Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ В КАЧЕСТВЕ ПЕРЕНОСЧИКА ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ В КАЧЕСТВЕ ПЕРЕНОСЧИКА ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК"

л-зтз

На правах рукописи

Щит Ирина Юрьевна

ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ СПЕРМАТОЗОНДОВ в КАЧЕСТВЕ ПЕРЕНОСЧИКА ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК

03.00.23 - Зкотекнолстик •

Автореферат диссертации на соискание учакой етапаия Кандидата биологических нау»

Дубровмцы, М соков оса я область 1$>Э7г

1 tXиао^со-ш $ , Тра^л7^MM

Работа выполнен* а Государственном научно-исследовательском институт* прикладной микробиологии.

Научны* руководители: доктор биологических наук, Гусев В.В.

кандидат биологических наук, Кузнецов А. в.

Официальны« оппоненты: лектор биологических наук,

профессор Сергее* Н.И. кандидат биологических наук, Багиров В.А.

Ведущая организация • ВНИИ физиологии, биохимии и литания сельскохозяйственных животных

it "

Защита состоится Cj^t-fU'l^i-S.'- 1М8 г. ■ "ЦТ часом на ■ заседании Диссертационного совета Д 020.16.02 при Всероссийском научно-исследовательском институт* животноводства по адресу: 142012, Дубро*.> . Подольский район, Московская область.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотек* ВНИИ животноводства

Автореферат разослан 1М7 т

Ученый секретарь

диссертационного совета, *' .. *

доктор сельскохозяйственных £аук • .,;■ Н.В.Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ,

А*туэдьнфсть темы исследования. Успехи генной инженерии сделали возможным получение животных, содержащих в своем геноме чужеродную ДНК (чДНК), так называемых траисгеиных животных. Большое значение имеет получение животных . с генетически запрограммированными свойствами: заданным потенциалом продуктивности и качеством продукции (Wart, Nancarrow, 1991). устойчивых к различным заболеваниям (MuBer, Brem, 1991), а также использование трансгенных животных в качестве живых биореакторов, т. е. способных продуцировать биологически активные вещества (Clark. 1989),

Жиьотные-биореакторы, полученные при помощи трансгенной технологии, могут стать новым источником производства рекомбннантных белков для медицины. Корректная посттранспяционная модификация белков в тканях траисгенных животных делает эту технологию более предпочтительной по сравнению с микробиологическим синтезом (Meade, 1997).

Существующие в настоящее время методы переноса экзогенной ДНК в геном делятся на инструментальные (прямая микроинъекция клонированной ДНК в проиукпеус зигот), биологические (ретровирусная инфекция предим плантационных эмбрионов) и Комплексные (трансформация эмбриональных стволовых клеток (ES-клеток) и их перенос в бластоцисту, пересадка ядер из ES-клеток в энуклеировэнные зиготы). Данные методы, наряду с преимуществами, имеют ряд недостатков, связанных с трудоемкостью операций и сложностью применения их для крупных животных (Brem, 1993).

В связи с этим, актуальной становится необходимость разработки простого, эффективного и широко применяемого метода для встраиваний чужеродных генов в геномы различных водов млекопитающих, птиц и рыб.

Таким методом является процесс введения клонированной ДНК в клетки разных видов животных с помощью сперматозоидов. В основе этого метода лежит способность спермиев псспощатъ ДНК. Эта особенность, свойственная спермиям мнопис емко* животных, была использована для вводи нот в мужхме гаметы чДНК к для переноса ее в ямдепелег при оплодотворении. При таю* процедуре спермалжмды выпогегал. роль вектора для переноса чДНК. Эффективность переноса экзогенном ДНК с помощью этого метода составляет Э&-60% (Gfuenbaum

el а» . 1991) против 25% (BmslecMdl .

НАУЧМАП БИБЛИОТЕКА

Моск. ■ . а ^Дв»« и... inj

Йна. МаД^

Этот метод в перспективе может быть применен для введения нужных генов в геномы сельскохозяйственных животных для крупномасштабного производства белков. Переход на технологий получения трансгенных животных с помощью трансформированных сперматозоидов {возможно о использованием техники замораживания спермиев для создания криобанков семени) позволит значительно ускорить процедуру и 'снизить стоимость работ по созданию трансгеиных животных, а также снизигь цену получаемых при этом , биологически важных белков.

Цель .настоящей работы - разработать технологические основы генетической трансформации животных с использованием сперматозоидов кролика в качестве модели вектора для экзогенной ДНК.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

разработать систему неинаазивной доставки экзогенной ДНК гетерологичными спермиями в ооциты золотистого хомячка;

- изучить векторные свойства спермиев кролика при помощи рекомбинантных ДНК. '

• оценить эффективность переноса чужеродной ДНК;

- исследовать интеграцию экзогенной ДНК в геном реципиенткых животных при помощи Сауэерн-блотинга;

провести анализ зоотехнических преимуществ использования трансформированных сперматозоидов ло сравнению с микроииъекцией для получения трансгенкых животных.

Новизна работы заключается в том, что впервые рассматривается понятие состояния компетентности сперматозоидов к экзогенной ДНК. 8 связи С этим, определено влияние поповых режимов самцов кролика на связывание ДИК с кроличьими слермиями. Обнаружена разница начальных скоростей связывания ДНК спермнями. обусловленная различными режимами полового использования доноров спермы Впервые выявлены 4 участка связывания меченой дигоксигенином ДНК С головкой сперматозоида кролика, в серии экспериментов обнаружено отсутствие корреляции между подвижностью мужских гаиет и их способностью связыаатъ ДНК.

Впервые показана возможность тестирования векторных . свойств сперматозоидов с помощью осцитое золотистого хомячка.

Проведен анализ зоотехнических- преимуществ использования трансформированных спермиее для получения трансгенных животных по сравнению с методом мнкроиньекции. ""

Практическая значимость работы состоит а том, что в результате проведенных исследований разработана система неинвазивной доставки экзогенной ДНК мужскими гаметами кролика в яйцеклетки золотистого хомячка.

Предложенная методика интродукции чДНК в ооциты с помощью трансформированных спермиев кролика может быть использована дпя получения трансгенных особей у других видов сельскохозяйственные животных, птиц и рыб Разработанный метод в будущем позволит специалистам сельского хозяйства получать млекопитающих, птиц и рыб с более продуктивными свойствами, для биотехнологов появится возможность создания нового поколения биопрепаратов дпя медицины и ветеринарии, используя трансгенных животных в качестве живых биореакторов.

Апробация работы! Результаты исследований были представлены на научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых ВИЖа (Дубровицы, 1994 г,); на Международной научно-практической конференции "Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства" (Степногорск, 1995 г.); на Eurasian Symposium on Current Trends in Biotechnology: Gene Diagnostics, Gene Therapy and Informational Immunity. The Firsl Turkish - Russian Meeting (Ankara, 1995); на Международной конференции, посвященной памяти аиад A.A. Баева (Москва. 1996 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 205 источников, и приложения. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, включает 19 рисунков и 14 таблиц

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Общий план работы представлен на рис. 1,

в

Рис. 1 Общая схема проведенных исследований.

Эксперименты проводили на популяции . кроликов породы советская шиншилла питомника ГНЦ ПМ (Оболенск). Сперму для опытов по получению трэмс-тенных животных брали при помощи искусственной вагины от самцов-доноров

8 работе испольэовэлк: коммерческий вектор pGEM-4Z (Promega, США), плаэмиды pROacZ и pMTlacZ (предоставлены Ждановым А.6.), а также pCMVIacZ (получена от Чумакова Г.М ) Трансформацию сперматозоидов проводили по методике Кузнецовой и coai T. (1993). *

Для опытов по тестированию векторных свойств слермиев кролика с помощью* ооцитов хомяка капацитацию сперматозоидов проводили в среде В WW с 3,5% бычьим сывороточным альбумином (6СА) по методу Rogers (1979). После проведения капацитации проводили, трансформацию сперматозоидов экзогенной ДНК

Ооциты хомяка получали от 8-12 нед самок-доноров после обработки фопликулостимулирующим гормоном (ФСГ-супер, Россия) и хорионическим гонадотролином (чХГ, Россия). Животных убиеапи через 15-17 ч после инъекции

<ХГ, яйцеводы удаляли и помещали в среду BWW с 0,3% 6СА. Для высвобождения' яйцеклеток кумулюсные массы обрабатывали 10 мин 0,1% гиалуронидаэой при )7"С. Чтобы удалить гола peltucida ооциты помещали на 5 мин в 0,1% раствор троназы в среде BWW.

Для оплодотворения ооцитсв в каплю (200 мкл) капаци тированных слермиев .10' ntt/мл) под вазелиновым маслом помещали 20-25 яйцеклеток хомяка, лишенных ;ona pelluctda, и инкубировали при 37а С в течение 3 ч После отмывки от налипших Гринев яйцеклетки фиксировали в 1% глутаровом альдегиде (ГА) ti готовили ;ре Мараты, которые просматривали под фазово-контрастным микросхопом Opton .Германия) при увеличении к300 и фотографировали. Ооциты золотистого хомячка £ыли исследованы на содержание чужеродной .ДНК pCMVlacZ при помощи пол»'Мераэной цепной реакции (ПЦР).

ДНК pRK3lacZ (7 kb) метили tt-32P(CTP) (ИЯФ, Обнинск) в реакции ник-транс-ряции с помощью набора фирмы Fermentes (Литва). Для определения мест связывания экзогенной ДНК на сперматозоидах кролика ДНК pROacZ метили 01G-(ЛР, используя кит №1175033 фирмы Boehringer Manheim (Германия).

В опытах по определению участков связывания суспензию отмытых спермиев л DIG-ДНК инкубировали при комнатной температуре а течение 30 мин. Цветную реакцию проводили по методике & соответствии с настаьовнием к киту №1175041 фирмы Boehringer Manheim (Германия). ■ -

Суперовуляцию у крольчих вызывали в стадии ^роэструса при помощи знутримышечной инъекции фолликулостимулирующеш гормона (по 20 ME на кг живой массы) (intergonan, Германия) за 95 - часов до осеменения. Животных осеменяли пластиковыми катетерами, затем инъецировали внутривенно по 100 ME хорионического томадотропина (Ekluton. Германия). Через 46 часов после осеменения из яйцеводов раствором Хенкса вымывали предимллантационные эмбрионы

Выявление бактериальной ß-галактозидазы в ранних эмбрионах кролика проводили с помощью гистохимического окрашивания X-gal (Кузнецова и др., 1993; Кузнецова, 1995) и выявляли с помощью MUG (Херди, 1990).'

Выделение хромосомной ДНК (Ман/атис, 1Э64), точкоеую .гибридизацию (Мазин и Др.„ 1990) и Саузерн-блотинг (Девис и др., 1984) осуществляли по общепринятым методикам.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Эксперименты по получению траисгснных кропимое методом ммяроингьекци и

В опытах по микроинъекции с использованием хирургической техники имплантации эмбрионов, проведенных совместно с П А. Гоголевским (с геном RSV-iacZ) после пересадки 199 инъецированных зигот крольчихам-реципиентам родилось всего 6 крольчат, 2 из которых были мертворожденными (табл.1). .Трансгенных животных получено не было. В другой серии экспериментов вместе с Л.Е. Андреевой (при использовании гена cas-bGH) было имплантировано 205 инъецированных зигот, но у полученных 9 особей трансген не был обнаружен (см, табл.1). В этих двух опытах использовали 118 животных-доноров и реципиентов, проинъецировали 545 яйцеклеток, родилось всего 15 крольчат.

Таблица 1

Результаты опытов по получению трансгенных кроликов методом микроинъекции.

Опыт (соавтор) П.А. Гоголевский Л.Е. Андреева G. Brem

Используемые генные конструкции RSV-LTR-lacZ cas-bGH P814J3, B39J5, PB 159, 79578G, PB1534, Р15/34, PB140MLC

Инъецированные зиготы Трансплантирован ные 265(100,0) 199(75,1) 260 (100.0) 205 (73,2) ДО

Общее число реципиентов - 20 203

Родившиеся крольчата : В (100,0) 4(100,0) 41« (100,0)

Исследованные особи В (100,0) Выявленные особи • С интеграцией гена 0 (0,0) » (100,0) о Ю.О) 41« (100.0) 6(1,4)

| Примечание: ДО -данные отсутствуют

В эксперимента», проведенных совместно с Q. Brem, применение лапароскопии позволило значительно увеличить количество беременностей и ускорить процедуру имкроинъекции. Было использовано большое количество животных (см. табл. 1). В двух сериях экспериментов было получено 6 трансгенных крольчат (1,4%' от числа новорожденных особей). Даже с усовершенствованием

техники манипулирования эмбрионами и уменьшении трудоемкости процедуры микроинъекции частота получения трансгенных животных остается низкой.

Топография связывания чужеродной ДНК сперматозоидами

В опытах по определению участков связывания ДНК исследовано 1184 сперматозоида {564 • контрольных и 620 - опытных) 8 пробах не было аномапьных форм спермиев, обнаружены лишь отдельные клетки с утраченными хвостами. Окрашивание выявлено в виде полосок на головке сперматозоида. Выделено 5 окрашенных, четко видимых областей: I - акросомный участок. It - экваториальный сегмент, 111 - постакросомальная область, IV - задняя часть головки и V - шейка спермия. В опытной пробе окрашивание отмечено у 35,3% клеток. С зоной I связалось 6,5% чДНК, с зоной II - 3.6%. Большинство экзогенной ДНК было обнаружено на зоне III - 62,3%. В зоне IV находилось 22,9% чДНК. Небольшое количество ДНК (4,5%) связалось с шейкой спермия - зона V. На препарате сперматозоидов, обработанных гепарином, окрасилось лишь 4,5% клеток. Данные статистической обработки контрольных и опытных сперматозоидов представлены в виде гистограмм (рис. ?).

I II IV V I К IV V

i

I ill

о>=

i II

э

к 3 л.

3

S

г

. . Б

SM

юн

ж t f

•■«в i I

т * 1 t ■ ■ I

*

Ркармвннн I

Рис. 2 Результаты опыте* по определению участков связывания чДНК »в сперматозоидах кролика: А - опыт; Б - контроль (обработка гепарином).

Тест-система для характеристики векторных свойств спермиев

Схема экспериментов по оплодотворению in vitra яйцеклеток хомячке трансформированными слермиями кролика приведена на рис. 3.

Для обнаружения перенесенной ДНК применяли технику ПЦР. Были проведены 10 различных экспериментов, в которых было исследовано 100 яйцеклеток. Результаты опытов представлены на рис. 4.

После амплификации трансген был обнаружен в положительной пробе Net, где ДНК добавляли непосредственно к яйцеклеткам и не обрабатывали их ДНКаэои). Кроме того, положительный сигнал зарегистрирован в пробах №6-9. где сперматозоиды после капацитации подвергали искусственной трансфекции и затеи обрабатывали ДНКазойГ либо сами спермин (проба 9), либо оплодотворенные ими яйцеклетки (пробы 6-6). Размеры амллифицированного фрагмента соответствовали ожидаемому величиной 369 лн. Сигналы не были зарегистрированы в образцах 6ed добавления ДНК как при использовании необработанных спермиев (проба 2), так i -после их обработки Э% ДМСО и теплового шока (проба 5). Кроме того, сигналы не

I

««■■ним. к»

xiL»

4.

i niiiwmB^nJ'HainMmrt) i

цм<«14 (Г4 Мах Ш: f-чЛя

j»*» i платно

IBWt»cM46CA.»\ 1Г"Ь 1

/ ' —-*"

kr.wnnir

t ■ ' M', lui. ииня. w.îA:

î'

* i c* M. «ii ÎH M ME w • »

"t - .

РИс. 3. Схема опытов по тестированию векторных свойств сяермиев крепила при помощи яйцеклеток золотистого хомячка \:

обнаружены в пробах № 3.4,10 с естественной трансфвкцией капацитироеанных спермиев. причем не только в образце без удаления сперматозоидов с поверхности яйцеклеток трипсином (проба 4), ко и без обработки прилипших к яйцам сперматозоидов ДНКазой! (проба 3).

. Проведенные исследования дают основания утверждать, что оплодотворение яйцеклеток золотистого хомячка, лишенных zona peHuctda можно использовать как тест-систему для характеристики векторных свойств спермиеа разных животных.

1 2345 67 89 1011 1213

сперматозоидами кролика, трансформированными, плазмидой pCMVlacZ: 1 - zona-free ооциты хомяка с добавлением ДНК pCMVlacZ; 2 - ооциты хомяка.

оплодотворенные спермиями кролика; 3,4,10 • ооциты, оплодотворенные спермиями, которые инкубировали с плазмидой pCMVladZ; 5 - ооциты. оплодотворенные спермиями, на которые действовали ДМСО и тепловым шоком; 69 - то же , С ДНК pCMVlacZ, 11 - отрицательный контроль без ДНК; 12 - контрольная ДНК трансгенного животного с геном lacZ; 13 - ДНК фага к, рестрицированная Psll.

Идентификация репортер ж) й ДНК по экспрессии гена lacZ в , доимллантяционных эмбрионах кролика

фпуориметоия с использованием MUQ Через 4в ч после осеменения крольчих сперматозоидами, обработанными плззмидой pMTIacZ, в отдельных эмбрионах с помощью хромогенного субстрата MUG была зарегистрирована р-гапактозидаэная активность. Уровень флуоресценции в некоторых пробах с ДНК

pMTiacZ достоверно отличался от флуоресценции а образцах без ДНК или в пробах

*

с ппазмидой pGEM-4Z, несущей делегированный вариант гена lacZ без эукарйотического промотора (рис. 5). *

Гистохимическое выявление О-галэктозидазы рри помощи хромогекнрго <рубстрата Х-оа1. В экспериментах по переносу сперматозоидами рекомбинантной ДНК рЯК31ас2, в отличие от контрольных эмбрионов, подопытные зародыши после инкубации с Х-да1 демонстрировали равномерное окрашивание бластомеров разной степени интенсивности. В одном из экспериментов после обработки сперм пев ллазмидой было получено 18 эмбрионов с интенсивной (>+). 18 с умеренной (+) и 1 с неопределенной окраской (±). В случае использования сперматозоидов, не подвергавшихся обработке, только 1 зародыш обладал умеренной окраской и 1-меопределенмой, а у-16 эмбрионов сине-зеленое окрашивание отсутствовало. В ряде . случаев в окрашенных, зародышах краситель - образовывал кластеры. Большинство Интенсивно и слабо окрашенных опытных эмбрионов имели интактную морфологию и были покрыты муциноеой оболочкой.

Рис. 5 Активность бактериальной (!-галактозидаэы в отдельных эмбрионах кролика: а ' Ьосле осеменения елермиями, обработанными ДНК рМ"Пас2, б - ДНК рСЕМ42; в -

буфер БО;гй - статистически достоверное отличие (Р <0,05; ^тест).

Использование различных генетических конструкций. ш ш кодирующих гзлактозкдаэу. С помощью рекомбинактных конструкций, содержащих различные

регуляторные области, и репортерный ген 1ас2 (рОЕМ42, рНКЭ1ас2. рСМУ1ас2, рМЛасЛ), был проведен комбинаторный анализ влияния [>егуляторных элементов на экспрессию гена 1эс2 в предим плантационных эмбрионах (табл. 2). Полученные данные указывают на специфичность экспрессии гена 1зсг в сочетании с.НЭУЛЬТЕ*. СМУ и МТ1 промоторами и, соответственно, проявления признака |5-да!* в ранних эмбрионах кролика после применения трансформированных сперматозоидов.

Таблица 2

Экспрессия гена 1асГпод различными промоторами в ранних эмбрионах кролика.

Название генной конструкции Промотор Репортерный ген Обнаружение Р*да1 в предимплактационных эмбрионах

р8К31ас2 RSV-I.TR 1асГ р-даГ*

рСМУ1ас2 СМУ 1ас2* НаГ*

рмпасг МТ1 1ас2+ р-даГв

рСЕМ42 1асГ ИвГ'

Примечание: *- гистохимическое окрашивание Х-да1, использованием М1Ю. - флуориметрия с

Воспроизводимость опытов по переносу чДНК сперматозоидами в ооциты ироликэ с помощью искусственного осеменения изучали с помощью плаэмид рВК31асг и рСМУ1ас2. В результате (кстохимкческого окрашивания эмбрионов Х-да1 показано, что в стдельиъх экспериментах частота встречаемости зародышей, накапливающих р-галзктоэидаэу составляет от 0 до 97%* при средней величине 31.6±16,1 и ассимметрии распределения 0,96 для рЯКЗ(ас1, а также 37,7±24,3 и 0.44 дня рСМУ1ас2 соответственно (рис. 6).

И

4 1 . ' *

I -•—--1 »-----•■«-

» в » ■ »

Рис. в. Воспроизводимость опытов по переносу ДНКрЯКЗ>Ас2 и рСМУ1ас2 сперматозоидами а ооциты кролика: а- сДНКрЙКЭ1эс2. е-сДНКрСМ\Яаег; б.г-без ДНК.

Генетическая трансформация жимтьп с помшцыо омримв

Обшие итоги опытов, результаты точковой, гибр^диз^цци с зондом 1а-заР1-рЯК^а^ Было проведено три опыта по получению трансгенных кроликов. В первом эксперименте из 10 самок, осемененных трансформированными спермиями. 4 крольчихи (А2. АЗ, Ав и А9) родили 26 крольчат, которые были исследованы при помощи дот-гибридизации на содержание чужеродных последовательностей ДНК. Положительные сигналы зарегистрированы не были. Во Ьтором эксперименте е результате осеменения 8 крольчих (07-014) было получено 35 крольчат, из которых 29 особей исследовали с помощью дот-гибридизации. Как и в предыдущем случае позитивные животные выявлены не были.

В третьем опыте 3 самим, осемененные трансформированными сперматозоидами, родили 30 крольчат (табл. 3), 27 из моторых исследованы при .помощи дот-гибридизации на содержание последовательности рЯК31ас2 (рис. 7). В 19 случаях (70,4%). зарегистрирован положительный сигнал. В этих образцах обнаружено 0.1-1 пг искомой ДНК на 10 мкг хромосомной ДНК, что соответствует примерно 1-10 копиям ппазмиды рггЮэсг на геном. Зонд не гибридизовапся с ДНК мз контрольных животных.

Таблица 3

Итоги опыта N»3.

ДНК Реципиент Число крольчат

рожденных исследованных с положительным

(№} (%) сигналом (%)

р«К31ас2 С1 14 12(№ 1-12} 9

рЯКЗ)асг С2 в 7 {N»-13-19} 5

рВК31эс2 СЗ " & 8 {На 20-27) 5

всего 30 27 (100%) 19 (70,4%)

$ « *

\шз 1Мнг 1«иг 1мг ТНлт Миг 1иг (Мфг 1М>г

К М — I С1 ,

• • •

7345678 9 10

• - о - о о -ьо

11 12 П 14 15 16 17 1в 19 20

© • • •--о о о о

21 22 23 24 25 2Б 27

"---©ООО

Рис 7. Дот-гибридшац^ | "Р}-рР1К31эс2 с хромосомной ДНК А - рааноает «рафия Б - схема расположения образцов; К • ДНК контрольного кролика; и - мэр«ер разведения плазмиды ;аКК31асг: С1. С2. СЗ - самки, осемененные трансформирован*.»««!- сперматозоидами; 1-27 - ДНК полулег**« крол&чэт.

Интеграция е ге <ом ии г ро/зуцировэниой последовательности Хромосомная ДНК из ушей 3 >э<59'-(ьпг (№2.5,14) гидролиэовааэ рестрн^таэой ЕсэЯ! а потом л£к>акализирова"3 лрк помощи Сэуэлои-блотннга и тибредизаиин с зондом [п-^Р^

рРК31ас2 (рис. в). 8 пробах обнаружена по два утяжеленных фрагмента: более 23 кЬ и около 10 КЬ, что свидетельствует о сайт-слецифической интеграции экзогенной ДНК в геном и присутствии в трансгеие только одного ЕсоРИ-сайта- Помимо этого, замечено равномерное распределение сигнала в области, заключенной между указанными рестриктами. Такая картина характерна для рассеянных по геному повторов. Полученный результат позволяет предположить, что участки, в которые произошло встраивание трансгена содержат повторяющиеся последовательности.

вм

нм 7,1 кЬ 4,4 кЬ 2,7 кЬ

Рис, 8, Дот-гибридизация [ Р]-рРК31асг с хромосомной ДНК кроликов N<12, 5.14. гидропизованной рестриктазой Есой1, М - маркеры, смесь Н»гм1Ш н Н^гиЗШ, Крп1 рестриктов плаэмиды р(ЧК31ас2; 2, 5,14-ДНК траметенных кроликов; 8М - фрагмент более 23 М>; НМ - рестрикт ~ 10 кЬ.

Возможны« причины гибели предим плантационных эмбрионов после оплодотворения яйцеклеток кролика трансформированными омртпмидами

При изучении морфологии вымытых из яйцеводов крольчих эмбрионов, полученных после осеменения трансформированными слермиями, замечен ряд нарушений развития зародышей, связанных с остановкой на разных стадиях развития (от одноклеточной до морулы включительно) и фрагментацией отдельных бластомеров После обработки зеленая окраска зафиксирована как у

М 2 5 14

морфологически нормальных эмбрионов, так и у аномальных опытных зародышей (табл. 4).

Было исследовано 284 доимллантационных эмбриона кролика, полученных в . результате осеменения самок сперматозоидами, трансформированными плазмидой рР?К31эс2, и 98 зародышей после трансформации ДНК рСМ\Лас2. В результате обработки эмбрионов хромогенным субстратом р-гал актозидазы - Х-да1 в первом случае зарегистрирован 131 (46,1%) окрашенный зародыш, а во втором -39(39.8%). При этом в случае использования плазмиды рР?КЭ!ас2, нормальный ритм дробления демонстрировали 125 (44,0%) эмбрионов, а в случае рСМУ1ас2 * 20 (20,4%). При использовании ДНК рСМу<а<£ с более сильным промотором число аномалий было

Таблица 4

Развитие и окрашивание Х-да1 доимллантационных эмбрионов кролика после искусственного осеменения трансформированными спермиями.

Параметры развития рЯОасг рСМУ1ас2

окрашенные всего окрашенные всего

Нормальный ритм развития 48 (16,9%) 125(44,0%) 2 (2.0%) ' 20 (20,4%)

Аномалии развития 83 (29,2%) 151 (53,2%) 37(37,4%) 78(79,6%)

Всего 131 (46,1%) 284(100%) 39 (39,8%) 98(100%)

больше, чем в случае применения плазмцды рРК31ас2. Доля зародышей с различными аномалиями развития в случае рСМ\Лас2 составила 79,6%, а для рЯК31эс2 • 53,2%. При работе с ДНК рПК31асЛ обнаружено: что 36.4% нормально дробящихся эмбрионов окрашиваются Х-да! (16,9% от общего числа зародышей), а среди зародышей с задержкой в развитии доля зеленых эмбрионов составляла 58,9% (27,8% от общего числа зародышей). Эти факты могут указывать на возможную связь между уровнем экспрессии привнесенного гена и нарушениями 8 раннем эмбриогенезе (-'<0,05, ^Атест).

„ Результаты опытов с 'ДНК из спермы лосося показали, что ДНК может Негативно воздействовать на жизнеспособность сперматозоидов. При инкубировании слермиее с высокими концентрациями ДНК их подвижность снижается. При осеменении крольчих сперматозоидами, трансформированными

высокой (0,5 мг/мл) концентрацией ДНК из спермы лосося, увеличивается количество иеопподотворенных яйцеклеток, возможной причиной потери спермиями оплодотворяющей способности может быть связывание дезоксирибонуклеиноеой кислоты с молекулами МНС II, участвующими в межклеточном узнавании при оплодотворении (Mori et at.. 1990: Wu et at , 1990), Следует отметить, что в экспериментах с применением низкой концентрации ДНК после искусственного осеменения трансформированными спермилми был отмечем нормальный уровень оплодотворяв мости яйцеклеток, вероятно, что при искусственной трансформации (ДМСО и тепловой шоч) ДНК, минуя молекулы МНС II. проникает внутрь клеток (Кузнецова. 1995; Кузнецов, Кузнецова, 1995а)

Следует отметить, что в результате микроинъекции ДНК в зиготы гибнет мною эмбрионов 8 наших экспериментах уровень гибели лредимп лактационных эмбрионов после оплодотворения яйцеклеток трансформированными сперматозоидами кролика был значительно ниже, чем при микроинъекции. Кроме того, из проведенных исследований следует, что в отдельных опытах эффективность получения трансгенных животных с помощью трансформированных сперматозоидов значительно выше по сравнению с методом микроинъекции. 6 двух сериях опытов с G. Вгет было попучено.6 трансгенных крольчат (1,44% от числа новорожденных особей), а в эксперименте с * использованием искусственного осеменения трансформированными сперматозоидами из 27 крольчат 19 оказались траксгэнными (70,4%). При этом не требовалось большого количества животных, дорогого оборудования, а сама процедура намног о легче и'проще микроинъекции. Искусственное осеменение трансформированными спермиями могло бы использоваться в будущем как элемент программ по массовому оо л учению трансгенных сельскохозяйственных жикотных, птиц и рыб, в т. ч. "живых биореакторов*.

ВЫВОДЫ

?. В результате экспериментов по оплодотворению in vitro обнаружено, что слермии кролика способны проникать в лишенные блестящей оболочки ооциты золотистого хомячка и вносить чужеродную ДНК в яйцеклетку. Преренесенная спермиями плаз мида pCMVtacZ' выявлена в ооцитах хомячка с помощью лолимеразной цепной реакции.

■19

2. В опытах по искусственному осеменению крольчих показано, что трансформированные сперматозоиды кролика способны переносить различные генетические конструкции (pVP7, pRK3lacZ, pCMVlacZ и pMTIacZ) e яйцеклетки,

3. Определена эффективность переноса рекомбинантных ДНК спермиями кролика, оцениваемая допей окрашенных X-gal доимплантационных эмбрионов В отдельных опытах Эффективность переноса колеблется от 0 до 97,3% (при средней величине 31.6*16,1) при использовании плазмиды pRK3lacZ и от 0 до 85.7% (со средним значением 37,7±24,3) для ллазмнды pCMVlacZ.

4. Переносимая сперматозоидами кролика экзогенная ДНК способна интегрировать в геном реципиентных животных с вероятностью до 70,4%. s отличие от 2,03% в опытах по микроинъекции.

5. При исследовании развития лредимплантационных эмбрионов после осеменения крольчих трансформированными спермиями замечен ряд нарушений развития зародышей, которые могут быть связаны с действием высоких концентраций ДНК не спермин, с экспрессией перенесенных генов н зависеть от типа промотора используемой генетической конструкции.

6. Проведенные исследования дают основания утверждать, что искусственное осеменение трансформированными сперматозоидами может быть использовано для доставки рекомбинантных ДНК в яйцеклетки и получения генетически модифицированных животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ,

1. Кузнецова И в.. Кузнецов A.B., Сигаева В.А , Щит И.Ю. Использование сперматозоидов кролика fc качестве вектора для чужеродной ДНК. // Биотехнология. 1993. Т. 11-12. С. 2-5.

2. Щит И Ю. Определение участков связывания чужеродной ДНК на сперматозоидах кролика. - Конференция молодых ученых 8ИЖа. Дубровицы. 1993.

3. Щит И.Ю,, Гусев В В., Кузнецова ИВ,, Сигаева В А, Кузнецов A.B. Мобильные реакторы на основе трансгенных животных. - Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства. 41 Материалы междунар. научно-лрактич конф. Степногорек 2-4 августа 1995 г. С. 170.

4. Кузнецов А.в.. СигаеваВА,, Кузнецова И В., Щит И Ю, Сперматозоиды кролика способны связывать чужеродную ДНК U Проблемы репродукции. 1996. Т. 1. С..7-10.

5. Щит И.Ю., Кузнецова И.В.. Денисова Т.С., Кузнецов A.B. Сперматозоид • подвижный вектор для рекомбинантиой ДНК. - Международная конференция, посвященная памяти акад. A.A. Баееа. Москва. Россия. 20-22 мая 1996 г. С. 66.

За*.* 7 155 тер. 80

Тип, ШШ ЩГЛуч" г.Подольск И.О.