Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммобилизация рекомбинантной ДНК на подвижном векторе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммобилизация рекомбинантной ДНК на подвижном векторе"

РГ6 од

1 О ДПР !?93

ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ _________ • - РОССИЙСКИЙ УНИВЕРШТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ

На правах рукописи.

ГОРЛОВА Алла Владимировна УДК 612.616.2+547.963.32.915.5

ИММОБИЛИЗАЦИЯ Р1ХШВИНАНТНОЙ. ДНК -НА -ПОДВИЖНОМ ВЖТОРЕ

/03.00.04 - биохимия/

' N

Автореферат --■ •

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических^ наук...... —~~—.....

- М о с к в а - 1993

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всесоюзного института животноводства и на кафедре биохимик медицинского факультета Российского университета дружбы народов.

Научный руководители: доктор биологических наук

Башкёев Е.Д.,

доктор биологических наук, профессор Кондрашин А.А.

Официальные оппонентн: доктор медицинских наук.,

профессор Конь И.Я.,

кандидат биологических наук Костнрко В.А.

у \

Ведущая организация - Российский Государственный медицинский университет

Защита состоится 14 мая 1993 г. в >" часов на заседании специализированного совета Д 053.22.|02 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, медицинский корпус.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского'университета друкбн народов по адресу: Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан @ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета

В.Э. Торбек

Актуальность темы иаСЛеДЙШШЯ • В наетоящ&е враия появилась возможность о поиовыо методов генной инженерии целенаправленна , изменять наелодствениуп природу. Это позволит значительно

повысить продуктивность сельскохозяйственны)! животных, ооздать -

»

иммунитет к болезням, вывести искуоотвенние виды .живитных, в связи с чем приобрели orpov..yw актуальность работы по получению , трансгешшх иообеЯ (Hammer R.E., Pursei V.O., 1385).' - '

t

Для интродуиирования чужеродного гена наиболее широко причрпяотой метод микроиягекции в мужской пронуклеус однодневной зиготы. Начиная с 1980 года таким способом было получено несколько тыейч трансгенних мышей, а также небольвое количество трансгенных овец,' свиней я кроликов. Однако, этот метод имеет , существенные недочтатки. В яйцеклетка* животных содержится большое количество липидных, пигментных. желточных н других включений, маскирующих пронуклеуоы. Но данном аарубежних авторов поело микроиньекцни чужеродной ДНК погибает от зо до 50% яйцеклеток, а после трансплантации но все зародыши развиваются нормально (Rottmann О., Hofer Р., 1987).

Таким образом актуальной становится проблема разработки иовых методических подходов для введения чужеродных 'енов в яйцеклетки' сельскохозяйственных животных, базирующихся не -.только на достижениях генной и клеточной инженерии, но и био. мии.

В последние годы активно ведутся биохимические работы по созданию и использованию искусственных мембранных везикул - ■ липоеом для доставки разнообразных биологически активных веществ к органам и тканям. Липосомы имеют свойства практически идеального переносчика: они биологически инертны, полностью бнодеградмруемн, не вызывают антигенных и токсических реакций

1

(Грбгориадис Г.. 1993). Эти свойства лнпосом могли бн тть использованы и для получения траногешшх животных. если бы были решены задачи, во-первых. иммобилизации рекомбинанпюН ЛИК в липосомах, а. во вторых, найден способ векторной доотапки липосон. нагруженных ДНК. в яйцеклетку животного. Среди таких способов перспективным представляется использование сперматозоидов, ассоциированных с липосомами. Такая модель имеет ряд достоинств, с одной стороны сперматозоиды могли бы выполнять, функции естественного вектора для переноса чужеродной ДНК в яПцвкдотку. о с другой - липосомы способствовали бы защите доставляемых конструкций от Агрессивного воздействия биологического окружения.

Однако исследований по иммобилизации рекомбтшнтной ДНК на сперматозоидах с помощью липосоы весьма мало, а в нашей стране подобный исследования вообще не проводились.

Поскольку •липосомы представляют собой весьма перспективный объект для использования в различных областях биологик и медицины, изучение их свойств и потенциальных возможностей, которые изучен« далеко не полностью, имеет отдельное научное и практическое значение.

1|5ЛЬ работы И Зйдадш (ШСДОДёРОДШ . Целью .настояций работы было; поиск подходящей системы, позволяют«!! иммобилизовать чужеродный генетический материал но сперматозоидах животных с

помоцып ЛИПОСОМ.

В связи о этим в задачу исследования входило:

I. Разработать метод получения липос.им из днольиых фосфолинидов холинового типа и их тиоианалогов.

2

2. Испытать физические свойства полученных-липосои!

3.-Отработать метод включения в липосомы ДНК и к&Л1.ииИИ<к ..

4. 1'аэработать метод прикрепления ДНК-содержащих липосом к-, сперматозоидам животных. • ..

5 Оценить функциональную активность сперматозоидов о адсорбированным» на них лип .-омами. . ■•-.". с.-Ул ,'*

Научная новизна иабо_ТЦ. . . . ' . V ■

1 - - р

В настоящей работе разработан новый метод фиксации рекомйштнтпоЛ ДНК на сперматозоидах животных о помощью липосом. ;" .

Били получены липосомы из ранее не исследованных с этой * целью синтетических диольных фосфолипидов холинового типа и их ; тионаналогов. Экспериментально доказано, что. Подобные липосомы , обладают высокой инкапсулирующей.способность», : ,

8 ходе исследований было • подобрано оптимальное время инкубации линооом со сперматозоидами. В работе суммированы полученные имервцо результаты об оптимальной концентрации липида, необходимой для адсорбции липосом на каждом сперматозоиде и не нарушавшей их функциональной активности.

Впервые предложена возможность использования сперматозоида ф

.. .. г* I

адсорбированными на нем липосомами в качестве естественного! , вектора для доставки чужеродного генетического материала.

Практическая аеннаец». саМщ. ' -л-'

в работа показана. возможность получения .положительно | заряженных липойом из синтетических фосфолипидов. В ходе, работы был подобран оптимальный состав липосом для включения в них генетического материала и низкомолекулярного красителя' .•••"•''-■" кальцеина. Проведенные исследования дают основания утверждать, . что подобные липосомы не являются токсичными : дл*клеток у '

3 -

¿1'Благодаря положительному заряду, данные липосомы могут быть

, использованы для стабильной адсорбции на клетках. Полученные в

работе данные показывают высокую захватывающую способность

; исслодуемых липосом. что свидетельствует о высокой транспортной

способности последних. Проведенные исследования дают основания

утверждать о возможности использования полученных липосом для

переноса чужеродного генетического материала в цитоплазму

яйцеклеток путем адсорбиии на сперматозоидах.

¿Дйомиия ВД&ИИ- Результаты исследований были представлены на

44-ой научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых 1 ' . . -ВИЛа (Дубровицы, 1391 г.); на межлабораторной конференции ВНЖа

■(Лубровицы. 1992 г.); на и-ой Конференции молодых ученых

' РоЬоиЯского Университета Дружбы Народов (Москва, 1992 г.).

Щ^ДМ&ШШ^. По материалам диссертации опубликовано з работы.

{сПШШСеа И йбКМ РйЗАХ». Диссертация состоит из введения, обзора

литературы, описания материалов и методов исследования, изложения

результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой,

литературы, включаюаеП 204 источника. Работа изложена на

отр. машинописного текста, включает /^/рисунков и & таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

& работе использовали положительно заряженные лнпиды: три-

стеароксипропилендиол-1-О-фосфогомохолин (ФГХ) и два

отеароксиэтилендиол-1-О-тионфосфогомохолшГ (тион-ФГК),

синтезированные на химическом факультете МИГУ им. В.И. Ленина под

I

руководством Д.А. Предводителева и Э.Е. Нифаитьева.

Для контроля использовали яичный 1,2-диаиид-5п-глицеро-з-фосфохолин (*Х> - продукт Харьковского предприятия по

4

производству бактерийных препаратов: ~ Чистоту липидл контролировали тонкослойной хроматографией.

Ц некоторых случаях липосомы получали с добавлением 1,2-диолеоил си-глииеро-з фоефоэтаноламина (Д0ФЭ1.

В работе использовали замороженную сперму быка, получешич из блика отдела биотехнологии (ШЖа (концентрация сперматозоидов 31 млн. шт. в 1 дозе; активность 8 баллов): для рпзЗаьлоции спврин игполг,повали цитрат натрия 2,3% раствор в ампулах по 1 мл для искусственного осеменения сельскохозяйственных животных продукт Борисовского химфармзавода.

Спектральные измерения проводили при помощи двухлучевого спектрофотометра "Yanaco UO 2000", СПеКТрофлуориМСТра "Hitachi F 3000".

Ригисгрчннк! флуоресценции препаратов клеток производили с ПОМОЩЬЮ фл\оруецеНТНОГО микроскопа "Ojiton Phn t un.1 ilOiwi« 111", снабженного unj ><>фильтрамн с полосой длин волн возбуждения флуоресценции зпп - 150 им. Фазопоконтрастпыо и флуоресцентные изображения фотографировали на фотопленку РФ " (350 ед. ГОСТ) о использованием автоматического экспонометра. ¡.

Были получены липосомы двух составов; ФГ\.Д040 и тион-1 ФГХ.ДОФЭ (в обоих случаях молярное соотношение 1:1). В качестве Kolli ролл били приготовлены ЛИПОСОМЫ ИЗ ЧИСТОГО ФХ

Приготовление липосом проводили методом замораживания-оттаивания, включение в них переносимых веществ и отмывание от невключившегооя материала осуществляли согласно методикам Pick и. (1й«1 ) .

0 цель» инкапсулирования флуоресцентного красителя вместо буферного раствора использовали во Мм раствор кальпеина рН=7,0.

5

• В качество нотки для определения процента вкличения т..<иетв в липооомм добавляли раствор плазмиды рВй 322 (о.оз мг/.мл).

Пнкуйштю кальиеим-содержащих лнпосои со сперматозоидами провалили в тсчонпо в, во мни и 1 часа при комнатной температуре, после чего несвязавшШсл материал отмывали центрифугированием на малых оборотах (зооо *) в точение трех минут.

После инкубации и отмывки проводили визуальнуи оценку подвижности спермиев в каждой пробирке (в баллах) по методике, описанной в "Инструкции по организации и технологии работы стгмиШ по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных" (1йбВ). Сперму исследовали при помощи светового •микроскопа "Лпр|(ФРГ) при увеличении в гоо - зоо раз. Лля контроля мспользег-али сперму, но обработанную липосомами. Электронно-микроскопическое! исследование липосоы и сперматозоидов проводит« совместно с лабораторной клеточных структур и мпкромолокул Института экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН.

ПЭУЛМАТИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Получение н стабилизация линосом.

В иокей работе была научен« возможность создания новых типов липосои нз не исслсдгвамшг синтетических диолышх

фоофолинидов хо.-цтового типа для включения в них ДНК. и адсорбции их и» сперматозоидах животных.

В процессе лабораторных исследований нами было отобрано два синтетических положительно заряженных линида (ФГХ и тиен-ФГХ) и на их основе tto.iv чопм ляппсомы двух составов-. ФГХ:Л<Ж> и тиун ФГХ:Д1Ж>. пг'и молярном соитнрясиии i:! в обоих случая* ,

Известно. чг*> фогфатилмлэтанолашши 1'Ю >. содержащие

с

ненасыщенные жирные кислоты (каким является ДОФЭ) кеспоикЛии самостоятолыю в чистой виде образовывать биелойные структуры (липосомы) при физиологической температуре и нейтральных значениях pli. Методами рентгеновского рассеивания (31Р)-ЯМР и ;>.'Кн;тро1жиП микроскопии было показано, чч.о молекулы ненасыщенных ФЭ, имеющие форму прямого конуса, в водной среде образуют гексагональные структуры (рис. 1 а). Авторы Нап<1 et al,

(1971). funis and »eKruîff (1979) ПОКУЗаЛН, ЧТО В СМвСИ С

молекулами, имеющими форму обращенного конуса (например, лизофо-сфатидилхолин) ненасыщенные ФЭ приобретают способность образовывать липосомы (рис. 1б).

А

Рис,1. Гипотетические механизмы организации амфифильных молекул, имеющих форму прямого

и обращенного конуса в водной среде:

1 - молекула ФГХ

2 - молекула ФЭ

- полярная головка гидрофобная обдасть:

. - ' 1 • Поскольку используемые нами диолыше фосфолипиды холинового типа имеет форму Слизкую к обращенному конусу, мы решили изучить ,' возможность получения стабильиых ли'посом на основе ФГ'Х и ДОФЭ.

Образование стабильных липосомальных конструкций можно '. контролировать о помощью метода светорассеиваиия. Чтобы определить минимальное количество ДОФЭ, которое может стабилизировать ФГХ-липосомы, были смешаны различные

- количества ФГХ с ДОФЭ II обработаны ультразвуком в течение 5 мин. На рио. г показано уменьшение величины светорассеиваиия с • увеличением процентного содержания ДОФЭ в липосомах из ФГХ. В качеств!} контроля использовали липосомы из чистого ФХ,

Св*тор»сс«»»«и»» (т^я. «д.)

а'1......°.......®

♦

а

в

Рис.2. Стабилизация ФГХ-липосом с увеличением процентного содержания ДОФЭ. Измерения флуорес-ионции проводили при длине волны возбуждения и испускания ббо нч. шоли э нм.

о

О 10 го 80 40 во во 70

X ДОФЭ

8

Между б и го х суспензия ФГХ-липосом била заметно мутной, показывая, таким образом, на присутствие неоднородные чийТШЬ Минимальная величина светорассеивания, говорящая об относительной

однородности частиц достигалась при содержании ДОФЭ >ззх.

*

О Помощи) метода электронной микроскопии молфо определит]-размер и форму полученных .шпосом. Поскольку яипосомы аа ФГХ и тион-ФГХ внешни очень похожи, на рис:, а г. род с топлены микрофотографии только ФГХ-липосом, полученные с помощь» трансмиссионной (а) и сканирующей (б) электронной микроскопии.

Рис. з. Микрофотографии ФГХ-липосом. порченные с помощью трансмиссионной (а) и сканирующей (б) электр..иной микроскопии. Увеличение: 40 ооо (а); 80 ооо (й)

На фотографии, сделанноП с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (а) видно, что линосоми однор^^ни ц приблизительно одного размера (0,20 - о.гз мкм) в виде замкнуты? Фигур, близких к окружности. Среди них есть как электронно плотные, так и электронно прозрачные липосомы. Это связано с тем, что срез через шар может пройти по его поверхности, т.е. быть электронно плотним-по ясей плоскости. Если хо срез прошел ближе к центру иара, то можно увидеть электронно плотную оболочку и светлое внутреннее

Штстранстио. Неровные края липосом можно объяснить полостью внутри иара. Условия проводки по спиртам и заливки в эпоновую сшоь не дают возможности равномерной пропитки препарата и, поэтому, чтобы уволиться в шарообразной форме липосом, приведена микрофотография, выполненная с помочью сканирующей электронной мпкроокопмм (б». В этом случае условия приготовления препарата иные; обезвоживание можно провести очень быстро, что познгляот сохранить форму более близкой к натуральной.

Для приготовления липосом в навей работе использовался метод обработки ультразвуком с последующим циклом замораживания -оттаивания и пголавливанвем через поллкарбонатные фильтры. Поскольку »¡лева ладачой является доставка биологически активных ее«е«тв. то при включении их б лппосомы, мы выбрали один из наиболее мягких методов: цикл замораживания - оттаивания. Этот метол пцнонаи на быстром замораживании озвученных фосфолипи диопоосил последующим оттаиванием и непродолжительным вторичным . озвучиванием. Метол замораживания - оттаивания не требует неиосрапотвпнной обработки биологически активных веществ. (например. iiltRl ультразвуком, так как подобная процедура может разрушить ИИ1Ь ЛИК. Методом замораживания - оттаивания удается включить » лппосомы не только ДНК. но м низкоиолекуляриые вещества, в частности флуоресцентны!» краситель казьиеин.

Одним из самых важных свойств Зншосом является пх способность ипкапеудпрорать различны« ►евества. Изгоняя молярное соотношение ашшдиит компонеитов, и; проведи ряд экспериментом по включении калънргша И I Я*Р1-wseimofl ДНК. В случае кальиепна степень захвата г>пр<>п^пяди по максимальному значение флуоресценция, востигаеммочу р ррэ*.и,тат« раарт«и?кия дипооом тритоном X -

ю

loo и разбавления включенного красителя, а в случа« меченной измеряя радиоактивность образное.

В качество контроля ми использовали шнрико известии» липосомы из чистого 'И, которые формируют о raiíii.UiuJu бЖ).|о[|ИЧ"' структуры.

Результаты зкеперимуигов по включении (Hyopticudirniui'' красителя кальнеинз представлены в таблице 1. Дли "ulero ионользовали метод Straubingar k.M. и др. daes), »снованный нг самотушешш флуоресценции кадщеши iiíui ьыьоьиь киццишуиикы. 1внутри липосом) и увеличении интенсивное i и флуоресценции ирг разбавлении (при вытекании из липосом).

Наибольший процент включения кальиеина наблюдался при молярном соотношении липидов 1 ; i.

В таблице г представлены результаты экспериментов по включению радиоактивно меченной ДНК • Наибтыиая величине» включении ДНК в липосомы достигалась Ta,<*<¡. при молярном соотношении липидов i : i и составляла более нбх. Такой шлшкип процент включения ДНК объясняется формированием лшшл ЛИК комплекса за счет ионных взаимодействий мижду ппложмтплмк) . заряженными группами в молекулах Ф1X и тон Ф(X ;i отрицательно' заряженными фосфатными группами н mo.iuc Л(1К, Подобные результаты мо*но встретить у зарубежных авторов л£11р I.. Fei «пег и др. (19H7), которые синтезировали положительно заряженный лииид, приготавливали липосомы и включили 1) них ДНК с. эффективностью включения до юо*. Контрольные липосомы из чистого ФХ включали гох.ДШС, что согласуется о данными, полученными в работах Клнбанмва А.Л. и др. (i9üo).

I 1

'таблица 1. Зависимость величины включения кальцепна в липосомы от соотношения липидных компонентов.

Молярное соотношение Увеличение флуоресценции при

липидов добавлении тритона Х-юо. раз.

lfTT-дмдг—---------------------•-------------------------------

9 ; 1 0.9

7:3 2,1

\ : 1 П.О

3:7 1.8

ТНОП-Ш : Д(Ж)

9:1 0.6

7:1 1.9

1:1 7.5

3-7 1,5

контроль 4-х 4.1

Гчб.чиип г. Зависимость величины включения 1згР)-меченной ДНК в липосомы от соотношения липидных компонентов.

Чёлярнпё "iioof ношение ' """¿'включения

чипидоп - [згР]-меченной ДНК

tfx "ДОМ"' ....................

9 : 1 <1.в

7 : 3 32.0

1:1 >85.0

3:7 27,2

ТИЛН ФГХ : Л0*Э

s : 1 <0.9

7:3 26.0

1:1 >75.0

п : 7 1э.0

контроль <1 " 20.О

Таким образом. данные обоих таблиц иоказывлшт. что получении» нами липосомы из ФГХ : ЛоФЭ и Timi •И * : ДСИИ в молярном соотношении ) : 1 являитпя перспективным обьектом для Изучения, поскольку их злхрлтнрягяяя способность значительно

12

вше, чем у контрольных липосом из ФХ. При этом следует отметить, что липосомы, приготовленные из ФГХ инкапсулируют кальцеин и ЛИК несколько лучшие, нехели липосомы из тион-ФГХ. Как будет показано ниже, это объясняется наличием более высокого положительного заряда на поверхности их мембран.

2. Исследование физических свойств липосом.

Одной из важных характеристик липосом является их стабильность при хранении и сохранение целостности в различны), буферных растворах ( например, в цитратном буфере, иеобхояимг-м для ралЛавленил спермы). Также необходимым условием является сохранение целостности липосом в течение определенного времени, которое потребуется для проведения ипкубации со сперматозоидами и для прохождения спермиев по половым путям.

Согласно нашим исследованиям, липосомы из ФГХ и. тион-ФГХ стабильны в течение длительного времени,и могут храниться. В ' течение двух недель при 4°С без заметного вытекания содержимого, что удовлетворяет нашим требованиям,

Для изучения электростатического потенциала поверхности липосом их пиолм«!?. фссфслипидоа. мг1мм использовался метод флуоресцентной спектроскопии зонда i анплинонпфталин ч оульфоната (MIC).

Гетаюиее значение для использования донва ДНО имеет увеличение выхода флуоресценции при включении зонда в мембрану липосом Увеличение параметров флуоресценции позволяет количественно оценить степень связывания зонда с мембранами.

В мембранах моста связывания отрицательных гидрофильных зондов чувствуют их локальную концентрации вблизи поверхности чрчбр.-иш 1Л>1"~|() Последняя связана п полной концентрацией анионов

п

(AHC le» через потенциал поверхности мембран - г соотношением

Больииана . <

IАНС10 lAHCl^exple У^/кТ).

где Т - абсолютная температура," к - постоянная Больцмана, е -

элементарный заряд.

Определив количество связанного зонда при условии полного

экранизирования электростатического взаимодействия (например, при

концентрации Nací i М) мы можем вычислить значение потенциала в

заданной среде из соотношения :

y?s КХ inUüÜld г в IАНСlh ,

где lAHCJd - концентрация зонда, сорбированного в заданной среде

и (АНС1h - при концентрации NaCi равной 1 К. Потенциал определяли

в среде с 0.01 М Nucí.

Анализ флуоресценции АНС показывает, что'зонд в исследуемых

лмлосомах связан . с липидами и. следовательно, параметры

связывания его будут отражать электростатический потенциал

поверхности липосом.

Чногочисленные данные, полученные в работах о системах зонд-

мембраны, показали, что, как правило, зонды лучше связываются с

Противоположно заряженными мембранами и хуже с одноименными.

Соответственно изменения поверхностного заряда мембран влияют на

свиэиааиио зонда.

Как известно, мембрана липосом из ФХ заряжена нейтрально,

тогда как липосомы из ФГХ и тион-ФГХ, как мы предполагаем. должны

hvutm невольной положительный заряд. Для того, чтобы ото

проверить, мы изучали связывание зонда АНС с мембранами ФГХ- и

ttwnЧГ*-липосоизиа И сравнивали эти значения с липосо.шми из ФХ

' • i1 ;

В таблице з приведены значения электростатического

потенциала поверхности липосом. Липосомы нэ ФГХ и типи-ФГХ имеют более положительны!! поверхностный потенциал по сравнению о липосомами из ФХ. причем ФГХ-липосомы имеют болывий положительная заряд, чем липосомы из тион-ФГХ. '

Таблица з. Значения потенциала поверхности липосом (У).

Состав липосом :

ФГХ:Л0ФЭ тион-ФГХ -.ПОФЭ « .

У (МВ) ♦ 17,8 + 11,9 -

з. Инкубация клеток с липосомами." .''!""'■■

Согласно . нашим исследования. липосомы из диольных фосфолипидов - ФГХ и тион-ФГХ - являются положительно заряженной ' ,

и, следовательно, должны адсорбироваться на • сперматозоидах; 1 которые имеют слабый отрицательный заряд.

Л'1н ?к''пернмонтов использовали замороженную сперму быка с

КОНИРНТПяти'й 4 1 или 5Т 5 ! ДСЗО. Ко!!ПС!!ТрЗиИЯ ЛИПОСОп: 300 и Г липида на 1 млн сперматозоидов. . 1

Сперматозоиды инкубировали с ФГХ -, тион-ФГХ- и ФХ -липосомами. во внутреннее водное пространство которых быт включен' Флуоресцентный краситель - кальцеин в концентрации частичного / паиптуоенмя. Инкубацию провопили в точение го мин при комнатной ' тмчппратуре. Для определения количества липосом, адсорбированных г на сперматозоида* по истечения времени инкубации и. после ,: отделения иесвязаавпхся липооом добавляли тритон Х-1 оо, -то',.

15

приводило к лизису липосом, выходу красителя во внешнюю среду, его разбавлению и соответственному увеличению , интенсивности флуоресценции.

В таблице 4 приведены значения увеличения флуоресценции при добавлении тритона к препаратам сперматозоидов после их инкубации о кальцеин-несущими липосомами. Максимальный рост флуоресценции наблюдали■ в образцах, к которым были добавлены положительно заряженные липосомы. Это свидетельствует о лучшем связывании липосом состава ФГХ:ДОФЭ и тион-ФГХ :ДОФЭ со сперматозоидами. В атих экспериментах количество добавляемых в систему липосом было нормировано по кальцеину, чтобы избежать искожения результатов, связанного с лучшим включением кальценна в положительно заряженные липосомы.

Хнблкиа 4. Связывание кальцеин-содержащих липосом со сперматозоидами.

Состав липосом Увеличение флуоресценции при добавлении

тритона Х-100. раз.

♦ГХ 1 ДОФЭ е.о

ТИОН ФП : ЛОФЭ . 5.5

♦X 3.5

Флуоресцентное мочение липосом позволяет проводить мвкрофлуоримнтричнекое определение связывания л: носом с метками. С не.ию визуализации липосом, связанных с ьолерх постно епсры.иоаниоп, нами были получены флуоресцентные микрофотографии. прелстивленныо на рис. 4. 5.

1С

1'ис. 4. Микрофотографии препаратов сперматозоидов, инкубированных с кальцеин-содержащими липосомами из ФГХ:

1 - флуоресцентная микрофотография сперматозоидов;

2 - фазово-контрастное изображение того же поля зрения. (Увеличений: :юо)

Рис. 5. Микрофотографии препаратов сперматозоидов, инкубированных с кальцеин-содержащими липосомами из тион ФГХ:

1 - флуоресцентная микрофотография сперматозоидов; ': Г.'.

2 фазово контрастное изображение того же поля ярения., ■ --: •.. (Увеличение: 300)

При инкубации флуоресцентных ФГХ- и тион ФГХ лилосом со сперматозоидами мы наблюдали появление диффузного окрашивпния всей головки и хвоста сперматозоидов (рис 4.1. 6.И., Как видно ;

на фотографиях, наиболее интенсивное свечение наблюдалось в

17

случав инкубации сперматозоидов с липосомами из ФПС, несколько меньшее - с липосомами из тион-ФГХ. Для того, чтобн выяснить, обусловлено ли свечение сперматозоидов сорбцией липосом на их поверхности, мы включили в эксперимент инкубацию сперматозоидов с контрольными липосомами из ФХ и со свободным «алтейном. В этом случае свечения почти но наблюдалось. Собственное свечение сперматозоидов отсутствует. Эти результаты свидетельствуют о том, что исследуемые нами липосомы из положительно заряженных диолышх фосфолипидов адсорбируются на сперматозоидах.

Для доказательства адекватности вывода о существовании различий в связывании ФГХ- и тион-ФГХ липосом с контрольными, сделанном на основе данных микрофлуориметрии, нами были поставлены эксперименты о радиоактивно меченными, липосомами. Для этого в лнпиднур фазу липосом включали необмениваемый радиоактивный маркер - 114С]-холестерил олеат. Из приведенных в таблице 5 данных зледует, что исследуемые нами положительно заряженные липосомы значительно лучше связываются со сперматозоидами, чем контрольные липосомы из ФХ.

Таблица 5. Связывание.{14С)-липосом со сперматозоидами.

Внесенная " Связанная1'

Состав липосом радиоактивность, радиоактивность,

расп/мин расп/мин

♦ГХ : ДОФЭ 2110® 284076*1 .45

ТИОН-ФГХ ; ЛОФЭ 1 96513 1.1523

♦I -..<•-- 410171.1018

II {хмдьтты представлены ь виде среднее > стандартнее йТк .сПонио,

1 *

Таким образом, результаты экспериментов с радиоактивно меченными липосомами подтверждают выводы, сделанные на основе данных микрофлуориметрии.

С целью визуализации контактов липосом с поверхностью сперматозоидов мы использовали метод трансмиссионной электронной микроскопии. Фиксацию, обезвоживание и заливку препаратов проводили по стандартной методике, однако, вместо ацетона мы использовали пропиленоксид, как более мягклй реактив., позволяющий лучше сохранить форму и структуру сперматозоидов Липосоиы готовили по стандартной методике, инкубацию липосом; со сперматозоидов проводили в течение 5, го мин и 1 часа.

На рис. с представлена микрофотография чистого сперматозоида быка, который имеет классическое строение: головка, где видим ядро, мембрану, связующий и хвостовой отделы.

Рис. 6. Электронная микрофотография чистого спер!ИТозйПда быка. Увеличения: тис.

На рис 1 представлена микрофотография сперматозоида после

5 минутной инкубации с ФГХ-липосомами. Кок видно на

фотографии. ляпосомм либо удержнв<тптся на определенно»

расстоянии. лиЧо сидят на повер»мости сперматозоида. Форма и

1»

'* диаметр липосом соответствуют рано^ полученным микрофотографиям чистых липосом. Отдельные липосомы находятся в области спязуюшого отдела,

Рис. 7. Электронная микрофотография сперматозоида быка по окончании 5 минутной инкубации с ФГХ-липосомами. (Увеличение-. 16-тыс.)

Почти такуи же картину мы наблюдали •после го мину гной инкубации (рис.' 8>, однако уже встречаются сперматозоид», на головке которых адсорбировалось большее колнчестио липосом.

Гиа. е. О.к'ктроннля микрофотография сперматозоида- быка по окончании % О ытптноп инкубации о ФГХ лпписимами. О »«иичемт": 20 тыс . I

¡.■о

По окончании 1 часа инкубеция гязш спорматозоидов било значительно меньза и продолжение времени эксперимента ин сочли , нецелесообразный. К тому ее, некоторые липосомы начали отделяться от иоибраин сперматозоидов, которые к атому времени также меняет овоп мбрфологии. Вотрсчаотйя сперматозоиды, в которых между ядром . и клеточноП мембраной находятся участки разреженного клеточного < матрикоя,

Таким образом, можно заключить, что оптимальное время ' для адсорбции липосом на сперматозоидах еостп2"Л5Т ¿5 - го мин.

4. Оценка функциональной активности модифицированных сперматозоидов.

Помимо обеспечения высокой эффективности доставки биологически активных веществ, липосомальные системы не должны оказывать токсического воздействия на клетки-миоени. _ Так, например, при обработке клеток положительно заряженными лппосомами авторы УоБЫкага Е.. Явкпв Т. {1-900) наблюдали снижение эндопитируюшвП активности клеток, что можно объяснить токсическим воздействием стояри^^нппз.

Таким образом, положительный заряд исследуемых" нами липосом может оказать нежелательное влияние на функциональную активность

сперматозоидов. .......

Сохранение жизнеспособности сперматозоидов определяли визуально при помощи светового микроскопа по методике, описанной в "Инструкции по организации и технологии раоотн станций по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных" (1968).

Сразу после окончания инкубации проводили-оценку подвсгностк спермиев. по которой судили о сохранении их функциональной

21

активности после обработки липосомами. Для итого подочитыьали количество спормиев, которые имеют прямолшшйтыюступатслыте движение и оценивали по десятибальной шкале. Пии этом концентрация сперматозоидов в каждом образце била одинаковой.

Результаты подсчетов активности сперматозоидов приведены в таблице 6. Для контроля была взята сперма не обработанная липосомами. Концентрация липосом - зоо нг липида на 1 млн сперматозоидов.

Таблица 6. Оценка функциональной активности спормиев.

Состав липосом .Активность спормиев, балл

ФГХ ; ДОФЭ 7

ТИОН-ФГХ ; ДОФЭ- 6

♦X 3

контроль 3

Примечание. Активность (подвижность) сперматозоидов оценивают по десятибальной икале. Оценку ю баллов дают сперме, в которой практически все (юох) спермин имеют прямолинейно-поступательное движение.

Как видно из таблицы 6. активность сперматозоидов,

обработанных ФСК- и тйон-ФРХ-липосомами заметно выше, чем в

случай ФХ-липосом И, даже, в контроле. Можно полагать, что

"налкиднно- положительно заряженных липосом предохраняет ипермии

от стрессов в процессе эксперимента (центрифугирование, перепад

тбииоратуры). (

однако, было замечено, что при добавлении слишком болышх

концещраиий положительно заряженных липосом к сперматозоидам,

илйлидадась слипание последних. >

/

г 2

На рио. 9 показана зависимость функциональной активности сперматозоилов быка от концентрации добавленных липвдов.

в

я о

с 4

31»

-о- •X

* «гх

■а-..........а- а

100 200 300 400 ковцвгттрапия пттца, нг

Рис. 9. Зависимость функциональной активности сперматозоидов от конной трянии ФГХ

600

оказалось, что при концентрации положительно заряженных липосом (по липиду), больней, чем зоо нг па 1 млн клеток, наблюдалось слипание сперматозоидов и нарушение их подвижности. При более низких количествах липида слипания не наблюдалось и спермин активно .двигались. В случае обработки сперматозоилов лшюоомами из ФХ слипания не наблюдались вообще, однако обещая их актиьнооть-заметно ниже. .

Таким образом, можно сделать вывод, что липосомы из диольных фосфолипндоп не являются токсичными для сперматозоидов и В небольших количествах способны предохранять их от внешни«

о

о

23

воздействий. .Но данным электронной микроскопии, концентрации зоо нг липида на 1 млн сперматозоидов вполне достаточнд для адсорбции липосом почти на каждом сперматозоиде.

Результаты работы позволяют утверждать, что сперматозоиды, нагруженные липосомаыи с чужеродной ДНК могли бы служить естественным вектором для ее доставки •в яйцеклетки или соматические клетки животных. Кроме того, такие сперматозоиды можно использовать в качестве тест-системы для определения влияния различных веществ на соматические клетки и, в особенности, на яйцеклетки.

ВЫВОДЫ: '.

1. Получены стабильные бислойные везикулы (липосомы) из , „ синтетических -диольных фосфолипидов и их тионаналогов.

2. Липосомы из три-стеароксипропилендиол-1-0-фосфогомохолин : диолеоилфосфатидилэтаноламина и два-стеар'оксиэтилендиол-1-0-тионфосфогомо'холин : диолеоилфосфатйдилзтаноламина в молярном соотношении 1:г способны инкапсулировать ДНК и кальцеин на 33 - 65* больше, чем липосомы из чистого фосфатидилхолина. ДНК-захватываюоая способность липосом из три-стеарокси-пролилендиол-1-0-фосфогомохолина выше, чем липосом из два-стеврокси»тилендиол-1-0-тионфосфогомохолина, 85* и 75*. соответственно.

3. Измерен поверхностный потенциал липосом, сформированных из три-стоарохсмпропилеидиол-ЬО-фосфогоыохолина и два-стеа-рокснзтилендиол-1'0-тнонфосфогомохолнна (и7.6 и и!,э мъ, соответственно). Показано, что липосомы с . большим положительным поверхностным потенциалом обладает более

I

высокой ДНК-захватывающей способностью, а также дучпс-й адсорбцией на сперматозоидах .

4. Липисомы из положительно париженных фосфолипидоп активно адсорбируются на сперматозоидах. Степень адсорбции липооем повышается о увеличенном заряда их поверхностного потенциала. Оптимальное время.инкубации составляет 15 - 20 минут.

5. -то нг липосом (по суммарному лшшду). на л. млн.сперматозоидов"■ достаточно для адсорбции их почти на каждомсперматозоиде.-Укпзайнал' 'доза не пвпяется токсичной' для спермиев и не нарушает их функциональной активности. 1 '

6. Проведенные исследования" дают основания утверждать, что полученные нами липосомн из диолышх фосфолипидоп калинового типа и их тионаналогов могут быть использованы для перенос» ч>*ор»лноИ ДИК в цитоплазму яйцеклеток.

<:тгс.-ок работ опубликованных по теме диссертации,. 1 )'ер..;опа А.В.. Торчилин" В.II. Иоптьзовзнис ли1к>с.)М для <«-<:<>||И'>иш1 ч> "»сродного генетического материала «о (-нопм.-лтозои.'мми Бк;лл. экоп. бнмл. п. мед.. М., 1Я91, N ч. стр. 2'гг ?чл.

Горлова \.Н. Возможность использования липосом дла ассоциации чу ■••еродного ...генотического-материяла'сб'сперматозондамн. Вопросы . интемеиф жис^ттволстКп: Дубровины'. 1992. сын. 106. стр. 97-100.

1 Гоолопи \ И,. Кемлрпшли л.А.___Возможность—получения-

по'южнтельнс заряженных липосом из новых типов диолышх фое^олнпидоп. Тез. XI конф. молод, ученых мед. фак. РУЛН, М. .

\ ■' ч . ' !!" 4,1 I п

, :- - = . Я^Л ^ - .......

Оем I гг. л. Т..р. 100..........За:, 204-

Ттг. РУ£Н. Срд.-г.ашж.;дзе, 3