Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуно-биологическая характеристика гидатидной жидкости эхинококка от различных промежуточных хозяев

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Иммуно-биологическая характеристика гидатидной жидкости эхинококка от различных промежуточных хозяев"

Министерство здравоохранения РФ

Волгоградский ордена Трудового Красного Знамени медицинский институт

На правах рукописи

ЧЕРНИКОВА Евгения Анатольевна

ИММУНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИДАТИДНОЙЖИДКОСТИ ЭХИНОКОККА ОТ РАЗЛИЧНЫХ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ХОЗЯЕВ

03.00.19 — паразитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1993

Работа выполнена в Волгоградском ордена Трудового Красного Знамени медицинском институте.

Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор Г. Р. Ярулин. Доктор медицинских наук, профессор Е. С. Лейкина.

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук Н. И. Тумольская. Доктор медицинских наук, профессор А. Я. Лысенко.

Ведущая организация: Московская Медицинская Академия им. И. М. Сеченова.

Защита состоится Уч^года в /^{^часов на

заседании Специализированного Совета Д.074.39.01 при институте медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е. И. Марциновского (Москва, М. Пироговская, 20).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « » . 199Д, г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

А. А. ФРОЛОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАВОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Эхпнококкозы - хронически протекающие риродно-очаговые гелышнтозы, возбудитель гндатидозной стадии кото-ых - личиночная форма ленточного гельминта Е. grsni.ilОБиз.

Пзоляты эхинококков, относящиеся к одном/ виду, но полученные а разных паразитарных систем пли географически удаленных районов, тлнчаются по ряду морфологических,биологических и инвазивных свой-тп. В частности, у них варьируют такие характеристики как интенсив-ость проникновения, поорганная локализация в конкретном хозяине, а акже скорость развития личинки в биоценозе паразит-хозяин . До сих ор не определено, имеют ли эти различия иммунологическую основу.

Признается существование вариационной изменчивости изолятов па-азнта, сведения о которых могут многое прояснить как при оценки оймо-потенциала заболевания, так и клинического проявления инвазив-остн паразита в плане его опастностп для человека. В этой связи, в цде дополнения к морфологическим характеристикам изучаемых изолятов ;е чаще используют новые критерии, в том числе биохимические и пм-унохшшческие. Выявленные различия в составе жидкостей могут дать пмч к пониманию причин неодинаковой выраженности иммунологических гакций у промежуточных хозяев Е.дГапиЬжиз в географически удаллен-,к регионах.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: изучить зависимость иммуно-биологическпх зонетв секретпруемьи антигенов гидатид эхинококка от различий в толого-географической природе и органной локализации возбудителя.

ОСНОВНЬЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. 1. Провести бпо- и иммунохимичес-т оценку состава эхинококковой жидкости цист от различных промежу-)чных хозяев из двух географически удаленных регионов.

2. Определить фракционный состав и исследовать высокомлекул; ные компоненты полостной жидкости гидатид.

3. Научить антигенный состав высокомолекулярных фракции эхш кокковой жидкости цист различной органной локализации.

4. Изучить возможности использования высокомолекулярных биог лимеров в составе нммунодиагностикумов для оценки поведения цисты паразито-хозяпновой системе.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. 1. Впервые показаны различия в составе биог лимеров эхинококковой жидкости цист, выделенных от одних и тех видов промежуточных хозяев из географически отдаленных районов.

2. Изучен (Ьракционнш состав н показаны различия в био- и I мунохимичеокпх свойствах эхинококковых жидкостей цист у промежут< ных хозяев из одного региона.

3. Выделены антигенные компоненты, обладающие ферментатив: активностью. В сыворотках больных эхинококкозом обнаружены антнт« к этим ферментосодержациы фракциям эхинококковой жидкости, что п< воляет получить дополнительные сведения о состоянии цисты у болы го.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. 1. Выявленные различия в антенном составе эхинококковых жидкостей цист от промежуточных хоз' из разных географически удаленных регионов открывают новые возм> ности для эпидемиологических исследований в очагах инвазии.

■ 2. Выделение из эхинококковой жидкости компонентов, обладаю! фёрментативной активностью, расширяет возможности диагностики.эхн коккоза на ранних стадиях развития заболевания и прогнозирования : хода после операционного течения процесса.

ПОЛОЖЕНИЯ,ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ. 1. Гидатидные жидкости эко го-географических субварнантов эхинококка различаются по набору ;

гигенно активных термоотабильных и термолабильных компонентов, а также по распределении карбокснлэстеразной активности среди нолеку-пярно-гетерогенных полимеров.

2. При изучении субварнантов Е.granulosus в зависимости от области распространения, вида промежуточного хозяина и органной локализации цисты био- н пмиунохииичеекпе различия могут бьггь использованы для выделения эколого-географических изолятов среди популя-цш,циркулирующей на данной территории.

3. Эрнтроцнтарные диагностнкумы, полученные на основе антигенно исгнвных ¡компонентов гидатидной жидкости, обладающих ферментативной активностью» позволят повысить информативность серологических тес-, 'ов, направленных на прижизненную оценку потенциальной способности (исты к функционированию, в условиях различной органной ее локализации, а также получить дополнительную информацию в конкретных парази-о-хозягГновых системах и в очаге инвазии в целом. -

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации докладывались и обсуж-ались на конференциях молодьк ученых Волгоградского медицинского нститута (1987 - 1992 ); заседаниях Волгоградского отделения обцес-ва иммунологов (1987,1991); ежегодных научных сессиях Волгоградско-о медицинского института(1987-1992); 1 Всесоюзной иколе-семинаре злодых ученых и специалистов "Фундаментальные и прикладные проблемы эдпцинской паразитологии " (Москва,1990).

ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертации опубликованы в 6 пе-1тньи работах, из них 3 статьи - в журнале "Медицинская паразитолога и паразитарные болезни".

СТРУКТУРА И ОБЬЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, ¡пора литературы,описания^ материалов и методов исследования,резуль-itob работы и их обсуждения , заключения,выводов и приложений. Дне-

сертация изложена на 147 страницах машинописного текста/ содержит рисунков,25 таблиц. В список литературы включены 159 публикаций, которых 76 1 лринадлежит отечественным и 83-'иностранным авторам.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалом для исследования послужили эхинококковые жидкое (ЭЖ) цист различной локализации ( печень,легкие ) от различных пр межуточных хозяев - овец,крупного рогатогоо скота (КРС),свиньи, л лученные из двух географически удаленных регионов ( Ростовской и С ыаркандской областей ). Исследовано 11 образцов ЭЖ, в том числе : из печени овец,2- из легких овец, 2- из печени КРС н 1 - из пече свиньи.

Изучение .всех исходных образцов ЭЖ и компонентов их составля щих проводили по единой схеме.

Определялисодержание белка с использованием реактива Фолина-Ч окальтео.карбоксилэстеразную активности (КЭА) с исполььзованием качестве субстрата ci-нафтнл-ацетата, а фракционный состав образцов Э определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии приборе М-3500 " Spectra-Physics " с использованием "голубых" кол нок.

Для получения вьюоокомолекулярньк компонентов Ш проводили по ледовательное фракционирование исходных образцов методом ступе чатой диафильтрации на мембраннах ХМ-300,XI.I-100,ХМ-50 и UM-0,5 ячейках фирмы Am icon (США) и гелевой хроматографией на колонках з полненных сефарозой 4В и 6В.

Полисахаридный компонент определяли методом аффинной хромато рафии на колонке,заполненной кон-А-сефарозой 4В.

Два основных антигена <АГ) ЭЖ (АГ-5 и АГ-В) характеризующие

ответственно термолабпльностьи и термостабильностью, определяли в акции торможения пассивной гемзгглютинацпп (РТПГА) с сыворотками льных эхннококкозом, содержащих антитела (АТ) к основным АГ парата - термостабильному (ТС) -используя референс- сыворотки А п В, и рмолабнльному (ТЛ) используя референс- сыворотки Б и Г . В качест-референс-препарата (РС) использовали также коммерческую полиспе-фпческую сыворотку Ставропольского НПО "Аллерген", с помощью кото-й выявляется весь спектр АТ,вырабатывающихся к общему АГ-комплек-

Перекрестно-реагирующие АГ компоненты выявляли в реакции двой-й диффузии в геле (РДДГ) по методу Уохтерлонн в микроварианте; с умя гипериммунными кроличьими сыворотками: коммерческой антпсыво,-ткой против глобулинов барана (КАСг.б.) и антисывороткой к цельной (КАСц.ЭЖ).от кроликов,иммунизированных по схеме НагЬоу Н. (1977).

На основе полученнш высокомолекулярных компонентов были иготовлены эритроцитарные диагностикумы (ЭД) по двум схемам: 1) нсибилизацпю эритроцитов антнгенно активными компонентами проводи-с помощю риванола по методике,предложенной Кузьминым Ю.А. 982);2) сенсибилизацию проводили с помощью танина. ЭД были исполь-ваны в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) в мнкроварнанте, по тодике,разработанной в ИМПлТМ им.Е.И. Марцпновского, с сыворотками больных эхннококкозом.

Для вычисления значимости полученных различий по въйранным по-зателям использовали непараметрические кр!ггерии статистической зчпмости различий (Гублер Е.В.,1978 ).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Биохимическая характеристика исходных образцов ЭХ! и компо-

нентов ее составляющих.

На первом этапе нашего исследоваия было проведено научение и ходных образцов Ш, по выбранным биохимическим параметрам.

В результате удалось показать,что исходные образцы Эй различ лиеь по содержанию белковых компонентов. Хроматографический анал ЭЖ на "голубых" колонках выявил их гетерогенность. , .

. . Причем различия наблюдались в содержании компонентов с м.м. м нее 5кД и более 700 кД. Отличались научаемые образцы ЭЖ и по соста макромолекул,обладающих КЭА. Содержание белковой фракции ЭЖ.получе ных от промежуточных хозяев из Ростовской области значимо превыш этот показатель в Эж цист, полученных от промежуточных хозяев из С ыаркандской области.

Дальнейшее препаративное разделение и концентрирование биопол ыеров ЭЖ проводили"методами мембранной фильтрации и гельфильтраци В результате такого ступенчатого разделения впервые были выделе высокомолекулярные компоненты ЭЖ, обладнщпе КЭА, и определены кол чественные параметры этой активности. Содержание биополимеров, обл дающих КЭА в высокомолекулярных фракциях ЭК цист промежуточных хоз ев из Ростовской области болыле, чем в аналогичных фракциях цч у промежуточных хозяев из Самаркандской области (рис.1). Наибольи ферментативной активностью обладали фракции ХМ-300, выделенные из цист овец. Последовательное изучение отобранных фракций выяснило что высокомолекулярные биополимеры, в частности, белковые макромол кулы с ы.м. более 1 ООО кД, входящие в состав фракций ЭЖ цист легких, гетерогенны и обладают невысокой ферментативной активность тогда как аналогичные макромолекулы, входящие в состав фраки ХМ-300 ЭК цист из печени однородны и обладают значимо большей КЭА.

Ферментативно-актпвные макромолекулы образуют комплексы в о

Самаркандская

Ростовская

< 5

11

I 3

Рис. 1.. Суммарная карбоксилэстеразная активность высокомолекулярных

Фракций Ж-300 и ХМ-100. ЭЖ одет печени овец 2 - ЭЖ цист печени к.р.е.

52 цист лёгких овец _ 4 - ЭЖ цист печени свиньи

новном, с белковыми молекулами в ЭЖ цист из легких, а в Э* цист печени с глпкопротеидньши компонентами.

Выявленные биохимические различия ЭЖ цист от различных промеж точных хозяев были сопоставленны с их пммунохпмнческиии свойствами

2. Нммунохимическая характеристика исходных образцов ЭЖ и ко понентов ее составлянщих.

Изучение АГ активности и выявление перекрестно-реагирующих компонентов", проводили во всех исследуемьи образцах ЭЖ и последов тельно получаемых фракциях.

Сравнительное изучение исходных образцов ЭЖ показало, что с держание ТС АГ компонента в гидатидных жидкостях цист промежуточных хозяев из Ростовской области было значимо вше,нежели в ЭЖ цист от промежуточных хозяев из Самаркандской области .2 же различия наблюдались и в высокомолекулярных фракциях ЭЖ - конце тратя* ХН-300 и ХМ-100.

Определение перекрестно-реагирующих АГ компонентов с помои КАСг.б. показало наличие таковых во всех исходных образцах ЭЖ. I: вестно, что в процессе эволюции паразитические организмы выработа много общих, для возможных отношении в экосистеме паразит-проме* точный хозяин,антигенных детерминант. Скорее всего, в данном cj чае,мы столкнулись именно с таким, общим для Е.granulosus явлением

Исследование с помощью КАС ц.ЭЖ показало, что в Э* цист из ле

различный

ких и печени овец определяются АГ детерминанты, {юдственные^глобу: нам хозяина.

Применение метода ступенчатой диафнльтрации и гельфнльтра! позволило сконцентрировать высокомолекулярные фракции и значнмо г выснть в них удельную АГ активность исходньи ЭЙ.

Содержание ТС компонента в высокомолекулярных фракциях ЭЖ цист [з Ростовской области было выше,чем во фракциях ЭЖ цист из Самаркан-|ской области, тогда как по отношению к ТЛ наблюдалась обратная зависимость. Доверительные границы содержания ТС компонента в ЭЖ цист |ромежуточных хозяев из Ростовскоой области колебались от 7,85/. до 4,1'/., а в ЭЖ Самаркандской области этот показатель составил от |,02% до 3,8'/.. и различие это статистически значимо (рис. 2).

Анализ высокомолекулярных фракций ЭЙ из цист от разных проиежу-очных хозяев показал, что наиболее репрезентативными как в отноие-ии ферментативной активности, так и содержании ТС и ТЛ АГ компонен-ов, являются концентраты ХМ-300 гидатиднои жидкости цист,выделенных т овец. Не исключено, что субвариантные различия могут зависить и от органной локализации цисты. При сравнительном анализе АГ ЭЖ цист дного вида промежуточного хозяина - овцы, в зависимости от локалн-ации цисты (легкие и печень)было обнаружено различие.

с" - ■ ; между содержанием ТС и ТЛ АГ: в част-

ости ТЛ АГ в ЭЖ из цист печени и легких встречаются примерно в рав-ых концентрациях, тогда как содержание ТС АГ в Э8 цист из печени вец значимо превосходило таковые в ЭЖ цист из легких.

3. Приготовление и оценка эрптроцнтарных диагностикумов на ос-ове полученных подфракций концентратов ХМ-300 ЭЖ цист легких и пе-ени овец. .

Вшвленные различия биохимических и серологических свойств ги-атидных жидкостей цист разных промежуточньи хозяев и разной орган-ой локализации позволили провести предварительное исследование воз-ожности использования полученнш высокомолекулярных биополимеров в

Самаркандская

Ростовская

Ряс. 2. содержание ТС а ТЛ " АГ компонентов"

1 - ТС Аг компонент

2 - ТЛ АГ компонент

3 - общий АГ комплекс

качестве иммунохпмичееких реагентов для оценки паразито-хозянновш отноыений у больных эхинококкозом с разной органной локализацией цист.

Как было показано выше ферментсодержащие биополимеры связаны, в основном, с ТЛ АР компонентом. Исходя из этого,была предпринята попытка приготовления ЭД на основе полученных подфракций высокомолекулярных концентратов ХМ-300 ЭЖ цист из легких и печени овец, п рассмотрена возможность использования их в качестве вспомагательных реагентов для оценки состояния и жизнеспособности цисты.

ЭД реагируют с сыворотками здоровых доноров в титрах 1:8 -1:16, что дало основание принять' титр 1:16 как фоновый.

При исследовании сывороток больных эхинококкозом было определено, что титр АТ у больных эхинококкозом печени несколько больше с АГ 13 ЭЖ цист, локализованных в печенп, а у больньк с эхинококкозом аегкпх-с АГ из ЭЖ цист, локализованных в легких. Обнаружение сравнительно высоких титров с помощью ЭД, приготовленного на основе фер-лентсодержащей подфракций может говорить об активном процессе.

4. Заключение.

Проведенные исследования можно в какой-то степени рассматривать как попытку провести системный анализ, одновременно связав во •дино биохимические п серологические свойства изученньи ЭЖ и компо-ентов их составляющих,поскольку именно эти различия оказывают су-ественное влияние на проникновение и локализацию паразита в конк-етном хозяине и органе, равно как и на реакцию хозяина в ответ на то проникновение.

Мы полагали, что сравнительная комплексная оценка свойств Э* эзволит в перспективе вносить коррективы в данные, получаемые при

оценке эпидемиологической динамики эхинококкоза на конкретной территории, по ходу обследования репрезентативных групп населения,особен но групп повышенного риска заражения.

Основываясь на материалах сравнительного биохимического анализ; представляется возможны»! заключить, что: 1) ферментсодержащие компо ненты связаны с высокомолекулярными биополимерами ЭЖ; 2)содержани< белковой фракции и ферментсодержащих компонентов в гидатндных жид костях цист,выделенных от промежуточных хозяев из Ростовской^. облас ти выше, чем в аналогичных ЭЖ цист промежуточных хозяев из Самаркан декой области; 3)Эж цист овец содержат больше ферментативноактивны .компонентов,чем Эй цист других промежуточных хозяев; 4)гидатпдны жидкости цист разной локализации от промежуточных хозяев одного ви,п отличаются по составу биополимеров.КЭ в ЭЙ цист из легких связана белковыми молекулами,а в ЭЯ цист из печени - с гликопротеиднымн,

По материалам экспериментов,выполненных с применением мммунош мических методик, мы склоны заключить, что: I) содержане ТС-АГ ко( понента в гидатндных жидкостях, выделенных из цист промежуточных х< зяев из Ростовской области больше, нежели в ЭЖ цист промежуточн! хозяев из Самаркандской области; 2)содержание ТС АГ компонента в цист от овец выше,чем в ЭЖ цист от других промежуточных хозяе] 3 высокомолекулярные фракции ЭЖ цист из легких овец в отношении компонента менее активны таковых в ЭЖ цист из печени; 4)АГ акти ность концентратов ХМ-300 и ХМ-100 в 100-150 раз превышает таковую исходных ЭЖ;55ТЛ АГ компонент сосредотачивается в основном во фра циях с м.м. более 700 кД, а ТС компонент - в подфракциях с м.м. ок ло 280-300кД.

ВЫВОДЫ.

Т. Гидатидные жидкости цист, полученные от промежуточных хозяев Е.granulosus из двух географически удаленных регионов,различаются по содержанию белковых компонентов, составу макромолекул, обладающих карбокснлэстеразной активностью и соотношению термостабнльного и териолабильного антигенных компонентов.

2. Выявленные био- и иммунохимически^.различия в гидатндах эхинококка обосновывают целесообразность изучения субвариантов

Lgranulosus в зависимости от области распространения,вида промежуточного хозяина и органной локализации цисты паразита.

3. Основная антигенная активность 3* связана с высокомолекулярными компонентами, антигенная активность концентратов ХМ-300 и Ш-100 в 100-150 раз превышала таковую в исходных образцах Ш.

4. Карбоксилэстераза является частью комплекса высокомолекулярны термолабильных антигенно активных биополимеров,имеющих выражен-•1ЫЙ углеводный компонент и сродство к конканавалину-А.

5. Содержание ТЛ антигенного компонента в цист от промежуточных хозяев одного вида (овец),но разной органной. лоокализации печень,легкие), варьирует не существенно, тогда как количество ТС антигенного компонента в ЭЖ из цист печени овец значимо превосходит ;одержание этого компонента в Ш из цист легких.

6. Содержание ферментативно активных биополимеров и термоста-1ильных антигенных компонентов в ЭК цист,выделенных от промежуточных озяев из Ростовской области значимо больше таковых в Ъ% цист, от громежуточных хозяев из Самаркандской области. Выявленная завнсп-'ость должна учитываться при подборе критериев для серологической арактеристики субвариантов и дифференциальной идентификации геогра-ических вариантов эхннококка.

7.Эритроцнтарные диагностикумы, приготовленные на основе вые комолекулярных фракций ЭЖ, обладающих карбокснлэстеразной акт! ностыо, можно использовать в качестве дополнительных реагентов , оценки состояния и жизнеспособности цисты при обследовании болы эхинококкезон.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

.1. Е.А.Совнна, А.П.Збарский, А.В.Ермолаев, М.В.Далпн, Г.Р.Я|

лин. Иммунохимическая характеристика эхинококковой жидкости, испо. *

зуемой для приготовления иммунодиагностических препаратов Мед.парэнтол.-1989.-Н 2.-С.54-57.

2. А.П.Збарский, Е.А.Совнна, А.В.Ермолаев, М.В.Далпн. Выделе! антигенов из пузырей Е.granulosus методом1 ступенчатой мембранной j афнльтрации.// Мед.парзитол.-1989.-И 2.-С.57-61.

3. Е.А.Совнна. Получение высокомолекулярных диагностические них антигенов из пузырей Echinococcus granulosus.// Актуальные вс росы экспериментальной, клинической и профилактической медш. ны.-Волгоград.-1989.-С.53.

4. Е.А.Совнна. Иммунохимическая характристика фракций эхиноке новой жидкости.// Мед.парзитол.-1990.-И 4.-С.48-50.-

5. Е.А.Совнна, Г.Р.Ярулин. Роль местного иммунитета в реинваа эхинококка.// Кровь-, лимфообращение и пммунокомпетентные органь Сборник науных статей. -Волгоград.- 1990.- В.З.- том 43.- С.110-И

6. Е.А.Совнна. Выделение антигенных компанентов, обладают ферментной активностью из фракций эхинококковой жидкости.//Актуал ные , проблемы медицинской науки и практики.-Волгоград. - 1992 С.65-66.

(

> 1 1 I Тг1Ь/1ица 1

Р«3у/П» 1 «1ТЫ РН1 О и сигшгчи ками здоровых донгзрш* .

Сисшрпткм ДП1 юрпи эд.2 эд.з ЭД.4 ЭЛ.6 ЭЛ.9

с "Л" 1:8 0 0 0 1:16

С г;- 0 0 0 0 0

С "О" 0 О 0 0 0

С 0 0 0 0 1:16

С "Л" 1:16 1:8 1:16 0 1:8

Таблица 2

Результаты РИГА с сисшратками Сольных эхииокаккпзом,

Сиооротки | Яика/ноация |>о/1Ь11ы* | парлзига ЗД.2 ЭД.З ЭД.4 ЭД.6 ЭД.9

С. 7 | Г1РЧ1!Ч|Ь 1:64 1:64 1:64 1:512 1:128

С .8 I пичгмш 1:256 1:128 1:128 1:16 1:32 ___

С . 9 | мечп и. 1:256 1:128 1:64 1:32 1:32

С . Ю | легкие 1:256 1:128 1:128 1:64 1:512

С.11 | легкие 1:32 1:8 0 1:64 1:256

С . 12 ] ЛСГКИ1" 1:32 1:64 1:16 1:64 1:25В

С . 13 | печень 1:256 1: 128 1:64 1:8 1:16

С.14 | печень 1:256 1:128 1:128 1:64 0

С. 15 | легкие 1:32 1:16 1:16 1:128 1:64

Подп. . ^ 3«К. ' Тир./ф;

Типография при ХоэяЯстаенном управлении Минздрава России