Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные аспекты транспорта экзогенной ДНК сперматозоидами
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Молекулярные аспекты транспорта экзогенной ДНК сперматозоидами"
На прав» рукописи
КУЗНЕЦОВ Андрей Вадимович
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ ТРАНСПОРТА ЭКЗОГЕННОЙ ДНК СПЕРМАТОЗОИДАМИ .
0300.23 - Биотехнология г
А в т о р • ф о р ш т
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук ■
у
" ' ч • ■ • • . ■ }
* . / Дуброеицы, Московсмю область 4 1999 г;
.о¿ш/ гх uObCoi^tZ "
^ ' .
Работа выполнена ь Государства* и iot>. научненисследоеатопьсхом институт* прикладной микробиологии.
доктор медицинских наук, профессор. А. В. Степанов, академик РАСХН. Л. К. Эрнст 1
доктор биологических наук, профессор, Я. П. ^Цякомо*. ' доктор биологических наук, С. В. Сомтям, доктор биологических наук,-И.аСавчемюаа
Ведущее учреждение - Всероосмйсжийнаучмо-иесладоаагельстй -" институт caffccxoxoaw'ic i aai п юй биотехнологии '
Зашита диссертации состоится 'S' 1999 г а "/&>
часов на заседании ДисеертачионмоюсоаетаД 020.1802 прн Всероссийском научно-иоследоаатальсяом институте животноводства по адресу;142012. Дуброаи^!, Подольский район, Московская oflin.
С диссертацией можно ознакомиться а библиотеке ВНИИ ' ~: ! - жиеоп юеодсте а.1
АатореФевшраасюпан'З" ^¿чг-^?^.^ 1999г.: ■ .
. ч- Ученый секретарь
Диссертационного осаета, кандидат биологических м
Научные консультанты:
. . Официальные оппоненты:
I
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Сперматозоид (СП) - это зукариотическая клетка с гаплоидным набором хромосом, специализированная на поиске/ еыоокослецифичном узнавании и доставке генетической информации в ооцит. Результатам оплодотворения ' является объединение частей : отцовского и материнского геномов-м начало ицдивцадального развития организма. в последнее время появились данные о том, что сперматозоиды ряда видов-иглокожих, земноводных, рыб, птиц и млекопитакхцих способны поглощать чужеродную ДНК (чДНК). Более того, при оплодотворении слерматозоцд может занести эту ДНК в- яйцеклетку, где {мча впоследствии и при наличии ■ соответствующих условий способна ««премироваться *(Brackett et а/,, 1971; Jonak et at., 1994; Кузнецов, Кузнецова, 1995а; Кузнецова u dp., 1993, 1999). Оказалось, что данкьм феномен, получивший название "двойной траисфеяции" (Arezzo, 1999). широко: представлен,в мире эукариот и обнаружен у представителей рада таксонов: от иглокожих до млекопитающих {Lavitrano et ai., 19В9а; Laurie, Gandoifi, 1993). Новый тип передачи генетической информации у эукариот имеет прямые„ аналоги .среди микроорганизмов, где называется ДНК-трансформацией (Smith,. 1981). Именно поэтому в нашей лаборатории укоренился термин 'трансформация сперматозоидов*. Некоторые исследователи приложили усилия для поиска факторов компетентности слермиев к чужеродной ДНК. В настоящее время известны связывающие ДНК белки ("рецепторы ДНК"): MHCI! (Wu et в/., 1990), белок 30-35 (Lavitrano et в!., 1992а), CD4 (Lavitrano eta/., 1997b) и отрицательный регулятор tF-1 (37 кД) (Lavitrano et al., 1992b.c; Zani е/ at., 1995). С другой стороны, рядом авторов предложены различные приемы искусственной трансформации слермиев (Brackett et al., 1971; Gagne ef ai,, 1991; Nakanîshi. Iritani, 1993; Rotimann et al, 1991; Баранов и др., 1990; Горлова, 1993). 8 области биотехнологии представляется весьма интересным использовать сперматозоиды .в качестве переносчика ■ рекомбинантной ДНК для получения трансгенных животных (Rottaiann. Hofer, 1987; Spadafora, 1990; Kicnetsov ef al., 1997b; Кузнецов и др., 1994, 19966). Немаловажным является такой аспект проблемы -транспорта экзогенной ДНК мужскими гамагями. как возможность инфицирования
ЦЕНТРАЛЬНАЯ НЪУЧНАЯ (ОТЕКА счльскохш. скадеыни мм. Н, А.
И но Ка .
посторонними ДНК при оплодотворении (Cabrera et а/., 1997; Chan et el., 1995; Chen, Chen, 1996; Cohen, 1991; Dussaix ef af„' 1993; Habrova ef a/.,' 1995; Кузнецов и др., 1996a; Сигаееа и др.. 1996). В связи с этим возникает вопрос: ' существуют ли механизмы опознавания (Elinson, 19S6; Houshmand et el., 1997; Kanada etat., 1995) и защиты (Щит и dpi, 1998) от проникновения чужеродной - . ДНК при оплодотворении? И, наконец, интересно знать * реализуется ли этот тип переноса генов в природных сообществах (Кузнецов, Кузнецова, 1993), "
Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению процесса переноса рекомбинантных ДНК в яйцеклетки сперматозоидами ряда видов млекопитающих, рыб и моллюсков с целью создания трансгенных животных. В связи с зтим были поставлены следующие задачи:
• изучить проницаемость мужских гамет для иизхо- и высокомолекулярных ^ ■ соединений - по их, способноста вызывать , дехондвнсацию хроматина -спермиев ir» vtf/o; .„у ',.-_Jv Vy'/;'.
• исследовать процесс взаимодействия экзогенной ДНК со сперматозоидами и v его модуляцию; ..■'.'..'■"". '■■."у"'Л-'С-' ■
• разработать методы включения чужеродной ДИК в спермин; : : - ; V
• доказать факт передачи экзогенной ДНК а ооциты и оценить эффективность ". переноса рекомбинантной ДНК по ее экспрессии на: ранних стадиях
■■ эмбриогенеза; . . ■: ,- '.'.< "■' ' • исследовать перенесенную сперматозоидами экзогенную ДНК а развивающемся организме; . .........."'-';Л ,'■■■.,■•',
• изучить последствия переноса посторонней ДНК сперматозоидами применительно к раннему эмбриогонозу.:
Новизна результатов заключается • том, что ' -
• впервые подробно изучен процесс взаимодействия экзогенной ДНК со сперматозоидами кролика и факторы, влияющие на него;
• использована дигоксигениновая техника мечения ДНК для картирования участков связывания на поверхности слормия; .
> разработан метол тестирования векторных свойств спэрмиев с применением ооцитов золотистого хомячк? бе» zona pellucida;
>: разработаны методы инкорпорирования ДНК в мужские гаметы с помощью , диметилсульфоксида, тепловой обработки или электропорации;
> создана модель проникновения экзогенной ДНК в ядро спермия;
> предложена ротаксаноеая модель упаковки рекомбинангной ДНК в ядре ' сперматозоида; ' ■ ■ : . ■
• с помощью спермиев осуществлена передача ряда рекомбинантных плазмид ■ . (pCMVtecZ, pRK3tecZ, pMT/acZ и др.) в геномы кролика и вьюна.
Научная значимость:
• накоплены данные, описывающие процесс взаимодействия ДНК со спермия-ми кролика, которые стали теоретическим фундаментом для разработки методов трансформации сперматозоидов других видов животньис, рыб, а также моллюсков; "' _ * ■ 1
• доказана принципиальная возможность < применения - сперматозоидов в качестве подвижного вектора для переноса чужеродной генетической информации; _ •
• в работе продемонстрирована высокая инфицирующая способность мужских гамет и поставлен вопрос о защите спермиев от контакта с посторонней ДНК при оплодотворении in vitro\
• полученные в работе результаты могут быть использованы' при изучении регуляции экспрессии генов и модуляции их активности на ранних стадиях
, эмбриогенеза; '■* ;
• в результате изучения процесса переноса экзогенных последовательностей ДНК сперматозоидами разработаны теоретические положения, совокупность которых можно квалифицироватькак достижение в развитии перспективных направлений прикладной генетики - генотерапии и трансгенеза.
Апробация работы. Результаты исследований бьши представлены на конференциях в ГНЦ ПМ (ОСоленс*, 1991, 1992 гг.), ВИЖе (Дубровицы, 1993, 1994 гг.). на межинститутском семинара ВНИИ СХ6 (Москва, 1994 г.), на VI
конференции Российской Федерации Ноеые направления биотехнологии (Пущино, 24-26 мая 1994 г.), на кафедре эмбриологии МГУ (Москва, 1994,1993 гг.), на международной научно-практической конференции - Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства (Стелногорсх, 2-4 августа 1995 г.). на международной конференции - Eurasian Symposium on Cunent Trends in Biotechnology: Gene Diagnostics, Gene Therapy and Informational Immunity (The First Turkish - Russian Mee ¡¿no. Ankara, October 29 - November 6, 1995). на международной конференции посвященной памяти акад. А А. Баевэ (Москва, 20-22 мая 1S9B г.), на международной конференции • 8th IMP Spring Conference "Genes* (Vienna. Austria. May 22-24, 1997), на межпаборяторном семинаре в Институте белка (Пущино, 1997 г), на международной конференции - ¡V International Marine Biotechnology Conference (Naples. Baly. September 22-29.1ЭЭ7), на межотдепьском семинаре в Институте биологии южных морей (Севастополь, 1998 г), на кафедре биохимии и биофизики ДГУ (Днепропетровск, 1998 г.), на международной конференции - II International Conference on Transgenic Animals (Beijino- October 26-28. 1999).
По теме диссертации опубликовано 35 работ, Э обзорные статьи, 1 патент, 1 монография. •
Структура диссертации. Диссертационная работа сострит из введения, обзора литературы Yio проблеме транспорта экзогенных ДНК сперматозоидами^ описания объектов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, рекомендаций и списка цитируемой литературы (377 . источников). Диссертация изложена на 242 стр. машинописного. текста, -содержит 46 рисунков и 30 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕРАБОТЫ
Во введении рассмотрена актуальность проблемы, анализируются цель и задачи исследования, изложены научная новизна и значимость результатов работы, выделены основные положения, въмосимые на аащиту.
Обзор литературы посвящен современным данным о переносе сперматозоидами. чужеродной генетической информации. Рассматривается феномен спонтанного захвата посторонней ДНК зрелыми спермиями. излагаются сведения о * кинетике и топографии связывания ДНК * со сперматозоидами, описываются факторы, контролирующие процесс связывания, приводятся доказательства проникновения ДНК в сперматозоиды. . Упоминаются методы искусственного введения (инкорпорирования) ДНК в сперматозоиды различных видов животных. В разделах, посвященных' переносу экзогенной ДНК сперматозоидами в ооциты, описаны способы ; доказательства выполнения спермиями векторных функций; акцентируется внимание не обнаружении перенесенной ДНК по радиоактивной метке или при помощи полимера зной цепной реакции, а также на идентификации экзогенной ДНК по ее экспрессии. Дается критический анализ результатов экспериментов по получению трансгенных животных с помощью трансформированных спермиев. Рассмотрены различные варианты транспорта экзогенной ДНК и 'судьба* перенесенной в ооцит посторонней ДНК: 1) деградация привнесенной ^ чужеродной ДНК, 2) персистенция в экстрахромосомном состоянии, f3) интеграция чужеродной ДНК в геном. Рассматриваются возможные механизмы интеграции экзогенной ДНК; оппортунистическое репарационное лигирование, характерное для микроинъекции ДНК в пронуклеусы зиготы, ретротранспозон-зависимая интеграция и др. Анализируются результаты итальянской школы . исследователей * работы М. Lavitrano и С. Spadafora (Dipaitimento di Mediana Sperimeniale e Patotogia, Universlt a La Sapienza, Roma, ItalyV.
В собственных исследованиях мы придерживались разнопланового изучения процесса переноса посторонней ДНК мужскими гаметами с цепью создания независимого представления об этом явлении. Чтобы исключить возможность контаминации в экспериментах по переносу экзогенной ДНК ' сперматозоидами, мы использовали плазмиды pVP7 и pGEM-4Z Для доказательства специфичности экспрессии экзогенной ДНК а ранних эмбрионах применяли бактериальный ген iacZ, находящийся под контролем разных эукяриотических промоторов (CMVe, • RSV-LTR, МТ-1). Следуя ' классической статье Brackett и соает. (1971), для изучения механизм;) переноса
был выбран кролик - один из хорошо изученный объектов биологии развития, В филогенетическом плане работа выполнена на. моллюсках, земноводных, рыбах и млекопитающих. Процесс переноса экзогенной ДНК сперматозоидами логически разделили на несколько последовательных этапов и исследовали каждый из них с помощью подходящих молекулярных и эмбриологических методов, применив ингибиторный ■ анализ. Дополнительно использовали разные топологические формы ДНК и методы трансформации спермиев. Свертка накопленной информации выполнена в виде структурных моделей. Такой* подход обеспечил создание общей картины описываемого феномена. Основной план исследований представлен на схеме (Рисунок 1).
Рисунок 1. Схема исследований
Б разделе 'МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ* приводятся необходимые в работе сведения по эмбриональному развитию подопытных животных; кролика (Qfyefo/agus cuniculus), вьюна (Misgurrws fossilis L) и . черноморской мидии (Mytäu$ galloprovinctsKs L). Изложены условия проведения экспериментов на O.cuniculus: содержание, кормление (Нормативы, Минздрав, 1983) и подготовка животных; получение сперматозоидов. Приводится методика тестирования векторных свойств, спермиев кролика с помощью ооцитов золотистого хомячка без zona pellucida, разработанная совместно с И.Ю. Щит (1997). Представлены физические карты используемых в работе рекомбинантных ллазмид: pRK3/acZ, pCMVtecZ, pMTtocZ и др. Описаны: подготовка ДНК для трансформации спермиев и микроинъекции зигот; условия экспериментов .по связыванию сперматозоидами экзогенной ДНК, : дигоксигениноеая техника визуализации ' чДНК; методы выявления бактериальной (í-галактоэцдаэы с помощью X-gal, MUG или CPRG; условия выделения хромосомной ДНК; проведение цепной полимеразной реакции с праймерами к иуклестидной последовательности гена /ас2; дот-гибридизация и Саузерн-бггатинг (Boebringer Manheim fluide. 1969; Femientas guide, 1996/9?; Promega guicie, 1539/90; Гловер, 1963,1939; Девис и 6р.; 1984; Дейвис и др, 1990; Мазии и др., 1990; Маниатис и др., 1984).
В разделе 'РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ'
систематизированы данные, полученные а предварительных й основных эютеримекгах.'
Предварительные исследования включают опыты по инъекции экзогенной ДНК 8 зиготы кролихов и овец, проведенные совместно с С И. Городецким, Л-Е- Андреевой/ ЕА Вашкеевым. И.Л. Гольдманом, П А. Гоголевским, . С.Г„ Кодулиным, НА Зиновьевой и G Brem (Германия). Эксперименты описаны в хронологическом порядке, дается их критический .. анализ. Оценивается эффективность метода микроинъекции при создании трансгенных животных, которая составляет для кроликов 1,4% (Таблица 3). Рассматривается идея использования MAR-элементое. для поддержания Трансгена в виде автономного петельного домена в составе хроматина с целью
в
лоэиционно-независимой экспрессии. Указывается на то, что применение сперматозоидов открывает возможность для принципиально иных подходов к интродукции чужеродной ДНК а геном высших - эукариот (транспортировка крупных фрагментов ДНК, массовый перенос генов и возможность селекции в случае большого количества яйцеклеток). Далее описана неудачная попытка трансформации зрелых сперматозоидов кролика с применением селективного маркера (саО и селекции клеток по подвижности - (Ст1). Рассматривается возможность использования везикулярного транспорта для введения в спермин экзогенной ДНК. Изучена кинетика взаимодействия липосом со спермиями. Обнаружен ингибирукпций эффект хлороквина - специфического ингибитора эндоцитоза - на проникновение ДНК в сперматозоиды. Описаны структуры... потенциально ответственные за транспорт ДНК в спермин. Приводятся результаты изучения проницаемости мембран и деконденсации хроматина сперматозоидов кролика по интенсивности флуоресценции бромистого этидия.
Основные эксперименты раскрывают суть диссертационной работы и начинаются с исследования процесса взаимодействия чужеродной ДНК со ' сперматозоидами млекопитающих и факторов, влияющих на него Это такие разделы; 1) изучение связывания ДНК сперматозоидами кролика (кинетика, ' ингибиторный анализ, топография связывания, расчет емкости спермиев для. чужеродной ДНК), 2) факторы, влияющие на связывание экзогенной ДНК сперматозоидами (деградация ДНК а семенной плазме, ингибирующев . действие семенной жидкости на связывание ДНК), 3) особенности связывания молекул ДНК сперматозоидами быка и человека.
* ' Показано, что сперматозоиды млекопитающих, отмытые от семенной плазмы, самопроизвольно связывают ' экзогенную . ДНК. Около 60-70% добавленной в среду инкубирования ДНК ассоциирует с 35% спермиев кролика в течение первых ' 15 минут, демонстрируя двухфазную кинетику.. Взаимодействие имеет обратимый характер. Поглощение и последующая элиминация ДНК проходят более активно при физиологической температуре (Рисунок.2). 62% связанной ДНК расположены в посгакросомной области головки спермия (Рисунок 3). Сперматозоиды, полученные от самцов, которых содержали в разных половых режимах проявляют различную кинетику взаимодействия с чДНК. '
g
О 20 40 M М 100 130
Рисунок 2. Взаимодействие радиоактивной ДНК со сперматозоидами кролика
1 - при 4* С; 2 - при 37* С. ' .
Распределение Распределение Зоны -.. чДНК по клеткам чДНК по зонам связывания
. .untw
' И*МЯ»Ы**ЮТ - 01
' 65% ■. 62% ...
Рисунок 3. Топография связывания чужеродной ДНК со сперматозоидами ' кролика.
. Представлены диаграммы распределения меченной дигоксигенином ДНК и соответствующего индикаторного красителя по клеткам и зонам на отдельных клетках, в также схема зон связывания чДНК сперматозоидом: I • акросомный участок, II • экваториальный сегмент, II) - лостакросомная область головки, IV • задняя часть головки, V - средняя часть сперматозоида, VI • хвост, VII -концевой отдел. Цифры соответствуют выраженной в процентах допе окрашенных и неокрашенных спермиев и доле сперматозоидов с красителем в зонах, олределенньк на схеме зон связывания чДНК.
8 разделе (У.З описывается разработка а соавтора ое с И В. Кузнецовой 0995) метода инкорпорирования ДНК » спермин кролика: влияние димегилсульфоксида (ДМСО). медленного охлаждения и кратковременного теплового воздействия на подвижность сперматозоидов, ассоциация чужеродной ДНК со спермиями в присутствии димвтилсульфоксидэ, влияние диметилсульфоксцдз. на проницаемость сперматозоидов для ДНК в присутствии семенной жидкости, аддитивный эффект диметилсульфоксида и тепловой обработки (ТО) на проницаемость сперматозоидов, который составляет 123%.
12 3 4 5 6 7 В 9 10111213
Рисунок 4. ПЦР-анллиз лишенных гола реЛисШа ооцитов хомяка после оплодотворения спермиями кролика, которых трансфецировали плазмндой рСМ\МесГ
1 • ооциты хомяка, к которым добавили 1 мкт ДНК рСМУ/ас?. 2 - яйцеклетки хомяка, оплодотворенные капацитироаанными спермиями кролика; 3,4,10 - -яйцеклетки, оплодотворенные спермиями, которые инкубировали с плазм идой рСМУ/зсТ; 5 • яйцеклетки, оплодотворенные спермиями, на которые действовали ДМСО и тепловым шоком; 6-9 - то же, с ДНК рСМУ/ес£; 11-отрицательная проба без ДНК; 12 - хромосомная ДНК контрольного трансгенного животного с геном 13 • ДНК фага X, рестрицированная РзН,
Далее в разделе IV. 4 приводятся доказательства переноса' экзогенной ДНК сперматозоидами кролика а яйцеклетки а опытах «л (лГго «л >У» «иэ: 1) обнаружение чужеродной ДНК а гола-Сгве яйцеклетках хомяка и ранни* эмбрионах кролике с помощью попимеразнвй цепной реакции (Рисунок 4), 2) идентификация - ропортерной ДНК по экспрессии гена 1асЖ в доимплактационных эмбрионах кролика - это обнаружение активности (3-галактозидазы флуори метрическим методом с использованием М1Ю и
мстохимичесхое выявление при - помощи хромогенного субстрата Х-да1 (Таблица 1). Сравнивается эффективность двух методов трансформации по транзиентной экспрессии релсртерного гена 1ас2 в эмбрионах кролика и исследуется воспроизводимость опытов ло переносу экзогенной ДНК рКК31асг сперматозоидами в ооциты.
■ Применение ■ диметилсульфоксида и тепловой обработки * для инкорпорирования ДНК рЙКЗ;ас2 е спермин кролика увеличило в 3 раза (с ,19,3% до 61,7%) эффективность ее переноса в яйцеклетки и последующую . экспрессию гена /ас2 в ранних эмбрионах кролика (Таблица 2). Максимальное значение экспрессии получено при использовании эквимолярной смеси линейной и кольцевой форм ДНК. ' '
Таблица 1. Экспрессия гена 1ас2 под контролем разных промоторов в 48-часовых эмбрионах кролика
Название конструкции Промотор Релортерный ген Обнаружение p-gal в доимппантационных эмбрионах
pRK3/acZ RSV-LTR iacZ
рСМVtecZ CMVe tacZ
pMTtócZ МТ1 IacZ
pGEM4Z ...
'•гистохимическое окрашивание X-gal, *-фпуориметрия с использованием MUG, *!-' присутствие/отсутствие сигнала
Таблица 2, Экспрессия гена l*cZ в 48-часовых эмбрионах кропи ка после . ыикроинъекции, естественной и искусственной трансформации спермиев -
Форма ДНК микроинъекция в пронуклеус зиготы
Линейная 4/151 (2.7%)
Кольцевая 45/58 (77.6%)
трансформация спермиев естественная искусственная
Линейная 11/57(19,3%)' 37/60(61,7%)"
Линейная + кольцевая (1/1) НО 36/37 (97,3%)
Линейная + кольцевая (1/4) НО 13/18(72.2%)
Кольцевая НО 3/22 (13,6%)
Примечание: НО - не определяли, - статистически достоверное отличие (Р<0,01 к'-тест)
Воспроизводимость результатов экспериментов - по переносу чДНК спермиями в ооциты кролике при искусственном осеменении изучали с помощью плазмид рВКЗ/ас2 и рСМУ/асг. В результате гистохимического окрашивания эмбрионов показано, что в: отдельных экспериментах
частота встречаемости зародышей, иаквпливаюифм Р<алакгозцдазу составляет от 0% до 974 при средней величине 31,6±16,1 и асимметрии распределения 0,96 для рЯКЗ/ас£ а также 37,7±24,3 и 0,44 для рСМУ1ас? соответственно (Рисунок 5). Усредненная по обеим ллазмцдам эффективность переноса экзогенной- ДНК сперматозоидами кролика составляет 35%, что совладает с долей спермиее способных связывать нДНК (Рисунок 3).
Г
I -
Рисунок б. Воспроизводимость экспериментов ло переносу ДНК рРКЗ&ег и рСМУ£м2 в кйцеклеши кролика при помощи сперматозоидов
1 - С ДНК рНКХасг, 2-е ДНК рСШ/ас2, 3-бе» ДНК (среднее число эмбрионов в опыте-17,0*6.5), .
:___В этом же раздела диссертационной работы приводятся результаты
обнаружения последовательности рНКУвсХ (Рисунок 6) с помощью дот-гибридизации в ДНК, выделенной из 27 рожденных животных. Хромосомная и ДНК из ушей 9 крольчат (ГО) в возраста 1 мес. (№2,5, в. 14, 26,28,29. 34 и 43)
Была гидротзоеана рестриктззой ЕсоШ. а потом исследована при помощи Саузерн-блотинга и гибридизации с зондом [иР|-рРКЗ/зс7. У крольчат, полученных от самца №5 и самок С1, С2. СЗ. в пробах 2, 5. 6 (5хС1), 14{5хС2) и 26 (5хСЭ) обнаружено по два утяжеленных фрагмента: более 23 т.п.н. и около 10 т.п.н. (Рисунок 7}. Помимо этого, отмечено слабое распределение сигнала в области, заключенной между указанными рестриктами/ От позитивных кроликов (самца №8 и самки №2), по достижении ими половой зрелости, было получено потомство. Хромосомную ДНК из ушей крольчат № 50-56 (Р1) гибридизовали с. меченой плазмидой рРЖЗ/асг, однако положительных сигналов не обнаружено. У животных № 1-3. 14, 15 (ГО), часть из которых по результатам дот- и Саузерн-анализа была трансгенными, в возрасте 6 месяцев из ушей снова была выделена хромосомная ДНК и проанализирована с помощью гибридизации на присутствие последовательности рВКЗИасГ. Результат оказался во всех случаях отрицательным. Продукт экспреоси гена 1ас2 искали в сыворотка крови 6-месячных опытных животных № 1-8, 14, 15 и 21 при помощи цветной реакции с хромогенным субстратом р-гаяактозидззы • СРНС; активность р~галактозидазы не обнаружена. Из печени, селезенки, почек, сердца, легких, мышцы, мозга и семенника кролика №21 (ГО) в возрасте 6 месяцев была выделена высокомолекулярная ДНК и гибридизоеена в точках с плазмидой рИКЭ/ас?, меченной дигоксигенином. Сигналы были зарегистрированы в печени, селезенке и почках. -
1 а! 3 511ИШ
р^с2 и!. И '■■■Ш'"-*
пая рис1Э
Рисунок 6, Физическая карта плазмиды рНКЗ/ас2 .
Плазмида рНКЗ/ас2 состоит из следующих частей: З'-фрагмект длинного концевого повтора провируса саркомы Рауса {RSV-1.TR). который содержит сигналы инициации транскрипции; полусинтетический ген /ас2, кодирующий бактериальный фермент р-галзктоэидзэу; Э'-концевой участок гена гормона роста быка (ЬвН), содержащий сигналы сплайсинга, полиаденилирования и терминации транскрипции; вектор р11С1Э (Жаданов, 1991).
Т.П.Н. М 2 5 14
: У4 . ' .
1-
вгл
— нм
7.1 4,4 2,7
Рисунок 7. Результат гибридизации зонда ["р]-рРКЗ/ас2с ДНКиз презумлтивно трансгенных животных
Б лот-гибридизация с хромосомной ДНК, гидролизованной рестриктазой ЕссР): М - маркеры, смесь Н1гк1111 и Н1п<3111,Крп1-рестриктов ллазмиды рРКЗ/ас^ 2,5,14 - ДНК кроликов №2,5,14; ВМ -фрагмент более 23 т.п.к; НМ* рвстрикт размером -10 тин.
Были опробованы разные сочетания способов ' трансформации сперматозоидов (естественная, искусственная) и топологических форм ДНК (линейная, линейная + кольцевая) (Таблица 3). В случае использования смеси линейной и кольцевой . форм ппазмиды рЛКЗШй2 чужеродные последовательности регистрировали у животных месячного возраста. Экзогенная последовательность была обнаружена в геноме животных а малом числе копий {»0,04-0,4) При обработке хромосомной ДНК позитивных живо гных эндоиуклеаээй ЕсоШ м последующей гибридизации с линеаризованной ллаэмидой рШЗАэс? а качестве зонда, вместо ожидаемого фрагмента размером 7.1 т.п.н, на блотах обнаружены, по два высокомолекулярных рестрикта и слабая 'засеатка* между ними. Плазмида рРКЗ/ас2 была перестроена, не экслрессировалась, имела мозаичное распределение по тканям и не передавалась потомству. Этот результат может быть следствием интеграции чужеродной ДНК в область нестабильных повторов и указывать на ее 11ерсиствнциЮ в автономном состоянии в виде коеалентно замкнутых конкатемероа.
Таблица 3. Получение трансгенных кроликов методом микроинъекции и позитивных по рЙКЗ/эс2 крольчат с помощью трансформированных сперматозоидов
Форма ДНК микроинъекция в пронуклеус зиготы
Линейная 6/416(1,4%)
трансформация спермиеа естественная искусственная
Линейная 0/26 (0,0%) 0/29 (0,0%)
Линейная + кольцевая (1/4) 24/27 (88,9%)' 8/17 (47,1%)*
Примечание: НО - не определяли,- статистически достоверное отличив (Рс0,01.т*-тест)
Вероятность обнаружения последовательности рРХЗ/зс? о потомстве крольчих, осемененных трансформированными сперматозоидами (68,9% и 47,1%; Таблица 3), на первый взгляд не согласуется с экспериментами по выявлению, транзиентной экспрессии индикаторного гена 1эс2 в доимплантационных эмбрионах (19,3% и 61,7%; Таблица 2), т.е. в случае искусственной трансформации с применением ДМСО мы добились увеличения числе доимплантационных эмбрионов с экспрессией гена /ас? в 3 раза, но количество животных месячного возраста с содержанием этого гена снизилось в 2 раза. Меньшая доля появления позитивных особей при искусственной трансформации (47,1%) по сравнению с естественной (83,9%) может быть следствием гибели развивающихся эмбрионов из-за нарушений, вызванных у спермиеа. Креме того, такой результат резко отличается от микроикьекции ДНК в пронуклэус (1,4% трансгенных особей) и свидетельствует в пользу высокоэффективной интеграции трансгена непосредственно в хроматин сперматозоида - по данным 2огад! и вр»За<ога (1997) - в основание петельных доменов по сайтам связывания топоизомеразы II. вероятно, естественная трансформация способствует проникновению экзогенной ДНК в ядро "компетентного" сперматозоида и обеспечивает ее встраивание а геном, в то время как искусственная приводит к "незаконному" накоплению чДИК в цитоплазме, попаданию в ядро слермия и ассоциации с хроматине м в форме, ротахсаное, в после оплодотворения проявляется в виде тр^кзие.-ггиой экспрессии трансформирующей ДНК в ранних эмбрионах. Мы полагаем, что а случае естественной трансформации плазмцда рЯКЗ&с2 первоначально
встроилась а область нестабильных повторов хроматина спермия, *выщепилась* после оплодотворения, просуществовала в течение некоторого времени в виде эписомы и в дальнейшем элиминировалась у реципиентных животных. Отметим, что возможность персистенции экзогенной ДИК в виде эписомы была продемонстрирована Rottmann и соавт, (1992,1994).
В пунктах 1V.5-6 систематизируются результаты влияния трансформации слермиеа кролика на их оплодотворяющую способность, развитие эмбрионов и рождаемость потомства - блокировка оплодотворения и появление аномалий в ходе дробления эмбрионов, возможные корреляции между типом ДНК, уровнем экспрессии и нарушениями раннего эмбриогенеза. Приводятся результаты экспериментов. по переносу экзогенной ДНК сперматозоидами быка {Sos taunis), лягушки {Rana temporaria), карпа (Сyprimis carpió), вьюна (Misgurmjs fossiüs L) и мидии [Mytilus ga!toprovinciali$ L). В лабораторных опытах на карпе и еьюне, проведенных совместно с В А Барминцееым и Л- Б. Андреевой, удалось осуществить транспорт экзогенной ДНК слермиями в икру. Вопрос, может ли посторонняя ДНК передаваться мужскими гаметами в природных сообществах, остается спорным. В совместных с A.B. Пиркоеой'и Г.А. Деорянчикоеым экспериментах на двустворчатых моллюсках получен отрицательный результат. С другой стороны, наглядно продемонстрировано, что обработка спермиев ДНК негативным образом сказывается на последующем развитии личинок. Количество развившихся троотофор уменьшалось (й«0,95) в результате увеличения концентрации фрагментированной ультразвуком ДНК (04ДНК) и времени обработки сперматозоидов мидии (Рисунок В). Добавим, что нарушение развития наблюдали не во всех опытах. Выживаемость' личинок заметно варьировала кэ фоне индивидуальной изменчивости (Рисунок 9). Негатианью эффекты действия ДНК на спермин и последующее. развитие эмбрионов были отмечены также при работе С другими животными (Таблица 4; Jonak et al./1Э94; Гершензок, 1996). В случае эмбрионов кролика наблюдали отставание в дроблении, остановки развития, фрагментацию и гибель эмбрионов. Как и в работа Júrisícova с соавт, (1996) у ранних зародышей отмечены морфологические признаки апопггоза.
Рисунок 8. Развитие личинок мидии М.дз11орго*1пс1аН» поело обработки {(мрмлоюидов разными кокцоктрациями озДНК в течение различных промежутков времени
Рисунок 9. Влияние ДМ С О (3%, 30 мин) и озДНК (200 м кг/ил, 30 мин) на оплодотворение и раннее развитие мидии на фоне индивидуальной изменчивости, выявляемой в попарных скрещиваниях '.г
Таблица 4. Эффекты, вызываемые процедурой трансформации сперматозоидов чужеродной ДНК <
Объект' . Днк Эффект Обнаружение
исследования - (концентрация) (время наблюдения)' ЧДНК
кролик РРКЗЙ&2Г 53,24 аномальных гибридизация*,
(Oryctotegus (5-20 мкг/мп) эмбрионов (48 ч) Р-ва!*
cun/culus) рСШ1асг (5-20 мкг/мл) 79,6% аномальных эмбрионов {49 ч) ПЦР\ р-даГ
озДНК из спермы 05,6% НО
лосося неоплодотворенных
<500 м кг/мл) яйцеклеток .
бык рИКЗ/асг 75,9%- ПЦР"; р-даГ - .
(Sos taurus) (10 мкг/мл) неоплодотворенных блокировка
. ■ яйцеклеток гепарином
лягушка рЯКЗ/зсг 1,0% развившихся: НО
(Rana temporaria) (50 мкг/мл) икринок (6-7 ч)
карп рИКЗ/ас2 65% аномальных »-да!*
(Cyprinus carpió) (50 мкг/мл) эмбрионов
ВЬЮН рСЬ/Ы1асг изменение ПЦР*, р-да|"
{Misgumus (40-100 мкг/мл) жизнеспособности
fossrf/s L.) личинок в широком1 диапазоне (19-52 ч)
озДНК из спермы 38,3% и 30.2% НО
лосося выживших личинок
(250,500 мкг/мл) (19-294)
мидия рсмадэсг НО ПЦР", р-даГ
(Mytilus (5-20 мкг/мл)
gatlopmvináatis L) озДНК из спермы лосося (5-500 мкг/мл) эффекты неоднозначны (24-96 ч) НО
1)-да! - активность р-гелактоэидаэы, +/- - присутствие/отсутствие сигнала, НО -на определяли ПЦР - полимераэная цепная реакция
В главе V обсуждается возможность использования сперматозоидов кролика в качестве переносчиков чужеродного генетического материала в ооциты. Сюда относятся: 1) интерпретация результатов по взаимодействию чужеродной ДНК со сперматозоидами, 2) понятия диметипсульфоксидньиЗ шунт и состояние компетентности слермиев к экзогенной ДОК. Обосновывается выбор рекомбинантных конструкций и сроков визуализации и* экспрессии в опытах по переносу экэоге*юй ДНК в ооциты кролика. Обсуждается перенос репортерной ДОК сперматозоидами а ооциты, транэиентнэя экспрессия гена lacZ и накопление ß-галахтозидазы в доимплантационных эмбрионах. Подчеркивается, что проникновение экзогенной ДОК в ядро спермия является необходимым условием ее интеграции в гоном зиготы. Суммируются данные по влиянию различных агентов ^ на - связывание ДНК спермиями (Таблица 5). Приводятся модели проникновения экзогенной ДНК в сперматозоид млекопитающего (Рисунок 10) и ее упаковки в хроматин спермия. Обсуждаются возможные ' причины гибели доимплантационных эмбрионов после оплодотворения яйцеклеток трансформированными сперматозоидами, одной из которых может быть апоптоз. Поднимается вопрос о существовании механизмов опознавания чужеродных последовательностей ДНК в ранних эмбрионах.-.....
В разделе V.2 рассматриваются пути повышения частоты интеграции и способы заидоы привнесенной спермием чужеродной ДНК от деградации: 1} модификация сахарофосфатного остова и концов ДНК, 2) использование ферментов нуклеинового обмена и олигонукпеощдов направленного действия, 3) применение адгезивных последовательностей (MAR-элементов), ort репликации и транспонирующих элементов в составе ДНК, 4) разработка систем селекции трансформированных эмбрионов, б) использование элементов таргвтинга генов, 6) применение ДНК разной конформации. Обсуждаются перспективы использования подвижных векторов в генотеропии и 'трансгенезе.
Выводы и рекомендации для дальнейших исследований завершают работу.
4. Таблица S. Влияние различных агентов на подвижность сперматозоидов ... кролика и способность связывать чужеродную ДНК .
Агент ч Связанная ДНК Подвижность
(инкубирование 30 мин при ИТ) (%> (♦/->
контроль - отмытые спермин ■ б5±5
бычий сывороточный альбумин (15 мг/мл) 97±2
сыворотка кроеи кролика (60% об/об) зо±э
семенная жидкость кролика (50% об/об) 17±2 +
семенная жидкость человека (50% об/об) 16±2
хлороквин (1 мг/мл) 14±2
гепарин (1000 ед/мл) 1*1
тепловой цкж (60* С, 5 мин) 28t3
азид натрия (15 мМ) 10±2
глутароеый альдегид (2,5%) 5±1 -
Рисунок 10. Гипотетическая схема проникновения экзогенной ДНК 8 сперматозоиды млекопитающих
1 -плазмалемма Ьперматозоида, 2 * связанный с цитоскелетом интегральный ' белок, разделяющий мембранные домены. 3 - везикула. 4 - везикула, ' - высвобождающая связанную ДНК, 5 - ядерная оболочка, 6 - протамины, 7 -хромосомная ДНК, в • ядерный матрикс, 9 - ядерный аннулус; +i- -актиеация^ингибирование процесса захвата ДНК; I, It, III, IV, V- зоны на поверхности спермия согласно Atkinson ef ef.. 1991; Кузнецов, Кузнецова, 1995; (Рисунок 3). *
ВЫВОДЫ .
1. Плотно упакованная в ядрах сперматозоидов кролика хромосомная ДНК : доступна как дпя малых молекул (Ыа\ Е(Вг, ДТТ), так и для
высокомолекулярных соединений • (гепарин), которые способны . при физиологических значениях рН и температуры проникать в мужские гаметы ./ и в разной степени вызывать деконденсацию хроматина,
2. Зрелые' сперматозоиды млекопитающих: кролика, быка и человека,, отмытые от семенной жидкости, самопроизвольно захватывают до 60-70% добавленной радиоактивной ДНК, достигая стадии насыщения за 10-30 мин. Среди сперматозоидов кролика ДНК связывают 35% клеток. Емкость слермиев кролика составляет -10000 молекул экзогенной ДНК размером 10 т.п.н. на одну клетку. Связывание чужеродной ДНК со слермиями подавляют азид натрия, хлороквин, гомологичная и гетерологичная плазма семени и полианионы, такие как ДНК-конкурент и гепарин, напротив,
■ поликатион поли-О-лизин способствует процессу связывания.
3. Выделены 3 фазы взаимодействия экзогенной ДНК со сперматозоидами . ' млекопитающих: специфическая адсорбция, проникновение и частичная
элиминация ДНК. Создана модель интернапизации ДНК а ядро сперматозоида канонического типа. Разработаны оригинальные процедуры ' инкорпорирования экзогенной ДНК в спермии кролика с применением ДМСО и тепловой обработки и в сперматозоиды вьюна - путем электролорации.. Предложена ротаксаноеая модель упаковки - рекомбинантной ДНК в сперматозоиды млекопитающих. А. Трансформированные сперматозоиды кролика, карпа и вьюна в процессе оплодотворения могут вносить экзогенную ДНК в ооциты с эффективностью, достигающей 97%, при средней величине для кролика -35%. Привнесен кьи слермиями ДНК рНКЭ/ас2, рСМ\flacZ и рМТ(ас2 сохраняют способность к экспрессии гена о чем свидетельствует активность . бактериальной р-галактоэидазы в доимплантационных эмбрионах кролика. Данные ДНК-гибридизации говорят о том, что ппазмида ■ рЯКЗ/ас2, внесенная сперматозоидами в ооциты кролика, обнаружена у
"ч 73% рюжденных животных с копийностью 0,04-0,4 на геном, подверглась ^.перестройке и имела .мозаичное распределение по тхакям,'" что '
подчеркивает ее нестабильное существование у реципиентных животных/ -5, Диметилсульфоксцдный шунт при искусственной трансформации способствует накоплению экзогенной ДНК в цитоплазме, проникновению в , ядро и удержанию в хроматине спермиев кролика в 47% случаев... Благодаря использованию естественной компетентности сперматозоидов и -смеси линейной и- кольцевой • форм ДНК интеграция чужеродных последовательностей ДНК с хроматином составляет 83%. ,
6. Экзогенная ДНК в высоких концентрациях (200-500 мкг/мл) блокирует процесс оплодотворения у кролика, вьюна и, в некоторых случаях, у мидии. Перенесенная спермием - чужеродная' ДНК. способна вмешиваться в. развитие кролика, лягушки, вьюна и мидии/негативными последствиями; чего являются отставания в дроблении, остановки развития, фрагментация и гибель эмбрионов. У трзмсфецйровакнь« . сяермиями эмбрионов обнаружены морфологические признаки : апогттозз. Эффективность. "двойной трансфекции* возрастает в ряду: моллюски, рыбы, млекопитающие. - .
7. Обнаруженная способность сперматозоидов . представителей разных таксономических групп; при определенных условиях специфически связывать значительные количества экзогенной ДНК и переносить ее а процессе • оплодотворения в ооциты позволяет поставить . вопрос о биологической роли этого феномена. Полученные в работе результаты могут способствовать более глубокому пониманию генетических процесоов>
' РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ДАЛЬНЕЙШИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Проведенные исследования дают основания утверждать, что в результате связывания сперматозоидами экзогенной ДНК возникает высокая вероятность заражения яйцеклеток во время искусственного' оплодотворения. Эта проблема имеет место как в животноводстве при использовании процедуры искусственного осеменения замороженной спермой, те* и в клинике во время оплодотворения in vitro, поэтому
необходимо тщательно контролировать присутствие посторонней ДНК при описанных выше манипуляциях со сперматозоидами.
. 2. В дальнейшем следует изучить корреляции между присутствием белковых факторов "на поверхности спермиев, подобных молекулам главного комплекса гмсгооовместимости типа М, и их способностью к захвату и переносу экзогенной ДНК в яйцеклетки. Использование антител к рецепторам ДНК на поверхности ; спермиев позволит провести популяционные исследования и реально' оценить . риск перколяции .чужеродных последовательностей ДНК в-геном при оплодотворении. .. Предварительная иммунологическая оценка спермы самцов могла бы способствовать повышению эффективности; транспорта экзогенных последовательностей ДНК сперматозоидами и обеспечению стабильной . воспроизводимости опытов по переносу рекомбинантных генов мужскими гаметами. . ."' ., Ч '■ '
3. Результаты. опытов по передаче чужеродной ДНК в яйцеклетки путем . . искусственного осеменения: трансформированными спермиями
показывают, что перенесенная ДНК способна , транзиентно зкспрессироааться в ■ ранних эмбрионах, в то же время обнаружены существенные перестройки интродуцироеанной ДНК. Вопрос о механизме рекомбинации и условиях интеграции чДНК в хроматин спермия остается . открытым Его практическое решение, на наш взгляд, может быть выполнено с помощью генноиюкенерных конструкций, включение которых в хромосомную ДНК приводило бы ' к определенным . селективным преимуществ зм у ранних эмбрионов после начала активации транскрипции генома. В качестве альтернативы может рассматриваться эписомное существование привнесенной ДНК. В этом случае необходимо добиваться -, структурной и сегрегационной стабильности используемых рекомбинантных конструкций, в частности, путем блокировки ДНКазной и рекомбинационной активностей в слермиях.
4. На основании экспериментов по микроиньехции ДНК и рСМШэсг в зиготы кроликов сделано заключение, что последовательности СМУв и RSV-l.TR опознаются факторами транскрипции, присутствующими на ранних этапах развития эмбриона.. Данное обстоятельство позволяет
указать на возможное использование. CMVe- и RSV-LTR-регуляторных участков для достижения экспрессии необходимых генов в цис-лоложении.' Последние, в свою очередь, могли бы выступать в роли трзнс-активаторов для коррекции программы развития, в этом смысле, использование сперматозоидов как неинвазивной системы доставки генов для пренатальной генотерапии может быть весьма перспективным.
5. Способностью поглощать молекулы чужеродной ДНК. обладают мужские гаметы представителей разных таксономических групп, следовательно. ■ .... .... механизмы, обеспечивающие захват экзогенной ДНК сперматозоидами, равно как и его блокировку, достаточно универсальны. Интересно использовать отдельные компоненты механизма поглощения ДНК спермиями {например, интернатызацию CD4) для создания молекулярных систем доставки рекомбинантных ДНК в соматические клетки. В таком случае сперматозоид может представлять собой идеальную модель для отработки методов генотерапии.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ
1. Kuznetsov A.V., Andreeva L.E., Grigorenko А.Р., Dvoiyanchikov G.A. Plasmid ONA transfer into eggs of loach Misgumus fossilis by electroporaled spermatozoa // IV International Marine Biotechnology Conference. Naples. Italy. September 22-29. 1097. P. 251. :
2. Kuznetsov A.V., Andreeva L.E., Kuznetsova l,V., Grigorenko A.P. Sperm cells as noninvaslon system of delivery foreign genes to ova for prenatal genotherapy // ЙШ IMP Spring Conference'Genes". Vienna, Austria, May'22-24.1997, P 86. ,
3. БарминцевВА., Кузнецов AB, Шан Лицзюань Получение трансгенных карпов с помощью микроинъекций и оплодотворения яйцеклеток спермиями, импрегнироаанными в растворе рекомбинзнтной ДНК. - Новые направления биотехнологии. VI конференция Российской Федерации. 2426.5.1994. Пущино. С. 132.
4. Гоголевский П.А., Гоголевская И.К., Кузнецова ИВ, Кузнецов А.8. Экспрессия рекомбинантных ДНК RSV/acZ и pCMV/aeZ в
предимплантвционных эмбрионах кролика // Генетика. 1996. Т. 32(7). С. 1054-1059.
5. Гоголевский П.А., Гольдман И.Л., Гусев В.В., Жаданов А6., Кауроэа СА. Кузнецов А В., Собенникова ПЛ., Эрнст Л. К. Исследование гена р-галактоэидаэы. в трансгенных ранних эмбрионах кроликов // Докл.
• ВАСХНИЛ. 1991. Т. 10. С. Зв-42. :
■ i -
6. Гольдман И.Л., Эрнст Л.К. Гоголевский П.А, Афанасьев В.М.. Семенова ЛВ.А, Гращук МА, Коновалов МА, Клемовицкий П.М., Жиаалев ПК.,
■ Полежаева ИА, Мкталипова ММ, Жаданов А Б.» Кузнецов А В., Дворянское ГА, Дубовая Т.К. Исследование экспрессии гена гормона роста крупного рогатого скота у кролика, трансгенного по генной конструкции mMT1/bGHatt, содержащей MAR (Matrix Attachment Region) элемент I) Доклады Россельхозакадемии. 1993. Т. 1 С. 58-71.,
7. Гольдман И.Л., Эрнст Л.К, Гоголевский П.А, Семенова ВА,Кадулин С.Г., Жаданов А В., Дворянчиков ГА, Разин С.В., Кузнецов А В., Афанасьев В.М. Теоретические вопросы получения трансгенных животных. Эксперименты на кроликах. - Генноиюквнерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудоа. (Выпуск 1). РАСХН. М. 1995. С. 93-103.
О в. Кузнецов А В. Трансгенные■ животные. Приемы конструирования U
.,: Биотехнология. 1Э95. Т. 3-4. С. 3-е . 9. Кузнецов А В., Григоренко А П. ь Кузнецова ИВ, Андреева Л.Е, Дворянчиков ГА, Старицын И А Перенос плазмияной ДНК при оплодотворении яйцеклеток вьюна Misgurnus ■ fossilis L электропорированными сперматозоидами // Генетика. 1999. Т. 35(2). С. 159- : т. " '*■" : ' ■ ■
' 10. Кузнецов АВ., Жаданов АБ,. Кузнецова И.В., Щит И.Ю. Пврколяция чужеродной ДНК ■ геном при оплодотворении // Проблемы репродукции, V 1996а. Т. 4(1). С. 38-43. : ' 11 Кузнецов АВ., Каурова СА„ Кузнецова ИВ. Трансфвкция маточного эпителия . при осеменении . крольчих - трансформированными сперматозоидами. Модель иктернализации ДНК в спермий // Проблемы репродукции. 19986. Т. 4(6). С. 29-33. .
12. Кузнецов A.B., Кузнецова И.В. Подвижный вектор. 1998. • 1S9 С. // URL http://*ww.chat nV-obomon. ."V. V '=■
13. Кузнецов A.B., Кузнецова И.8: Попытки получения трансгенных животных с. гюмощью подвижных векторов. -Генноинжвнерные сельскохозяйственные _ животные."Сборник'научных трудов. (Выпуск 1). РАСХН, M.199S. С. 173;; <во. ■ ■ . '"-'■л ■■■ .
14. Кузнецов A.B., Кузнецова И.8. Связывание экзогенной ДНК pRK3tecZ сперматозоидами' кролика, ее", перенос'- в- ооциты й. экспрессия в доимплантационныхзмбрионвх//Онтогенез.1995. Т. 26(4). С. 300-309. •.>;;'.,
15. Кузнецов A.B., Кузнецова И.В., Народицкий B.C.; Гольдман И.Л., Эрнст Л.К. Способ введения чужеродной ДНК в сперматозоиды. - Патент Pocchh:RU 94027663 А1, 21.07.1994. : " ' ' ., . "
16. Кузнецов A.B., Сигаева В А., Кузнецов И В , ЦЙт И.Ю. Сперматозоиды кролиха способны связывать чужеродную ДНК //Проблемы репродукции. Т.;
' 1. 199$. С. 7-10. . : /"-\v. -.7"'' \\ ■■
17. Кузнецова И В , Кузнецов AB., Сигаева В.А.,'Щит* И.Ю. Использование сперматозоидов кролика в качестве ^вектора дл*!г чужеродней ДНК I/ Биотехнология. 1993. Т. 11-12. С. 2-5. \ \ ' . . ' " '
18. Кузнецова И.В., Лущиков С.Б, Кузнецов A.B. Изучение , декомпенсации хроматина в сперматозоидах кролика // Проблемы репродукции. 1995. Т. 4. '
с.8-12. '■ .А,-
19. Кузнецова И.8., Щит И,Ю„ Кузнецов A.B. Эффективность переноса сперматозоидами рекомбинантных' ДНК в яйцеклетки кролика // Сельскохозяйственная биология. 1998. Т. 6. С. 40-44.
20. Сигаева В.А., Кузнецова И.В., Кузнецов A.B. Связывание экзогенной ДНК сперматозоидами // Проблемы репродукции. 1996. Т. 2. С. 18-20.
21. Щит И.Ю., Кузнецов A.B . Кауроеа CA, Кузнецова И.В., Гусее В.В. ; Негативные эффекты экзогенной - ДНК на оплодотворение и ранний эмбриогенез ц опытах по опосредованному сперматозоидами переносу генов//Проблемы репродукции. 1998.Т. 4(4). С. 5-10.. -..
"22. Щит И Ю., Кузнецова И.В., Денисова Т.С., Кузнецов A.B. Сперматозоид -подвижный' вектор для рекомбинантной ДНК - Международная конференция посвященная памяти акад. A.A. Баева. Москва. Россия. 20-22 мая 1996г. С.66. . ■ '
\
Подписано к печати 18.01.1999 г. Объем 1 ,2 уч.- издл. З&Киэ № 18 Тираж 35 экз.
: Участок оптативной полиграфии ВНИИМЖ
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кузнецов, Андрей Вадимович
I. ВВЕДЕНИЕ.
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
11.1 Связывание чужеродной ДНК сперматозоидами.
II. 1.1 Феномен спонтанного захвата посторонней ДНК зрелыми спермиями18 И. 1.2 Кинетика и топография связывания ДНК со сперматозоидами.
11.1.3 Факторы, контролирующие процесс связывания.
11.1.4 Проникновение ДНК в сперматозоиды.
11.2 Исследования по переносу экзогенной ДНК сперматозоидами в ооциты.
11.2.1 Обнаружение перенесенной ДНК по радиоактивной метке или при помощи полимеразной цепной реакции.
11.2.2 Идентификация экзогенной ДНК по ее экспрессии.
11.3 Изучение перенесенной в ооцит посторонней ДНК.
11.3.1 " градация привнесенной чужеродной ДНК.
11.3.2 Персистенция в экстрахромосомном состоянии.
11.3.3 Интеграция чужеродной ДНК в геном.
11.3.4 Возможные механизмы интеграции экзогенной ДНК.
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ.
111.1 Сведения по эмбриональному развитию подопытных животных.
III. 1.1 Кролик (Oryctolagus cuniculus).
III. 1.2 Вьюн (Misgurnus fossilis L.).
III. 1.3 Черноморская мидия (Mytilus galloprovincialis L.).
111.2 Условия проведения экспериментов: содержание и подготовка животных, получение сперматозоидов.
111.2.1 Опыты на Oryctolagus cuniculus.
111.2.2 Тестирование векторных свойств спермиев кролика с помощью ооцитов золотистого хомячка.
II 1.2.3 Опыты на представителях разных систематических групп.
II 1.3 Материалы и методы.
II 1.3.1 Используемые в работе рекомбинантные конструкции.
111.3.2 Подготовка ДНК для трансформации спермиев и микроинъекции зигот.
111.3.3 Эксперименты по связыванию сперматозоидами экзогенной ДНК. 81 II 1.3.4 Выявление бактериальной р-галактозидазы в ранних эмбрионах кролика.
III. 3.5 Выделение хромосомной ДНК.
II 1.3.6 Проведение цепной полимеразной реакции.
III.3.7Дот-гибридизация и Саузерн-блотинг.
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
IV. 1 Предварительные эксперименты.
IV. 1.1 Опыты по инъекции экзогенной ДНК в зиготы.
IV. 1.2 Попытка трансформации зрелых сперматозоидов кролика с использованием селективного маркера и селекции клеток по подвижности97 IV. 1.3 Изучение возможности использования везикулярного транспорта для введения в спермии экзогенной ДНК.
IV. 1.4 Исследование проницаемости мембран и деконденсации хроматина сперматозоидов кролика.
IV.2 Исследование процесса взаимодействия чужеродной ДНК со сперматозоидами млекопитающих и факторов, влияющих на него.
IV. 2.1 Изучение связывания радиоактивной ДНК сперматозоидами кролика113 IV. 2.2 Факторы, влияющие на связывание экзогенной ДНК сперматозоидами.
IV. 2.3 Связывание молекул ДНК сперматозоидами быка и человека.
IV.3 Разработка метода инкорпорирования ДНК в спермии кролика.
IV. 3.1 Влияние диметилсульфоксида и кратковременного теплового воздействия на подвижность сперматозоидов.
IV. 3.2 Ассоциация чужеродной ДНК со спермиями в присутствии диме у vсульфоксида.
IV. 3.3 Влияние диметилсульфоксида на проницаемость сперматозоидов для ДНК в присутствии семенной жидкости.
IV. 3.4 Аддитивный эффект диметилсульфоксида и тепловой обработки на проницаемость сперматозоидов.
IV.4 Результаты переноса экзогенной ДНК сперматозоидами кролика в яйцеклетки.
IV. 4.1 Обнаружение чужеродной ДНК в ранних эмбрионах с помощью полимеразной цепной реакции.
IV. 4.2 Идентификация репортерной ДНК по экспрессии гена lacZ в доимплантационных эмбрионах.
IV. 4.3 Сравнение эффективности двух методик трансформации по транзиентной экспрессии репортерного гена.
IV.4.4 Воспроизводимость опытов по переносу экзогенной ДНК сперматозоидами в ооциты. Отсутствие корреляции между подвижностью спермиев и экспрессией привнесенной ДНК в эмбрионах. 138 IV. 4.5 Обнаружение последовательности pRK3lacZ в ДНК рожденных животных.
IV.5 Влияние "трансформации" спермиев кролика на их оплодотворяющую способность, развитие эмбрионов и рождаемость потомства.
IV.5.1 Развитие доимплантационных эмбрионов кролика после искусственного осеменения трансформированными спермиями.
IV. 5.2 Рождение потомства после искусственного осеменения трансформированными спермиями.
IV.6 Эксперименты по переносу экзогенной ДНК сперматозоидами быка, лягушкг "<\рпа, вьюна и мидии.
IV. 6.1 Манипуляции со спермиями быка Bos taurus.
IV. 6.2 Опыты на травяной лягушке Rana temporaria.
IV. 6.3 Эксперименты со сперматозоидами карпа Cyprin us carpió.
IV. 6.4 Опыты с вьюном Misgurnus fossilis L.
IV. 6.5 Эксперименты на черноморской мидии Mytilus galloprovincialis Lam.
V. ОБСУЖДЕНИЕ.
V.1 Использование сперматозоидов кролика в качестве переносчиков чужеродного генетического материала в ооциты.
V.1.1 Взаимодействие чужеродной ДНК со сперматозоидами. Диметилсульфоксидный шунт. Вариабельность состояния компетентности спермиев кролика к экзогенной ДНК.
V.1.2 Обоснование выбора рекомбинантных конструкций и сроков визуализации экспрессии в опытах по переносу экзогенной ДНК в ооциты кролика.
V.1.3 Перенос репортерной ДНК сперматозоидами в ооциты, транзиентная экспрессия гена lacZ и накопление у3-галактозидазы в доимплантационных эмбрионах.
V.1.4 Проникновение экзогенной ДНК в ядро спермия - необходимое условие ее интеграции в геном зиготы.
V. 1.5 Возможные причины гибели доимплантационных эмбрионов после оплодотворения яйцеклеток трансформированными сперматозоидами. К вопросу о существовании механизмов защиты от чужеродной ДНК у ранних эмбрионов.
V.2 Пути повышения частоты интеграции и способы защиты привнесенной спермием чужеродной днк от деградации. перспективы применения подвижных векторов.
V.2.1 Модификация сахарофосфатного остова и концов ДНК.
У. 2.2 Использование ферментов нуклеинового обмена и олигонуклеотидов направленного действия.
У. 2.3 Применение адгезивных последовательностей (MAR-элементов), orí репликации и транспонирующих элементов в составе ДНК.
V.2.4 Разработка систем селекции трансформированных эмбрионов.
У.2.5 Использование элементов таргетинга генов.
V.2.6 Применение ДНК разной конформации.
V.2.7 Перспективы использования подвижных векторов.
VI. ВЫВОДЫ.
VII. РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ДАЛЬНЕЙШИХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
VIII. БЛАГОДАРНОСТИ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные аспекты транспорта экзогенной ДНК сперматозоидами"
Актуальность темы исследования связана с возрастающим интересом к генетической модификации животных путем интродукции рекомбинантных ДНК, что позволяет добиваться направленных изменений генотипа и фенотипа. Предпринимаются попытки вести работы в прикладном аспекте. Определился ряд самостоятельных направлений в области трансгенеза: создание лабораторных животных тест-объектов и моделей патологических состояний человека; сельскохозяйственных животных с измененными ростовыми характеристиками; животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, загрязнениям или экстремальным факторам среды; животных с дополнительными метаболическими путями; животных-биореакторов, продуцирующих с молоком гетерологичные протеины и животных - доноров органов для трансплантации человеку (Brem, 1987; Ebert, 1989; Gannon et al., 1990; Evans, Hollander, 1986; Jaenisch, 1988; Grosveld, Kollias, 1992; Wall, Seidel, 1992; Ward, Nancarrow, 1991; Вайсман и др., 1988; Городецкий, 1984; Дыбан, Городецкий, 1985, 1986; Кузнецов, 1995; Серов, 1985; Эрнст, 1994; Эрнст и др., 1993). Расширился круг объектов генноинженерных манипуляций, и теперь опыты проводятся не только на млекопитающих, но и на птицах, рыбах и моллюсках (Cadoret, 1992; Chen, Powers, 1990; Naito, 1996).
В эпоху тотального секвенирования геномов меняется сама парадигма трансгенеза - на смену методам встраивания чужеродных генов в случайные области хроматина приходит методология направленной (сайт-специфической) интеграции рекомбинантной ДНК в заранее намеченные районы определенных хромосом (методология таргетинга). Отметим, что таргетинг генов в клетках высших эукариот идет с разной эффективностью, но в подавляющем числе случаев требуется большое количество исходного материала и соответствующие системы селекции (Тарантул, 1996). Именно по этой причине считается, что таргетинг не применим к яйцеклеткам млекопитающих. В связи с этим большие надежды возлагают на процедуры клонирования животных с помощью пересадки ядер (Wilmut et al., 1997; Schnieke et al., 1998) из таргетированных соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки. С другой стороны, постепенно формируются требования к рекомбинантным ДНК, предназначенным для трансгенеза (Кузнецов, 1995). В идеале генноинженерные конструкции должны целенаправленно встраиваться в геном хозяина или обеспечивать независимую от эффекта положения экспрессию трансгена, кроме того, они должны передаваться через клетки зародышевого пути и обеспечивать ткане- и стадиоспецифичный синтез закодированного белка. Необходимо, чтобы продукт экспрессии подвергался правильной посттрансляционной модификации и направлялся в соответствующий клеточный компартмент или секретировался. Хотелось бы, чтобы уровень экспрессии искусственного гена корректировался посредством авторегуляции или извне по желанию человека. В любом случае привнесенные генетические контурь; управления должны органически вплетаться в метаболическую сеть и поддерживаться гомеостазом. Теоретически канонический трансген должен состоять из структурной части, кодирующей целевой продукт; регуляторных областей, обеспечивающих экспрессию участков, поддерживающих искусственную конструкцию в составе хроматина в виде самостоятельного домена; и, наконец, сайтов, способствующих эффективной интеграции. Как видим, выполнить все эти требования одновременно технически очень сложно - может потребоваться манипулировать с фрагментами ДНК размером порядка 100-200 т.п.н., для которых необходима соответствующая векторная система (например, искусственные хромосомы дрожжей) и методы трансфекции.
П^пзые работы по генетической инженерии высших эукариот были выполнены на DrosofUa melanogaster, Xenopus laevis и Mus musculus. За последнее десятилетие существования этого направления накоплены данные для оценки применения генетической инженерии к другим объектам. Например, следует обратить внимание на то, что использование микроинъекции ДНК в зиготы и их дальнейшей трансплантации приемным матерям связано со сложностью выполнения этих операций, особенно, на крупных сельскохозяйственных животных. Изоляция, культивирование ES- и EG-клеток с целью таргетирования и их реимплантация требуют немалых затрат и усилий. Поэтому поиск иных способов трансгенеза представляется весьма актуальным. Ощущается потребность в универсальном и эффективном векторе для массового переноса чужеродной ДНК (чДНК) в клетки-мишени. Таким вектором могли бы служить сперматозоиды, то есть клетки, специализирующиеся на поиске, высоко специфичном узнавании и доставке генетической информации в яйцеклетку.
В последнее время независимыми исследователями опубликованы сведения о том, что сперматозоиды представителей ряда видов иглокожих, земноводных, рыб, птиц и млекопитающих способны поглощать чужеродную ДНК (Arezzo, 1989; Atkinson et al., 1991; Bachiller et ai, 1990; Brackett et al., 1971; Camaioni et al., 1992; Castro et al., 1990; Chourrout, Perrot, 1992; Clausen et al., 1991; Horan et al., 1991; Imai et al., 1992; Khoo et al., 1992; Lavitrano et al., 1989a, 1991; Macha et al., 1994; Nakanishi, Iritani, 1993; Trefil et al., 1994; Кузнецов и др., 1996, 1998a; Кузнецов, Кузнецова, 1995аб; Кузнецова, 1995; Сигаева и др., 1996). Более того, при оплодотворении сперматозоид может вносить экзогенную ДНК в ооцит с эффективностью, сопоставимой с инфицированием клеток ;.,0гровирусами. Оказалось, что данный феномен, получивший название "двойной трансфекции" (Arezzo, 1989), широко представлен в мире эукариот и обнаружен у представителей ряда таксонов: от иглокожих до млекопитающих (Arezzo, 1989; Bachiller et al., 1990; Brackett et al., 1971; De la Fuente et al., 1991; Fainsold et al., 1990; Gagne et al., 1991; Gandolfi et al., 1989; Gruenbaum et al., 1991; Hochi et al., 1990; Jonak et al., 1994; Khoo ef al., 1992; Kuznetsov et al., 1997a; Lavitrano et al., 1989a, 1994; Milne et al., 1989; Muller et al., 1992; Ninomiya et al., 1989; Perez et al., 1991; Rottmann et al., 1992, 1994; Schellander et al., 1995; Sin et al., 1993, 1997; Sperandio et al., 1996; Squires, Drake, 1993, 1994; Sun et al., 1994; Tsai et al., 1995, 1997ab; Tseng et al., 1994; Wu et al., 1990; Барминцев и др., ^994; Кузнецов и др., 19986, 1999; Кузнецов, Кузнецова, 1995а; Кузнецова и др., 1993, 1998; Хафаги и др., 1994). Новый тип передачи генетической информации у эукариот имеет прямые аналоги среди микроорганизмов, где называется ДНК-трансформацией (Smith, 1981). Именно поэтому в нашей лаборатории укоренился термин "трансформация сперматозоидов". Метод "подвижных векторов" (Горлова, 1993) не требует дорогого оборудования, прост в исполнении и в перспективе мог бы использоваться для введения нужных генов в геномы представителей разных таксонов Metazoa (млекопитающих, птиц, рыб, моллюсков и т.д.).
Феномен передачи экзогенной ДНК сперматозоидами в яйцеклетки был впервые описан Brackett с соавт. (1971). Авторы использовали свойство инфекционное™ ДНК вируса SV-40. Спермии кролика обрабатывали ДНК SV-40, после оплодотворения in vivo зиготы вымывали, экспонировали с культурой клеток CV-1 и регистрировали цитопатический эффект. Иной прием (Rottmann, Hofer, 1987) состоял в следующем: после обработки спермиев ДНК МТbGH, заключенной в липосомы, ее обнаружили при помощи гибридизации in situ интегрированной в геном бластоцисты. В опыте на мышах (Lavitrano et al., 1989а) после связывания ДНК pSV2caf сперматозоидами, извлеченными из эпидидими-са, дальнейшего оплодотворения ооцитов in vitro и имплантации 2-клеточных зародышей приемным матерям, в конечном счете родились трансгенные особи, которые передали признак следующему поколению. Первоначально этот эксперимент, за одним исключением (De la Fuente et al., 1990), не был воспроизведен в других лабораториях (Brinster et al., 1989). В последующем появились сообщения, что при помощи спермиев, обработанных чДНК, получены трансгенные свиньи (Gandolfi et al., 1989; Lavitrano et al., 1997a), куры (Gruenbaum et al., 1991), рыбы (Muller et al., 1992), пчелы (Milne et al., 1989), морские ежи (Arezzo, 1989), моллюски (Tsai et al., 1997ab) и другие животные. Однако в ряде случаев авторами не были представлены строгие доказательства включения .трансгена в геном. Неудачи в опытах по получению трансгенных животных при помощи "подвижных векторов" некоторые исследователи (Lauria, Gandolfi, 1993) связывают с существованием неизвестных факторов, контролирующих процесс взаимодействия экзогенной ДНК со сперматозоидами. Так, семенная плазма предотвращает связывание чДНК со спермиями (Lavitrano et al., 1992; Кузнецов и др., 1996). Были приложены усилия для поиска факторов компетентности спермиев к чужеродной ДНК. В настоящее время известны связывающие ДНК белки ("рецепторы ДНК"): MHCII (Wu et al., 1990), белок 30-35 кД (Lavitrano et al., 1992a), CD4 (Lavitrano et al., 1997b) и отрицательный регулятор IF-1 (37 кД) (Lavitrano et al., 1992b,c; Zani et al., 1995). Для того чтобы исключить их влияние применяют различные приемы инкорпорирования чДНК в сперматозоиды. С этой целью используют диметилсульфоксид (ДМСО) (Brackett et al., 1971; Баранов и др., 1990а; Кузнецова и др., 1993), электропорацию (Gagne et al., 1991, 1995; Nakanishi, Iritani, 1993) и липофекцию (Rottmann et al., 1992, 1994; Nakanishi, Iritani, 1993). После слияния спермия с яйцеклеткой экзогенная ДНК обнаруживается на поверхности плазмалеммы зиготы, диффузно распределяется по цитоплазме или локализуется в мужском пронуклеусе (Gagne et al., 1991). Не исключено, что столь значительные различия в распределении чДНК обусловлены ее первоначальной локализацией в сперматозоидах. В связи с этим в диссертационной работе большое внимание уделено изучению процесса взаимодействия экзогенной ДНК со сперматозоидами и разработке методов ее инкорпорирования в головки спермиев представителей разных таксонов. С другой стороны, остается до конца не решенным вопрос об условиях и механизмах интеграции интродуцированной ДНК в геном реципиента. В ряде случаев перенесенная спермием ДНК длительное время персистировала в реципиентном организме (Rottmann, 1992) и даже передавалась потомкам (Squires, Drake, 1993, 1994), в других - стабильно интегрировала в геном (Lavitrano et al., 1989а). Эти события иногда сопровождались перестройкой донорной ДНК (Lavitrano et al., 1989а; Sperandio et al., 1996), a иногда - нет (Rottmann, 1992). Полученные De la Fuente и соавт. (1990) мыши были мозаичными с низким содержанием трансгена.
В области биотехнологии представляется весьма интересным использовать сперматозоиды в качестве переносчика рекомбинантной ДНК для получения трансгенных животных (Rottmann, Hofer, 1987; Spadafora, 1990; Kuznetsov et al., 1997b; Кузнецов и др., 1994, 19986, 1999). Немаловажным является такой аспект проблемы транспорта экзогенной ДНК мужскими гаметами, как возможность инфицирования посторонними ДНК при оплодотворении (Cabrera et al., 1997; Chan et al., 1995; Chen, Chen, 1996; Cohen, 1991; Dussaix et al., 1993; Habrova et al., 1996; Кузнецов и др., 1998а; Сигаева и др., 1996). В связи с этим возникает вопрос: имеются ли механизмы опознавания (Elinson, 1986; Houshmand et al., 1997; Kaneda et al., 1995) и защиты (Щит и др., 1998) от чужеродной ДНК при оплодотворении? Существует предположение, что благодаря способности зрелых сперматозоидов захватывать ДНК и переносить ее в яйцеклетки, может осуществляться горизонтальный поток генетического материала (Birnstiel, Busslinger, 1989). Отметим, что передача генов между видами широко распространена в мире прокариот и способствует эволюции бактерий (Smith, 1981). Возможность обмена генетическим материалом между разными видами у высших эукариот является спорной. Исключением является перенос генов ретровирусами
Хесин, 1985). Правомерен вопрос: могут ли сперматозоиды способствовать обмену ДНК между высшими эукариотами в природных сообществах? Его решение имеет не только теоретический интерес, но обещает избавиться от трудностей технического порядка при создании трансгенных животных, что позволит работать с разнообразными позвоночными и беспозвоночными, представляющими практический интерес (Кузнецов, Кузнецова, 1998).
Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению процесса переноса рекомбинантных ДНК в яйцеклетки сперматозоидами ряда видов млекопитающих, рыб и моллюсков с целью создания трансгенных животных. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
• изучить проницаемость мужских гамет для низко- и высокомолекулярных соединений по их способности вызывать деконденсацию хроматина спермиев in vitro;
• исследовать процесс взаимодействия экзогенной ДНК со сперматозоидами и его модуляцию;
• рйзработать методы включения чужеродной ДНК в спермии;
• доказать факт передачи экзогенной ДНК в ооциты и оценить эффективность переноса рекомбинантной ДНК по ее экспрессии на ранних стадиях эмбриогенеза;
• исследовать перенесенную сперматозоидами экзогенную ДНК в развивающемся организме;
• изучить последствия переноса посторонней ДНК сперматозоидами применительно к раннему эмбриогенезу.
Новизна результатов заключается в том, что
• впервые подробно изучен процесс взаимодействия экзогенной ДНК со сперматозоидами кролика и факторы, влияющие на него;
• использована дигоксигениновая техника мечения ДНК для картирования участков связывания на поверхности спермия;
• разработан метод тестирования векторных свойств спермиев с применением ооцитов золотистого хомячка без zona pellucida;
• разработаны методы инкорпорирования ДНК в мужские гаметы с помощью диметилсульфоксида, тепловой обработки или электропорации;
• создана модель проникновения экзогенной ДНК в ядро спермия; предложена ротаксановая модель упаковки рекомбинантной ДНК в ядре сперматозоида; с помощью спермиев осуществлена передача ряда рекомбинантных плазмид (pCMV/acZ, pRK3lacZ, рМТlacZ и др.) в геномы кролика и вьюна.
Научная значимость: накоплены данные, описывающие процесс взаимодействия ДНК со спермия-ми кролика, которые стали теоретическим фундаментом для разработки методов трансформации сперматозоидов других видов животных, рыб, а также моллюсков; доказана принципиальная возможность применения сперматозоидов в качестве подвижного вектора для переноса чужеродной генетической информации; в работе продемонстрирована высокая инфицирующая способность мужских гамет и поставлен вопрос о защите спермиев от контакта с посторонней ДНК при оплодотворении in vitro; полученные в работе результаты могут быть использованы при изучении регуляции экспрессии генов и модуляции их активности на ранних стадиях эмбриогенеза; в результате изучения процесса переноса экзогенных последовательностей ДНК сперматозоидами разработаны теоретические положения, совокупность которых можно квалифицировать как достижение в развитии перспективных направлений прикладной генетики - генотерапии и трансгенеза.
Положения, выносимые на защиту. Проницаемые для малых молекул и высокомолекулярных соединений сперматозоиды кролика в отсутствии семенной жидкости способны спонтанно связывать и поглощать молекулы чужеродной ДНК. В процессе оплодотворения захваченные спермиями рекомбинантные плазмиды pCMVIacZ, pRK3lacZ и pMTIacZ вводятся в яйцеклетку кролика, где способны транзиентно экспрессироваться.
Захват посторонней ДНК мужскими гаметами и ее перенос в ооциты может быть "усилен" с помощью известных методов трансформации (трансфекции) бактерий и эукариотических клеток в культуре, а именно, 1) в результате
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Кузнецов, Андрей Вадимович
VI. выводы
1. Плотно упакованная в ядрах сперматозоидов кролика хромосомная ДНК доступна как для малых молекул (Ыа+, Е1Вг, ДТТ), так и для высокомолекулярных соединений (гепарин), которые способны при физиологических значениях рН и температуры проникать в мужские гаметы и в разной степени вызывать деконденсацию хроматина.
2. Зрелые сперматозоиды млекопитающих: кролика, быка и человека, отмытые от семенной жидкости, самопроизвольно захватывают до 60-70% добавленной радиоактивной ДНК, достигая стадии насыщения за 10-30 мин. Среди сперматозоидов кролика ДНК связывают 35% клеток. Емкость спермиев кролика составляет -10000 молекул экзогенной ДНК размером 10 т.п.н. на одну клетку. Связывание чужеродной ДНК со спермиями подавляют азид натрия, хлороквин, гомологичная и гетерологичная плазма семени и полианионы, такие как ДНК-конкурент и гепарин, напротив, поликатион поли-Э-лизин способствует процессу связывания.
3. Выделены 3 фазы взаимодействия экзогенной ДНК со сперматозоидами млекопитающих: специфическая адсорбция, проникновение и частичная элиминация ДНК. Создана модель интернализации ДНК в ядро сперматозоида канонического типа. Разработаны оригинальные процедуры инкорпорирования экзогенной ДНК в спермии кролика с применением ДМСО и тепловой обработки и в сперматозоиды вьюна - путем электропорации. Предложена ротаксановая модель упаковки рекомбинантной ДНК в сперматозоиды млекопитающих.
4. Трансформированные сперматозоиды кролика, карпа и вьюна в процессе оплодотворения могут вносить экзогенную ДНК в ооциты с эффективностью, достигающей 97%, при средней величине для кролика -35%. Привнесенные спермиями ДНК рРКЗ/ас2, рСШИас! и рМТ/ас2 сохраняют способность к экспрессии гена ¡ас2, о чем свидетельствует активность бактериальной р-галактозидазы в доимплантационных эмбрионах кролика. Данные ДНК-гибридизации говорят о том, что плазмида рРЖЗ/ас2, внесенная сперматозоидами в ооциты кролика, обнаружена у 73% рожденных животных с копийностью 0,04-0,4 на геном, подверглась
204 перестройке и имела мозаичное распределение по тканям, что подчеркивает ее нестабильное существование у реципиентных животных.
5. Диметилсульфоксидный шунт при искусственной трансформации способствует накоплению экзогенной ДНК в цитоплазме, проникновению в ядро и удержанию в хроматине спермиев кролика в 47% случаев. Благодаря использованию естественной компетентности сперматозоидов и смеси линейной и кольцевой форм ДНК интеграция чужеродных последовательностей ДНК с хроматином составляет 89%.
6. Экзогенная ДНК в высоких концентрациях (200-500 мкг/мл) блокирует процесс оплодотворения у кролика, вьюна и, в некоторых случаях, у мидии. Перенесенная спермием чужеродная ДНК способна вмешиваться в развитие кролика, лягушки, вьюна и мидии, негативными последствиями чего являются отставания в дроблении, остановки развития, фрагментация и гибель эмбрионов. У трансфецированных спермиями эмбрионов обнаружены морфологические признаки апоптоза. Эффективность "двойной трансфекции" возрастает в ряду: моллюски, рыбы, млекопитающие.
7. Обнаруженная способность сперматозоидов представителей разных таксономических групп при определенных условиях специфически связывать значительные количества экзогенной ДНК и переносить ее в процессе оплодотворения в ооциты позволяет поставить вопрос о биологической роли этого феномена. Полученные в работе результаты могут способствовать более глубокому пониманию генетических процессов.
VII. РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ДАЛЬНЕЙШИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Проведенные исследования дают основания утверждать, что в результате связывания сперматозоидами экзогенной ДНК возникает высокая вероятность заражения яйцеклеток во время искусственного оплодотворения. Эта проблема имеет место как в животноводстве при использовании процедуры искусственного осеменения замороженной спермой, так и в клинике во время оплодотворения in vitro, поэтому необходимо тщательно контролировать присутствие посторонней ДНК при описанных выше манипуляциях со сперматозоидами.
2. В дальнейшем следует изучить корреляции между присутствием белковых факторов на поверхности спермиев, подобных молекулам главного комплекса гистосовместимости типа II, и их способностью к захвату и переносу экзогенной ДНК в яйцеклетки. Использование антител к рецепторам ДНК на поверхности спермиев позволит провести популяционные исследования и реально оценить риск перколяции чужеродных последовательностей ДНК в геном при оплодотворении. Предварительная иммунологическая оценка спермы самцов могла бы способствовать повышению эффективности транспорта экзогенных последовательностей ДНК сперматозоидами и обеспечению стабильной воспроизводимости опытов по переносу рекомбинантных генов мужскими гаметами.
3. Результаты опытов по передаче чужеродной ДНК в яйцеклетки путем искусственного осеменения трансформированными спермиями показывают, что перенесенная ДНК способна транзиентно экспрессироваться в ранних эмбрионах, в то же время обнаружены существенные перестройки интродуцированной ДНК. Вопрос о механизме рекомбинации и условиях интеграции чДНК в хроматин спермия остается открытым. Его практическое решение, на наш взгляд, может быть выполнено с помощью генноинженерных конструкций, включение которых в хромосомную ДНК приводило бы к определенным селективным преимуществам у ранних эмбрионов после начала активации транскрипции генома. В качестве альтернативы может рассматриваться эписомное
206 существование привнесенной ДНК. В этом случае необходимо добиваться структурной и сегрегационной стабильности используемых рекомбинантных конструкций, в частности, путем блокировки ДНКазной и рекомбинационной активностей в спермиях.
4. На основании экспериментов по микроинъекции ДНК РБ\//ас7 и рСМ\//ас7 в зиготы кроликов сделано заключение, что последовательности СМУе и RSV-L.TR опознаются факторами транскрипции, присутствующими на ранних этапах развития эмбриона. Данное обстоятельство позволяет указать на возможное использование СМ\/е- и [ЧвУ-ШЧ-регуляторных участков для достижения экспрессии необходимых генов в цис-положении. Последние, в свою очередь, могли бы выступать в роли транс-активаторов для коррекции программы развития. В этом смысле, использование сперматозоидов как неинвазивной системы доставки генов для пренатальной генотерапии может быть весьма перспективным.
5. Способностью поглощать молекулы чужеродной ДНК обладают мужские гамзты представителей разных таксономических групп, следовательно, механизмы, обеспечивающие захват экзогенной ДНК сперматозоидами, равно как и его блокировку, достаточно универсальны. Интересно использовать отдельные компоненты механизма поглощения ДНК спермиями (например, интернализацию С04) для создания молекулярных систем доставки рекомбинантных ДНК в соматические клетки. В таком случае сперматозоид может представлять собой идеальную модель для отработки методов генотерапии.
VIII. БЛАГОДАРНОСТИ
Хочется выразить слова благодарности руководителям, коллегам и подчиненным без благожелательности, содействия и энтузиазма которых вряд ли были получены результаты, изложенные в диссертационной работе.
Я признателен проф. Уракову H.H. - директору ГНЦПМ (Оболенск), д.м.н. Степанову A.B., д.х.н. Волкову В.Я. и д.б.н. Гусеву В.В., в подчинении которых я находился, за предоставленную свободу в принятии решений, за возможность использовать необходимые лабораторные помещения, оборудование и лабораторных животных. Большую роль сыграла поддержка акад. Эрнста Л.К., д.б.н. Народицкого Б.С. и общение с к.м.н. Гольдманом И.Л.
В первую очередь хочется поблагодарить к.б.н. Андрееву Л.Е., к.б.н. Барминцева В.А., к.м.н. Городецкого С.И. и ныне покойного Кузнецова Ю.М. благодаря которым я приобщился к эмбриологии и генетике эукариот, а дружественная критика которых уберегла меня от скоропалительных выводов.
Особенно я благодарен моим верным помощникам - к.б.н. Кузнецовой И.В. и к.б.н. Щит И.Ю., вместе с которыми была выполнена большая часть экспериментов, а самоотверженность и преданность науке которых нельзя переоценить.
Спасибо бывшим сотрудникам лаборатории перспективной биотехнологии - Сигаевой В.А., Кауровой С.А., Собенниковой Л.Л. и к.б.н. Дианову Е.Е., работа с которыми стала частью моей жизни.
Очень полезными оказались продуктивные контакты с к.б.н. Гоголевским П.А., к.б.н. Жадановым А.Б., д.б.н. Чумаковым П.М., к.б.н. Лагутиной И.С., д.б.н. Башкеевым Е.Д., к.б.н. Языковым В.А., к.б.н. Чубатовой С.А., Лущиковым С.Б., Григоренко А.П., к.б.н. Пирковой A.B., к.б.н. Дворянчиковым Г.А., к.х.н. Денисозой Т.С., д.б.н. Померанцевым А.П., д.м.н. Старицыным H.A., Besenfelder U., к.б.н. Зиновьевой H.A., Шан Лицзюань, к.б.н. Багировым В.А. и к.б.н. Кадулиным С.Г.
Я также благодарен к.б.н. Ерохину В.Е., к.б.н. Иванову В.Н., д.б.н. Прокофьеву М.И. и д.б.н. Кононову В.П. за предоставленную возможность работать в их лабораториях.
208
Я признателен д.м.н. Волковому К.И., д.б.н. Черепанову П.А., д.м.н. Шмелеву В.А. за критические замечания, к.б.н. Говорунову И.Г. за помощь при работе над текстом диссертации, к.ф-м.н. Сомову А.Н. и Федюкину B.C. за техническое содействие.
Неоценимую помощь оказали консультации и литература, любезно предоставленные Dr. G. Brem, Dr. С. Spadafora и Prof. J. Houghton, - большое им спасибо!
Прошу прощения у тех, кого не упомянул в этом списке, но чей интерес стимулировал меня в работе по изучению транспорта чужеродной ДНК сперматозоидами, и чье участие способствовало прогрессу в понимании этого биологического феномена.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Кузнецов, Андрей Вадимович, Оболенск
1. Андреева Л.Е. Получение трансгенных лабораторных и сельскохозяйственных животных методом микроинъекций генов в зиготы и эмбрионы: Дис. . канд. биол. наук. М. 1989. 160 с.
2. Андреева Л.Е., Григоренко А.П., Гордеева О.Ф., Дворянчиков Г.А. Экспрессия CMV-/acZ и RSV-/acZ-reHOB в трансгенных эмбрионах рыб и мышей // Генетика. 1996. Т. 32(12). С. 1661-1668.
3. Андреева Л.Е., Дворянчиков Г.А. Анализ экспрессии RSV-/acZ-reHa в трансгенных эмбрионах вьюна Misgurnus fossils L. при различных вариантах инъекции // Генетика. 1995. Т. 31(6). С. 759-766.
4. Андреева Л.Е., Жаданов А.Б., Кузнецов Ю.М. Экспрессия гена ß-галактозидазы в трансгенных эмбрионах вьюна Misgurnus fossilis L // Генетика. 1993. Т.29 (5). С. 740-747.
5. Багиров В.А. Влияние чужеродных нуклеиновых кислот в семени животных на оплодотворение и эмбриогенез: Автореф. дис. канд. биол. наук. Дубровицы. 1996.
6. Баранов B.C., Гапала И., Грияч П., Ковач Л., Бодя К. Включение макромолекул в половые клетки самцов мышей при помощи электропорации и диметилсульфоксида // Цитология и генетика. 1990. Т. 24(3). С. 3-7.
7. Биология развития млекопитающих. Методы. Под ред. Манк М. - М.: Мир. 1990.-406 с.
8. Вайсман Б.П., Капелинская Т.В., Городецкий С.И., Дыбан А.П. Возможность получения животных продуцентов биологически активных препаратов путем микроинъекции клонированных генов в яйцеклетки // Антибиотики и химиотерапия. 1988. Т. 33. С. 154-159.
9. Георгиев Г.П. Гены высших организмов и их экспрессия. М: Наука, 1989. -254с.
10. Гершензон С.М. Пассивный перенос экзогенных молекул ДНК или синтетических полинуклеотидов сперматозоидами Drosophila в оплодотворенные яйца // Цитол. Генет. 1996. Т. 30(1). С. 5-8.
11. Гершензон С.М., Александров Ю.Н., Малюта С.С. / В кн.: Мутагенное действие ДНК и вирусов у дрозофилы. К.: Наук, думка. 1975.
12. Гловер Д. (ред.) Новое в клонировании ДНК. Методы. М.: Мир. 1989. С. 346.
13. Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы. М.: Мир. 1988. 538 с.
14. Гоголевский П.А., Гоголевская И.К., Кузнецова И.В., Кузнецов A.B. Экспрессия рекомбинантных ДНК RSV/acZ и pCMV/acZ в предимплантационных эмбрионах кролика // Генетика. 1996. Т. 32(8). С. 1054-1059.
15. Гоголевский П.А., Гольдман И.Л., Гусев В.В., Жаданов А.Б., Каурова С.А., Кузнецов A.B., Собенникова Л.Л., Эрнст Л.К. Исследование гена ß-галактозидазы в трансгенных ранних эмбрионах кроликов // Докл. ВАСХНИЛ. 1991. Т. 10. С. 38-42.
16. Гольдман И.Л., Эрнст Л.К, Гоголевский П.А., Семенова В.А., Кадулин С.Г., Жаданов А.Б., Дворянчиков Г.А., Разин C.B., Кузнецов A.B., Афанасьев
17. B.М. Теоретические вопросы получения трансгенных животных. Эксперименты на кроликах. Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов. (Выпуск 1). РАСХН. М. 1995. С. 93103.
18. Горлова A.B. Иммобилизация рекомбинантной ДНК на подвижном векторе: Автореф. дис. канд. биол. наук. М. 1993.
19. Горлова A.B., Торчилин В.П. Использование липосом для ассоциации чужеродного генетического материла со сперматозоидами // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1991. Т. 112(9). С. 292-293.
20. Городецкий С.И. Генетическая инженерия высших животных // Ж. Всесоюзного химического общества им. Д.И. Менделеева. 1984. Т. 29(2).1. C. 153-157.
21. Девис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Генетика бактерий. Методы генетической инженерии. М.: Мир. 1984. 155 с.
22. Доссе Ж. Биоэтика и ответственность // Вестник новых медицинских технологий. 1995. Т. 2(1-2). С. 75.
23. Дыбан А.П. Трансгенные млекопитающие в биологии развития // Онтогенез. 1989. Т. 20(6). С. 577-592.
24. Дыбан А.П., Городецкий С.И. Генетическая трансформация млекопитающих // Молекулярные механизмы генетических процессов. М.: Наука, 1985. С. 84-93.
25. Дыбан А.П., Городецкий С.И. Интродукция в геном млекопитающих чужеродных генов. Пути и перспективы // Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. П.: Наука, 1986. С. 120-128.
26. Дыбан А.П., Городецкий С.И. Трансгенные млекопитающие: изучение фенотипических эффектов гена гормона роста человека, индуцированного животным// Биотехнология. 1987. Т. 3. С. 352-357.
27. Заика В.Е., Валовая H.A., Повчун A.C., Ревков Н.К. Митилиды Черного моря. Киев. Наук. Думка. 1990. 208 с.
28. Захваткина К.А. Личинки двустворчатых моллюсков // Определитель фауны Черного и Азовского морей. Киев. Наук. Думка. 1972. Т. 3. С. 250270.
29. Зильбер Л.А., Ирлин И.С., Киселев Ф.Л. Эволюция вирусно-генетической теории возникновения опухолей. М.: Наука. 1975. С. 170-171.
30. Кадулин С.Г. Использование 5'-фрагмента домена альфа-глобиновых генов кур для повышения эффективности экспрессии чужеродных генов у трансгенных животных: Автореф. дис. канд. биол. наук. Дубровицы. 1996.
31. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов. Перев. с англ. / Пер. В.А. Вавера. - М.: Мир. 1975. С. 76.
32. Киселева Г.А. Размножение и развитие скальной и иловой мидии в Черном море// Биология моря. 1972. Вып. 26. С. 88-98.
33. Колесников В.А., Алимов A.A., Барминцев В.А., Бенюмов А.О., Зеленина И.А., Краснов A.M., Джабур Р., Зеленин A.B. Высокоскоростная механическая инъекция чужеродной ДНК в яйцеклетки рыбы // Генетика. 1990. Т. 26(12). С. 2122-2126.
34. Кузнецов A.B. Трансгенные животные. Приемы конструирования // Биотехнология. 1995. Т. 3-4. С. 3-6.
35. Кузнецов A.B., Григоренко А.П., Кузнецова И.В., Андреева Л.Е., Дворянчиков Г.А., Старицын H.A. Перенос плазмидной ДНК при оплодотворении яйцеклеток вьюна Misgumus fossilis L электропорированными сперматозоидами // Генетика. 1999. Т. 35(2). С. 159-163.
36. Кузнецов A.B., Жаданов А.Б., Кузнецова И.В., Щит И.Ю. Перколяция чужеродной ДНК в геном при оплодотворении // Проблемы репродукции. 1998а. Т. 4(1). С. 38-43.
37. Кузнецов A.B., Каурова С.А., Кузнецова И.В. Трансфекция маточного эпителия при осеменении крольчих трансформированными сперматозоидами. Модель интернализации ДНК в спермий // Проблемы репродукции. 19986. Т. 4(6). С. 29-33.
38. Кузнецов A.B., Каурова С.А., Собенникова Л.Л., Гусев В.В. Определение оптимальной фазы микроинъекции экзогенной ДНК в мужские пронуклеусы зигот при помощи индикаторного гена lacZ II Материалы итоговой конференции ВНИИ ПМ. 1991. С. 31-33.
39. Кузнецов A.B., Кузнецова И.В. Подвижный вектор. 1998. 189 С. // URL: http://www.chat.ru/~obomon.
40. Кузнецов A.B., Кузнецова И.В. Попытки получения трансгенных животных с помощью подвижных векторов. Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов. (Выпуск 1). РАСХН. М. 1995а. С. 173180.
41. Кузнецов A.B., Кузнецова И.В. Связывание экзогенной ДНК pRK3/acZ сперматозоидами кролика, ее перенос в ооциты и экспрессия в доимплантационных эмбрионах// Онтогенез. 19956. Т. 26(4). С. 300-309.
42. Кузнецов A.B., Кузнецова И.В., Народицкий B.C., Гольдман И.П., Эрнст Л.К. Способ введения чужеродной ДНК в сперматозоиды // Патент России: RU 94027663 А1, 21.07.1994.
43. Кузнецов A.B., Сигаева В.А., Кузнецова И.В., Щит И.Ю. Сперматозоиды кролика способны связывать чужеродную ДНК // Проблемы репродукции. 1996. Т. 1. С. 7-10.
44. Кузнецов A.B., Собенникова Л.Л., Каурова С.А., Гусев В.В. Мозаичная экспрессия гена RSV-LTR-lacZ в предимплантационных эмбрионах кролика. Материалы итоговой конференции ВНИИ ПМ, 1991, С. 29-31.
45. Кузнецова И.В. Использование сперматозоидов в качестве подвижного вектора для переноса чужеродной генетической информации в яйцеклетки кролика: Дис. . канд. биол. наук. -Дубровицы, 1995,- 115 с.
46. Кузнецова И.В., Кузнецов A.B., Сигаева В.А., Щит И.Ю. Использование сперматозоидов кролика в качестве вектора для чужеродной ДНК // Биотехнология. 1993. Т. 11-12. С. 2-5.
47. Кузнецова И.В., Лущиков С.Б., Кузнецов A.B. Изучение деконденсации хроматина в сперматозоидах кролика // Проблемы репродукции. 1995. Т. 4. С. 8-12.
48. Кузнецова И.В., Щит И.Ю., Кузнецов A.B. Эффективность переноса сперматозоидами рекомбинантных ДНК в яйцеклетки кролика // Сельскохозяйственная биология. 1998. Т. 6. С. 40-44.
49. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. шк. 1980. 294 с.
50. Мазин A.B., Кузнеделов К.Д., Краев A.C. и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск: Наука. 1990. 248 с.
51. Макарова И.В., Тарантул В.З., Газарян К.Г. Структурные особенности сайт интеграции чужеродной ДНК в геном трансгенной мыши // Молекул, биология. 1988. Т. 22(6). С. 1553-1561.
52. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984. 480 с.
53. Методы генетики соматических клеток. Под ред. Дж. Шея (Т.1), М., Мир, 1985. С. 311.
54. Нейфах A.A. Использование метода радиационной инактивации ядер для исследования их функций в раннем развитии рыб // Журн. Общ. Биологии. 1959. Т. 20. С. 202-213.
55. Нормативы затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения. Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР № 1179 от 10 октября 1983. М. С. 6-7.
56. Объекты биологии развития. М.: Наука. 1975. 579 с.
57. Пиркова A.B. Размножение мидии Mytillus galloprovincialis Lam. и элементы биотехнологии ее культивирования // Автореф. дис. канд. биол. наук. Севастополь. АН Украины Институт биологии южных морей. 1994. 25 с.
58. Пиррота В. Векторы для трансформации Drosophila на основе Р-элементов // В кн.: Сельскохозяйственная биотехнология: векторные системы молекулярного клонирования. Под ред. Негрука В.И. М., ВО "Агропромиздат". 1991. С. 407-428.
59. Получение трансгенных животных продуцентов биологически активных белков. Госзаказ БС 12/91 // Промежуточный отчет ГНЦПМ. Оболенск.1991. С. 29.
60. Получение трансгенных животных продуцентов биологически активных белков. Госзаказ БС 12/91 // Промежуточный отчет ГНЦПМ. Оболенск.1992. С. 30.
61. Получение трансгенных животных продуцентов биологически активных белков. Госзаказ БС 12/91 // Промежуточный отчет ГНЦПМ. Оболенск. 1994. С. 18.
62. Практикум по эмбриологии. Под ред. Ивановой-Казас О.М. /Л.: Изд-во Ленинградского университета. 1986. 232 с.
63. Прозоров A.A. Генетическая трансформация и трансфекция. М.: Наука. 1980. 248 с.
64. Реунов A.A., Малахов В.В. Эволюция строения сперматозоидов у беспозвоночных//Успехи современной биологии. 1993. Т. 113(1). С. 3-18.
65. Серов О.Л. Генетическая трансформация животных посредством введения чужеродных генов в зиготы // Онтогенез. 1985. Т. 16(6). С. 553567.
66. Сигаева В.А., Кузнецова И.В., Кузнецов A.B. Связывание экзогенной ДНК сперматозоидами // Проблемы репродукции. 1996. Т. 2. С. 18-20.
67. Столяров З.Е. О механизме интеграции клеточной и вирусной ДНК. Возможная роль интеграции клеточной ДНК в канцерогенезе // Мол. биология. 1990. Т. 24(1). С. 17-22.
68. Сураева Н.М., Трухан P.C. Некоторые методологические приемы введения чужеродного гена в зиготы животных // Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов. (Выпуск 1). РАСХН. М. 1995. С. 227-243.
69. Тарантул В.З. Таргетинг генов как современная методология изучения их функции // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1996. Т. 2. С. 3-13.
70. Тарантул В.З., Кузнецова Е.Д., Андреева Л.Е., Серова И.А., Газарян К.Г. Дифференцированное выщепление аденовирусной ДНК из соматических клеток трансгенных мышей // Онтогенез. 1988. Т. 19(4). С. 443 .
71. Тарантул В.З., Макарова И.В., Андреева Л.Е., Смирнова Е.Б., Газарян К.Г., Кузнецова Е.Д. ДНК аденовируса обезьян и ее экспрессия в органах потомков трансгенных мышей // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. 1986. Т. 1. С. 22-26.
72. Хафаги О., Барминцев В.А., Шан Лицзуань Сперматозоиды могут быть использованы для переноса рекомбинантных конструкций, экспрессирующих ген ß-Gal в тканях личинок карпа // Генетика. 1994. Т. 30. Приложение. С. 169.
73. Хесин Р. Б. Непостоянство генома. М.: Наука. 1985. 472 с.
74. Шан Лицзуань, Бенюмов А.О., Голиченков В.А. Аномалии эмбриогенеза у трансгенных Danio rerio (pisces) // Генетика. 1994. Т. 30 (приложение). С. 180.
75. Штыркина Л.Ф. Влияние температуры и солености воды на ранний онтогенез черноморской мидии (Mytillus galloprovincialis Lam.) IV Всесоюз. конф. по промысловым беспозвоночным. Севастополь. Апр. 1986 г. Ч. 2. С. 257-258.
76. Щит И.Ю., Кузнецов A.B., Каурова С.А., Кузнецова И.В., Гусев В.В. Негативные эффекты экзогенной ДНК на оплодотворение и ранний эмбриогенез в опытах по опосредованному сперматозоидами переносу генов// Проблемы репродукции. 1998. Т. 4(4). С. 5-10.
77. Щит И.Ю., Кузнецова И.В., Денисова Т.С., Кузнецов A.B. Сперматозоид -подвижный вектор для рекомбинантной ДНК. Международная конференция посвященная памяти акад. A.A. Баева. Москва. Россия. 2022 мая 1996 г. С. 66.
78. Эрнст Л.К. Современные проблемы генной инженерии и перспективы селекции сельскохозяйственных животных // Сельскохозяйственная биология. 1994. Т. 4. С. 4-11.
79. Эрнст Л.К, Гольдман И.Л., Кадулин С.Г. Генная инженерия в животноводстве: трансгенные сельскохозяйственные животные, кормовые растения, микроорганизмы рубца// Биотехнология. 1993. Т. 5. С. 2-14.
80. Эрнст Л.К, Сергеев Н.И. Трансплантация эмбрионов сепьскохозяйственных животных. М.: ВО. Агропромиздат. 1989.
81. Янгмен Ф. Плазмидные векторы для обнаружения и использования транспозиций Тп917 в Bacillus и других грамположительных бактериях // Плазмиды. Методы. Под ред. К. Харди - М. Мир. 1990. С. 122-156.
82. Al-Shaw¡ R., Ansell J.D., Bishop J.О., Simons J.P., West J.D. Failure to produce transgenic mice by exposing to spermatozoa to DNA // Mouse Genome. 1990. V. 86. P. 224.
83. Albertrs B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. Molecular biology of the cell. 3-d ed. New York, London: Garland Publishing, Inc. 1994. 1294.110 p.
84. Allan D.J., Harmon B.V., Roberts S.A. Spermatogonia! apoptosis has three morphologically recognisable phases and shows no circadian rhythm during normal spermatogenesis in the rat // Cell Proliferation. 1992. V. 25. P. 241-250.
85. Alyarez M.C., Garcla-Pozo S., Bejar J. Expression and fate of the plasmid CMV-CAT in the marine species Sparus aurata // IV International Marine Biotechnology Conference. Naples. Italy. September 22-29. 1997. P. 250.
86. Ambramczuk J., Vorbrodt A., Solter D., Koprowski H. Infection of mouse preimplantation embryos with simian virus 40 and polyoma virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. P. 999-1003.
87. Amiya P.S.H., Wang C., Leung A., Swerdloff R.S. Involvement of apoptosis in the induction of germ cell degeneration in adult rats after gonadotropin-releasing hormone antagonist treatment // Endocrinology. 1995. V. 136. P. 2770-2775.
88. Anderson D.J., Bach D.L., Yunis E.J., Dewolf W.C. Major histocompatibility antigens are not expressed on human epididymal sperm // J. Immunol. 1982. V. 129. P. 452-454.
89. Anderson D.J., Wolff H., Pudney J., Whenhao Z., Martinez A., Martinez K., Mayer K. / In: Heterosexual transmission of AIDS. (Alexander N.J., Gebelnick H.L., Spieler J.M., eds.). New York: Wiley-Liss. 1990. P. 167-180.
90. Arezzo F. Sea urchin sperm as a vector of foreign genetic information // Cell Biol. Int. Rep. 1989. V. 13(4). P. 391-404.
91. Ashida E.R., Scofield V.L. Lymphocyte major histocompatibility complex-encoded class II structures may act as sperm receptors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84(10). P. 3395- 3399.
92. Atkinson P.W., Hiñes E.R., Beaton S., Matthaei K.I., Reed K.C., Bradley M.P. Association of exogenous DNA with cattle and insect spermatozoa in vitro II Mol. Reprod. Dev. 1991. V. 29. P. 1-5.
93. Autiero M., Abrescia P., Guardiola J. Interaction of seminal plasma proteins with cell surface antigens: presence of a CD4-binding glycoprotein in human seminal plasma// Exp. Cell. Res. 1991. V. 197(2). P. 268-271.
94. Babbitt B.P., Allen P.M., Matsueda G., Haber E., Unanue E.R. Binding of immunogenic peptides to la histocompatibility molecules // Nature. 1985. V. 317. P. 359-360.
95. Babinet C., Farza H., Morello D., Hadchouel M., Pursel C. Specific expression of hepatitis B surface antigen (HBsAG) in transgenic mice // Science. 1985. V. 230. P. 1160-1163.
96. Baccetti B. Evolutionary biology of orthopteroid insects. London: Ellis Horwood. 1987.
97. Bachiller D., Dotti C., Schellander K., Ruther U. Investigations of the use sperm as a vehicle for the introduction of exogenous DNA in oocytes // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1990. P. 178.
98. Bachiller D., Schellander K., Peli J., Ruether U. Liposome-mediated DNA uptake by sperm cells // Mol. Reprod. Dev. 1991. V. 30. P. 194-200.
99. Balhorn R. A model for the structure of chromatin in mammalian sperm // J. Cell Biol. 1982. V. 93. P. 298-305.
100. Barinaga M. Gene-transfer method fails test// Science. 1989. V. 246(4929). P. 446.
101. Bartke A. Editorial: apoptosis of male germ cells, a generalized or a cell type-specific phenomenon? // Endocrinology. 1995. V. 136. P. 3-4.
102. Bearer E.L., Friend D.S. Morphology of mammalian sperm membranes during differentiation, maturation and capacitation // J. Electron Microscopy Technique. 1990. V. 16. P. 281-297.
103. Bedford J.M., Cooper G.W. Membrane fusion events in the fertilization of vertebrate eggs / In: Membrane fusion. (Nicholson G.L., Poste G., eds.). Amsterdam: Elsevier-North Holland. 1978. P. 65-125.
104. Bedford J.M., Moore H.D.M., Franklin L.E. Significant of the equatorial segment of the acrosome of the spermatozoon in eutherian mammals // Exp. Cell. Res. 1979. V. 119. P. 119-126.
105. Benacerraf B. Role of MHC gene products in immune regulation // Science. 19Ö1. V. 212. P. 1229-1238.
106. Benoist C., Mathis D. Sperm cells as vectors for transferring DNA into mouse eggs: a breakthrough for immunologists? // Immunol. Today. 1989. V. 10(11). P. 369.
107. Billig H., Furuta I., Rivier C., Napanainen J., Parvinen M., Hsueh A.J.W. Apoptosis in testis germ cells: developmental changes in gonadotropin dependence and localization to selective tubule stages // Endocrinology. 1995. V. 136. P. 5-12.
108. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction method for screening recombinant plasmid DNA// Nucl. Acids Res. 1979. V. 6(7). P. 1513-1522.
109. Birnstiel M.L., Busslinger M. Dangerous liaisons: spermatozoa as natural vectors for foreign DNA? // Cell. 1989. V. 57. P. 701-702.
110. Bishop J.O., Smith P. Mechanism of chromosomal integration of microinjected DNA //Mol. Biol. Med. 1989. V. 6. P. 283-298.
111. Blanchard K.T., Boekelheide K. Adenovirus-mediated gene transfer to rat testis in vivo II Biol. Reprod. 1997. V. 56(2). P. 495-500.
112. Bodley A.L., Huang H.C., Yu C., Liu L.F. Integration of Simian virus 40 into cellular DNA occurs at or near topoisomerase II cleavage hot spots induced by VM-26 (teniposide) // Mol. Cell Biol. 1993. V. 13. P. 6190-6200.
113. Bollag R.J., Waldman A.S., Liskay R.M. Homologous recombination in mammalian cells //Annu. Rev. Genet. 1989. V. 23. P. 199-225.
114. Bonifer C., Vidal M., Grosveld F., Sippel A.E. Tissue specific and position independent expression of the complete gene domain for chicken lysocyme in transgenic mice // EMBO J. 1990. V. 9. P. 2843-2848.
115. Bonifer C., Yannoutsos N., Krueger G., Grosveld F., Sippel A.E. Dissection of the locus control function located on the chicken lysocyme gene domain in transgenic mice // Nucl. Acids Res. 1994. V. 22. P. 4202-4210.
116. Brackett B.G., Baranska W., Sawicki W., Koprowski H. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1971. V. 68. P. 353-357.
117. Brackett B.G., D.V.M., Ph.D., Mills J.A., M.B., Ch.B., M.R.C.O.G., Jeitles G.G., Jr., B.S. In vitro fertilization of rabbit ova recovered from ovarian follicles II Fert. Ster. 1972. V. 23(12). P. 898-909.
118. Bradley M.P., Rayns D.G., Forrester I.T. Effects of filipin, digitonin and polymyxin B on plasma membrane of ram spermatozoa an EM study // Arch. Androl. 1980. V. 4. P. 195-204.
119. Brem G. Transgenic animals / In: Biotechnology. V. 2. (Puhler A. ed.). New York: VCH Press. 1993. P. 745-832.
120. Brinster R.L., Avarbock M.R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonia! transplantation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 11303-11307.
121. Brinster R.L., Chen H.Y., Trumbauer M.E., Yagle M.K., Palmiter R.D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 4438-4442.
122. Brinster R.L., Sandgren E.P., Behringer R.R., Palmiter R.D. No simple solution for making transgenic mice // Cell. 1989. V. 59. P. 239-241.
123. Brinster R.L., Zimmermann J.W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 11298-11302.
124. Brown J.H., Jardetzky T., Saper M.A., Samraoui B., Bjorkman P.J., Wiley D.C. A hypothetical model of the foreign antibody binding site of class II histocompatibility molecules // Nature. 1988. V. 332. P. 845-850.
125. Burdon Th.G., Wall R.J. Fate of microinjected genes in preimplantation mouse embryos// Mol. Reprod. Dev. 1992. V. 33. P. 436-442.
126. Calarco P.G., Szollosi D. Intercisternal A particles in ova and preimplantation stages of mouse // Nature. (London) New. Biol. 1973. V. 243. P. 91-93.
127. Camaioni A., Russo M.A., Odorisio T., Gandolfi F., Fazio V.M., Siracusa G. Uptake of exogenous DNA by mammalian spermatozoa: specific localization of DNA on sperm heads // J. Reprod. Fertil. 1992. V. 96. P. 203-212.
128. Capecchi M.R. Altering the genome by homologous recombination // Science. 1989. V. 244. P. 1288-1292.
129. Castro F.O., Hernandez O., Uliver C., Solano R., Milanes C., Aquilar A., Perez A., de Armas R., Herrera L., de la Fuente J. Introduction of foreign DNA into the spermatozoa of farm animals//Theriogenology. 1990. V. 34 (6). P. 1099-1110.
130. Chan P.J., Kalugdan T., Su B.C., Whitney E.A., Perrott W., Tredway D.R., King A. Sperm as a noninvasive gene delivery system for preimplantation embryos // Fertil. Steril. 1995. V. 63(5). P. 1121-1124.
131. Chang X.-B. Wilson J.H. Modification of DNA ends can decrease end joining relative to homologous recombination in mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 4959-4963.
132. Chen T.M., Chen Y.H. Transgenic sperm or deadly missiles? // Fertil. Steril. 1996. V. 66(1). P. 167-169.
133. Chen T.T., Powers D.A. Transgenic fish //Tibtech. 1990. V. 8. P. 209-215.
134. Chourrout D., Perrot E. No transgenic rainbow trout produced with sperm incubated with linear DNA // Mol. Marine Biol. Biotech. 1992. V. 1(4/5). P. 282235.
135. Christians E., Rao V.H., Renard J.P. Sequential acquisition of transcriptional control during early embryonic development in the rabbit // Developmental biology. 1994. V. 164. P. 160-172.
136. Church R.B. Embryo manipulation and gene transfer in domestic animals // Tibtech. 1987. V. 5. C. 13-18.
137. Clausen P.A., Iyer A.P., Zaneveld L.J.D., Polakoski K.L., Waller D.P., Drisdell R. DNA uptake by mammalian spermatozoa // J. of Andrology. 1991. V. 12(1). P. 69.
138. Cockerill P.N., Garrad W.T. Chromosomal loop anchorage of the k-immunoglobulin gene occurs next to the enchancer in a region containing topoisomerase II sites // Cell. 1986. V. 44. P. 273-282.
139. Cohen J. Spermatozoa as carriers of extrinsic DNA consequences for intentional and unintentional gene transfer procedures // Human Reproduction. 1991. V. 6 (8). P. 1181.
140. Cohen J.S. Phosphorothioate oligodeoxynucleotides // In: Antisense Research and Applications. S.T. Crooke, B. Lebleu (eds). CRC Press Inc. 1993. P. 205221.
141. Cook P.R., Brazell I.A. Spectrofluorometric measurement of the binding of ethidium to superhelical DNA from cell nuclei // Eur. J. Biochem. 1978. V. 84. P. 465-477.
142. Dawid T.B., Blackler A.W. Maternal and cytoplasmic inheritance of mitochondria in Xenopus H Dev. Biol. 1972. V. 29. P. 152-161.
143. Delouis C., Bonnerot C., Vernet M., Nicolas J.-F. Expression of microinjected DNA and RNA in early rabbit embryos: changes in permissiveness for expression and transcriptional selectivity// Exp. Cell Res. 1992. V. 201. P. 284291.
144. Doi S., Campbell C., Kucherlapati R. Direct modification of genes by homologous recombination in mammalian cells // Transgenic animals. Eds. F. Grosveld, G. Kollias - London: Academic Press, 1992. P. 27-46.
145. Dussaix E., Guetard D., Dauguet C., Dalmeida M, Auer J., Ellrodt A., Montagnier L., Auroux M. Spermatozoa as potential carriers of HIV // Research in Virology. 1993. V. 144(6). P. 487-495.
146. Dym M. Spermatogonia! stem cells of the testis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 11287-11289.
147. Ebert K.M. Gene transfer through embryo microingection // In Animal biotechnology. Babiuk L.A., Phillips J.P. Eds. Pergamon Press. 1989. P. 233250.
148. Efimov V.A., Kalinkina A.L., Chakhmakhcheva O.G., Hill T.S., Jayaraman K. New efficient sulfurizing reagents for the preparation of oligodeoxyribonucleotide phosphorothioate analogues // Nucleic Acids Research. 1995. V. 23(20). P. 4029-4033.
149. Elinson R.P. Fertilization in amphibians: The ancestry of the block to polyspermy// Int. Rev. Cytol. 1986. V. 101. P. 59-100.
150. Erickson R.P. Are intermediate vectors needed between foreign DNA on sperm and the nucleus? // Immunology Today. 1990. V. 6. N. 2. P. 31.
151. Etkin L.D., Pearman B. Distribution, expression and germ-line transmission of exogenous DNA sequences following microinjection into Xenopus laevis eggs // Development. 1987. V. 99. P. 15-23.
152. Evans J.W., Hollander A. Eds. Genetic engineering of animals. An agricultural perspective. New York: Plenum Press. 1986.
153. Fellous M., Dausset J. Probable haploid expression of HL-A antigens on human spermatozoon // Nature. 1970. V. 225. P. 191-193.
154. Flytzanis C.N., McMahon A.P., Hough-Evans B.R., Katula K.S., Britten R.J., Davidson E.H. Persistence and integration of cloned DNA in postembryonic sea urchins // Dev. Biol. 1985. V. 108. P. 431-442.
155. Forbes D.J., Kirschner M.W., Newport J.W. Spontaneous formation of nucleuslike structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs // Cell. 1983. V. 34. P. 13-23.
156. Francolini M., Lavitrano M., Lamia C.L., French D., Frati L., Cotelli F., Spadafora C. Evidence for nuclear internalization of exogenous DNA into mammalian sperm cells // Mol. Reprod. Dev. 1993. V. 34. P. 133-139.
157. Freeman B.M., Bumstead N. Transgenic poultry: theory and practice // World's Poultry Science Journal. 1987. V. 43. P. 180-190
158. Gagne M., Pothier F., Sirard M.A. The use of electroporated bovine spermatozoa to transfer foreign DNA into oocytes // Methods Mol. Biol. 1995. V. 48. P. 161-166.
159. Gagne M.B., Pothier F., Sirard M.-A. Electroporation of bovine spermatozoa to carry foreign DNA in oocytes // Mol. Reprod. Dev. 1991. V. 29. P. 6-15.
160. Gandolfi F., Lavitrano M., Camaioni A., Spadafora C., Siracusa G., Lauria A. The use of sperm-mediated gene transfer for the generation of transgenic pigs // J. Reprod. Fértil. Abstr. 1989. V. 4. P. 21.
161. Gandolfi F., Terqui M., Modina S., Brevini T.A., Ajmone-Marsan P., Foulon-GauzHe F., Courot M. Failure to produce transgenic offspring by intra-tubal insemination of gilts with DNA-treated sperm // Reprod. Fértil. Dev. 1996. V. 8(7). P. 1055-1060.
162. Gannon F., Powell R., Barry T., McEvoy T.G., Sreenan J.M. Transgenic farm animals //J. of Biotechnology. 1990. V. 16. P. 155-170.
163. Gavora J.S., Benkel B., Sasada H., Cantwell W.J., Fiser P., leather R.M., Nagai J., Sabour M.P. An attempt at sperm-mediated gene transfer in mice and chickens// Canadian Journal of Animal Science. 1991. V. 71. P. 287-291.
164. Giles R.E., Blanc H., Cann H.M., Wallace D.C. Maternal inheritance of human mitochondrial DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. P. 6715-6719.
165. Gobert B., Amiel C., Tang J., Barbarino P., Bene M.C., Faure G, CD4-like molecules in human sperm // FEBS Lett. 1990. V. 261(2). P. 339-342.
166. Goldberg E.H., Aoki T., Boyse E.A., Bennett D. Detection of H-2 antigens on mouse spermatozoa by the cytotoxicity test // Nature. 1970. V. 228. P. 570-572.
167. Gordon J.W., Ruddle F.H. Gene transfer into mouse embryos. Production of transgenic mice by pronuclear injection // Meth. Enzymol. 1983. V. 101. P. 411437.
168. Gordon J.W., Ruddle F.H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei // Science. 1981. V. 214. P. 1244-1246.
169. Greaves D.R., Wilson F.D., Lang G., Kioussis D. Human CD2 3'-flanking sequences confer high-level, T cell-specific, position independent gene expression in transgenic mice // Cell 1989. V. 56. P. 979-986.
170. GridleyTh., Soriano Ph., Jaenisch R. Insertional mutagenesis in mice//Trends Genet. 1987. V. 3(6). P. 162-166.
171. Grosveld F., Blom van Assendelft G., Greaves D.R., Kollias G. Position-independent, high-level expression of the human (3-globin gene in transgenic mice // Cell. V. 1987. V. 51. P. 975-985.
172. Grosveld F., Kollias G. Eds. Transgenic animals. London: Academic Press. 1992. P. 288.
173. Gruenbaum Y., Revel E., Yarns S., Fainsod A. Sperm cells as vectors for generation of transgenic chickens//J. Cell Biochem. 1991. Suppl. 15. P. 194.
174. Guo M.W., Watanabe T., Mori E., Mori T. Molecular structure and function of CD4 on murine egg plasma membrane // Zygote. 1995. V. 3(1). P. 65-73.
175. Habrova V., Takac M., Navratil J., Macha J., Ceskova N., Jonak J. Association of rous sarcoma virus DNA with Xenopus laevis spermatozoa and its transfer to ova through fertilization // Mol. Reprod. Dev. 1996. V. 8(3). P. 332-342.
176. Hammer R.E., Pursel V.G., Rexroad C.E., Wall R.J., Bolt D.J., Palmiter R.D., Brinster R.L. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection // Nature. 1985. V. 315. P. 680-683.
177. Hinnen A., Hicks J.B., Fink G.R. Transformation of yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. P. 1929-1933.
178. Hochi S.-l., Ninomiya T., Mizuno A., Honma M., Yuki A. Fate of exogenous DNA carried into mouse eggs by spermatozoa //Animal Biotech. 1990. V. 1(1). P. 21-31.
179. Hoist A., Muller F., Zastrow G., Zentgraf H., Schwender S., Dinki E., Grummi F. Murine genomic DNA sequences replicating autonomously in mouse L cells // Cell. 1988. V. 52. P. 355-365.
180. Horan R., Powell R., McQuaid S., Gannon F., Houghton J.A. Association of foreign DNA with porcine spermatozoa // Archives of Andrology. 1991. V. 26. P. 83-92.
181. Horst J., Kluge F., Beyreuther K., Geron W. Gene transfer to human cells: transducting phage X plac gene expression in GM-gangliosidosis fibroblasts // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 3531-3535.
182. Houshmand M., Holme E., Hanson C., Wennerholm U.B., Hamberger L. Is paternal mitochondrial DNA transferred to the offspring following intracytoplasmic sperm injection?//J. Assist. Reprod. Genet. 1997. V. 14(4). P. 223-117.
183. Hrs-Brenco M. Temperature and salinity requirements for embryonic development of Mytilus galloprovincialis Lam // Thalassia Jugoslavia. 1974. V. 10(1-2). P.131-138.
184. Imai H., Walton C.E., Marshall J.T., Nancarrow C.D. Characteristics of DNA binding to sheep spermatozoa // J. Reprod. Develop. 1992. V. 38 (4). P. 255262
185. Iyengar A., Maclean N. Transgene concatemerization and expression in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) II Mol. Marine Biol. Biotech. 1995. V. 4(3). P. 248-254.
186. Jaenisch R. Transgenic animals // Science. 1988. V. 240. P. 1468-1474.
187. Jaenisch R., Mintz B. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. V. 71. P. 1250-1254.
188. Jager S., Wijchman J., Kremer J. Studies on the decondensation of human, mouse, and bull sperm nuclei by heparin and other polyanions // J. Exp. Zool. 1990. V. 256. P. 315-322.
189. Johnson M.H., Edidin M. H-2 antigens on mouse spermatozoa // Transplantation. 1972. V. 14. P. 781-786.
190. Jonak J., Habrova V., Takac M., Macha J., Reinis M., Pokorna H. Transfer of Rouse sarcoma virus DNA to ova by Xenopus laevis spermatozoa // Biology International. 1994. V. 18(5). P. 465.
191. Jonakova V., Sanz L., Calvete J.J., Henschen A., Cechova D., Topferpetersen E. Isolation and biochemical-characterization of a zona pellucida-binding glycoprotein of boar spermatozoa//FEBS Lett. 1991. V. 280(1). P. 183-186.
192. Jurisicova A., Varmuza S., Casper R.F. Programmed cell death and human embryo fragmentation // Mol. Hum. Reprod. 1996. V. 2. P. 93-98.
193. Kaneda H., Hayashi J., Takahama S., Taya C., Lindahl K.F., Yonekawa H. Elimination of paternal mitochondrial DNA in intraspecific crosses during early mouse embryogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92(10). P. 45424546.
194. Kellum R., Schedl P. A position effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains//Cell. 1991. V. 64. P. 941-950.
195. Kelly F., Condamine H. Tumor viruses and early mouse embryos // Biochem. Biophys. Acta. 1982. V. 651. P. 105-141.
196. Khoo H.W., Ang L.H., Lim H.B., Wong K.Y. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into zebrafish //Aquaculture. 1992. V. 107(1). P. 1-19.
197. Kiessling A.A., Crowell R.C., Connell R.S. Sperm-assosiated retroviruses in the mouse epididymis// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 8667-8671.
198. Kim J.H., Jung-Ha H.S., Lee H.T., Chung K.S. Development of a positive method for male stem cell-mediated gene transfer in mouse and pig // Mol. Reprod. Dev. 1997. V. 46(4). P. 515-526.
199. Koller B.H., Smithies 0. Altering genes in animals by gene targeting // Annual Review of Immunology. 1992. V. 10. P. 705-730.
200. Kumar S. Gene targeting and its potential applications in manipulation of chicken genome // Proceedings of the 5th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. 1996. V. 21. P. 365-377.
201. Kuznetsov A.V., Andreeva L.E., Kuznetsova I.V., Grigorenko A.P. Sperm cells as noninvasion system of delivery foreign genes to ova for prenatal genotherapy // 8th IMP Spring Conference "Genes". Vienna. Austria. May 2224. 1997b. P 88.
202. Lacy E., Roberts S., Evans E.P., Burtenshaw M.D., Costantini F. A foreign a-globin gene in transgenic mice: integration at abnormal chromosomal positions and expression in appropriate tissues // Cell. 1983. V. 34. P. 343-358.
203. Laimins L.A., Tsichlis P., Khoury G. Multiple enhancer domains in the 3' terminus of the Prague strain of Rous sarcoma virus // Nucl. Acids Res. 1984. V. 12. P. 6427-6442.
204. Lauria A., Gandolfi F. Resent advances in sperm cell mediated gene transfer // Mol. Reprod. Dev. 1993. V. 36. P. 255-257.
205. Lavitrano M., Camaioni A., Fazio V.M., Dolci S., Farace M.G., Spadafora C. No simple solution for making transgenic mice (replay) // Cell. 1989b. V. 59. P. 239-241.
206. Lavitrano M., Camaioni A., Fazio V.M., Dolci S., Farace M.G., Spadafora C. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice // Cell. 1989a. V. 57. P. 717-723.
207. Lavitrano M., Forni M., Varzi V., Pucci L., Bacci ML., Di Stefano C., Fioretti D., Zoraqi G., Moioli B., Rossi M., Lazzereschi D., Stoppacciaro A., Seren E.,
208. Alfani D., Cortesini R., Frati L Sperm-mediated gene transfer: production of pigs transgenic for a human regulator of complement activation // Transplant. Proc. 1997a. V. 29(8). P. 3508-3509.
209. Lavitrano M., French D., Camaioni A., Zani M., Frati L., Spadafora C. The interaction between exogenous DNA and sperm cells // Mol. Reprod. Dev. 1992a. V. 31. P. 161-169.
210. Lavitrano M., Lulli V., Maione B., Zani M., Francolini M., Spadafora C. Interaction between sperm cells and exogenous DNA: sperm mediated gene transfer// Biology International. 1994. V. 18(5). P. 464.
211. Levis W.R., Whalen J.J., Sherins R.J. Mixed cultures of sperm and leukocytes as a measure of histocompatibility in man // Science. 1976. V. 191. P. 302-304.
212. Loke S.L., Stein C.A., Zhang X.H., Mori K., Nakanishi M., Subasinghe C., Cohen J.S., McNeckers L. Characterization of oligonucleotide transport into living cell // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 3474-3478.
213. Macha J., Stursova D., Habrova V., Takac M., Jonak J. DNA uptake by mice and toad sperm cells // Biology International. 1994. V. 18(5). P. 464.
214. Mahon K.A., Overbeek P.A., Westphal H. Prenatal lethality in a transgenic mouse line is the result of a chromosomal translocation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 1165-1168.
215. Maione B., Pittoggi C., Achene L., Lorenzini R., Spadafora C. Activation of endogenous nucleases in mature sperm cells upon interaction with exogenous DNA//DNA & Cell Biol. 1997. V. 16(9). P. 1087-1097.
216. Mandel M., Higa A. Calcium dependent bacteriophage DNA infection // J. Mol. Bio! 1970. V. 53(1). P. 159-166.
217. Mark W.K., Signorelly K., Lacy E. An insertional mutant in a transgenic mouse line results in developmental arrest at day 5 of gestation // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1985. V. 50. P. 453-463.
218. McCarrey J.R., Thomas K. Human testis-specific PGK gene lacks introns and possesses characteristics of a processed gene // Nature. 1987. V. 326. P. 501505.
219. McKnight R.A., Shamay A., Sankaran L., Wall R.J., Hennighausen L. Matrixattachment regions can impart position-independent regulation of a tissue-specific gene in transgenic mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 6S43-6947.
220. McKnight R.A., Shamay L., Wall R.J., Hennighausen L. Matrix-attachment regions can impart position-independent regulation of a tissue-specific gene in transgenic mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 6943-6947.
221. McMahon A.P., Flytzanis C.N., Hough-Evans B.R., Katula K.S., Britten R.J., Davidson E.H. Introduction of cloned DNA into sea urchin egg cytoplasmsreplication and persistance during embriogenesis // Dev. Biol. 1985. V. 108. P. 420-430.
222. McPherson S., Longo F. Nicking of rat spermatid and spermatozoa DNA: Possible involvement of DNA topoisomerase II // Dev. Biol. 1993. V. 158. P. 122-130.
223. Meizel S. The importance of hydrolytic enzymes to an exocytotic event, the mammalian sperm acrosome reaction // Biol. Rev. 1984. V. 59. P. 125-157.
224. Milne C.P., Jr., Eischen F.A., Collis J.E., Jensen T.L. Preliminary evidence for honey bee sperm-mediated DNA transfer // International Symposium on Molecular Insects Science. Tucson. USA. 24 Oct. 1989. P. 3-7.
225. Mirkovitch J., Mirault M.E., Laemmli U.K. Organization of the higher order chromatin loop: specific DNA attachment sites on nuclear scaffold // Cell. 1984. V. 39. P. 223-232.
226. Mita M., Nakamura M. Lipid globules at the midpieces of Glyptocidaris crenularis spermatozoa and their relation to energy metabolism // Mol. Reprod. Dev. 1993. V. 34. P. 158-163.
227. Mori T., Guo M.W., Mori E., Shindo Y., Mori N., Fukuda A., Mori T.A. Expression of class II major histocompatibility complex antigen on mouse sperm and its roles in fertilization // Am. J. Reprod. Immunol. 1990. V. 24. P. 914.
228. Mori T., Guo M.W., Yoshida H., Saito S., Mori E. Expression of the signal transducing regions of CD4-like and Ick genes in murine egg // Biochem. Biophys Res. Commun. 1992. V. 182(2). P. 527-533.
229. Morse-Gaudio M., Risley M.S. Topoisomerase II expression and VM-26 induction of DNA breaks during spermatogenesis in Xenopus laevis // Journal of Cell Science. 1994. V. 107(10). P. 2887-2898.
230. Muller F., Ivies Z., Erdelyi F., Papp T., Varadi L., Horvath L., Maclean N., Orban L. Introducing foreign genes into fish eggs with electroporated sperm as a carrier// Mol. Marine Biol, and Biotech. 1992. V. 1(4/5). P. 276-281.
231. Muramatsu T., Shibata 0., Ryoki S., Ohmori Y., Okumura J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V. 233(1). P. 45-49.
232. Naito M. Genetic improvement of chickens by direct gene transfer // Proceedings of the 5th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. 1996. V. 21. P. 341-353.
233. Nakanishi A., Iritani A. Gene transfer in the chicken by sperm-mediated metnods // Mol. Reprod. Dev. 1993. V. 36. P. 258-261.
234. Nakanishi A., Matsumoto K., Utsumi K., Iritani A. Association of exogenous DNA with fowl sperm // Proc. 6th Ann. Meet. Jpn. Soc. Reprod. Immunol. Reprod. 1992. V. 6. P. 49-51.
235. Natali P.G., Martino CD., Quaranta V., Nicotra M.R., Frezza F., Pellegrino M.A., Ferrone S. Expression of la-like antigens in normal human nonlymphoid tissues//Transplantation. 1981. V. 31. P. 75-78.
236. Nelson W.G., Kastan M.B. DNA strand breaks: the DNA template alteration that triggers p53-dependent DNA damage response pathways // Mol. Cell. Biol. 1994. V. 14. P. 1815-1823.
237. Ninomiya T., Hochi M., Yuki A. Structures of integrated DNA containing human adenovirus E1A gene in transgenic mice // Agric. Biol. Chem. 1988. V. 52. P. 2537-2546.
238. Ninomiya T., Hoshi M., Mizumo A., Magao M., Yuki A. Selection of mouse preimplantation embryos carrying exogenous DNA by polymerase chain reaction // Mol. Reprod. Dev. 1989. V. 1. P. 242-248.
239. Ogawa T., Arechaga J.M., Avarbock M.R., Brinster R.L. Transplantation of testis germinal cells into mouse seminiferous tubules // Int. J. Dev. Biol. 1997. V. 41(1). P. 111-122.
240. Ono T., Muto S., Matsumoto T., Mochii M., Eguchi G. Use of gonadal primordial germ cells (PGCs) as tools for gene transfer in chickens // Methods Mol. Biol. 1997. V. 180. P. 425-432.
241. Orkin S.H. Globin gene regulation and switching: circa 1990 // Cell. 1990. V. 63. P. 665-672.
242. Overbeek P.A., Lai S.-P., Van Quill K.R. Westphal H. Tissue-specific expression in transgenic mice of a fused gene containing RSV terminal sequences//Science. 1986. V. 231. P. 1574-1577.
243. Paleudis G.A., Kohler C.C., Muhlach W.L. Failure of sperm cells as vector for introducing foreign DNA into fish eggs // II International Marine Biotechnology Conference. Baltimor. USA. October 13-16. 1991. P. 78.
244. Palmiter R.D., Brinster R.L. Germline transformation of mice // Ann. Rev. Genet. 1986. V. 20. P. 465-499.
245. Palmiter R.D., Chen H.Y., Brinster R.L. Differential regulation of metallothionein-thimidine kinase fusion genes in transgenic mice and their offspring // Cell. 1982b. V. 29. P. 701-710.
246. Palmiter R.D., Sandgren E.P., Avarbock M.R., Allen D.D., Brinster R.L. Heterologous introns can enhance expression of transgenes in mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 478-482.
247. Papahadjopoulos D., Vail W.J., Pangborn W.A., Poste G. Studies on membrane fusion II. Introduction of fusion in pure phospholipid membranes by calcium ions and other divalent metals // B.B.A. 1976. V. 135. P. 639-652.
248. Parnes J.R. Molecular biology and function of CD4 and CD8 // Adv. Immunol. 1989. V. 44. P. 265-311.
249. Patil J.G., Khoo H.W. Nuclear internalization of foreign DNA by zebrafish spermatozoa and its enhancement by electroporation // The Journal of Experimental Zoology. 1996. V. 274. P. 121-129.
250. Pelchen-Matthews A., Armes J.E., Griffiths G., Marsh M. Differential endocytosis of CD4 in lymphocytic and nonlymphocytic cells // J. Exp. Med. 1991. V. 173(3). P. 575-587.
251. Pelchen-Matthews A., Armes J.E., Marsh M. Internalization and recycling of CD4 transfected into HeLa and NIH3T3 cells // EMBO J. 1989. V. 8(12). P. 3641-3649.
252. Pelchen-Matthews A., Boulet I., Littman D.R., Fagard R., Marsh M. The protein tyrosine kinase p56lck inhibits CD4 endocytosis by preventing entry of CD4 into coated pits // J. Cell. Biol. 1992. V. 117(2). P. 279-290.
253. Perez A., Solano R., Castro F.O., Lleonart R., de Armas R., Martinez R., Aquilar A., Herrera L., de la Fuente J. Sperm cells mediated gene transfer in cattle // Biotecnología Aplicada. 1991. V. 8(1). P. 90-94.
254. Phillips D.M. Insect sperm: their structure and morphogenesis // J. Cell Biol. 1970. V. 44. P. 243-277.
255. Piearahita J.A., Moore K., Oetama В., Lee C.K., Scales N., Ramsoondar J., Bazer F.W., Ott T. Generation of transgenic porcine chimeras using primordial germ cell-derived colonies// Biol. Reprod. 1998. V. 180. P. 1321-1329.
256. Piko L., Hammons M.D., Taylor K.D. Amounts, synthesis, and some properties of intracisternal A particle-related RNA in early mouse embryos // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 488-492.
257. Powell D., Cran D.G., Jennings C., Jones R. Spatial organization of repetitive DNA sequences in the bovine sperm nucleus // J. Cell Sci. 1990. V. 97. P. 185191.
258. Promega guide. Protocols and application 1989/90.
259. Razin S.V., Kekelidze M.G., Lukanidin E.M., Scherrer K., Georgiev G.P. Replication origins are attached to the nuclear skeleton // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 8189-8207.
260. Razin S.V., Vasetzky Y.S. Domain organization of eukaryotic genome // Cell Biol. Int. Reports. 1992. V. 16. P. 697-708.
261. Reynolds E.J. The use of lead citrate at high pH as electronopaque stain in electron microscopy//J. Cell Biology. 1963. V. 17. P. 2108-2112.
262. Roth D., Wilson J. Illegitimate recombination in mammalian cells // In: Genetic recombination, Kucherlapati R., Smith G.R. (eds). Washington. DC: Am. Soc. Microbiol. 1988. P. 621-653.
263. Rothstein R.J. One step gene disruption in yeast // Meth. Enzymol. 1983. V. 101. P. 202-211.
264. Rottmann 0., Hofer P. A method for transferring organic and/or inorganic substances to egg cells and/or somatic cells of animals and compositions for use therein // World patent WO 87/05325. 11.09.1987.
265. Rottmann O.J., Antes R., Hofer P., Maierhofer G. Liposome mediated gene transfer via spermatozoa into avian egg cell // J. Anim. Breed. Genet. 1992. V. 109. P. 64-70.
266. Rottmann O.J., Antes R., Hofer P., Sommer B., Grummt F. Liposome mediated gerte transfer via sperm cells // Biology International. 1994. V. 18(5). P. 483.
267. Rusconi S., SchaffnerW. Transformation of frog embryos with a rabbit (3-globin gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P. 5050-5055.
268. Saiki R.K., Gelfand D.G., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. V. 239. P. 487-491.
269. Sailer B.L., Jost L.K., Evenson D.P. Mammalian sperm DNA susceptibility to in situ denaturation associated with the presence of DNA strand breaks as measured by the terminal deoxynucleotidyl transferase assay // J. Androl. 1995. V. 16. P. 80-87.
270. Sang H., Perry M.M. Episomal replication of cloned DNA injected into the fertilized ovum of the hen Gallus domesticus // Mol. Reprod. Dev. 1989. V. 1. P. 98-106.
271. Schellander K., Peli J., Schmall F., Brem G. Artificial insemination in cattle with DNA-treated sperm //Animal Biotechnol. 1995. V. 6. P. 41-50.
272. Schnieke A., Harber K., Jaenisch R. Embryonic lethal mutation in mice induced by retrovirus insertion into the a1 (I) collagen gene // Nature. 1983. V. 304. P. 315-320.
273. Schnieke A.E., Kind A.J., Ritchie W.A., Mycock K., Scott A.R., Ritchie M., Wilmut I., Colman A., Campbell K.H. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts // Science. 1998. V. 278(5346). in press.
274. Schwartzman R.A., Cidlowski J.A. Apoptosis: the biochemistry and molecular biology of programmed cell death//Endoc. Rev. 1993. V. 14. P. 133-151.
275. Scofield V.L., Clisham R., Bandyopadhvay L., Gladstone P., Zambont L., Raghupaty R. Binding of sperm to somatic cells via HLA-DR. Modulation by sulfated carbohydrates//J. Immunol. 1992. V. 148(6). P. 1718-1724.
276. Scofield V.L., Schlumpberger J.M., West L.A., Weissman I.L. Protochordate allorecognition is controlled by a MHC-like gene system // Nature. 1982. V. 295(5849). P. 499-502.
277. Selivanova G., Lotsova V., Grafstrom R., Wiman K.G. DNA strand breaks: direct activators of p53 // IMP 7th Spring Conference "Genes". The Austria Center. Vienna. Austria. 1996.
278. Sette A., Buus S., Appella E., Adorini L., Grey H.M. Structural requirements for the interaction between class II MHC molecules and peptide antigens // Immunol Res. 1990. V. 9. P. 2-7.
279. Shalgi R., Phillips D.M. Mechanics of sperm entry in cycling hamsters // J. Ultrastruct. Res. 1980. V. 71. P. 154-161.
280. Shamila Y., Mathavan S. Sperm-mediated gene transfer in the silkworm Bombyxmori //Arch. Insect Biochem. Physiol. 1998. V. 37(2). P. 168-177.
281. Shiokawa K., Tashiro K., Yamana K., Sameshima M. Electron microscopic studies of giant nucleus-like structure formed by X-DNA introduced into the cytoplasm of Xenopus fertilized eggs and embryos // Cell Diff. 1987. V. 20. P. 253-261.
282. Simons J.P., Wilmut I., Clark A.J., Archibald A.L., Bishop J.O., Lathe R. Gene transfer into sheep // Bio/Technology. 1988. V. 6. P. 179-183.
283. Sin F.Y.T., Bartley A.L., Walker S.P., Sin I.L., Symonds J.E., Hawke L., Hopkins C.L. Gene transfer in Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-/acZ DNA // Aquaculture. 1993. V. 117(1-2). P. 57-69.
284. Sin F.Y.T., Walker S.P., Symonds J.E., Sin I.L. Sperm-mediated gene transfer in Chinook salmon // International Fish Physiology Symposium. Vancouver. Canada. July 16-21. 1994.
285. Sleckman B.P., Peterson A., Jones W.K., Foran J.A., Grenstein J.L., Seed B., Burakoff S.J. Expression and function of CD4 in a murine T-cell hybridoma // Nature. 1987. V. 328(6128). P. 351-353.
286. Sliwa L. Heparin as a chemoattractant for mouse spermatozoa // Archives of Andrology. 1993. V. 31(3), P. 149-152.
287. Smith F., Rouet R., Romanienko P.J., Jasin M. Double strand break at the target locus stimulate gene targeting in embryonic stem cells // Nucleic Acids Research. 1995. V. 23. P. 5012-5014.
288. Smith H.O., Danner D.B., Deich R.A. Genetic transformation // Annual Review of Biochemistry. Esmond E. Snell, Editor. 1981. V. 50. P. 41-68.
289. Snell G.D. Studies in histocompatibility//Science. 1981. V. 213. P. 172-178.
290. Sperandio S., Lulli V., Bacci M.L., Forni M., Maione B., Spadafora C., Lavitrano M. Sperm-mediated DNA transfer in bovine and swine species // Animal Biotechnology. 1996. V. 7. P. 59-77.
291. Squires E.J., Drake D. Transgenic chickens by liposome-sperm-mediated gene transfer // Proceedings of the 5th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. 1994. V. 21. P. 350-353.
292. Stief A., Winter D.M., Stratling W.H., Sippel A.E. A nuclear DNA attachment element mediates elevated and position independent gene activity // Nature. 1989 V. 341. P. 343-345.
293. Stoffel M.H., Frethem C., Hamilton D.W., Friess A.E. Improved preservation of rat epididymal sperm for high-resolution low-voltage scanning electron microscopy (HR-LVSEM) // Mol. Reprod. Dev. 1993. V. 34. P. 175-182.
294. Stuart G.W., Mcmurray J.V., Westerfield M. Replication, integration and stable germline transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos// Development. 1988. V. 103. P. 403-412.
295. Sun Y.X., Chen D., Guo Z.Q., Chen Y.F. The production of transgenic sheep by sperm mediated gene transfer method // Biology International. 1994. V. 18(5). P. 464.
296. Sunes J.R., Rubenstein L.R., Nicholas J. Use of a recombinant retrovirus to study post-implantation cell lineage in mouse embryos // EMBO J. 1986. V 5(12). P. 3133-3142.
297. Symonds J.E., Walker S.P., Sin F.Y.T. Electroporation of salmon sperm with plasmid DNA: Evidence of enhanced sperm/DNA association // Aquaculture 1994. V. 119(4). P. 313-327.
298. Symonds J.E., Walker S.P., Sin F.Y.T., Sin I.L. Development of mass gene transfer method in chinook salmon: Optimization of gene transfer by electroporated sperm // Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1994. V. 3(2). P. 104-111. .
299. Szostak J.W., Orr-Weaver T.L., Rothstein R.J., Stahl F.H. The double strand break repair model for recombination // Cell. 1983. V. 33. P. 25-35.
300. Tapanainen J.S., Tilly J.L., Vikho K.K., Hsueh A.J.V. Hormonal control of apoptotic cell death in the testis: gonadotropins and androgens as testicular cell survival factors // Mol. Endoc. 1993. V. 7. P. 643-650.
301. Tarantul V.Z., Kucheriava V.V., Makarova I.V., Baranov Yu.N., Begetova T.V., Andreeva L.E., Gazaryan K.G. Rearrengements of microinjected recombinant DNA in the genome of transgenic mice // Mol. Gen. Genet. 1986. V. 203. P. 305-311.
302. Telford N.A., Watson A.J., Schultz G.A. Transition from maternal to embryonic control in early mammalian development: a comparison of several species // Mol. Reprod. Dev. 1990. V. 26. P. 90-100.
303. Thomas K.R., Capecchi M.R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo derived stem cells // Cell. 1987. V. 51. P. 503-512.
304. Thorey I.S., Meneses J.J., Neznanov N.S., Kulesh D.A., Pedersen R.A., Oshima R.G. Embryonic expression of human keratin 18 and K-18-j3-galactosidase fusion genes in transgenic mice // Develop. Biol. 1993. V. 160. P. 519-534.
305. Trefil P., Kopecny V., Hajkova M., Petr J., Mika J. Association of (3H) DNA with fowl spermatozoa and their in vitro fertilization of hamster ova // British Poultry Science. 1992. V. 33. P. 879-882.
306. Trefil P., Mika J., Sliva D. Uptake of exogenous DNA by cock spermatozoa // Cell Biol. Intern. Rep. 1994. V. 18(5). P. 465.
307. Trefil P., Mika J., Sliva D., Kopecny V. Association of plasmid pKT3 with cock spermatozoa in 2 different temperatures // Cell Biol. Intern. Rep. 1993. V. 17(6). P. 615-617.
308. Trendelenburg M.F., Gurdon J. Transcription of cloned Xenopus ribosomal genes visualised after injection into oocyte nuclei // Nature. 1978. V. 276. P. 292-294.
309. Tsai H.J., Lai C.H., Yang H.S. Sperm as a carrier to introduce an exogenous DNA fragment into the oocyte of Japanese abalone (Haliotis divorsicolor suportexta) // Transgenic Res. 1997b. V. 6(1). P. 85-95.
310. Tsai H.J., Tseng F.S., Liao I.C. Electroporation of sperm to introduce foreign DNA into the genome of loach (Misgurnus anguillicaudatus) II Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 1995. V. 52. P. 776-787.
311. Udvardy A., Maine E., Schedl P. The 87A7 chromomere: identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domain // J. Mol. Biol. 1985. V. 185. P. 341-358.
312. SJeno K., Hiramoto Y., Hayashi S., Kondoh H. Introduction and expression of recombinant (3-galactosidase genes in cleavage stage mouse embryos // Develop. Growth and Differ. 1987. V. 30. N 1. P. 61-73.
313. Vielkind J.R. Medaka and zebrafish: ideal as transient and stable transgenic systems / In: Transgenic fish. (HewC.L., Fletcher G.L., eds.). Singapore: World Scientific. 1992. P. 72-91.
314. Vitetta E.S., Klein J., Vhr J.W. Partial characterization of la antigens from murine lymphoid cells// Immunogenetics. 1974. V. 1. P. 82.
315. Vojtiskova M. H-2d antigens on mouse spermatozoa // Nature. 1969. V. 222. P. 1293-1294.
316. Walker S.P., Symonds J.E., Sin I.L., Sin F.Y.T. Gene transfer by electroporated ch:;ncok salmon sperm // III International Marine Biotechnology Conference. Tromsoe. Norway. August 7-12. 1994. P. 71.
317. Wall R.J., Seidel G.E., Jr. Transgenic farm animals a critical analysis // Theriogenology. 1992. V. 38. P. 337-357.
318. Ward K.A., Nancarrow C.D. The genetic engineering of production traits in domestic animals // Experientia. 1991. V. 47. P. 913-922.
319. Ward W.S. Minireview deoxyribonucleic acid loop domain tertiary structure in mammalian spermatozoa // Biol. Reprod. 1993. V. 48(6). P. 1193-1201.
320. Ward W.S. The structure of the sleeping genome: implications of sperm DNA organization for somatic cells // J. Cell Biochem. 1994. V. 55(1). P. 77-82.
321. Ward W.S., Coffey D.S. Specific organization of genes in relation to the sperm nuclear matrix// Biochem. Biophys. Res. Comm. 1990. V. 173(1). P. 20-25.
322. Weng D.E., Morgan R.A., Gearhart J.D. Estimates of mRNA abundance in the mouse blastocyst based on cDNA library analysis // Mol. Reprod. Dev. 1989. V. 1. P. 233-241.
323. Whittingham D.G. Culture of mouse ova // J. Reprod. Fertil. Suppl. 1971. V. 14. P. 2-21
324. Wilkie T., Brinster R.L., Palmiter R.D. Germline and somatic mosaicism in transgenic mice//Dev. Biol. 1986. V. 118. P. 9-18.
325. Williams A.F. The immunoglobulin superfamily takes shape // Nature. 1986. V. 308. P. 12-13.
326. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J., Kind A.J., Campbell K.H.S. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells // Nature. 1997. V. 385. P. 810-813.
327. Winkler C., Vielkind J.R., Schartl M. Transient expression of foreign DNA during embryonic and larval development of the medaka fish (Oryzias latipes) II Mol. Gen. Genet. 1991. V. 226. P. 129-140.
328. Wong E.A., Capecchi M.R. Effect of cell cycle position on transformation by microinjection // Somat. Cell Mol. Genet. 1985. V. 11. P. 43-51.
329. Wong E.A., Capecchi M.R. Homologous recombination between coinjected DNA sequences peaks in early to mid-S phase // Mol. Cell Biol. 1987. V. 7. P. 2294-2295.
330. Wu G.M., Nose K., Mori E., Mori T. Binding of foreign DNA to mouse sperm mediated by its MHC class II structure // American J. of Reprod. Immunology. 1990. V. 24. P. 120-126.
331. Yamazaki Y., Fujimoto H., Ando H., Ohyama T., Hirota Y., Noce T. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation // Biol. Reprod. 1998. V. 59. P. 1439-1444.
332. Yanagimachi R. Mechanisms of fertilization in mammals / In: Fertilization and embryonic development in vitro. (Mastroianni L., Biggers J.D., eds.). New York: Plenum Press. 1981. P. 81-182.
333. Yang S.S., Wivel N.A. Physicochemical analysis of the deoxyribonucleic acid product of murine intracisternal A particle RNA-directed DNA polymerase // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 444. P. 167-174.243
334. Ycrifuji T., Mikawa H. Co-transfer of restriction endonucleases and plasmids DNA into mammalian cells by electroporation: Effects on stable transformation // Mutation Research. 1990. V. 243. P. 121-126.
335. Yotsuyanagi Y., Szollosi D. Early mouse embryo intracisternal particle: fourth type of retrovirus-like particle associated with the mouse // J. Natl. Cancer. Inst. 1981. V. 67. P. 677-685.
336. Yu J., Yan W., Zhang Y., Shen Y., Yan S. Sperm mediated gene transfer and method of detection of integrated gene by PCR // Acta Zool. Sin. Dongwu Xuebao. 1994. V. 40(1). P. 96-99.
337. Zani M., Lavitrano M., French D., Lulli V., Maione B., Sperandio S., Spadafora C. The mechanism of binding of exogenous DNA to sperm cells: factors controlling the DNA uptake // Exp. Cell Res. 1995. V. 217. P. 57-64.
338. Zoraqi G., Spadafora C. Integration of foreign DNA sequences into mouse sperm genome // DNA & Cell Biol. 1997. V. 16(3). P. 291-300.
-
Кузнецов, Андрей Вадимович
-
доктора биологических наук
-
Оболенск, 1999
-
ВАК 03.00.23
- Морфологическая и молекулярно-биологическая характеристика мужских гамет при патоспермии и идиопатическом бесплодии
- Генетические и эпигенетические особенности генома сперматозоида и их влияние на раннее эмбриональное развитие человека
- Ультраструктурная и молекулярно-генетическая характеристика сперматозоидов у пациентов с астенозооспермией
- Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из сперматозоидов: выделение, свойства и роль в их подвижности
- ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ В КАЧЕСТВЕ ПЕРЕНОСЧИКА ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК
