведены результаты иммуноанализа. Наличие характерной люминесценции европия на 615 нм (синий спектр) позволяет сделать вывод об определении в анализируемой пробе искомого аналита -холерного токсина, что показывает применимость разработанных меток для анализа биозагрязнений в экологическом анализе (Регистрация: Varioscan Flash, td 0,05 мс, tg 0,2 мс, Xao-l6 385 нм.).

[ ога.ед.

/„да!

Рис. 15. Спектр эмиссии люминесценции (синий спектр -образованный иммунокомплекс, проявленный стрептавидином, меченым комплексом 13-Еи-ТОФО; зеленый спектр - контроль без антигена)

Для апробации возможностей применения разработанных наночастиц использовали прямой вариант иммуноанализа, при котором детекция сорбированного антигена осуществляется непосредственно с помощью специфичных антител, конъюгированных с меткой. В качестве антигена использовался кролика, в качестве проявляющего антитела -анти^С кролика. Предварительное маркирование антикв осуществлялось поливинилкарбазольными частицами, допированными комплексом лиганда 4, содержащим метоксикарбонильную группу. Конъюгация проводилась в среде Трис-буфера рН 7,3 в течение 20 часов. Полученный конъюгат был заблокирован раствором БСА для предотвращения неспецифичных взаимодействий с материалом подложки. После получения конъюгата частиц с белком проводили иммуноанализ.

Таблица 4 - Значения люминесценции системы кроличья сыворотка -

анти1°Р кролика, меченного наночастицами

Разведение сыворотки Исх. 1/10 1/102 1/103 1/104 1/103 1/106 1/107 фон

Сигнал, отн.ед. 16115 17352 14261 10451 6738 9986 3471 3768 1169

Концентрация 1«С в 1 мкл 20 мкг 2 мкг 0,2мкг 20 нг 2 нг 200пг 20 пг 2 пг

Люминесценцию полученного иммунокомплекса измеряли на регистраторе фосфоресценции "Диагем" в "сухих пятнах". Результаты эксперимента, представленные в таблице 4, свидетельствуют о том, что люминесцентный сигнал надежно регистрируется даже при определении в концентрации 2хЮ"13г/мкл.

Результаты эксперимента, представленные в таблице 4, свидетельствуют о том, что люминесцентный сигнал надежно регистрируется при определении в концентрации 2х10'13г/мкл. По полученным данным можно судить о том, что в реализованном процессе иммунного взаимодействия маркирующие наночастицы несущественно влияют на биоспецифичность связывания реагентов, что позволяет проводить анализ без значительной потери активности иммуноглобулинов.

Глава 3. Экспериментальная часть

В главе приведены экспериментальные методики проведения синтезов фторсодержащих бензо- и дибензогетероциклических 1,3-дикарбонильных соединений. Приведены табулированные спектральные данные и данные элементного анализа, подтверждающие строение и состав полученных соединений. Дано описание условий экспериментов по изучению люминесцентно-спектральных и комплексообразующих свойств изучаемых лигандов. Приведены прописи синтеза полученных в работе нанодисперсий. Описаны биохимические методики проведения экспериментов по апробиробации разработанных реагентов для анализа биологических загрязнений. Даны характеристики приборов, использованных в работе.

Выводы:

1. В результате проведения систематического исследования методов получения, люминесцентно-спектральных, комплексообразующих свойств ряда фторсодержащих Р-дикарбонильных бензогетероциклических соединений разработаны новые реагенты для иммунофлуоресцентного анализа биологических загрязнителей.

2. Определены оптимальные условия получения фторсодержащих р-дикарбонильных бензогетероциклических соединений, получено несколько новых представителей этого ряда соединений. В том числе синтезированы новые соединения, содержащие подшивочные метоксикарбонильные группы, отделенные от хромофорных групп дифторметиленовыми ножками-спейсерами (Ср2)4.

3. При изучении комплексообразования фторсодержащих р-дикарбонильных бензогетероциклических соединений с лантаноидами выявлены оптимальные соотношения аддендов в комплексах, определяющие их максимальную люминесценцию. Проведена оценка зависимости люминесценции комплексов от природы используемого фосфорсодержащего синергического агента, определена устойчивость люминесценции комплексов в течение времени.

4. Методами ковалентного связывания, а также сорбционными методами получены активно флуоресцирующие частицы нанопараметрового размера, содержащие флуорогены ряда фторсодержащих Р-дикарбонильных бензогетероциклических соединений.

Оценены люминесцентно-спектральные свойства дисперсий наночастиц и выбраны наиболее перспективные из них для последующего мечения белковых молекул.

5. При проведении маркирования белковых молекул получены новые вспомогательные реагенты для иммунофлуоресцентного анализа биоспецифических взаимодействий, содержащие фторсодержащие р-дикарбонильные бензогетероциклические соединения.

6. Разработанные конъюгаты апробированы в иммунофлуоресцентном анализе. Показана возможность проведения иммуноанализа в системе кроличья сыворотка - aHTHlgG кролика, меченного наночастицами. Результаты иммуноанализа холерного токсина, проведенного с захватывающими антителами, находящимися на поверхности микрочастиц, нагруженных Pt-КП, и проявлением иммунокомплекса с биотинилированными антителами стрептавидином, меченым комплексом Ей, показывают применимость разработанных меток для анализа биологических загрязнений.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации, где вклад автора составляет 50% и более:

Статьи в журналах из перечня ВАК:

1. Кострюкова Т.С. Новые комплексы европия для иммунофлуоресцентного анализа биоспецифических взаимодействий / Кострюкова Т.С., Васильев Н.В., Ивановская Н.П., Затонский Г.В., Осин Н.С. // Вестник МГОУ, серия "Естественные науки" - 2009 - №4. - С.33-40.

2. Кострюкова Т.С. Квантовохимические расчеты комплексообразующих фторированных дибензосодержащих р-дикетонов/ Свердлова Н.Д., Станкявичюс P.P., Романов Д.В., Кострюкова Т.С., Васильев Н.В. // Вестник МГОУ, серия "Естественные науки".- 2010, №4. - с.107-113.

3. Кострюкова Т.С. Перспективы развития химических реагентов для иммунофлуоресцентного анализа и клинической диагностики заболеваний"/ Кострюкова Т.С., Васильев Н.В. // Вестник МГОУ, серия "Естественные науки" - 2011 - №5,- с.54-59.

4. Кострюкова Т.С. Синтез и люминесцентно-спектральные свойства фторированных бензогетероциклических р-дикетонов и их комплексов с европием"/ Кострюкова Т.С., Ивановская Н.П., Лямин А.И., Романов Д.В., Осин Н.С., Затонский Г.В., Васильев Н.В. // ЖОХ - 2012 - т.82 (3).

Статьи в сборниках материалов конференций:

1. Кострюкова Т.С. "Разработка наночастиц для иммунофлуоресцентного анализа"/ Кострюкова Т.С., Ивановская Н.П., Васильев Н.В. // Сборник материалов международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы биоэкологии", Москва, 2008г. М. МГОУ. -2008. -С. 30-32

2. Кострюкова Т.С. Новые реагенты и методы иммунофлуоресцентного анализа для обнаружения опасных биологических материалов в экологическом мониторинге"/ Кострюкова Т.С., Васильев Н.В., Осин Н.С., Ивановская Н.П., Романов Д.В. // Международный симпозиум "Экология арктических и приарктических территорий", Архангельск, 610 июня 2010г. - Архангельск. - 2010. - С.162-165

3. Кострюкова Т.С. "Новые бензогетероциклические маркеры ß-дикетонатного ряда для экологического мониторинга'ТКострюкова Т.С., Васильев Н.В., Осин Н.С., Ивановская Н.П., Романов Д.В. //Сборник материалов международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы биоэкологии", Москва, 26-28 октября 2010г. М. МГОУ. -2010. - С.191-193

4. Кострюкова Т.С. Изучение комплексообразования гетероциклических ß-дикетонов физико-химическими методами'ТКострюкова Т.С., Свердлова Н.Д., Ибрагимова А.Д., Васильев Н.В.//Материалы 2-ой научной региональной конференции с международным участием "Химия 2011. Физическая химия. Теория, эксперимент, практика", Коломна, 26-27 мая 2011г. Коломна. - 2011. - С. 124-127

5. Свердлова Н.Д.. Комплексы европия (III) с фторированным ß-дикетоном и трифенилфосфиноксидом"/ Свердлова Н.Д., Кострюкова Т.С., Байкова О.И.//Сборник материалов научной конференции преподавателей, аспирантов и молодых ученых московской области, посвященной 300-летию М.В. Ломоносова и 80-летию МГОУ, Москва, 1-2 декабря 2011г. М. МГОУ. -2011. - С.16-21

6. Кострюкова Т.С. Комплексообразование дибензогетероциклических тетракетонов с металлами"/ Кострюкова Т.С., Ивановская Н.П., Васильев Н.В. //Сборник материалов научной конференции преподавателей, аспирантов и молодых ученых московской области, посвященной 300-летию М.В. Ломоносова и 80-летию МГОУ, Москва, 1-2 декабря 2011г. М. МГОУ. -2011. - С.31-34

Тезисы докладов на конференциях:

7. Кострюкова Т.С. Новые реагенты для иммунофлуоресцентного анализа/ Кострюкова Т.С., Ивановская Н.П., Васильев Н.В., Романов Д.В., Затонский Г.В. // Тезисы докладов международной конференции

"Органическая химия для медицины", Черноголовка, 7-11 сентября 2008г. -Интерконтаюг Наука.- 2008. - С.127

8. Кострюкова Т.С. "Фторсодержащие тетракетоны для иммунофлуоресцентного анализа"/ Кострюкова Т.С., Ивановская Н.П., Васильев Н.В., Затонский Г.В., Осин Н.С7/ Тезисы докладов VIII всероссийской конференции "Химия фтора", Черноголовка, 22-25 ноября 2009г. - Интерконтакг Наука. - 2009. - С. 55

9. Кострюкова Т.С. Новые аналитические реагенты и методы иммунофлуоресцентного анализа"/ Кострюкова Т.С., Осин Н.С., Ивановская Н.П., Романов Д.В., Васильев Н.В.// Сборник материалов VIII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика 2011" Архангельск, 26 июня - 2 июля 2011г. -Архангельск. - 2011. - С. 151

Ю.Свердлова Н.Д. Комплексообразование Еи3+ с фторированным ¡}-дикетоном в присутствии трифенилфосфиноксидом в водном растворе"/Свердлова Н.Д., Кострюкова Т.С. //Тезисы докладов XI Международной конференции «Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах», Иваново, 10-14 октября 2011г. -Иваново.-2011,- С.71-72

11.Кострюкова Т.С. "Люминесцирующие комплексы фторированных гетероциклических Р-дикетонов с лантаноидами в водных растворах"/ Кострюкова Т.С., Свердлова Н.Д., Ивановская Н.П., Осин Н.С., Васильев Н.В.// Тезисы докладов XI Международной конференции «Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах», Иваново, 10-14 октября 2011г.-Иваново. - 2011.- С. 181-182.

Подписано в печать: 20.02.2012 г. Бумага офсетная. Гарнитура «Times New Roman». Печать офсетная. Формат бумаги 60/86 ^б.Усл. пл. 1,5. Тираж 130 экз. Заказ № 260.

Изготовлено с готового оригинал-макета в профессиональном центре КОПИМАСТЕР. г.Москва, Калужская площадь, д.1, к.1.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Кострюкова, Татьяна Сергеевна, Москва

61 12-2/287

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ОБЛАСТНОЙ УНИВЕРСИТЕТ» ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРИБОРОСТРОЕНИЯ

На правах рукописи

Кострюкова Татьяна Сергеевна

ФТОРСОДЕРЖАЩИЕ РДИКАРБОНИЛЬНЫЕ БЕНЗОГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА БИОЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ

03.02.08 - экология (химические науки)

Диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук

Научный руководитель доктор химических наук, профессор Н.В. Васильев

Москва -

2011

Содержание

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИИ И

ОБОЗНАЧЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 7

ГЛАВА 1. АНАЛИЗ ЛИТЕРАТУРНЫХ СВЕДЕНИЙ 12

1.1 Основные виды люминесцентных меток в иммунофлуоресцентном анализе 12

1.2 Метки, содержащие флуорогены и реализующие быструю люминесценцию 13

1.2.1 Реагенты, применяемые в иммунофлуоресцентных методах с " временной задержкой 22

1.2.2 Метки, используемые в методе ЛИФА 24

1.3 Фторированные р-дикетоны 41

1.3.1 Основные методы получения фторированных (3-дикетонов и их некоторые свойства 43

1.3.2 Комплексообразование фторсодержащих [3-дикетонов с лантаноидами и люминесценция 48

ГЛАВА 2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 60

2.1 Разработка методов получения фторированных р~

дикарбонильных бензогетероциклических соединений 60

2.1.1 Получение бензогетероциклических фторированных (3-дикетонов 60

2.1.2 Получение дибензогетероциклических фторированных р-дикетонов 65

2.1.3 Модификация фторсодержащего тетракетодиэфира 75

2

2.2 Люминесцентно-спектральные свойства фторированных дикетонов и их комплексов 77

2.2.1 Комплексы с европием 77

2.2.2 Влияние фосфорсодержащих синергистов на люминесценцию комплексов и устойчивость во времени 87

2.2.3 Комплексообразование дибензогетероциклических тетракетонов с металлами 90

2.3 Разработка методов получения люминесцирующих микро- и нанодисперсий на основе Р-дикетонов 92

2.3.1 Ковалентное введение фторированных (3-дикарбонильных фрагментов в матриксы 93

2.3.2 Сорбционное введение фторированных (3-дикарбонильных фрагментов и комплексов в матриксы 108

2.4 Оценка возможности использования фторированных бензогетероциклических 1,3-дикарбонильных реагентов в иммунофлуоресцентном анализе 116

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 128

Химические реагенты 128

Экспериментальная часть к разделу 2.1 129

Экспериментальная часть к разделу 2.2 145

Экспериментальная часть к разделу 2.3 148

Экспериментальная часть к разделу 2.4 151

ВЫВОДЫ ПО РАБОТЕ 155

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 157

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

АА - ацетилацетон

АНС - 1-фениламино-8-хлорсульфонилнфталин

БТА - бензоилтрифторацетон

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГМП - гексаметапол, фосфорной кислоты гексаметилтриамид

ГФАА - 1,1,1,5,5,5-гексафторацетилацетон

ГФДМО - 1,1,1,2,2,3,3-гептафтор-7,7-диметилоктан-4,6-дион

ДАКМ- >Ц7-диметиламино-4-метил-2-окси-3 -хроменил)малеимид

ДАНС - 1-диметиламино-5-хлорсульфонилнафталин

ДБМ - дибензоилметан

ДБСО -Дибензилсульфоксид

ДЕТ - дибензотиофен

ДБФ - дибензофуран

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДПМ - дипивалоилметан

ДТПА - диэтилентриаминпентауксусная кислота

ДФБМ - ди(р-фторбензоил)метан

ЛИФА - лантанидный иммунофлуоресцентный анализ

НСМО - низшая свободная молекулярная орбиталь

HTA- 2-нафтоилтрифторцетон

ПАВ - поверхностно-активное вещество

ПВК - поливинилкарбазол

ПВС - поливиниловый спирт

ПТП - 3 -пивалоил-1,1,1 -трифторпропанон-2

ПФГ - 1,1,1,2,2-пентафторгексан-3,5-дион

ПФДМГ - 1,1,1,2,2-пентафтор-6,6-диметилгептан-3,5-дион

ПФТД - 1,1,1,2,2-пентафтортетрадекан-2,4-дион

ПФФП - 1,1,1,2,2-пентафтор-5-фенилпентан-3,5-дион РЗЭ - редкоземельные элементы РИТЦ - родамин изотиоцианат

ТКДЭ - метил-8-[4-(4,4,5,5,6,6,7,7-октафтор-8-метокси-3,8-диоксооктаноил)-

9Н-карбазол-3-ил]-2,2,3,3,4,4,5,5-октафтор-6,8-диоксооктаната

ТОФО - триоктилфосфиноксид

Трис - трис-(гидроксиметиламинометан)-НС1;

ТТА - теноилтрифторацетон

ТТГ - тиреотропный гормон человека

ТГС - тетрагидросульфон, сульфолан

ТГФ - тетрагидрофуран

ТФАА- 1,1,1-трифторацетилацетон

ТФМГ - 1,1,1 -трифтор-6-метилгептан-2,4-дион

ТФТД -1,1,1 -трифтортридекан-2,4-дион

ТФФО - трифенилфосфиноксид

ТЭФ - триэтилфосфат

ФБТА - р-фторбензоилтрифторацетон

ФИА - флуоресцентный иммуноанализ

ФИТЦ - флуоресцеин изотиоцианат

ФК - фосфорная кислота

ФТА - 2-фураноилтрифторацетон

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Bipy - бипиридил

D - оптическая плотность, отн.ед.

DCC - карбодиимид

DELFIA - Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent Immunoassay

Ig G - иммуноглобулин G

NBD - 7-хлор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазол

Phen - фенантролин

с - коэффициент молярной экстинкции

I - интенсивность люминесценции, отн.ед.

А, - длина волны света

А,пог„- длина волны поглощения

Я,в03б - длина волны возбуждения люминесценции

А,эм - длина волны эмиссии люминесценции

1с) - время задержки регистрации эмиссии люминесценции в стробоскопическом режиме

^ - время регистрации эмиссии люминесценции в стробоскопическом режиме

т - постоянная времени жизни возбужденного состояния (время жизни люминесценции)

Введение

Обнаружение опасных биологических материалов - прионов, вирусов, риккетсий, бактерий, грибов, простейших и других биологических инфекционных загрязнителей, а также токсинов у людей, животных, растений, в объектах окружающей среды следует рассматривать как важный элемент системы обеспечения экологической безопасности. Одно из наиболее перспективных направлений экологического анализа связано с выявлением искомых загрязнителей на основе методов биоспецифического взаимодействия, и, прежде всего, с иммуноанализом с флуоресцентным способом детекции сигнала Такого взатмодействия. Для флуоресцентного иммуноанализа (ФИА) известно применение олигобензоциклических и гетероциклических соединений, которые относятся к ряду ксантена, нафталина, антрацена, пирена, кумарина, порфирина, цианиновых красителей и т.д. Многие из них используются и в настоящее время. Применяемые соединения удовлетворяют следующим основным требованиям: высокая эффективность поглощения света; высокий квантовый выход, большое разнесение полос возбуждения и эмиссии; достаточно большое время жизни возбужденного состояния; метка, как правило, должна содержать функциональную группу для связывания ее с белками [1, 2]. Большое распространение в последние десятилетия получили методы ФИА, основанные на использовании комплексов гетероциклических соединений с металлами. Среди них наиболее известны порфириновые комплексы благородных металлов (Р1:, Рс1) и комплексы лантаноидов (Ей, ТЬ, Бш, Бу). Существенными преимуществами этих реагентов являются большие времена жизни в возбужденном состоянии (порядка десятков и сотен мкс), что позволяет реализовать методики регистрации флуоресценции с временной задержкой, и, таким образом, исключить фоновое влияние собственной люминесценции биологического материала проб и материалов подложки (пластика планшета), в результате чего пороговый уровень детекции

люминесцентных меток повышается на 2-3 порядка. Аналитические методики, основанные на применении лантанидных комплексов сгруппированы в методе ЛИФА - лантанидом иммунофлуоресцентном анализе, в котором существующие диссоциативные и недиссоциативные технологии базируются на детектировании комплексов фторированных (3-дикетонов с лантаноидом. Наиболее часто используются комплексы Еи3+. В настоящее время чувствительность методик ЛИФА достигает 10"14 моль/л, однако для многих целей экологического анализа даже такая чувствительность не является удовлетворительной. В частности, многие патогены, токсины, а также и абиотические экотоксиканты представляют опасность и в меньших концентрациях, особенно при продолжительных воздействиях. Большие возможности по увеличению чувствительности методов ЛИФА предоставляет совершенствование их приборной реализации, вместе с тем, создание новых эффективных комплексообразующих реагентов ряда фторированных |3-дикетонов, увеличивающих чувствительность экологического анализа, является актуальным. Актуальность темы исследования проистекает из следующих причин. Во-первых, для практического использования люминесцентных методик в экологическом анализе целесообразным является применение дешевых источников возбуждения и средств регистрации, что может быть достигнуто только при реализации методик с применением хромофоров с длинноволновым возбуждением (380-400 нм). Метки, содержащие такие хромофоры в методе ЛИФА, а также в других люминесцентных методиках с временной задержкой, разработаны слабо [3]. Во-вторых, увеличение устойчивости комплексов Еи3+, в сравнении с используемыми в настоящее

7 1

время (~10_/ М ), должно приводить к симбатному увеличению

чувствительности экологического анализа. Таким образом, получение более

эффективных хелатов, также как и выявление оптимальных условий

комплексообразования чрезвычайно целесообразны для повышения

чувствительности методик и снижении стоимости анализа. В-третьих,

8

диссоциативные варианты иммунофлуоресцентного анализа, в частности, широко реализованный в клиниках метод «БЕГЛА» [4], предполагает использование стадии перекомплексообразования ионов лантаноидов и не пригоден для многих методик прямого мечения и, в том числе, для мультикомпонентного определения экотоксикантов в одной пробе. В связи с этим, перспективна разработка реагентов, имеющих возможность для конъюгирования с белковыми молекулами посредством активных функциональных групп, отделенных от комплексообразователя специальной инертной "ножкой" - спейсером. Эти же реагенты могут быть полезными для создания флуоресцирующих частиц нанопараметрового размера для усиления сигнала люминесценции.

Фторированные (3-дикетоны следует также рассматривать как весьма перспективные реагенты для определения ионов металлов в природных средах и для аналитического контроля в производственных отходах. Следовательно, создание фторсодержащих |3-дикетонов с улучшенными параметрами востребовано для решения широкого спектра практических задач в области экологии.

Настоящая работа посвящена разработке фторсодержащих (3-дикарбонильных бензогетероциклических соединений как аналитических реагентов, которые могут использоваться в экологическом анализе.

Целью настоящего исследования является разработка фторсодержащих Р-дикарбонильных бензогетероциклических реагентов, удовлетворяющих требованиям современного иммунофлуоресцентного анализа биозагрязнителей.

В соответствии со сформулированной целью в работе были поставлены следующие задачи:

• На основе анализа литературных сведений, касающихся современного состояния люминесцентного анализа, выбрать объекты изучения среди аналитических реагентов с оптимальным комплексом свойств,

определяющих перспективы их дальнейшего практического использования.

• Исходя из анализа литературы, а также собственных экспериментальных данных, определить оптимальные условия получения фторсодержащих (З-дикарбонильных бензогетероциклических соединений, осуществить их синтез, изучить особенности строения и физико-химические свойства.

• Изучить комплексообразование полученных комплексонов с лантанидами, а также ионами других металлов, представляющих интерес в экологическом плане, оценить люминесцентно-спектральные свойства образующихся комплексов. Разработать методы получения фторсодержащих (З-дикарбонильных бензогетероциклических синтонов, имеющих активные функциональные группы, пригодных для создания флуоресцирующих наночастиц, а также для введения в белковые молекулы.

• Провести мечение белковых молекул фторсодержащими (3-дикарбонильными бензогетероциклическими соединениями и оценить возможности использования полученных конъюгатов для иммунофлуоресцентного анализа биоспецифических взаимодействий.

• Разработать методы получения флуоресцирующих частиц нанопараметрового размера на основе ковалентного, а также сорбционного принципов введения разрабатываемых флуорогенов. Оценить люминесцентно-спектральные свойства дисперсий наночастиц, выбрать наиболее перспективные из них для последующего мечения белковых молекул. Определить возможности конъюгации разрабатываемых наночастиц с белками и их применимость для целей иммунофлуоресцентного анализа биоспецифических взаимодействий.

Диссертационная работа включает в себя исследования, выполненные

методами органической химии, физико-химическими и биохимическими

10

методами, а также содержит элементы нанохимических технологий, в связи с этим, аналитический обзор посвящен основным работам в области флуоресцентного иммуноанализа, а также методам получения и основным свойствам фторированных (3-дикетонов. Необходимые литературные сведения приводятся также и в начале других разделов, предваряя обсуждение экспериментальных результатов.

Порядок изложения диссертационной работы, список оформления литературных источников соответствуют правилам оформления, принятым для работ, публикующихся в ведущих отечественных и зарубежных журналах синтетического направления.

Глава 1. Анализ литературных сведений

Существуют достаточно полные обзоры по иммунофлуоресцентному анализу, приведенные в работах [3, 5-7]. В связи с этим, в данной главе освещены только основные сведения, позволяющие определить перспективы направлений разработки фторированных [3-дикарбонильных ароматических и гетероароматических соединений, как одного из наиболее эффективных типов реагентов для иммунофлуоресцентного анализа, а также и в других областях их потенциального применения.

В настоящем обзоре не анализируются данные по свойствам и применению комплексных соединений на основе порфиринов и фталоцианинов и других лигандов, применяющихся в иммунофлуоресцентном анализе. Эта обширная область люминесцирующих соединений чрезвычайно подробно разработана, в том числе и в направлении создания реагентов для иммунофлуоресцентного анализа и изложена в ряде зарубежных и отечественных обзоров [3, 6, 8-11].

Отдельно рассмотрены методы получения фторированных |3-дикарбонильных соединений и их некоторые свойства.

1.1 Основные виды люминесцентных меток в иммунофлуоресцентном анализе

При проведении иммунофлуоресцентного анализа используется следующий общий принцип: при облучении образца «пучком» электромагнитного излучения метка, маркирующая акт биоспецифического взаимодействия, переходит в возбужденное состояние и затем излучает квант с длиной волны большей, чем длина волны возбуждения. Выбор метки чрезвычайно важен, поскольку достигаемый аналитический эффект не должен маскироваться собственным свечением и рассеянием биологического материала, а также образцом полимерной подложки - пластика планшета. Требования к флуоресцентной метке могут быть в общем виде

сформулированы следующим образом. Идеальная флуоресцентная метка должна высокоэффективно поглощать свет - молекулярная экстинкция г > 105 Мсм"1; иметь высокий квантовый выход; различие между длинами волн возбуждения и флуоресценции должно превышать определенную величину (более 100 нм); обладать низкой неспецифической сорбцией на белках и поверхностях; иметь определенную растворимость в воде, быть достаточно устойчивой фотохимически и термодинамически. Для недиссоциативных вариантов иммуноанализа возникают дополнительные требования: наличие активной функциональной группы для ковалентного связывания с белками, а также оптимальным является наличие ножки-спейсера, разделяющей функциональную группу и люминесцирующий хромофор. Длительное время жизни флуоресцентной метки в возбужденном состоянии - порядка десятков и сотен микросекунд - является необходимым условием для кардинального повышения чувствительности современного иммунофлуоресцентного анализа [3,7].

1.2 Метки, содержащие флуорогены и реализующие быструю люминесценцию

Наибольшее распространение на первоначальном этапе развития иммунофлуоресцентного анализа получили метки для визуальной детекции на основе ксантеновых красителей - производных 9-фенилксантена. Наиболее известными являются флуоресцеин изотиоцианат (1) (ФИТЦ), родамин изотиоцианат (2) (РИТЦ) и другие [6, 12-13] (схема 1). Эти соединения до сих пор практически применимы в медико-биологической практике. Мечение этими соединениями осуществляется за счет присоединения тиоизоцианатной группы к нуклеофильным группам -главным образом аминным группам биологических молекул, реже упоминается присоединение по тиоловым группам, еще реже - по гидроксильным. Такое присоединение достаточно эффективно

осуществляется в водны