Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиметиленовые производные нуклеиновых оснований с φ-функциональными группами. Синтез и свойства

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Полиметиленовые производные нуклеиновых оснований с φ-функциональными группами. Синтез и свойства"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

Комиссаров Всеволод Владимирович

ПОЛИМЕТИЛЕНОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ НУКЛЕИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ С со-ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ ГРУППАМИ. СИНТЕЗ И СВОЙСТВА.

03.00.03 - Молекулярная биология и 02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени «Аидидета химических наук

ОБЯЗАТЕЛЬНЫЙ

БЕСПЛАТНЫЙ

Москва-2005

Работа выполнена в Лаборатории химических основ биокатализа Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга Российской академии наук.

Научный руководитель: кандидат химических наук А.М. Крицын Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Т С. Орецкая,

Химический факультет Московского государственного университета им М.В Ломоносова.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. академиков М М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В. А Энгельгардга РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А. Энгельгардга РАН

доктор химических наук С.Н. Михайлов заведующий Лабораторией стереохимии ферментативных реакция Института молекулярной биологии им. В. А Энгельгардга

РАН

Защита диссертации состоится «_»

2006 г. в_ч. на заседании

Автореферат разослан «_»

2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат химических наук

АМ. Крицын

löoGQ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Полиметиленовые прошводные нуклеиновых оснований с о- функциональными группами обладают широким спектром биологической активности. В ряде случаев полиметиленовая цепь таких соединений моделирует остаток 2'-дезоксирибозы, делая их структурно подобными нуклеозидам и нуклеотидам Среди негликозидных ациклических аналогов нуклеозидов обнаружены эффективные ингибиторы различных ферментов нуклеинового обмена. Однако довольно часто участки связывания нуклеинового основания и фосфата в активном центре фермента находятся на более значительном расстоянии, что отражается на структуре ингибиторов. В этих случаях длина полиметиленового спейсера в молекуле эффектора достигает 8-9 звеньев (8-10 Ä) Отдельные представители указанного класса соединений являются мощными ингибиторами HSVI и HSVTI тимидинкиназ in vitro-, тимидинфосфорилазы E.coli, обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ, пуриннуклеозидфосфорилазы и др.

Выявлены гидрофобные производные 2-тиоурацила, эффективно ингибирующие липопротеин зависимую Aj фосфолипазу - фермент, вовлеченный в развитие атеросклероза

Большая группа липофильных производных пурина, обладающих значительной активностью, была выявлена при разработке антипсихотических агентов, не вызывающих экстрапиримидальных побочных эффектов

К веществам, стимулирующим иммунную систему, действуя на Т-лимфоциты, относятся соединения, в которых остаток аргинина отделен от пуринового остатка полиметиленовой цепью длиной в пять углеродных атомов

Липофильность молекулы соединения зачастую способствует его проникновению через клеточную мембрану Липофильные пролекарственные формы (производные по 5'-ОН-группе) зидовудина (AZT) - одного из основных препаратов, используемых для подавления репликации ВИЧ - имеют в культурах клеток ECjo в 50 раз меньшее, чем AZT.

В связи с вышеперечисленным представляются актуальными исследования свойств новых полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевыми функциональными группами

Цель исследования. Целью данной работы являлась разработка удобных методов получения новых полиметиленовых производных нуклеиновых оснований, в которых

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

концевая ß-дикарбонильная группа или фенилкетогруппа отделена от остатка пуринового или пиримидинового основания цепью варьируемой длины, синтез соединений указанного строения и изучение их свойств.

Научная новизна работы. Разработаны удобные методы синтеза ранее не описанных полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевой ß-дикарбонильной группой Среди указанных соединений выявлены производные, способные в микромолярных концентрациях ингибировать обратную транскрилтазу ВИЧ

Показано, что для синтеза полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевой фенилкетогруппой с успехом может быть применено прямое алкилирование нуклеиновых оснований, однако в ряде случаев кетогруппа алкилирующего реагента должна быть защищена. В ряду соединений указанного строения обнаружены производные, обладающие нейролептической активностью Практическая ценность работы. Разработаны удобные методы синтеза полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевой ß-дикарбонильной и фенилкето-группами Выявленные в ходе работы закономерности могут быть использованы для синтеза новых полиметиленовых производных с другими концевыми функциональными группами.

Обнаружены новые неконкурентные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ Причем легкореализуемая возможность плавного изменения геометрии молекулы эффектора за счет длины полиметиленовой цепи делает указанные соединения удобными инструментами для изучения ОТ ВИЧ

В экспериментах на лабораторных животных выявлены производные, обладающие выраженным нейролептическим действием.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на двух ежегодных научных конференциях аспирантов Института молекулярной биологии им В. А Энгельгардга РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части и выводов. Диссертация содержит 17 схем, 3 рисунка и 15 таблиц. Список цитированной литературы включает 117 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературные данные о способности полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевыми функциональными группами выступать ингибиторами различных ферментов свидетельствуют о большом потенциале исследований, направленных на изучение новых представителей этого класса веществ

Ранее в лаборатории химических основ биокатализа ИМБ РАН были синтезированы полиметиленовые производные нуклеиновых оснований с концевыми гидроксильными, карбоксильными и карбалкоксильными группами, среди которых обнаружены соединения, ингибирующие или активирующие обратную транскриптазу ВИЧ

В рамках данной работы нам представлялось важным получить и изучить свойства полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевыми р-дикарбонильной и фенилкего-группами.

Синтез полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевой р-дикарбонильной группой.

На основании литературных данных и работ, ранее проведенных в нашей лаборатории, для получения полиметиленовых производных с концевыми функциональными группами целесообразно применение прямого алкилирования нуклеиновых оснований, поскольку этот метод приводит к хорошим выходам целевых соединений, не требуя использования труднодоступных или дорогостоящих прекурсоров нуклеиновых оснований и выполнения многостадийных синтезов К достоинствам прямого алкилирования нуклеиновых оснований можно также отнести то, что наряду с продуктами ^-алкилирования для пиримидиновых оснований и V-алкилирования для пуриновых оснований, реакция в ряде случаев приводит к минорным продуктам, боковая цепь которых находится в положении, отличном от природного Указанное обстоятельство позволяет без дополнительных усилий расширить спектр исследуемых потенциально биологически активных соединений

Представлялось важным синтезировать и изучить свойства соединений, в которых остаток нуклеинового основания отделен от концевой функциональной группы гидрофобным полиметиленовым спейсером варьируемой длины, от 6 до 8 метиленовых звеньев В качестве концевой функциональной группы была выбрана р-дикарбонильная, так как хорошо известно, что Р-дикетоны в зависимости от рН среды

и природы растворителя находятся преимущественно либо в дикето-, либо в енольной формах (Рис 1 ) Соответственно при определенных условиях они могут эффективно участвовать в образовании водородных связей Кроме того, Р-дикетоны являются прекрасными хелатирующими агентами для ионов двухвалентных и трехвалентных металлов, что обусловливает высокую ингибирующую активность некоторых представителей этого класса, например, в отношении РНК-зависимой РНК полимеразы вируса гепатита С и интегразы ВИЧ-1 В рамках данной работы изучались как производные пиримидиновых нуклеиновых оснований (урацила, тимина, цитозина), так и пуриновых (гипоксантина, аденина, гуанина).

В соответствии с поставленной задачей и выбранным методом создания связи углерод-азот, на первоначальном этапе нами были синтезированы алкилирующие реагенты (1а) - (1с).

Рис.1. Алкилирующие реагенты (1а) - (1с).

В качестве исходных соединений для синтеза (1а) и (1с) мы использовали 1,1,1,7-тетрахлоргептан (теломер С7) и 1,1,1,9-тетрахлорнонан (теломер С9), которые стали доступны после открытия Джойсом и сотр реакции радикальной теломеризации этилена и четыреххлористого углерода. Кислотным гидролизом трихлорметильной группы теломеров, в соответствии с методикой, описанной в работах А Н Несмеянова и его сотрудников, получали т-хлоркислоты. Последующее взаимодействие с хлористым тионилом приводило к хлорангидридам и-хлорэнантовой и ш-хлорпеларгоновой кислот, соответственно (Схема 1):

и Н2804/Н20, А; 0- вОСЬ, А.

Для получения хлорида (1Ь) нам потребовалось синтезировать коммерчески недоступный хлорангидрид ш-хлоркаприловой кислоты Взаимодействием гексаметиленбромгидрина с диэтилмалонатом, последующим гидролизом и декарбоксилированием была синтезирована о-гидроксикаприловая кислот, которая без дальнейшей очистки переводилась взаимодействием с хлористым тионилом в целевой

ап-4 Ьп-5

с 11=6

Схема!.

хлорангидрид (Схема 2) Поскольку гексаметиленбромгидрин был необходим нам в значительном количестве, а его стоимость неоправданно высока, мы синтезировали его, исходя из доступного е-капролактона, используя способность последнего подвергаться алкоголизу в кислых условиях (Схема 2).

Схема 2.

i- MeOH/TosOH; й- PBr3/Et20; ш- LiAlHVEtîO, 0°С; tv- NaOEt/диоксан, А; v- НСШ20 1.1, A; те- 180-190°С; vii- SOCI2/CHCI3

Синтезированные таким образом хлорангидриды со-хлорэнантовой, ш-хлоркаприловой и m-хлорпеларгоновой кислот вводили в реакцию Сторка по методике, аналогичной использованой А.Н Несмеяновым и сотр для получения соединения (1с), с той лишь разницей, что вместо М-циклогексенилпиперидина мы применяли менее реакционноспособный АГ-циклогексенилморфолин (Схема 3).

Схема 3.

Алкилирование нуклеиновых оснований пиримидинового ряда реагентом (1а) проводили в ДМФА в присутствии 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен (ОВЦ) (Схема 4). Реакция при 80-100°С завершалась за 20ч, с хорошими выходами давая целевые моно-алкилированые производные урацила и тимина (Па,Ь). Помимо этого в результате реакции образовывалось небольшое количество продуктов реакции бис-алкилирования (Ша,Ь), которые также выделялись и охарактеризовывались Относительно малый суммарный выход алкилированных продуктов может быть объяснен протеканием побочных реакций между Р-дикарбонильной и хлор-группами алкилирующего реагента (1а) При попытке алкилирования цитозина с использованием ОВи в качестве основания происходило сильное осмоление реакционной смеси, целевой продукт V-алкилирования (Пс) был выделен с низким выходом (6%) Для получения цитозинового

производного (Пс) нами также применялось алкилирование Л^-бензоилцитозина в присутствии ИВи с последующим аммонолизом бензоильной группы В этом случае суммарный выход (Пс) на две стадии составил 27% Однако наиболее высокий выход производного (Пс) был достигнут при введении в реакцию с (1а) №-соли цитозина, предварительно полученной обработкой суспензии цитозина в ДМФА 80% суспензией гидрида натрия в минеральном масле

Схема 4.

а- Я=Н, выход 35% а- Я=Н, выход 3%

Ъ- Л^СН* выход 39% Ъ- К=СН„ выход 4%

и ОВи/ДМФА, 90°С; и- ХаН/ДМФА, 90°С; ш- Шз/МеОН, 20°С.

Выделение и очистку производных (Па-с), (Ша,Ь) проводили хроматографией на колонке с силикагелем УФ-, масс-спектры и данные ЯМР-спектров согласуются с их строением

Для получения производных пуринового ряда нами, в основном, применялось взаимодействие алкилирущего реагента (1а) с нуклеиновыми основаниями в присутствии ОВи (Схема 5).

В случае гипоксантина единственным вьщеленным продуктом алкилирования был //'-замещенный изомер (Пе).

Схема 5.

/- ОВи/ДМФА, 90°С; и- ЫаН/ДМФА, 90°С; Ш- МЩЕЮН/НзО, Д

Апеллирование аденина в присутствии БВи также проходило, в основном, по атому Л*9, что позволило получить соединение (Щ) с выходом 48% УФ-, масс-спектры и данные ЯМР-спектров (табл. 1 и 2) согласуются с его строением. Помимо изомера (Ш), с выходом 5% был выделен более полярный продукт Из спектров ЯМР следовало, что он отличается от Л^-изомера лишь положением боковой цепи при пуриновом ядре Для доказательства строения полученного изомера использовалась двумерная гетероядерная спектроскопия ядерного магнитного резонанса В то время как для Л^-изомера (ТИ) проявлялись дополнительные сигналы, свидетельствующие о спин-спиновом взаимодействии дальнего порядка между атомами С4, С8 и НГ, для минорного продукта наблюдались взаимодействия С2, С4 и НГ, что говорит о том, что заместитель находится при атоме пуринового ядра Дополнительным

свидетельством в пользу положения боковой цепи у атома Л3 является наличие "характерных эффектов алкилирования" в спектрах 13С-ЯМР, описанных в работах Голи по сравнению с

-изомером (Ш) для Л* -изомера (Щ) наблюдается сдвиг сигнала С2 в сильное поле (~9 м.д.) и сигнала С8 в слабое поле (-12 м д.) (см табл 2)

Табл. 1. Данные *Н-ЯМР спектров синтезированных соединений (II).

12* В В* а: урацил-1-ип; Ь'тамин-1-ил; | 2' 4' в' Г | с: цитозин-1-ил, е: пшоксанпш-9-ил; ¡и^4^/44^^^^^^' {■ аденин-9-ип; g адснин-3-ил; ^ ^ .. гуанин^.лл; ^ гуанин-7-ил.

Протоны Соединение (П), 8, м.д.

а ь* с е Г К 1 к

1 Н, Н1 илиЮ 8.99, с 7 99, с - 3 03, с - - 10 58, с 10 75, с

1 Н, Н2 идиН5 5.68, д" - 5.6, д™ 7.85, с 8.13,с 7 77, с - -

1 Н, Нб или Н8 7 14, д" 6.95, с 7.9, д™ 8.18, с 8 12, с 8.34, с 7 67, с 7.88, с

2 Н, 2- МНг или 4- ИНз или б-ЫЦ; - - 6.75, с - 7.14,с 7.15,с 6 42, с 6.10 с

2 Н,/7 16, НГ 3.72, т 3.67, т 3 65, т 4 19, т 4.14,т 4 29, т 3 91, т 4 15, т

8 Н, Н2'-Н5' 1 5-1.7, м 1.5-1.7, И 1 5-1 7, м 1 5-1 7, м 1 5-1 7, а 1 5-1 7, м 1 5-1 7, и 1 5-1 7, м

2 Н, У 7 16, Н6' 2.41, т 2.40, т 2.41, т 2.41, т 2.41, т 2.41,т 2 39, т 2 39, т

1 Н, 9'-ОН 15.91, с 15.90, с 15.90,с 15 91, с 15.91, с 15.92,с 15 95,с 15.96, с

4Н,Н10'иН13' 2 30, м 2.30, и 2 30,и 2 30, м 2 30, м 2.30, м 2 30, м 2 30, м

4 Н, Н1Г иН12' 1.33, и 1.33, м 1.33, м 1.33, и 1.33,к 1.33, м 1 33, м 1 33, м

' Для соединения (ПЪ) сигналы протонов 5-СН3- группы' 1 9, с, 3 Н, СН3; " У 7.8; ""77 7; "" ЯМР-спектры соединений регистрировали в ДМСОч/ь в остальных случаях - в СОС13

Табл. 2. Данные 13С-ЯМР спектров синтезированных соединений (П).

Атомы углерода Соединение (П), 5, м.д.

а ь" с е Г е Г к"

С2 150.9 150.8 156.4 144.5 153.1 143.8 153 4 154.6

С4 163 7 164.1 165.5 149.6 150 3 149.6 151 1 152 7

С5 102.2 107.8 93.8 124.4 117.5 120.5 116.6 108.1

С6 144.5 140.5 141.4 155.7 155 6 154.9 156.9 159.9

С8 - - - 140.2 140.6 152.4 137.4 143 1

С1' 48.9 48.6 50.1 44.2 42.7 49.3 42.6 45.6

С2' 28 9 28.9 28 9 28.9 28.9 28 9 28 1 28 6

СЗ' 24.0 24.0 23.9 24.0 240 241 23.9 23.8

С4' 26.4 26 4 26.5 26.4 26.4 26.4 25.8 26 3

С5' 29.0 29.2 29.0 29.1 29.0 29.2 30.4 30.8

С6' 36.8 36.8 36.8 36.8 36.8 36 8 36.09 36.4

СГ 201.4 2014 201.4 2014 201.5 201.4 2017 2013

С8' 106.9 106.9 106.9 106 9 107.1 106.9 106.6 106 2

С9' 181.8 181.8 181.8 181.8 181.9 181.9 180.7 180 9

СЮ1 31.2 31.2 30 3 31.2 31.0 28.3 29.3 29.7

СИ' 24.0 24.2 24.3 24.1 24.2 24.2 23.4 23.5

С12' 21.8 21.8 21.8 21.8 215 217 21.1 21.3

С13' 23.0 23.1 23.0 23.0 23.1 23.1 22.9 22.9

" Для соединения (ЛЬ) сигнал 5-СНггру1шы: 12.4, £Н3; ** ЯМР-спеетры соединений регистрировали в ДМСО-^б, в остальных случаях - в СОС13

УФ-спектры полученных изомеров также существенно различаются, максимум поглощения ^-изомера (П1) находится при 264 нм, в то время как Л^-изомера (1^) -при 276 нм При рН 14 максимумы поглощения пуринового ядра и

|3-дикетофугосции Л^-изомера сильно перекрываются, образуя плато, и установить

точные значение Хщк весьма сложно (Рис.2).

Рис.2.

Х(нм)

УФ-спектры Л/'-[7-(2-оксоциююгексил)-7-оксогептил]аденина (Ш) рН 7—■—, рН 14—±— и Л'3-[7-(2-оксоциклогексил)-7-оксогептил]аденина рН 7 —0-, рН 14—Д—

Выход ^-изомера несколько увеличивается (с 48 до 55%), а ^-изомера

уменьшается (3%), если алкилировать не аденин, а его натриевую соль, которую

предварительно получали взаимодействием аденина с гидридом натрия в ДМФА

Известно, что реакция алкилирования гуанина не приводит к

удовлетворительным результатам в связи с плохой растворимостью последнего в

апротонных биполярных растворителях Поэтому обычно алкилируют не сам гуанин, а

его производные по экзоциклическим заместителям с последующим удалением

защитных групп. В качестве растворимого производного гуанина мы применяли

2-изобутироилгуанин, который с 80% выходом получали по описанной методике

Реакция алкилирования 2-изобутироилгуанина соединением (1а) в присутствии

ВВи приводила к смеси Л*9- (ПЬ) и Ы7- (Ш) изомеров Из этой смеси индивидуальные

вещества удалось выделить с выходами 8 и 12%, соответственно. Их строение

подтверждено масс-спектрами и данными спектров ЯМР (табл 1 и 2)

Изобутироильная группа может быть легко удалена в щелочной среде Но,

поскольку в этих условиях протекает расщепление р-дикарбонильного фрагмента

молекулы до кетокислотного, мы использовали более мягкий метод - длительное

кипячение соединений (ПН), (ИВ) в водно-спиртовой смеси (1:6) в присутствии

триэтиламина. В результате с выходом, близким к количественному, были получены

гуаниновые производные (Щ) и (Пк) (Схема 5)

Достоверно известно, что по сравнению с ^-изомерами, максимум поглощения

А^-изомеров алкилгуанинов при нейтральных значениях рН сдвинут в

длинноволновую область. Характерное различие в величинах А^ах пуринового ядра в УФ-спектрах изомеров (Щ) и (Пк) при рН 7 составляет ~30 нм (РисЗ) Это подтверждает, что (Щ) является А19-, а (Пк) - ?/7-производным гуанина РисЗ.

УФ-спектр Л^-[7-(2-оксоциклогексил)-7- УФ-спеир Л/'-[7-(2-оксоциклогексил)-7-

оксогептил]гуанина (Щ) оксогептил]гуанина (Пк) рН1 —•—, рН7 —■-,рН14—А—

В 13С-ЯМР спектрах - для И1- изомера (Пк) по сравнению с Л^-изомером (Щ) наблюдается сдвиг сигнала С5 в сильное поле (-8 5 ид), а сигнала С8 в слабое поле (~5 7 м д) (см табл. 2) Наличие подобных значительных изменений в величинах химических сдвигов в зависимости от положения боковой цепи способствует быстрой и надежной идентификации изомерных гуаниновых производных

Синтезированные соединения (Па-к) по данным ЯМР-спектров (рМ80ч&, СИСЬ) находятся главным образом в енолизованной форме, о чем свидетельствует наличие характерного сигнала в слабом поле (15 9 мд) в 'Н-ЯМР-спектрах, а также сигналов атомов С7',С8' и С9* (201 4,106 9 и 181 8) енолизованной Р-дикетофункции в 13С-ЯМР-спектрах (табл 1 и табл 2) Это нами отражено в приведенных формулах соединений (Па-к) Однако в кислых и нейтральных водных растворах Р-дикетоновый фрагмент соединений (Па-к) по данным УФ-спекгров енолизован незначительно, при повышении рН доля енольной формы возрастает, что выражается в появлении максимума поглощения в области 315 нм (Рис 2 и 3)

По аналогии с вышеизложенным были синтезированы производные пиримидиновых и пуриновых нуклеиновых оснований, в которых Р-дикетофункция отделена от остатка нуклеинового основания полиметиленовым спейсером длиной 7 и 8 метиленовых звеньев.

Для получения производных тимина и урацила (ГУа,Ь) мы использовали загрузки вдвое меньшие, чем при получении соединений (Па,Ь), что привело к существенному уменьшению выходов (Схема 6) как целевых моноалкилированных пиримидинов, так и продуктов бис-алкилирования (Уа,Ь) Уменьшение загрузки не сказалось на выходе цитозинового производного (1Ус). Пиримидиновые производные (У1а-с), (У11а,Ь) были получены с хорошими выходами при использовании стандартных количеств реагентов.

Схема б.

СП»*)

Ь- п=б; с- грП

(TVa,b) n=fi я- R=H, выход 25'/« b- R=CHy выход 16%

(VIa,b) n=7 a- R«H, выход 34% b- R=CHj, выход 58%

У/,

(Vb)n=6 ^^ b- R^Hy выход 2%

(VDa,b) n=7 a- R=H, выход 24% b- R=CHj, выход 10%

tyH,

(IVc) n-6, выход 38% (Vic) n=7, выход 31%

о он

Ob*)

b-n=6, с-п=7

i- DBU/ДМФА, 90°С; й- NaH/ДМФА, 90°С.

Лг-Замещенные производные гипоксантина (IVd) и (Vld) были синтезированы с

хорошими выходами его алкилированием реагентами (lb) и (1с) в присутствии DBU (Схема 7)

Для синтеза производных аденина (TVe) и (Vie) мы применяли алкилирование его натриевой соли. При алкилировании натриевой соли аденина реагентом (lb) в незначительном количестве образовывался If -замещенный продукт (IVf), который подвергали повторной очистке и охарактеризовывали В аналогичной реакции с (1с) образования Д^-изомера не наблюдалось.

Известно, что при взаимодействии аденина с активированными галогенидами в отсутствие основания в диметилацегтамиде, алкилирование в основном происходит по атому Л^ Поскольку А^-замещенное производное аденина (Vlf) представляло для нас некоторый интерес, мы попытались его синтезировать по вышеописанной методике,

при этом (Vif) был выделен с выходом ~8%, а Л^-изомер (Vie) образовывался лишь в следовых количествах (ср. Схема 7) Строение изомерным производным аденина приписывалось на основании наличия "характерных эффектов алкилирования", наблюдаемых в "С-ЯМР-спектрах, аналогичных наблюдаемым для соединений (ITf) и №)

Схема 7.

(Пъс)

(IVd) df6, выход 57% (VId)n-7, выход 51%

1*2

NH2

(Ib,c) 1 I (IVe) п-5, выход 40%

(Vie)ff=6, выход39%

(IVf) п-5, выход 1%

КГ о он

^ о ОН (Vif) Irf, выход 8%

<

(1Ь,с) Ь-п=6; с-Пг^7

(IVg) п=б, выход 17% (VIg)n=7, выход 31%

(IVh)n=6, выход 17% (Vlh)n^7, выход 22%

I-

I"

NH2

(IV!) п-б, выход 87% (VII) 0=7, выход 97%

(IVj) п=б, выход 44% (Vlj) п=7, выход 53%

»- ОВи/ДМФА, 90°С, й- N811/^1®^ 90°С, ¡и- АсК(СН3)2, 90°С; гV- Шгз/ЕЮН/Н20, А Для синтеза производных гуанина мы использовали алкилирование А^-

изобутироилгуанина в присутствии ЭВи Изобутироильную группу производных

(Г^Ь) и (VIg,h) гидролизовали в условиях, аналогичных вышеприведенным для

гидролиза (ШМ) (Схема 7)

Положение полиметиленовой цепи при пуриновом ядре соединений (IVij) и (VIi,j) устанавливалось по "характерным эффектам алкилирования", идентичным выявленным для соединений (Hj) и (Пк)

Синтезированные соединения (TV-VI) охарактеризовывались методами ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.

Синтез полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевой фенилкетогруппой.

По ряду причин представлялось важным синтезировать соединения, в которых на конце полиметиленового спейсера различной длины содержится фенилкетогруппа Методом создания связи азот-углерод служило алкилирование нуклеиновых оснований в присутствии DBU, либо алкилирование их натриевых солей.

Мы синтезировали алкилирующие реагенты общей формулы (УПа-d) в соответствии с методикой, описанной в работе А Н. Несмеянова и сотр для получения б-хлорвалерофенона и ш-хлорэнантофенона (Схема 8) Как и при синтезе алкилирующих реагентов с концевой р-дикето группой (1а-с), исходными соединениями являлись хлорангидриды ш-хлоркислот Хлорангидрид у-хлормаслянной кислоты бьш получен кипяченем у-бутиролактона в хлористом тиониле в присутствии безводного хлористого цинка:

Схема 8.

* п=1 выход 86% Ь пр2 выход 82% с л=4 выход 95% d f6 выход 82%

<у°

¿- А1С13/СбНб, 5°С; й- гпсувоси, А.

Попытка алкилирования тимина бутирофеноном (УПа) по разработанной нами ранее методике с применением БВи приводила, вместо ожидаемых Л^-моно- и 1 бис-производных, к циклопропилфенижетону (УПГ) с выходом 55% (Схема 9), продуктов же алкилирования нуклеинового основания в реакционной смеси обнаружено не было Сопоставимый выход соединения (VIII) (78%) бьш получен в классических условиях синтеза производных циклопропана обработкой водной щелочью у-хлоркетонов Для подтверждения того, что азотсодержащие органические основания (например ИВЦ) в данном случае действуют аналогичным образом, а

с-^нГу0-*-

а

(VU a-d)

ot^Y3

присутствие нуклеинового основания не влияет на ход реакции, мы нагревали в ДМФА эквимолярные количества фенона (УПа) и ИВи в течение 20 ч при 80-100°С, при этом циклопропилфенон (УШ) был получен с выходом -60%.

Схема 9.

<иливилиш.

i-выход- 55% Ü- выход- 78% щ- выход- 59%

[I Л выход- 84

(УШ) (УШ)

и ТиминЛЭВи/ДМФА, 80°С; й- №0Н/Н20, Д; Ш- ОВи/ДМФА, 80°С; п»- Н0СН2СН20Н/НС(0Е1)з/Т080Н/СбН5СНз, Д.

Следовательно, кетогруппу алкилирующего реагента (УПа) необходимо блокировать, удобной защитной группировкой оказалась 1,3-диоксолановая, которая легко вводится кипячением в толуоле у-хлорбутирофенона и избытка этиленгликоля в присутствии триэтилортоформиата и каталитического количества и-толуолсульфо-кислоты. Таким образом был синтезирован алкшгаругощий реагент (IX).

Применение соединения (IX) для алкилирования пиримидиновых нуклеиновых оснований в условиях, указанных на схеме 10, с хорошими выходами приводило к моноалкилированным производным (Ха-с)

Схема 10.

п " 1-1

NH,

О

(Ха,Ь) »-R-H выход 41%'« Ь- R-Cllj, выход 54%

NH,

(К)

(XI»,b) kfcj ■-R-H, выход 13% b- R-CHj, выход 22%

<Xc), выход 31%

и DBU/ДМФА, 90°С; й- NaH/ДМФА, 90°С.

В случае урацила и тимина наблюдалось также образование продуктов rfjf-бис-алкилирования (XIa-b).

Гипоксантин и аденин при алкшшровании реагентом (IX) в присутствии DBU главным образом давали А^-замещенные продукты (Xd, е) (Схема 11):

Схема 11.

(X) выход 29% [J

При реакции (IX) с аденином образовалось небольшое количество сильнозагрязненного -изомера (XÍ). Взаимодействие натриевой соли аденина с реагентом (IX) давало целевой продукт (Хе) с более скромным выходом, образования Л^-изомера (Xf) зафиксировано не было.

Алкилирование Л^-изобутироилгуанина в присутствии DBU приводило к ожидаемой смеси

и tf -замещенных производных, из которой индивидуальные изомеры (Xg,h) были выделены с умеренными выходами (Схема 11)

Строение моноалкилированных производных (Xa-h) и бис-алкилированных (Х1а,Ь) было подтверждено ЯМР- и масс-спектрами

Количественное удаление диоксолановой защитной группы соединений (Ха-е) осуществляли посредством их непродолжительного кипячения в 50% уксусной кислоте Удаление защитной группы для производного (Xf) наблюдалось в процессе его очистки на колонке с Dowex 50 х 8 (Н^-форма) Для выхода к целевым V- и замещенным гуанинам (Xllg), (ХШ) первоначально деблокировали 2-NH2-rpynny в соединениях (Xg) и (Xh) посредством продолжительного кипячения в водно-спиртовой смеси в присутствии триэтиламина После упаривания растворителей в вакууме, без очистки соответствующих промежуточных соединений, проводили кислотный гидролиз 1,3-диоксоланового фрагмента в вышеописанных условиях Производные (Xllg) и (ХПЪ) были получены с хорошими выходами (Схема 12).

Схема 12.

в

п

(Х«-£)

1ЧН,

урацил-1-ил, выход 98%; ^ й Ь: тимии-1-ил, выход 97%-(ХПа-«) I у с: цитозив-1-ил, выход 99%;

гнпоксантнн-9-ил, выход 98%, е: адеиин-9-ил, выход 96%.

(XI) (хщ

Г й выход-96%

(ХПйЬ)

2: гуаявн-9-ил, выход 73%; Ь:г---------

Б: 1Таннн-7-нл, выход 46%.

и Ас0Н/Н20, А, ю- Ьо\¥ех Н'-форма; иг~ 1) Ш1з/ЕЮН/Н20, А; 2) Ас0Н/Н20, А

Строение синтезированных соединений (ХПа) - (ХШ) полностью доказывают их 'Н-ЯМР- и иС-ЯМР-спектры (табл.3 и 4) В ЯМР спектрах присутствуют три группы сигналов' сигналы соответствующих атомов ядра нуклеинового основания, сигналы атомов полиметиленовой цепи и сигналы концевой функциональной группы Как и в случае Р-дикетопроизводных, изомерным соединениям (ХПе) и (ХПО, (ХЩ) и (ХШ) строение приписывалось на основании наличия "характерных эффектов алкилирования" в спектрах 13С-ЯМР (см. табл. 4).

Табл. 3. Данные *Н-ЯМР спектров синтезированных соединений (ХПа)-(ХШ1).

О 12' И 4' 6' а: урацил-1-ил;Ь-тнмин-1-ил; и^ч^^и»*^ — с: цитозин-1-ил; d: гшюксашин-9-ил, 1' 3' 5'1] 1 ^ е аденин-9-ил; Г адешш-3-ил; 10 9" 8 гуанин-9-ил; Ь: гуанин-7-ил.

Протоны Соединение (ХП), 5, м.д.

а ь* с «1 е { Й Ь

1Н, Н1 шш НЗ 11.17, с 11.12, с - 12.26, с - - 10.52, с 10.67, с

1Н, Н2 или Н5 5 50, д~ - 5.63, д;*" 7.85,с 8 10, с 7.76, с - -

1 Н, Н6 или Н8 7 63,д~ 7 49, с 715, д~* 8.18, с 8.15,с 8.35, с 7.69, с 7.89, с

2 Н, 2-Ш2 или 4-Ш2 шш 6-Ш2 - - 6.91с - 7 14, с 7.90,с 6.36, с 6.03,с

2Н,Л 16, Н1' 3.74, т 3.71, т 3.70, т 4.48, т 4.23,т 4.41, т 4.03,т 4.25,т

2Н.Н2' 194,11 1.94,м 1.91,м 2.17, м 2 18, м 2.26, м 2 10, м 2 14, м

2Н,У6 88,НЗ' 3.07, т 3.07, т 3.02, т 3 07, т 3.06, т 3.10,т 3.04, т 3 00, т

2 Н, 3 7 48, Нб'иНЮ' 7 93, д 7.94, д 7.93,д 7 92, д 7 91, д 7.90, д 7 90, д 7 90, д

2Н,Н7'иН9' 7.51, м 7.51, ы 7.52, и 7.50, м 7 50, и 7.51, м 7.50, ы 7 50, и

1Н,/7 16, Н8' 7.61, т 7 62, т 7 63, т 7.60, т 7.62, т 7.62, т 7 61, т 7 62, т

" Д.та соединения (ХПЬ) сигналы протонов 5-СН3- группы 1.73, с, 3 Н, С1 16

Табл. 4. Данные 13С-ЯМР спектров синтезированных соединений (ХПа)-(ХПЬ).

Атомы углерода Соединение (XII), 5, м д.

а ь* С а е Г Я ь

С2 151,0 150.9 155.8 147.7 152.3 143.4 153.5 154.5

С4 163.7 164 2 165.9 148.8 149.6 149.7 151.2 152.6

С5 101.0 108.5 93.2 114.5 118.8 120.4 116.7 108.1

С6 145 5 141.2 145.9 153.0 155.9 155.0 156.8 159.9

С8 - - - 139.5 140.8 152.4 137.4 143.1

С1' 47 0 46.7 48.0 48.5 42.4 489 42.2 45 6

С2' 23.0 23.0 23 5 24.1 241 23 4 24 0 25 1

СЗ' 34.7 34 7 34.9 34 5 34.9 34.9 34 9 34.7

С4' 199 0 199.0 199.2 200 1 198.9 198.9 198 9 198 9

С5' 136.6 136.6 136.6 135.7 136.5 136.1 136.6 136.6

Сб'иСЮ' 128.6 128.6 128.7 128 7 128.6 128.6 128.6 128.6

С7'иС9' 127.8 127 8 127.8 127.8 127.8 127.8 127 8 127.7

а' 133.0 133.0 133.1 133.5 133.1 133.1 133 1 133.0

" Для соединения (ХИЬ) сигнал 5-СН3-группы: 11.8, СН3.

В ультрафиолетовых спектрах синтезированных соединений полоса поглощения, обусловленная переносом электрона от карбонильной группы к фенильному радикалу, находится в области 245 нм (е 13000 М^см"1), перекрываясь для большинства производных с полосой поглощения хромофора нуклеинового основания, что делает УФ-спектры малоинформативными

При взаимодействии в вышеописанных условиях нуклеиновых оснований с реагентами (УПЬ)-(УШ), имеющими полиметиленовую цепь из 4, 6 и 8 метиленовых звеньев, реакция проходила гладко, приводя к ожидаемым продуктам алкилирования Алкилированием тимина и урацила в присутствии ИВи и алкилированием натриевой соли цигозина фенонами (УПЬ)-(УШ) с хорошими выходами были получены целевые А^-замещенные пиримидины (ХШа)-(ХШс), (Х1Уа)-(Х1Ус), и (ХУа)-(ХУс) (Схема 13) Как и в предыдущих случаях, образование моноалкшшрованых тимина и урацила сопровождалось образованием значительных количеств продуктов бис-алкилирования

Схема 13.

(ХШс) о-2, выход 13% (Х1Ус)л>4, выход 38% (ХУс) п-б, выход 56%

и

I- ОВи/ДМФА, 90°С; й- КаН/ДМФА, 90°С.

(упь-ЛЧ»/-

(ХШа,Ъ)п-2

а- Й-Н, выход 32% Ь- Й-СН,, выход 57% (Х1У«,Ь) п=4 »- 11-Н, выход 59% Ь- Я-СН^ выход 46% (ХУа,Ь) гг4 *-К-Н, выход 29% Ь- Й-СН,. выход 27%

Соединения (УПЬ) - (УШ) также применялись нами и для синтеза монозамещенных производных аденина и гипоксангина методами, описанными выше. Условия реакций приведены на Схеме 14

Схема 14.

Изомерные пары соединений (ХШе)-(ХПИ), (Х1Уе)-(ХШ), и (ХУе)-(ХУ^, как и в предыдущих случаях, характеризуются сущесгвено различающимися спектрами 13С-ЯМР, позволяющими однозначно приписать положение боковой цепи при пуриновом ядре.

Производные И1- и А'9-замещенного гуанина (ХПИ), (ХЩ); (ХГУО, (ХЩ); и (XVI), (XVj), были получены посредством хорошо себя зарекомендовавшего подхода, основанного на алкилировании Л^-изобутироилгуанина в присутствии ОВ1), с последующим удалением изобутироильной группы в основных условиях (Схема 14)

Строение синтезированных соединений полностью доказывают их 'Н-ЯМР- и 13С-ЯМР-спектры В ЯМР спектрах присутствуют три группы сигналов сигналы соответствующих атомов ядра нуклеинового основания, сигналы атомов полимегиленовой цепи и сигналы концевой функциональной группы

Биологическая активность полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевыми функциональными группами.

Полиметиленовые производные нуклеиновых оснований, несущие в ш-положении углеродной цепи различные функциональные группы - удобные и перспективные инструменты для изучения функционирования ферментов нуклеинового обмена. Отдельные представители данного класса соединений являются потенциальными кандидатами на роль лекарственных препаратов.

Ранее в нашей лаборатории были синтезированы такие производные, несущие в ш-положении углеродной цепи гидроксильные, карбоксильные и карбалкоксильные функциональные группы. Было найдено, что подобные производные урацила, тимина, аденина и гипоксантина способны эффективно взаимодействовать с участком обратной транскритттазы ВИЧ, отвечающим за узнавание антикодона тРИС1,5", и активировать этот фермент, ускоряя реакцию полимеризации. Причем сила взаимодействия зависит от природы основания и длины углеродной цепи.

При изучении взаимодействия с ДНК-топоизомеразой оказалось, что такие производные слабо ингябируют фермент, причем активность производных урацила выше, чем у производных тимина.

Нам представлялось интересным и важным определить, влияют ли синтезированные в данной работе соединения на энзиматическую активность обратной транскриптазы ВИЧ В качестве тест-системы использовали реакцию синтеза ДНК в присутствии активированной ДНК, четырех (ШТР (один из которых содержит в а-положении [иР]-метку) и обратной транскриптазы ВИЧ. Были получены зависимости степени включения меченого дКГР в цепь ДНК от концентрации исследуемых веществ Выявлено несколько соединений, в микромолярных концентрациях эффективно инпибирующих синтез ДНК, катализируемый обратной транскриптазой ВИЧ (Табл 5) Установлено, что ингибирование носит неконкурентный характер.

Табл. 5. Ингибирование обратной транскриптазы ВИЧ синтезированными

соединениями.

Соединение Ю (мкМ) Соединение АГ;"(мкМ)

о тУ II г о хУ

3±1 ^Х) 50±10

(ЛЬ) (ХПЬ)

NN2 Ш цХХ р 0

10±3 150±30

(Ш) (ХПс)

% о «АЛ

35±15 50±15

(ХЬ) (ХУЬ)

ж2 3±0.7 о но-^-ск^о^ он он он м, 0.7±0.2

(Хе) А7.ТТР

Помимо обратной транскриптазы, рациональной мишенью для воздействия на инфекцию ВИЧ и в дальнейшем для лечения СПИДа является интеграза ВИЧ. В последние 10-12 лет разработаны молекулярно-биологические подходы к клиническому использованию этой мишени. В результате фронтальных исследований в различных лабораториях США, Франции, Италии и др найден целый ряд весьма эффективных ингибиторов интегразы ВИЧ. Среди них особое место занимают 4-арил-2,4-диоксобутановые кислоты. Высокая активность представителей данного класса обусловливается наличием р-дикетоновой группы, сочлененной с карбоксильным

фрагментом, что способствует эффективному связыванию с двумя ионами двухвалентного металла в активном центре фермента.

Поскольку синтезированные нами соединения (П), (IV) и (VI), как и 4-арил-2,4-диоксобутановые кислоты, имеют в молекуле (З-дикарбонильную группу и значительный гидрофобный фрагмент, нам представлялось интересным исследовать их активность в отношении ингегразы ВИЧ-1 Соединения (Па), (ПЬ), (Пс) и (П1), производные урацила, тимина, цитозина и аденина, соответственно, были протестированы в лаборатории М Б Готтих (МГУ) (частное сообщение) в системе, содержащей указанный фермент Сколько-нибудь значимой ингибирующей активности в отношении интегразы ВИЧ-1 эти соединения не проявили По всей видимости это объясняется тем, что наличие непосредственно связаннной с р-дикетоновым фрагментом карбоксильной группы или ее изостерного аналога является необходимым условием для ингибиторов интегразы ВИЧ-1.

Среди лекарственных средств, действующих преимущественно на центральную нервную систему, большую группу составляют психотропные препараты Значительное место в их ряду занимают нейролептики или антипсихотические препараты. Хорошо известно, что нарушение гомеостаза дофаминергической системы мозга играет важную роль в патогенезе шизофрении и болезни Паркинсона. В первом случае наблюдается повышение, а во втором - понижение функциональной активности дофаминергических нейронов Блокада дофаминовых рецепторов при введении нейролептиков препятствует развитию симптомов дофаминергической гиперактивности К нейролептикам относят целый ряд производных фенотиазина, тиоксантена, дифенилбутилшшеридина, бутирофенона и др. Из бутирофенонов широко применяются такие препараты как галоперидол, трифлуперидол, дроперидол и др

Синтезированные нами производные нуклеиновых оснований (ХПа) - (ХПЬ) имеют структурное сходство с бутирофенонами. Можно было ожидать, что они, как и лекарственные препараты группы бутирофенона, будут проявлять нейролептическую активность.

В НИИ Фамакологии РАМН Н.А.Бондаренко на мышах и крысах были изучены поведенческие реакции животных при введении им бутирофенона (ХПЬ) -производного тимина.

(ХПЬ)

В экспериментах на животных усиление дофаминергической активности моделируют введением предшественника дофамина - аминокислоты ¿-диоксифенилаланина (L-ДОФА) При этом у животных наблюдается нарушение поведения в виде «стереотипии» (монотонного повторения одного и того же движения, например, принюхивания или вставания на задние лапы) Большинство известных препаратов с нейролептической активностью, применяемых при терапии шизофрении, (за исключением так называемых «атипичных») ослабляют интенсивность стереотипии Тест антагонизма с стереотипией от L-ДОФА включен в список обязательных для скрининга нейролептиков. Было обнаружено, что соединение (ХПЬ) снижает интенсивность стереотипных реакций у крыс, получивших ¿-ДОФА, что указывает на его возможную нейролептическую активность Известно, что продолжительный прием нейролептиков приводит к появлению у людей синдрома «лекарственного паркинсонизма». Этот побочный эффект нейролептиков является следствием снижения уровня дофамина Адекватной моделью такого состояния является введение мышам нейротоксина МПТП, который нарушает двигательную активность Установленно, что соединение (ХПЬ) не усиливает действие МПТП, что свидетельствует о низком риске развития симптомов лекарственного паркинсонизма при возможном использовании данного соединения в качестве лекарства.

Механизм действия нейролептиков включает блокаду D2 и/или Di подтипов дофаминовых рецепторов. Здоровые животные реагируют на блокаду этих рецепторов характерными изменениями поведения. Если заблокировать посгсинаптические рецепторы нигро-стриарной дофаминергической системы, то возникает каталепсия (нарушение способности совершать производные движения). Симптом каталепсии при введении такого препарата людям, с высокой вероятностью, соотносится с развитием побочных реакций (в особенности, паркинсонизма). Блокада пресинаптических D2 рецепторов наоборот приводит к усилению двигательной активности, что указывает на возможное активирующее действие препарата Установлено, что введение соединения (ХПЬ) не вызывало каталепсии у мышей, а напротив усиливало двигательную активность животных Таким образом, можно предположить, что данное соединение является нейролептиком со свойствами D2 блокатора.

выводы

1 Синтезировано 56 новых соединений - полиметиленовых производных нуклеиновых оснований, имеющих в го-попожении цепи Р-дикарбонильную и фенилкетогруппу.

2 Разработаны и оптимизированы методы получения полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевой 3-дикарбонильной и фенилкетогруппами и варьируемой длиной полиметиленовой цепи от 3 до 8 метиленовых звеньев. Методы основаны на алкилировании нуклеиновых оснований в присутствии 1,8-диазабищшю[5 4.0]ундец-7-ена (ЬВЦ). Для получения производных аденина и цитозина предпочтительно алкилирование их натриевых солей. Установлено, что в случаях внутримолекулярной циклизации алкилирующего реагента необходима защита его кетофункции. Строение синтезированных соединений подтверждено данными УФ-, 'Н-ЯМР-, 13С-ЯМР- и масс-спектров.

3 Физико-химическими методами показано, что соединения с Р-дикарбонильной группой в зависимости от природы растворителя и рН среды находятся преимущественно в кетонной либо енольной формах.

4 Изучено ингибирование обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ синтезированными соединениями. Среди них выявлено несколько веществ, в микромолярных концентрациях ингибирующих ОТ ВИЧ

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1 А М. Крицын, В В. Комиссаров Полиметиленовые производные нуклеиновых оснований с го-функциональными группами. Ш Лг-[7-(2-оксоциклогексил)-7-оксогептил]-замещенные пиримидины Биоорган химия, (2004), тЗО, N 5, с 487-492.

2 А М Крицын, Й. Вепсалайнен, В В Комиссаров Полиметиленовые производные нуклеиновых оснований с го-функциональными группами IV Лг-[7-(2-оксоциклогексил)-7-оксогептил]-замещенные пурины. Биоорган химия, (2005), т.31, N 3, с. 288-294.

3. А.М. Крицын, В.В. Комиссаров. Полиметиленовые производные нуклеиновых оснований с го-функциональными группами V. у-Бутирофеноны пиримидинов и пуринов. Биоорган, химия, (2005), т.31, N 6, с. 609-615.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 11.01.2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 007 Тел 939-3890 Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

ч »

5427

- 5 4 2 7

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Комиссаров, Всеволод Владимирович

Введение

Глава 1. Обзор Литературы. Методы синтеза и биологическое значение негликозидных аналогов нуклеозидов.

1.1. Алкилирование нуклеиновых оснований.

1.1.1. Алкилирование нуклеиновых оснований пиримидинового ряда.

1.1.2. Алкилирование нуклеиновых оснований пуринового ряда. 1 б

1.2. Присоединение нуклеиновых оснований по Михаэлю как метод синтеза негликозидных ациклических аналогов нуклеозидов.

1.3. Применение реакции Мицунобу к синтезу негликозидных аналогов нуклеозидов.

1.4. Реакции циклизации в синтезе негликозидных аналогов нуклеозидов.

1.4.1. Применение реакций циклизации в синтезе негликозидных аналогов нуклеозидов пиримидинового ряда.

1.4.2. Применение реакций циклизации в синтезе негликозидных аналогов нуклеозидов пуринового ряда.

Глава 2. Обсуждение результатов.

2.1. Полиметиленовые производные нуклеиновых оснований с концевой

3-дикарбонильной группой.

2.1.1. Получение алкилирующих реагентов с концевой р-дикарбонильной группой.

2.1.2. Получение полиметиленовых производных пиримидиновых и пуриновых нуклеиновых оснований с концевой Р-дикарбонильной группой с использованием реагента (109а).

2.1.2. Получение полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевой

3-дикарбонильной группой с использованием реагентов (109Ь) и (109с).

2.2. Полиметиленовые производные нуклеиновых оснований с концевой фенилкето группой.

2.2.1. Получение алкилирующих реагентов с концевой фенилкетогруппой.

2.2.2. Получение полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевой фенилкетогруппой с использованием реагента (116а).

2.2.3. Получение полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевой фенилкетогруппой с использованием реагентов (116Ь)-(116<3).

2.3. Биологическая активность полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевыми функциональными группами.

Глава 3. Экспериментальная часть.

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Полиметиленовые производные нуклеиновых оснований с φ-функциональными группами. Синтез и свойства"

Среди современных лекарственных средств, используемых для лечения заболеваний, вызванных вирусными инфекциями, значительную область занимают соединения, относящиеся к группе негликозидных аналогов нуклеозидов [1]. В случае вирусов HSV и VZV негликозидные аналоги нуклеозидов под действием вирусной тимидинкиназы (ТК) превращаются в соответствующие монофосфаты, последующее их фосфорилирование ферментами клетки приводит к трифосфатам, которые: 1) ингибируют вирусную ДНК-полимер азу; 2) терминируют рост цепи вирусной ДНК, встраиваясь по ее 3'-концу.

Селективность действия аналогов нуклеозидов является следствием двух причин: 1) вирусная ТК, способная осуществить фосфорилирование нуклеозидных аналогов, присутствует только в инфецированных клетках; 2) соответствующие трифосфаты более эффективно ингибируют вирусную . ДНК-полимеразу, нежели полимеразу клетки [2].

К полиметиленовым аналогам нуклеозидов относятся такие эффективные противовирусные препараты, как пенцикловир (1) и (-)2HM-HBG (2) [3]. о о он он

1) (2)

Вирус герпеса первого типа (HSVI) кодирует уникальную ТК, которая экспрессируется и в продуктивно и в скрыто инфецированных клетках как в культуре, так и in vivo. HSVI-специфическая ТК значительно отличается от ТК млекопитающих, как в отношении строения, так и в отношении каталитической активности. "Пластичность" активного сайта - это одно из уникальных свойств HSVI ТК, выявленное в процессе разработки селективных антивирусных аналогов нуклеозидов. В то время как ТК млекопитающих способна фосфорилировать лишь тимидин (TdR), HSV! ТК способна фосфорилировать тимидиловую кислоту (dTMP), а также различные пиримидиновые и пуриновые дезоксирибонуклеозиды и нуклеозидные аналоги, такие как ациклогуанозин и бромовинилдезоксиуридин. Результаты исследований патогенеза и репликации HSV in vivo свидетельствуют в пользу того, что функция вирус-специфичной ТК необходима для репликации вируса и скрытой инфекции неделящихся клеток, в которых процессы синтеза dTTP подавлены или отсутствуют. Например, ТК дефицитные (ТК) мутантные формы HSV практически не реплицируются или вообще не реплицируются в (TIC) тканях и тканях с дефицитом ТМР-синтетазы, таких как тригеминальный ганглий и мозг [4].

Вирусы герпеса первого и второго типов имеют длительный скрытый период жизни в нейронах. Скрытое состояние периодически прерывается реактивацией, вызывающей повторяющуюся время от времени болезнь, при этом значительное количество инфецированных людей может распространять инфекционный вирус и без видимых признаков заболевания. Помимо этого, HSV может вызывать опасный для жизни энцефалит как у новорожденных в результате действия вируса во время внутриутробного периода, так и у взрослых с пониженным иммунитетом. Герпетический энцефалит приводит к высокой смертности, выжившие часто серьезно травмированы. Герпетический энцефалит ежегодно наблюдается у 3000 новорожденных в США. Если инфекция проявляется в виде рассеянного заболевания, то у 50% младенцев наблюдаются заболевания ЦНС, в 75% случаев приводящие к летальному исходу. 50-75% выживших имеют психомоторное замедление. Ацикловир и форсанет применялись для лечения HSV энцефалита у новорожденных с рассеянной и локализованной формой заболевания. Хотя лечение понизило смертность от энцефалита до 15%, только 50% выживших смогло дальше нормально развиваться. К сожалению, общая смертность от рассеяного неонатального герпеса остается крайне высокой (40-65%), несмотря на современную антивирусную терапию [5, б]. Конкурентные ингибиторы HSV ТК предотвращают вирусную реактивацию in vitro и in vivo, при лечении ингибиторами ТК экспрессия вирусной ДНК в инфецированных нервных ганглиях падает. Ясно, что есть необходимость в противовирусных лекарствах, способных проникать в ЦНС и эффективно ингибировать HSV инфекцию. В рамках работ направленных на решение данной проблемы Райтом и сотр. [7] был синтезирован ряд гидрофобных полиметиленовых производных нуклиновых оснований (3), среди котрых были выявлены сильные ингибиторы HSVI и HSVII тимидинкиназ in vitro. о

3)

Липофильность молекулы лекарства способствует лучшему проникновению последнего через гематоэнцефалический барьер и более эффективному захвату клетками.

Одним из основных препаратов, используемых для подавления репликации ВИЧ, является зидовудин (А2Т), однако высокие дозы, необходимые для достижения требуемой концентрации в спинномозговой жидкости являются токсичными для клеток костного мозга, а также вызывают анемию и лейкопению. С целью повышения эффективности действия А2Т были синтезированы его многочисленные гидрофобные пролекарственные формы - производные по 5'-ОН-группе. Таким образом, было выявлено соединение (4), имеющее ЕС50 до 50 раз меньшее, чем для А2Т в культурах клеток [8].

Наряду с Т и другими нуклеозидными ингибиторами, связывающимися в активном центре обратной транскриптазы ВИЧ, существует ряд ингибиторов, связывающихся в гидрофобном кармане, расположенном вблизи полимеразного каталитического центра, причем это взаимодействие не влияет на связывание нуклеотидного аналога. В связи с этим актуальным направлением исследований является изучение ингибиторов смешанного типа, одновременно связывающихся с двумя упомянутыми сайтами. Молекулы ингибиторов подобного типа содержат остаток нуклеозидного ингибитора, отделенный от остатка ненуклеозидного ингибитора спейсером, как правило гидрофобным [9].

Исследования полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с различными концевыми функциональными группами, выполненные ранее в нашей лаборатории [10,11], позволили выявить несколько соединений, ингибирующих или даже активирующих обратную транскриптазу ВИЧ.

Соединения (5) [12] эффективно ингибирут тимидин фосфорилазу Е.соИ за счет связывания фосфонатной группы в фосфатсвязывающем участке фермента, остаток тимина связывается в 2'-дезоксинуклеотидсвязывающем участке. Эти связывающие о

4) участки фермента находятся на расстоянии 8-10 А, комплиментарные им участки молекулы ингибитора отделены друг от друга полиметиленовой цепью приблизительно на такое же расстояние. о сн3 да сДы

П 5 (СН2)п-Р-о ын4 он

5)

Указанный фермент изучается в качестве модели тимидин фосфорилазы человека - фермента, уровень которого в многочисленных видах опухолей человека значительно повышен, более того, имеется ряд указаний на его вовлеченность в процессы ангиогенеза и апоптоза.

Кристаллографические исследования пуриннуклеозидфосфорилазы, выявившие в ее активном центре три связывающих участка: гуанинсвязывающий, гидрофобный карман, фосфатсвязывающий привели авторов работ [13, 14] к ингибиторам данного фермента общей формулы (б). мн п=4; В.=Н; п=4, К=Р; ЫНг п=6, п=б, 11=Н; нор-—(СН2)п п=7>к=н;^К=н он

6)

Ингибиторы пуриннуклеозидфосфорилазы рассматриваются в качестве препаратов для лечения различных аутоиммунных дисфункций, лейкемии и предотвращения отторжения трансплантированных органов.

Спектр применения гидрофобных производных нуклеиновых оснований не ограничивается исследованиями по ингибированию ферментов, явно содержащих в своем активном центре участок связывания нуклеинового основания.

Так соединение (7) великолепно ингибирует липопротеин зависимую А2 фосфолипазу [15] - фермент, расщепляющий липопротеины низкой плотности до лизофосфатидил холина и окисленных жирных кислот.

МН-(СН2)8 — -с8н17

V)

Эти вещества, как известно, играют значительную роль в развитии атеросклероза. Соответственно ингибиторы этого фермента являются потенциальными препаратами для лечения атеросклероза.

При разработке антипсихотических агентов, не вызывающих экстрапиримидальных побочных эффектов, исследователями была выявлена большая группа гидрофобных производных пурина (8), обладающих значительной активностью [16].

N1^; ША1к; ЫА1кСНО; ИА Щ-Н; С1; СБ3; Ш2; №А1к; N К(СН3)2; ОА1к; 8СН3. 1Г=А1к

8)

Среди соединений, неспецифически стимулирующих иммунную систему, важное положение занимают нуклеозиды - различные представители этого класса избирательно действуют на разные типы клеток имммунной системы. К группе нуклеозидных аналогов, преимущественно действующих на Т-лимфоциты, относятся соединения, в которых остаток аргинина отделен от пуринового остатка полиметиленовым линкером длиной в пять углеродных атомов (9) [17].

Из вышеприведенных литературных данных следует важность изучения новых полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевыми функциональными группами в качестве потенциальных ингибиторов ферментов, что в ряде случаев поможет уточнить строение их активного центра и особенности механизма функционирования. При этом особенно ценной является легкореализуемая возможность плавного изменения геометрии молекулы ингибитора за счет длины полиметиленового спейсера.

Следует добавить, что соединения, содержащие два остатка нуклеиновых оснований, разделенных полиметиленовым спейсером различной длины (10, 11), служат моделями для изучения стекинг-взаимодействий нуклеиновых оснований [18,19]. Причем если остатки различные, например аденин и тимин (11), то в неполярных растворителях доминирующим типом внутримолекулярных взаимодействий становится образование водородных связей [20]. и

К=Ш2; ША1к; ЫАИ^; ^ ШШ^; 01; БН; Н;

9)

Повышенное внимание к молекулярным ансамблям, образованным за счет водородных связей, вызвано возможностью применения последних в качестве жидких кристаллов:

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Комиссаров, Всеволод Владимирович

выводы

Синтезировано 56 новых соединений - полиметиленовых производных нуклеиновых оснований, имеющих в со-положении цепи Р-дикарбонильную и фенилкетогруппу.

Разработаны и оптимизированы методы получения полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевой (З-дикарбонильной и фенилкетогруппами и варьируемой длиной полиметиленовой цепи от 3 до 8 метиленовых звеньев. Методы основаны на алкилировании нуклеиновых оснований в присутствии 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (БВи). Для получения производных аденина и цитозина предпочтительно алкилирование их натриевых солей. Установлено, что в случаях внутримолекулярной циклизации алкилирующего реагента необходима защита его кетофункции. Строение синтезированных соединений подтверждено данными УФ-, 1Н-ЛМР-,13С-ЛМР- и масс-спектров.

Физико-химическими методами показано, что соединения с Р-дикарбонильной группой в зависимости от природы растворителя и рН среды находятся преимущественно в кетонной либо енольной формах.

Изучено ингибирование обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ синтезированными соединениями. Среди них выявлено несколько веществ, в микромолярных концентрациях ингибирующих ОТ ВИЧ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Комиссаров, Всеволод Владимирович, Москва

1. Tippie M.A., Martin J.C., Smee D.F., Mcittews T.R., Verheyclen P.H. II Antiherpes simplex virus activity of 9-4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-l-butyl.guanine. Nucleosides and Nucleotides (1984), v. 3, No 5, p. 523-535

2. De Clercq E. II Guanosine analogues as anti-herpesvirus agents. Nucleosides and Nucleotides (2000), v. 19, No (10-12), p. 1531-1541

3. McGrctth K, Anderson N.E., Croxson M.S., Powell K.F. //Herpes simplex encephalitis treated with acyclovir: Diagnosis and long-term outcome. J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. (1997), v. 63, p. 321-326

4. Halazy S., Ehrhard A., Danzin С. II 9-(Difluorophosphonoalkyl)guanines as a new class of multisubstrate analogue inhibitors of purine nucleoside phosphorylase. J. Amer. Chem. Soc. (1991), v. 113, No 1, p. 315-317

5. Kelley J.L., Bullock R.M., Krochmcd M.P., McLean E.W., Linn J.A., Durcan M.J., Cooper B.R. II 6-(Alkylamino)-9-alkylpurines. A new class of potential antypsychotic agents. J. Med. Chem. (1997), v. 40, No 20, p. 3207-3216

6. Zhu X.-F. II The latest progress in the synthesis of carbocyclic nucleosides. Nucleosides and Nucleotides (2000), v. 19, No 3, p. 651-690

7. Simons С. II Nucleoside mimetics. Their chemistry and biological properties. Gordon and Breach science publishers (2001)

8. Лидак М.Ю., Паэгле Р.А., Плата М.Г., Швачкин Ю.П. // Синтез пиримидил-Ni-а-аминокислот. Химия гетероцикл. соед. (1971), No 4, р. 530-534

9. Koomen G.J., Provoost L.M., van Maarschalkerwaari D.A.H., Willard N.P. II Synthesis of an acyclic analogue of azidothymidine. Nucleosides and Nucleotides (1992), v. 11, No 7, p. 1297-1303

10. Hermecz I. // Chemistry of diazabicycloundecene (DBU) and other pyrimidoazepines. Adv. in Heterocycl. Chem. (1987), v. 42, No 84, p. 83-202

11. Tjoeng F.-S., Kraas E., Breitmaier E., Jung G. II Einfache Darstellung von 2-Amino-co-(uracil-l-yl und thymin-l-yl)-n-alkansauren. Chem. Ber. (1976), v. 109, p. 26152621

12. Qiu 7,-L., Zemlicka J. // Synthesis of new nucleoside analogues comprising a geminal difluorocyclopropane moiety as potential antiviral/antitumor agents. Nucleosides and Nucleotides (1999), v. 18, No 10, p. 2285-2300

13. Nollet A.J.H., Pandit U.K. II Unconventional nucleotide analogues-Ill 4-(Ni-pyrimidyl)-2-aminobutyric acids. Tetrahedron (1969), v. 25, p. 5989-5994

14. Maag H., Rydzewski R.M., McRoberts M.J., Crawford-Ruth D., Verheyden J.P.H., Prisbe E.J. H Synthesis and anti-HTV activity of 4'-azido- and 4'-methoxynucleosides. J. Med. Chem. (1992), v. 35, No 8, p. 1440-1451

15. Holy A., Rosenberg I., Dvorakova H. II Synthesis of N-(2-phosphonylmethoxyethyl) derivatives of heterocyclic bases. Coll. Czechoslovac Chem. Communs. (1989), v. 54, p. 2190-2210

16. Shapiro R., Di Fate V., Welcher M. // Deamination of cytosine derivatives by bisulfite. Mechanism of the reaction. J. Amer. Chem. Soc. (1974), v. 96, No 3, p. 906912

17. Hodge R.P., Sihna N.D. II Simplified synthesis of 2'-D-alkyipyrimidines. Tetrah. letters (1995), v. 36, No 17, p. 2933-2936

18. Hockova D., Holy A.U Synthesis of some "abreviated" NAD+ analogues. Coll. Czechoslovac Chem. Communs. (1997), v. 62, p. 948-956

19. Поспелова Т.А., Рудакова И.П., Дрижова С.Ю., Замуреенко В.А., Торосян Ж.К., Юркевич A.M. // Синтез о-замещенных 9-пентиладенинов и 9-(Г-метиленокси-2'-хлорэтил)аденина. Биоорган, химия. (1975), т. 1, No б, с. 787-792

20. Ефгшцгва Е.В., Михайлов С.Н., Фомичева М.В., Мешков С.В., Родионов М.С., Хомутов А.Р., Де Клерк Э. II Ациклические аналоги нуклеотидов на основе фосфоновых кислот. Биоорган, химия. (1998), т. 24, No 1, с. 16-20

21. Meszarosova К, Holy A., Masojidkova М. И Synthesis of acyclic adenine 8,N-anhydronucleosides. Coll. Czechoslovac Chem. Communs. (2000) v. 65, p. 1109-1125

22. Seley K.L., Mosiey S.L., Zeng F. Carbocyclic Isoadenosine analogues of neoplanocin A. Org. Letters (2003) v. 5, No 23, p. 4401-4403

23. Harnden M.R., Jarvest R.L., Bacon T.H, BoydM.R. // Synthesis and antiviral activity of 9-4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)but-l-yl.purines. J. Med. Chem. (1987), v. 30, No9, p. 1636-1642

24. Dolakova P., Masojidkova M., Holy A. II Synthesis of base substituted 2-hydroxy-3-(purin-9-yl)-propanoic acids and 4-(purin-9-yl)-3-butenoic acids. Nucleosides and Nucleotides (2003), v. 22, No 12, p. 2145-2160

25. Kim C. U., Luh B.Y., Misco P.F., Bronson J.J., HitchcockM.J.M., Ghazzouli /., Martin J.C. II Synthesis and biological activities of phosphonylalkylpurine derivatives. Nucleosides and Nucleotides (1989), v. 8, No (5-6), p. 927-931

26. Kjellberg J., Liljenberg M. И Regioselective alkylation of 6-(|3-methoxyethoxy)guanine to give the 9-alkylguanine derivative. Tetrah. letters (1986), v. 27, No 7, p. 877-880

27. Choudary B.M., Geen G.R., Kincey P.M., Parratt M.J. // A direct approach to the synthesis of famciclovir and penciclovir. Nucleosides and Nucleotides (1996), v. 15, No 5, p. 981-994

28. Nollet A.J.H., Pandit U.K. //Unconventional nucleotide analogues. II. Synthesis of the adenyl analogue of willaridine. Tetrahedron (1969), v. 25, p. 5983-5987

29. Seley K.L., Schneller S.W. II Does the anti-hepatitis B virus activity of (+)-5'-noraristeromycin exist in its 4'-epimer and 4'-deoxygenated derivatives? J. Med. Chem. (1998), v. 41, No 12, p. 2168-2170

30. Perbost M., Lucas M., Chavis C., Imbach J.-L. II An expeditious synthesis of homohiral (R) 2-(9-purinyl)butane-l,4-diols from (S) butane -1,2,4-triols. Nucleosides and Nucleotides (1992), v. 11, No 8, p. 1529-1537

31. Jenny T.F., Schneider K.C., Benner S.A. II N2-isobutyryl-06-2-(>-nitrophenyl)ethyl.guanine: a new building block for the efficient synthesis of carbocyclic guanosine analogs. Nucleosides and Nucleotides (1992), v. 11, No 6, p. 1257-1261

32. Wang P., Gullen В., Newton M.G., Cheng Y.-C., Schinazi R.F., Chu C.K. II Asymmetric synthesis and antiviral activities of L-Carbocyclic 2',3'-didehydro-2',3'-dideoxy and 2',3'-dideoxy nucleosides. J. Med. Chem. (1999), v. 42, No 17, p. 33903399

33. Escuredo V., Ferro В., Santana L., Teijeira M., Uriarte E. II 1,2-Disubstituted carbocyclic analogues of thymine nucleosides. Nucleosides and Nucleotides (1997), v. 16, No (7-9), p. 1453-1456

34. Delaye J., Naumberg M., Reyners Т. II Analogues non glycosidiques des nucleosides. III. Metylene tetrahydro-2'-furyl)-l- uracile. thymine et cytosine. (Metylene tetrahydro-2'-R-furyl)-l-uracile. J. Heterocyclic. Chem. (1969), v. 6, p. 229-234

35. De Koning H., Pandit U.K. // Unconventional nucleotide analogues. V. Derivatives of 6-(l-pyrimidinyl)- and 6-(9-purinyl)-2-aminocaproic acid. Rec. Trav. Chim (1971), v. 90, p. 874-884

36. Montgomery J. A., Temple C. Jr. // Synthesis of potential anticancer agents. IX. 9-Etyl-6-substituted-purines. J. Amer. Chem. Soc. (1957), v. 79, p. 5238-5242

37. Montgomery J.A., Temple C. Jr. // Synthesis of potential anticancer agents. XII. 9-Alkyl-6-substituted-purines. J. Amer. Chem. Soc. (1958), v. 80, p. 409-411

38. Konkel M.J., Vince R. II Synthesis and biological activity of cyclohexenyl nucleosides. cw-5-(9j7-purin-9-yl)-3-cyclohexenyl carbinols and their 8-azapurinyl analogs. Nucleosides and Nucleotides (1995), v. 14, No (9-10), p. 2061-2077

39. Marquez V.E., Bodenteich M. // Psicoplanocin A. A synthetic carbocyclic nucleoside with the combined structural features of neoplacin A and psicofuranine. Nucleosides and Nucleotides (1991)', v. 10, No (1-3), p. 311-314

40. Schaeffer H.J., Schwender C.F. II Enzyme inhibitors. 26. Bridging hydrophobic and hydrophilic regions on adenosine deaminase with some 9-(2-hydroxy-3-alkyl)adenines. J. Med. Chem. (1974), v. 17, No 1, p. 6-8

41. ЛидакМ.Ю. ,ШлукгЯ.Я., Поритере С.Е., ШвачкинЮ.П. //Новыйметод синтеза 6-замещенных пуринил-9-а-аминокислот. Получение а-амино-е-(6-хлорпуринил-9)капроновой кислоты. Химия гетероцикл. соед. (1971), No 3, с. 427-428

42. Dang О., Liu Y., Erion M.D. II A new regio-defmed synthesis of PMEA. Nucleosides and Nucleotides (1998), v. 17, No 8, p. 1445-1451

43. Rosenqnist A., Kvarnstorm I., Svensson S.C.T., ClassonB., Samuelsson В. I I Synthesis of carbocyclic 2',3'-dideoxy-2'-C-hydroxymethyl nucleosides as potential inhibitors of HIV. Org. Chem. (1994), v. 59, No 7, p. 1779-1782

44. Besada P., Teran C., Santana L., Teijeira M., Uriarte E. II Nucleoside analogues of purine with a l',2'-disubstituted cyclopentene ring. Nucleosides and Nucleotides (1999), v. 18, No (4-5), p. 725-726

45. Pontikis R, Monneret C. II Synthetic and antiviral studies of carboacyclic 6- and 2,6-substituted purine nucleosides. Nucleosides and Nucleotides (1993), v. 12, No 5, p. 547-558

46. Joyce R.M., Hanford W.E., Harmon J. И Free Radical-initiated reaction of ethylene with carbon tetrachloride. J. Amer. Chem. Soc. (1948), v. 70, p. 2529-2532

47. Несмеянов A.H., Захаркин Л.И. П аз-Хлоркарбоновые кислоты и некоторые их превращения. Изв. АН СССР, ОХН (1955), с. 224-234

48. Bookser B.C., Kasibhatla S.R., Appleman J.R., ErionM.D. //AMP deaminase inhibitors. 2. Initial discovery of non-nucleotide transition-state inhibitor series. J. Med. Chem. (2000), v. 43, No 8, p. 1495-1507

49. Friess S.L. II Reaction of per acids. II. The reaction of perbenzoic acid with simple cyclic ketones. Kinetic studies. J. Amer. Chem. Soc. (1949), v. 71, p. 2571-2575

50. Stork G., Terrell R., Szmnszkovicz J. IIA new synthesis of 2-alkyl and 2-acylketones. J. Amer. Chem. Soc. (1954), v. 76, p. 2029-2030

51. Hiinig S., Liicke E., BenzingE. II Kettenverlangerund von Carbonsauren um 6 CAtome. Chem. Ber. (1958), v. 91, p. 129-133

52. Stork G., Brizzolara A., Lcindesman H., Szmuszkovicz J., Terrell R. II The enamine alkylation and acylation of carbonyl compounds. J. Amer. Chem. Soc. (1963), v. 85, p. 207-222

53. Locke D.M., Pelletier S. W. II l-Methyl-6-ethyl-3-azaphenanthrene, a key degradation product of atisine. J. Amer. Chem. Soc. (1958), v. 80, p. 2588-2589

54. Несмеянов A.H., Захаркан Л.И., Кост Т.А., Фрейдлгта Р.Х. II А.Н. Несмеянов. Избранные труды. М. 1959, т. 3, с. 466-472

55. Досон P., Эллиот Д., Эллиот Т., Джонс К. // Справочник биохимика: Пер. с англ. М.: Мир, 1991 (Dawson R.M.C., Elliott D.C., Elliott W.H., Jones K.M. Data for biochemical res er ch. Oxford: Clarendon Press, 1986).

56. Титце JJ., Айхер Т. II Препаративная органическая химия: Пер. с нем. М.: Мир, 1999 (Tietze L.F., Eicher T.Reaktionen und Synthesen im orgamsche-chemischen Praktikum und Forschungslaboratorium. New York: Georg Thieme Verlag Stutgart, 1991).

57. МашковскийМ.ДЛ Лекарственные средства. M.: «Новая волна», т. 1, с. 75-80.

58. Физер П., Физер М. II Реагенты для органического синтеза. Пер. с англ. М.: Мир, 1970, т. 2, с. 314 (Fieser L.F., Fieser М. Reagents for Organic Synthesis. New York; London: Sydney: John Wiley and Sons, Inc., 1968).

59. Считаю своим долгом выразить искреннюю благодарность моему научному руководителю, кандидату химических наук Крицыну Анатолию Михайловичу за предоставленную тему, постоянное руководство ею.

60. Благодарю всех сотрудников Лаборатории химических основ биокатализа Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН за помощь и поддержку.