Иммобилизованные и модифицированные олигонуклеотиды в физико-химических исследованиях дуплексов и триплексов ДНК

Тимофеев, Эдуард Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммобилизованные и модифицированные олигонуклеотиды в физико-химических исследованиях дуплексов и триплексов ДНК
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Иммобилизованные и модифицированные олигонуклеотиды в физико-химических исследованиях дуплексов и триплексов ДНК"

На правах рукописи

ТИМОФЕЕВ Эдуард Николаевич

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ И МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ В ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ДУПЛЕКСОВ И ТРИПЛЕКСОВ ДНК

03.00.03 — Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва 2009

□ □34В17 !□

003481710

Работа выполнена в Лаборатории стереохимии ферментативных реакций Учреждения Российской Академии Наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта

РАН

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук, чл.-корр. РАН Георгий Валерианович Гурский

Доктор химических наук, профессор Татьяна Семеновна Орецкая

Доктор химических наук, профессор Владимир Алексеевич Ефимов

Ведущая организация:

Институт физико-химической медицины Минздрава РФ

г. в /3

Защита состоится '^г^оьг. в / ^ на заседании диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан « ¿^Р %

2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Широкий спектр функций нуклеиновых кислот в живых системах определяется структурным разнообразием этого класса природных соединений. Помимо канонической антипараллельной двойной спирали Уотсона-Крика природные полинуклеотидные цепи образуют трех- и четырехцепочечные структуры различных типов, параллельные дуплексы, рибозимы и ДНК-зимы. В качестве отдельного структурного семейства можно выделить сложные синтетические надмолекулярные олигонуклеотидные конструкции, в которых могут быть реализованы различные типы взаимодействий.

Из всех вышеперечисленных форм организации нуклеиновых кислот, вне всякого сомнения, наиболее важной является двойная спираль ДНК. Огромное значение исследований дуплексов ДНК обусловлено тем, что комплементарное узнавание в двойной спирали является основой современной молекулярной биологии и таких ее методов и приложений как полимеразная цепная реакция, биологические микрочипы, гибридизационный анализ, молекулярная диагностика.

Единственной структурой, сопоставимой с дуплексами ДНК по количеству посвященных ей исследований, является тройная спираль или триплексы. Открытые лишь через три года после опубликования структуры двойной спирали, трехцепочечные комплексы до настоящего времени являются объектом повышенного интереса, что обусловлено главным образом потенциальной возможностью использования синтетических олигонуклеотидов для контроля экпрессии генов на уровне транскрипции за счет связывания с двуспиральной ДНК. Другим важным аспектом в исследованиях этих структур является изучение роли и функций параллельных триплексов ДНК в генетической рекомбинации. Настоящая работа включает литературный обзор, полностью посвященный рассмотрению триплексов ДНК.

Доступность синтетических олигонуклеотидов вывела как биологические, так и физико-химические исследования дуплексов и триплексов ДНК на новый уровень. С середины 80-х появилась возможность детально исследовать поведение этих структур различными методами. Однако, уже скоро стало очевидно, что исследования только природных олигонуклеотидных цепей не позволяют в полной мере оценить влияние различных факторов на стабильность и специфичность образования дуплексов и триплексов ДНК. Кроме того, образование триплексов ДНК из природных цепей ограничено полипуриновыми и полипиримидиновыми участками, а также требованием протонирования цитидинов в пиримидиновых антипараллельных триплс

Возможности синтетической олигонуклеотидной химии в настоящее время позволяют в широких пределах варьировать состав и свойства олигонуклеотидов. Огромное количество методов модификации олигонуклеотидов предоставляет возможности для целенаправленного изменения свойств взаимодействующих цепей. Появилась уникальная возможность селективной трансформации цепей для оценки влияния тех или иных факторов на свойства образующихся комплексов. Модифицированные олигонуклеотиды предоставляют недоступную ранее возможность моделирования новых типов взаимодействиий нуклеиновых кислот. Методы современной олигонуклеотидной химии позволяют модифицировать или полностью замещать сахарофосфат и нуклеиновые основания, синтезировать самые разнообразные конъюгаты олигонуклеотидов, проводить их иммобилизацию на поверхности или в объеме полимера, вводить в цепь ненуклеотидые фрагменты.

Целыо настоящей работы являлось комплексное физико-химическое исследование дуплексов и триплексов ДНК с привлечением синтетических методов к построению олигонуклеотидных моделей и при разработке платформы анализа.

В ходе выполнения работы были решены следующие задачи:

1. Разработаны синтетические подходы к иммобилизации олигонуклеотидов и ДНК в объеме гидрофильного полимера. Предложена синтетическая платформа для параллельного анализа взаимодействий нуклеотидных цепей на гидрогелевых микрочипах.

2. Осуществлен параллельный анализ образования модифицированных дуплексов с использованием полной матрицы иммобилизованных гексануклеотидов (4096 элементов). Исследовано влияние типа модификаций на стабильность образующихся коротких дуплексов ДНК и специфичность их образования.

3. Проведено исследование влияния гидрофобных и ионных модификаций олигонуклеотидных цепей на стабильность и структуру дуплексов ДНК.

4. Проведен выбор адекватных олигонуклеотидных моделей, содержащих модифицированные цепи, для исследования новых и известных типов триплексов ДНК. Реализован новый принцип построения триплексов ДНК, позволяющий адресовать неприродные синтстичсские олигонуклеотиды к произвольной последовательности ДНК.

Научная новизна и практическая ценность работы. Рассмотренные в работе подходы к разработке уникальной платформы анализа и построению моделей в физико-химических исследованиях нуклеиновых кислот и полученные результаты имеют приоритетный характер и открывают новое направление исследований.

Физико-химические исследования модифицированных дуплексов ДНК осуществлены как традиционными методами, так и с привлечением новых подходов, основанных на использовании параллельных методов анализа. Разработка синтетических платформ для реализации этих новых подходов представляется одним из наиболее значимых результатов настоящего исследования. Предложенные в настоящей работе методы иммобилизации олигонуклеотидов в сшитых гидрофильных полимерах являются базовыми для нескольких поколений олигонуклеотидных гидрогелевых микрочипов. Три принципиально различных подхода к иммобилизации предоставляют возможность выбора технологического решения при изготовлении гидрогелевых трехмерных микрочипов -традиционная иммобилизация, фотонаправленный синтез или сополимеризация модифицированных олигонуклеотидов с акриловыми мономерами. Параллельный анализ образования дуплексов на олигонуклеотидных микрочипах широко используется в настоящее время для решения широкого круга биологических и диагностических задач. Однако, возможности этого метода как инструмента физико-химических исследований все еще остаются вне поля зрения исследователей. В настоящей работе впервые представлен параллельный физико-химический анализ образования модифицированных дуплексов ДНК на матрице 4096 иммобилизованных гексануклеотидов.

Проведен синтез и физико-химические исследования дуплексов ДНК, содержащих неприродные цепи, с целью проследить влияние гидрофобных или ионных модификаций на стабильность двойной спирали. Полученные результаты представляют безусловный интерес при конструировании олигонуклеотидных проб для гибридизационного анализа.

В ходе выполнения работы впервые было экспериментально доказано образование

нового типа триплексов ДНК с химерной а,Р-третьей цепью. Новый подход к построению

третьей цепи - с использованием неприродных аномеров нуклеозидов - позволяет

адресовать триплекс-образующие олигонуклеотиды к произвольной последовательности

ДНК и не ограничивается полипуриновыми и полипиримидиновыми участками. В работе

рассмотрены свойства различных типов триплексов, исследованных с использованием

универсальных синтетических конструкций. Предложенный подход к построению

внутримолекулярных моделей триплексов ДНК был реализован впервые и обеспечивает

заметное повышение стабильности, задает взаимную ориентацию цепей, упрощает

термодинамический анализ и сводит к минимуму влияние петли. Благодаря

использованию таких моделей удалось экпериментально получить и охарактеризовать

параллельный триплекс рекомбинантного типа или R-форму ДНК.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных и

российских конференциях: DOE Human Genome Program Contractor-Grantee Workshop IV,

VII, VIII (США, 1994, 1999 и 2000), XIII Internationa Round Table «Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications» (Франция, 1998), XV международная конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 32 работы, в том числе 8 патентов.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 267 страницах машинописного текста, содержит 104 рисунка, 23 таблицы, 10 схем. Диссертация состоит из введения, обзора литературы на тему «Синтетические подходы в исследованиях триплексов ДНК», обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы из 540 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. исследование взаимодействий модифицированных олигонуклеотидов на трехмерной полимерной подложке

За последнее десятилетие методы анализа взаимодействий нуклеиновых кислот пополнились рядом новых подходов, среди которых особое место занимает параллельный анализ на микрочипах. Олигонуклеотидные микрочипы представляют собой матрицу коротких олигонуклеотидов, иммобилизованных на поверхности стекла, пластика или в объемных микроэлементах гидрофильного сшитого полимера. Отличительной особенностью микрочипов, разрабатываемых в ИМБ РАН, является то, что они представляют собой гидрогелевые элементы, фиксированные на поверхности стекла или пластика. Трехмерная иммобилизация обеспечивает ряд существенных преимуществ, основными из которых являются повышенная чувствительность метода, обусловленная увеличенной емкостью элементов на единицу поверхности, меньшая плотность иммобилизации по сравнению с поверхностью, а также возможность изолировать ячейки и осуществлять независимые реакции или взаимодействия в каждой из них. В первой части работы представлены методы иммобилизации олигонуклеотидов, один из которых положен в основу синтетической платформы для изготовления гидрогелевых олигонуклеотидных микрочипов. Также представлен анализ взаимодействий коротких модифицированных олигонуклеотидов с микрочипом, составленным из всех возможных 4096 гексануклеотидов.

1.1. Иммобилизация коротких олигонуклеотндов в сшитых акриловых сополимерах

Самым первым подходом к иммобилизации олигонуклеотндов в объеме геля являлась реакция З'-диальдегидных производных с гидразидными функциональными группами в геле. К сожалению, гидразидная химия не обеспечивает стабильности связи олигонуклеотида с подложкой, особенно в условиях многократных раундов гибридизации и отмывки.

Мы разработали два типа полимерных акриловых носителей для иммобилизации олигонуклеотндов. Эти полимерные носители содержат аминогруппы или альдегидные группы и позволяют проводить иммобилизацию соответственно З'-диальдегидных или аминоалкильных производных олигонуклеотидов в присутствии восстанавливающего агента. Введение аминогрупп в акриловый сополимер было выполнено с использованием хлоргидратов аминоалкилакриламидов. Эти соединения могут быть легко получены при ацилировании соответствующих диаминов акрилоил хлоридом в эфире. Для введения альдегидных групп был использован 5,6-0-изопропилиден-5,6-дигидрокси гексилакриламид, синтез которого представлен на схеме 1. Прочность связи между гелевой подложкой и стеклянной поверхностью достигалась благодаря испльзованию 3-(триэтоксисилилпропил)акриламида. Активация альдегидных функциональных групп в геле проводилась последовательной обработкой сшитого полимера 80% уксусной кислотой и 0.1 М раствором ИаЮ^.

Схема 1. Синтез 5,6-0-изопропилиден-5,6-дигидроксигексилакриламида. (¡) Ацетон, ТэОН, азеотропная отгонка воды; (ц) МбС1 в Ру; (ш) Ш3 в ДМФ, 150°С; (¡у) РЬ3Р в Ру; (у) акрилоил хлорид, триэтиламин, 0°С.

он

¡-ш

Иммобилизация проводилась с использованием 5'-32Р-меченных олигонуклеотидов АТССТАСТ-Х, где X - окисленный метилуридиновый фрагмент или аминоалкильная

группа (ONI и ON2, соответственно). Немодифицированный олигонуклеотид (ON3) был использован в качестве отрицательного контроля. Химия иммобилизации представлена на схемах 2 и 3. Как и ожидалось, обе схемы иммобилизации обеспечивают высокий выход пришивки, таблица 1. Наилучшие результаты были получены при использовании в качестве восстановителя пиридин-борана как для амино-, так и для альдегидного сополимера (74% и 97%, соответственно).

Из всех исследованных методов иммобилизации наиболее привлекательным с точки зрения эффективности, стабильности и технологичности представляется метод, основанный на привязке аминоолигонуклеотидов к альдегидной полимерной подложке.

Вышеописанная процедура иммобилизации аминоолигонуклеотидов в сшитых акриловых сополимерах была адаптирована для процесса изготовления гидрогелевых олигонуклеотидных микрочипов. В модифицированной схеме иммобилизации мы использовали другой акриловый мономер - Л'-(2,2-диметоксиэтил)-акриламид, легко получаемый в одну стадию из коммерчески доступного (2,2-диметоксиэтил)амина. Ячейки функционализованного сшитого сополимера были сформированы методом фотополимеризации смеси акриламида, бис-акриламида и А'-(2,2-днметоксиэтил)-акриламида. Альдегидные группы в геле были деблокированы короткой кислотной обработкой микрочипов, после чего с помощью автоматизированной системы нанесения каждая ячейка геля была загружена индивидуальным раствором аминоолигонуклеотида. Восстановление оснований Шиффа пиридиний-бораном было осуществлено в условиях, препятствующих переносу олигонуклеотидных растворов между соседними ячейками.

1) 5'-oligo-p-Link-NHj

2) X-BIIj, X=NaCN, I'y или NMe,

Схема 2. Иммобилизация аминоолигонуклеотидов на альдегидной полимерной подложке.

1) н*

2) NalO,

Link* р -oligo-S*

11=11 «ли Ме

N11,

Х-ВН3, Х=^СМ, Ру или КМ е.,

5'-онео-р-0—1 у"

] ^о - р-0

аЛг

Схема 3. Иммобилизация З'-диальдегидиых производных олигонуклеотидов на аминированной полимерной подложке.

Таблица 1. Данные по эффективности иммобилизации.

Тип подложки Функциональная группа Выход, % Неспецифическое

(восстановитель) олигонуклеотида связывание, %

-ЫН2 (№С№ВН3) -СН=0 60±5 2±\

-Ш2(Ру-ВН,) -СН=0 74±5 5±1.5

ЫН2 (ММе3-ВН3) -СН=0 68±5 3±1

-СН=0 (ИаСЫ-ВИз) -ИН2 95±5 9±2

-СНО (Ру-ВНз) -Ш2 97±5 8±2

-СН=0 (ММе3-ВН3) -ИН2 94±5 3±1

-С(0)МШН2 -СН=0 87±5 1±0.5

-С(0)ШШ2 -СН=0 88± 5 1±0.5

Вышеописанный процесс изготовления был использован при разработке олигонуклеотидных гидрогелевых микрочипов для анализа 168 РНК некоторых патогенных микроорганизмов, микрочипов, содержащих полный набор всех возможных гексануклеотидов, при разработке методов амплификации ДНК с использованием микрочипов, в экспериментах по анализу полиморфизма на микрочипах и при исследовании ферментативных реакций с участием иммобилизованных олигонуклеотидов.

1.2. Функционалнзация ДНК и ее иммобилизация в полиакриламидпом геле

В работе представлен простой метод функционализации ДНК за счет апуринизации и введении аминогрупп по апуринизованным участкам. Благодаря наличию аминогрупп модифицированная ДНК может быть иммобилизована в альдегид-содержащем сшитом полиакриламиде. Такая процедура иммобилизации ДНК полностью совместима с иммобилизацией аминоолигонуклеотидов, что позволяет использовать ее при изготовлении гибридных ДНК-олигонуклеотидных микрочипов. Введение аминогрупп в ДНК может при необходимости сопровождаться ее фрагментацией по участкам функционализации.

Реакция апуринизации и последующее присоединение этилендиамина были изучены на олигонуклеотидной модели РЛМ-с1(ТлОТ8), 0.\4. Апуринизация сопровождается незначительной фрагментацией (ок. 10%) с образованием более мобильного гексануклеотида ИАМ-сШ-р, являющегося продуктом ¿-элиминирования. При инкубации апуринизованного олигонуклеотида с этилендиамином в течение 3 часов при 37°С и рН 7.4 наблюдается /?-элиминиерование и разрыв цепи в месте апуринизации с выходом ок. 70%. Восстановление образованного фрагмента боргидридом натрия приводит к образованию аминоолигонуклеотида РАМ-с1Тг,-с1Я-Ь1Н-С2Н4-1\1Н2. Помимо этого образуется до 15% полноразмерного аминоолигонуклеотида. При восстановительном аминировании апуринизованного олигонуклеотида этилендиамином при рН 4.4 в присутствии цианборгидрида натрия образуется полноразмерный аминоолигонуклеотид РАМ-ЛбЧст-МН-СгЩ-МНгЭ-сГГа с выходом около 90%. Наряду с основным продуктом в реакционной смеси содержалось не более 5% исходного апуринизованного олигонуклеотида и продукта ¿-элиминирования.

При моделировании иммобилизации в гидрогелевых ячейках микрочипа был использован синтетический 40-мерный олигонуклеотид О N5 (рис. 1А). Эффективность иммобилизации ДНК оценивали по комплементарному связыванию четырех флуоресцентно меченных олигонуклеотидов (Ж6-(Ш9. Результат гибридизации ДНК микрочипа с олигомером <Ж8 представлен на рис. 1В. Гибридизация проходила с большей эффективностью при больших временах апуринизации (40 и 60 мин кислотной обработки) как в случае фрагментации, так и без нее. Большее количество апуриновых участков и меньшая длина фрагмента ДНК повышает эффективность иммобилизации и последующей гибридизации. Однако, при избыточной апуринизации следует ожидать снижения эффективности гибридизации, вследствие заметной потери пуриновых

оснований. Количественные данные по гибридизации четырех проб с иммобилизованной ДНК представлены на рис. 1С и Ш.

I .

80% НСООН

ш2чсн2)2^н2 на,

рН 4.4, ЫаВН3Оч1

I .

О-

ОН

ША

Ш2-{СН2)2-М42 на, рН 7.4, ЗЬ; ЫаВН4

ОХА

I .

О-

? ША

ОШ-1шкег-Се1 РуВН3

ША

I -

^02

О.

ОН

N 11-С П2- 1ткег- Ос 1

ША \ .

^>2

ОН

ОСН-1ткег-С!е1 РуВН3

ША \ -

[02 О

ОН

МН^^Н-СН2-1ткег-(Зе1

ША

Схема. 4. Конденсация апуриновой ДНК с этилендиамином.

В качестве длинных фрагментов ДНК были использованы перекрывающиеся одно- и двухцепочечные участки длиной 218 и 972 нуклеотидов к-ДНК антигена карциномы человека GA733-2 (клон GA733-2-2), а также 227-нуклеотидный участок HLA DQa 0201, которые были получены обычной или ассиметричной ПЦР. На рис. 2 показаны результаты гибридизации ДНК-микрочипа с олигонуклеотидами ONIO (10-мер), ON11 (15-мер) и ON12 (37-мер), комплементарными фрагментам длиной 218, 972 и 227 нуклеотидов, соответственно. Все три олигонуклеотидные пробы показали специфическое связывание с комплементарной иммобилизованной ДНК. Гелевые элементы с контрольной необработанной ДНК и ненагруженные ячейки не обнаружили сколько-нибудь заметного гибризационного сигнала. Увеличение времени апуринизации ДНК с 3 до 30 мин привело к усилению эффективности гибридизации. Однако, дальнейшее увеличение длительности кислотной обработки до 1 часа не привело к повышению сигналов гибридизации как для одноцепочечной, так и для двухцепочечной ДНК. При фрагментации флуоресцентный сигнал распределен более равномерно по полю ячейки, что свидетельствует о более равномерной иммобилизации. Нефрагментированная ДНК иммобилизуется преимущественно по поверхности ячейки. Следует отметить, что как одноцепочечная, так и двухцепочечная ДНК дают схожий профиль гибридизации. Это свидетельствует о том, что присутствие комплементарной цепи в геле не осложняет гибридизацию с олигонуклеотидными пробами.

1.3. Фотоиаправлениый синтез матрицы олнгонуклеотидов на гидрогелевой полимерной подложке

Совмещение технологии фотонаправленного синтеза олнгонуклеотидов на поверхности с преимуществами гидрогелевых микрочипов позволило бы существенно расширить границы применения и эффективность использования биологических микрочипов. Нами была предпринятата попытка конвергенции двух различных подходов к изготовлению олигонуклеотидных микрочипов.

Среди акриловых полимеров, совместимых с процедурой олигонуклеотидного синтеза, можно назвать сшитый полидиметилакриламид и полиакрилоилморфолид. Оба этих носителя характеризуются совместимостью как с органическими растворителями, так и с водными растворами. Полидиметилакриламид хорошо набухает в воде, хлористом метилене, пиридине, диметилформамиде и удовлетворительно в ацетоне, спиртах и ацетонитриле. Стандартные реагенты для олигонуклеотидного синтеза - трихлоруксусная кислота в дихлорметане, раствор иода в системе ТГФ-пиридин-вода, кэпирующие растворы не вызывают разрушения полимера.

40-mer (ON5):

ON9

TACCAGTTTTACQGTCCCTCTGGCCAQTACACCCATGAAT

ON8 ON7 ON6

Фрагментированный Нефрагментированный \ /

Время

апуринизации 60 min

контроль

Labeled probe

Рис. 1. Гибридизация олигомеров ON6-ON9 с иммобилизованным 40-мером. (А) Нуклеотидная последовательность 40-мерного олигонуклеотида. (В) Результат гибридизации микрочипа с ON8. Контроль - флуоресцентно меченный октамер. (C,D) Количественные данные по гибридизации ON6-ON9 (позиции на графике с 1 по 4 соответственно).

ДНК-микрочип

Необр. 227-нт 972-нт 972-нт

218-нт

Время

апуринизации 3 min

30 min

60 min

+ - - +

- + +

+ + + 7 6 5

+ +

S.S. d.s.

Фрагментированная Нефрагментированная

onio

» ® a m

ONU

ON12

Рис. 2. Гибридизация ДНК-микрочипа. (А) Результаты гибридизации с олигонуклеотидами ONIO-ONI2. (В) Количественные данные по гибридизации с ДНК-микрочипом.

Lane number

(lepurinalion time □ 3m,,

^ 60 it

ON11

Метод пришивки полимера к стеклянной повехности с использованием Л-(3-триэтоксисилилпропил)-акриламидом, рассмотренный выше, обеспечивает стабильную привязку полимерной пленки к стеклу и стабильность в условиях деблокирования олигонуклеотидов (50% спиртовой этилендиамин при комнатной температуре в течение нескольких часов). В качестве функциональной группы для инициирования олигонуклеотидного синтеза в геле была выбрана аминогруппа, поскольку соответствующий мономер - хлоргидрат Ы-(2-аминоэтил)акриламида - может быть легко синтезирован в одну стадию из этилендиамина и акрилоилхлорида. Таким образом, олигонуклеотид оказывается связанным с гелевой подложкой фосфорамидатной связью. Для фотонаправленного олигонуклеотидного синтеза в сшитом полидиметилакриламиде мы использовали 15 мкм или 50 мкм пленки геля на стекле.

Синтез олигонуклеотида (dT)[6 на 50 мкм полидиметилакриламидной пленке с использованием стандартной DMTr химии показал высокую эффективность конденсации начиная со второго нуклеотидного звена, тогда как первый присоединенный нуклеотид характеризовался эффективностью в 90%. Емкость гелевой подложки в расчете на площадь 1 кв. дюйм составила 90 микромоль по данным фотометрии первого отщепленного DMTr фрагмента. Это соответствует концентрации доступных функциональных групп в геле 6 тМ. Однако, это значение составляет лишь 6% от исходного количество использованного аминомономера.

Сравнительный анализ гибридизации на 15 мкм гидрогелевых и плоских

микрочипах был осуществлен с использованием матрицы 16x16 элементов размером 200

и 800 мкм. Олигонуклеотид FAM-CTGAACGGTA (ON13) в концентрации 10"® М (в

5xSSPE) был использован для гибридизации с пробами на чипе, нуклеотидный состав

которых был представлен полным набором вариаций в центральном тетрануклеотидном

фрагменте. Анализ гибридизации показал, что поверхностные и гидрогелевые микрочипы

различаются по двум основным характеристикам: емкость ячеек по иммобилизованной

пробе и кинетика отмывки. Интенсивность сигнала с гелевых микрочипов приблизительно

в 2 раза превышала этот параметр для поверхностных микрочипов, при этом

интенсивность лазера при сканировании геля была понижена в 10 раз. Скорость отмывки

пригибридизованной пробы с гелевого чипа существенно ниже скорости отмывки

поверхностных чипов. Так, для получения стандартной гибридизационной картины на

поверхностном микрочипе было достаточно провести одну отмывку при температуре

гибридизации (16°С). В случае гелевых микрочипов для получения такого же уровня

сигнала необходимо было провести многократную отмывку при повышенной температуре

(50°С). Распределение мисматчевых сигналов представляется более адекватным в случае

гидрогелевых микрочипов. Наиболее стабильным мисматчем на поверхностном микрочипе оказался ТТ (мисматч/перфект = 187/465), тогда как на гелевом - GT (543/1005). Наиболее существенным недостатком гелевых полидиметилакриламидных микрочипов является высокий уровень фона, который в 4 раза превышает фон на поверхностных микрочипах.

1.4. Иммобилизация олигонуклеотидов в сшитом полнакриламидном геле методом сополимернзации

Нами впервые был разработан метод фото- или химически индуцируемой сополимернзации аллильных производных олигонуклеотидов с акриламидом, пригодный для изготовления гидрогелевых олигонуклеотидных микрочипов.

В качестве непредельных модификаторов олигонуклеотидной цепи, способных к совместной полимеризации с акриламидом, мы выбрали аллиловый спирт и бутендиол. Соответствующие фосфорамидиты для использования в автоматическом олигонуклеотидном синтезе были синтезированы в одну или две стадии, соответственно. Для достижения совместимости аллильных мономеров со всеми этапами олигонуклеотидного синтеза оказалось достаточным заменить стандартный окислитель раствором 1 M трет-бутил пероксида в ТГФ.

Для проведения сополимернзации в микрокаплях глицеринового раствора мономеров и персульфата аммония был использован метод межфазной доставки реагента, в данном случае TEMED.

Сополимеризация акриловых мономеров с аллильными олигонуклеотидами может быть проведена в микрокаплях в условиях межфазной доставки активатора или при облучении видимым или УФ светом. Последовательные циклы фотосополимеризации с применением физической или проецируемой маски позволяют формировать ячейки малого размера и получать микрочипы высокой плотности. С помощью соответствующей экспериментальной установки были получены микрочипы с размером ячеек 10X10X5 мкм. Пробы на модельном микрочипе представлены набором олигонуклеотидов 5'-А11у1-XTGGAC (ON22-ON25) (X = TGA, ТСТ, GAC и ССС), тогда как флуоресцентно меченные олигонуклеотиды - набором 5'-GTCCAY (ON26-ON29) (Y = ТС A, AGA, GTC и GGG). Результаты гибридизации такого микрочипа представлены на рисунке ЗА. Флуоресцентный сигнал ассоциирован преимущественно с перфектными олигонуклеотидами на чипе. Разрешение перфект/мисматч может быть повышено при отмывке микрочипа гибридизационным буфером в оптимальном диапазоне температур. С другой стороны, существует возможность провести термическую денатурацию дуплексов

на микрочипе, что позволяет наблюдать различия между перфектным и мисматчевым дуплексами в широком интервале температур. На рисунке ЗВ показаны профили термической денатурации дуплексов (Ж25-ОГО9 и (Ж24-(Ж29.

При уменьшении размера ячеек скорость гибридизации существенно возрастает. На рисунке ЗС представлены сравнительные данные по скорости гибридизации для ячеек размером 10Х10X5 мкм и 100Х 100X5 мкм.

Иммобилизация аллильных производных олигонуклеотидов представляет собой самостоятельный подход к формированиию олигонуклеотидных гидрогелевых микрочипов и является прототипом технологии изготовления биочипов, используемой в настоящее время в Институте Молекулярной Биологии РАН.

1.5. Исследование стабильности и специфичности образования модифицированных дуплексов ДНК с использованием полной матрицы гексапуклеотидов

В этой главе представлено исследование специфичности образования и стабильности дуплексов, образованных модифицированными олигонуклеотидами и гексамерными иммобилизованными пробами. Мы использовали в олигонуклеотидный микрочип, содержащий все возможные гексануклеотиды (4096 проб). В качестве модификаций в исследуемых олигонуклеотидах были использованы 2'-0-метиладенозин (Ат), 2'-0-метилрибозид 2,6-диаминопурина (От), 2'-дезоксирибозид 2,6-диаминопурина (Б), 2'-0-метилцитидин (Ст) и 5-бромдезоксиуридин. Олигонуклеотидный микрочип, содержащий полный набор проб определенной длины, представляется чрезвычайно удобным инструментом при исследовании специфичности взаимодействии. Очевидно, что таким образом можно отследить все возможные мисматчевые дуплексы и провести их сравнение как между собой, так и с перфектным дуплексом. С применением синтетической платформы, рассмотренной выше, мы создали олигонуклеотидную матрицу всех возможных гексапуклеотидов и использовали ее при исследовании коротких модифицированных дуплексов. С учетом относительно низкой стабильности гексамерных дуплексов каждая проба на микрочипе была дополнена смесью четырех природных нуклеотидов с 5' и с 3' конца.

Иммобилизованные олигонуклеотиды

ON26 ON27 ON28 ON29

к <

и и н о

U и н с

Ü <

о и

о U

Temperature

Time, min

Рис.J. (А) Результаты гибридизации микрочипа с размером ячеек 10 X 10X5 мкм. (В) Профили плавления перфектного и мисматчевого дуплексов. (С) Кинетика гибридизации для ячеек различного размера.

Специфичность образования модифицированных дуплексов. Для всех замен дезоксиаденозина мы использовали одну и ту же последовательность 5'-ЛАОТААСА. Это дало возможность прямого сравнения влияния различных аналогов на специфичность связывания. Модифицированные основания были введены во вторую, пятую и шестую позиции октамера (таблица 2).

Сравнительный анализ гибридизации немодифицированного олигонуклеотида и олигомеров с Ат и Б модификацией цепи показал, что при низкой температуре (7°С), когда наблюдаются наиболее интенсивные гибридизационные сигналы, распределение флуоресценции по ячейкам наиболее узкое для Ат, а для О-замсщснных олигомеров наиболее широкое. Такое распределение обусловлено дискриминацией мисматчей, т.е. соотношением сигналов от перфектного и мисматчевого дуплексов при выбранной темпереатуре. Количественные данные по флуоресцентным сигналам, зарегистрированным при 7°С для дуплексов а(АХОТХХСЛ>с1(ЖУГТАСТМ) (X = (1А, Ат, Т>) и их стабильных мисматчей, представлены на рисунках 4А, 4В. Очевидное преимущество в дискриминации неперфектных дуплексов наблюдалось для всех модификаций А™. Чем выше степень модификации олигонуклеотида этим аналогом, тем лучше дискриминация. В случае Б-модифицированных олигонуклеотидов специфичность образования дуплексов была близкой к ^модифицированному контролю или хуже.

Таблица 2. Структура, стабильность и термодинамические данные для модифицированных и немодифицированнных олигонуклеотидов ОГОО-ОЖЗ.

Олиго Нуклеотидная последовательность -т» чип * гп (°С) гр росте ш ГС) АЯ (ккал моль'1)

огоо ААвТААСА 18.6 20.6 30.4; 31.4"

ОГО1 ААтОТААСА 18.7 - 32.9

ОШ2 ААт0ТАтАСд 15.0 13.1 33.7; 28.6"

ОГОЗ ААгаОТАтАтСА 14.5 - 35.8

ОШ4 АООТААСА 21.3 - 31.3

ОШ5 АОвТОАСА 26.4 27.2 32.9; 52.2"

ОШ6 АОтСТААСА 20.6 - 32.0

ОГО7 АО^ПУАСА 23.3 - 40.9

ОГО8 АСвАССТА 28.3 - 26.8

ОГО9 АСОАССтТА 28.4 - 31.3

ото АСтОАСп,С""ГЛ 27.3 - 43.4

АТвАТТСА 20.7 - 36.8

ОМ2 АВОАТТСА 20.4 - 35.9

ожз АВвАВТСА 21.5 - 37.0

"Данные по денатурации в растворе

с^ ,0° & хг & „с*> & л

□ ааотааса а аап,0тааса я аатотатаса | ■ аат0тататса 1

А* ^ А & <У <у

о ааотааса а аатвтааса и аа"отатаса ■ аап,стататса

0.6

I 0.4

а ааотааса а аовтааса ■ аротоаса

1 1

1 п А

1 и*

□ аастааса в аостааса ■ аостоаса

^ ^ .Р4 5? «Л & &

-о" л.*" ■о" а* а* ** ■о"

Рис. 4. Флуоресцентные сигналы дуплексов выбранных ячеек микрочипа. Гибридизация с А"'- (А) и О-модифицированными (В) олигонуклеотидами при 7°С. Гибридизация с Ат- (С) и О-модифицированными (й) олигонуклеотидами при температуре плавления соответствующего перфектного дуплекса, сигналы которого приняты за 1.

1.2 1

0.8 0.6 0.4 0.2 0

ЯП^п п ги. -

^ А7" ^ ^ Л*-'/У ^ ^ ^ ^ л- ¡V л л су о СУ О Ф

□ аастааса

■ аототааса

■ АБтОТОп,АСА

X Х> С» X .с. г> X ,-0 X X

асоасста

асоасс'та

астоастстТА

атоаттса авоаттса авоавтса

Рис. 5. Флуоресцентные сигналы дуплексов выбранных ячеек микрочипа. Гибридизация с Г)т- (А) и Ст - (В) и В-модифицированными олигонуклеотидами при температуре плавления соответствующего перфектного дуплекса,

Однако, данные полученные при определенной выбранной температуре не отражают истинной дискриминации, поскольку не принимается в рассчет эффект стабилизации или дестабилизации при модификации цепей. Для корректной оценки дискриминирующей способности мы получили кривые плавления для всех дуплексов на микрочипе. Анализ специфичности был проведен при температуре плавления соответствующего перфектного дуплекса. На рисунках 4С, 40 представлены данные по дискриминации мисматчей для тех же олигонуклеотидов, но полученные при температуре плавления соответствующего перфектного дуплекса. Видно, что дискриминация мисматчей для Ат- и для О-модифицированных олигонуклеотидов существенно увеличилась.

Аналоги Б"1 содержат модификацию как в сахарном остатке, так и в основании. Данные по дискриминации для Ош-замещенных олигонуклеотидов представлены на рисунке 5А. Эффект от введения этой модификации на специфичность образования дуплекса оказался более выраженным, чем для Аш и Б аналогов. Принимая во внимание заметный стабилизирующий эффект этого аналога можно считать его наиболее предпочтительной модификацией.

Модификация октамеров В и Ст аналогами не вызвала сколько нибудь выраженного эффекта на специфичность образования дуплексов по сравнению с немодифицированными олигонуклеотидами (рис. 5В и 5С)..

Стабильность дуплексов и термодинамические параметры. Профили денатурации модифицированных дуплексов, полученные с использованием полной матрицы гексануклеотидов, подтверждают стабилизирующий эффект 2,6-диаминопуриновых аналогов. Среднее значение ДТт для Б составило ~4°С. Заметную стабилизацию вызывает также аналог Влияние Ат сводится к незначительной дестабилизации, тогда как Сш и В аналоги практически не влияют на стабильность дуплексов.

Мы провели сравнение флуоресцентных кривых плавления трех выбранных дуплексов с данными, полученными из УФ профилей термической денатурации в растворе. Различие в стабильности дуплексов не превышало 2°С.

2. Исследования дуплексов ДНК, содержащих неприродные цепи

Среди факторов, определяющих устойчивость дуплексов ДНК, основными являются гидрофобные взаимодействия, водородное связывание, конформация сахарофосфата и ионные взаимодействия. Все многообразие модификаций олигонуклеотидов, как правило, сводится к изменению удельного вклада в структуру какого либо одного или нескольких из перечисленных факторов. В этой части работы рассмотрены модификации олигонуклеотидной цепи, изменяющие ее гидрофобные или ионные свойства.

Модификация цепей олигонуклеотидов проводилась с использованием нуклеозидов 5-нитроиндола и замещенного 4-нитроиндола, межнуклеотидной фенантридиниевой вставки, цвиттерионной межнуклеотидной связи и М1-метил дезоксиаденозина.

2,1, Стабилизация коротких ДНК дуплексов концевым нуклеотидом 5-нитроиндола

Наиболее удачным синтетическим аналогом нуклеозидов, содержащим универсальное основание, принято считать 2'-дезоксирибозид 5-нитроиндол. При введении в состав одной из цепей дуплекса 5-нитроиндол приводит лишь к незначительной дестабилизации, образуя при этом пары с природными основаниями с близкой эффективностью. Сходные характеристики были обнаружены также для 4-и 6-нитроиндолов. В настоящем разделе рассмотрен стабилизирующий эффект от включения 1-(2'-дезокси-/?-.0-рибофуранозил)-5-нитроиндола (5№) по 5' или по З'-конецу октамерного олигонуклеотида при различных сочетаниях прилежащего и спаренного с нитроиндолом нукпеотида.

Олигонуклеотидные модели. Целью настоящего исследования было изучение влияния природы соседних с 5>Л по цепи или противостоящих нуклеотидов комплементарной цепи на стабильность коротких ДНК дуплексов и изменение термодинамических параметров. Мы синтезировали набор октамерных олигонуклеотидов 5'-ХОАСССТС и 5'-ОАССОТСХ, где X - А, О, Т или С, и набор комплементарных им ундекануклеотидов 5'-ТОАСООТСУ2Т и З'-ТгУСЛСССТСТ, где У и Ъ - также какие-либо из природных нуклеотидов. Из этого набора олигонуклеотидов были составлены все возможные варианты дуплексов с различными сочетаниями X, У, Ъ. Помимо этого были получены модифицированные олигонуклеотиды, отличающиеся от октамеров наличием концевого 5№: 5'-(5Ы1)ХОАССОТС или У-САССОТСХЧЗМ). Комплементарные этим олигонуклеотидам олигомеры представлены набором ундекануклеотидов. Для анализа стабильности и рассчета термодинамических параметров были подобраны варианты дуплексов с различными сочетаниями X, У, Ъ и 5М. Таким образом, полученный набор моделей позволил провести сравнение характеристик немодифицированных и фланкированных 5№ либо по 5', либо по 3' концу дуплексов. Кроме того, была предусмотрена возможность проследить влияние различных сочетаний X, У и Z.

Анализ стабильности дуплексов и значений термодинамических параметров. На основании профилей термической денатурации были рассчитаны термодинамические параметры образования дуплексов. Как и следовало ожидать, присоединение 5№ к одному из концов олигонуклеотида стабилизирует дуплекс. Выяснилось, однако, что если

5№ находится на 5'-конце олигонуклеотида, имеет место более выраженная стабилизация. На рисунке 6 представлена зависимость разницы температур плавления модифицированных и не модифицированных дуплексов (ДТ^) от природы спаренного с 5№ основания и положения модификации. Видно, что добавление ¿N1 с 5' конца октануклеотида вызывает больший эффект стабилизации дуплексов (среднее значение Д7!п составляет 6.8°С) по сравнению с 3' модификацией (среднее значение ДГт - 2.7°С). Вариации по температурам плавления в зависимости от природы основания в немодифицированной цепи невелики и укладываются в диапазон, не превышающий 2.2°С как для 3', так и для 5' модификации 5141. Выступая в роли универсального основания, концевой 5М не отдает явного предпочтения ни одному из спаренных с ним природных нуклеотидов.

Рис. 6. Значения ДТт (°С) для разных вариантов спаренных с 5М оснований при модификации октануклеотидов по 3' концу (колонки серого цвета) или по 5' концу (колонки черного цвета).

Рис. 7. Значения ДТт (°С) для разных вариантов соседних с 5№ пар оснований при модификации октануклеотидов по 3' концу (колонки серого цвета) или по 5' концу (колонки черного цвета).

Для оценки влияния прилежащей пары оснований на стабилизирующий эффект 5NI в паре с аденином мы исследовали термическую денатурацию 32 коротких дуплексов ДНК. Сравнивая данные для перфектных пар природных оснований можно отметить значительный стабилизирующий эффект для модификации по 5' концу октануклеотида, в среднем ДГт=6.5°С, при минимуме отклонений от средней величины. Для 3' концевой модификации среднее значение ДТт составило 3°С и разброс значений оказался больше, что также можно проследить из рисунка 7. Для находящихся рядом с парой 5NI'A мисматчевых пар наблюдается снижение стабилизирующего эффекта и увеличение колебаний значений ДТт относительно средней величины. Для 5NI на 5' конце среднее значение АТт составило 4.8°С, тогда как для 3' конца — 1°С. Можно также отметить, что, как правило, эффект стабилизации уменьшается в случае соседства 5NI с пуринами. Так, для 5' концевой модификации наименее стабильными оказались дуплексы с G'G, A'G, G'A и Л*А мисматчевыми парами, соседними с 5NI. При рассматрении 3' концевой модификации, можно отметить дестабилизирующий эффект добавленного 5NI для соседних неперфектных пар A*A, G'A, T*G и G*G.

2.2. Олигодезоксннуклеотнды, содержащие замещенные 4-11итроиндолы: синтез и исследование в составе дуплексов ДНК

В данном разделе представлен синтез олигонуклеотидов, содержащих новые универсальные основания, 2-метил-4-нитроиндол и 2-фенил-4-нитроиндол, и исследовано поведение коротких дуплексов ДНК с одной модифицированной цепью.

Синтез фосфорамидитов нуклеозидов нитроиндопов и модифицированных олигонуклеотидов. Замещенные 4-нитроиндолы 2.12а и 2.12Ь были получены окислительной нуклеофильной конденсацией 3-нитроанилина с ацетоном или ацетофеноном в присутствии сильного основания. Синтез дезоксинуклеозидов 2-метил- и 2-фенил-4-нитроиндола (2.14а и 2.14Ь) был осуществлен путем алкилирования натриевых или калиевых солей гетероциклических оснований 3,5-ди-0-(л-толуил)-2-дезоксиЛ> рибофуранозил хлоридом. Алкилированием 2-метил-4-нитроиндола был синтезирован достаточно чистый нуклеозид с выходом 83%. Однако, при алкилировании 2-фенил-4-нитроиндола нам не удалось добиться выхода более 26%. После удаления толуильных групп метилатом натрия была введена 4,4'-диметокситритильная защита по 5' положению нуклеозидов. Последующий синтез фосфорамидитов нуклеозидов 2.16а и 2.16Ь был проведен с использованием 2-цианэтил-М,М,№,1Ч'-тетраизопропилфосфорамидита в присутствии тетразолида пиридиния (схема 5).

N0-

ОН

2.12

Ш, IV

Я - СН3 (а), РЬ (Ь)

СН:

2.16 н3с—( о

имто

N—Р

Н3С—(

сн,

¡.- 3,5-ди-0-(и-толуил)-2-дезокси-0-рибофуранозил хлорид, №Н (или ГВиОК);

и. - КОН/МеОН;

¡11- - 0МТС1/Ру;

¡V. -((¡Рг)2М)2-Р-ОСН2СН2СК, тетразол, Ру.

Схема 5. Получение фосфорамидитов нуклеозидов замещенных нитроиндолов.

Фосфорамидиты 2.16а и 2.16Ь были использованы для автоматического синтеза олигодезоксинуклеотидов 0.\'61 - ON68 (табл. 3). Последовательность оснований в олигонуклеотидах была выбрана таким образом, чтобы оценить влияние 4-нитроиндолов в паре с каждым из природных оснований на стабильность дуплексов по сравнению с немодифицированным дуплексом и с дуплексами, содержащими 5-нитроиндол. В качестве контрольных олигонуклеотидов были синтезированы ^модифицированные олигомеры ((>N73, (Ж74), а также олигонуклеотиды, содержащие 5-нитроиндол ((Ж69-

Исследованш стабильности модифицированных дуплексов. Денатурацию дуплексов проводили в растворе, содержащем 0.1М хлорид натрия и 0.01М фосфат натрия при рН 7. Рассчитанные значения температур плавления дуплексов (Тт) и энтальпии переходов (АН) приведены в табл. 3. Наименьший дестабилизирующий эффект модификации наблюдался для дуплексов, содержащих 5-нитроиндол. В этом случае средняя величина дестабилизации ДТт" составила 8.9°С. Близкие результаты были получены для 2-метил-4-нитроиндола Д Гтст = 9.9°С). Наибольшую дестабилизацию обнаружили модифицированные дуплексы с 2-фенил-4-нитроиндолом (Д = 12.ГС). Дискриминирующую способность универсальных оснований оценивали по диапазону

СШ72).

температур плавления для всех четырех природных оснований. Самый узкий диапазон значений показали дуплексы, содержащие 2-фенил-4-нитроиндол (ЛТтд = 5.3°С). Несколько большую избирательность проявили 2-метил-4-нитроиндол и 5-нитроиндол, ДГтд = 6.2 и 6.ГС соответственно. Таким образом, обладая более выраженным «универсальным» характером, 2-фенил-4-нитроиндол также в большей степени дестабилизирует дуплекс. Наблюдаемая обратная корреляция между стабильностью модифицированных универсальными основаниями дуплексов и дискриминирующей способностью гетероцикла наблюдалась и для другого универсального основания, 3-нитропиррола. Меньшая дискриминирующая способность 3-нитропиррола по сравнению с 5-нитроиндолом сочетается с более выраженным дестабилизирующим эффектом.

Таблица 3. Характеристики олигонуклеотидов (Ж61-(Ж74 и образуемых ими дуплексов.

м Последовательность МСа1с/Мехр тт °с АН, ккал/моль

(>N61 5' -АСГТСС(1а)СТСАССА 4289.8 / 4288.9 43.6 53

(Ж62 5' -АСГТССА(1а)ТСАССА 4313.8/4314.2 37.4 33

(Ш63 5' -АСТТССАС(1а)САССА 4298.9/4299.7 43.5 39

ON64 5' -АСТТССАСТ(1а)АССА 4273.8/4272.8 39.2 39

ОМ5 5' -АСТТСС(1Ь)СТСАССА 4351.9/4352.6 41.6 46

(Ж66 5' -АСТТССА(1Ь)ТСАССА 4375.9/4375.4 37.5 33

(Ш67 5' -АСТТССАС(1Ь)САССА 4360.9/4361.3 39.6 37

0№8 5' -АСТТССАСТ(1Ь)АССА 4335.9/4336.7 36.3 31

ON69 5' -АСТТССБШСТСАССА 4275.8/4275.9 41.1 37

ON70 5' -АСГТССАБОТТСАССА 4299.8 / 4300.2 38.9 45

ON71 5' -АСТТССАСБЫКАССА 4284.8/4285.9 45.0 42

(>N72 5' -АСТТССАСТ5М1АССА 4259.8/4261.3 42.7 38

ON73 5' -АСТТССАСТСАССА 4248.8/4249.3 50.8 73

СШ74 5' -ТССТСАСТССААСТ 4279.8 / 4280.5 _ _

2.3. Модификация цепей олигонуклеотидов интеркалирующей фенантридиниевой вставкой

В этой главе рассмотрен синтез фосфорамидита интеркалятора на основе фенантридина — метидия - и гибридизационные свойства олигонуклеотидов, модифицированных этим красителем.

Синтез интеркалирующей метидиевой вставки осуществлен в соответствии со схемой 6. С использованием полученного фосфорамидита был осуществлен автоматический синтез модифицированного олигонуклеотида б'-ССАТО-МйЬ-ССТЛТ

((>N73). Структура полученного олигонуклеотидного конъюгата с метидием была подтвержена масс-спектрометричееким анализом неочищенной синтетической смеси методом МАЬШ ТОР.

сн3

2.17

(СР3С0),0 в СР3СООН

но

Схема 6. Синтез фосфорамидита метидия (2.28). (¡) Ме2СО, СИСЬ, ТэОН, кипячение с азеотропной отгонкой воды; (ц) МэС1 в Ру; (ш) натриевая соль триэтиленгликоля; (¡у) \1sC1 в Ру; (v) ик3 в ДМФА, 130°С; (уО 80% СН3СООН; (ун) ОМТгС1 в Ру; (\<Ш) РИ3Р в Ру; (¡х) имидазольное производное 2.18 в Ру; (х) (¡Р^ЬГ^РОСРЬСНгСМ, тетразол, Ру в МеОГ/СН2С12.

Стабильность и свойства гетеродуплекса, содержащего одну модифицированную интеркалирующей вставкой цепь, были изучены с использованием олигонуклеотидных моделей 5'-ССАТС-МеШ-ОСТАТ (ON73), 5'-ССАТСОСТАТ (ON74) и 5'-АТАОССАТОО (ON75). В спектрах поглощения олигонуклеотида 0X73 и модифицированного дуплекса (Ж73*(Ж75 при температуре 20°С в наблюдаются полосы поглощения при 520 и 526 нм соответственно, характерные для красителя, взаимодействующего с цепями олигонуклеотидов. При температурах выше 70°С спектры (Ш73 и модифицированного дуплекса соответствуют поглощению несвязанного красителя (Хтах = 495 нм). Длинноволновый сдвиг в спектрах поглощения связанного метидия указывает на интеркаляцию красителя в соответствующий стэкинг-контакт.

Дополнительным свидетельством интеркаляции метидия является высокий квантовый выход флуоресценции этого красителя при взаимодействии с дуплексом — восьмикратное увеличение при интеркаляции близко к десятикратному увеличению этого параметра для бромистого этидия. Следует отметить также, что изотермы связывания метидия (в виде амида) и этидия с немодифицированным дуплексом практически совпадают. Число мест связывания для обоих красителей также совпадает -одно на три пары оснований. Все эти данные однозначно указывают на один и тот же тип взаимодействия красителей с дуплексом - интеркаляцию.

Исследование стабильности модифицированного дуплекса методом термической денатурации в 0.1 М ЫаС1 при рН 7 показало заметный прирост температуры плавления (ДГт = 8.1°С) после введения модификации. Анализ профилей денатурации в рамках модели двух состояний показал, что стабилизация модифицированного дуплекса обусловлена энтропийной составляющей (ДДН - 10.6 ккал/моль, ДД51 = 36.4 ккал/(моль-К)).

Расчеты молекулярной механики модифицированного дуплекса позволили оценить особенности взаимодействия интеркалирующей вставки с цепями дуплекса и сделать два основных вывода: 1) интеркаляция метидия осуществляется в тот же стэкинг-контакт, в который введена интеркалирующая вставка; 2) вхождение красителя в стэкинг-контакт осуществляется со стороны главного желоба.

2.4. Олигонуклеотиды с удлиненной цвиттерионной межнуклеотидной связью

Введение цвиттерионных фрагментов (рис. 8) в олигонуклеотиды было проведено с использованием фосфорамидитов модифицированных нуклеозидов 2.22 (сИ1*™8) и 2.27 (сП™). При конструировании этих модифицированных нуклеозидов учитывалась

возможность электростатического взаимодействия между протонированной 5' аминогруппой нуклеозида и примыкающей фосфодиэфирной группой. Оптимизация геометрии цвиттерионной структуры позволила определить оптимальную длину линкера между аминогруппой и гидроксильной группой. Модифицированный фрагмент не искажает геометрию В-формы ДНК и формирует шестичленную квазициклическую систему в конформации кресла. В силу возможных инверсий конфигурации протонированного азота, предполагается некоторая гибкость гидроксиэтильной цепи. Рассчетные неэлектростатические составляющие потенциальной энергии структуры мало отличаются от немодифицированного дуплекса, что свидетельствует о незначительных отклонениях конформации цепи при модификации. С другой стороны, значительный вклад электростатической составляющей приводит к заметному понижению суммарного значения потенциальной энергии структуры.

Синтез защищенного нуклеозида 2.31 был выполнен в 3 стадии без использования временной защиты 3' гироксильной группы тимидина (схема 7). После замещения п-толуолсульфоната тимидина Л'-метил-этаноламипом, Л-(2-гидроксиэтил)-Л-метил-2',5'-дидезокси-5'-аминотимидин был очищен от избытка амина с использованием Бо\уех-50.

Альтернативная синтетическая схема с использованием временной защиты 3' гироксильной группы была задействована при синтезе Аг-(2-гидроксиэтил)-2',5'-дидезокси-5'-аминотимидина. По 3' положению нуклеозида была введена гидрофобная трет-бутилдиметилсилильная группа, что заметно облегчило хроматографическую очистку производных нуклеозида 2.33.

Рис. 8. Цвиттерионная межнуклеотидная связь.

Фосфорамидиты защищенных нуклеозидных аналогов бьши получены in situ и использованиы без выделения для синтеза олигонуклеотидов ON76-ON83 (табл. 4). Протонирование по аминогруппам модифицированных нуклеотидов приводит к появлению цвиттер-ионной структуры и вызывает изменение общего заряда цепи. Этот эффект был зафиксирован в неденатурирующем гель-электрофорезе в сшитом полиакрил амиде.

Схема 7. Синтез нуклеозидов 2.31 и 2.36. (i) N-метил-этаноламин в ДМФ, 100°С, 2 ч.; (и) DMTrCl в Ру; (iii) /BDMSC1, Iт, Ру; (iv) этаноламин в ДМФ, 100°С, 2 ч.; (v) трифторуксусный ангидрид, диметиламинопиридин в ацетонитриле, -10°С; (vi) DMTrCl в Ру; (vii) 1 М TBAF в ТГФ.

Таблица 4. Нуклеотидный состав олигомеров ON76-ON82 и данные MALDI спектров.

т Последовательность M«XP (Мыс)

ON76 5'-d(T),

ON77 5'-d(TTTTTNHTTTT) 2718(2721)

ON78 5'-d(mTTNMTnT) 2734 (2735)

ON79 5'd (TTK1 rTTKI 'TTNr 'TTNi 'T) 2852(2850)

ON80 5 ,-d(TTNM,>rTNM'>rTNMeTTNMeT) 2910(2906)

ON81 5'-d(GATATCTTC)

ON82 5'-d(GATATNMeCTTC) 2751(2747)

ON83 5'-d(GATNMcATNMeCTNMeTC) 2867(2861)

Физико-химические исследования модифицированных дуплексов проводились с методами термической денатурации в растворе и КД-спектроскопии. В качестве комплементарных цепей были использованы олигодезоксинуклеотиды А10 (СЖ84) и 5'-ОААОАТАТС (ОЛ'85). Стабильность дуплекса с однократной модификацией оказалась заметно ниже стабильности контрольного немодифицированного дуплекса (АТт ~ 10°С). Столь резкое расхождение расчетных данных и эксперимента можно объяснить конформационной гибкостью модифицированного фрагмента. Спектры КД контрольного дуплекса (Ж76*(Ж84 и модифицированных дуплексов (Ж84-(Ж77 и (Ж85»(Ж78 подтверждают результаты расчетов в отношении структурных характеристик дуплексов. Известно, что В-форма ро1у(<1А)»ро1у(с1Т) отличается двумя характеристичными полосами в области 260-280 нм. При низких температурах (0°С) спектры гибридного дуплекса ОЭТ7»(Ж84 и контроля (Ж76*ОШ4 практически не отличаются. Это свидетельствует в пользу В-формы модифицированного дуплекса.

2.5. Олигонуклеотиды, содержащие 2'-дезоксн->П-метнладенозш1.

Несмотря на заметный интерес к этой модификации, в литературе нет синтетических или биофизических работ с использованием этого дезоксинуклеозида в олигонуклеотидных моделях. В данном разделе рассмотрен синтез и гибридизационные свойства коротких синтетических шпилек ДНК, содержащих 2'-дезокси-Ж-метиладенозин (ш'(1А).

Синтез защищенного фосфорамидита 2'-дезокси-Ы1-метиладенозина и модифицированных олигонуклеотидов. Синтез защищенного фосфорамидита 2.40 представлен на схеме 8. Стадия метилирования 2'-дезоксиаденозина была проведена после предварительной защиты 5' гидроксильной группы монометокситритильным фрагментом. Алкилирование защищенного дезоксиаденозина проводилось в диметилацетамиде с помощью иодистого метила и позволило получить соединение 2.38 с выходом 72%.

Замена традиционной в олигонуклеотидном синтезе диметокситритильной группы монометокситритильной в модифицированном нуклеозиде позволила повысить стабильность 5' защитной группы в соли 2.38. Такая замена не влияет на эффективность детритилирования в ходе олигонуклеотидного синтеза.

он он

2.38

„сн3

I J

m-iv

ммтю

cnel

Схема 8. Синтез фосфорамидита m'dA. (i) MMTrCl в Ру; (ii) Mel; (iii) (C1CH2C0)20 в Ру, NH3 в МеОН; (iv) (iPr2N)2P(OCH2CH2CN), тетразол.

Введение модифицированных нуклеотидов в олигомеры в ходе автоматического олигонуклеотидного синтеза не потребовало изменения стандартного протокола. Ранее было показано, что отщепление модифицированных Nl-метиладенозином олигонуклеотидов от подложки и дальнейшее деблокирование может быть осуществлено в метанольном аммиаке при комнатной температуре за 60 часов без риска перегруппировки Димрота. Следуя той же процедуре, мы провели обработку олигонуклеотидов, содержащих m'dA (табл. 5) В отдельных экспериментах было показано, что использование в синтезе фосфорамидитов с лабильными защитными группами (dAPAC и dG'Pr"PAC) позволяет сократить время обработки до 2 часов при комнатной температуре.

Подтверждение модификации цепей было получено из данных MALDI масс-спектрометрин. Убедительные доказательства включения m'dA в синтезированные олигонуклеотиды и отсутствия перегруппировки были получены из ВЭЖХ анализа смеси нуклеозидов, образующихся при ферментативном гидролизе олигомеров фосфодиэстеразой змеиного яда и фосфатазой. Мы провели проверку совместимости стандартного протокола деблокирования олигонуклеотидов с выбранной модификацией. Обработка m'dA-модифицированных олигонуклеотидов концентрированным водным аммиаком при 55°С в течение 10 часов привела к 80% конверсии m'dA m6dA. При увеличении времени обработки до 16 ч перегруппировка Димрота проходила практически количественно. Ферментативный гидролиз обработанного таким образом олигонуклеотида приводил к образованию четырех природных нуклеозидов и m6dA. Надо отметить, что перегруппировка на уровне олигомеров не сопровождается какой либо

деградацией цепи. Это обстоятельство позволяет использовать фосфорамидит 2.40 для синтеза как шМЛ-, так и ш6с1Л-модифицированных олигонукпеотидов.

Гибридизационные свойства модифицированных шпилек. Мы исследовали термическую денатурацию коротких олигонуклеотидных шпилек, содержащих т'с1А (табл. 5). В силу неспособности т'<1А к образованию Уотсон-Криковских пар введение этого нуклеотида в олигомер способствует формированию неспаренных одноцепочечных участков. При введении модификации в петлевой фрагмент шпильки можно ожидать некоторой стабилизации внутримолекулярного дуплекса. Как видно из данных таблицы, значения Тт для модифицированных шпилек выше по сравнению с природным контролем. Как и ожидалось, введение модификации в область стебля вызывает резкую дестабилизацию ((>N90). Увеличение размера петли или введение дополнительной модификации в петлю также негативно сказывается на стабильности шпильки (Д7"га -4.5 и -7.6°С соответственно).

Таблица 5. Олигонуклеотидные шпильки (Ж86-(Ж92.

О ш# Нуклеотидный состав* Mc.lt МоЬзеп'«! Т °С

(Ж86 5'-ООАССТААТАОТСС 4287.8 4285.8 53.3

ОШ7 5'-ООАСОТААТАСТСС 4302.8 4301.2 53.8

(Ж88 5 '-О О АСОТ АЛТЛОТСС 4302.8 4303.7 55.6

0№89 5'-аОАСОТЛАТАСТСС 4302.8 4300.4 56.9

(Ж90 5'-ООЛСОТААТАОТСС 4302.8 4302.2 п/<1

(Ж91 5'-ООАСОТАААТАОТСС 4613.8 4612.8 48.5

(Ж92 5'-ООАССТААААТАОТСС 4944.2 4941.2 45.7

* Остатки т'с1А выделены жирным шрифтом

3. Исследования триплексов ДНК

Триплексы ДНК являются объектом исследований уже в течение длительного времени, что обусловлено, по крайней мере, двумя причинами. Во-первых, триплекс-формирующие олигонукпеотиды (ТФО) являются доступными синтетическими сиквенс-

специфичными агентами, которые могут быть использованы для контроля экспрессии генов, индуцированной рекомбинации или мутагенеза. Во-вторых, некоторые типы трехцепочечных комплексов играют важную роль в биологических процессах, таких как рекомбинация. В этой части диссертации рассмотрены подходы к построению третьей цепи с использованием неприродных аномеров нуклеозидов, а также рассмотрены

свойства различных типов триплексов, исследованных на внутримолекулярных синтетических конструкциях одного и того же типа.

3.1. Исследования химерных а,р-триплексов

3.1.1. Структурный полиморфизм а,Р-олигоцитндилатов

В конце 90-х годов была предложена новая синтетическая модель триплексов ДНК, которые могут быть построены на произвольной нуклеотидной последовательности. В рамках этого подхода мы исследовали связывание химерных а,р-олигоцитидилатов с АТ-содержащими дуплексами ДНК.

В работе были исследованы химерные ос,р-олигоцитидилаты, которые предположительно могут распознавать АТ-дуплексы ДНК смешанного нуклеотидного состава. Шестичленная гетероциклицеская система цитозина представляется наиболее предпочтительной с точки зрения водородного связывания и положения гликозидных связей (рис. 9).

Рис. 9. Схема АТСР и TAC" триплетов.

В исследованиях термической денатурации, кругового дихроизма и поляризации флуоресценции интеркалированного бромистого этидия мы использовали олигонуклеотидные модели, представленные в таблице 6.

Таблица 6. Олигонуклеотидные модели ON93-ON1QO.

Название Нуклеотидная последовательность3

ON93 5 ' - СССС ССССС С - Lb - АТАТ АТ АТАТ - L-АТ АТ АТ АТ АТ ■ -3'

ON94 5' -CCCCCCCCCC-L-AAAAAAAAAA-L-TTTTTTTTTT- 3'

ON95 5 ' -CCCCCCCCCC-L-ATATATATAT-L-ATATATATAT- 3'

ON96 5 ' -СССССССССС-31

ON97 5 ' -СССССССССС-3'

ON98 5 ' -TTATTTTAATTATTTTTATAAATTTTATTT-TMRc-3 1

ON99 5' -АААТААААТТТАТАААААТААТТААААТАА-3'

ONIOO 5' -сссссссссссссссссссссссссссссс-з1

"С - а-дезоксицитидин; bL = триэтиленгликольный линкер; CTMR - тетраметилродамин.

Исследования термической денатурации трех олигонуклеотидных моделей- ON93, ON94 и ON95 - однозначно указывают на образование межмолекулярных структур и не подтверждают модель триплекса с олигоцитидиловой третьей цепью. Определение времени вращательной релаксации олигонуклеотида ON94 дало основания предположить, что раствор не является гомогенным и содержит как moho-, так и бимолекулярные структуры. Оценочная доля бимолекулярных структур составила 0.6±0.1. Дополнительные исследования термической денатурации подтвердили предположение об образовании низкотемпературных самоассоциатов олигоцитидилатов.

Таблица 7. Значения Тт (°С)а для низко- и высокотемпературных комплексов, образующихся при нейтральных значениях рН.

Назв. Низкотемпературный переход Высокотемпературный переход

0.1 М Na* 0.5 М Na*" lMNa+ 0.1 MNa+ 0.5 M Na+ 1M Na+ 30 mM Mg"

ON93 17.3 20.9 22.5 46.8 54.8 57.8 51.6

ON94 14.9 19.4 52.9 64.4 67.1

ON95 19.2 57.7

ON96 22.6; 26.5b

ON97 16.9

"Значения Гт определялись как точка полуперехода (АГ„ = ±0.5°С). ьГт при концентрации цепей 10 цМ.

Плавление цепей с1(С)ю и <1(СаСр)5 не является равновесным: кривые отжига и денатурации не совпадают. Подобное поведение было отмечено для /-ДНК и связано с замедленной скоростью формирования и диссоциации /'-мотива. Инвертированный профиль плавления олигомера (Ж96 при 295 нм представляет дополнительное доказательство образования полупротонированного комплекса на основе химерной а,Р-олигоцитидиловой цепи.

Дополнительные данные о низкотемпературных комплексах с СС+ парами оснований были получены из анализа спектров КД олигонуклеотида ОШЗ. Две полосы, высокоспецифичные для протонированных СС+ пар оснований (при 265 и 289 нм), были обнаружены для этого олигомера в 0.25М ИаС1 в диапазоне 4.5-6.9. Увеличение рН до 8 приводит к депротонированию цитозинов и исчезновению соответствующих полос в спектрах.

Несмотря на выраженную склонность химерных а,р-олигоцитидилатов к самоассоциации при низких температурах, нам удалось зафиксировать межмолекулярный триплекс в экспериментах по неденатурирующему гель-электрофорезу в присутствии 50 шМ Г^СЬ при рН 7.0. Образование триплекса наблюдалось при присоединении химерной

а,р-цепи 014100 к дуплексу 0Ш8'0№99 (рис. 10). Полное связывание дуплекса наблюдалось при 15°С и использовании 5-кратного избытка третьей цепи.

Рис. 10. Неденатурирующий гель-электрофорез олигонуклеотида (Ж98 (дорожки 1 и 7, полоса А) и дуплекса (Ж98'(Ж99 (дорожка 2, полоса В) в присутствии возрастающих количеств химерного олигомера СЖ100 (дорожки 3-6, соответственно 1-, 3-, 5- и 10-кратное количество ОМОО, триплекс — полоса С).

3.1.2. Связывание неприродных а,Р-олигоцитидилатов с дуплексами ДНК

Более детальное исследования связывания коротких АТ-содержащих синтетических дуплексов ДНК с химерными олигоцитидилатами было выполнено на моделях, представленных в табл. 8, а также с использованием олигомеров (Ж98, (Ж99, и ОШОО.

Таблица 8. Олигонуклеотидные модели ОШИ-ОМОб.

Олиго Нуклеотидная последовательность3

ош.01 5 ' -сЗ (Т) зо-ТМКь-3 '

от 02 5 ' -сЦАЬо-З'

от оз 5 ' -сПОзо-З'

от 04 5 1 -с! (АТ) 16-ТМК-3 '

от об 5 1 -а ссс) 15-з'

от об 5 ' - СССССССССССССССССССССССССССССС-З'

аС - а-дезоксицитидин, С-2'ОМе-С; ЬТМЯ- тетраметилродамин.

По данным неденатурирующего гель-электрофореза при 15 °С образование триплекса (Ж98*{Ж99'01Ч100 сопровождалось формированием самоассоциатов химерных олигоцитидилатов избыточной третьей цепью. Понижение температуры до 3°С, как и ожидалось, способствовало повышению стабильности комплекса (Ш98'СШ99,(Ж100, который можно было наблюдать при добавлении лишь 3-кратного избытка олигоцитидилата. Образования триплексов с регулярной или альтернирующей

последовательностью из олигонуклеотидов 014101, ON102, ОШОЗ и ON104, ON105 не наблюдалось даже при использовании 20-кратного избытка третьей цепи. Либо структурные особенности регулярного и альтернирующего дуплексов, либо специфические требования при образовании предполагаемого триплекса препятствуют его формированию. В то же время, для этих моделей характерно образование самоассоциатов ро1у-с!С при нейтральных значениях рН.

Для оценки роли конкуренции между процессами образования триплекса и самоассоциатов ро!у-сЮ мы исследовали поведение полностью модифицированного олигоцитидилата 014106 в отношении дуплекса 0Ш8«0№9. Ожидалось, что предполагаемое подавление самоассоциации за счет модификации природных цитидинов по 2'-положению сахарного остатка может способствовать более эффективному связыванию олигоцитидилата с дуплексом. Однако, эффективность образования комплекса оказалась ниже по сравнению с 014100. Для полного связывания дуплекса потребовалось увеличить избыток третьей цепи до 10-кратного. Весьма интересным оказался тот факт, что введение модификаций не препятствовало формированию самоассоциатов ро1у-с!С.

Повышение рН до 8 привело к подавлению самоассоциатов ро1у-с1С. Однако, образование межмолекулярного комплекса ОМ98'ООТ9'О.МЮО также оказалось подавленным. Это обстоятельство однозначно указывает на возможность взаимодействия с ДНК дуплексом протонированной ро1у-с1С цепи. В этом случае может быть реализована схема водородного связывания третьей цепи с пуринами дуплекса в предполагаемом трехцепочечном комплексе, аналогичная той, что наблюдается в антипараллельных триплексах с О и Т основаниями в третьей цепи.

3.1.3. Распознавание инвертированных ТА пар дуплекса а-тимидином

Принимая во внимание возможность реализации другой схемы водородного связывания в химерных триплексах (рис. 11), мы изучили возможность распознавания инвертированных ТА пар дуплекса а-тимидином.

Образование химерных триплексов было изучено на 15-нуклеотидных моделях (табл. 9) с помощью неденатурирующего гель-электрофореза при рН 7.8 и температуре 10°С, а также методом термической денатурации в растворе.

А В С

Рис. 11. Схемы триплетов оснований: АТС (А), АТС+ (В), АТТ в антипараллельном триплексе с G и Т в третьей цепи (С).

Таблица 9. Олигонуклеотидные модели ОМ07-(Ж126*.

Нуклеотидная

Олиго

последовательность_

5'-ААА-ААС-САС-АСС-САС 5'-СТС-ССТ-СТС-СТТ-ТТТ 5'-СТС-ССТ-СТС-СТТ-ТТТ 5'-САС-ССА-САС-САА-ААА

5'-ААА-ААС-САС-ТСС-САС 5'-ААА-АТС-САС-АСС-САС 5 1 -ААА-ААС-СТС-ТСС-СТС 5 >-ТТТ-ТТС-САС-АСС-САС

51-СТС-ССА-СТС-СТТ-ТТТ 5'-СТС-ССТ-СТС-САТ-ТТТ 5'-САС-ССА-САС-СТТ-ТТТ 51-СТС-ССТ-СТС-САА-ААА

5'-СТС-ССТ-СТС-СТТ-ТТТ 5'-СТС-ССТ-СТС-СТТ-ТТТ 5'-СТС-ССТ-СТС-СТТ-ТТТ ОЫ122 5' -СТС-ССТ-СТС-СТТ-ТТТ-С

ОШ23 5'-САС-ССТ-САС-САА-ААА

©N124 5' -САС-ССА-САС-СТА-ААА

(Ж125 5'-СТС-ССТ-СТС-САА-ААА

<Ж126_5' -САС-ССА-САё-СТТ-ТТТ-С

*Нсприродные а-тимидины выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.

ON107 ON108 ON109 ONHO

ON111 ON112 ON113 ON114

ON115 ON116 ON117 ON118

ON119 ON120 ON121

Как и ожидалось, неинвертированные дуплексы образовывали триплексы с Ав- и Тв-содержащими ТФО 0»109 и ON110. Избыток третьей цепи 014110 проявлялся в геле в виде параллельного дуплекса, с подвижностью ненамного превышающей подвижность Уотсон-Криковского дуплекса. ДНК дуплекс ONlll'ON115 с однократной инверсией

образовывал трехцепочечный комплекс с химерным олигонуклеотидом 014119, однако не связывался с вА-содержащим ТФО ОШ23. При другом расположении инвертированной пары оснований в дуплексе ОШ12'ОМ16 оба химерных олигонуклеотида - СТ-содержащий ON120 и вА-содержащий 0X124 - оказались способными к образованию триплексов. Три изолированные инверсии пар оснований дуплекса 01Ч113*0ГШ7 не позволяют сформировать устойчивый химерный триплекс. Нам не удалось зафиксировать связывание олигонуклеотидов 014121 или 014125 с этим ДНК дуплексом. Шесть структурных переходов (три а-»р и три р-их) должно заметно ослабить стэкинг взаимодействия в гипотетическом триплексе. Наконец, пять сопряженных АТ/ТА инверсий в дуплексе 0Ш14'01Ч118 удалось распознать с помощью химерных олигонуклеотидов ОМ22 и ОМ26. В этом случае структурные изменения оказались минимальными с единственным а->р переходом в трехцепочечном комплексе. Полученный триплекс сходен по строению с известной моделью чередующихся цепей, в которой третья олигонуклеотидная цепь построена из двух блоков различной полярности. Образование параллельной ДНК не препятствовало формированию химерных триплексов с вА мотивом. Параллельные вА-дуплексы проявлялись как результат самоассоциации избыточного количества третьей цепи.

Для оценки стабильности немодифицированных и химерных триплексов мы исследовали денатурацию этих комплексов в 0.1 М Трис-боратном буфере в присутствии 0.03 М М§С12 (Табл. 10). Характер денатурации всех исследованных комплексов соответствует типичному профилю плавления триплекса ДНК с двухфазным переходом. С учетом данных элетрофореза, мы соотнесли низкотемпературные переходы на полученных кривых во всех случаях с плавлением триплекса, а не параллельной ДНК.

Немодифицированные олигонуклеотиды образовывали наиболее стабильные трехцепочечные структуры. Введение однократной инверсии в дуплекс существенно снижает стабильность триплексов как для вТ, так и для ОА мотива. Величина АТт составила более 15°С. Триплексы с пятью сопряженными инверсиями оказались наиболее стабильными из модифицированных структур. Стабильность химерных триплексов коррелирует с количеством а/р переходов в третьей цепи. Различие в стабильности между вТ и ОА мотивами химерных триплексов было минимальным для моделей с однократной инверсией с разницей в температурах плавления 1.5°С, тогда как немодифицированные триплексы и химеры с пятью инверсиями показали большее различие с предпочтительной стабилизацией вА мотива. Данные по стабильности подтверждают предположение о том, что аномерные переходы нарушают стэкинг и вызывают искажения в регулярной структуре триплекса.

В этом контексте решение проблемы стабилизации химерных триплексов может заключаться в дополнительной модификации природных или неприродных а-нукпеотидов каким либо фрагментом, способным заполнить образующиеся «провалы» в стэкинге.

Таблица 10. Стабильность немодифицированных и химерных триплексов.

Триплекс трипл у Oq дуплу oq

ON107-ON108-ON109 30.5 54.7

ON107'ON108-ONHO 34.2 55.6

ON112-ON116-ON120 11.9 56.1

ON112»ON116*ON124 10.4 55.6

ON114-ON118-ON122 13.7 55.1

ON114*ON118,ON126 15.6 55.2

* ± 0.5°С.

3.2. Исследования внутримолекулярных моделей триплексов с гидрофильным межцепным линкером

Большая часть данных по структуре, стабильности и специфичности образования триплексов различных типов получена на олигонуклеотидных моделях. Во многих случаях использование внутримолекулярных моделей является предпочтительным, т.к. позволяет повысить стабильность комплексов, а также заметно упрощает термодинамический анализ. Наиболее корректными являются модели, представляющие собой олигонуклеотидные блоки, соединенные между собой оксиалкильной цепью. Такие гидрофильные ненуклеотидные петли в минимальной степени возмущают стуктуру и энергию стебля. В настоящем исследовании впервые использован гидрофильный триэтиленгликольный линкер при построении внутримолекулярных моделей триплексов.

3.2.1. Исследование антипараллельного триплекса с АТТ триплетами оснований

Нами впервые была исследована внутримолекулярная олигонуклеотидная модель триплекса 3'-(dA)10-pO(CH2CH2O)3p-(dT)10-pO(CH2CH2O)3p-(dT)10-5' (ON127). Для сравнения были изучены также олигонуклеотиды 3'-(dA)10-pO(CH2CH2O)3p-(dT)10-5' (ON128) и 3'-(dA)1„-pO(CH2CH2O)3p-(dT)10-3' (ON129), которые могут существовать в виде двухцепочечных шпилек с параллельной и антипараллельной ориентацией цепей.

Основываясь на экспериментально измеренных профилях тепловой денатурации мы рассчитали термодинамические параметры переходов. Данные термодинамического

анализа показали, что энтальпийные стабилизирующие взаимодействия (энергия водородных связей, стэкинг-взаимодействия, электростатические взаимодействия) приблизительно одинаковы в уотсон-криковском дуплексе и хугстиновском дуплексе в составе триплекса. Если судить по величинам Тт, ионы магния в концентрации 0.01 М стабилизируют спиральные структуры приблизительно также, как и 0.5 М Na+. Ионы Mg2+ усиливают энтальпийные взаимодействия, вероятно, за счет образования специфических стабильных комплексов с двух- и, особенно, трехцепочечными спиралями. Термодинамические параметры образования триплекса с АТТ триплетами оснований при различных концентрациях Na+ представлены нами впервые.

Наличие положительного экстремума при 260 нм в спектре КД триплекса указывает на то, что основные черты конформации дуплекса сохраняются и в трехцепочечной структуре. Исходя из этого факта следует предположить, что в триплексе по крайней мере уотсон-криковский дуплекс имеет В-подобную конформацию.

Показано, что бромистый этидий интерклирует в тройную спираль олигонуклеотида ON127 и флуоресцирует с высоким квантовым выходом, совпадающим с (¡Гднк- Анализ кривых связывания EtBr с ON127 позволил оценить максимальное число мест связывания EtBr на триплексе, которое соответствует трем триплетам оснований на одну молекулу красителя.

3.2.2. Исследование триплекса рекомбинантного типа (R-форма ДНК)

Триплексы рекомбинантного типа резко отличаются от триплексов классического типа, поскольку в R-ДНК в каждой цепи присутствует полный набор нуклеиновых оснований и третья цепь ориентирована параллельно гомологичной цепи дуплекса.

Рис. 12. Топология сворачивания параллельного Л-триплекса. Третья цепь выделена наклонным шрифтом для каждого из конформеров.

В настоящей работе мы исследовали свойства параллельного триплекса из олигонуклеотида 5'-с1(САТ0СТААСТ)-р0(СН2СН20)зр-а(А0ТТАССАТ0)-р0(СН2СН20)3р-<1(САТ0СТААСТ)-3' (ОГШО). Существует два способа укладки

сегментов ОШЗО в триплекс - А (в главную бороздку уотсон-криковского дуплекса укладывается З'-сегмент) и В (в главную бороздку уотсон-криковского дуплекса укладывается 5'-сегмент), рис. 12. Полученные нами результаты однозначно указывают на то, что при низких температурах и рН 7 ON130 образует относительно стабильный триплекс (Гга находится в пределах от 26 до 34°С в зависимости от условий) с параллельно ориентированными идентичными цепями, причем конформер А превалирует в равновесной смеси.

Кривые плавления 0N13Ü в 0.01 М фосфатном буфере, рН 7.0, при концентрации NaCl 0.25 и 1.0 М, а также в присутствии либо двухвалентных ионов (0.01 М Mg2+ или Мп2+), либо 0.1 М спермидина обладают ярко выраженным двухфазным характером и свидетельствуют об образовании в области низких температур многоцепочечных комплексов. Как moho-, так и двухвалентные катионы увеличивают стабильность триплексов. Ионы натрия не оказывают влияния на кооперативность первого перехода, тогда как двухвалентные катионы и, в еще большей степени, спермидин делают низкотемпературный переход более кооперативным. Мы рассчитали кажущиеся значения АН0 и AS° из кривой плавления триплекса ON127 в присутствии спермидина. Для низкотемпературного перехода АН°=32.2±4 ккал/моль, AS0 =104.6±12 кал/моль-К, а для высокотемпературного перехода АЯР=49.9±4 ккал/моль, AS0 =141.6±6 кал/моль-К. Судя по формальным термодинамическим параметрам образования триплекса, его стабильность ниже стабильности триплексов классического типа.

Таблица 11. Стабильность R-триплекса.

Условия Тт (°С)*

плавление триплекса плавление дуплекса

Фосфатный буфер 24.5 61.8

0.25 М ИаС1 26.9 11.Ъ

1.0МКаС1 30.7 82.8

0.01ММеС12 30.8 67.9

0.01ММпС12 30.7 67.5

0.1 М спермидин 36.6 69.3 "Ошибка не превышает ±0.5СС.

Реакция модификации тиминов 0з04 и ферментативное расщепление 81 нуклеазой, выполненное при 0-3°С, свидетельствует об образовании внутримолекулярного трехцепочечного комплекса с экранированными пиримидиновыми основаниями и не

содержащего одноцепочных участков. Однако, З'-концевой сегмент олигонуклеотида защищен в меньшей степени по сравнению с двумя другими. Это дает основание полагать, что образование триплекса из олигонуклеотида ОШЗО протекает преимущественно по схеме А. Обнаружено, что пиримидины легче подвергаются выщеплению, чем пурины, а цитидины легче, чем тимины.

Определение гидродинамического объема и времени вращательной корреляции ОШЗО также однозначно указывает на существование триплекса.

Оптимизация геометрии структуры позволила предложить схемы водородного связывания для всех четырех триплетов оснований. Следует отметить относительную изоморфность триплетов. Экспериментально наблюдаемая стабильность триплетов описывается следующим рядом: 0:С-0 = А:Т-А » Т:А-Т > СЮ-С.

3.2.3. Стабилизация рекомбинантного триплекса йодистым пропидием

С использованием той же синтетической модели, которая позволила зафиксировать образование внутримолекулярного рекомбинантного триплеса в отсутствие белка ЯесА, мы изучили взаимодействие иодистого пропидия с параллельным Л-триплексом. В данном разделе рассмотрено взаимодействие пропидия с параллельным триплексом ОШЗО, а также с антипараллельным триплексом из олигонуклеотида 5'-(с1А)1о-р0(СН2СН20)зр-(с1Т)11Гр0(СН2СН20)зр-(с1Т)|„-3' (ОШ31) и ДНК дуплексом.

Показано, что фенантридиновая система пропидия интеркалирует между соседними триплетами триплекса ОШЗО. Связывание пропидия с ОШЗО является антикооперативным, так же как и в случае ДНК. По максимальному числу мест связывания красителя параллельный триплекс заметно отличается от ДНК и антипараллельного триплекса. В ОШЗО пропидий интеркалирует в в каждый второй стэкинг-контакт.

Результаты экспериментов по термической денатурации ОШЗО с различным числом связанных молекул пропидия свидетельствуют о заметной стабилизации триплекса. Связывание первой молекулы пропидия приводит к существенной стабилизации триплекса (ДГт=13.6°С). При связывании второй молекулы красителя этот эффект становится менее выраженным ((ДГт=6.5°С). Связывание третьей и четвертой молекулы пропидия практически не меняет стабильность параллельного триплекса.

Конформационные рассчеты комплексов параллельного триплекса с пропидием позволили определить предпочтительный тип связывания иодистого пропидия с Я-триплексом.

3.2.4. Исследование пуриновых параллельных трнплексов

В настоящем разделе представлено исследование параллельного триплекса с АО-третьей цепью. Возможность образования такого комплекса была впервые продемонстрирована нами с использованием внутримолекулярных моделей с межцепными гидрофильными линкерами. Мы исследовали две олигонуклеотидные модели: 5'-с1(СТ)5-Ь-<1(АО)5-Ь-с)(ОА)5 (0X132) и 5'-(1(СА)5-Ьё(ТС)5-Ь-[1(ОА)5 (ОШЗЗ), где Ь - триэтиленглигольный линкер. Структура моделей позволяет им складываться с образованием антипараллельного или параллельного триплекса с идентичными вА-цепями.

Профили термической денатурации обеих моделей характеризуются выраженным двухфазным характером. Два кооперативных перехода указывают на образование трехцепочечного комплекса при низких температурах при условии, что процесс является внутримолекулярным. Последнее было подтверждено экспериментами по поляризации флуоресценции интеркалированного бромистого этидия. Дополнительные доказательства образования триплексов были получены из данных по химической модификации диэтилпирокарбонатом, 0.<Ю4 и нуклеазой 81. Характер модификации цепей ОШЗЗ заметно отличается от распределения, наблюдаемого дня ОШ32 и позволяет предположить, что параллельный триплекс существует в виде двух возможных топоизомеров, между которыми существует динамическое равновесие.

Из профилей термической денатурации были рассчитаны термодинамические параметры образования параллельного и антипараллельного триплекса, из которых следует, что параллельный триплекс намного менее устойчив по сравнению с антипараллельным.

ВЫВОДЫ

1. Разработана общая синтетическая платформа для параллельного анализа ДНК на трехмерной полимерной подложке. Платформа представляет собой комплексное решение задачи иммобилизации модифицированных по 3' или 5' концу олигонуклеотидов в объеме изолированных ячеек полиакриламидного геля. Данный подход нашел применение при изготовлении микрочипов для термодинамического анализа дуплексов, а также при разработке широкого набора диагностических микрочипов.

2. Разработан эффективный метод функционализации ДНК с целью флуоресцентного мечения или иммобилизации. Метод основан на частичном кислотном гидролизе ДНК с последующей модификацией апуриновых участков.

3. Впервые продемонстрирована возможность использования трехмерной полимерной подложки для фотонаправленного синтеза олигонуклеотидных матриц высокой плотности. Показано, что олигонуклеотидный синтез в тонком слое сшитого полидиметилакриламида с использованием фосфорамидитов с фотоудаляемой защитой проходит с высокой эффективностью и позволяет достигать существенного усиления гибридизационного сигнала по сравнению с поверхностно-связанными пробами.

4. Предложен новый способ изготовления олигонуклеотидных микрочипов, основанный на сополимеризации 5'-аллильных производных олигонуклеотидов с акриламидом. Метод позволяет формировать ячейки размером от 10 микрон с равномерным распределением пробы по объему гелевого элемента и представляет собой прототип современной технологии изготовления гидрогелевых микрочипов.

5. Впервые проведен параллельный физико-химический анализ взаимодействий модифицированных олигонуклеотидов с использованием микрочипа, содержащего 4096 гексануклеотидных проб. Исследована специфичность образования модифицированных дуплексов ДНК и их стабильность. Установлено, что из всех исследованных модификаций 2'-0-метилрибозид 2,6-диаминопурина обеспечивает наилучшее соотношение стабилизации и дискриминирующей способности.

6. Предложен ряд новых модификаций нуклеотидной цепи, позволяющих проследить влияние гидрофобных или ионных фрагментов на стабильность двойной спирали. Получены данные о стабильности и структуре дуплексов, модифицированных известными и новыми типами универсальных оснований, интеркалятором на основе фенантридина, а также нуклеотидными звеньями с положительным зарядом на основании или в 5' положении дезоксирибозы.

7. Проведено исследование трехцепочечных комплексов принципиально нового типа, структура которых не органичена полипуриновыми или полипиримидиновыми трактами Уотсон-Криковской двойной спирали. Третья, неприродная цепь в этих комплексах построена из а- и р-нуклеотидных звеньев, что обеспечивает связывание оснований третьей цепи с пуринами либо одной, либо другой цепи

дуплекса. Впервые получены экспериментальные доказательства образования триплексов нового типа, предложена схема образования триплетов, проведена оценка термической стабильности этих комплексов.

8. Предложена универсальная модель внутримолекулярного триплекса ДНК, построенная на основе гидрофильного линкера ненуклеотидной природы. С использованием данной модели различные типы триплексов ДНК. Впервые исследованы закономерности образования параллельного пуринового триплекса, а также параллельного триплекса рекомбинантного типа. Исследовано связывание этих комплексов с флуоресцирующими красителями.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. А.К. Щелкина, O.K. Мамаева, О.Ф. Борисова, Ю.П. Лысов, Э.Н. Тимофеев, И.А. Ильичева, Б.П. Готгах, В.Л. Флорентьев. Трехцепочечная «скрепка» из олигонуклеотида 3'-d(A)10-pO(CH2CH2O)3-pd( T)10-pO(CH2CH2O)3-p-d(T)l()-5\ Молекулярная биология 1992, т.26, с. 1314-1326.

2. A. Schyolkina, О. Mamaeva, О. Borisova, Y. Lysov, Е. Timofeev, I. Il'icheva, В. Gottikh and V. Florentiev. 3-stranded clip of the oligonucleotide 5' -Тю-Тщ-Аю Anisence Res. Develop. 1994, v. 4, pp. 27-33.

3. A. Schyolkina, E. Timofeev, O. Borisova, I. Il'icheva, E. Minyat, E. Khomyakova and V. Florentiev. The R-form of DNA does exist. FEBS Letters v. 339,1994, pp. 113-118.

4. O. Borisova, A. Schyolkina, E. Timofeev, S. Tsybenko, A. Mirzabekov and V. Florentiev. Stabilization of parallel (recombinant) triplex with propidium iodide. J. Biomol. Struct. Dyn. 1995, v.13, pp. 15-27.

5. О.Ф. Борисова, A.K. Щелкина, Э.Н. Тимофеев, В.Л. Флорентьев. Димеры триплексов ДНК. Молекулярная биология 1995, т.29, с.635-640.

6. А. Schyolkina, О. Borisova, Е. Minyat, Е. Timofeev, I. Il'icheva, Е. Khomyakova and V. Florentiev. Parallel purine-pyrimidine triplex: experimental evidence of existence. FEBS Letters 1995, v.367, pp. 81-84.

7. E. Timofeev, S. Kochetkova, A. Mirzabekov and V. Florentiev. Regioselective immobilization of short oligonucleotides to acrylic copolymer gels. Nucleic Acids Res. 1996, v.24, pp. 3142-3148.

8. S. Parinov, V. Barskii, G. Yershov, E. Kirillov, E. Timofeev, A. Belgovskiy and A. Mirzabekov. DNA-sequencing by hybridization to microchip octanucleotide and

decanucleotide extended by stacked pentanucleotides. Nucleic Acids Res. 1996, v.24, pp. 2998-3004.

9. E. Timofeev, I. Smirnov, L. Haff E. Tischenko, A. Mirzabekov and V. Florentiev. Methidium intercalator inserted into synthetic oligonucleotides. Tetrahedron Letters 1996, v. 37, pp. 8467-8470.

10. D. Proudnikov, E. Timofeev and A. Mirzabekov. Immobilization of DNA in Polyacrylamide Gel for the Manufacture of DNA and DNA-Oligonucleotide Microchips. Analytical Biochemistry 1998, v. 259, pp 34-41.

11. G. Yershov, E. Timofeev, I. Ivanov, V. Florentiev and A. Mirzabekov. Method с immobilizing water soluble bioorganic compounds on a capillary-porous carrier. US patent 5741700 (1998).

12. A. Mirzabekov, E. Timofeev, V. Florentiev and E. Kirillov. Rapid method to dete( duplex formation in sequencing by hybridization. US patent 5,861,247 (1999).

13. V. Vasiliskov., E. Timofeev, S. Surzhikov, A. Drobyshev V. Shick and A. Mirzabekov. Fabrication of microarray of gelimmobilized compounds on a chip by copolymerization. BioTechnique 1999, v. 27 pp. 592-4, 596-8, 600 passim.

14. B.A. Василисков, Э.Н. Тимофеев, C.A. Суржиков, A.JI. Дробышев, В.В. Шик, А.Д. Мирзабеков. Метод получения микрочипов с помощью сополимеризации с акриламидом. Молекулярная биология 1998, т. 32, с.923- 925.

15. A. Mirzabekov, D. Proudnikov, Е. Timofeev, S. Kochetkova, V. Florentiev and V. Shick. Methods for immobilizing nucleic acids on a gel substrate. US Patent 5,981,734 (1999).

16. S. Sundberg, J. Jacobs, J. Schullek, G. McGall, A. Mirzabekov, E. Timofeev, D. Fujimoto, C. Holmes and H. Yang. Derivatization of solid supports and methods fc oligomer synthesis. US Patent 5,919,523 (1999).

17. S.V. Kochetkova, E.I. Tishchenko, E.N. Timofeev, .I.L. Shchaveleva and V.I Florentiev. Intercalating insert into internucleotide linkages as way for stabilization ал detection of of short DNA duplexes. Nucleos. Nucleot. 1999, v. 18, pp. 1495-1496.

18. A. Stomakhin, V. Vasiliskov, E. Timofeev, D. Shulga, R. Cotter, A. Mirzabekov. DN. sequence analysis by hybridization with oligonucleotide microchips: MALDI ma: spectrometry identification of 5mers contiguously stacked to microchip oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 2000, v. 28, pp. 1193-1198.

19. Э.Н. Тимофеев, А.Д. Мирзабеков. Способ изготовления микрочипов на ochoi олигонуклеотидов. Патент РФ 2157385 (2000).

20. Э.Н. Тимофеев, А.Д. Мирзабеков, В. А. Василисков. Способ иммобилизации модифицированных непредельными фрагментами олигонуклеотидов путем сополимеризации. Патент РФ 2157377 (2000).

21. S. A. Surzhikov, Е. N. Timofeev, В. К. Chernov, J. В. Golova, A. D. Mirzabekov. Advanced method for oligonucleotide deprotection. Nucleic Acids Res. 2000, v. 15, E29.

22. E. N. Timofeev, O. F. Borisova, A. K. Shchyolkina. Structural polymorphism of oligo(dC) with mixed alpha,beta-anomeric backbone. J. Biomol. Struct. Dyn. 2000, v. 17, pp. 655-664.

23. A. K. Shchyolkina, E. N. Timofeev, Yu P. Lysov, V. L. Florentiev, Т. M. Jovin and D. J. Arndt- Jovin. Protein-free parallel triple-stranded DNA complex formation. Nucleic Acids Res. 2001, v. 29, pp. 986-995.

24. E. Timofeev and A. Mirzabekov. Binding specificity and stability of duplexes formed by modified oligonucleotides with a 4096-hexanucleotide microarray Nucl. Acids. Res. 2001, v. 29, pp. 2626- 2634.

25. S.V. Kochetkova, E.N. Timofeev, E.A. Korobeinikova, N.A. Kolganova and V.L. Florentiev. Oligodeoxynucleotides with extended zwitter-ionic internucleotide linkage. Tetrahedron. 2001, v. 57, pp. 10287-10292.

26. H.A. Колганова, С.В. Кочеткова, Э.Н. Тимофеев, Б.П. Готтих, B.JI. Флорентьев. Повышение стабильности дуплексов олигонуклеотидов. Эффект присоединения 1-(2'-дезокси-р-В-рибофуранозил)-5-нитроиндола. Молекулярная биология 2002, т. 36, с. 1-8.

27. A. Mirzabekov, G. Yershov, D. Guschin, M. Gemmel, V. Shick, D. Proudnikov and E. Timofeev. Rapid method to detect duplex formation in sequencing by hybridization methods, a method for constructing containment structures for reagent interaction. US Patent 6,465,174 (2002).

28. A. Mirzabekov, E. Timofeev and V. Vasiliskov. Method of fabrication of microarray of gel-immobilized compounds on a chip by copolymerization. US Patent 6,656,725 (2003).

29. Э.Н. Тимофеев, C.B. Кочеткова, B.JI. Флорентьев. Исследование связывания неприродных а,р-олигоцитидилатов с дуплексами ДНК. Молекулярная биология 2004, т. 38, с. 459-464.

30. Е. N. Timofeev, В. V. Goryaeva, V. L. Florentiev Recognition of Base Pair Inversions in Duplex by Chimeric (a,p) Triplex-Forming Oligonucleotides. J. Biomol. Struct. Dynam., 24, No. 2, 183-188 (2006).

31. E. N.Timofeev, S. N. Mikhailov, A. N. Zuev, E. V. Efimtseva, P. Herdewijn, R. I Somers and M. M. Lemaitre. Oligodeoxynucleotides containing 2'-deoxy-l methyladenosine and Dimroth rearrangement. Helv. Chim. Acta 2007, v.90, pp. 928-937.

32. Э. H. Тимофеев, H. А. Колганова, И. П. Смирнов, С. В. Кочеткова, В. J Флорентьев. Олигодезоксинуклеотиды, содержащие замещенные 4-нитроиндоль синтез и исследование в составе дуплексов ДНК. Биоорг.химия 2008, 34 (2): 22( 226.

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, Ленинский пр-т, Д.37А Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, доктора химических наук, Тимофеев, Эдуард Николаевич

Условные сокращения

1. Введение

2. Литературный обзор: Синтетические подходы в исследованиях триплексов ДНК В

2.1. Характеристики немодифицированных триплексов

2.2. Проблема протонирования цитидинов третьей цепи пиримидиновых триплексов

2.3. Распознавание инвертированных пар оснований

2.4. Повышение стабильности триплексов

2.5. Подавление альтернативных структур

2.6. Функционализация ТФО

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммобилизованные и модифицированные олигонуклеотиды в физико-химических исследованиях дуплексов и триплексов ДНК"

Широкий спектр функций нуклеиновых кислот в живых системах определяется структурным разнообразием этого класса природных соединений. Помимо канонической антипараллельной двойной спирали Уотсона-Крика природные полинуклеотидные цепи образуют трех- и четырехцепочечные структуры различных типов, параллельные дуплексы, рибозимы и ДНК-зимы. В качестве отдельного структурного семейства можно выделить сложные синтетические надмолекулярные олигонуклеотидные конструкции, в которых могут быть реализованы различные типы взаимодействий.

Доступность синтетических олинонуклеотидов вывела как биологические, так и физико-химические исследования дуплексов и триплексов ДНК на новый уровень. С середины 80-х появилась возможность детально исследовать поведение этих структур различными методами. Однако, уже скоро стало очевидно, что исследования только природных олигонуклеотидных цепей не позволяют в полной мере оценить влияние различных факторов на стабильность и специфичность образования дуплексов и триплексов ДНК. Кроме того, образование триплексов ДНК из природных цепей ограничено полипуриновыми и полипиримидиновыми участками, а также требованием протонирования цитидинов в пиримидиновых антипараллельных триплексах.

Целью настоящей работы являлось комплексное физико-химическое исследование дуплексов и триплексов ДНК с привлечением синтетических методов к построению олигонуклеотидных моделей и при разработке платформы анализа. В ходе выполнения работы экспериментально изучена возможность повышения стабильности дуплексов и триплексов ДНК и специфичности их образовании за счет модификации цепей взаимодействующих олигонуклеотидов, а также реализован новый тип взаимодействий в триплексах ДНК с неприродной третьей цепью.

Физико-химические исследования модифицированных дуплексов ДНК осуществлены как традиционными методами, так и с привлечением новых подходов, основанных на использовании параллельных методов анализа. Разработка синтетических платформ для реализации этих новых подходов представляется одним из наиболее значимых результатов настоящего исследования. Параллельный анализ образования дуплексов на олигонуклеотидных микрочипах широко используется в настоящее время для решения широкого круга биологических и диагностических задач. Разработанные методы иммобилизации олигонуклеотидов в сшитых гидрофильных полимерах послужили основой для создания олигонуклеотидных гидрогелевых микрочипов. Три принципиально различных подхода к иммобилизации олигонуклеотидов предоставляют возможность выбора технологического решения при изготовлении гидрогелевых трехмерных микрочипов - традиционная иммобилизация, фотонаправленный синтез или сополимеризация модифицированных олигонуклеотидов с акриловыми мономерами. Следует отметить, что биологические микрочипы как инструмент физико-химических исследований обладают огромным потенциалом, который до настоящего времени, к сожалению, все еще остается вне поля зрения исследователей. В настоящей работе б впервые был использован параллельный физико-химический анализ образования модифицированных дуплексов ДНК на олигонуклеотидных микрочипах.

Среди факторов, определяющих устойчивость дуплексов ДНК, основными являются гидрофобные взаимодействия, водородное связывание, конформация сахарофосфата и ионные взаимодействия. В настоящей работе были рассмотрены модификации олигонуклеотидной цепи, изменяющие ее гидрофобные или ионные свойства. Проведен синтез и физико-химические исследования дуплексов ДНК, содержащих неприродные цепи, с целью проследить влияние гидрофобных или ионных модификаций на стабильность двойной спирали. Модификация цепей олигонуклеотидов проводилась с использованием нуклеозидов 5-нитроиндола и замещенного 4-нитроиндола, межнуклеотидной фенантридиниевой вставки, цвиттерионной межнуклеотидной связи и N1-метил дезоксиаденозина.

В заключительной части работы рассмотрены различные типы триплексов ДНК. Впервые экспериментально доказано образование нового типа триплексов ДНК с химерной а,р-третьей цепью. Новый подход к построению третьей цепи — с использованием неприродных аномеров нуклеозидов — позволяет адресовать триплекс-образующие олигонуклеотиды к произвольной последовательности ДНК и не ограничивается полипуриновыми и полипиримидиновыми участками. В работе также рассмотрены свойства различных типов триплексов, исследованных с использованием синтетических конструкций одного и того же типа. Внутримолекулярные модельные конструкции представляют собой олигонуклеотидные цепи, соединенные между собой ненуклеотидным гидрофильным линкером. Такой подход к построению моделей триплексов ДНК был реализован впервые и обеспечивает заметное повышение стабильности, задает взаимную ориентацию цепей, упрощает термодинамический анализ и сводит к минимуму влияние петли. Благодаря использованию таких моделей удалось экпериментально получить и охарактеризовать параллельный триплекс рекомбинантного типа или 11-форму ДНК.

Рассмотренные в работе подходы к построению моделей в физико-химических исследованиях нуклеиновых кислот и полученные результаты открывают по существу новое направление исследований.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Тимофеев, Эдуард Николаевич

5. ВЫВОДЫ

2. Разработан эффективный метод функционал из ации ДНК с целью флуоресцентного мечения или иммобилизации. Метод основан на частичном кислотном гидролизе ДНК с последующей модификацией апуриновых участков.

5. Впервые проведен параллельный физико-химический анализ взаимодействий модифицированных олигонуклеотидов с использованием микрочипа, содержащего 4096 гексануклеотидных проб. Исследована специфичность образования модифицированных дуплексов ДНК и их стабильность. Установлено, что из всех исследованных модификаций 2 '-О-метилрибозид 2,6-диаминопурина обеспечивает наилучшее соотношение стабилизации и дискриминирующей способности.

7. Проведено исследование трехцепочечных комплексов принципиально нового типа, структура которых не органичена полипуриновыми или полипиримидииовыми трактами Уотсон-Криковской двойной спирали. Третья, неприродная цепь в этих комплексах построена из а- и Р-нуклеотидных звеньев, что обеспечивает связывание оснований третьей цепи с пуринами либо одной, либо другой цепи дуплекса. Впервые получены экспериментальные доказательства образования триплексов нового типа, предложена схема образования триплетов, проведена оценка термической стабильности этих комплексов.

2.7. Заключение

В настоящем обзоре рассмотрены литературные данные по модификациям третьей цепи триплексов ДНК с целью устранить ряд ограничений, существующих при образовании трехцепочечных структур. Благодаря синтетической трансформации сахарофосфатной основы или нуклеиновых оснований, а также за счет дополнительной конъюгации ТФО с функциональными или стабилизирующими фрагментами удалось заметно продвинуться в решении большинства проблем, связанных с получением устойчивых триплексов ДНК. Быстрое развитие альтернативных технологий распознавания нуклеиновых кислот (антисенсные олигонуклеотиды и не уменьшает важность использования триплексов, как самостоятельного подхода. Это связано, в первую очередь, с тем, что мишенью ТФО является единственная молекула хромосомной ДНК, а не копии матричной РНК. Многочисленные публикации по направленному мутагенезу, триплекс-инициируемой рекомбинации и регуляции экспрессии подтверждают большое значение антигенного подхода в молекулярной медицине [393-398]. Учитывая заметный прогресс в создании эффективных модифицированных ТФО, на первый план, как и в случае антисенсных олигонуклеотидов или з1ШЧА, выходят проблемы доставки олигонуклеотидных агентов в клетки-мишени. Интенсивные исследования методов доставки модифицированных олигонуклеотидов и их конъюгатов [399-407] дают основания полагать, что олигонуклеотидные терапевтические препараты в скором времени станут инструментом практической медицины.

3. Обсуждение результатов 3.1. Исследование взаимодействий модифицированных олигонуклеотидов на трехмерной полимерной подложке

За последнее десятилетие методы анализа взаимодействий нуклеиновых кислот пополнились рядом новых подходов, среди которых особое место занимает параллельный анализ на микрочипах. Олигонуклеотидные микрочипы представляют собой матрицу коротких олигонуклеотидов, иммобилизованных на поверхности стекла, пластика или в объемных микроэлементах гидрофильного сшитого полимера. Несмотря на то, что основным направлением использования микрочипов является молекулярная диагностика, они также являются уникальным инструментом для анализа процессов образования дуплексов ДНК [408, 409]. Прослеживая распределение флуоресцентных сигналов от пригибридизованных фрагментов в зависимости от температуры, оказывается возможным не только выявить стабильность образующихся комплексов, но и оценить специфичность их образования. Формат метода позволяет получить огромный массив данных в ходе одного эксперимента.

Развитие этой передовой технологии неразрывно связано с именем академика А.Д. Мирзабекова. Отличительной особенностью микрочипов, разрабатываемых в ИМБ РАН, является то, что они представляют собой гидрогелевые элементы, фиксированные на поверхности стекла или пластика. Предварительно синтезированные и очищенные олигонуклеотиды равномерно иммобилизуются в объеме геля. Трехмерная иммобилизация обеспечивает ряд существенных преимуществ, основными из которых являются повышенная чувствительность метода, обусловленная увеличенной емкостью элементов на единицу поверхности, меньшая плотность иммобилизации по сравнению с поверхностью, а также возможность изолировать ячейки и осуществлять независимые реакции или взаимодействия в каждой из них.

Существует несколько подходов к иммобилизации олигонуклеотидов в гидрогелевых элементах. В последующих главах будет представлен ряд синтетических платформ, использованных при создании гидрогелевых олигонуклеотидных чипов различных типов. Также будет представлен анализ взаимодействий коротких модифицированных олигонуклеотидов с микрочипом, составленным из всех возможных 4096 гексануклеотидов.

3.1.1. Региосслсктивная иммобилизация коротких олигонуклеотидов в сшитых акриловых сополимерах

Существует два альтернативных подхода к изготовлению олигонуклеотидных микрочипов. Один из них базируется на синтезе олигонуклеотидов непосредственно на плоской стеклянной подложке с использованием стандартной олигонуклеотидной химии [410, 411] или с использованием фосфорамидитов с фотоудаляемыми защитными группами на 5' конце [412]. Альтернативой прямому химическому синтезу на подложке является иммобилизация олигонуклеотидов. При изготовлении гелевых трехмерных олигонуклеотидных микрочипов используются предварительно очищенные олигонуклеотиды, которые иммобилизуются в микроячейках функционализованного полиакриламидного геля [413, 414]. Среди очевидных преимуществ такого подхода можно назвать повышенную емкость трехмерной подложки, возможность иммобилизовать олигонуклеотиды различной длины, концентрации, а также возможность размещать на одном чипе различные классы соединений — олигонуклеотиды, ДНК, пептиды, белки и т.д. Корректный подбор концентрации иммобилизуемого олигонуклеотида позволяет добиться близких сигналов при гибридизации с пробами разного ОС состава [415].

Самым первым подходом к иммобилизации олигонуклеотидов в объеме геля являлась реакция З'-диальдегидных производных с гидразидными функциональными группами в геле (схема 2.1). К сожалению, гидразидная химия не обеспечивает стабильности связи олигонуклеотида с подложкой, особенно в условиях многократных раундов гибридизации и отмывки. Среди других требований, предъявляемых к платформе иммобилизации следует отметить легкость модификации полиакриламида, доступность функционализованных олигонуклеотидов, воспроизводимость выхода иммобилизации, возможность длительного хранения как активированной подложки, так и самих микрочипов.

В данном разделе представлены подходы к иммобилизации олигонуклеотидов в сшитых гидрофильных акриловых сополимерах, а также описана синтетическая платформа для изготовления микрочипов на основе наиболее эффективной схемы иммобилизации.

РII МАЛ

Гидрат в-пдрат V он он

Н=Н или М1

N11 N11,

К~Н или М*

Схема 2.1. Иммобилизация 3 '-ди альдегидных производных олигонукпеотцдов на гидразидной полимерной подложке.

Присоединение гелевой подложки к стеклянной поверхности. В отличие от иммобилизации биомолекул на микрочастицах, микрочип требует фиксации гелевых элементов на поверхности. Традиционно, в технологии биологических микрочипов акрил амид или другой акриловый полимер полнмеризуется на поверхности стекла, модифицированного акрипьными группами. В дальнейшем гелевые элементы или пленка полиакриламида подвергается обработке различными реагентами (например, гидразинолиз). Недостаточная прочность связи геля со стеклом может приводить к отслаиванию микроячеек. Коммерчески доступный реагент, чаще всего используемый для фиксации геля на стекле — (3-метакрилоксипропил)триэтоксисилан (Втё-5Папе) ие обеспечивает необходимой стабильности связи гель-стекло. Мы разработали альтернативный метод - с использованием 3-(триэтоксисилилпропил)акриламнда (2.1), легко получаемого ацилированием (3-аминопропил)триэтоксисилана акрилокл хлоридом. Замена сложи оэф ирной связи на амидную позволила избежать отпаивания полиакриламидной пленки (20 мкм) от стеклянной поверхности при многочасовой обработке такими реагентами, как гидразин-гидрат при комнатной температуре или 50% 3-аминопропанол в этаноле при 50°С.

Функционализация геля. В качестве метода функционализации акрилового полимера мы выбрали подход, основанный на сополимеризации различных акрилатных мономеров. Введение функциональных групп путем обработки сформированного геля различными реагентами, такими как гидразин или этилендиаимин [416-418], представляется менее предпочтительным. Использование сополимеризации позволяет осуществлять контролируемую модификацию полимера широким набором функциональных групп. Кроме того, сохраняется возможность постполимеризационной обработки, которая может быть осуществлена исключительно по функциональным группам и в достаточно мягких условиях.

Мы разработали два типа полимерных акриловых носителей для иммобилизации олигонуклеотидов. Эти полимерные носители содержат аминогруппы или альдегидные группы и позволяют проводить иммобилизацию соответственно 3 '-диальдегидных или аминоалкильных производных олигонуклеотидов в присутствии восстанавливающего агента. Введение аминогрупп в акриловый сополимер было выполнено с использованием хлоргидратов аминоалкилакриламидов (2.2 и 2.3). Эти соединения могут быть легко получены при ацилировании соответствующих диаминов акрилоил хлоридов в эфире. Реакция проходит в мягких условиях почти количественно. Синтезированные продукты не содержали дизамещенных производных. Поскольку замещенный акриламид 2.3 характеризуется низкой растворимостью в воде (0.06 г/мл), мы использовали амид 2.2 для получения амино-модифицированного полимера. Степень модификации сшитого полиакриламида аминогруппами (при соотношении акриламида к аминомономеру 9:1) оценивали путем прокрашивания динитрофторбензолдом 100 мкм пленки, приполимеризовапной к поверхности стекла, с последующей УФ-детекцией на 365 нм. В соответствии с данными фотометрии около 10% аминоэтилакриламида включилось в полимерную сетку. Показано, что вместо акриламида может быть использован диметилакриламид. Непосредственно перед иммобилизацией диальдегидных О

2.2 (п=2); 2.3 (п=6) производных олигонуклеотидов аминомодифицированный полимерный носитель был обработан 0.1 М раствором КОН.

Схема 2.2. Синтез 5,6-0-изопропилиден-5,б-дигидроксигексилакриламида. (i) Ацетон, TsOH, азеотропная отгонка воды; (ii) MsCl в Ру; (iii) LiN3 в ДМФ, 150°С; (iv) Ph3P в Ру; (v) акрилоил хлорид, триэтиламин, 0°С.

Для введения альдегидных групп мы использовали 5,6-0-изопропилиден-5,6-дигидроксигексилакриламид (2.8). Это соединение было получено в соответствии со схемой 2.2. Растворимость мономера в воде ограничена, но достаточна для получения 0.1 М раствора. Сополимер, содержащий защищенные диольные фрагменты, был получен на основе сшитого полидиметилакриламида, при мольном соотношении диметилакриламида к мономеру 2.8 - 9:1. Активация функциональных групп в геле проводилась последовательной обработкой сшитого полимера 80% уксусной кислотой и 0.1 М раствором NaI04

Иммобилизация олигонуклеотидов. Иммобилизация проводилась с использованием 5'- Р-меченных олигонуклеотидов ATGCTACT-X, где X — окисленный метилуридиновый фрагмент или аминоалкильная группа (ON1 и ON2, соответственно). Немодифицированный олигонуклеотид (ON3) был использован в качестве отрицательного контроля. Химия иммобилизации представлена на схемах 2.3 и 2.4. Эффективность иммобилизации оценивали по остаточной радиоактивности после 20 минутной промывки полимерных пленок в 0.1 М ТЕАА при 50°С. Как и ожидалось, обе схемы иммобилизации обеспечивают высокий выход пришивки, таблица 1. Несколько меньшая эффективность иммобилизации на амино-полимере вероятнее всего вызвана частичным элиминированием окисленного З'-диальдегидного фрагмента при увеличении рН (механизм ElcB [419]). Более эффективная альдегидная пришивка характеризуется несколько большим неспецифическим связыванием контрольного олигомера. В качестве восстанавливающих агентов мы использовали цианборгидрид натрия, пиридин-борановый комплекс и триметиламин-борановый комплекс. Наилучшие результаты были получены при использовании ниридин-борана как для амино-, так н для альдегидного сополимера (74% и 97%, соответственно).

O^NR., О^ЛЩ

R=U или \»с

1) Н+

2) NaI04

WNR3

К=Н M ill Me

R=H или Mc

Liak-p-oligo-5" ,NH

1) 5'-о1»Ео-р-Ь111к-1ЧН1

2) Х-В11а, \-NaCN, Ру или МИе,

Схема 23. Иммобилизация аминоолигонуклеотидов на альдегидной полимерной подложке.

R-11 или \1е

Х-ВНз, X=NaCN, Ру или NMe,

К=Н или Ml

Схема 2.4. Иммобилизация З'-диапьдегидных производных олигонуклеотидов на аминированной полимерной подложке.

Библиография Диссертация по биологии, доктора химических наук, Тимофеев, Эдуард Николаевич, Москва

1. Felsenfeld G., Davies D.R., Rich A. Formation of a three stranded polynucleotide molecule. J. Am. Chem. Soc., 1957, v. 79, N 8, pp. 2023-2024.

2. Felsenfeld G., Miles M.T. Physical and chemical properties of nucleic acids. Annu. Rev. Biochemistry, 1967, v. 36, pp. 407-448.

3. Michelson A.M., Massoulie J., Gushlbauer W. Oligonucleotide interactions. Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol., 1967, v. 6, pp. 83-141.

4. Lipsett M.N. The interaction of polyC and guanine trinucleotide. Biophys. Biochem. Res. Comm., 1963, v. 11, N 3, pp. 224-228.

5. Lipsett M.N. Aggregation of guanine oligoribonucleotides and the effect of mercuric salts. J. Biol. Chem. 1964, v. 239, N 4, pp. 1250-1260.

6. Lee J.S., Johnson D.A., Morgan A.R. Complexes formed by (purine)n-(pyrimidine)n DNAs on lowering pH are three-stranded. Nucleic Acids Res., 1979, v. 6, N9, pp. 3073-3081.

7. Moser H.E., Dervan P.B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science, 1987, v. 238, N 4827, pp. 645-650.

8. Povsic T.J, Dervan P.B. Triple helix formation by oligonucleotides on DNA extended to the physiological pH range. J. Am. Chem. Soc., 1989, v. 111, N 8, pp. 3059-3061.

9. Arnott S., Bond P.J. Triple stranded polynucleotide helix containing only purine bases. Science, 1973, v. 181, N 94, pp. 68-69.

10. Arnott S., Seising E. Structure of the polynucleotide complexes poly(dA)-poly(dT) and poly(dA)-poly(dT)-poly(dT). J. Mol. Biol., 1974, v. 88, N 2, pp. 509-521.

11. Arnott S., Bond P.J. Structures for poly(U)-polu(A)-poly(U) triple stranded polynucleotides. Nature New Biol., 1973, v. 244, N 134, pp. 99-101.

12. Larsen A., Weintraub H. An altered DNA conformation detected by SI nuclease occurs at specific regions in active chick globin chromatin. Cell, 1982, v. 29, N2, pp. 609-622.

13. Wells R.D., Collier D.A., Hanvey J.C., Shimizu M., Wohlrab F. The chemistry and biology of unusual DNA structures adopted by oligopurine.oligopyrimidine sequences. FASEB J., 1988, v. 2, N 14, pp. 2939-2949.

14. Htun H., Dahlberg J.E. Topology and formation of triple-stranded H-DNA. Science, 1989, v. 243, N 4898, pp. 1571-1576.

15. Lee J.S., Woodsworth M.L., Latimer L.J.P., Morgan A.R. Poly(pyrimidine) . poly(purine) synthetic DNAs containing 5-methylcytosine form stable triplexes at neutral pH. Nucleic Acids Res., 1984, v. 12, N 16, pp. 6603-6614.

16. Christophe D., Garber B., Bacolla A., Pohl V., Vassart G. An unusually long poly(purine)-poly(pyrimidine) sequence is located upstream from the human thyroglobulin gene. Nucleic Acids Res., 1985, v. 13, N 14, pp. 5127-5144.

17. Lyamichev V.l., Mirkin S.M., Frank-Kamenetskii M.D. Structures of homopurine-homopyrimidine tract in superhelical DNA. J. Biomol. Struct. Dyn., 1986, v. 3, N 4, pp. 667-669.

18. Daniel M. Brown A Brief History of Oligonucleotide Synthesis. In Methods in Molecular Bology, v. 20, Protocols for Oligonucleotides and Analogs. Edited by S Agrawal, 1993, Humana Press Inc., Totowa, NJ.

19. Plum G.E., Breslauer K.J. Thermodynamics of an intramolecular DNA triple helix: a calorimetric and spectroscopic study of the pH and salt dependence of thermally induced structural transitions. J. Mol. Biol., 1995, v. 248, N 3, pp. 679-695.

20. Wilson W.D., Hopkins H.P., Mizan S., Hamilton D.D., Zon G. Thermodynamics of DNA Triplex Formation in Oligomers with and without Cytosine Bases: Influence of Buffer Species, pH, and Sequence J. Am. Chem. Soc., 1994, v. 116, N8, pp. 3607-3608.

21. Xodo L.E., Giorgio M., Quadrifoglio F., Van der Marel G.A., Van Boom J. Effect of 5-methylcytosine on the stability of triple-stranded DNA a thermodynamic study. Nucleic Acids Res., 1991, v. 19, N 20, pp. 5625-5631.

22. Godde F., Toulme J., Moreau S. 4-amino-lH-benzoy.quinazoline-2-one: a fluorescent analog of cytosine to probe protonation sites in triplex forming oligonucleotides. Nucleic Acids Res., 2000, v. 28, N 15, pp. 2977-2985.

23. Inman R.B. Multistranded deoxyribonucleic acid homopolymer interactions. J. Mol. Biol., 1964, v. 10, N 1, pp. 137-146.

24. Morgan A.R., Wells R.D. Specificity of the three stranded complex formation between double stranded DNA and single stranded RNA containing repeating nucleotide sequences. J. Mol. Biol., 1968, v. 37, N 1, pp. 63-80.

25. Blake R.D., Massoulie J., Fresco J.R. A spectral approach to the equilibria between polyriboadenylate and polyribouridilate and their complexes. J. Mol. Biol., 1967, v. 30, N 2, pp. 291-308.

26. Riley M., Maling B., Chamberlin M.J. Physical and chemical characterizatin of two and three stranded adenine-thymine and adenine-uracil homopolymer complexes. J. Mol. Biol., 1966, v. 20, pp. 359-389.

27. Massoulie J. Acciciations de poly A et poly U en milieu acide. Eur. J. Biochemistry, 1968, v. 3, pp. 439-447.

28. Massoulie J. Thermodinamique des association de poly A et poly U en milieu et alkalin. Eur. J. . Biochemistry, 1968, v. 3, pp. 428-438.

29. Miles H.T., Frazier J. A strand disproportionate reaction in a helical polynucleotide system. Biochemistry Bioph. Res. Commun., 1964, v. 14, N 2, pp. 129-136.

30. Manzini G., Xodo L.E., Gasparotto D., Quadrifoglio F., van der Marel G.A., van Boom J.H. Triple helix formation by oligopurine oligopyrimidine DNA fragments. Electrophoretic and thermodynamic behavoir. J. Mol. Biol., 1990, v. 213, N4, pp. 833-843.

31. Pilch D.S., Levenson C.H., Shafer R.H. Structural analysis of the (dA)10-2(dT)i0 triple helix. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1990, v. 87, N 5, pp. 19421946.

32. Plum G.E., Park Y.-W., Singleton S.E., Dervan P.B., Breslauer K.J. Thermodynamic characterization of the stability and the melting behavoir of a

33. DNA triplex: a spectroscopic and calorimetric study. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1990, v. 87, N 23, pp. 9436-9440.

34. Hampel K.J., Crosson P., Lee J.S. Polyamines favor DNA triplex formation at neutral pH. Biochemistry, 1991, v. 30, N 18, pp. 4455-4459.

35. Singleton S.F., Dervan P.B. Influence of pH on the equilibrium association constants for oligodeoxyribonucleotide-directed triple helix formation at single DNA sites. Biochemistry, 1992, v. 31, N 45, pp. 995-1003.

36. Wu P., Kawamoto Y., Hara H., Sugimoto N. Effect of divalent cations and cytosine protonation on thermodynamic properties of intermolecular DNA double and triple helices. J. Inorg. Biochemistry, 2002, v. 91, N 1, pp. 277285.

37. Keppler M.D., Fox K.R. Relative stability of triplexes containing different numbers of T.AT and C+.GC triplets. Nucleic Acids Res., 1997, v. 25, N 22, pp. 4644-4649.

38. Ferdous A., Watanabe H., Akaike T., Maruyama A. Poly(L-lysine)-graft-dextran copolymer: amazing effects on triplex stabilization under physiological pH and ionic conditions (in vitro). Nucleic Acids Res., 1998, v. 26, N 17, pp. 3949-3954.

39. Maruyama A., Katoh M., Ishihara T., Akaike T. Comb-Type Polycations Effectively Stabilize DNA Triplex. Bioconjugate Chem., 1997, v. 8, pp. 3-6.

40. Thomas T.J., Kulkarni G.D., Greenfield N.J., Shirahata A., Thomas T. Structural specificity effects of trivalent polyamine analogues on the stabilization and conformational plasticity of triplex DNA. Biochemistry J., 1996, v. 319, pp. 591-599.

41. Ferdous A., Akaike T., Maruyama A. Mechanism of intermolecular purine-purine-pyrimidine triple helix stabilization by comb-type polylysine graft copolymer at physiologic potassium concentration. Bioconjugate Chem., 2000, v. 11, N4, pp. 520-526.

42. Thomas T., Thomas T.J. Selectivity of polyamines in triplex DNA stabilization. Biochemistry, 1993, v. 32, N 50, pp. 14068-14074.

43. Rajeev K.G., Sanjayan G.J., Ganesh K.N. Conformationally Restrained Chiral Analogues of Spermine: Chemical Synthesis and Improvements in DNA Triplex Stability. J. Org. Chem., 1997, v. 62, N 15, pp. 5169-5173.

44. Alberti P., Arimondo Р.В., Mergny J.L., Garestier T., Hélène С., Sun J.S. A directional nucleation-zipping mechanism for triple helix formation. Nucleic Acids Res., 2002, v. 30, N 24, pp. 5407-5415.

45. Arnott S., Bond P.J., Seising E. Models of triple stranded polyribonucleotides with optimized stereochemistry. Nucleic Acids Res., 1976, v. 3, N 10, pp. 2459-2470.

46. Radhakrishnan I., Patel D.J. Solution structure of a pyrimidine.purine.pyrimidine DNA triplex containing T.AT, C+.GC and G.TA triples. Structure, 1994, v. 2, N 1, pp. 17-32.

47. Radhakrishnan I., Patel D.J. Solution structure and hydration patterns of a pyrimidine.purine.pyrimidine DNA triplex containing a novel T.CG base-triple. J. Mol. Biol., 1994, v. 241, N 4, pp. 600-619.

48. Wang E., Malek S., Feigon J. Structure of a G.T.A triplet in an intramolecular DNA triplex. Biochemistry, 1992, v. 31, N 20, pp. 4838-4846.

49. Macaya R., Wang E., Schultze P., Sklenar V., Feigon J., Proton nuclear magnetic resonance assignments and structural characterization of an intramolecular DNA triplex. J. Mol. Biol., 1992, v. 225, N 3, pp. 755-773.

50. Asensio J.L., Dosanjh H.S., Jenkins T.C., Lane A.N. Thermodynamic, kinetic, and conformational properties of a parallel intermolecular DNA triplex containing 5' and 3' junctions. Biochemistry, 1998, v. 37, N 43, pp. 15188-15198.

51. Radhakrishnan I., Patel D.J. DNA triplexes: solution structures, hydration sites, energetics, interactions, and function. Biochemistry, 1994, v. 33, N 38, pp. 11405-11416.

52. Radhakrishnan I., Patel D.J. Solution structure of a purine.purine.pyrimidine DNA triplex containing G.GC and T.AT triples. Structure, 1993, v. 1, N 2, pp. 135-152.

53. Chandrasekaran R., Giacometti A., Arnott S. Structure of poly (I).poly (A).poly (I). J. Biomol. Struct. Dyn., 2000, v. 17, N 6, pp. 1035-1045.

54. Chandrasekaran R., Giacometti A., Arnott S. Structure of Poly (U).poly (A).poly (U). J. Biomol. Struct. Dyn., 2000, v. 17, N 6, pp. 1023-1034.

55. Chandrasekaran R., Giacometti A., Arnott S. Structure of poly (dT).poly (dA).poly (dT). J. Biomol. Struct. Dyn., 2000, v. 17, N 6, pp. 1011-1022.

56. Shin C., Koo H. Helical periodicity of G A-alternating triple-stranded DNA. Biochemistry, 1996, v. 35, pp. 968-972.

57. Howard F.B., Miles H.T., Liu K., Frazier J., Raghunathan G., Sasisekharan V. Sructure of d(T)n-d(A)n-d(T)n the DNA triple helix has B-form geometry with C2'-endo sugar pucker. Biochemistry, 1992, v. 31, N 44, pp. 1067110677.

58. Liquier J., Coffinier P., Firon M., Taillandier E. Triple helical polynucleotide structures sugar conformation determined by FTIR spectroscopy. J. Biomol. Struct. Dyn., 1991, v. 9, N 3, pp. 437-445.

59. Akhebat A., Dagneaux C., Liquier J., Taillandier E. Triple helical polynucleotide structures. An FTIR study of the C+GC triads. J. Biol. Struct. Dyn., 1992, v. 10, N 3, pp. 577-588.

60. Tsuboi M. Application of infrared spectroscopy to structure studies of nucleic acids. Appl. Spectrosc. Rev., 1969, v. 3, pp. 45-90.

61. Higuchi S., Tsuboi M., Iitaka Y. Infrared spectrum of a DNA-RNA hybrid. Biopolymers, 1969, v. 7, N 6, pp. 909-916.

62. Hausheer F.H., Singh U.S., Saxe J.D., Colvin O.M., T'so P.O.P. Can oligonucleoside methylphosphonate form a stable triplet with a double DNA helix. Anti Cancer Drug Des., 1990, v. 5, N 2, pp. 159-167.

63. Laughton C.A., Neidle S., Molecular dynamics simulation of the DNA triplex d(TC)5-d(GA)5-d(C+T)5. J. Mol. Biol., 1992, v. 223, N 2, pp. 519-529.

64. Sun J.-S., Mergny J.-L., Lavery R., Montaney-Garestier T., Helene C. Triple helix structures sequence dependence, flexibility and mismatch effects. J. Biomol. Struct. Dyn., 1991, v. 9, N 3, pp. 411-424.

65. Radhakrishnan I., Patel D.J., Veal J.M., Gao X. Solution conformation of a GTA triple in an intramolecular pyrimidine-purine -pyrimidine DNA triplex. J. Am. Chem. Soc., 1992, v. 114, pp. 6913-6915.

66. Radhakrishnan I., Patel D.J. Solution structure of an intramolecular purine-purine-pyrimidine DNA triplex. J. Am. Chem. Soc., 1993, v. 115, N 4, pp. 1615-1617.

67. Radhunathan G., Miles H.T., Sasisekharan V. Symmetry and molecular stucture of a DNA triple helix: d(T)n-d(A)n-d(T)n. Biochemistry, 1993, v. 32, N 2, pp. 455-462.

68. Laughton С.A., Neidle S. Prediction of the structure of Y+R-R+ type DNA triple helix by molecular modelling. Nucleic Acids Res., 1992, v. 20, N 24, pp. 6535-6541.

69. Ojha R.P., Tiwari R.K. Triplex hydration: nanosecond molecular dynamics simulation of the solvated triplex formed by mixed sequences. Nucleic Acids "Res., 2003, v. 31, N 21, pp. 6373-6380.

70. Rathinavelan Т., Yathindra N. Base triplet nonisomorphism strongly influences DNA triplex conformation: effect of nonisomorphic G* GC and A* AT triplets and bending of DNA triplexes. Biopolymers, 2006, v. 82, N 5, pp. 443-461.

71. Petrov A.S., Lamm G., Pack G.R. The triplex-hairpin transition in cytosine-rich DNA. Biophys. J., 2004, v. 87, N 6, pp. 3954-3973.

72. Цыбенко С.Ю., Ильичева И.А., Флорентев B.Jl. Структура и конформационная динамика (dA.dT:dT)6 с параллельно направленными тиминовыми цепями. Молекулярная Биол., 1997, v. 31, pp. 315-323.

73. Kiran M.R., Bansal M. Molecular dynamics simulations on parallel and antiparallel C.G*G triplexes. J. Biomol. Struct. Dyn., 1998, v. 16, N 3, pp. 511-526.

74. Pilch D.S., Brousseau R., Shafer R.H. Thermodynamics of triple helix formation: spectrophotometric studies on the d(A)io-2d(T)io and d(C+3T4C+3)-d(G3A4G3)- d(C3T4C3). Nucleic Acids Res., 1990, v. 18, N 19, pp. 5743-5750.

75. Xodo L.E., Manzini G., Quadrifoglio F. Spectroscopic and calorimetric investigation on the DNA triplex formed by d(CTCTTCTTTCTT) and d(GAGAAGAAAGAA) at acidic pH. Nucleic Acids Res., 1990, v. 18, N 12, pp. 3557-3564.

76. Gray D.M., Morgan A.R., Ratligg R.L. A comparison of circular dichroism spectra of synthetic DNA sequences of the homopurine-homopyrimidine and mixed types. Nucleic Acids Res., 1978, v. 5, pp. 3679-3695.

77. Goobes R., Minsky A. Contextual Equilibrium Effects in DNA Molecules. J. Biol. Chem., 2001, v. 276, N 19, pp. 16155-16160.

78. Marek С., Thiele D. Poly(dG)-poly(dC) at neutral and alkaline pH; the formation of triple stranded poly(dG)-poly(dG)-poly(dC). Nucleic Acids Res., 1978, v. 5, N 3, pp. 1017-1028.

79. Thiele D., Marek С., Schneider С., Guschlbauer W. Protonated polinucleotide structures 22. CD study of the acid-base titration of poly(dG)-poly(dC). Nucleic Acids Res., 1978, v. 5, N 6, pp. 1977.

80. Durand M., Peliolle S., Thuong N.T., Maurizot J.C. "Triple helix formation by an oligonucleotide containing one d(A)n and two d(T)i2 sequences brigged by two hexaethyleneglycol chains. Biochemistry, 1992, v. 31, N 8, pp. 9197-9204.

81. Johnson K.H., Gray D.M. Vacuum UV CD spectra of homopolymer duplexes and triplexes containing AT or AU base pairs. Nucleic Acids Res., 1991, v. 19, N9, pp. 2275-2280.

82. Waring M.J. Stabilization of two-standard ribohomopolymer helices and destabilzation of a three-stranded helix by ethidium bromide. Biochem. J., 1974, v. 143, N2, pp. 483-486.

83. Lehrman E., Crothers D.M. An ethidium-induced double helix of poly(dA)-poly(rU). Nucleic Acids Res., 1977, v. 4, N 5, pp. 1381-1392.

84. Щелкина A.K., Лысов Ю.П., Ильичева И.А., Черный A.A., Голова Ю.Б., Чернов Б.К., Готтих Б.П., Флорентьев B.JL Молекулярная биол., 1989, т. 23, с. 295-305.

85. Mergny J.L., Collier D., Rougee M., Montaney-Garestier T., Helene C. Intercalation of ethidium bromide into a triple stranded oligonucleotide. NucleicAcids Res., 1991, v. 19, N7, pp. 1521-1526.

86. Scaria P.V., Shafer R.H. Binding of ethidium bromide to a DNA triple helix. Evidence for intercalation. J. Biol. Chem., 1991, v. 266, N 9, pp. 5417-5423.

87. Pilch D. S., Breslauer K.J. Ligand-induced formation of nucleic acid triple helices. Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)., 1994, v. 91, N 20, pp. 9332-9336.

88. Gamper H.B., Kutyavin I.V., Rhinehart R.L., Lokhov S.G., Reed M.W., Meyer R.B. Modulation of Cm/T, G/A, and G/T triplex stability by conjugate groups in the presence and absence of KC1. Biochemistry, 1997, v. 36, N 48, pp. 14816-14826.

89. Escude C., Sun J.-S., Nguyen C. H., Bisagni E., Garestier T., Helene C. Biochemistry, 1996, v. 35, N 18, pp. 5735-5740.

90. Chandler S.P., Strekowski L., Wilson W.D., Fox, K.R. Footprinting studies on ligands which stabilize DNA triplexes: effects on stringency within a parallel triple helix. Biochemistry, 1995, v. 34, N 21, pp. 7234-7242.

91. Wilson W.D., Tanious F.A., Mizan S., Yao S., Kiselyov A.S., Zon G., Strekowski L. DNA triple-helix specific intercalators as antigene enhancers: unfused aromatic cations. Biochemistry, 1993, v. 32, N 40, pp. 10614-10621.

92. Fox K.R., Polucci P., Jenkins T.C., Neidle S. A molecular anchor for stabilizing triple-helical DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1995, v. 92, N 17, pp. 7887-7891.

93. Marchand C., Bailly C., Nguyen C. H., Bisagni E., Garestier T., Helene C., Waring, M. J. Stabilization of triple helical DNA by a benzopyridoquinoxaline intercalator. Biochemistry, 1996, v. 35, N 15, pp. 5022-5032.

94. Escude C., Nguyen C.H., Kukreti S., Janin Y., Sun J.-S., Bisagni E., Garestier T., Helene C. Rational design of a triple helix-specific intercalating ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1998, v. 95, N 7, pp. 3591-3596.

95. Zain R., Marchand C., Sun J., Nguyen C.H., Bisagni E., Garestier T., Helene C. Design of a triple-helix-specific cleaving reagent. Chem. Biol., 1999, v. 6, N 11, pp. 771-777.

96. Durand M., Thuong N.T., Maurizot J.C. Binding of netropsin to a DNA triple helix. J. Biol. Chem., 1992, v. 267, N 34, pp. 4394-4399.

97. Durand M., Maurizot J.C. Distamycin A complexation with a nucleic acid triple helix. Biochemistry, 1996, v. 35, N 28, pp. 9133-9139.

98. Arya D.P., Coffee R.L. DNA triple helix stabilization by aminoglycoside antibiotics. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2000, v. 10, N 17, pp. 1897-1899.

99. Arya D.P., Coffee R.L., Charles I. Neomycin-induced hybrid triplex formation. J. Am. Chem. Soc., 2001, v. 123, N44, pp. 11093-11094.

100. Xue L., Charles I., Arya D.P. Pyrene-neomycin conjugate: dual recognition of a DNA triple helix. Chem. Commun., 2002, pp. 70-71.

101. Arya D.P., Xue L., Tennant P. Combining the best in triplex recognition: synthesis and nucleic acid binding of a BQQ-neomycin conjugate. J. Am. Chem. Soc. 2003, v. 125, N27, pp. 8070-8071.

102. Cheng A.J., Vandyke M.W. Oligodeoxyribonucleotide length and sequence effects on intermolecular purine—purine—pyrimidine triple-helix formation Nucleic Acids Res., 1994, v. 22, N 22, pp. 4742-4747.

103. Clarenc J.P., Lebleu B., Leonetti J.P. Base Changes and Triple-Helix Hybridization Properties of GT Containing Third Strands: A Systematical Study Nucleosides Nucleotides, 1994, v. 13, N 1-3, pp. 799-809.

104. Durland R.H., Kessler D.J., Gunnell S., Duvic M., Pettitt B.M. Hogan M.E. Binding of triple helix forming oligonucleotides to sites in gene promoters. Biochemistry, 1991, v. 30, N 38, pp. 9246-9255.

105. Olivas W.M., Maher L.J. Competitive triplex/quadruplex equilibria involving guanine-rich oligonucleotides. Biochemistry, 1995, v. 34, N 1, pp. 278-284.

106. Roy C. Inhibition of gene transcription by purine rich triplex forming oligodeoxyribonucleotides. Nucleic Acids Res., 1993, v. 21, N 12, pp. 28452852.

107. Dagneaux C., Liquier J., Taillandier E. FTIR study of a nonclassical dT10*dA10-dT10 intramolecular triple helix. Biochemistry, 1995, v. 34, N 45, pp. 14815-14818.

108. Dagneaux C., Gousset H., Shchyolkina A.K., Ouali M., Letellier R., Liquier J., Florentiev V.L., Taillandier E. Parallel and antiparallel A*A-T intramolecular triple helices. Nucleic Acids Res., 1996, v. 24, N 22, pp. 45064512.

109. Schyolkina A., Borisova O., Minyat E., Timofeev E., Il'icheva I., Khomyakova E., Florentiev V. Parallel purine-pyrimidine triplex: experimental evidence of existence. FEBS Letters, 1995, v. 367, N 1, pp. 8184.

110. Porumb H., Gousset H., Taillandier E. Parallel and antiparallel triple helices with G, A-containing third strands. Electrophoresis, 1999, v. 20, N 3, pp. 511-513.

111. Mohammadi S., Slama-Schwok A., Léger G., el Manouni D., Shchyolkina A., Leroux Y., Taillandier E. Triple helix formation and homologous strand exchange in pyrene-labeled oligonucleotides. Biochemistry, 1997, v. 36, N 48, pp. 14836-14844.

112. Otero R.D.C., Hsieh P. Homologous Recombination Proteins in Prokaryotes and Eukaryotes. Annu. Rev. Genet., 1995, v. 29, pp. 509-552.

113. Camerini-Otero R.D., Hsieh P. Parallel DNA triplexes, homologous recombination, and other homology-dependent DNA interactions. Cell, 1993, v. 73, N2, pp. 217-223.

114. West S.C. Enzymes and Molecular Mechanisms of Genetic Recombination Annu.Rev. Biochemistry, 1992, v. 61, pp. 603-640.

115. Zhurkin V.B., Raghunathan G., Ulyanov N.B., Camerini-Otero R.D., Jernigan R.L. A parallel DNA triplex as a model for the intermediate in homologous recombination. J. Mol. Biol., 1994, v. 239, N 2, pp. 181-200.

116. Yancey-Wrona J.E., Camerini-Otero R.D. The search for DNA homology does not limit stable homologous pairing promoted by RecA protein. Curr. Biol., 1995, v. 5, N 10, pp. 1149-1158.

117. Baliga R., Singleton J.W., Dervan P.B. RecA.oligonucleotide filaments bind in the minor groove of double-stranded DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1995, v. 92, N 22, pp. 10393-10397.

118. Rao B.J., Radding C.M. Formation of base triplets by non-Watson-Crick bonds mediates homologous recognition in RecA recombination filaments. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1994, v. 91, N 13, pp. 6161-6165.

119. Shchyolkina A.K., Kaluzhny D.N., Arndt-Jovin D.J., Jovin T.M., Zhurkin V.B. Recombination R-triplex: H-bonds contribution to stability as revealed with minor base substitutions for adenine. Nucleic Acids Res., 2006, v. 34, N 11, pp. 3239-3245.

120. Kaluzhny D.N., Timoshin V.V., Borisova O.F., Zhurkin V.B., Florentiev V.L., Shchyolkina AK. Intramolecular Recombination R-Triplex in Solution: Stabilization by bis-intercalator YOYO. J. Biomol. Struct. Dyn., 2008 v. 26, N 3, pp. 301-306.

121. Shchyolkina A.K., Timofeev E.N., Lysov Y.P., Florentiev V.L., Jovin T.M., Arndt-Jovin D.J. Protein-free parallel triple-stranded DNA complex formation. Nucleic Acids Res., 2001, v. 29, N 4, pp. 986-995.

122. Borisova O.F., Shchyolkina A.K., Timofeev E.N., Tsybenko S.Yu., Mirzabekov A.D., Florentiev V.L. Stabilization of parallel (recombinant) triplex with propidium iodide. J. Biomol. Struct. Dyn., 1995, v. 13, N 1, pp. 15-27.

123. Shchyolkina A.K., Timofeev E.N., Borisova O.F., Il'icheva I.A., Minyat E.E., Khomyakova E.B., Florentiev V.L. The R-form of DNA does exist. FEBS Lett., 1994, v. 339, N 1-2, pp. 113-118.

124. Noonberg S.B., François J.C., Garestier T., Hélène C. Effect of competing self-structure on triplex formation with purine-rich oligodeoxynucleotides containing GA repeats. Nucleic Acids Res., 1995, v. 23, N 11, pp. 1956-1963.

125. Shiber M.C., Braswell E.H., Klump H., Fresco J.R. Duplex-tetraplex equilibrium between a hairpin and two interacting hairpins of d(A-G)10 at neutral pH. Nucleic Acids Res., 1996, v. 24, N 24, pp. 5004-5012.

126. Mukerji I., Shiber M.C., Fresco J.R., Spiro T.G. A UV resonance Raman study of hairpin dimer helices of d(A-G)10 at neutral pH containing intercalated dA residues and alternating dG tetrads. Nucleic Acids Res., 1996, v. 24, N24, pp. 5013-5020.

127. Svinarchuk F., Cherny D., Debin A., Delain E., Malvy C. A new approach to overcome potassium-mediated inhibition of triplex formation. Nucleic Acids Res., 1996, v. 24, N 19, pp. 3858-3865.

128. Mergny J-L., Lacroix L., Han X., Leroy J-L., Helene C. Intramolecular Folding of Pyrimidine Oligodeoxynucleotides into an i-DNA Motif. J. Am. Chem. Soc., 1995, v. 117, N 35, pp. 8887-8898.

129. Mäher L.J., Wold B., Dervan P.B. Inhibition of DNA binding proteins by oligonucleotide directed triple helix formation. Science, 1989, v. 245, N 4919, pp. 725-730.

130. Froehler B.C., Ricca D.J. Triple helix formation by oligonucleotides containing the carbocyclic analogs of thymidine and 5-Me-2'-deoxycytidine. J.Am. Chem. Soc., 1992, v. 114, N21, pp. 8320-8322.

131. Hildbrand S., Blaser A., Parel S.P., Leumann C.J. 5-Substituted 2-Aminopyridine C-Nucleosides as Protonated Cytidine Equivalents: Increasing Efficiency and Selectivity in DNA Triple-Helix Formation J. Am. Chem. Soc., 1997, v. 119, N 24, pp. 5499-5511.

132. Hildbrand S., Leumann C. Enhancing DNA Triple Helix Stability at Neutral pH by the Use of Oligonucleotides Containing a More Basic Deoxycytidine Analog. Angew.Chem. Int. Ed. Engl, 1996, v. 35, N 17, pp. 1968-1970.

133. Chen D.L., McLaughlin L.W. Use of pKa Differences To Enhance the Formation of Base Triplets Involving C-G and G-C Base Pairs. J. Org. Chem., 2000, v. 65, N 22, pp. 7468-7474.

134. Ono A., T'so P.O.P., Kan L.S. "Triplex formation of oligonucleotides containing 2'-0-methyl-pseudoisocytidine in substitution for 2'-deoxycytidine. " J. Am. Chem. Soc. 1991, v. 113(10), pp. 4032-33.

135. Ono A., T'so P.O.P., Kan L.S. Triplex formation of an oligonucleotide containing 2'-0-methylpseudoisocytidine with a DNA duplex at neutral pH. J. Org. Chem., 1992, v. 57, N 11, pp. 3225-3230.

136. Davison E.C., Johnsson K. Triple helix binding of oligodeoxyribonucleotides containing 8-oxo-2'-deoxyadenosine. Nucleosides Nucleotides, 1993, v. 12, N 2, pp. 237-243.

137. Jetter M.C., Hobbs F.W. 7,8-dihydro-8-oxo-adenine as a replacement for cytosine in the third strand of triple helices. Triplex formation without hypochromicity. Biochemistry, 1993, v. 32, N 13, pp. 3249-3254.

138. Dervan P.B., Koh J.S. Design of an nonnatural deoxyribonucleoside for recognition of GC base pairs by oligonucleotide directed triple helix formation. J. Am. Chem. Soc., 1992, v. 114, N 4, pp. 1470-1478.

139. Xiang G., Soussou W., McLaughlin L.W. A New Pyrimidine Nucleoside (m5-oxC) for the pH-Independent Recognition of G-C Base Pairs by Oligonucleotide-Directed Triplex Formation (1994) J. Am. Chem. Soc., v. 116, N24, pp. 11155-11156.

140. Berressem R., Engels J.W. 6-Oxocytidine a novel protonated C-base analogue for stable triple helix formation. Nucleic Acids Res., 1995, v. 23, N 17, pp. 3465-3472.

141. Bédu E., Benhida R., Devys M., Fourrey J-L. Novel 2'-deoxycytidine analogues as pH independent substitutes of protonated cytosines in triple helix forming oligonucleotides. Tetrahedron Lett., 1999, v. 40, N 5, pp. 835838.

142. Prakash T.P., Barawkar D.A., Kumar V.A., Ganesh K.N. Synthesis of site-specific oligonucleotide-polyamine conjugates. Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, v. 4, N 14, pp. 1733-1738.

143. Rajeev K.G., Jadhav V.R., Ganesh K.N. Triplex formation at physiological pH: comparative studies on DNA triplexes containing 5-Me-dC tethered at N4 with spermine and tetraethyleneoxyamine. Nucleic Acids Res., 1997, v. 25, N21, pp. 4187-4193.

144. Goobes R., Minsky A. Thermodynamic aspects of triplex DNA formation in crowded environments. J. Am. Chem. Soc., 2001, v. 123, N 50, pp. 1269212693.

145. Griffin L.C., Dervan P.B. Recognition of thymine adenine.base pairs by guanine in a pyrimidine triple helix motif. Science, 1989, v. 245, N 4921, pp. 967-971.

146. Chandler S.P., Fox K.R. Triple helix formation at A8XA8.T8YT8. FEBS Lett., 1993, v. 332, N 1-2, pp. 189-192.

147. Fossella J.A., Kim Y.J., Shih H., Richards E.G., Fresco J.R. Relative specificities in binding of Watson-Crick base pairs by third strand residues in a DNA pyrimidine triplex motif. Nucleic Acids Res., 1993, v. 21, N 19, pp. 4511-4515.

148. Chandler S.P., Fox K.R. Specificity of antiparallel DNA triple helix formation. Biochemistry, 1996, v. 35, N 47, pp. 15038-15048.

149. Greenberg W.A., Dervan P.B. Energetics of Formation of Sixteen Triple Helical Complexes Which Vary at a Single Position Within a Purine Motif. J. Am. Chem. Soc., 1995, v. 117, N 18, pp. 5016-5022.

150. Miller P.S., Cushman C.D. Triplex formation by oligonucleotides involving the formation of XUA triads. Biochemistry, 1993, v. 32, N 12, pp. 2999-3004.

151. Rougee M., Faucon B., Mergny J.L., Barcelo F., Giovannangeli C., Garestier T., Helene C. Kinetics and thermodynamics of triple helix formation effects of ionic strength and mismatches. Biochemistry, 1992, v. 31, N 38, pp. 92699278.

152. Xodo L.E., Allunifabbroni M., Manzini G., Quadrifoglio F. Sequence specific DNA triplex formation at imperfect homopurine-homopyrimidine sequences within a DNA plasmid. Eur. J. Biochemistry, 1993, v. 212, N 2, pp. 395-401.

153. Roberts R.W., Crothers D.M. Specificity and stringency in DNA triplex formation. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 1991, v. 88, N 21, pp. 9397-9401.

154. Beal P.A., Dervan P.B. Influence of single base triplet changes on the stability of a PUR.PUR.PYR triple helix determined by affinity cleaving. Nucleic Acids Res., 1992, v. 20, N 11, pp. 2773-2776.

155. Pei D., Ulrich H.D., Schultz P.G. A combinatorial approach toward DNA recognition. Science, 1991, v. 253, N 5026, pp. 1408-1411.

156. Gowers D.M., Fox K.R. DNA triple helix formation at oligopurine sites containing multiple contiguous pyrimidines. Nucleic Acids Res., 1997, v. 25, N 19, pp. 3787-3794.

157. Kiessling L.L., Griffin L.C., Dervan P.B. Flanking sequence effects within the pyrimidine triple-helix motif characterized by affinity cleaving. Biochemistry, 1992, v. 31, N10, pp. 2829-2834.

158. Patel D.J. NMR assignment strategy for DNA protons through three-dimensional proton-proton connectivities. Application to an intramolecular triplex. J. Am. Chem. Soc., 1991, v. 113, N 22, pp. 8542.

159. Ji J., Hogan M.E., Gao X. Solution structure of an antiparallel purine motif triplex containing a T.CG pyrimidine base triple. Structure, 1996, v. 4, N 4, pp. 425-435.

160. Dittrich K„ Gu J., Tinder R., Hogan M., Gao X. T.C.G triplet in an antiparallel purine.purine.pyrimidine DNA triplex. Conformational studies by NMR. Biochemistry, 1994, v. 33, N 14, pp. 4111-4120.

161. Vasquez K.M., Wensel T.G., Hogan M.E., Wilson J.H. High-affinity triple helix formation by synthetic oligonucleotides at a site within a selectable mammalian gene. Biochemistry, 1995, v. 34, N 21, pp. 7243-7251.

162. Kandimalla E.R., Manning A.N., Venkataraman G., Sasisekharan V., Agrawal S. Single strand targeted triplex formation: targeting purine-pyrimidine mixed sequences using abasic linkers. Nucleic Acids Res., 1995, v. 23, N21, pp. 4510-4517.

163. Mayfield C., Ebbinghaus S., Gee J., Jones D., Rodu B., Squibb M., Miller D. Triplex formation by the human Ha-ras promoter inhibits Spl binding and in vitro transcription. J. Biol. Chem., 1994, v. 269, N 27, pp. 18232-18238.

164. Mayfield C., Miller D. Effect of abasic linker substitution on triplex formation, Spl binding, and specificity in an oligonucleotide targeted to the human Ha-ras promoter. Nucleic Acids Res., 1994, v. 22, N 10, pp. 19091916.

165. Home D.A., Dervan P.B. Recognition of mixed-sequence duplex DNA by alternate-strand triple helix formation. J. Am. Chem. Soc., 1990, v. 112, N 6, pp. 2435-2437.

166. Mccurdy S., Moulds C., Froehler B. Deoxyoligonucleotides with inverted polarity: synthesis and use in triple helix formation. Nucleosides Nucleotides, 1991, v. 10, N 1-3, pp. 287-290.

167. Froehler B., Terhorst T., Shaw J.P., Mccurdy S. Triple helix formation and cooperative binding by oligodeoxynucleotides with a 3'-3' internucleotide junction. Biochemistry, 1992, v. 31, N 6, pp. 1603-1609.

168. Hoshika S., Ueno Y., Matsuda A. Nucleosides and nucleotides. Part 218: Alternate-strand triple-helix formation by the 3-3 '-linked oligodeoxynucleotides using a purine motif. Bioconjugate Chem., 2003, v. 14, N 3, pp. 607-613.

169. Ono A., Chen C.N., Kan L.S. DNA triplex formation of oligonucleotide analogs consisting of linker groups and octamer segments that have opposite phosphate backbone polarities. Biochemistry, 1991, v. 30, N 41, pp. 99149921.

170. Ueno Y., Mikawa M., Hoshika S., Takeba M., Kitade Y., Matsuda A. Alternate-strand triple-helix formation by the 3-3'-linked oligodeoxynucleotides with the intercalators at the junction point. Nucleic Acids Res. Symp ser., 2001, v. 1, pp. 11-12.

171. De Napoli L., Messere A., Montesarchio D., Pepe A., Piccialli G., Varra M. Synthesis and Triple Helix Formation by Alternate Strand Recognition of Oligonucleotides Containing 3'-3' Phosphodiester Bonds. J. Org. Chem. 1997, v. 62, N 26, pp. 9024-9030.

172. Beal P.A., Dervan P.B. Recognition of double helical DNA by alternate strand triple helix formation. J. Am. Chem. Soc., 1992, v. 114, N 13, pp. 4976-4982.

173. Marchand C., Sun J.S., Bailly C., Waring M.J., Garestier T., Hélène C. Optimization of alternate-strand triple helix formation at the 5'CpG3' and 5'GpC3'junction steps. Biochemistry, 1998, v. 37, N 38, pp. 13322-13329.

174. Brodin P., Sun J.S., Mouscadet J.F., Auclair C. Optimization of alternatestrand triple helix formation at the 5"-TpA-3" and 5"-ApT-3" junctions. Nucleic Acids Res., 1999, v. 27, N 15, pp. 3029-3034.

175. Noonberg S.B., François J.C., Praseuth D., Guieysse-Peugeot A.L., Lacoste J., Garestier T., Hélène C. Triplex formation with alpha anomers of purine-rich and pyrimidine-rich oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res., 1995, v. 23, N 20, pp. 4042-4049.

176. Shinozuka K., Matsumoto N., Suzuki H., Moriguchi T., Sawai H. Alternate stranded triplex formation of chimeric DNA composed of tandem alpha- and beta-anomeric strands. Chem. Commun., 2002, N 22, pp. 2712-2713.

177. Moriguchi T., Azam Z., Shinozuka K. Synthesis and alternate-stranded triple helix forming ability of novel anthraquinone modified alpha-beta chimeric DNA. Nucleic Acids Res. Symp.Ser., 2005, N 49, pp. 7-8.

178. Azam Z., Hasegawa M., Moriguchi T., Shinozuka K. Synthesis and alternate-stranded triplex forming ability of novel -B chimeric oligonucleotides bearing an intercalator-conjugated nucleobase. Nucleic Acids Res. Symp.Ser., 2004, N 48, pp. 207-208.

179. Koshlap K.M., Gillespie P., Dervan P.B., Feigon J. Nonnatural deoxyribonucleoside D3 incorporated in an intramolecular DNA triplex binds sequence-specifically by intercalation. J. Am. Chem. Soc., 1993, v. 115, N 17, pp. 7908-7909.

180. Wang E., Koshlap K.M., Gillespie P., Dervan P.B., Feigon J. Solution structure of a pyrimidine-purine-pyrimidine triplex containing the sequence-specific intercalating non-natural base D3. J. Mol. Biol, 1996, v. 257, N 5, pp. 1052-1069.

181. Huang C.Y., Cushman C.D., Miller P.S. Triplex formation by an oligonucleotide containing N4-(3-acetamidopropyl)cytosine. J. Org. Chem. 1993, v. 58, N 19, pp. 5048-5049.

182. Huang C.Y., Miller P.S. Triplex formation by an oligodeoxyribonucleotide containing N4-(6-aminopyridinyl)-2'-deoxycytidine. J. Am. Chem. Soc., 1993, v. 115, N22, pp. 10456-10457.

183. Verma S., Miller P.S. Interactions of Cytosine Derivatives with T-A Interruptions in Pyrimidine-Purine-Pyrimidine DNA Triplexes. Bioconjugate Chem., 1996, v. 7, N 5, pp. 600-605.

184. Wang Y., Rusling D.A., Powers V.E., Lack O., Osborne S.D., Fox K.R., Brown T. Stable recognition of TA interruptions by triplex forming oligonucleotides containing a novel nucleoside. Biochemistry, 2005, v. 44, N 15, pp. 5884-5892.

185. Sollogoub M., Darby R.A.J., Cuenoud B., Brown T., Fox K. () Stable DNA triple helix formation using oligonucleotides containing 2'-aminoethoxy,5-propargylamino-U. Biochemistry, 2002, v. 41, N 23, pp. 7224-7231.

186. Puri N., Majumdar A., Cuenoud B., Miller P.S., Seidman M.M. () Importance of clustered 20-O-(2-aminoethyl) residues for gene targeting activity of triple helix formation. Biochemistry, 2004, v. 43, N 5, pp. 1343-1351.

187. Buchini S., Leumann C.J. Stable and selective recognition of three base pairs in the parallel triple-helical DNA binding motif. Angew. Chem. Int. Ed., 2004, v. 43, N30, pp. 3925-3928.

188. Durland R.H., Rao T.S., Bodepudi V., Seth D.M., Jayaraman K., Revankar G.R. Azole substituted oligonucleotides promote antiparallel triplexformation at non-homopurine duplex targets. Nucleic Acids Res., 1995, v. 23, N4, pp. 647-653.

189. Prévot-Halter I., Leumann C.J. Selective recognition of a C-G base-pair in the parallel DNA triple-helical binding motif. Bioorg. Med. Chem. Lett., 1999, v. 9, N 18, pp. 2657-2660.

190. Amosova O.A., Fresco J.R. A search for base analogs to enhance third-strand binding to 'inverted' target base pairs of triplexes in the pyrimidine/parallel motif. Nucleic Acids Res., 1999, v. 27, N 23, pp. 4632-4635.

191. Ranasinghe R.T., Rusling D.A., Powers V.E., Fox K.R., Brown T. Recognition of CG inversions in DNA triple helices by methylated 3H-pyrrolo2,3-d.pyrimidin-2(7H)-one nucleoside analogues. Chem. Comm., 2005, N20, pp. 2555-2557.

192. Rusling D.A., Powers V.E., Ranasinghe R.T., Wang Y., Osborne S.D., Brown T., Fox K.R. Four base recognition by triplex-forming oligonucleotides at physiological pH. Nucleic Acids Res., 2005, v. 33, N 9, pp. 3025-3032.

193. Sollogoub M., Domínguez B., Fox K.R., Brown T. () Synthesis of a novel bis-amino-modified thymidine monomer for use in DNA triplex stabilisation. Chem. Commun., 2000, N 23, pp. 2315-2316.

194. Mokhir A.A., Connors W.H., Richert C. Synthesis and monitored selection of nucleotide surrogates for binding T:A base pairs in homopurine-homopyrimidine DNA triple helices. Nucleic Acids Res., 2001, v. 29, N 17, pp. 3674-3684.

195. Sasaki S., Yamauchi H., Nagatsugi F., Takahashi R., Taniguchi Y., Maeda M. W-shape nucleic acid (WNA) for selective formation of non-natural antiparallel triplex including a TA interrupting site. Tetrahedron Lett., 2001, v. 42, N39, pp. 6915-6918.

196. Sasaki S., Yamauchi H., Takahasi R., Taniguchi Y., Maeda M. New base analogs for the formation of non-natural triplexes. Nucleic Asids Res. Symp. Ser., 2001, N 1, pp. 23-24.

197. Taniguchi Y., Nakamura A., Senko Y., Sasaki S. Effects of 5-substituted pyrimidine nucleoside bases of WNA on stability of triplex DNA. Nucleic Asids Res. Symp. Ser., 2004, N 48, pp. 69-70.

198. Taniguchi Y., Nakamura A., Senko Y., Nagatsugi F., Sasaki S. Effects of Halogenated WNA Derivatives on Sequence Dependency for Expansion of Recognition Sequences in Non-Natural-Type Triplexes. J. Org. Chem., 2006, v. 71, N5, pp. 2115-2122.

199. Aoki E., Taniguchi Y., Sasaki S. Effective strand invasion ODN incorporating a new bicyclic nucleoside analogue (WNA). Nucleic Asids Res. Symp. Ser., 2007, N 51, pp. 255-256.

200. Li J.-S., Fan Y.-H., Zhang Y., Marky L.A., Gold B. Design of Triple Helix Forming C-Glycoside Molecules. J. Am. Chem. Soc., 2003, v. 125, N 8, v. 2084-2093.

201. Li J.-S., Chen F.-X., Shikiya R., Marky L.A., Gold, B. Molecular Recognition via Triplex Formation of Mixed Purine/Pyrimidine DNA

202. Sequences Using OligoTRIPs. J. Am. Chem. Soc., 2005, v. 127, N 36, 1265712665.

203. Li J.-S., Gold B. Synthesis of C-Nucleosides Designed To Participate in Triplex Formation with Native DNA: Specific Recognition of an A:T Base Pair in DNA. J. Org. Chem., 2005, v. 70, N 22, pp. 8764-8771.

204. Doronina S.O., Behr J.-P. Towards a general triple helix mediated DNA recognition scheme. Chem. Soc. Rev., 1997, v. 26, N 1, pp. 63-71.

205. Doronina S.O., Behr J-P. Synthesis of 4-guanidinopyrimidine nucleosides for triple helix-mediated guanine and cytosine recognition. Tetrahedron Lett., 1998, v. 39, N7, pp. 547-550.

206. Timofeev E. N., Borisova O. F., Shchyolkina A. K. Structural Polymorphism of Oligo(dC) with Mixed a,)3-Anomeric Backbone. J. Biomol. Struct. Dyn., 2000, v. 17, N4, pp. 655-664.

207. Parel S.P., Leumann C.J. Triple-helix formation in the antiparallel binding motif of oligodeoxynucleotides containing N(9)- and N(7)-2-aminopurine deoxynucleosides. Nucleic Acids Res., 2001, v. 29, N 11, pp. 2260-2267.

208. Тимофеев Э.Н., Кочеткова C.B., Флорентьев B.JI. Исследование связывания неприродных а,р-олигоцитидилатов с дуплексами ДНК. Молекулярн. Биол., 2004, т. 38, N 3, с. 547-555.

209. Timofeev E.N., Goryaeva B.V., Florentiev V.L. Recognition of Base Pair Inversions in Duplex by Chimeric (a,p) Triplex-Forming Oligonucleotides. J. Biomol. Struct. Dyn., 2006, v. 24, N 2, pp. 183-188.

210. Li J.S., Shikiya R., Marky L.A., Gold B. Triple helix forming TRIPside molecules that target mixed purine/pyrimidine DNA sequences. Biochemistry, 2004, v. 43, N 6, pp. 1440-1448.

211. Gehring K., Leroy J.L., Guéron M. A tetrameric DNA structure with protonated cytosine.cytosine base pairs. Nature, 1993, v. 363, N 6429, pp. 561-565.

212. Leroy J.L., Gehring K., Kettani A., Guéron M. Acid multimers of oligodeoxycytidine strands: stoichiometry, base-pair characterization, and proton exchange properties. Biochemistry, 1993, v. 32, N 23, pp. 6019-6031.

213. Mergny J.L., Lacroix L. Kinetics and thermodynamics of i-DNA formation: phosphodiester versus modified oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res., 1998, v. 26, N 21, pp. 4797-4803.

214. Rush III T., Yong H., Peticolas W.L. Structure and stability of cytosine deoxyoligonucleotides multiplexes. Biopolymers, 1997, v. 41, N 2, pp. 121130.

215. Nielsen, P.E., Egholm, M., Berg, R.H. and Buchardt, O. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science, 1991, v. 254, N 5037, pp. 1497-1500.

216. Egholm, M., Buchardt, O., Nielsen, P.E. and Berg, R.H. Peptide nucleic acids (PNA). Oligonucleotide analogs with an achiral peptide backbone. J. Amer. Chem. Soc., 1992, v. 114, N5, pp. 1895-1897.

217. Nielsen P.E., Egholm M., Buchardt O. Evidence for (PNA)2/DNA triplex structure upon binding of PNA to dsDNA by strand displacement. J. Mol. Recognition, 1994, v. 7, N3, pp. 165-170.

218. Veselkov A.G., Demidov V.V., Frank-Kamenetskii M.D., Nielsen P.E. PNA as a rare genome-cutter. Nature, 1996, v. 379, N 6562, pp. 214.

219. Kuhn H., Demidov V.V., Nielsen P.E., Frank-Kamenetskii M.D. An experimental study of mechanism and specificity of peptide nucleic acid (PNA) binding to duplex DNA. J. Mol. Biol., 1999, v. 286, N 5, pp. 13371345.

220. Egholm M., Christensen L., Dueholm K.L., Buchardt O., Coull J., Nielsen P.E. Efficient pH-independent sequence-specific DNA binding by pseudoisocytosine-containing bis-PNA. Nucleic Acids Res., 1995, v. 23, N 2, pp. 217-222.

221. Griffith M.C., Risen L.M., Greig M.J., Lesnik E.A., Sprangle K.G., Griffey R.H., Kiely J.S., Freier S.M. Single and Bis Peptide Nucleic Acids as Triplexing Agents: Binding and Stoichiometry. J. Amer. Chem. Soc., 1995, v. 117, N2, pp. 831-832.

222. Bentin T., Hansen G.I., Nielsen P.E. Structural diversity of target-specific homopyrimidine peptide nucleic acid-dsDNA complexes. Nucleic Acids Res., 2006, v. 34, N 20, pp. 5790-5799.

223. Wittung, P., Nielsen, P.E. and Norden, B. Extended DNA-recognition repertoire of peptide nucleic acid (PNA): PNA-dsDNA triplex formed with cytosine-rich homopyrimidine PNA. Biochemistry, 1997, v. 36, N 26, pp. 7973-7979.

224. Lagriffoule P., Eriksson M., Jensen K.K., Nielsen P.E., Wittung P., Norden B., Buchardt O. Peptide Nucleic Acids with a Conformationally Constrained Chiral Cyclohexyl-Derived Backbone. Chem. Eur. J., 1997, v. 3, N 6, pp. 912-919.

225. Jordan S., Schwemler C., Kosch W., Kretschmer A., Stropp U., Schwenner E., Mielke B. New hetero-oligomeric peptide nucleic acids with improved binding properties to complementary DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett., 1997, v. 7, N 6, pp. 687-690.

226. Hyrup B., Egholm M., Buchardt O., Nielsen P.E. A flexible and positively charged PNA analogue with an ethylene-linker to the nucleobase: Synthesis and hybridization properties. Bioorg. Med. Chem. Lett., 1996, v. 6, N 10, pp. 1083-1088.

227. Nielsen P.E., Haaima G., Lohse A., Buchardt O. Peptide Nucleic Acids (PNAs) Containing Thymine Monomers Derived from Chiral Amino Acids: Hybridization and Solubility Properties of D-Lysine PNA. Angew. Chem. 1996, v. 35, N 17, pp. 1939-1941.

228. Püschl A., Sforza S., Haaima G., Dahl O., Nielsen P.E. Peptide nucleic acids (PNAs) with a functional backbone. Tetrahedron Lett., 1998, v. 39, N 26, pp. 4707-4710.

229. Efimov V.A., Choob M.V., Buryakova A.A., Kalinkina A.L., Chakhmakhcheva O.G. Synthesis and evaluation of some properties of chimeric oligomers containing PNA and phosphono-PNA residues. Nucleic Acids Res., 1998, v. 26, N 2, pp. 566-575.

230. Hyrup B., Egholm M., Nielsen P.E., Wittung P., Norden B., Buchardt O. Structure-Activity Studies of the Binding of Modified Peptide Nucleic Acids (PNAs) to DNA. J. Am. Chem. Soc., 1994, v. 116, N 18, pp. 7964-7970.

231. Fader L.D., Tsantrizos Y.S. Hybridization Properties of Aromatic Peptide Nucleic Acids: A Novel Class of Oligonucleotide Analogues. Org. Lett., 2002, v. 4, N 1, pp. 63-66.

232. Harada H., Funayama S., Shoji Y., Wada T. Solid-phase synthesis and properties of chiral peptide nucleic acids bearing cationic side chains Nucleic Acids Res. Symp.Ser., 2007, N 51, pp. 259-260.

233. Fader L.D., Boyd M., Tsantrizos Y.S. Backbone Modifications of Aromatic Peptide Nucleic Acid (APNA) Monomers and Their Hybridization Properties with DNA and RNA. J. Org Chem., 2001, v. 66, N 10, pp. 3372-3379.

234. D'Costa M., Kumar V.A., Ganesh K.N. Aminoethylprolyl Peptide Nucleic Acids (aepPNA): Chiral PNA Analogues That Form Highly Stable DNA:aepPNA2 Triplexes. Org. Lett., 1999, v. 1, N 10, pp. 1513-1516.

235. Singh S.K., Nielsen P., Koshkin A.A., Olsen C.E., Wengel J. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chem. Commun., 1998, N 4, pp. 455-456.

236. Koshkin A.A., Singh S.K., Nielson P., Rajwanshi V.K., Kumar R., Meldgaard M., Olsen C.E., Wengel J. LNA (Locked Nucleic Acids):

237. Synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5-methylcytosine, thymine and uracil bicyclonucleoside monomers, oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition. Tetrahedron, 1998, v. 54, N 14, pp. 3607-3630.

238. Koshkin A.A., Nielson P., Meldgaard M., Rajwanshi V.K., Singh S.K., Wengel J. LNA (Locked Nucleic Acid): An RNA Mimic Forming Exceedingly Stable LNA:LNA Duplexes. J. Am Chem. Soc., 1998, v. 120, N 50, pp. 13252-13253.

239. Singh S.K., Wengel J. Universality of LNA-mediated high-affinity nucleic acid recognition. Chem. Commun., 1998, N 12, pp. 1247-1248.

240. Wengel J. Synthesis of 3'-C- and 4'-C-Branched Oligodeoxynucleotides and the Development of Locked Nucleic Acid (LNA). Acc. Chem. Res., 1999, v. 32, N4, pp. 301-310.

241. Obika S., Nanbu D., Hari Y., Morio K., In Y., Ishida T., Imanishi T. Synthesis of 2'-0,4'-C-methyIeneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3, -endo sugar puckering. Tetrahedron Lett., 1997, v. 38, N 50, pp. 8735-8738.

242. Kaur H., Babu B.R., Maiti S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA)., 2007, v. 107, N 11, pp. 46724697.

243. Sorensen J.J., Nielsen J.T., Petersen M. Solution structure of a dsDNA:LNA triplex. Nucleic Acids Res., 2004, v. 32, N 20, pp. 6078-6085.

244. Obika S., Hari Y., Sugimoto T., Sekiguchi M., Imanishi T. Triplex-forming enhancement with high sequence selectivity by single 2'-0,4'-C-methylene bridged nucleic acid (2',4'-BNA) modification. Tetrahedron Lett., 2000, v. 41, N46, pp. 8923-8927.

245. Koizumi M., Morita K., Daigo M., Tsutsumi S., Abe K., Obika S., Imanishi T. Triplex formation with 2'-0,4'-C-ethylene-bridged nucleic acids (ENA) having C3'-endo conformation at physiological pH. Nucleic Acids Res., 2003, v. 31, N 12, pp. 3267.

246. Torigoe H., Nagasawa N. Effect of ENA modification of triplex-forming oligonucleotide on pyrimidine motif triplex formation. Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 2007, N 51, pp. 161-162.

247. Obika S., Uneda T., Sugimoto T., Nanbu D., Minami T., Doi T., Imanishi T. 2'-0,4'-C-methylene bridged nucleic acid (2',4'-BNA): synthesis and triplex-forming properties. Bioorg. Med. Chem., 2001, v. 9, N 4, pp. 1001-1011.

248. Kumar N., Nielsen K.E., Maiti S., Petersen M. Triplex Formation with a-L-LNA (-L-Ribo-Configured Locked Nucleic Acid). J. Am. Chem. Soc., 2006, v. 128, N 1, pp. 14-15.

249. Nielsen J.T., Stein P.C., Petersen M. NMR structure of an alpha-L-LNA:RNA hybrid: structural implications for RNase H recognition. Nucleic Acids Res., 2003, v. 31, N 20, pp. 5858-5867.

250. Torigoe H., Hari Y., Obika S., Imanishi T. Triplex formation involving 2',4'-BNA with 2-pyridone base analogue: Efficient and selective recognition of C:G interruption Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 2001, N 1, pp. 281-282.

251. Obika S., Hari Y., Inohara H., Imanishi T. 2', 4'-BNA bearing unnatural nucleobases: Toward the expansion of the target sequence of double-stranded DNA in triplex formation Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 2001, N 1, pp. 171172.

252. Inohara H., Obika S., Imanishi T. 2',4-BNA derivatives bearing an unnatural nucleobase: Synthesis and application to triplex-forming oligonucleotides Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 2004, N 48, pp. 63-64.

253. Matsugu S., Inohara H., Obika S., Imanishi T. Synthesis and triplex-forming properties of 2',4-BNA derivatives bearing pyridines as an unnatural nucleobase. Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 2005, N 49, pp. 159-60.

254. Katayama T., Maruyama A., Obika S., Imanishi T., Torigoe H. Synergistic stabilization of triplex by combination of comb-type cationic copolymer and 2',4'-BNA. Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 2004, N 48, pp. 139-140.

255. Cuenoud B., Casset F., Hüsken D., Natt F., Wolf R.M., Altmann K., Martin P., Moser H. Dual Recognition of Double-Stranded DNA by 2-Aminoethoxy-Modified Oligonucleotides. Ang. Chem. Int. Ed. Eng., 1998, v. 37, N 9, pp. 1288-1291.

256. Puri N., Majumdar A., Cuenoud B., Natt F., Martin P., Boyd A., Miller P.S., Seidman M.M. Targeted gene knockout by 2'-0-aminoethyl modified triplex forming oligonucleotides. J. Biol. Chem., 2001, v. 276, N 31, pp. 2899128998.

257. Prakash T., Püschl A., Lesnik E., Mohan V., Tereshko V., Egli M., Manoharan M. 2'-0-2-(Guanidinium)ethyl.-Modified Oligonucleotides: Stabilizing Effect on Duplex and Triplex Structures. Org. Lett., 2004, v. 6, N 12, pp. 1971-1974.

258. Gryaznov S., Chen J.-K. Oligodeoxyribonucleotide N3'-P5' Phosphoramidates: synthesis and Hybridization Properties. J. Am. Chem. Soc., 1994, v. 116, N7, pp. 3143-3144.

259. Gryaznov S.M., Lloyd D.H., Chen J.K., Schultz R.G., DeDionisio L.A., Ratmeyer L., Wilson W.D. Oligonucleotide N3'—>P5' phosphoramidates. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA)., 1995, v. 92, N 13, pp. 5798-5802.

260. Giovannangeli C., Perrouault L., Escudé C., Gryaznov S., Hélène C. Efficient inhibition of transcription elongation in vitro by oligonucleotide phosphoramidates targeted to proviral HIV DNA. J. Mol. Biol., 1996, v. 261, N 3, pp. 386-398.

261. Torigoe H. Thermodynamic and kinetic effects of N3'—>P5' phosphoramidate modification on pyrimidine motif triplex DNA formation. Biochemistry, 2001, v. 40, N4, pp. 1063-1069.

262. Tereshko V., Gryaznov S., Egli M. Consequences of Replacing the DNA 3'-Oxygen by an Amino Group: High-Resolution Crystal Structure of a Fully Modified N3' —> P5' Phosphoramidate DNA Dodecamer Duplex. J. Am. Chem. Soc., 1998, v. 120, N 2, pp. 269-283.

263. Ding D., Grayaznov S.M., Lloyd D.H., Chandrasekaran S., Yao S., Ratmeyer L., Pan Y., Wilson W.D. An oligodeoxyribonucleotide N3'—> P5' phosphoramidate duplex forms an A-type helix in solution. Nucleic Acids Res., 1996, v. 24, N 2, pp. 354-360.

264. Ding D., Gryaznov S. M., Wilson W. D. NMR Solution Structure of the N3' P5' Phosphoramidate Duplex d(CGCGAATTCGCG)2 by the Iterative Relaxation Matrix Approach. Biochemistry, 1998, v. 37, N 35, pp. 1208212093.

265. Torigoe H., Maruyama A. Synergistic Stabilization of Nucleic Acid Assembly by 01igo-N3'P5' Phosphoramidate Modification and Additions of Comb-type Cationic Copolymers. J. Am. Chetn. Soc., 2005, v. 127, N 6, pp. 1705-1710.

266. Torigoe H., Akaike T., Maruyama A. Synergistic stabilization of triplex by combination of comb-type cationic copolymer and oligo-N3'P5' phosphoramidates. Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 2001, N 1, pp. 195-196.

267. Vasquez K.M., Dagle J.M., Weeks D.L., Glazer P.M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J. Biol. Chem., 2001, v. 276, N 42, pp. 38536-38541.

268. Michel T., Debart F., Heitz F., Vasseur J. Highly Stable DNA Triplexes Formed with Cationic Phosphoramidate Pyrimidine -Oligonucleotides. Chembiochem, 2005, v. 6, N 7, pp. 1254-1262.

269. Dagle J.M., Weeks D.L. Positively charged oligonucleotides overcome potassium-mediated inhibition of triplex DNA formation. Nucleic Acids Res., 1996, v. 24, N 11, pp. 2143-2149.

270. Robles J., Ibanez V., Grandas A., Pedroso E. Synthesis and triple helix-forming ability of oligonucleotides with N,N-dimethylaminoethyl phosphoramidate linkages. Tetrahedron Lett., 1999, v. 40, N 39, pp. 71317134.

271. Basye J., Trent J.O., Gao D., Ebbinghaus S.W. Triplex formation by morpholino oligodeoxyribonucleotides in the HER-2/neu promoter requires the pyrimidine motif. Nucleic Acids Res., 2001, v. 29, N 23, pp. 4873-4880.

272. Roig V. Asseline U. 01igo-2'-deoxyribonucleotides Containing Uracil Modified at the 5-Position with Linkers Ending with Guanidinium Groups. J. Am. Chem Soc., 2003, v. 125, N 15, pp. 4416-4417.

273. Klysik J., Kinsey B.M., Hua P., Glass G.A., Orson F.M. A 15-Base Acridine-Conjugated Oligodeoxynucleotide Forms Triplex DNA with Its IL-2R Promoter Target with Greatly Improved Avidity. Bioconjugate Chem., 1997, v. 8, N3, pp.318-326.

274. Ono A. Synthesis and characterization of oligodeoxyribonucleotides carrying arrays of intercalating groups Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 2001, N 1, pp. 109-110.

275. Gianolio D.A., Segismundo J.M., McLaughlin L.W. Tethered naphthalene diimide-based intercalators for DNA triplex stabilization. Nucleic Acids Res., 2000, v. 28, N 10, pp. 2128-2134.

276. Maruyama A., Saito M., Ueda M., Yamada M., Watanabe II., Akaike T. Preparation and evaluation of ODN conjugates with polycation comb-type copolymer. Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 1999, N 42, pp. 97-98.

277. Ueda M., Saito M., Ishihara T., Akaike T., Maruyama A. Triplex formation using ODN conjugates with polycation comb-type copolymer. Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 2000, N 44, pp. 209-210.

278. Tung C., Breslauer K.J., Stein S. Stabilization of DNA Triple-Helix Formation by Appended Cationic Peptides. Bioconjugate Chem., 1996, v. 7, N5, pp. 529-531.

279. Lee I., Deng W., Yang L., Wang C., Bai C. Biphasic transitions of a hairpin hexanucleotide triplex DNA. Biophys Chem., 1997, v. 67, N 1-3, pp. 159-165.

280. Pasternack L.B., Lin S.B., Chin T.M., Lin W.C., Huang D.H., Kan L.S. Proton NMR studies of 5'-d-(TC)(3) (CT)(3) (AG)(3)-3'-a paperclip triplex: the structural relevance of turns. Biophys. J., 2002, v. 82, N 6, pp. 3170-3180.

281. Gondeau C., Maurizot J.C., Durand M. Spectroscopic studies on ethidium bromide binding to intramolecular parallel and antiparallel triple helices containing T*A:T and G*G:C triplets. J. Biomol. Struct. Dyn., 2000, v. 17, N 5, pp. 879-886.

282. Powell S.W., Jiang L., Russu I.M. Proton exchange and base pair opening in a DNA triple helix. Biochemistry, 2001, v. 40, N 37, pp. 11065-11072.

283. Kan L.S., Pasternack L., Wey M.T., Tseng Y.Y., Huang D.H. The paperclip triplex: understanding the role of apex residues in tight turns. Biophys. J., 2006, v. 91, N 7, pp. 2552-2563.

284. Hoyne P.R., Gacy A.M., McMurray C.T., Maher L.J. Stabilities of intrastrand pyrimidine motif DNA and RNA triple helices. Nucleic Acids Res., 2000, v. 28, N 3, pp. 770-775.

285. Tarkoy M., Phipps A.K., Schultze P., Feigon J. Solution structure of an intramolecular DNA triplex linked by hexakis(ethylene glycol) units: d(AGAGAGAA-(EG)6-TTCTCTCT-(EG)6-TCTCTCTT). Biochemistry, 1998, v. 37, N 17, pp. 5810-5819.

286. Shibata A., Ueno Y., Matsuda A., Kitade Y. Synthesis and properties of double-stranded antisense oligonucleotides connected with a pentaerythritol linker. Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 2006, N 50, pp. 73-74.

287. Trkulja I., Haner R. Monomeric and heterodimeric triple helical DNA mimics. J. Am. Chem. Soc., 2007, v. 129, N 25, pp. 7982-7989.

288. Davis J.T. G-quartets 40 years later: from 50-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 2004, v. 43, N 6, pp. 668-698.

289. Arimondo P.B., Barcelo F., Sun J.S., Maurizot J.C., Garestier T. Helene, C. () Triple helix formation by (G,A)-containing oligonucleotides: asymmetric sequence effect. Biochemistry, 1998, v. 37, N 47, pp. 16627-16635.

290. Cheng A.J., Van Dyke M.W. Monovalent cation effects on intermolecular purine-purine-pyrimidine triple-helix formation. Nucleic Acids Res., 1993, v. 21, N24, pp. 5630-5635.

291. Burge S., Parkinson G.N., Hazel P., Todd A.K., Neidle S. Quadruplex DNA: sequence, topology and structure. Nucleic Acids Res., 2006, v. 34, N 19, pp. 5402-5415.

292. Olivas W.M., Maher L.J. Overcoming potassium-mediated triplex inhibition. Nucleic Acids Res., 1995, v. 23, N 11, pp. 1936-1941.

293. Seela F., Mersmann K. 7-Deazaguanosine: Synthesis of an oligorbonucleotide building block and disaggregation of the U-G-G-G-G-U G4 structure by the modified base. Helv. Chim. Acta, 1993, v. 76, N 4, pp. 1435-1449.

294. Milligan J.F., Krawczyk S.H., Wadwani S., Matteucci M.D. An anti-parallel triple helix motif with oligodeoxynucleotides containing 2'-deoxyguanosine and 7-deaza-2'-deoxyxanthosine. Nucleic Acids Res., 1993, v. 21, N 2, pp. 327-333.

295. Pei D., Corey D.R., Schultz P.G. Site-specific cleavage of duplex DNA by a semisynthetic nuclease via triple-helix formation. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1990, v. 87, N 24, pp. 9858-9862.

296. Strobel S.A., Moser H.E., Dervan P.B. Double strand cleavage of genomic DNA at a single site by triple helix formation. J. Am. Chem. Soc., 1988, v. 110, N23, pp. 7927-7929.

297. Eisenschmidt K., Lanio T., Simoncsits A., Jeltsch A., Pingoud V., Wende W., Pingoud A. Developing a programmed restriction endonuclease for highly specific DNA cleavage. Nucleic Acids Res., 2005, v. 33, N 22, pp. 70397047.

298. Grant K.B., Dervan P.B. Sequence-specific alkylation and cleavage of DNA mediated by purine motif triple helix formation. Biochemistry, 1996, v. 35, N 38, pp. 12313-12319.

299. Povsic T.J. Dervan P.B. Sequence-specific alkylation of double-helical DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation J. Am. Chem. Soc., 1990, v. 112, N25, pp. 9428-9430.

300. François J.C., Saison-Behmoaras T., Chassignol M., Thuong N.T., Helene C. Sequence-targeted eleavage of single- and double-stranded DNA by oligothymidylates covalently linked to 1,10-phenanthroline. ,/. Biol. Chem., 1989, v. 264, N 10, pp. 5891-5898.

301. Bigey P., Pratviel G., Meunier B. Cleavage of double-stranded DNA by 'metalloporphyrin-linker-oligonucleotide' molecules: influence of the linker. Nucleic Acids Res., 1995, v. 23, N 19, pp. 3894-3900.

302. Havre P.A., Gunther E.J., Gasparro F.P., Glazer P.M. Targeted mutagenesis of DNA using triple helix-forming oligonucleotides linked to psoralen. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1993, v. 90, N 16, pp. 7879-7883.

303. Havre P.A., Glazer P.M. Targeted mutagenesis of simian virus 40 DNA mediated by a triple helix-forming oligonucleotide. J. Vir., 1993, v. 67, N 12, pp. 7324-7331.

304. Wang G., Levy D.D., Seidman M.M., Glazer P.M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol. Cell Biol.; 1995, v. 15, N 3, pp. 1759-1768.

305. Vasquez K.M., Wang G., Havre P.A., Glazer P.M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res., 1999, v. 27, N 4, pp. 1176-1181.

306. Intody Z., Perkins B.D., Wilson J.H., Wensel T.G. Blocking transcription of the human rhodopsin gene by triplex-mediated DNA photocrosslinking. Nucleic Acids Res., 2000, v. 28, N 21, pp. 4283-4290.

307. Guillonneau F., Guieysse A.L., Nocentini S., Giovannangeli C., Praseuth D. Psoralen interstrand cross-link repair is specifically altered by an adjacent triple-stranded structure. Nucleic Acids Res., 2004, v. 32, N 3, N 1143-1153.

308. Thoma B.S., Wakasugi M., Christensen J., Reddy M.C., Vasquez K.M. Human XPC-hHR23B interacts with XPA-RPA in the recognition of triplex-directed psoralen DNA interstrand crosslinks. Nucleic Acids Res., 2005, v. 33, N9, pp. 2993-3001.

309. Liu Y., Nairn R.S., Vasquez K.M. Processing of triplex-directed psoralen DNA interstrand crosslinks by recombination mechanisms. Nucleic Acids Res., 2008, v. 36, N 14, pp. 4680-4688.

310. Ping Y.H., Rana T.M. Mechanism of site-specific psoralen photoadducts formation in triplex DNA directed by psoralen-conjugated oligonucleotides. Biochemistry, 2005, v. 44, N 7, pp. 2501-2509.

311. Lampe J.N., Kutyavin I.V., Rhinehart R., Reed M.W., Meyer R.B., Gamper H.B. Factors influencing the extent and selectivity of alkylation within triplexes by reactive G/A motif oligonucleotides. Nucleic Acids Res., 1997, v. 25, N20, pp. 4123-4131.

312. Reed M.W., Lukhtanov E.A., Gorn V., Kutyavin I., Gall A., Wald A., Meyer R.B. Synthesis and Reactivity of Aryl Nitrogen Mustard-Oligodeoxyribonucleotide Conjugates. Bioconjugate Chem., 1998, v. 9, N 1, pp. 64-71.

313. Zhou Q., Pande P., Johnson A.E., Rokita S.E. Sequence-specific delivery of a quinone methide intermediate to the major groove of DNA. Bioorg. Med. Chem., 2001, v. 9, N 9, pp. 2347-2354.

314. Nagatsugi F., Sasaki S., Miller P.S., Seidman M.M. Site-specific mutagenesis by triple helix-forming oligonucleotides containing a reactive nucleoside analog. Nucleic Acids Res., 2003, v. 31, N 6, pp. e31.

315. Dieter-Wurm I., Sabat M., Lippert B. Model for a platinated DNA triplex: Watson-Crick and metal-modified Hoogsteen pairing. J. Am. Chem. Soc., 1992, v. 114, N 1, pp. 357-358.

316. Colombier C., Lippert B., Leng M. Interstrand cross-linking reaction in triplexes containing a monofunctional transplatin-adduct. Nucleic Acids Res. 1996, v. 24, N 22, pp. 4519-4524.

317. Sharma S.K. McLaughlin L.W. Cross-Linking of a DNA Conjugate Tethering a cis-Bifunctional Platinated Complex to a Target DNA Duplex. J. Am. Chem. Soc., 2002, v. 124, N 33, pp. 9658-9659.

318. Nagatsugi F., Sasaki S. Chemical tools for targeted mutagenesis of DNA based on triple helix formation. Biol. Pharm. Bull., 2004, v. 27, N 4, pp. 463467.

319. Dagle J.M., Weeks D.L. Oligonucleotide-based strategies to reduce gene expression. Differentiation, 2001, v. 69, N 2-3, pp. 75-82.

320. Duca M., Vekhoff P., Oussedik K., Halby L., Arimondo P.B. The triple helix: 50 years later, the outcome. Nucleic Acids Res., 2008, v. 36, N 16, pp. 51235138.

321. Knauert M.P., Glazer P.M. Triplex forming oligonucleotides: sequence-specific tools for gene targeting. Human Molec. Genetics, 2001, v. 10, N 20, pp.2243-2251.

322. Chan P.P., Glazer P.M. Triplex DNA: fundamentals, advances, and potential applications for gene therapy. J. Mol. Medicine, 1997, v. 75, N 4, pp. 267282.

323. Uil T.G., Haisma H.J., Rots M.G. Therapeutic modulation of endogenous gene function by agents with designed DNA-sequence specificities. Nucleic Acids Res., 2003, v. 31, N 21, pp. 6064-6078.

324. Wu B., Moulton H.M., Iversen P.L., Jiang J., Li J., Li J., Spurney C.F., Sali

325. A., Guerron A.D., Nagaraju K., Doran T., Lu P., Xiao X., Lu Q.L. Effective rescue of dystrophin improves cardiac function in dystrophin-deficient mice by a modified morpholino oligomer. Proc. Nad. Acad. Sci. (USA), 2008, v. 105, N39, pp. 14814-14819.

326. Deshayes S., Simeoni F., Morris M.C., Divita G., Heitz F. Peptide-mediated delivery of nucleic acids into mammalian cells. Methods Mol Biol., 2007, v. 386, pp. 299-308.

327. Stewart K.M., Horton K.L., Kelley S.O. Cell-penetrating peptides as delivery vehicles for biology and medicine. Org. Biomol. Chem., 2008, v. 6, N 13, pp. 2242-2255.

328. Jeong H.S., Seo Y.J., Bang E.K., Hwang G.T., Jung J.H., Jang S.K., Kim

329. B.H. Cholesterol-linked pyrene excimer molecular beacon with enhanced cell permeability. Nucleic Acids Symp Ser., 2008, N 52, pp. 351-352.

330. Mehiri M., Upert G., Tripathi S., Di Giorgio A., Condom R„ Pandey Y.N., Patino N. An efficient biodelivery system for antisense polyamide nucleic acid (PNA). Oligonucleotides, 2008, v. 18, N 3, pp. 245-256.

331. Lutz G.J., Sirsi S.R., Williams J.H. PEG-PEI copolymers for oligonucleotide delivery to cells and tissues. Methods Mol. Biol., 2008, v. 433, pp. 141-158.

332. Godeau G., Staedel C., Barthélémy P. Lipid-conjugated oligonucleotides via "click chemistry" efficiently inhibit hepatitis C virus translation. J. Med. Chem., 2008, v. 51, N 15, pp. 4374-4376.

333. Moreira J.N., Santos A., Moura V., Pedroso de Lima M.C., Simoes S. Non-viral lipid-based nanoparticles for targeted cancer systemic gene silencing. J. Nanosci. Nanotechnol., 2008, v.8, N 5, pp. 2187-2204.

334. Liu Y., Franzen S. Factors determining the efficacy of nuclear delivery of antisense oligonucleotides by gold nanoparticles. Bioconjugate Chem., 2008, v. 19, N5, pp. 1009-1016.

335. Timofeev E., Mirzabekov A. Binding specificity and stability of duplexes formed by modified oligonucleotides with a 4096-hexanucleotide microarray. Nucleic Acids Res., 2001, v. 29, N 12, pp. 2626-2634.

336. Vasiliskov V.A., Prokopenko D.V., Mirzabekov A.D. Parallel multiplex thermodynamic analysis of coaxial base stacking in DNA duplexes by oligodeoxyribonucleotide microchips. Nucleic Acids Res., 2001, v. 29, N 11, pp. 2303-2313.

337. Maskos U., Southern E. Oligonucleotide hybridisations on glass supports: a novel linker for oligonucleotide synthesis and hybridisation properties of oligonucleotides synthesised in situ. Nucleic Acids Res., 1992, v. 20, N 7, pp. 1679-1784.

338. Pease A.C., Solas D., Sullivan E.J., Cronin M.T., Holmes C.P., Fodor S.P.A. Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc. Natl. Acad Sci. (USA), 1994, v. 91, N 11, pp. 5022-5026.

339. Khrapko K.A., Lysov Yu., Khorlin A., Shick V., Florentiev V., Mirzabekov, A. An oligonucleotide hybridization approach to DNA sequencing. FEBS Lett., 1989, 256, N 1-2, pp. 118-122.

340. Livshits M., Florentiev V., Mirzabekov A. Dissociation of duplexes formed by hybridization of DNA with gel-immobilized oligonucleotides. J. Biomol. Struct. Dyn., 1994, v. 11, N 4, pp. 783-795.

341. Inman J.K., Dintzis H.M. The derivatization of cross-linked polyacrylamide beads. Controlled introduction of functional groups for the preparation ofspecial-purpose, biochemical adsorbents. Biochemistry, 1969, v. 8, N 10, pp. 4074-4082.

342. Narang C.K., Brunfeldt K., Norris K. Oligonucleotide synthesis on a crosslinked polyacrylmorpholide support. Tetrahedron Lett., 1977, v. 18, N 21, pp. 1819-1822.

343. Otsuka E., Takashima H., Ikehara M. Solid phase synthesis of ribo-oligonucleotides on a polyacrylmorpholide support. Tetrahedron Lett., 1981, v. 22, N 8, pp. 765-768.

344. Saunders S.W.H., Cockerill C.A.F. Mechanism of Elimination Reactions. 1973, John Wiley and Sons, NY.

345. Ivanov I., Khrapko K., Chernyi A., Khorlin A., Lysov Yu., Florentiev V., Mirzabekov A. Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 1991, N 24, pp. 189-190.

346. Guschin D., Yershov G., Zaslavsky A., Gemmell A., Shick V., Proudnikov D., Arenkov P., Mirzabekov A. Manual manufacturing of oligonucleotide, DNA, and protein microchips. Anal. Biochemistry, 1997, v. 250, N 2, pp. 203-211.

347. Pernov A., Modi H., Chandler D.P., Bavykin S. DNA analysis with multiplex microarray-enhanced PCR. Nucleic Acids Res., 2005, v. 33, N 2, pp. el 1.

348. Dubiley S., Kirillov E., Lysov Y., Mirzabekov A. Fractionation, phosphorylation and ligation on oligonucleotide microchips to enhance sequencing by hybridization. Nucleic Acids Res., 1997, v. 25, N 12, pp. 22592265.

349. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K. in Current Protocols in Molecular Biology, v. 1, pp. 2.9.12.10.16, Wiley, New-York, 1994.

350. Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996.

351. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

352. Drobyshev A., Mologina N., Shik V., Pobedimskaya D., Yershov G., Mirzabekov A. Sequence analysis by hybridization with oligonucleotide microchip: identification of beta-thalassemia mutations. Gene, 1997, v. 188, N 1, pp. 45-52.

353. Guschin D.Y., Mobarry B.K., Proudnikov D., Stahl D.A., Rittmann B.E., Mirzabekov A.D. Oligonucleotide microchips as genosensors for determinative and environmental studies in microbiology. Appl Environ Microbiol., 1997, v. 63, N 6, pp. 2397-2402.

354. Suzuki T., Ohsumi S., Makino K. Mechanistic studies on depurination and apurinic site chain breakage in oligodeoxyribonucleotides. Nucleic Acids Res., 1994, v. 22, N 23, pp. 4997-5003.

355. Lindahl T., Nyberg B. Rate of depurination of native deoxyribonucleic acid. Biochemistry, 1972, v. 11, N 19, pp. 3610-3618.

356. Kochetkov N.K., Budovskii E.I. Organic Chemistry of Nucleic Acids, Plenum, New York, 1976.

357. Gilbert W., Maxam A, Mirzabekov A. in Control of Ribosome Synthesis (Kjeldgaarg N.O. and Maaloe O. Eds.) pp. 139-148, Munksgaard, Copenhsgen, 1976.

358. Maxam A., Gilbert W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages. Methods Enzymol., 1980, v. 65, pp. 499-560.

359. Proudnikov D., Mirzabekov A. Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling. Nucleic Acids Res., 1996, v. 24, N 22, pp. 4535-4542.

360. Mirzabekov A.D., Bavykin S.G., Belyavsky A.V., Karpov V.L., Preobrazhenskaya O.V., Shick V.V., Ebralidse K.K. Mapping DNA-protein interactions by cross-linking. Methods Enzymol., 1989, v. 170, pp. 386-408.

361. McHugh P.J., Knowland J. Novel reagents for chemical cleavage at abasic sites and UV photoproducts in DNA. Nucleic Acids Res., 1995, v. 23, N 10, pp. 1664-1670.

362. Narang C.K., Brunfeldt K., Nortis K.E. Oligonucleotide synthesis on a crosslinked polyacrylmorpholide support. Tetrahedron Lett., 1977, v. 18, N 21, pp. 1819-1822.

363. Ohtsuka E., Takashima H., Ikehara M. Solid phase synthesis of ribo-oligonucleotides on a polyacrylmorpholide support. Tetrahedron Lett., 1981, v. 22, N 8, pp. 765-768.

364. Miyoshi K., Itakura K. Solid phase synthesis of nonadecathymidylic acid by the phosphotriester approach. Tetrahedron Lett., 1979, v. 20, N 38, pp. 36353638.

365. Timofeev E., Kochetkova S.V., Mirzabekov A.D., Florentiev V.L. Regioselective immobilization of short oligonucleotides to acrylic copolymer gels. Nucleic Acids Res., 1996, v. 24, N 16, pp. 3142-3148.

366. Righetti P.G., Brost B.C.W., Snyder R.S. On the limiting pore size of hydrophilic cells for electrophoresis and isoelectric focusing. J. Biochemistry Biophys. Meth., 1981, v. 4, N 5-6, pp. 347-363.

367. Fotin A.V., Drobyshev A.L., Proudnikov D.Y., Perov A.N., Mirzabekov A.D. Parallel thermodynamic analysis of duplexes on oligodeoxyribonucleotide microchips. Nucleic Acids Res., 1998, v. 26, N 6, pp. 1515-1521.

368. Weiler J., Gausepohl H., Hauser N., Jensen O.N., Hoheisel J.D. Hybridisation based DNA screening on peptide nucleic acid (PNA) oligomer arrays. Nucleic Acids Res., 1997, v. 25, N 14, pp. 2792-2799.

369. Kutyavin I.V., Rhinehart R.L., Lukhtanov E.A., Gorn V.V., Meyer R.B., Gamper H.B. Oligonucleotides containing 2-aminoadenine and 2-thiothymineact as selectively binding complementary agents. Biochemistry, 1996, v. 35, N34, pp. 11170-11176.

370. Bailly C., Waring M.J. The use of diaminopurine to investigate structural properties of nucleic acids and molecular recognition between ligands and DNA. Nucleic Acids Res., 1998, v. 26, N 19, pp. 4309-4314.

371. Chazin W.J., Ranee M., Chollet A., Leupin W. Comparative NMR analysis of the decadeoxynucleotide d-(GCATTAATGC)2 and an analogue containing 2-aminoadenine. Nucleic Acids Res., 1991, v. 19, N 20, pp. 5507-5513.

372. Hoheisel J.D., Lehrach H. Quantitative measurements on the duplex stability of 2,6-diaminopurine and 5-chloro-uracil nucleotides using enzymatically synthesized oligomers. FEBSLett., 1990, v. 274, N 1-2, pp. 103-106.

373. Chollet A., Kawashima E. DNA containing the base analogue 2-aminoadenine: preparation, use as hybridization probes and cleavage by restriction endonucleases. Nucleic Acids Res., 1988, v. 16, N 1, pp. 305-317.

374. Cheong C., Tinoco I., Chollet A. Thermodynamic studies of base pairing involving 2,6-diaminopurine. Nucleic Acids Res., 1988, v. 16, N 11, pp. 51155122.

375. Howard F.B., Miles H.T. Poly(2-aminodeoxyadenylic acid): circular dichroism and thermal stability of its complexes and their relevance to phage DNA in which a is replaced by 2NH2A. Biopolymers, 1983, v. 22, N 2, pp. 597-600.

376. Inoue H., Hayase Y., Imura A., Iwai S., Miura K., Ohtsuka E. Synthesis and hybridization studies on two complementary nona(2'-0-methyl)ribonucleotides. Nucleic Acids Res., 1987, v. 15, N 15, pp. 61316148.

377. Cullen B.R., Bick M.D. Thermal denaturation of DNA from bromodeoxyuridine substituted cells. Nucleic Acids Res., 1976, v. 3, N 1, pp. 49-62.

378. Mergny J.L. Fluorescence energy transfer as a probe for tetraplex formation: the i-motif. Biochemistry, 1999, v. 38, N 5, pp. 1573-1581.

379. Germann M.W., Kalisch B.W., van de Sande J.H. Structure of d(GT)n.d(GA)n sequences: formation of parallel stranded duplex DNA. Biochemistry, 1998, v. 37, N 37, pp. 12962-12970.

380. Nichols R., Andrews P.C., Zhang P., Bergstrom D.E.A universal nucleoside for use at ambiguous sites in DNA primers. Nature, 1994, v. 369, N 6480, pp. 492^193.

381. Bergstrom D. E., Zhang P., Johnson W. T. Comparison of the base pairing properties of a series of nitroazole nucleobase analogs in the oligodeoxyribonucleotide sequence 5'-d(CGCXAATTYGCG)-3'. Nucleic Acids Res., 1997, v. 25, N 10, pp. 1935-1942.

382. Loakes D., Brown D. M. 5-Nitroindole as an universal base analogue. Nucleic Acids Res., 1994, v. 22, N 20, pp. 4039-4043.

383. Loakes D., Brown D. M., Linde S., Hill F. 3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR. Nucleic Acids Res., 1995, v. 23, N 13, pp. 2361-2366.

384. Loakes D., Hill F., Brown D. M., Salisbury S. A. Stability and structure of DNA oligonucleotides containing non-specific base analogues. J. Mol. Biol., 1997, v. 270, N3, pp. 426^135.

385. Gallego J., Loakes D. Solution structure and dynamics of DNA duplexes containing the universal base analogues 5-nitroindole and 5-nitroindole 3-carboxamide. Nucleic Acids Res., 2007, v. 35, N 9, pp. 2904-2912.

386. Moskalev N., Makosza M. A novel method of indole ring system construction: One-pot synthesis of 4- and 6- nitroindole derivatives via base promoted reaction between 3-nitroaniline and ketones Tetrahedron Lett., 1999, v. 40, N 29, pp. 5395-5398.

387. Nielsen K.R., Pennington M.W. Mass spectral analysis of peptides containing nitrobenzyl moieties. Lett. Pept. Sci., 1996, v. 2, N 5, pp. 301-305.

388. Petersson A.S., Steen H., Kalume D.E., Caidahl K., Roepstorff P. Investigation of tyrosine nitration in proteins by mass spectrometry. J. Mass Spectrom., 2001, v. 36, N 6, pp. 616-625.

389. Sarver A., Scheffler N.K., Shetlar M.D., Gibson B.W. Analysis of peptides and proteins containing nitrotyrosine by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. J. Amer. Soc. Mass Spectrom., 2001, v. 12, N4, pp. 439-448.

390. Sheeley S.A., Rubakhin S.S., Sweedler J.V. The detection of nitrated tyrosine in neuropeptides: a MALDI matrix-dependent response. Anal. Bioanal. Chem., 2005, v. 382, N 1, pp. 22-27.

391. Strohalm M., Kodicek M., Pechar M. Tryptophan modification by 2-hydroxy-5-nitrobenzyl bromide studied by MALDI-TOF mass spectrometry. Biochemistry Biophys. Res. Communs, 2003, v. 312, N 3, pp. 811-816.

392. Jacutin S., Zhang A.J., Russell D.H., Gibbs R.A., Burgess K. Test of the potential of a dATP surrogate for sequencing via MALDI-MS. Nucleic Acids Res., 1997, v. 25, N 24, pp. 5072-5076.

393. Dotter R., Smith C., Young M., Kelly P., Jones A., Mccauley E., Chang D. Laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons. Anal. Chem., 1996, v. 68, N 14, pp. 23192324.

394. Mouscadet J.F., Ketterle C., Goulaouic H., Carteau S., Subra F., Le Bret M., Auclair C. Triple helix formation with short oligonucleotide-intercalator conjugates matching the HIV-1 U3 LTR end sequence. Biochemistry, 1994, v. 33, N 14, pp. 4187-4196.

395. Orson F.M., Kinsey B.M., McShan W.M. Linkage structures strongly influence the binding cooperativity of DNA intercalators conjugated to triplex forming oligonucleotides. Nucleic Acids Res., 1994, v. 22, N 3, pp. 479-484.

396. Konakahara T., Wurdeman R.L., Gold B. Synthesis of an N-methyl-N-nitrosourea linked to a methidium chloride analogue and its reactions with 32P-end-labeled DNA. Biochemistry, 1988, v. 27, N 23, pp. 8606-8613.

397. Letsinger R.L., Schott M.E. Selectivity in binding a phenanthridinium-dinucleotide derivative to homopolynucleotides. J. Am. Chem. Soc., 1981, v. 103, N24, pp. 7394-7396.

398. Crooke S.T. Advances in understanding the pharmacological properties of antisense oligonucleotides. Adv. Pharmacol., 1997, v. 40, pp. 1-49.

399. Wang J. From DNA biosensors to gene chips. Nucleic Acids Res., 2000, v. 28, N 16, pp. 3011-3016.

400. Blaskor A., Dempcy R.O., Minyat E.E., Bruice T.C. Association of Short-Strand DNA Oligomers with Guanidinium-Linked Nucleosides. A Kinetic and Thermodynamic Study. J. Am. Chem. Soc., 1996, v. 118, N 34, pp. 78927899.

401. Gait M.J. Oligonucleotide Synthesis. IRL Press, Oxford, 1984.

402. Rhodes D., Klug A. Sequence-dependent helical periodicity of DNA. Nature, 1981, v. 292, N5821, pp. 378-380.

403. Agris P.F. The importance of being modified: roles of modified nucleosides and Mg2+ in RNA structure and function. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 1996, v. 53, pp. 79-129.

404. Sprinzl M., Horn C., Brown M., Ioudovitch A., Steinberg S. Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes. Nucleic Acids Res., 1998, v. 26,N l,pp. 148-153.

405. Helm M., Giege R., Florentz C. A Watson-Crick base-pair-disrupting methyl group (mlA9) is sufficient for cloverleaf folding of human mitochondrial tRNALys. Biochemistry, 1999, v. 38, N 40, pp. 13338-13346.

406. Anderson J., Phan L., Hinnebusch A.G. The Gcdl0p/Gcdl4p complex is the essential two-subunit tRNA(l-methyladenosine) methyltransferase of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 2000, v. 97, N 10, pp. 5173-5178.

407. Mikhailov S.N., Rozenski J., Efimtseva E.V., Busson R., Van Aerschot A., Herdewijn P. Chemical incorporation of 1-methyladenosine into oligonucleotides. Nucleic Acids Res., 2002, v. 30, N 5, pp. 1124-1131.

408. Delaney J.C., Essigmann J.M. Mutagenesis, genotoxicity, and repair of 1-methyladenine, 3-alkylcytosines, 1-methylguanine, and 3-methylthymine in alkB Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 2004, v. 101, N 39, pp. 1405114056.

409. Sun L.Q., Cairns M.J., Saravolac E.G., Baker A., Gerlach W.L. Catalytic nucleic acids: from lab to applications. Pharmacol Rev., 2000, v. 52, N 3, pp. 325-347.

410. Silverman S.K. In vitro selection, characterization, and application of deoxyribozymes that cleave RNA. Nucleic Acids Res., 2005, v. 33, N 19, pp. 6151-6163.

411. Macon J.B., Wolfenden R. 1-Methyladenosine. Dimroth rearrangement and reversible reduction. Biochemistry, 1968, v. 7, N 10, pp. 3453-3458.

412. Takeuchi Y., Tazawa I., Inoue Y. Intramolecular Stacking Association of Three Dinucleoside Monophosphates Containing Naturally-occurring 1-Methyladenosinc Residue(s): mlApA, ApmlA, and mlApmlA. Bull. Chem. Soc. Jpn., 1982, v. 55, N 11, pp. 3598-3602.

413. Agris P.F., Sierzputowska-Gracz H., Smith C. Transfer RNA contains sites of localized positive charge: carbon NMR studies of 13C.methyl-enriched

414. Escherichia coli and yeast tRNAPhe. Biochemistry, 1986, v. 25, N 18, pp. 5126-5131.

415. Jones J.W., Robins R.K. Purine Nucleosides. III. Methylation Studies of Certain Naturally Occurring Purine Nucleosides. J. Am. Chem. Soc., 1963, v. 85, N2, pp. 193-201.

416. Chen L., Cai L., Zhang X., Rich A. Crystal structure of a four-stranded intercalated DNA: d(C4). Biochemistry, 1994, v. 33, N 46, pp. 13540-13546.

417. Lacroix L., Mergny J.L., Leroy J.L., Helene C. Inability of RNA to form the i-motif: implications for triplex formation. Biochemistry, 1996, v. 35, N 26, pp. 8715-8722.

418. Gray D.M., Ratliff R.L., Vaughan M.R. Circular dichroism spectroscopy of DNA. Methods Enzymol., 1992, v. 211, pp. 389-406.

419. Rush III T., Yong H., Peticolas W.L. Structure and stability of cytosine deoxyoligonucleotides multiplexes. Biopolymers, 1997, v. 41, N 2, pp. 121130

420. Kang C.H., Berger I., Lockshin C., Ratliff R., Moyzis R., Rich A. Crystal structure of intercalated four-stranded d(C3T) at 1.4 A resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1994, v. 91, N 24, pp. 11636-11640.

421. Edwards E.L., Ratliff R.L., Gray D.M. Circular dichroism spectra of DNA oligomers show that short interior stretches of C.C+ base pairs do not form in duplexes with A.T base pairs. Biochemistry, 1988, v. 27, N 14, pp. 51665174.

422. Manzini G., Yathindra N., Xodo L.E. Evidence for intramolecularly folded i-DNA structures in biologically relevant CCC-repeat sequences. Nucleic Acids Res., 1994, v. 22, N 22, pp. 4634-4640.

423. Kanehara H., Mizuguchi M., Tajima K., Kanaori K., Makino K. Spectroscopic evidence for the formation of four-stranded solution structure of oligodeoxycytidine phosphorothioate. Biochemistry, 1997, v. 36, N 7, pp. 1790-1797.

424. Collin D., Gehring K. Stability of Chimeric DNA/RNA Cytosine Tetrads: Implications for i-Motif Formation by RNA. J. Am. Chem. Soc., 1998, v. 120, N 17, pp. 4069—4072.

425. Rippe K., Fritsch V., Westhof E., Jovin,T-M. Alternating d(G-A) sequences form a parallel-stranded DNA homoduplex. EMBO J., 1992, 11, N 10, pp. 3777-3786.

426. Liquier J., Geinguenaud F., Huynh-Dinh T., Gouyette C., Khomyakova E., Taillandier E. Parallel and antiparallel G*G.C base triplets in pur*pur.pyr triple helices formed with (GA) third strands. J. Biomol. Struct. Dyn., 2001, v. 19, N 3, pp. 527-534.

427. Haner R., Dervan P.B. Single-strand DNA triple helix formation. Biochemistry, 1990, v. 29, N 42, pp. 9761-9765.

428. Lyamichev V.I., Mirkin S.M., Frank-Kamenetskii M.D. pH-dependent structural transition in the homopurine-homopyrimidine tract in superhelical DNA. J. Biomol. Struct. Dyn., 1985, v. 3, N 2, pp. 327-338.

429. Klug A., Rhodes D., Smith J., Finch J.T., Thomas J.O. A low resolution structure for the histone core of the nucleosome. Nature, 1980, v. 287, N 5782, pp. 509-516.

430. Pack L., Wang J. Sequence dependence of the helical repeat of DNA in solution. Nature, 1981, v. 292, N 5821, pp. 375-378.

431. Wing R., Drew H., Takano T., Broka C., Tanaka S., Itakura K., Dickerson R.E. Crystal structure analysis of a complete turn of B-DNA. Nature, 1980, v. 287, N 5784, pp. 755-758.

432. Umlauf S.W., Cox M.M., Inman R.B. Triple-helical DNA pairing intermediates formed by recA protein. J. Biol. Chem., 1990, v. 265, N 28, pp. 16898-16912.

433. Hsieh P., Camerini-Otero C.S., Camerini-Otero R.D. Pairing of homologues DNA sequences by proteins: evidence for three stranded DNA. Genes and Dev., 1990, v. 4,N 11, pp. 1951-1963.

434. Rao B.J., Jwang B., Dutreix M. Production of triple-stranded recombination intermediates by RecA protein in vitro. Biochemie, 1991, v. 73, N 4, pp. 363370.

435. Kiyama R., Camerini-Otero R.D. A triplex DNA-binding protein from human cells purification and characterization. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1991, v. 88, N 23, pp. 450-454.

436. Rao B.J., Chiu S.K., Radding C.M. Homologues recognition and triplex formation promoted by RecA protein between duplex oligonucleotides and single stranded DNA. J. Mol. Biol., 1993, v. 229, N 2, pp. 328-343.

437. Schyolkina A., Mamaeva O., Borisova O., Lysov Y., Timofeev E., Il'icheva I., Gottikh B., Florentiev V. 3-stranded clip of the oligonucleotide 5' -T10-T10-A10 Anisence Res. Develop. 1994, v. 4, pp. 27-33.

438. Jain S.K., Inman R.B, Cox M.M. Putative 3-stranded DNA pairing intermediate in RecA protein mediated DNA strand exchange no role for guanine N7. J. Biol. Chem., 1992, v. 267, N 6, pp. 4215-4222.533.534.535.536.537.538.539.540.

Информация о работе

Тимофеев, Эдуард Николаевич
доктора химических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Иммобилизованные и модифицированные олигонуклеотиды в физико-химических исследованиях дуплексов и триплексов ДНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы