Индодикарбоцианиновые красители для флуоресцентного маркирования олигонуклеотидов и белков

Кузнецова, Виктория Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Индодикарбоцианиновые красители для флуоресцентного маркирования олигонуклеотидов и белков
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Индодикарбоцианиновые красители для флуоресцентного маркирования олигонуклеотидов и белков"

На правах рукописи

□D3454914

Кузнецова Виктория Евгеньевна

ИНДОДИКАРБОЦИАНИНОВЫЕ КРАСИТЕЛИ ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО МАРКИРОВАНИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И БЕЛКОВ

03.00.03 - Молекулярная биология 02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степепи кандидата химических наук

Москва 2008

003454914

Работа выполнена в Лаборатории биологических микрочипов Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Научный руководитель:

Кандидат химических наук Чудинов Александр Васильевич Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор Костяновский Ремир Григорьевич

Кандидат химических наук Александрова Людмила Александровна

Ведущая организация: Институт органической химии

им. Н.Д Зелинского РАН

Защита диссертации состоится "7 ' " О&КД&иД. 2008 г в "

К часов на заседании

диссертационного Совета Д 002 235 И при Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу. 119991, г Москва, ул Вавилова, д 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Автореферат разослан "11" ИА^Х 2008 г

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат химических наук

.М. Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Флуоресцентное маркирование является одним из наиболее используемых способов выявления результатов биоанализа в иммунологическом и гибридизационном анализе. Синтетическая доступность индодикарбоцианиновых красителей, их химическая устойчивость и фотостабилыюсть, высокие коэффициенты экетинкции и квантовые выходы флуоресценции делают их подходящими маркерами для анализа олигонуклеотидов и белков в технологии биологических микрочипов Благодаря поглощению и флуоресценции в ближнем ИК-диапазоне, индодикарбоцианиновые красители являются оптимальными для маркирования биомолекул, так как биоматериал в диапазоне длин волн 600-1200 нм имеет низкую собственную флуоресценцию, что приводит к уменьшению фонового сигнала и, следовательно, увеличению чувствительности регистрации флуоресцентного маркера. В качестве источника света для индодикарбоцианиновых красителей используют сравнительно недорогие полупроводниковые лазеры, характеризующиеся высокой интенсивностью свечения, что приводит к повышению флуоресцентного сигнала.

Одним из важнейших требований, предъявляемых к красителям, является возможность их ковалентного связывания с маркируемыми веществами, в данном случае, с олигонуклеотидами и белками. Для этих целей наиболее подходящей реакционноспособной группой является карбоксильная Введение различных заместителей в гетероциклические фрагменты флуорофора, изменение места присоединения реакционноспособной карбоксильной группы и длины полиметиленовой цепочки, отдаляющей карбоксильную группу от флуорофора, приводит к изменению физико-химических свойств маркера

Целью исследования является разработка метода синтеза асимметричных индодикарбоцианиновых красителей, содержащих карбоксиалкильную группу и различные заместители в индолешшовом ядре, а также изучение влияния этих функциональных групп на спектрально-люминесцентные характеристики красителей, предназначенных для флуоресцентного маркирования олигонуклеотидов и белков в технологии биологических микрочипов. В соответствии с поставленной целью в работе предполагалось решить следующие основные задачи:

1. Разработка метода синтеза индодикарбоцианиновых красителей, а также их активных производных, необходимых для получения флуоресцентно меченых олигонуклеотидных праймеров, белков и трифосфатов нуклеозидов

2 Синтез асимметричных индодикарбоцианиновых красителей с карбоксиалкильной группой (карбоксибутил - положение 3 или карбоксиэтил - положение 5) и различными заместителями в положениях 1, Г, 5, 5', 7' индолениновых фрагментов.

3. Выявление влияния расположения и природы заместителей в гетероциклических фрагментах на спектральные характеристики красителей

4. Маркирование индодикарбоцианиновыми красителями олигонуклеотидных праймеров, белков, трифосфатов нуклеозидов и испытание полученных флуоресцентно меченых продуктов в технологии биологических микрочипов

Научная новизна. Разработана схема синтеза и отработаны препаративные методики получения 6-метил-7-оксооктановой кислоты, которая послужила основой для синтеза индоленинов с карбоксибутильной группой в положении 3 и различными заместителями в положениях 1 и 5. На их основе синтезировано 32 новых асимметричных индодикарбоцианиновых красителя с реакционноспособной карбоксильной группой, расположенной в положении 3 и отдаленной от индоленинового фрагмента на тетраметиленовую цепочку атомов.

Разработана схема синтеза и отработаны препаративные методики получения гидрохлорида 4-(2-карбоксиэтил)фенилгидразина, который послужил основой для синтеза индоленинов с карбоксиэтильной группой в положении 5 и различными заместителями в положении 1 На их основе синтезировано 7 новых асимметричных индодикарбоцианиновых красителей, у которых реакционноспособная карбоксильная группа расположена в положении 5 и отдалена от индоленинового фрагмента на диметиленовую цепочку атомов

Выявлено влияние расположения, природы и количества функциональных групп в индолениновых фрагментах на спектрально-люминесцентные свойства синтезированных красителей Отработаны методики синтеза, выделения и очистки Л'-гидроксисукщшимидных эфиров индодикарбоцианиновых красителей

Синтезировано 39 новых асимметричных индодикарбоцианиновых красителей, которые различаются гидрофильными свойствами, максимумами поглощения и флуоресценции, значениями квантового выхода флуоресценции и молярного коэффициента экстинкции, суммарным электрическим зарядом.

Практическая значимость работы. Выявленные в ходе работы закономерности изменения спектрально-люминесцентных характеристик в зависимости от природы и расположения функциональных групп могут быть использованы для синтеза индоцианиновых красителей с заранее заданными свойствами

Синтезированные индодикарбоцианиновые красители прошли испытания в Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН. Для технологии биологических микрочипов был выбран наиболее подходящий флуоресцентный маркер - натриевая соль 3-(4-карбоксибутил)-3,3',3'-триметил-1,Г-Ди(4-сульфонатобутил)-индодикарбоцианина Этот краситель в виде Л'-гидроксисукцинимидного эфира нашел применение для маркирования синтетических олигонуклеотидов и белков, и вошел в состав сертифицированных коммерческих диагностических тест-систем в виде флуоресцентно меченых олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых антител.

- набор реагентов для выявления микобактерий туберкулеза и определения их лекарственной чувствительности к рифампицину и изониазиду (ТБ-биочип), к фторхинолонам (ТБ-биочип-2),

- набор реагентов для выявления и диагностики генетической предрасположенности к развитию некоторых онкологических заболеваний и для определения индивидуальной чувствительности к ряду лекарственных препаратов (ПФ-биочип);

- набор реагентов для одновременного количественного определения шести маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови (ОМ-биочип), для определения общей и свободной форм простат-специфического антигена (ОМ-биочип-ПСА).

Апробация работы. Результаты работы были представлены в XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004), на X международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2004» (Волгоград, 2004), на X молодежной конференции по органической химии (Уфа, 2007) Отдельные фрагменты диссертационной работы докладывались на научных семинарах Лаборатории биологических микрочипов РАН

Публикации. По материалам диссертации получен международный патент на изобретение, опубликовано 6 статей в ведущих международных и отечественных научных журналах, 3 тезисов докладов на конференциях

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация содержит схем, рисунков и 15* таблиц Список цитируемой литературы включает А/Р наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Флуорофорное ядро цианиновых красителей состоит из двух гетероциклических фрагментов, соединенных сопряженной полиметиленовой цепочкой атомов Природа заместителей и места их связывания с флуорофором влияют на растворимость, образование межмолекулярных агрегатов, яркость флуоресценции маркированных биомолекул и на специфичность образуемых ими комплексов Ориентация флуорофора относительно маркированной биомолекулы и длина полиметиленовой цепочки, отдаляющей флуорофор от биомолекулы, существенно сказываются на неспецифическом связывании маркированных биомолекул.

Заранее предсказать природу заместителей и места их связывания с флуорофором для получения наиболее эффективной флуоресцентной метки невозможно. С целью их поиска в известные флуорофоры вводят различные заместители, изменяют места присоединения реакционноспособной карбоксильной группы к гетероциклическому фрагменту флуорофора и длину полиметиленовой цепочки, отдаляющей карбоксильную группу от флуорофора

Синтез цианиновых красителей состоит из 4 основных блоков: синтез гидрохлорида дифенилимина малонового альдегида - электрофильного соединения для получения полиметиленовой цепи, соединяющей два гетероциклических фрагмента красителя, синтез шщолениниевых оснований с реакционноспособной группой и без нее, конденсация этих промежуточных соединений с образованием асимметричных индодикарбоцианиновых красителей и их активных производных.

Нами был осуществлен синтез производного малонового диальдегида (4) (схема 1). Реакцией этилвинилового эфира (1) и триэтилортоформиата (2) в присутствии эфирата трехфтористого бора был получен тетраэтилацеталь малонового альдегида (3). Далее при действии гидрохлорида анилина был получен соответствующий дифенилимин (4) с выходом 60%

Схема 1

СН(ОС,Н«)3 2 5 „. 25 ,,, С1

(2) (3) 69% (4)60%

Для введения в молекулу красителя различных алкильных заместителей и сульфогрупп были синтезированы соответствующие гидразины, из которых, в свою очередь, были получены индолешгаы и их Л'-замещенные производиьге (схема 2).

Схема 2

к.

N112 (5Ь-(1)

5,6,7-10. Я1 = Я2 = Н (а); Я1 = СН3, Я2 = Н (Ь), Я1 = Я2 = СН3 (с); Я1 = БОГ, Я2 = Н ((1)

Диазотирование исходного ароматического амина (5Ь-<1) проводили в соляной кислоте раствором ЫаЫОг в воде Восстановление диазониевой соли осуществляли БпСЬ-гНгО (5Ь-с) или КагЗОз (5(1) в соляной кислоте, что приводило к образованию соответствующих замещенных фенилгидразинов (6Ь-(1) Циклизация по Фишеру производных фенилгидразипа является основным способом образования индоленипового ядра Индоленины (7а-<3) были получены с хорошим выходом нагреванием З-метил-2-бутанона (8) и гидразинов (6а-с1) в АсОН В случае использования гиярохлоридов (6Ь-с) циклизацию проводили в присутствии АсСЖа. Индоленин (7(1) перед кватернизацией превращали в соответствующую калиевую соль. Реакция соединений (7а-(1) с этил иодидом и 4-гидрокси-1-бутансульфоновой кислотой приводила к образованию соответствующих замещенных солей индолениния (9а-(1) и (10а-(1).

Для изучения влияния дополнительных фенильных заместителей в индолениновых фрагментах на спектральные характеристики и физико-химические свойства цианиновых красителей были синтезированы соответствующие соли индолениния (14,18) (схема 3,4)

Реакцией бифениламина (11) и концентрированной НгБС^ была получена дифениламин-4,4'-дисульфокислота (12), которую выделяли в виде ее натриевой соли (схема 3) Последующее нитрозирование амина (12) и восстановление полученного нитрозосоединения Тп в АсОН приводило к образованию соответствующего гидразина

(13) Индолениниевую соль (14) получали циклизацией по Фишеру гидразина (13) и 3-метил-2-бутанона (8) Проведение гетероциклизации в водных растворах неорганических кислот или в присутствии АсСЖа делает затруднительным отделение целевого продукта

(14) от образующихся в ходе реакции неорганических солей. В ледяной АсОН процесс образования индоленина останавливается на стадии получения гидразона. Нами было

обнаружено, что проведение реакции в смеси АсОН - ЕЮН в присутствии большого избытка ¿пСЬ позволяет синтезировать соль индолениния (14) с выходом 75%

Схема 3

Диазотирование 1-нафтиламин-5-сульфоксилоты (15) проводили в разбавленной серной кислоте раствором NaNCh в воде (схема 4) Гидразин (16) получали восстановлением диазониевой соли при помощи SnCh 2Н2О в соляной кислоте Последующая обработка эквимолярным количеством КОН приводила к образованию соответствующей калиевой соли гидразина (16). Калиевая соль 6-сульфо-2,3,3-триметилбензо[|;]индоленина (17) была синтезирована нагреванием гидразина (16) и 3-метил-2-бутанона (8) в АсОН

Схема 4

SOjH SOjK II,

'■NaN0'„ rY^i (8) I, fi"УУ" M*it

2. SnCl2, HCl A^nn* KOjS^Jl^L-ff "o3s

T 3.KOH T II T

(15) NHj (16) NHNH, (17)

При действии Mel на раствор индоленина (17) в ацетонитриле в присутствии диизопропилэтиламина (DIPEA) была получена соответствующая бензоиидолениииевая соль (18). Следует отметить, что взаимодействием бензо[)>]индоленина (17) с такими алкилирующими реагентами, как Etl, 4-гидрокси-1-бутансульфоновая кислота, этиловый и метиловый эфир и-толуолсульфоксилоты, 6-бромтексановая кислота нам не удалось получить соответствующие jV-замещенные производные. Структура всех промежуточных и целевых соединений подтверждена данными масс-спектрометрии и ЯМР 'Н спектроскопии.

Синтез 6-метил-7-оксооктановой кислоты и иидоленинов на ее основе

Индоленины с карбоксиалкильным заместителем в положении 3 получали из соответствующей кетокарбоновой кислоты (25) с концевой карбоксильной группой Кетокислоту (25) синтезировали ретроконденсацией Кляйзена из циклогексанона (19) (схема 5)

Синтез 2-ацетилциклогексанона (22) проводили двумя способами' ацетипированием циклогексанона (19) комплексом BF3-2AcOH и действием AcCI в хлороформе на морфолиновое производное циклогексена (21) в присутствии Et3N Выход дикетона (22) составил 50% и 60% соответственно 2-Ацетилциклогексанон (22) по

данным 'Н ЯМР спектра (СОСЬ) находится в енолизованной форме, о чем свидетельствует наличие характерного сигнала в слабом поле (15 80 м д)

Схема 5

° , , с,,н5сн3, 011;;^7глгсоа.зГ,н, Хсоснз

+ кх^р-С1ЬС<Н4503Н Д. 2. на а, N¡.011 аЧ и^! 3

(19) 4(20) М (22) (23)

О о

.СНзОЦ. ИзСДу^-^соосн3 НС'% ^ хоон

С"з (24) (25)

Селективное метилирование в положение 2 цикла соединения (22) зависит от алкилирующего агента и от условий проведения реакции Нами был получен 2-ацетил-2-метилциклогексанон (23) с выходом 75% Метилирование проводили действием Ме! в присутствии водного раствора КаОН.

Нами обнаружено, что раскрытие цикла дикетона (23) проходит по двум направлениям и приводит к смеси разных продуктов в зависимости от вводимого в реакцию основания (схема 6)

Схема 6

СООС1Г, О

-Н,С

^VS + rVH3

О /и L. + 4.J

II ' cilj (24) HjC - -

А^СОСН, 0 (26) (27)

A^'b °

(23) N—~ AcOH + I J + H3C' NaOH

Na0H CIIj (25)

ООН

• н3с у ~ ~

(27)

Проведение реакции в 10%-ном водном растворе NaOH способствует дезацетилированию соединения (23) и образованию 2-метилциклогексанона (27) с выходом 60%, тогда как кислоту (25) удалось выделить с выходом 10%. Проведение реакции в присутствии MeONa позволяет получить соединения (24), (26) и (27) с выходом 35%, 30% и 15% соответственно. Наилучшие результаты получены при использовании MeOLi. При этом уменьшается суммарный выход побочных продуктов (26) и (27) до 30%, и кетоэфир (24) удается выделить с выходом 52%.

Нами были подобраны оптимальные условия кислотного гидролиза эфира (24) Оказалось, что для достижения максимального выхода (75%) кетокислоты (25) необходимо использовать 30%-ную HCl. Структура всех полученных соединений подтверждена данными масс-спектрометр ли и ЯМР 'Н спектроскопии

Дальнейшее взаимодействие кетокислоты (25) и замещенных фенилгидразинов (6а—с) проводили циклизацией по Фишеру в кипящей АсОН в одну стадию без выделения промежуточных фенилгидразонов (28а-с) (схема 7). После дополнительной перекристаллизации из смеси Et20 : гексан (28Ь) или AcOEt : гексан (29с) индоленины были получены с выходом 78% и 84% соответственно. Водорастворимый индоленин (29а) выделяли в виде калиевой соли с выходом 83%. Алкилирование соединений (29а-с) этил

иодидом и 4-гидрокси-1-бутансульфоновой кислотой привело к образованию соответствующих иидолениниевых производных (ЗОа-Ь) и (31а—с)

Схема 7

6,28-32- Я = 50з~ (а); Я = Н (Ь); Я = СН3 (с)

Нами обнаружено, что при взаимодействии индоленинов (29а-с) и 4-гидрокси-1-бутансульфоновой кислоты всегда образуется смесь продуктов Ы— и О-сульфоалкилирования (31а-с) и (32а-с), причем выход производных (32а-с) увеличивается в ряду (32Ь)<(32с)<(32а) Полученную смесь солей индолениния (31) и (32) использовали без разделения на следующей стадии синтеза красителей

Кватернизованный индоленин (33) с сульфофенильным заместителем в положении 1 синтезировали из соответствующей динатриевой соли А^-дифенилгидразин-4,4'-дисульфокислоты (13) и кетокислоты (25) (схема 8) Реакцию проводили в смеси АсОН -ЕЮН в присутствии большого избытка 2пС12, при этом индолениниевое основание (33) было выделено с выходом 70%

Схема 8

БензоИиндоленин (36) получали из гидрохлорида 1-нафтилгидразина (35) (схема 9) Диазотирование 1-нафтиламина (34) проводили в большом объеме -1% НС1 при помощи мелко измельченного КаКСЬ. Восстановление соли диазония осуществляли действием БпСЬ^НгО в соляной кислоте, при этом гидрохлорид гидразина (35) был выделен с выходом 70% Реакцией гидразина (35) и кетокислоты (25) в присутствии 5-кратного избытка 30%-ной Н^СХ был получен соответствующий индоленин (36). В ледяной АсОН, в присутствии 2пС1г, в разбавленной НСЮ4 и Н3РО4 всегда

образовывалась смесь индоленина и гидразона Последующее взаимодействие индоленина (36) и Mel в ацетонитриле привело к образованию индолениниевого производного (37)

Схема 9 СООН COOII

r^Nj^l 1. Na.VO;, HCI r^Y^l (2S) Mel^

кьДч^ 2. SnCl;, HCI II2S04 „ ЦуДч.

(34) N»i (35) NHNHyHCl (36) kj» ' ¿»J LJ

(37)

Структура индоленинов и их ^-замещенных производных подтверждена дапными масс-спектрометрии и ЯМР 'н спектроскопии Введение заместителей в положения 1 и 5 приводит к появлению дополнительных сигналов в !Н ЯМР спектре, соответствующих метальному, этильному, сульфопатобутпльному или фенильному заместителям, и не оказывает сильного воздействия на величины химических сдвигов сигналов протонов, характерных карбоксибутильному фрагменту и индоленшювому ядру.

Для всех синтезированных индоленинов и их производных была определена температура плавления Введение двух сульфогрупп (в положения 1 и 5) способствует резкому повышению т пл до 225°С, в то время как наличие только одного сульфонатобутильного заместителя приводит к ее значительному понижению до 48-50°С

Синтез гидрохлорида 4-(2-карбоксиэтил)феннлгидразина и индоленинов

на его основе

Исходным соединением для синтеза индоленина (44) и его производных (45а-Ь), содержащих функциональную группу в положении 5, является гидрохлорид 4-(2-карбоксиэтил)фенилгидразина (43), синтез которого представлен на схеме 10.

3-(4-Нитрофенил)-акрилонитрил (40) получали из 4-нитроанилина (38) через 2-хлор-3-(4-нитрофенил)-пропионитрил (39). Гидролизом соединения (40) в концентрированной Н3РО4 получали 3-(4-ннтрофенил)-2-пропеновую кислоту (41) с выходом 92%.

Схема 10

Дальнейшее восстановление кислоты (41) может проходить по нескольким направлениям (схема 11, табл 1) Нами были подобраны условия восстановления как

ннтрогруппы, так и двойной углерод-углеродной связи в одну стадию (табл 1) Проведение реакции в АсОН позволило снизить время гидрирования до 2.5 ч и повысить выход целевого соединения (42) до 96% Последующее диазотирование соединения (42) и восстановление диазониевой соли БпСЬ 2НгО в соляной кислоте приводило к образованию гидрохлорида 4-(2-карбоксиэтил)фенилгидразина (43) с выходом 56% ■

Схема 11

спои ад-нл

ООСН,

Таблица 1. Условия реакции гидрирования 3-(4-нитрофенил)-2-пропеновой кислоты (41) в присутствии 5% Рё на угле.

Восстановитель Растворитель Про,-пет Выход, %

ььн, Н20 ЕЮН (46) 2 70

н2 МеОН, 5М НС1 (47) 3 80

НС1 (1М) (42) 6 81

НС1 (1М) АсОН (1 1) 45 80

НС1 (5М): АсОН (1.1) 8 83

АсОН 25 96

Индоленин (44) получали с выходом 55% циклизацией по Фишеру гидразина (43) и метилизопропилхетона (8) в АсОН в присутствии ацетата калия без выделения образующегося в ходе реакции гидразона. Алкилирование соединения (44) этил иодидом и 4-гидрокси-1-бутансульфоновой кислотой приводило к образованию соответствующих индолениниевых производных (45а) и (45Ь) Структура всех промежуточных соединений (39-43, 46, 47), шщоленина (44) и его /^-замещенных производных (45) подтверждена данными масс-спектрометрии и ЯМР 'Н спектроскопии.

Синтез индодикарбоцианиновых красителей

Цианиновые красители образуются путем соединения двух различных кватернизованных индопенинов через полиметиленовую цепочку, состоящую из пяти сопряженных метиленовых групп Второй индоленин, в свою очередь, отличается по строению и содержит карбоксильную группу для последующей активации флуорофора (схема 12) Путем введения соответствующих заместителей Я1, Я2, Я3, Я4 и Я5 можно варьировать спектральными характеристиками, суммарным электрическим зарядом и растворимостью цианиновых красителей

Методы получения асимметричных цианиновых красителей (54) и (57) различаются по порядку смешения реагентов и соотношению растворителей. В зависимости от вводимой на первой стадии индолениниевой соли (48) синтез индодикарбоцианиновых красителей проводили нагреванием в АсгО или в смеси АсгО-АсОН (таблица 2) Основная реакция заключается в образовании замещенных ацетанилидов (49) из кватернизованных индоленинов (48) и дифенилимина (4) Данные

интермедиаты (49) очень нестабильны, однако они образуются с высоким выходом, и, таким образом, для проведения следующей стадии, их возможно использовать без выделения. Ход реакции контролировали спекгрофотометрически, при этом по мере образования ацетанилида (49) происходило постепенное уменьшение интенсивности пика на длине волны 270-280 нм и соответственно рост интенсивности нового пика на длине волны 440-450 нм При длительном нагревании в качестве побочного продукта всегда образовывался симметричный краситель (52) В некоторых случаях (табл 2) добавление в реакционную массу ацетилхлорида позволило снизить его выход

Схема 12

Последующая конденсация полупродукта (49) и карбоксилсодержащей кватернизованной индолениниевой соли (50) или (51) в АсгО в присутствии конденсирующего агента - диизопропилэтиламша иди безводного АсОК - приводит к образованию смеси двух симметричных (52), (53) или (52), (56) и асимметричного (54) или (57) красителей Следует отметить, что использование безводного АсСЖа резко уменьшает выход целевого продукта (54) или (57).

В ходе реакции помимо асимметричных красителей (57) в разном количестве всегда образовывался индодикарбоцианин общей формулы (59) Это является следствием использования солей индолениния (51) в виде смеси двух продуктов (31а-с) и (32а-с).

Таблица 2. Структура синтезированных индодикарбоцианиновых красителей

R4 R! RJ a"

Imd J*i R1 R1 R3 R< R5 Заряд Способ синтеза* Выход %

509 H c,H, 0 48

508 Е (CHJ4S03- (Ъ) 72

507 О (CH^SOj- CH, -1 55

510 и SO," H C,ll. 28

513 i (CHJ4SO,- -2 33

521 о CjH; H 0 (с) 50

516 SO," H CjH, 53

coon

R ¿5 R2 =Yr1

Imd № R' R1 RJ R' Rs Заряд Способ синтеза* Выход %

519 H C:H, 0 (а) 38

504 (CH;)4SO,- -1 (с) 48

525 CH, c,H, 0 00 32

526 Н H (CH^SO,- 36

520 SO," C,H, W 22

512 (CH,),SO,- -2 32

527 CH, C,Hs 0 (а) 20

528 (CH^SOj- (CH^SO,- 5

52» H C;H. 7

530 (CH^SO,- -2 24

533 CH, c-ji, -1 9

534 H (CH,)4SO,- -2 40

531 SOj" C,H, 29

532 SOj" (CH,)«SO,- -3 W 41

535 CH, C,HS -1 6

53« (CH^SO,- -2 4

547 H C5H5 0 18

548 (CH2)4SO,- 20

549 c2H, SO," H C,H, 14

550 <CH,),.SO,- -2 19

546 н H (CH,).SO,- (Ь) 28

545 SO," H C,H, 0 27

537 H C,H, 18

538 (CH,),SO,- -1 (а) 29

541 CH, C,H. 0 27

542 СН3 (CH^sOj- H (CH,),SO,- 23

539 so," C;II, (с) 18

540 (CH,),SO,- -2 50

543 CH, C,H, 0 00 17

544 (CH,).SOj- -1 (с) 5

551 SO," QH.SO," SO," H C6H4SO," -3 15

558 jD^ , (CH^COOU 0 (а) 51

* (а) 1 ст: Ас20, АсОН, 2 ст Ас20, DIPEA, (b) 1 ст. Ас20, АсС1,2 ст. Ас20, D1PEA, (с) 1 ст Ас20, АсОН, 2 ст. Ас20, АсОН, АсОК.

Гидролизом соединения (59) в О 5М соляной кислоте при нагревании до 90°С в течение 5 ч получали индодикарбоцианин (57) с выходом 95% (схема 13). Таким образом, по завершению реакции конденсации (схема 12) и образования смеси красителей (57) и (59) проводили кислотный гидролиз реакционной массы

Схема 13

В таблице 2 представлены разработанные нами 39 новых сульфоиндодикарбоцианиновых красителей с карбоксильной группой положениях 3 и 5 и различными заместителями в положениях 1, 1', 5, 5' и 7' (далее все красители будут иметь сокращение 1ш<1№ - первая цифра номера означает количество метиленовых групп в полиметиленовой цепи) Все красители выделяли обращено-фазовой хроматографией на С18-ЯР колонке, соединенной с программируемым градиентным насосом, в системе МеСЫ-0.05М триэтиламмоний-ацетатный буферный раствор в линейном градиенте концентраций от 0 до 50% МсСК Чистые красители, полученные в виде триэтиламмониевых солей, далее переводили в натриевые соли Следует отметить, что литиевые соли красителей (54) и (57) крайне нестабильны при хранении Данная процедура очистки позволяет удалить различные промежуточные соединения, предшественники, симметричные красители и неорганические соли В зависимости от структуры цианиновых красителей выход располагался в пределах от 4% до 72% Структура и индивидуальность соединений (54) и (57) была подтверждена методом ТСХ, данными ЯМР Н спектроскопии и масс спектрометрии (МАЬИ-ТОР)

Для ковалентного связывания красителей с биомолекулами (синтетическими олигонуклеотвдами и белками) широко используются такие реавдионноспособные функциональные группы, как Л'-гидроксисукцинимидные эфиры. Активные производные были получены этерификацией красителей (54) и (57) Д'-гидроксисукцшшмидом в присутствии ОСС в ВМР. Активированные эфиры (55) и (58) были выделены с количественным выходом (90-95%) обращено-фазовой хроматографией в нейтральной смеси растворителей (вода - ацетонитрил).

Синтезированные активные производные (55, 58) далее использовали для маркирования ДНК, которое можно осуществить двумя методами - химическим и ферментативным Классическим методом маркирования нуклеиновых кислот, используемых в технологии биологических микрочипов, является введение в олигонуклеотид по 5'-концу флуоресцентного красителя. Для этого активированные производные индодикарбоцианинов (55) и (58) ковалентно присоединяли к синтетическим олигонуклеотидам (60), содержащим аминолинкер с Сб-спейсером на 5'-конце, в смеси ацетонитрил - карбонатный буферный раствор с последующей инкубацией при комнатной температуре (схема 14). После удаления избытка красителя экстракцией н-бутанолом маркированные олигонуклеотиды (61) и (62) выделяли с помощью НР1Х с

выходом ~70%. Молекулярные массы полученных конъюгатов были подтверждены с помощью МА1ЛМ-масс-спектрочетрического анализа

Схема 14

О (58)/

н^^М^о-г-о-, о в

(60) £ ч" .

(55)\К-

СН2ОН (61)

О н

о~

сн2он

(62)

о=р-о-

Синтезированные конъюгаты различаются ориентацией метки относительно маркированной биомолекулы вследствие разного расположения карбоксильной группы красителя. У индодикарбоцианиновых красителей (54) реакционноспособная карбоксиэтильная группа ориентирована вдоль главной оси флуорофорного ядра красителя и присоединена в положении 5 индолешшового фрагмента Карбоксибутильная группа индодикарбоцианиновых красителей (57), расположенная в положении 3 индоленинового ядра, обеспечивает определенную пространственную ориентацию флуорофора относительно олигонуклеогида, уменьшая стерические препятствия и влияние заместителей Я2 и Я5.

Альтернативным способом маркирования является введение меток в ДНК в виде флуоресцентно меченых трифосфатов нуклеозидов на стадии наработки кДНК методом ГГЦР. Этот способ маркирования позволяет добиться более высокой чувствительности, так как маркер вводится не по 5'-концу (в единственном числе), а в большем количестве вместе с нуклеотидами в ПЦР

5-(Аминоаллил)-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат (ААсШТР) обрабатывали соответствующими активированными производными красителей (64) (схема 15 на примере красителя 1пк1545) п-Нитрофениловые эфиры (64) получали действием л-нитрофенола на раствор красителя в ИМР в присутствии гексафторфосфата 0-(бензотриазол-1-ил)-НН,Ы',>Г-тетраметш1мочевины и 01РЕА Затем охлажденную реакционную массу (без выделения полученных активных производных) добавляли в раствор ААЛЛР в 0 1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе с каталитическими количествами Л^-метилимидазола, 4-диметиламинопиридина и Э1РЕА.

Флуоресцентно меченые трифосфаты выделяли сначала ионообменной хроматографией на ОЕАЕ-целлюлозе в линейном градиенте концентраций от 0 до 0.4М ИРинСОз в 40% МеОН, а затем обращено-фазовой хроматографией на С18-КР колонке в системе МеСЫ-О 1М триэтиламмоний-гидрокарбонатный буферный раствор в линейном градиенте концентраций от 0 до 50% МеСЫ. В зависимости от используемого красителя выход флуоресцентно меченых продуктов варьировался в интервале 25-60%.

Схема IS

Спектральные исследования цианиновых красителей и их конъюгатов

Для всех синтезированных красителей общей формулы (54) и (57) были определены максимумы поглощения и флуоресценции, молярные коэффициенты экстинкции и относительные квантовые выходы флуоресценции в метаноле и в водном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) (10 мМ калий фосфатный буфер, 0.9% NaCl, pH 7.4) Индодикарбоцианины являются красителями ближнего инфракрасного диапазона Эти красители поглощают в области 650 нм со сдвигом Стокса 15-18 нм, благодаря этому в качестве источника возбуждения используют полупроводниковые лазерные источники света с различными фильтрами возбуждения и регистрации. Цианиновые красители характеризуются узкими интенсивными полосами поглощения и испускания, высокими показателями молярного коэффициента экстинкции (до 250000 л моль''-cm"1) и удовлетворительными значениями квантового выхода флуоресценции (до 0 34).

Синтезированные нами индодикарбоцианины различаются положением максимумов поглощения и флуоресценции, что достигнуто путем введения в молекулу красителей дополнительных метильных и фенильных заместителей. Растворимость в воде и общий заряд красителя изменяется в зависимости от количества введенных сульфогрупп Непосредственное введение заместителей в ароматическую систему хромофора (метил, карбоксиэтил и сульфогруппа) приводит к незначительному батохромному сдвигу максимумов поглощения и флуоресценции (~5-10 нм) Природа заместителей при гетероциклическом атоме азота также ограниченно влияет на максимум поглощения Следует отметить, что наличие сульфофенильных заместителей в положениях 1 и Г красителя способствует небольшому батохромному сдвигу (~10 нм) и увеличению сдвига Стокса с 16-18 до 24 нм. Аннелирование индолениновых фрагментов

красителя (положения [g] и [g']) приводит к батохромному сдвигу в область длин волн -700 нм и сильному уширению полос в спектрах поглощения и флуоресценции

Квантовый выход (Q) вычисляли относительно красителя Су5 (Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) с квашовым выходом 32% в метаноле и 27% в PBS (ыбл 3) Введение сульфогрупп в позиции 1, Г, 5 и 5' хромофора приводит к увеличению квантового выхода до 31% (ImdS32) (PBS) Наличие в структуре красителя бензо^]индолеш1новых фрагментов (Imd558) способствует резкому уменьшению квантового выхода до 1% (метанол). В органических растворителях (метанол) значения квантового выхода немного выше, чем в водных растворах

Таблица 3. Структура индодикарбоциашшовых красителей с карбоксильной группой в

положении 1 индоленинового фрагмента

R1 | R2 RJ

RV CyS SOj" C2H5

4s к3 (CH2)5COOH Imd501 H

Irad505 (CH^SOj-

ImdS06 S03" | H

Молярные коэффициенты экстинкции были определены на основании данпых оптической плотности растворов с различной концентрацией красителей (10"7-10'6 моль/л) в PBS и в безводном метаноле Измеряли оптическую плотность выше перечисленных растворов в максимуме поглощения для каждого красителя По полученным данным строили график зависимости оптической плотности от концентрации и методом наименьших квадратов определяли значение коэффициента экстинкции Следует отметить, что коэффициент экстинкции коммерчески-доступного Су5, определенный данным способом, совпал с данньмч, представ пенными в литературе, что подтверждает достоверность полученных результатов

Из всех исследованных нами заместителей оказалось, что введение сульфонатобутильных групп в положение 1 индоленинового фрагмента позволяет повысить молярный коэффициент экстинкции до 245000 (Imd504). Аннелирование индоленинового фрагмента (положения [g] и [g']) (Imd558) приводит к резкому его уменьшению до 145000.

Понятие чувствительности регистрации флуоресценции определяется абсолютной чувствительностью метки, которую можно представить произведением значений коэффициента экстинкции и квантового выхода флуоресценции. Также данный параметр можно вычислить, определив интенсивность флуоресценции при возбуждении и регистрации в максимумах поглощения и флуоресценции красителя Таким образом, была определена абсолютная чувствительность регистрации индодикарбоцианинов (54) и (57).

В технологии биологических микрочипов результаты анализа регистрируют на флуоресцентном анализаторе биочипов, снабженном промышленными полупроводниковыми лазерными источниками света с длиной волны 635 (20мВт) и 655 нм (40мВт), обеспечивающим регистрацию флуоресценции па 670 и 690 нм соответственно Была определена относительная эффективность флуоресценции красителей (54) и (57) при одинаковой концентрации в МеОН и в PBS растворах. Она равна отношению входного сигнала к выходному сигналу.

Сигнал флуоресценции определяли при возбуждении на длинах волн 635 и 655 нм и регистрировали соответственно на длинах волн 670 и 690 нм (погрешность измерения ~1%) Во всех случаях ширина полосы составляла 1 нм Полученные результаты были нормированы на максимальное значение, полученное для красителя Imd532 в PBS Водные растворы полисульфированных красителей (Imd531, Imd532, Imd549, Imd550) обладают высокими значениями относительной эффективности флуоресценции как в области 635 нм / 670 нм, так и в области 655 нм / 690 нм, что в 2.5-5 раз превышает значения, полученные для гидрофобного красителя Imd501 (табл 3). Благодаря батохромному смещению максимумов поглощения и флуоресценции тетрасульфированного красителя Imd551, происходит увеличение относительной интенсивности флуоресценции в области 655 нм / 690 нм При сравнении дисульфированных красителей оказалось, что наибольшая относительная эффективность флуоресценции у индодикарбоцианинов с симметричным расположением сульфогрупп -Imd549 и Imd504

Было изучено влияние температуры на спектрально-люминесцентные характеристики растворов индодикарбоцианиновых красителей в PBS (рН 7 4) (рис. 1) Анализ полученных результатов показал, что как при охлаждении, так и при нагревании растворов исследуемых красителей формы спектров поглощения и флуоресценции остаются неизменными Интенсивность флуоресценции растворов красителей резко уменьшается при увеличении температуры от +5°С до +95°С, при этом характерно отсутствие температурного гистерезиса даже при длительном нагревании. Полученные данные незначительно изменяются при увеличении рН раствора до 8 5.

^ 0,0 -I-1-1-1-1-1-1-1-1---1-1-1-i-1-1-1---1

2 5 15 25 35 45 55 65 75 85 95 температура, °С

Рис. 1. Влияние температуры на флуоресценцию растворов индодикарбоцианиновых красителей в PBS.

Было выявлено воздействие температуры на интенсивность флуоресценции олигонуклеотидов, маркированных индоднкарбоцианиновыми красителями и нанесенных на гидрогелевые ячейки микрочипа (рис. 2) Оказалось, что при понижении температуры с +20°С до +5°С и -20°С интенсивность флуоресценции увеличивается на 5% и 20%

соответственно На основании полученных данных можно сделать вывод, что в полнакриламидном геле флуоресценция нндодикарбоцианиновых красителей незначительно зависит от температуры

5 I

« Э

0,75

ь ■»•к

- г,^ Уг

[ » ы ■г'

20 5

температура,

-20

Рис. 2. Влияние температуры на флуоресценцию олигонуклеотидов,

маркированных красителем 1т<1594 и нанесенных на полиакрилампдные ячейки микрочипа (совместно с Е.Е. Фесенко, В М Михайловичем)

Флуоресцентно меченые олигонуклеотиды (61) и (62) были иммобилизованы в полиакриламидные гелиевые ячейки микрочипа и подверглись непрерывному облучению на флуоресцентном микроскопе на длине волны 655 им. Время полураспада красителей сильно различается - от 1 5-2 5 ч (для представленных в литературе водорастворимых красителей с карбоксигексильным заместителем в положении 1 индоленинового фрагмента (табл. 3) - 1шй505, ¡т<1506) до 5-7 ч (для красителей формул (54), (57) и 1тс1501 с различным количеством и расположением сульфогрупп) (рис 3). Оказалось, что наличие метальной группы в положении 5 красителя (1т(1507) приводит к резкому снижению времени полураспада. Следует отметить, что после прекращения облучения спектры поглощения и флуоресценции не восстанавливаются

Рис. 3. Зависимость интенсивности флуоресценции от времени при облучении красителей полупроводниковым лазерным источником света (655 нм / 690 нм, 40 мВт) (совместно с Н.В Сорокиным).

Были записаны электронные спектры поглощения маркированных олигонуклеотидов (рис. 4) Из полученных результатов следует, что между красителем и

олигонуклеотидом не существует никаких дополнительных взаимодействий, которые приводили бы к существенным изменениям спектральных характеристик, что и необходимо для дальнейшего использования этих красителей в качестве флуоресцентных меток в гибридизационном анализе на биологических микрочилах

260 им

200

400

"Г"™

600

300 400 500

длина волны, нм

700

0,8 -|

I 0,6

к 0,4 ее X

1 0,2 1

650 нм

200 300 400 500 600 700 длина волны, нм

Е 0,02 р

200

300 400 500 600 длина волны, нм

700

Рис. 4. Спектр поглощения.

(A) синтетического олигонуклеотида;

(B) индодикарбоцианинового красителя,

При помощи биологического микрочипа была определена сравнительная чувствительность обнаружения маркированных синтетических олигонуклеотидов. Флуоресцентный сигнал каждого элемента микрочипа, содержащего различные концентрации иммобилизованных олигонуклеотидов, регистрировали на флуоресцентном анализаторе биочипов Предельная чувствительность обнаружения конъюгатов составила приблизительно 3-10"18 моль, превысив таковую для гидрофобного красителя 1гш1501 в 1.6 раза.

Флуоресцентно меченые олигонуклеотиды показали полную пригодность для техники маркированных праймеров с использованием ПЦР и последующей гибридизацией на олигонуклеотидных биочипах. Установлено, что все красители формул (54) и (57) обладают стабильностью, достаточной для проведения полного цикла анализа без заметного разложения красителя. Было обнаружено, что воспроизводимость результатов анализа зависит от гидрофильных свойств красителей и увеличивается в ряду несульфированные < моносульфированные < дисульфированные < трисульфированные < тетрасульфированные красители

В настоящее время праймеры, маркированные дисульфированным красителем 1т11504, используются в сертифицированных коммерческих тест-системах. В Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга РАН разработана тест-система

"ТБ-биочип" для одновременного проведения двух анализов: выявления Mycobacterium Tuberculosis и определения их чувствительности к рифампицину и изониазаду одновременно Эта тест-система основана на использовании мультиплексной полимеразной цепной реакции с последующей гибридизацией на биологическом микрочипе со специфическими олигонуклеотидами. Она позволяет выявлять наиболее распространенные типы мутаций 29 типов по гену гроВ, ответственному за устойчивость Mycobacterium Tuberculosis к рифампицину, 19 типов мутаций по генам katG, mhA, ahpC, ответственных за устойчивость Mycobacterium Tuberculosis к изониазиду

Микрочип для диагностики туберкулеза представляет собой расположенные на подложке ячейки из полнакриламидного геля с иммобилизованными внутри ячеек олигонуклеотидными зондами Диаметр ячеек приблизительно 100 микрон В разных ячейках находятся олигонуклеотидные зонды различного строения. В ходе гибридизации на микрочипе изучаемые флуоресцентно меченые фрагменты ДНК генома микобактерий образуют совершенные гибридизационные дуплексы только с соответствующими (полностью комплементарными) олигонуклеотидами Со всеми остальными олигонуклеотидами изучаемые фрагменты ДНК дают несовершенный дуплекс. Дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов выполняют путем сравнения интенсивностей флуоресценции ячеек, в которых образовались дуплексы Для анализа результатов гибридизации используют, разработанный в ИМБ РАК, портативный флуоресцентный микроскоп, оснащенный ПЗС-камерой н компьютером со специальным программным обеспечением

Используя схему расположения олигонуклеотидов на биочипе (рис. 5А), определяли мутации, присущие изучаемой последовательности ДНК, и делали заключение об устойчивости (или чувствительности) изучаемого образца к рифампицину и / или изониазиду. Интенсивности флуоресцентных сигналов в ячейках, принадлежащих одной группе, сравнивали между собой Максимальный сигнал флуоресценции свидетельствовал об образовании совершенного гибридизационпого дуплекса в ячейке, где данный сигнал зарегистрирован

Если в ячейке зарегистрирован максимальный сигнал, соответствующей ДНК без мутаций (принадлежащей микроорганизму, чувствительному к лекарственному препарату), то считают, что по этой группе ячеек исследуемый образец мутаций не имеет. И наоборот, если максимальный сигнал зарегистрирован в ячейке, соответствующей ДНК с мутацией (принадлежащей микроорганизму, устойчивому к лекарственному препарату), то считают, что по данной группе ячеек изучаемый образец имеет аминокислотную замену, приводящую к возникновению резистентности.

На рис. 5В представлена флуоресцентная картина гибридизации фрагментов ДНК М. tuberculosis дикого типа, полученная при использовании праймеров, содержащих флуоресцентную метку Imd504. Ячейки с олигонуклеотидами, комплементарными ДНК дикого типа, имеют большую интенсивность флуоресцентного сигнала, чем остальные ячейки внутри каждой группы Таким образом, ДНК изучаемого объекта образует совершенные гибридизационные дуплексы с олигонуклеотидами, комплементарными последовательности ДНК дикого типа (чувствительного к рифампицину и изониазиду штамма микобактерий туберкулеза).

Маркер Маркер

ahpC_C10 ahpC_G6 Trp328 Ser315 Ser315 Leu533 Ser522 Met515 Del507

ahpC TIO ahpC A6 Trp328>Gly Ser315>Thr(2) Ser315>Thr(l) Leu533>Pro Ser522>Leu Met515>lle Del507

ahpC А10 inhA G16 Trp328>Leu Ser315>Asn Leu5ll Ser531 His526 His526 Asp516

ahpC G9 inhA TIS Trp328>Cys Ser315>l!e Leu511>Pro Ser531>Leu His526>Tyr His526>Asp Asp516>Val

ahpC А 9 inhA C15 Ile335 Ser3 l5>Arg(l) Leu511 >Arg Ser531>Trp His526>Asn His526>Leu Asp516>Tyr

Is6110 neg ahpC C12 inhA G8 lle335>Val Ser31S>Arg(2) Ser5 l2>Arg Ser531>Cys His526>Arg His526>Gln Asp516>Gly

Is6110 neg ahpC T12 inhA AS inhA T24 Ser315>Gly Ser512>Thr Ser53 lXjln His526>Pro His526>Cys Asp516>GIu

Маркер IsßllO inhA T8 inhA G24 Is6110 Ser512 C)n513>Gly Gln5l3>Lys Gln513>Leu G!n513

# • * ♦ * о * в ® 09OÖIOOIО о о о о ♦ @ ® © »fooioooo о»; #000000

* it ® © о о о о о fе©вооооо м»#»ооо#

® ®

О ©©■»■<i OÖW

о©о®Ф®®®т #),©©©#♦ О© © OSHOOOOOC

О®©©оооооо

©<§©ООО0ООО ®* ®®»®оооФ

(В)

ДНК микобактерий

комплекса (фрагмент

Обнаружена туберкулезного 186110).

Ген гроВ не содержит мутаций, ответственных за устойчивость к рифампицину.

Гены каЮ, ¡пЬА, аЬрС не содержат мутаций, ответственных за устойчивость к изониазиду.

(С) днк

микобактерий комплекса (фрагмент

Обнаружена туберкулезного 156110).

Ген гроВ содержит мутацию, ответственную за устойчивость к рифампицину (5ег531>Ьеи).

Ген каЮ содержит мутацию, ответственную за устойчивость к изониазиду (БегЗ 15>ТЬг( 1)).

Рис. 5. Схема размещения дискриминирующих олигонуклеотидов на биочипе (А) и гибридизационные картины, полученные при анализе образцов ДНК Mycobacterium Tuberculosis дикого типа (В) и ДНК Mycobacterium Tuberculosis, содержащей мутацию (С) (совместно с Д.А Грядуновым, В.М. Михайловичем).

На рис 5С показана флуоресцентная гибридизациоиная картина фрагментов ДНК М. tuberculosis, содержащих мутации в исследуемых генах, и полученных при использовании праймеров, содержащих флуоресцентную метку Imd504 В каждой из групп элементов биочипа интенсивность флуоресцентного сигнала в ячейке с олигонуклеотидом, комплементарным ДНК дикого типа, выше интенсивности сигнала остальных ячеек Исключение составили группы элементов, соответствующих кодону 531 в гене гроВ и кодону 315 в гене latG. В обеих группах интенсивности сигналов в ячейках с олигоцуклеотидами, специфичными в отношении мутаций, превышали интенсивности сигналов в ячейках, содержащих олигонуклеотид дикого типа Следовательно, ДНК изучаемого объекта имеет точечную нуклеотидную замену А>Т в положепии 2431 гена гроВ, что приводит к замене аминокислоты Ser на Leu в позиции №531 и ведет к возникновению устойчивости изучаемого штамма к рифампнцину. В группе ячеек, соответствующих кодону 315, таким же образом определяется наличие в исследуемой ДНК нуклеотидной замены G на С в положении 1013 гена katG, что приводит к замене аминокислоты Ser 315 на Thr в позиции № 315 и ведет к возникновению резистентности изучаемого штамма к изониазиду.

На рис. 6 представлены результаты обнаружения мутации Mycobacterium Tuberculosis с помощью гибридизации на микрочипах при использовании флуоресцентно меченых красителями ImdSOl и Imd504 олигонуклеотидных праймеров

3,5

5 3

! ад

5 2

I1-5

и J

WwvrV

7 10 13 16 19 22 25 28 номер ячейки

Рис. 6. Обнаружение мутации Mycobacterium Tuberculosis (Leu531) на микрочипах при использовании красителя Imd501 (А) и Imd504 (В) (совместно с О В Антоновой, В М. Михайловичем).

Сравнение маркеров осуществляли на основании данных дискриминации -отношение сигнала флуоресценции совершенного дуплекса к несовершенному. На это значение сильное влияние оказывают и специфические, и не специфические взаимодействия как маркированных олигонуклеотидов, так и флуоресцентно меченого ампликона. Таким образом, значение дискриминации напрямую зависит от физико-химических свойств маркера. На графике (В) дискриминация в два раза больше, это означает, что чувствительность обнаружения мутации на биочипах при использовании красителя Imd504 выше

Другим примером использования синтезированных красителей является их применение в качестве флуоресцентных меток в технологии белковых микрочипов (рис.

7) Маркированные красителями 1тс1501 и 1т(1504 антитела проверяли на микрочипе с иммобилизованным белком А в различных концентрациях Сигналы от ячеек регистрировали с помощью исследовательского флуоресцентного микроскопа, при этом наблюдали зависимость флуоресценции от концентрации иммобилизованного белка. Для дисульфированного красителя 1т(1504 сигнал оказался в 2.5 раза выше, чем при использовании гидрофобного 1гпс1501.

1 — белок А (0 4 мг/мл*)

2 — белок А (0 2 мг/мл)

3 - белок А (0 1 мг/мл)

4 - белок А (0 05 мг/мл)

5 — белок А (0 025 мг/мл)

6-белокА(0013 мг/мл) ,

7-белок А (0 006 мг/мл) !

8 - пустой гель |

* - концентрация белка в геле '

1 г 3 4 5 6 7

т 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 Я 6 7

8 8

0,45

концентрация белка А, мг/мл

Рис.

7. Схема микрочипа и зависимость нормированного сигнала флуоресценции от концентрации иммобилизованного в геле белка А (совместно с Е Н. Савватеевой, АЮ Рубиной)

Флуоресцентно меченые нуклеозид трифосфаты (схема 15) были использованы для введения маркеров в ДНК на стадии наработки кДНК методом ПЦР и последующей гибридизации на трехмерных гидрогелевых микрочипах На эффективность прохождения ПЦР с включением в ходе реакции флуоресцентно меченого ААсШТР сильное влияние оказывает структура маркера.

Исходя из вышеизложенного следует, что синтезированные нами новые индодикарбоцианиновые красители формул (54) и (57) могут успешно применяться в качестве флуоресцентных маркеров для олигонуклеотидов и белков.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод синтеза новых индодикарбоцианиновых красителей, предназначенных для флуоресцентного маркирования белков и олигонуклеотидных праймеров, а также для получения флуоресцентно меченых трифосфатов нуклеозидов.

2 Получено 55 новых соединений, в том числе 32 асимметричных индодикарбоцианиновых красителя с карбоксибутильной группой в положении 3 индоленинового фрагмента и 7 красителей с карбоксиэтильной группой в положении 5 индоленинового фрагмента, различающихся гидрофильными свойствами и суммарным электрическим зарядом.

3 Выявлено влияние расположения и природы заместителей в индолениновом ядре на спектрально-люминесцентные характеристики синтезированных индодикарбоцианиновых красителей.

4 Показано, что применение синтезированных красителей в технологии биологических микрочипов приводит к повышению эффективности анализа генома Mycobacterium tuberculosis и позволяет с высокой дискриминацией выявлять мутации, определяющие устойчивость к противотуберкулезным препаратам Гидроксисукцинимидный эфир натриевой соли 3-(4-карбоксибутил)-3,3',3'-триметил-1,Г-ди(4-сульфонатобутил)-ш1додикарбоцианина вошел в состав пяти сертифицированных коммерческих диагностических тест-систем в виде флуоресцентно меченых олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых антител

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

Статьи

1 AV. Chudmov, V.E. Kuznetsova, A S. Zasedatelev, V.E Barsky Indocyanine dyes and the derivatives thereof for analyzing biological micromolecules // WO Patent 2008127139. -2008

2. B.E. Кузпецова, А В. Давыдов, В А. Василисков, A.A. Стомахин, A.B. Чудинов, А С. Заседателев Новые несимметричные индодикарбоцианиновые красители. // Изв АН,Сер хим -2007.-N2ll.-C 2186-2190

3 В.Е. Кузнецова, Т.А Лукьянова, В А Василисков, О В Харитонова, А В Чудинов, А.С Заседателев Водорастворимые цианиновые красители для технологии биологических микрочипов Изв АН, Сер. хим. - 2007. - № 12. - С. 2355 - 2359.

4 В.Е. Кузнецова, AB. Чудинов. Синтез карбоксиалкилсодержащих индоленинов на основе 6-метил-7-оксооктановой кислоты // Изв АН, Сер хим - 2008 - № 3 - С 595 - 598.

5 В.Е. Кузнецова, В А. Василисков, О В Антонова, В М Михайлович, А.С Заседателев, AB Чудинов Новые индодикарбоцианиновые красители для технологии биологических микрочипов //Биоорган химия -2008 -Т. 34 -Jfel.-С 141-144.

6 V.E. Kuznetsova, V.A Vasiliskov, A S Zasedatelev, A.V. Chudmov. Novel water-soluble asymmetric indodicarbocyanine dyes: synthesis, properties and bioconjugation // Mend Comm -2008.-№3 -P. 138-140

7. OA. Gra, A.S. Glotov, E.A Nikitin, OS Glotov, V.E. Kuznetsova, A.V. Chudmov, A.B. Sudarikov, T.V Nasedkina Polymorphisms in xenobiotic-metabolizing genes and the risk of Chronic Lymphocytic Leukemia and Non-Hodgkin's Lymphoma in adult Russian patients //Am J. Hematol. -2008 -V. 83.-№4.-P 279-287.

Тезисы

1. В.Е. Кузнецова, С.А. Лапа, А В. Чудинов. Синтез водорастворимых флуоресцентных красителей ближнего ИК-диапазона для технологии биологических микрочипов // XVI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 9-12 февраля 2004 г. - С 88.

2 В.Е. Кузнецова, ТА Лукьянова, АЛ Михейкин, A.B. Чудинов Полиметиновые красители для технологии биологических микрочипов. X международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии - 2004», Волгоград, 710 сентября 2004. - С. 269.

3 В.Е. Кузнецова, В А Василисков, А В. Чудинов Синтез сульфосодержащих индодикарбоцианиновых красителей для технологии биологических микрочипов X молодежная конференция по органической химии, Уфа, 26-30 ноября 2007 г - С. 196.

Подписано в печать 30.10 2008 г.

Печать трафаретная

Заказ №1076 Тираж. 120 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Кузнецова, Виктория Евгеньевна

Принятые сокращения.

Введение.

Литературный обзор

1. Биоанализ.

2. Биологические микрочипы - изготовление и применение.

3. Флуоресцентные маркеры.

4. Цианиновые красители

4.1. Строение.

4.2. Спектральные свойства

4.2.1. Флуоресценция.

4.2.2. Электронные спектры поглощения.

4.2.3. Влияние строения цианиновых красителей на их спектральные свойства.

4.3. Общие методы получения полиметиновых красителей.

5. Индоцианиновые красители

5.1. Спектральные свойства.

5.2. Синтез индоцианиновых красителей.

Обсуждение результатов.

1. Синтез замещенных арилгидразинов и индоленинов на их основе.

2. Синтез 6-метил-7-оксооктановой кислоты и индоленинов на ее основе.

3. Синтез гидрохлорида 4-(2-карбоксиэтил)фенилгидразина и ^ индоленинов на его основе.

4. Гидрохлорид дифенилимина малонового альдегида.

5. Синтез индодикарбоцианиновых красителей.

6. Спектральные исследования цианиновых красителей и их конъюгатов.

Экспериментальная часть.

Выводы.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Индодикарбоцианиновые красители для флуоресцентного маркирования олигонуклеотидов и белков"

Бурное развитие молекулярной биологии позволило исследовать и внедрять новые биохимические методы и технологии. В частности, благодаря гибридизационному анализу стало возможным проводить генную диагностику многих заболеваний, выявляя их на самых ранних этапах развития. Высокоэффективное обнаружение различных мутаций и изучение полиморфизма генов становится возможным при использовании гибридизации анализируемой ДНК с микрочипом — матрицей из геля, фиксированной на стеклянной подложке - на котором иммобилизован набор олигонуклеотидов [21]. Способность качественно и количественно проанализировать смесь нуклеотидных последовательностей делает биологические микрочипы чрезвычайно востребованной технологией с широкой областью применения [114, 108].

Флуоресцентное маркирование является одним из наиболее используемых способов выявления результатов биоанализа [77, 174]. Синтетическая доступность индодикарбоцианиновых красителей, их химическая устойчивость и фотостабильность, высокие молярные коэффициенты экстинкции и квантовые выходы флуоресценции делают их наиболее подходящими маркерами для анализа олигонуклеотидов и белков в технологии биологических микрочипов. Благодаря поглощению и флуоресценции в ближнем ИК-диапазоне, индодикарбоцианиновые красители являются оптимальными для маркирования биомолекул, так как биоматериал в диапазоне длин волн 600-1200 нм имеет низкую собственную флуоресценцию, что приводит к уменьшению фонового сигнала и, следовательно, увеличению чувствительности регистрации флуоресцентного маркера. В качестве источника света для индодикарбоцианиновых красителей используют полупроводниковые лазеры, характеризующиеся высокой интенсивностью свечения, что приводит к повышению флуоресцентного сигнала [185]. Кроме этого, они обладают низкой стоимостью.

Одним из важнейших требований, предъявляемых к красителям, является возможность их ковалентного связывания с маркируемыми веществами, в данном случае, с олигонуклеотидами и белками. Для этих целей наиболее подходящей реакционноспособной группой является карбоксильная. Введение различных заместителей в гетероциклические фрагменты флуорофора, изменение места присоединения реакционноспособной карбоксильной группы и длины полиметиленовой цепочки, отдаляющей карбоксильную группу от флуорофора, приводит к изменению физико-химических свойств маркера.

Таким образом, целью исследования является разработка метода синтеза асимметричных индодикарбоцианиновых красителей, содержащих карбоксиалкильную группу и различные заместители в индолениновом ядре, а также изучение влияния этих функциональных групп на спектрально-люминесцентные характеристики красителей, предназначенных для флуоресцентного маркирования олигонуклеотидов и белков в технологии биологических микрочипов. В соответствии с поставленной целью в работе предполагалось решить следующие основные задачи:

2. Синтез асимметричных индодикарбоцианиновых красителей с карбоксиалкильной группой (карбоксибутил — положение 3 или карбоксиэтил - положение 5) и различными заместителями в положениях 1, Г, 5, 5', Т индолениновых фрагментов.

3. Выявление влияния расположения и природы заместителей в гетероциклических фрагментах на спектральные характеристики красителей.

Литературный обзор 1. Биоанализ.

Многие достоинства биологического анализа способствовали его широкому внедрению в различные области медицины, сельское хозяйство, биологическую промышленность, охрану окружающей среды, а также в научные исследования [18]. В профилактике и лечении болезней человека особое значение приобретают методы ранней биохимической диагностики, что способствует точности диагностики и эффективности лечения.

Используемые для этой цели методы должны быть высокочувствительными, так как обычно речь идет о регистрации незначительного количества вещества, и достаточно эффективными. Поэтому в современной аналитической биохимии наиболее широкое применение нашли флуориметрические методы, основанные на измерении флуоресценции, и спектрофотометрические, основанные на измерении поглощения видимого и ультрафиолетового излучения. К тому же, возможности методов, основанных на флуоресцентном зондировании, расширились после распространения проточной цитофлуорометрии [92, 169] и конфокальной флуоресцентной микроскопии [113], что сделало более доступным изучение метаболизма липидов, путей их движения в клетках и тканях [116, 199]. Применяя лазерное возбуждение и компьютерную обработку данных, появилась возможность следить за поведением зонда внутри единичной живой клетки и регистрировать параметры его флуоресценции в малых объемах [42].

Методы, основанные на измерении флуоресценции, обладают высокой чувствительностью. Понятие чувствительности флуоресцентного анализа определяется абсолютной чувствительностью метки и чувствительностью прибора. Для разбавленных растворов флуоресцирующих соединений интенсивность флуоресценции определяется следующим уравнением:

I=I0-2.3-Q-e-l-C, где I — интенсивность флуоресценции, 10 — интенсивность возбуждающего пучка света, Q - квантовый выход, е - коэффициент экстинкции на длине волны возбуждения, 1 - длина оптического пути, С — концентрация флуоресцирующей метки. Абсолютная чувствительность метки - e-Q [49].

Широкая группа методов, основанная на специфическом взаимодействии антиген-антитело, известна под общим названием шшунохимический анализ. Современный иммуноанализ, как правило, используется в сочетании с высокочувствительными методами детекции — радиохимическими, флуоресцентными или ферментативными [31]. Иммуноанализ - это полуколичественный метод. Анализ можно использовать не только применительно к высокомолекулярным веществам, им можно определять любые соединения, вызывающие образование антител [27].

Иммунохимическая реакция в растворе между антителами и антигенами (идентифицируемыми веществами) протекает в несколько стадий, первой из которых является обратимое образование комплекса 1:1. Для достижения высокой специфичности, воспроизводимости и автоматизации иммунохимических анализов принципиально возможным является использование только первой стадии.

Индикация образовавшегося комплекса антиген-антитело в растворе может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались флуоресцентные метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов [18]. Количественная оценка осуществляется с помощью градуировочной кривой, которую строят по стандартным образцам с известной концентрацией, проводя несколько параллельных измерений.

Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения иммуноанализа, обуславливают разработку чрезвычайно большого количества вариантов этого метода.

Альтернативой иммунохимическому анализу является гибридизационный анализ, основанный на реакции гибридизации между анализируемой нуклеиновой кислотой и зондом [27, 49]. Метод применяется для определения вирусов и микроорганизмов по характерным для них нуклеиновым кислотам и для детекции отдельных генов в составе сложных генетических структур различных организмов.

Генетическая кодирующая единица (кодон) является последовательностью из трех нуклеотидов. Таким образом, совокупности о трех нуклеотидов дают 64 (4Л) возможных кодона (число более чем достаточное для кодирования 20 разных аминокислот) [52]. Присутствие специфических последовательностей нуклеотидов в исследуемых образцах можно определить с помощью комплементарных этим последовательностям полинуклеотидов или олигонуклеотидов, которые в этом случае называют ДНК- или РНК-зондами.

Само получение зондов или, точнее, их дискриминирующей части может вестись двумя основными путями. Во-первых, это могут быть комплементарные копии нуклеиновой кислоты анализируемого объекта (полученные с помощью синтеза ДНК на одной из цепей детектируемой ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы) [33, 76, 133, 193]. Достоинством такого подхода является то, что приготовление таких зондов не требует знания первичной структуры, т.е. нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, подлежащей детектированию.

Второй путь получения зондов - химический синтез олигонуклеотидов с последовательностью, комплементарной к некоторому выбранному участку детектируемой нуклеиновой кислоты. Современные быстрые методы получения олигонуклеотидов с помощью автоматических ген-синтезаторов открывают возможность синтеза зондов к любым выбранным последовательностям.

Достоинством олигонуклеотидных зондов в тех случаях, когда выбрана мишень с известной последовательностью, является значительно большая скорость их гибридизации с мишенью. Легкость введения в синтетические олигонуклеотиды (даже в ходе синтеза) группировок, необходимых для последующего введения фрагментов, позволяет проводить детекцию малого количества зонда [28].

Еще один перспективный подход - создание РНК-зондов. РНК синтезируется на ДНК-матрице в виде одной цепи, которая комплементарна одной из цепей ДНК.

Метод гибридизации основан на том, что молекулы ДНК, состоящие из двух комплементарных последовательностей, связанных водородными связями, при повышении температуры диссоциируют на отдельные цепи. При охлаждении в специально подобранных условиях отдельные цепи ДНК реассоциируют (гибридизуются) с образованием стабильных дуплексов [49].

В ряде случаев сочетание иммунохимических способов и метода полнили олигонуклеотидных зондов существенно расширяет информацию, то есть метод ДНК- и РНК-зондов является не только альтернативой, но и дополнением по отношению к иммунохимическим методам [28].

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кузнецова, Виктория Евгеньевна

157 ВЫВОДЫ

2. Получено 55 новых соединений, в том числе 32 асимметричных индодикарбоцианиновых красителя с карбоксибутильной группой в положении 3 индоленинового фрагмента и 7 красителей с карбоксиэтильной группой в положении 5 индоленинового фрагмента, различающихся гидрофильными свойствами и суммарным электрическим зарядом.

3. Выявлено влияние расположения и природы заместителей в индолениновом ядре на спектрально-люминесцентные характеристики синтезированных индодикарбоцианиновых красителей.

4. Показано, что применение синтезированных красителей в технологии биологических микрочипов приводит к повышению эффективности анализа генома Mycobacterium tuberculosis и позволяет с высокой дискриминацией выявлять мутации, определяющие устойчивость к противотуберкулезным препаратам. 3-(4-Карбоксибутил)-3,3',3'-триметил-1,Г-ди(4-сульфонатобутил)-индодикарбоцианин вошел в состав пяти сертифицированных коммерческих диагностических тест-систем в виде флуоресцентно меченых олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых антител.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю признательность и благодарность моему научному руководителю, кандидату химических наук Александру Васильевичу Чудинову, а также заведующему лабораторией биологических микрочипов, доктору физико-математических наук, профессору Александру Сергеевичу Заседателеву за помощь и участие в работе.

Выражаю благодарность группе анализа патогенных бактерий и вирусов под руководством В.М. Михайловича, группе анализа генома человека под руководством Т.В. Наседкиной и группе белковых микрочипов под руководством А.Ю. Рубиной за помощь в изучении свойств индодикарбоцианиновых красителей в условиях проведения анализа на гидрогелевых биологических микрочипах. Также благодарю группу под руководством С.А. Суржикова за синтез праймеров и олигонуклеотидов.

Кроме того, хочу отдельно поблагодарить В.А. Василискова и Н.В. Сорокина за помощь в определении спектральных свойств синтезированных красителей. Также благодарю P.A. Юрасова и Д.В. Прокопенко за помощь в математической обработке данных.

Кроме того, хочу отдельно поблагодарить за участие и поддержку: Алексея Давыдова, Татьяну Лукьянову, Елену Белобрицкую, Дмитрия Трушина, Валерия Шершова, Ольгу Заседателеву, Ольгу Гра, Ольгу Антонову, Евгения Фесенко и Эдуарда Тимофеева, а также выразить свою признательность всем сотрудникам нашей лаборатории, без участия которых выполнение этой работы было бы невозможно.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Кузнецова, Виктория Евгеньевна, Москва

1. Арбузов А.Е., Валитова Ф.Г. О некоторых деталях получения свободного радикала а,а-тринитрофенилгидразина. // Журн. Орган. Химии. 1957. - Т. 27. - №9. - С. 2354 - 2356.

2. Бартон Д., Оллис У.Д. Общая органическая химия. Под ред. Кочеткова Н.К. Т. 1.-М.: Химия, 1981.-736 с.

3. Вацуро К.В., Мищенко Г.Л. Именные реакции в органической химии. -М.: Химия, 1976.-528 с.

4. Вейганд К. Методы эксперимента в органической химии. Под ред. Белова В.П. Т. 2. — М.: Изд-во Иностранной литературы, 1952. 737 с.

5. Венкатараман К. Химия синтетических красителей. В 6 томах / Т. 1. Под ред. Порай-Кошиц Б.А Л.: Госхимиздат, 1957. - 803 с.

6. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: Наука, 1980. - 320 с.

7. Вульфсон Н.С. Препаративная органическая химия. М. Гос. науч-техн. издательство химической литературы, 1959. — 888 с.

8. Глотов A.C., Иващенко Т.Э., Образцова Г.И., Наседкина Т.В.,

9. Баранов B.C. Зависимость между возникновением стабильной артериальной гипертензии у детей и полиморфизмом генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем. // Молекуляр. биология. 2007. - Т. 41. - № 1. - С. 18 - 25.

10. Гранберг И.И., Сорокин В.И. Направление циклизации арилгидразонов и о-фениловых эфиров оксимов несимметричных кетонов в условиях реакции Фишера. // Успехи химии. 1974. - Т. 43. — Вып. 2. - С. 266 — 293.

11. Гуринович Г.П., Севченко А.Р., Соловьев К.Н. Спектроскопия хлорофилла и родственных соединений. Минск: Наука и техника, 1968.-518 с.

12. Джеймс Т.Х. Теория фотографического процесса. Под ред. Картужанского A.JI. JI: Химия. 1980. - 672 с.

13. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеидов. — М.: Наука, 1989. 277 с.

14. Дьяконов А.Н. Химия фотографических материалов. -М.: Искусство, 1989.-272 с.

15. Дыханов H.H., Егупова JI.M. // Методы получения химических реактивов и препаратов, под ред. Козлова Б.Г. М.: Государственный комитет химической промышленности при Госплане СССР, 1964. — Вып. 9.-С. 65-68.

16. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. — М.: Высшая школа, 1991. -288 с.

17. Жунгиету Г.И., Будылин В.А., Кост А.Н. Препаративная химия индола. Кишинев: Штиинца, 1975. 264 с.

18. Жунгиету Г.И. Суворов H.H., Кост А.Н. Новые препаративные синтезы в индольном ряду. Кишинев: Штиинца, 1983. 118 с.

19. Иванов И.Б., Ершов Г.М., Барский В.Е., Мирзабеков А.Д. Диагностика генетических мутаций на олигонуклеотидных микрочипах. // Молекуляр. биология. 1997.-Т. 31.-№ 1.-С. 159 - 167.

20. Ищенко A.A. Строение и спектрально-люминесцентные свойства полиметиновых красителей. — Киев.: Наукова Думка, 1994. — 207 с.

21. Ищенко A.A. Новые аспекты люминесценции полиметиновых красителей. // Журнал научной и прикладной фотографии. 1997. - Т. 42.-№4.-С. 60-68.

22. Киприанов А.И. Цвет и строение цианиновых красителей. Киев: Наукова Думка, 1979. 666 с.

23. Киприанов А.И. Введение в электронную теорию органических соединений. Киев: Наукова Думка, 1975. 189 с.

24. Киприанов А.И., Толмачев А.И. Получение четвертичных солей слабых органических оснований. // Журн. Общ. Химии. 1957. - Т. 27. - №1. -С. 142-150.

25. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия: учеб. для хим., биол. и мед. спец. Вузов. -М.: Высшая школа, 2000. — 479 с.

26. Кнорре Д.Г. ДНК- и РНК- зонды как альтернатива и дополнение иммунохимического анализа. // Журн. Всесоюз. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева. 1989.-Т. 34.-№1. С. 52-60.

27. Коган И.М. Химия красителей. М.: Госхимиздат, 1956. - 696 с.

28. Колчинский A.M., Грядунов Д.А., Лысов Ю.П., Михайлович В.М., Наседкина Т.В., Турыгин А.Ю., Рубина А.Ю., Барский В.Е.,г

29. Заседателев A.C. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы. // Молекуляр. биология. 2004. - Т. 38. — № 1. - С. 5 - 16.

30. Кольман Я., Рем К. Наглядная биохимия. М.: Мир, 2000. - 469 с.

31. Корнберг А. Синтез ДНК. М.: Мир, 1977. - 349 с.

32. Красовицкий Б.М., Болотин Б.М. Органические люминофоры. М.: Химия, 1984.-334 с.

33. Левина Р.Я., Шушерина Н.П., Лурье М.Ю. Цианэтилированные кетоны в синтезе непредельных 8-лактонов. II. Синтез и свойства непредельного 5-лактона из у-ацетилвалеронитрила. // Журн. Общ. Химии. 1954. - Т. 24. - №8. - С. 1439 - 1444.

34. Левкоев И.И. Органические вещества в фотографических процессах. -М.: Наука, 1982.-368 с.

35. Левшин Л.В., Салецкий A.M. Оптические методы исследования молекулярных систем. Ч. 1. Молекулярная спектроскопия. М.: Изд-во МГУ, 1994.-320 с.

36. Макин С.М., Монич Н.В., Шаврыгина O.A., Бережная М.И., Хейфец С.А. Новый метод синтеза цианинов на основе ацеталей глутаконового альдегида. // Журн. Орган. Химии. 1970. — Т. 6. —№1. - С. 107 - 112.

37. Мирзабеков А.Д. Биочипы в биологии и медицине XXI века. // Вестник Российской академии наук. — 2003. Т. 73. — №5. - С.412-421.

38. Михайленко Ф.А., Дядюша Г.Г., Богуславская А.Н. Полиметиновыекрасители с несколькими сопряженными хромофорами. // Химия Гетероцикл. Соединений. 1975. - №3. - С. 370 - 377.

39. Молотковский Ю.Г. Флуоресцентные липидные зонды: свойства и применение. // Биоорган, химия. 1999. - Т. 25. - № 11. — С. 855 — 867.

40. Мушкало Л. К., Хабуби М., Мушкало H.H., Федорова Л.В. Норцианины в ряду индоленина. // Укр. Хим. Журн. 1974. - Т. 40. — №9.-С. 957-962.

41. Наседкина Т.В. Использование биологических микрочипов в онкогематологии. // Онкогематология. 2006. - № 1-2. - С. 25 - 37.

42. Николаенко Л.Н. Лабораторный практикум по промежуточным продуктам и красителям. М.: Высшая Школа, 1965. - 312 с.

43. Органические реакции, сборник 8. Под ред. Арбузова Ю.Ю. М.: Издательство иностранной литературы, 1956. - 580 с.

44. Пептиды. Основные методы образования пептидных связей. Под ред. Гросс Э., Майенхофер И. М.: Мир, 1983. - 424 с.

45. Савицкий А.П. Флуоресцентный анализ: иммуноанализ, гибридные ДНК, биосенсоры. // Успехи биологической химии. 1990. - Т. 31. - С. 209-238.

46. Самойлов В.О. Медицинская биофизика. СПб.: Спецлит, 2004. -496 с.

47. Самойлова Н.П., Гальберштам М.А. О некоторых реакциях замещения в ряду фотохромных индолиноспирохроменов. // Химия Гетероцикл. Соединений. —1977. №8. - С. 1065 - 1068.

48. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. В 2 Т. / Т. 1. М.: Мир, 1998. -373 с.

49. Современные методы биофизических исследований. Практикум по биофизике. Под ред. Рубина А.Б. М.: Высшая школа, 1988. - 360 с.

50. Спасокукоцкий Н.С, Вомпе А.Ф, Левкоев И.И, Свешников H.H. Влияние вступления аминогруппы в полиметиновую цепь трикарбо-, -ди- и —трикарбоцианинов на их окраску и основность. // Журн. Орган. Химии. 1980. - Т. 16. - №11. - С. 2427 - 2434.

51. Степанов Б.И. Введение в химию и технологию органических красителей. М.: Химия, 1977. - 488 с.

52. Сыч Е.Д. Синтез некоторых производных индо ленина и индокарбоцианинов. III. Влияние заместителей в бензольных кольцах индокарбоцианинов на их спектры поглощения. // Укр. Хим. Журнал. // 1953. -Т. 19. -№6. - С. 657-661.

53. Толмачев A.A., Бабиченко Л.Н., Шейнкман А.К. 5-Винил-р-гетарилзамещенные 2-метил- и 2-метилениндолины и полиметиновые красители на Pix основе. // Укр. Хим. Журн. 1991. - Т. 57. - №2. - С. 183-186.

54. Толмачев А. А, Бабиченко Л.Н, Чмиленко Т.С, Шейнкман А.К.

55. Бензопиридилзамещенные 2-метил- и 2-метилениндолины. // Химия Гетероцикл. Соединений. 1989. - № 10. - С. 1367 - 1372.

56. Устинов Д.А. Свет молекул. М.: Колос, 1966. — 144 с.

57. Фирц-Давид Г.Э., Бланже JI. Основные процессы синтеза красителей. — М.: Издательство иностранной литературы, 1957. 383 с.

58. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. М.: Мир, 1980. - 582 с.

59. Хиккинботтом В. Реакции органических соединений. Под ред. Рутовского Б.Н. М.: ОНТИ, 1939. - 580 с.

60. Хюниг С., Люкке Э., Бреннингер У. В сб. Синтезы органических препаратов. М.: Мир, 1964. - Сб. 12. - С. 96 - 97.

61. Чечеткин В.Р., Прокопенко Д.В., Макаров A.A., Заседателев A.C. Биочипы для медицинской диагностики. // Российские нанотехнологии. 2006. - Т. 1. — №1-2. - С. 13 - 27.

62. Чубабрия М.Я., Майсурадзе Д.П., Павлиншвили И.Я. Синтез 2Н-хромен-2-спиро-2'-М-алкил(фенил)-индолин-3 '-спиро-1 циклопентанов. // Изв. АН ГССР. Сер. хим. 1982. - Т. 8. - №3. - С. 172-180.

63. Чунаев Ю.М., Пржиялговская Н.М. 2-Метилиндоениновые основания. Синтез и свойства. // Итоги науки и техники. Сер. Органическая химия. М.: ВИНИТИ. - 1990. - Т. 14. - 129 с.

64. Шапиро Б.И. Теоретические начала фотографического процесса. М.: Эдиториал УРСС, 2000.-288 с.

65. Яновская Л.А., Юфит С.С., Кучеров В.Ф. Химия ацеталей. Сообщение 1: общий метод синтеза тетраэтилацеталей /?-дикарбонильных соединений. // Известия АН СССР. Сер. Хим. 1960. - №7. - С. 1246

66. Artanari H., Basu S., Kawano T.L., Bolton P.H. Fluorescent dyes specific for quadruplex DNA. // Nucleic Acids Res. 1998. - V. 26. - №16. - P. 3724 -3728.

67. Asanuma N., Suzuki A., Yamakawa K. Method for preparation of benzindolenine. // Chem. Abstr. 2000. -V. 133. - №23. - 308246e.

68. Audrieth L.F., Weisiger J.R., Carter H.E. Alkylation of phenylhydrazine in liquid ammonia. // J. Org. Chem. 1941. - V. 6. - P. 417 - 420.

69. Balaban A.T., Frangopol P.T., Marculescu M., Bally J. Factors affecting stability and equilibria of free radicals. // Tetrahedron. 1961. - V. 13. - P. 259-267.

70. Baltimore D. Viral RNA-dependent DNA Polymerase: RNA-dependent DNA Polymerase in Virions of RNA Tumour Viruses. // Nature. 1970. -V. 226.-P. 1209-1211.

71. Barsky V., Perov A., Tokalov S., Chudinov A., Kreindlin E., Sharonov A., Kotova E., Mirzabekov A. Fluorescence Data Analysis on Gel-Based Biochips. // J. Biomol. Screen. 2002. - №7. - P. 247 - 257.

72. Bean F.R., Russel H.D. Naphthyl hydrazine sulfonic acids in direct positive photographic processes. // US Patent. 2604400. 1951.

73. Bellamy A.J., MacLean L. Synthesis and oxidation of some 1-alkenyl-l-phenylhydrazines and their 1,2-isomers // J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. — 1979.-P. 204-210.

74. Bouit P., Piazza E., Rigaut S., Guennic B., Aronica Ch., Toupet L., Andraud Ch., Maury O. Stable near-infrared anionic polymethine dyes: structure, photophysical, and redox properties. // Org. Lett. 2008. - V. 10. - №19. -P. 4159-4162.

75. Brindle J.R., Liard J.L., Berube N. Reactions of NaBH2S3 with some typical organic nitrogen compounds. // Can. J. Chem. 1976. - V. 54. - P. 871-877.

76. Cacchi S., Torre F., Misiti D. iV-Alkylation of tosylhydrazones through phase-transfer catalisis. // Synthesis. 1977. - №5. - P. 301 - 303.

77. Caputo G., Delia C.L. Improved process and method for the preparation of asymmetric monofunctionalised indocyanine labeling reagents and obtained compounds. // EP Patenet. 1211294. 2001.

78. Casarini D., Lunazzi L., Placucci G., Macciantelli D. Conformational studies by dynamic NMR. 32. Enantiomerization of chiral conformers in hindered naphthylamines and naphthyl nitroxides. // J. Org. Chem. — 1987. V. 52. — №21.-P. 4721-4726.

79. Cheng Zh., Levi J., Xiong Zh., Gheysens O., Keren Sh., Chen X., Gambhir S.S. Near-infrared fluorescent deoxyglucose analogue for tumor optical imaging in cell culture and living mice. // Bioconjugate Chem. 2006. - V. 17.-P. 662-669.

80. Chiuman W., Li Y. Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates. // Nucleic Acids Res. -2007.-V. 35.-№2.-P. 401 -405.

81. Clusius K., Vecchi M. Reaktionen mit 15N. Zum crackmechanismus des N,N-diphenylhydrazins. // Helv. Chim. Acta. 1953. - Bd. 35. - S. 933 -937.

82. Cox W.G., Beaudet M.P., Angew J.Y., Ruth J.L. Possible sources of dye-related signal correlation bias in two-color DNA microarray assays. // Anal. Biochem. 2004. - V. 331. - P. 243 - 254.

83. Dai Z., Peng B. Synthesis and characterization of indodicarbocyanines. // Dyes and pigments. 1998. - V. 36. - №2. - P. 169 - 175.

84. Damjanovich S., Gaspar R., jr., Pieri C. Dynamic receptor superstructures at the plasma membrane. // Q. Rev. Biophys. 1997. - V. 30. - P.67 - 107.

85. Davidson R.S., Hilchensach M.M. The use of fluorescent probes in immunochemistry. // Photochem. Photobiol. 1990. - V. 52. - P. 431 - 438.

86. Dutta P.Ch., Mandai D. Studies in indigoid dyes. Part XIV. Thioindigoid dyes derived from diphenyl-4,4'-disulphonic acid. // J. Indian Chem. Soc. — 1955. V. 32. - №6. - P. 339 - 343.

87. Eichenauer U., Neumann P. Process for the production of alkali salts of biphenyl-4,4'-disulphonic acid. // EP Patent. 0325975. 1989.

88. Eistert B., Wessendorf R. Eine methode zur identifizierung von aus unsymmetrischen ß-diketonen und hydrazinderivaten erhältlichen pyrazolderivaten. // Chem. Ber. 1961. - Bd. 94. - № 10. - S. 2590 - 2595.

89. Ernst L.A., Gupta R.K., Mujumdar R.B., Waggoner A.S. Cyanine dye labeling reagents for sulfhydryl groups. // Cytometry. 1989. - V. 10. - P. 3 -10.

90. Evans F. J., Lyle G.G., Watkins J., Lyle R.E. Molecular rearrangements. VIII. The equilibration of 3,3-dimethyl-2-phenyl- and 2,3-dimethyl-3-phenyl-H-indoles. // J. Org. Chem. 1962. - V. 27. - № 5. - P. 1553 - 1557.

91. Ficken G.E., Kendall J.D. The influence of bridging of the color of polymethin and aza-methin dyes. // Chimia. 1961. — V. 15. — P. 110 - 115.

92. Fierz-David H.E., Blangey L., Streiff H. Zur kenntnis der p-oxo-azo-farbstoffe. //Helv. Chim. Acta. 1946. Bd. 29. S. 1718 1765.

93. Fischer E. Ueber die hydrazinverbindungen. // Liebigs Ann. Chem. — 1877. — Bd. 174.-S. 167- 183.

94. Fisher E. Ueber naphtylhydrazine. // Liebigs Ann. Chem. 1886. - Bd. 232. -S. 236-243.

95. Flanagan J.H., Khan S.H., Menchen S., Soper S.A., Hammer R.P. Functionalized tricarbocyanine dyes as near-infrared probes for biomolecules. // Bioconjug. Chem. 1997. - V. 8. - P. 751 - 756.

96. Fotin A.V., Drobyshev A.L., Proudnikov D.Y., Perov A.N.,

97. Mirzabekov A.D. Parallel thermodynamic analysis of duplexes on oligodeoxyribonucleotide microchips. // Nucleic Acid Res. 1998. - V. 26. - №7. - P. 1515-1521.

98. Frankland P.F, Challenger F, Nicholls N.A. The preparation of monomethylaniline. // J. Chem. Soc. Trans. 1919. - V. 115. - P. 198 - 205.

99. Fritz S, Heinz H. Verfahren zur Herstellung von aromatischen und heterocyclischen Hydrazinen. // DE Patent. 1015442. 1957.

100. Gerhold D, Rushmore T, Caskey C.T. DNA chips: promising toys have become powerful tools. Trends in Biochemical Sciences. 1999. - V. 24. — №5.-P. 168- 173.

101. Gonsalez A. Simple preparation of ALalkyl-ALarylhydrazines from diazotable 7V-arylamines.//Synth. Commun. 1988. - V. 18.-№11.~P. 1225-1229.

102. Hamrick P.J, jr., Hauser C.F, Hauser C.R. Influence of ring size and 2-methyl substituent on two modes of alkaline cleavage of 2-acylcyclanones. Acylations of cycloheptanone and cyclooctanone. // J. Org. Chem. 1959. -V. 24.-№5.-P. 583 -586.

103. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Ed. Pawley J.B. N.Y.:

104. Plenum Press, 1990. 662 p.

105. Harshman K., Martinez A.C. DNA microarrays: a bridge between genome sequence information and biological understanding. // Eur. Rev. — 2002. — V. 10. -№ 3. P. 389-408.

106. Hayes B.T., Stevens T.S. The reduction of nitrosamines to hydrazines. // J. Chem. Soc. C. 1970. - №8. - P. 1088 - 1089.

107. Hendrickson H.S. Fluorescence-based assays of lipases, phospholipases, and other lipolytic enzymes. // Anal. Biochem. 1994. - V. 219. - №1. - P. 1 -8.

108. Hilderbrand S.A., Kelly K.A., Niedre M., Weissleder R. Near infrared fluorescence-based bacteriophage particles for ratiometric pH imaging. // Bioconjug. Chem. 2008. - V. 19.- №8. - P. 1635 - 1639.

109. Houben-Weyl. Methoden der Organischen Chemie. Stuttgart: Georg Thieme Verlag, 1967. Bd. 10. №2. Enders E. Arylhydrazine durch reduktion von N-nitroso- und N-nitro-verbindungen. S. 224-303.

110. Huckin S.N., Weiler L. C-Acetylation of ketones. // Can. J. Chem. 1974. -V. 52.-P. 1379- 1380.

111. Hünig S., Benzing E., Lücke E. Synthesen mit enaminen, I. Acylierung mit carbonsäurechloriden. // Chem. Ber. 1957. - Bd. 90. - № 12. - S. 2833 -2840.

112. Hünig S., Salzwedel M. Systematische synthese methylverzweigter carbonsäuren. // Chem. Ber. 1966. - Bd. 99. - № 3. - S. 823 - 842.

113. Hünig S., Salzwedel M. Beeinflussung der saurespaltung von 2-acyl-2-methyl-cyclohexanonen. // Angew. Chem. 1960. - Bd. 72. - S. 323.

114. Hung S.-C., Ju J., Mathies R., Glaser A.N. Cyanine dyes with high absorption cross section as donor chromophores in energy transfer primers. // Anal. Biochem. 1996. - V. 243. - № 1. - P. 15 - 27.

115. Hunsberger I.M., Shaw E.R., Fugger J., Ketcham R., Lednicer D. The preparation of substituted hydrazines. IV. Arylhydrazines via conventional methods. // J. Org. Chem. 1956. - V. 21. - № 4. - P. 394 - 399.

116. Illy H., Funderburk L. Fisher indole synthesis. Direction of cyclisation of isopropylmethyl keton phenylhydrazone. // J. Org. Chem. 1968. - V. 33. — №11.-P. 4283 -4285.

117. Jacquier R., Maury G. № 60. — Recherches dans la serie des azoles. XIX. -Syntheses et etude des (dinitro-2',4'-phenyl)-1 pyrazoles isomeres dérivant d'acetyl-2 cyclanones (Deuxieme partie). // Bull. Soc. Chim. Fr. 1967. — №1. - P. 316-320.

118. Jacquier R., Maury G. № 61. Acylation de ß-enamino-cetones derivees d'acetyl-2 cyclanones. // Bull. Soc. Chim. Fr. - 1967. - № 1. - P. 320 - 328.

119. Jacquier R., Petrus C., Petrus F., Valentin M. № 466. Recherches dans la serie des azoles. LXXV. - Synthese et identification de tetramethylene— isoxazoles. // Bull. Soc. Chim. Fr. - 1970. - № 7. - P. 2678 - 2685.

120. Jacquier R., Petrus C., Petrus F., Verducci J. № 467. Recherches dans la serie des azoles. LXXVI. - Action de Phydroxylamine sur les ß-cetoesters: synthese d'isoxazolones-3 et 5. // Bull. Soc. Chim. Fr. - 1970. - № 7. - P. 2685-2690.

121. Jelinek Ch.F., Kleinschmidt R.F. Preparation of malonaldehyde dianils. // US Patent. 2549097.- 1951.

122. Johansson M.K., Fidder H., Dick D., Cook R.M. Intramolecular dimers: a new strategy to fluorescence quenching in dual-labeled oligonucleotide probes. // J. Am. Chem. Soc. 2002. - V. 124. - P. 6950 - 6956.

123. Jonczik A., Wlostowska J., Makosza M. Reactions of organic anions. LXX. Catalytic TV-alkylation of phenylhydrazones in aqueous medium. // Synthesis. 1976. - №12. - P. 795 - 796.

124. Koga N., Anselme J.P. The preparation 1,1-diarylhydrazines. // J. Org. Chem. V. 33. - №10. - P. 3963 - 3964.

125. Koji N., Takeshi H., Shunsaku T., Katsuhiko T. Process for producing 4,4'-diphenyldisulfonic acid and its monopotassium salt. // US Patent. 4382896. -1982.

126. Larock R.C. Comprehensive organic transformations: a guide to functional group preparation. New York, 1999

127. Lerch U., Konig J. Selective Alkylation of Phenylhydrazine: a facile and efficient synthesis of 1-alkyl-l-phenylhydrazines. // Synthesis. — 1983. №2. -P. 157- 159.

128. Leung W.-Y., Cheung CH.-Y.,Yue S. Modified carbocyanine dye and their conjugates. // WO Patent. 0226891. 2002.

129. Levine R., Conroy J.A., Adams J.T., Hauser C.R. The acylation of ketones with esters to form ß-diketones by the sodium amide method. // J. Am. Chem. Soc. 1945. -V. 67. - P. 1510 - 1512.

130. Li Q., Tan J., Peng B.-X. Synthesis and characterization of heptamethine cyanine dyes. // Molecules. 1997. - №2. - P. 91 - 98.

131. Lieber D. Uber Indolinone. // Monatsh. Chem. 1908. - Bd. 29. - №5. - S. 421-429.

132. Limpricht H. Vermischte chemische mitthelungen. // Justus Liebigs Ann. Chem.- 1856.-Bd. 99.-S. 117-122.

133. Lin Y., Weissleder R., Tung C.H. Novel near-infrared cyanine fluorochromes: synthesis, properties, and bioconjugation. // Bioconjug. Chem. 2002. - V. 13. - P. 605 - 610.

134. Lüh T.Y., Fung Sh.H. A Convenient one-oot synthesis of A^-alkylanilines from benzanilides. // Synth. Commun. 1979. - V. 8. - P. 757 - 763.

135. Mader O., Reiner K., Egelhaaf H.-J., Fisher R., Brock R. Structure property analysis of pentamethine indocyanine dye: identification of a new dye of lifescince application. // Bioconjug. Chem. 2004. - V. 15. - P. 70 - 78.

136. Mank A.J.G., van der Laan H.T.C., Gooijer C., Brinkman U.A.Th., Velthorst N.H. Visible diode laser induced fluorescence detection in liquid chromatography after precolumn derivatization of amines. // Anal. Chem. -1995. V. 67. - P. 1742 - 1748.

137. Martin T.I., Mychajlowskij W. Process for preparing di-tertiary aryl amines. // GB Patent. 2147897. 1983.

138. Masotti A., Vicennati P., Boschi F., Calderan L., Sbarbati A., Ortaggi G. A novel near-infrared indocyanine dye polyethylenimine conjugate allows DNA delivery imaging in vivo. II Bioconjug. Chem. - 2008. - V. 19 — №5. -P. 983 - 987.

139. Medintz I.L.; Goldman E.R.; Lassman M.E.; Mauro J.M. A Fluorescence resonance energy transfer sensor based on maltose binding protein. // Bioconjug. Chem.-2003.-V. 14.-№5.-P. 909-918.

140. Meister O. Correspondenzen. II Chem. Ber. 1872. - Bd. 5. - S. 283 - 287.

141. Mikhailovich V., Lapa S., Gryadunov D., Sobolev A., Strizhkov B., Chernych N., Skotnikova O., Irtuganova O., Moroz A., Litvinov V.,

142. Morgan G.T., Micklethwait F.M.G. The interactions of aromatic amines and para-diazoimides. //J. Chem. Soc. Trans. 1907. -V. 91. - P. 1512 - 1518.

143. Mujumdar R.B., Ernst L.A., Mujumdar S.R., Lewis C.J., Waggoner A.S. Cyanine dye labeling reagents: sulfoindocyanine succinimidyl esters. // Bioconjug. Chem. 1993. - V. 4. - № 2. - P. 105 - 111.

144. Mujumdar R.B., Ernst L.A., Mujumdar S.R., Waggoner A.S. Cyanine dye labeling reagents containing isothiocyanate groups. // Cytometry. — 1989. — V. 10.-P. 11-19.

145. Mujumdar S.R., Mujumdar R.B., Grant C.M., Waggoner A.S. Cyanine-labeling reagents: sulfobenzindocyanine succinimidyl esters. // Bioconjug. Chem. 1996. - V. 7. - №3. - P. 356 - 362.

146. Mushkalo I.L., Dyadyusha G.G., Turova L.S., Kornilov M.Yu. A macrocyclic bis-cyanine dye. // Tetrahedron Lett. 1980. - V. 21. - № 30. — P. 2977 - 2980.

147. Narasimhachari N., Gabor P. A new method for the synthesis of heptamethine cyanine dyes: synthesis of new near-infrared fluorescent labels. // J. Org. Chem. 1995. - V. 60. - P. 2391 - 2395.

148. Nasedkina T.V., Zharinov V.S., Isaeva E.A., Mityaeva O.N., Yurasov R.N., Surzhikov S.A., Turigin A.Yu., Rubina A.Yu., Karachunskii A.I.,

149. Gartenhaus R.B, Mirzabekov A.D. Clinical screening of gene rearrangements in childhood leukemia using a multiplex PCR-microarray approach. // Clin. Cancer Res. 2003. V. 15. - № 9. - P. 5620 - 5629.

150. Nasipuri D, Biswas K. K. Diazoalkanes. Part I. Reaction of diazomethane with methyl ether of cyclic hydroxymethyleneketones. // J. Indian Chem. Soc. 1967. - V. 44. - № 7. - P. 620 - 627.

151. Neber P.W. Uber die freie o-aminophenyl-essigsaure, ihre ester und Umsetzungen. // Chem. Ber. 1922. - S. 826 - 848.

152. Payne G.B. Reactions of hydrogen peroxide. X. Oxidative rearrangements with certain ß-diketones. // J. Org. Chem. 1961. - № 12. - P. 4793 - 4797.

153. Parinov S, Barsky V, Ershov G, Kirillov E, Timofeev E, Belgovskiy A, Mirzabekov A. DNA sequencing by hybridization to microchip octa- and decanucleotides extended by stacked pentanucleotides. // Nucleic Acid Res. 1996. - V. 24. - P. 2998 - 3004.

154. Petit J.M, Denis Gay M, Ratinaud M.H. Assessment of fluorochromes for cellular structure and function studies by flow cytometry. // Biol. Cell. — 1993.-V. 78.-P. 1 - 13.

155. Pham W, Lai W.-F, Weissleder R, Tung C.-H. High efficiency synthesis of a bioconjugatable near-infrared fluorochrome. // Bioconjug. Chem. 2003. — V. 14.-P. 1048- 1051.

156. Poirier R.H, Benington F. Reduction of 7V-nitrosodiphenylamine to unsym-diphenylhydrazine by lithium aluminum hydride. // J. Am. Chem. Soc. — 1952. V. 74. - №12. - P. 3192.

157. Pritzkow W, Dietrich P. Uber diazoreactionen mit N-nitroso-caprolactam. // Liebigs Ann. Chem. 1963. -Bd. 665. - S. 88 - 90.

158. Proudnikov D, Mirzabekov A. Chemical methods of DNA and RNAfluorescent labeling. // Nucl. Acids Res. 1996. - V. 24. - №22. - P. 4535 -4542.

159. Ranasinghe R.T., Brown T. Fluorescence based strategies for genetic analysis. // Chem. Commun. 2005. - P. 5487 - 5502.

160. Roberts R.M., Vogt P.J. Ortho esters, imidic esters and amidines. VII. TV-Alkyl formanilides from alkyl orthoformates and primary aromatic amines; rearrangement of alkyl N-arylformimidates. // J. Am. Chem. Soc. 1956. — V. 78. - №18. - P. 4778 - 4782.

161. Rosenstock P.D. 2,3-Dimethyl-3H-indole-3-acetic acid. // J. Heterocycl. Chem. 1966. - V. 3. - P. 537 - 539.

162. Rubina A.Yu., Pan'kov S.V., Ivanov S.M., Dement'eva E.I., Mirzabekov A.D. Protein Microchip. // Doklady Biochemistry and Biophysics. 2001. — V. 381.-P. 419-422.

163. Rubina A.Yu., Kolchinsky A.A., Makarov A.A., Zasedatelev A.S. Why 3-D Gel-based microarrays in proteomics. // Proteomics. 2008. - V. 8. P. 817 — 831

164. Rubina A., Duykova V., Dementieva E., Stomakhin A., Nesmeyanov E., Grishin E., Zasedatelev A. Quantitative immunoassay of biotoxins on hydrogel-based protein microchips. // Anal. Biochem. 2005. - V. 340. - P. 317-329.

165. Sen H.K., Bose U. Bildung heterocyclischer Verbindungen, II. // Chem. Zentralbl. 1927. - Bd. 2. - S. 435 - 436.

166. Schobel U., Egelhaaf H.-J., Fröhlich D., Brecht D., Oelkrug D., Gauglitz G. Mechanisms of fluorescence quenching in donor-acceptor labeled antibody — antigen conjugates. // J. Fluoresc. 2000. - V. 10. - №2. - P. 147 - 154.

167. Schueler F.W., Hanna C. A synthesis of unsymmetrical dimethyl hydrazine using lithium aluminum hydride. // J. Am. Chem. Soc. 1951. - V. 73. - P. 4996.

168. Schultz R.G. Preparation of some substituted biphenylsulfonic acids. // J. Org. Chem. 1961.-№12.-P. 5195-5196.

169. Shealy D.B., Lipowska M., Lipowski J. Synthesis, chromatographic separation, and characterization of near infrared — labeled DNA oligomers for use in DNA sequencing. // Anal. Chem. - 1995. - V. 67. - P. 247 - 251.

170. Shinichi Y., Takashi T. Novel spirooxazine compounds. // EP Patent. 0358774.-1990.

171. Southwick P.L., Ernst L.A., Tauriello E.W., Parker S.R., Mujumdar R.B., Mujumdar S.R., Clever H.A., Waggoner A.S. Cyanine dye labeling reagents carboxymethylindocyanine succinimidyl esters. // Cytometry. - 1990. - V. 11.-P. 418-430.

172. Southwick P.L., Cairns J.G., Ernst L.A., Waggoner A.S. "One pot" synthesis of (2,3,3-trimethyl-3-H-indol-5-yl)-acetyc acid. Derivatives as intermediates for fluorescent biolabels. // Org. Prep. Proced. Int. 1988. - V. 20. - № 3. -P. 279-284.

173. Stahel R. Ueber einige derivate des diphenylhydrazins und methylphenylhydrazins. // Liebigs Ann. Chem. 1890. - Bd. 258. - S. 242

174. Sundberg RJ. Chemistry indoles. -N.Y.: Academic Press, 1970. 491 p.

175. Temin H.M, Mizutani S. Viral RNA-dependent DNA polymerase: RNA-dependent DNA polymerase in virions of rous sarcoma virus. // Nature. -1970. V. 226. - P. 1211 - 1213.

176. Terpetschnig E, Szmacinski H., Ozinskas A, Lakowicz J. Synthesis of squaraine-N-hydroxysuccinimide esters and their biological application as long-wavelength fluorescent labels. // Anal. Biochem. 1994. - V. 217. — P. 197-204.

177. The chemistry of heterocyclic compounds. N.Y.: John Wiley&Sons.

178. Tillib S.V, Strizhkov B.N, Mirzabekov A.D. Integration of multiple PCR amplifications and DNA mutation analyses by using oligonucleotide microchip. // Anal. Biochem. 2001. - V. 292. - P. 155 - 160.

179. Tolmachev A.I, Ishchenko A.A, Slominsky Yu.L. Directed synthesis of functional polymethine dyes. In Chemistry of functional dyes. Ed. by Yoshida Z, Kitao T. -Tokio: Mita Press, 1989. P. 108 - 111.

180. Toutchkine A, Nalbant P, Hahn K. Facile synthesis of thiol-reactive Cy3 and Cy5 derivatives with enhanced water solubility. // Bioconjug. Chem. -2002. V. 3. - №3. - P. 387 - 391.

181. Van Meer G. Lipid traffic in animal. // Annu. Rev. Cell. Biol. 1989. - V. 5. -P. 247-275.

182. Veibel S, Hauge N. Identification et dosage des substances a fonction carbonyle a l'aide de l'acide /?-hydrazinobenzoique (p-carboxyphenylhydrazine). // Bull. Soc. Chim. Fr. 1938. - V. 5. - №7. -P. 1506-1509.201. www.biochip.ru

183. Wang L, Peng X, Zhang R, Cui J, Xu G, Wang F. Syntheses and spectral properties of fluorescent trimethine sulfo-3H-indocyanine dyes. // Dyes and Pigments. 2002. - V. 54. - №5. - P. 107 - 111.

184. West R, Bosworth N, Mujumdar R. Cyanine Dye Labelling Reagents. // US1. Patent. 2007203343. 2007.

185. Yamamoto H., Atsuko Hirohashi A., Izumi T., Koshiba M. Process for produsing indolylacetic acid derivatives. // GB Patent. 1324494. 1973.

186. Yu H., Chao J., Patek D., Mujumdar R., Mujumdar S., Waggoner A.S. Cyanine dye dUTP analogs for enzymatic labeling of DNA probes. // Nucleic Acids Res. 1994. - V. 22. - №15. - P. 3226 - 3232.

187. Zangerle J. Uber naphtindolinbasen. // Monatsh. Chem. — 1910. — Bd. 91. -S. 123-134.

188. Zimmermann T. A facile synthesis of 3H-indolium perchlorates by one-pot hydrazone formation / Fisher indolization. // J. Heterocycl. Chem. 2000. — V.37.-№6.-P. 1571 - 1574.

189. Ф ЕДЕРАЛЬ11АЯ С Л УЖБ А. 501. И:С0ЦЙАЛ Ь 1ЮГ() РАЗВИТИЯгтшш1. Вйя: не ограничен

190. Йнсгнту1.моле1^лйрнон биол'оУки им. &.Л\Энгельгардта Российской . Академии Иаукгг Росси^'1199917Москва; уд. Вавилова,Д. 32 у:- . ,, ^ ,.V - 9 ¿у-Ч* ^ишшгве {зждаё-т.7 й й еЖе; м^Дйый не ко ия' .>'

191. А ь . I ^ ; ■ —• г - --' - ■ V"* - . - ^ - - -- --^ —- Т-" ' - .- -- - " . г1. Российской

192. Академии Наук, Россия*Вавилова, 32.с д Р^ици алнногй ;рй6ка2б^ео^етствуйгне^ко• . г. КРД 2(>:о5 от ■ . '.раз^е^пеяо.к произ1}одств%у1Грвдаже и Российской

193. Руководитель Ф^деррь1Гой.служ(Гь1 .' • 'но надзору в сфере адравоохрпненпя '-.■¿Щ^-Н.В.,^Юртелв;й социального рйзвнт11я^ ." V : Л ■:й соцкдльнрго а^АЗВЙТИЯ;23 октября -2ÛÔ8; года

194. Срок-Действий-: не ограничен.

195. Срответствугощсе комп аной^окументадии36685 ptj4.08.20081. ЙтГОрадР0с6ЙЙ(ЖОЙ1. Продаже"соводятел1^ Федеральной^ сЛу рщУч ад 3 о py ф ф ер^ дд p aso oip а H еш№1. ЯШ1шрте»шщш 1Ш11. V Л •

196. ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

197. РЕГИСТРАЦИОННОЕ УДОСТОВЕРЕНИЕ1. ФС 01202006/5317-06от 28 декабря 2006 года

198. Действительно до 28 декабря 2011 года

199. ИЗДЕЛИЕ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ1. Код ОКП 93 9817

200. Набор .реагентов для. выявления генетической предрасположенности .к развитию/онкологических . заболев аний р аз лично й" этиологии ;и для ,'опр ёделе н иянабиологическом микрочипе (ПФ-БИОЧЙП).1. НОРМАТИВНЫЙ ДОКУМЕНТ1. ТУ 9398-004-02699501-2006

201. ПРЕДПРИЯТИЕ ПРОИЗВОДИТЕЛЬ •

202. Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, ОЮПО 02699501 '

203. ЗАРЕГИСТРИРОВАНО Й РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ВНЕСЕНО >ГОСУДАРСТВЕННЫЙ РЕЕСТР "ИЗДЕЛИЙ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Й МЕДИЦИНСКОЙ ТЕХНИКИ

204. Государственная регистрация предусматривает надзор : в целях обеспечения безопасности, качества, эффеь зарегистрированных изделий медицинского назначения и м^^^ф'к'о

205. Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития1. Щ'г1. ВЙ1;':'

Информация о работе

Кузнецова, Виктория Евгеньевна
кандидата химических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Индодикарбоцианиновые красители для флуоресцентного маркирования олигонуклеотидов и белков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы