Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунно-биологическая характеристика гидатидной жидкости эхинококка от различных промежуточных хозяев

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Иммунно-биологическая характеристика гидатидной жидкости эхинококка от различных промежуточных хозяев"

Гоерарсшашй гэптст по сапзязрадзсрд ?-3 1нсшдт мерцмгай варазиошш а тршчеш! щцяи

На правах рукописи

черникова

Евгения Анатольевна

иммуно-биологическая характеристика гидатидной жидкости эхинококка от различных промежуточных хозяев

03.00.19 — паразитология

Автореферат диссертации на соискание ученой (степени кандидата биологических наук

Москва, 1993

Работа выполнена в Волгоградском ордена Трудового Красного Знамени медицинском институте.

Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор Г. Р. Ярулин. Доктор медицинских наук, профессор Е. С. Лейкина.

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук Н. И. Тумольская. Доктор медицинских наук, профессор А. Я. Лысенко.

Ведущая организация: Московская Медицинская Академия им. И. М. Сеченова.

Защита состоится «Ж в 1Ш часов на

заседании Специализированного Совета Д.074.39.01 при институте медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е. И. Марциновского (Москва, М. Пироговская, 20).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан » 199$, г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

А. А. ФРОЛОВА

0Б!1!АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМ)!. Эхинококкозы - хронически протекагоцие риродно-очаговые гельминтозы, возбудитель гидатидозной стадии которых - личиночная форма ленточного гельминта Е.granulosus.

Пзоляты эхинококков, относящиеся к одному виду, но полученные га разнш паразитарных систем или географически удаленных районов, отличаются по ряду морфологических,биологических и инвазнвных сной-:тв. В частности, у ник варьируют такие характеристики как интенсив-чость проникновения, гюорганная локализация в конкретном хозяине, а также скорость развития личинки в биоценозе паразит-хозяин,. До сих юр не определено, имеют ли эти различия иммунологическую основу.

Признается существование вариационной изменчивости нзолятов паразита, сведения о которых могут многое прояснить как при оценки поймо-потенциала заболевания, так и клинического проявления инвазив-ноетн паразита в плане его огаетности для человека. В этой связи, в виде дополнения к морфологическим характеристикам изучаемых изолятов все чаще используют новые критерии, в том числе биохимические и им-иунохиипческие. Выявленные различия в составе жидкостей могут дать клич к пониманию причин неодинаковой выраженности иммунологических реакций у промежуточных хозяев Е.granulosus в географически удаллен-ннх регионах.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: изучить зависимость иммуно-биологическнх свойств секретируемш антигенов гидатид эхинококка от различий в эколого-географической природе и органной локализации возбудителя.

ОСНОВНЬЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. !. Провести био- и иммунохимнчес-кую оценку состава эхинококковой жидкости цист от различных промежуточных хозяев из двух географически удаленных регионов.

2. Определить фракционный состав и исследовать высокоылекул нне компоненты полостной жидкости гидатид.

3. Научить антигенный состав высокомолекулярных фракций эхи кокковой жидкости цист различной органной локализации.

4. Изучить возможности использования высокомолекулярных био лимеров в составе иммунодиагностикумов для оценки поведения цисты паразито-хозяшовой системе.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. 1. Впервые показаны различия в составе био лимеров эхинококковой жидкости цист, выделенных от одних и тех видов промежуточных хозяев на географически отдаленных районов.

2. Изучен | фракционньдЧ состав и показаны различия в био- и мунохимическпх свойствах эхинококковых жидкостей цист у проиежут них хозяев из одного региона.

3. Выделены антигенные компоненты, обладающие ферментатив активностью. В сыворотках больных эхинококкозом обнаружены антнт к этим ферментосодержащим фракциям эхинококковой жидкости, что п воляет получить дополнительные сведения о состоянии цисты у боль го.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. 1. Выявленные различия в ан генном составе эхинококковых жидкостей цист от промежуточных хоз' из разных географически удаленных регионов открывают новые воам' ности для эпидемиологических исследований в очагах инвазии.

■ 2. Выделение из эхинококковой жидкости компонентов. обладаю! ферментативной активностью, расширяет возможности диагностики эхи: коккоза на ранних стадиях развития заболевания и прогнозирования ! хода после операционного течения процесса.

ПОЖЖННЯ,ВЫН0С11ШЕ НА ЗАЩИТУ. 1. Гидатндные жидкости эко го-географических субвариантов эхинококка различаются по набору ;

игенно активных термостабильнш и термолабилънш компонентов, а акже по распределению карбоксплэстераоноП активности среди молеку-ярно-гетерогенных полимеров.

2. При изучении субвариантов Е. ^гзпи1озия в зависимости от об-астн распространения, вида промежуточного хозяина и органной лока-изацин цисты бпо- и иммунохимические различия могут быть использо-аны для выделения эколого-географических пзолятов среди популя-11И,циркулирующей на данной территории.

3. Эрптроцитэрные диагностпкумы, полученные на основе антпгенно ггивных.компрн^Н'С'В гидатиднои жидкости, обладающих ферментативной тганостьм, позволят повысить информативность серологических тес-эв, направленных на прижизненную оценку потенциальной способности юты к функционированию, в условиях разлнчноП органной ее локализа-1П, а также получить дополнительную информацию в конкретных парази-)~хозяиновых системах и в очаге инвазии в целом.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации докладывались и обсуж-ишсь на конференциях молодых ученых Волгоградского медицинского гститута (1987 - 1992 ); заседаниях Волгоградского отделения обцес-1а иммунологов (1987,1991); ежегодных научных сессиях Волгоградско-| медицинского института(19В7-1992); 1 Всесоюзной школе-семпнаре 'лодых ученых п специалистов "Фундаментальные и прикладные проблемы ■дицинекой паразитологии " (Москва,1990).

ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертации опубликованы в 6 пе-тных работах, из них 3 статьи - в журнале "Медицинская паразнтоло-!я и паразитарные болеони".

СТРУКТУРА И ОБЬЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, зора литературы,описания материалов и методов исследования,резуль-тов работы и их обсуждения , заключения,выводов и приложений. Дне-

сертация наложена на 147 страницах машинописного текста, содержит рисунков,25 таблиц. В список литературы включены 159 публикаций, который 76 принадлежит отечественным и 83-*'иностранным авторам.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалом для исследования послужили эхинококковые жидкое (ЭЮ цист различной локализации ( печень,легкие > от различных пр межуточных хозяев - овец,крупного рогатогоо скота (КРС),свиньи, п •лученные из двух географически удаленных регионов ( Ростовской и С иаркандской областей ). Исследовано 11 образцов ЭЙ, в том числе : из печени овец,2- из легких овец, 2- из печени КРС и 1 - из пече свиньи.

Изучение всех исходных образцов ЭЙ п компонентов их составля. щих проводили по единой схеме.

ОпределиЛ1 ic-одержанпе белка с использованием реактива Фолина-Ч: окальтео,карбоксллэстераоную активности (КЭА) с исполььоованнем качестве субстрата ct-нафтил-ацетата, а фракционный состав образцов Э'. определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии i приборе М-3500 " Spectra-Physics " с использованием "голубых" кол< нок.

Для получения высоокомолекулярннх компонентов Ш проводили по< ледовательное фракционирование исходных образцов Ш. методом crynei чатой диафильтрации на мембранная ХМ-300, ХИ-100, Х1.1-50 и UM-0,5 ячейках фирмы Am icon (США) и гелевой хроматографией на колонках зе полненных сефароаой 4В и 6В.

t

Полисахаридный компонент определяли методом аффинной хроматог рафии на колонке,заполненной кон-А-сефарозой 4В.

Два основных антигена (АГ) ЭЖ (АГ-5 н АГ-В) характеризующее

ютветственно териолабнлыюстью и термостабпльностью, определяли в >акции торможения пассивной гемагглютинацпн (РТПГА) с сыворотками >льных эхинококкозон, содержащих антитела (АТ) к основным АГ парада - термоетабильноиу (ТС) -используя референс- сыворотки А и В, и ¡рмолабильному (ТЛ) используя референс- сыворотки Б и Г . В качест-; референс-препарата (РС) использовали также коммерческую полиспе-|фнческую сшоротку Ставропольского НПО "Аллерген", с помощью кото-й выявляется весь спектр АТ,вырабатывающихся к общему АГ-комплек-

Перекрестно-реагирующие АР компоненты выявляли в реакции двой-й диффузии в геле (РДДГ) по методу Уохтерлонп в мнкроварианте; с умя гипериммуннымп кроличьими сыворотками: коммерческой антисыво,-ткой против глобулинов барана (КАСг.б.) и антисывороткой к цельной (КАСц.ЭЮ,от кроликов,иммунизированных по схеме НагЬоу Н. (1977).

На основе полученных высокомолекулярных компонентов ЗК были иготовлены эрптроцитарные диагностикумн ОД) по двум схемам: 1) нсибилизацим эритроцитов антигенно активными компонентами проводи-с помощю риванола по методике,предложенной Кузьминым Ю.А. ■982);2) сенсибилизацию проводили с помоцьи танина. ЭД были исполь-ваны в реакции непрямой гемагглмтннации (РИГА) в микроварианте, по тодике, разработанной в ИШиТИ им.Е.И.Ыарциновского, с сыворотками больных эхинококковом.

Для вычисления значимости полученных различий по выбранным по-зателям использовали непараметрические критерии статистической ачимости различий (Гублер Е.В.,1978 ).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Биохимическая характеристика исходньи образцов ЭЖ и компо-

нентов ее составляющих.

На первом этапе наыего исследоваия было проведено изучение ходних образцов ЭЖ, по выбранным биохимическим параметрам.

В результате удалось показать,что «сходные образцы Э* разли лпсь по содержании белковых компонентов. Хроматографическпй ана, Ш на "голубых" колонках выявил их гетерогенность. , .

. „ Причем различия наблюдались в содержании компонентов с ы.м. 1 нее 5кД и более 700 кД. Отличались изучаемые образцы Ш и по сост; макромолекул,обладающих КЭА. Содержание белковой фракции ЭЯ.получ* ных от промежуточных хозяев из Ростовской области значимо превьп этот показатель в Эж цист, полученных от промежуточных хозяев из ( маркандской области.

Дальнейшее препаративное разделение и концентрирование биопо] меров Э(К проводили' методами мембранной фильтрации и гельфильтрац! В результате такого ступенчатого разделения впервые были выдел* высокомолекулярные компоненты ЭЖ, обладюцпе КЭА, и определены ю:и чественные параметры этой активности. Содержание биополимеров, oбJ дающих КЭА в высокомолекулярных фракциях ЭЖ цист промежуточных хо; ев из Ростовской области больше, чем в аналогичных фракциях Э& щ у промежуточных хозяев из Самаркандской, области (рис.1). Наиболы ферментативной активностью обладали фракции ХМ-300, выделенные из цист овец. Последовательное изучение отобранных фракций выяснило что высокомолекулярные биополимеры, в частности, белковые макромо; кулы'с м.м. более 1 ООО кД, входящие в состав фракций ЭЖ цист легких, гетерогенны и обладают невысокой ферментативной активность тогда как аналогичные макромолекулы, входящие в состав фраки ХМ-300 Э* цист из печени однородны и обладают значимо большей КЭА.

'{■ерыентативно-активные макромолекулы образуют комплексы в с

Самаркандская ; Ростовская

Рис. 1.. Суммарная карйоксилэстеразная активность высокомолекулярных фракций 2М-300 и Ж-100. I - ЭЖ вдет печени овец 2 - ЭЖ цист печена к.р.с. 3 - " - 32 Мст лёгких овец_______________ 4 - ЭЖ цист печени свиньи

1 ига г

новном, с белковыми молекулами в цист из легких, а в Э# цне печени с глнкопротеидншн компонентами.

Выявленные биохимические различия Э? цист от различных про» точных хозяев были сопоставлении о их пммунохимичеекшш свойстве

2. Иммунохлыпчеекая характеристика исходных образцов и понентов ее составляющих.

Изучение АГ активности и выявление перекрестно-реагирующих компонентов проводили во всех исследуемых образцах ЭЖ и послед тельно получаемых фракциях.

Сравнительное изучение исходных образцов Э* показало, что держание ТС АГ компонента в гпдатидных жидкостях цист Промежуточных хозяев из Ростовской области было значимо вше,не жели в ЭЖ цист от промежуточных хозяев из Самаркандской области же различия наблюдались и в высокомолекулярных фракциях ЭЯ - кош тратд* ХМ-300 и ХЫ-100.

Определение перекрестно-реагирующих АГ компонентов с поме КАСг.б. показало наличие таковых во всех исходных образцах Э>К. вестно, что в процессе эволюции паразитические организмы выработ много общих, для возможных отношении в экосистеме паразит-проие точный хозяин,антигенных детерминант. Скорее всего, в данном с чае,мы столкнулись именно с таким, общим для Е.£гапи1оеиз явление

Исследование с помощью КАС ц.ЭЖ показало, что в ЭЖ цист из л . различным

кнх и печени овец определяются АГ детерминанты, родственные^глобу

нам хозяина.

Применение метода ступенчатой диафнльтрацин и гельфильтра; позволило сконцентрировать высокомолекулярные фракции и значимо I высить в них удельную АГ активность исходных Э)К.

Содержание ТС компонента в высокомолекулярных фракциях цист па Ростовской области было выше,чем во фракциях Э# цист из Самаркандской области, тогда как по отношению к ТЛ наблюдалась обратная зависимость. Доверительные границы содержания ТС компонента в ЭЖ цист промежуточных хозяев из Ростовскоой области колебались от 7,85% до 34,1 а в Самаркандской области этот показатель составил от 3,02% до 3,8%. и различие это статистически значимо (рис. 2).

Анализ высокомолекулярных фракций Э$ из цист от разных промежуточных хозяев показал, что наиболее репрезентативными как в отношении ферментативной активности, так и содержании ТС и ТЛ АГ компонентов, являются концентраты ХМ-300 гидатндной жидкости цист,выделенных от овец. Не исключено, что субвариантные различия могут зависить и от органной локализации цисты. При сравнительном анализе АГ Эй цист одного вида промежуточного хозяина - овцы, в зависимости от локализации цисты (легкие и печень)было ¡обнаружено различие"

с' ■ ", между содержанием ТС и ТЛ АГ: в част-

ности ТЛ АГ в ЭЖ из цист печени и легких^рстречаштся примерно в равных концентрациях, тогда как содержание ТС АГ в цист из печени овец значимо превосходило таковые в Э* цист из легких.

3. Приготовление и оценка эритроцнтарнш дпагностикумов на основе полученных подфракций концентратов ХН-300 ЭЙ цист легких и печени овец.

Выявленные различия биохимических и серологических свойств ги-датидных жидкостей цист разных промежуточных хозяев и разной органной локализации позволили провести предварительное исследование возможности использования полученных высокомолекулярных биополимеров в

-лмак^ймдская

ростовская

2 ЕШЗ

Ряс. 2. содержание ТС и ТЛ АГ компонентов

1 - ТС Аг компонент '

2 - ТЛ АГ компонент

3 - общий АГ комплекс

качестве иммунохимических реагентов для оценки паразито-хозяиновых отношений у больных эхинококкозом с разной органной локализацией цист.

Как было показано вше ферментсодержацне биополимеры связаны, в основном, с ТЛ АР компонентом. Исходя из этого,была предпринята попытка приготовления ЭД на основе полученных подфракций высокомолекулярных концентратов ХМ-300 ЭЖ цист из легких и печени овец, и рассмотрена возможность использования их в качестве вспомагательньи реагентов для оценки состояния и жизнеспособности цисты.

ЭД реагируют с сыворотками здоровых доноров в титрах 1:8 -1:16, что дало основание принять титр 1:16 как фоновый.

При исследовании сывороток больных эхинококкозом было определе-чо, что титр АТ у больных эхинококкозом печени несколько больше с АГ 13 ЭЖ цист, локализованных в печени, а у больных с эхинококкозом легких-с АГ из цист, локализованных в легких. Обнаружение сравнительно высоких титров с помоцыо ЭД, приготовленного на основе фер-(ентсодержацей подфракции может говорить об активном процессе.

4. Заключение.

Проведенные исследования можно в какой-то степени рассматри-1ать как попытку провести системный анализ, одновременно связав во ;дино биохимические и серологические свойства изученных ЭЖ и композитов их составляющих,поскольку именно эти различия оказывают су-(ественное влияние на проникновение и локализацию паразита в конк-»етном хозяине и органе, равно как и на реакцию хозяина в ответ на то проникновение.

Мы полагали, что сравнительная комплексная оценка свойств Э* озволит в перспективе вносить коррективы в данные, получаемые при

оценке эпидемиологической динамики эхинококкоза на конкретной тер} тории, по ходу обследования репрезентативных групп населения,особе но групп повышенного риска заражения.-

Основываясь на материалах сравнительного биохимического анал! представляется возможным заключить, что: 1) ферментсодержащие комг ненти связаны с высокомолекулярными биополимерами ЭЖ; 2)еодержаь белковой фракции и ферментсодержащих компонентов в п)Датидных жг костях цист,выделенных от. промежуточных хозяев из Ростовской' обла тн выие, чем в аналогичных ЭЖ, цист промежуточных хозяев из Самаркз декой области; 3)Эж цист овец содержат больше фернентатпвноактнвь .компонентов,чем ЭЖ цист других промежуточных хозяев» 4)гидатидь жидкости цист разной локализации от промежуточньк хозяев одного ви отличаются по составу биополимеров.КЭ в ЭЖ цист из легких связана белковыми молекулами,а в ЭЖ цист из печени - с глпкопротеидньшЦ. , По материалам экспериментов,выполненных о применением,нимунох мичеекпх методик, мы склоны заключить, что: 1) содержане ТС АГ КС понента в гидатидннх жидкостях, вьщеленньк из цист промежуточных х зяев из Ростовской области больше, нежели в ЭЖ цист проыежуточь хозяев из Самаркандской области; 2)содержание ТС АГ компонента в цист от овец выше,чем в ЭЖ цист от других промежуточных хозяе 3)высокомолекулярные фракции ЭЖ цист из легких овец в отношении компонента менее активны таковых в ЭЖ цист из печени; 4)АГ актг ность концентратов ХМ-300 и ХМ-100 в 100-150 раз превышает таковук исходных ЭЖ;5)ТЛ АГ компонент сосредотачивается в основном во фрэ циях с м.м. более 700 кД, а ТС компонент - в подфракциях с м.м. он ло 2о0-300кД,

вьводы.

V. Гидатидные жидкости цист, полученные от промежуточных хозяев Е.granulosus из двух географически удаленных регионов,различают-я по содержанию белковых компонентов, составу макромолекул, облада-щпх карбоксилэстеразнои активностью и соотношению термостабпльного термолабильного антигенных компонентов.

2.Выявленные био- и имнунохимнчес-ки^, различия в гидатпдах эхи-ококка обосновывают целесообразность изучения субвариантов .granulosus в зависимости от области распространения,вида промежу-очного хозяина и органной локализации цисты паразита.

3. Основная антигенная активность связана с высоокомолеку-ярнымн компонентами, антигенная активность концентратов ХМ-300 и М-100 в 100-150 раз превышала таковую в исходных образцах ЭЯ.

4. Карбоксилэстераза является частью комплекса высокомолекуляр-ых термолабильных антнгенно активных биополннеров,имеющих выражений углеводный компонент и сродство к конканавалпну-А.

5. Содержание ТЛ антигенного компонента в Ш цист от промежу-эчных хозяев одного вида (овец),но разной органной. . лоокализации печень,легкие), варьирует не существенно, тогда как количество ТС птигенного компонента в ЭЖ из цист печени овец значимо превосходит эдержание этого компонента в из цист легких.

6. Содержание ферментативно активных биополимеров и термоста-лльньк антнгенньи компонентов в Э<< цист,выделенных от промежуточных эзяев из Ростовской области значимо больше таковых в Э>К цист, от '^межуточных хозяев на Самаркандской области. Выявленная зависи-:>сть должна учитываться при подборе критериев для серологической фактеристики субвариантов и дифференциальной идентификации геогра-1ческих вариантов эхинококка.

7.Эритроцптарные диагностнкумы, приготовленные на основе выс комолекулярных фракций Э^, обладающих карбоксилэстеразной акт ностьм, можно использовать в качестве дополнительных реагентов оценки состояния и жизнеспособности цисты при обследовании боль эх инококко зом.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

.1. Е.А.Совпна, А.И.Збарский, А.В.Ермолаев, Ы.В.Далин, Г.Р.Я]

лин. Иммунохимическая характеристика эхинококковой жидкости, испо. «

зуемой для приготовления иммунодиагностнческпх препаратов Нед.парзитол.-1989.-11 2.-С.54-57.

2. А.II.Збарскнй, Е.А.Совпна, А.В.Ермолаев, М.В.Далнн. Выделе! антигенов из пузырей Е.granulosus методом ступенчатой мембранной ) афильтрации.// Мед.парз1ггол.-1989.-П 2.-С.57-61.

3. Е.А.Совпна. Получение высокомолекулярных диагностические ных антигенов из пузырей Echinococcus granulosus.// Актуальные вс росы экспериментальной, клинической и профилактической медии ны.-Волгоград.-1989.-С.53.

4. Е.А.Совпна. Иммунохимическая характрпстика фракций эхиноко ковой жидкости.// Ыед.парзнтол.-1990.-!1 4.-С.48-50.'

5. Е.А.Совина, Г.Р.Ярулин. Роль местного иммунитета в реинваз эхинококка.// Кровь-, лимфообращение и иммунокомпетентные органы Сборник науных статен. -Волгоград.- 1990,- В.З.- том 43.- С.110-11!

6. Е.А.Совина. Выделение антигенных компанентов, обладают: ферментной активностью из фракций эхинококковой жидкости.//Актуал! ные проблемы медицинской науки и практики.-Волгоград.- 1992 С.65-66.

' I I.Ki/lklU.« 1 .•

Pejy/iii i .1 тч PHI A i: oumipo i иаии здоровых доиопш.

СЫПОРП * <<11 АП1 Hjpnt* ЭЛ.2 ЭЛ.З ЭЛ.4 ЭД.6 ЭЯ.9

С . "Л" 1:8 0 0 0 1: 16

С . "Ii " 0 0 0 0 0

С . "0 " 0 0 0 0 0

С . "Г •■ 0 0 0 0 1: 16

С."Л" 1:16 1:8 1:16 0 1:8

Таблица 2 .

Риульити РНГП а смоиротками больных зхинакоккшам.

Типография при Хозяйственном ,упра1леннм Минздрав! России