Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование сперматозоидов в качестве подвижного вектора для переноса чужеродной генетической информации в яйцеклетки кролика

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Использование сперматозоидов в качестве подвижного вектора для переноса чужеродной генетической информации в яйцеклетки кролика"

РГБ ОД

- з топ 1935

ВСЕРОССИЙКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА ( БИЖ )

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВА Ирина Владимировна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СПЕРМАТОЗОИДОВ В КАЧЕСТВЕ ПОДВИЖНОГО ВЕКТОРА ДЛЯ ПЕРЕНОСА ЧУЖЕРОДНОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ В ЯЙЦЕКЛЕТКИ КРОЛИКА

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссзртации на соискание ученой лтепени кандидата биологических наук

п.Дубровицы, Ыосковск. обл. 1995 г.

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте прикладной микробиологии.

Научиыо руководители: локтор биологических наук,

Гусев В.В.,

локтор биологических наук, профессор Кононов В.П.

локтор биологических наук, профессор Клопов М.И., кандидат биологических наук Андреева Л.Е.

ВНИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных

Защита состоится "/£" Ш<7*ХЖ 1995 г. в часов на заседании Диссертационного совета Л 020.16.02 при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства по адресу: 142012, Дубровины, Подольский район. Московская обл.

1 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ жи-

«

вотноводства.

| "

ЛьюреФ^рат разослан ШОНА* 1995 г.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация -

^ Уч«нн? секретарь Ди< ¡счртаиионного совета, лостор б5ОЛ0ГИЧ"0КИХ наук

П.А.Науменко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы исследования. Генетическая моли¿икания млекопитающих путем введения рексмбинантних ЛИК имеет большс-р практическое значение, так как позволяет добиться напрагленннч изменений генотипа и фенотипа. Таким способом получены животные с измененными ростовыми характеристиками, с повышенным мунитетом к вирусным заболеваниям, животные-биореактопы и животные с дополнительными метаболическими путями. Аналогичные работы ведутся на^ птицах и рыбах (Gannon et al., 1990: Waid, Nancarrow, 1991).

Классическими методами трансгенеза являются: прямая микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы, ретровирусная инфекция предимплантационных эмбрионов, трансфекция эмбриональных стволовых клегок с последующей пересадкой их в бластоцисту (Gros-veld, Kollias, 1992; Brem, 1993). Однако эти методы трудоемки и недостаточно эффективны по выходу трансгенных животных (Wall, Seidel, 1992). Из сказанного следует, что в трачсгенезе ощущается потребность в универсальном и эффективном векторе для доставки чужеродной ДНК. Таким вектором могут служить сперматозоиды, то есть клетки, специализированные для переноса генетического материала в ооцит. Использование сперматозоидов в качестве нативного вектора для введения экзогенной ДНК в яйцеклетки характеризуется естественностью, универсальностью, технологичностью и высокой эффективностью.'С помощью трансформированных сперматозоидов были получены трансгенные мыши (La-vi t rano et. al., 1989; de la Fuente, 1991), свиньи (Gandolfi et al., 1989), куры (Fainsold et al., 1990; Gruenbaum et al.. 1991), рыбы (Muller et al.. 1992), пчелы (Milne et al.. 1989)

и морские ежи (Arezzo, 1989). Трансгены, привнесенные в зиготу, спермием, экспрессироваяись и передавались потомству (Lavltra-no et al., 1989; Fainsold el al., 1990).

Определились следующие способы включения чужеродной ДНК (чДНК) в сперматозоиды: самопроизвольное поглощение и принудительное пропитывание (импрегнация) клеток чДНК. Феномен спонтанного поглощения экзогенной ДНК в отсутствии семенной плазмы был описан для зрелых спермиев (Lavltrano et al., 1989, 1992). Показано, что сперматозоиды способны переносить "захваченную" чужеродную ЦНК в яйцеклетку. Среди рожденных животных 30% особей содержали экзогенную ДНК (Lavitrario et al., 1989). Однако данный способ, несмотря на высокую результативность, отличается низкой воспроизводимостью (Brlnster et al., 1989). В основе другого подхода (импрегнация спермиев чДНК) лежит использование различных химических и физических факторов, повышающих эффективность проникновения чужеродной ДНК в сперматозоиды. Для этого применяют диметилсульфоксид (Brackett et al., 1971; Барановой др., 1990), электропорацию (Muller et al.. 19S2; Баранов и др., 1990: Gagne et al., 1991; Nakanishl, Irltani, 1993), а также предварительно заключают чужеродную ДНК в динасами (липофекция) (Rottmann et al.. 1991; Горлова, 19ЭЗ; Naka-nlshi. Iritani, 1993). Однако в результате использования этих способов обработки сперматозоидов часто нарушаются физиологические функции спермиев: -снижается подвижность. разрушается цитоплазыатическзя мембрана, происходит преждевременная акро-сомная реакция, утрачивается оплодотворяющая способность сперматозоидов (Gagne et al., 1991; Bachiller et al.. 1991). В связи с этим возникает проблема повышения эффективности шею-

чения рекомбииантной ДНК в сперматозоиды без утраты последними биологической полноценности.

Цель работы и задачи исследования. Целью работы было изучение возможности и разработка методических приемов использования сперматозоидов кролика в качестве тдвижного вектора для переноса чужеродной генетической информации в ооциты.

В соответствии с поставленной целью решались следуюкле задачи:

- исследовать процесс взаимодействия экзогенной ДНК со сперматозоидами кролика;

. - разработать метод включения чужеродной ДНК в спермии кролика;

- оценить оплодотворяющую способность сперматозоидов после трансформации и развитие эмбрионов после оплодотворения яйцеклеток такими спермиями;

- доказать факт передачи экзогенной ДНК в ооциты кролика после искусственного осеменения трансформированными спермиями.

Научная новизна. Новизна работы заключается в том, что впервые выяснены условия связывания чДНК со сперматозоидами кролика и факторы, влияющие на этот процесс. Обнаружены две фазы взаимодействия чДНК со спермиями кролика: быстрая и медленная, рассчитана емкость сперматозоидов для чДНК, выявлено ингибирующее действие семенной, жидкости на связывание ДНК со спермиями, отмечена деградация чДНК в семенной плазме кролика.

С помощью рекомбииантной конструкции рГЖ31ас?, (Жаданов, 1991) доказана возможность использования спермиев кролика для передачи чДНК в.ооциты в процессе оплодотворения. Об эффективности переноса судили по транзиентной экспрессии гена КЗУ1ас1

в предимплантадионных эмбрионах кролика.

Практическая значимость. Представлены данные, описывающие пропес-с взаимодействия чужеродной ДНК со спермиями кролика, которые послужили теоретическим фундаментом для разработки метода трансформации сперматозоидов. Разработана методика инкорпорирования чДНК в сперматозоиды кролика с помощью диметил-сульфоксида при подобранном температурном режиме, а также процедура искусственного осеменения трансформированными спермин-ми. как этап метода получения трансгенных животных. Методология иссдедоьания, предложенная в диссертационной работе, может Сыть применена к другим видам млекопитающих, в том числе к сельскохозяйственным животным.

Использование мужских гамет в качестве естественного вектора дл>- переноса ъкъогенной ДНК, наряду с методом микроинъекции, может найти применение при создании тр&чегенных животных, £1 также при изучении регуляции экспрессии генов в раннем эмбриогенезе.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на II конференции по проблемам цитокинов (Оболенск, 1992); на научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых ВЛЖа (Дубровины, 1994); на межлабораторном семинаре ВНИИ СХБ (Москва, 1901).

Публикации. По материала.! диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и обгем работы. Диссертация состоит из введения. обзера литературы, описании материалов и методов исследования , изложения' результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 155 источников. Работа из-

- б -

ложена на 115 стр. машинописного текста, включает 20 рисунков и 9 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И ЙЕТОДЫ.

Рекомбинантная плазмида pRK31acZ была любезно предоставлена А.Б.йадановым (1991).

Клонирование ДНК pRK31acZ осуществляли в бактериях E.coli НВ101. Трансформацию проводили с применением СаС1г (Mandel, Higa, 1970). Трансформантов отбирали на среде, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Выделение плазмидной ДНК из штамма E.coli HB101/pRK31acZ осуществляли методом щелочного лизиса (Birnboim и Doli, 1979) с последующей очисткой в градиенте CsCl.

Линейную ДНК получали путем рестрикции плазмиды pRK31acZ эндонуклеазами HindiII и Kpnl, используя рестрикционные буферы фирмы Fermentas (Вильнюс). Качество рестрикции проверяли при помощи электрофореза ДНК в агарозном геле (Маниатис и др., 1984).

ДНК pRK31acZ (7,1 т.п.н.) метили [«-32Р]дЦТФ (ИЯФ. г. Обнинск) при помощи реакции ник-трансляции, используя набор НПО "Биопол" (Москва), придерживаясь инструкции производителя. Измерение радиоактивности проводили в сцинтилляционном счетчике "Minibeta" (LKB).

В экспериментах использовались половозрелые кролики породы шиншилла из вивария при ГосНИИ прикладной микробиологии.

Кроличью сперму получали от половозрелых самцов.кролика с помощью искусственной вагины. Кроликов содержали в следующем половом режиме: одна эякуляция не чаще, чем в три дня и не ре-

же, чем в неделю. В каждом эксперименте использовали эякулят от 2-3 самцов. Подвижность спермиев определяли под микроскопом, подсчитывая долю клеток, двигающихся поступательно. Активные сперматозоиды отделяли от неподвижных флотацией в 10-кратном объеме раствора Зрла. Суспензию подвижных клеток дважды центрифугировали при 200 g на центрифуге ОС-6 (Россия), в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали и разводили до конечной концентрации Ю7 кл/мл.

Семенную плазму кроликов получали путем последовательных центрифугирований свежей спермы. Клетки осаждали при 800 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость подвергали дальнейшему центрифугирован»» ъ течение 15 мин при 10000 g. Использовали конечный супернатант.

Триюформация спермиев проводилась двумя способами: без применения и с применением химических и физических воздейс-тгнй.

Есякгавенная трансформация. ДНК в количестве 10 мет в 50 мел буфера ТЕ (рН -8,0) добавляли к 5-Ю6 сперматозоидов кролика в 500 Mia растгора Эрла. Для равномерного перемешивания ДНК и спермиев суспензию интенсивно встряхивали в смесителе Vortex UU:oM, Россия). Инкубацию проводили в течение 30 мин при комнатной температуре. Суспензию клеток после разведения раствором I)рли использовали для искусственного осеменения крольчих (1-2•10s сперматозоидов в 500 мкл на одну самку).

Искусопаишат тр:шсфо(жщия. К S00 мкл суспензии сперматозоидов кролика (10' кл/мл) добавляли раствор ДМСО до IX. ДНК (10 игл" в 50 мкл ТЕ) вводили в суспензию и перемешивали в смесителе. Клетки инкубировали при комнатной температуре.- Через

10 мин доводили концентрацию ДМСО до 3%. Затем пробирки со спермиями охлаждали в течение 20 мин до 4°С. После этого проводили тепловой шок (42°С, 2 мин).

За 72 часа до осеменения самкам в стадии проэструса внутримышечно вводили по 150 МБ фолликулостиму.-ирующего гормона (Россия). Сразу после-искусственного осеменения - внутривенно по 100 МЕ хорионического гонадотропина (Россия). Через 46 часов после осеменения из яйцеводов раствором Хенкса вымывали эмбрионы.

Зародышей фиксировали 2,57. глутаровым альдегидом, отмывали фосфатным буфером, содержащим 0,2 М NaCl, 3 мМ KCl, 4 мМ Na2HP04-12H20, 2 мМ кн2ро4 (рН=7,4-7,б) и инкубировали 30 мин в растворе следующего состава: 4 мМ KatFetCNJel. 4 мМ K4[Fe(Cfl)6l/6Н20, 2 мМ MgCl2, 0,2% Тритона Х-100, 150 мкг/мл хлороквина в фосфатном буфере (рН=7,4-7,6). После этого добавляли X-gal до конечной концентрации 0,4 мкг/мл и проводили окрашивание в течение 8-48 ч при 30°С (Thörey et al., 1993). Эмбрионов отмывали фосфатным буфером и хранили при 4°С в 30% растворе сахарозы с добавлением мертиолята натрия.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Связывание чдНК кроличьими сперматозоидами.

Первоначально исследовали кинетику связывания чДНК кроличьими спермиями. Для этого эякулированные и тщательно отмытые от семенной плазмы сперматозоиды кролика смешивали с ник-транслированной плазмидной ДНК. На рис.1 представлены типичные кривые поглощения." Процесс не зависит от температуры. ДНК быстро ассоциирует со спермиями в течение первых 5-15 мин,

30 б о 90

вовмя, мин

Рис.1. Зависимость связывания ник-транслированной ДНК рШ1асг с кроличьими сперматозоидами от времени совместного инкубирования. 1 - при 0°С, 2 - при 3?°С, 3 - после обработки глутаровым альдегидом.

а затем наступает стадия насыщения. С клетками связывается 60707. добеленной в среду инкубирования радиоактивной ДНК. Сперматозоиды, обработанные глутаровым альдегидом, теряют способность поглощать ДНК. Взаимодействие сперматозоидов с экзогенной ДНК обратимо. После 30 мин. инкубирования спермиев с радиоактивной ДНК и V последовательных отмывок из клеток выминается 90% раДИОаКТИВНОСТИ.

Расчет емкости сперматозоидов кролика проводили, исходя из опытов по связыванию радиоактивной ДНК рКК31ас2. При добавлении 5-10"° г ДНК к 5-106 сперматозоидов, на 1 клетку теоретически приходите;! Ю-12 г ДИК. Реально со спермиями ассоциировало 602 ДНК (рис.1), на них связывалось прочно - 102. Сле-

довательно, 1 спермий содержит

10"12-5-10"1-10"1=6-10~14 г чДНК, что составляет

б-Ю-14 (г)

- = 7,8-Ю3 молекуц р!?К31ас2,

7,1-6,5-105-1,бб-10*24 (г) где 7,1 (т.л.н.) - длина плаэмиды р!Ж31ас2, 1 т.п.п. ДНК соответствует б,5-Ю5 дальтон, а 1 дальтон равен 1,66-Ю"24 г.

2. Згитсра, влияняцяэ на саязызшвгэ чДНХ со спэршями.

После того как было показано, что экзогенная ДНК взаимодействует с.кроличьими сперматозоидами, возник вопрос, существуют ли факторы, влияющие на этот процесс. Ответ на него дали эксперименты по изучению действия ДНК-конкурента, заряженных полимеров и тепловой обработки на процесс связывания.

Спермии инкубировали в течение 30 мин с ник-транслированной плазмидой в присутствии различных концентраций ДНК-носителя из спермы лосося. Эксперименты проводили при 4° и 37°С. При взаимодействии со сперматозоидами радиоактивная ДНК вступала в кооперативные или конкурентные отношения с ДНК-носителем. На рис.2 показано, что ДНК-носитель в концентрации менее 1 мкг/мл способствовала ассоциации радиоактивной ДНК, при концентрациях больше этой величины она выступала в роли конкурента и препятствовала связыванию, причём этот процесс протекал независимо от температуры.

Аналогичные эксперименты проводились в.присутствии различных концентраций лоливинилпирролидона, поли-Б-лизина и гепарина. Ингибитором поглощения экзогенной ДНК являлся полианион гепарин в концентрации, превышающей 1 ед/мл. Поликатион по-

.-4-2 0 2 Ц

Ц КОШ 19ШАЦИИ ВИК-КОиКУРеиТА , МКГ/МЛ

Рис.2. Ассоциация радиоактивной ДНК со спермиями кролика в присутствии различных концентраций конкурентной ДНК из спермы лосося. 1 - при 4°С, 2 - при 37°С.

ли-Б-лизин в концентрации, Слизкой к 10 мг/мл, наоборот, способствовал связыванию чДНК. Поливинилпирролидон не оказывал заметного влияния на ассоциацию радиоактивной ДНК со сперматозоидами (рис.3).

Прогревание спермиев 5 мин при 60°С снижало их способность связывать чДНК примерно в 2 раза, однако, не исключало

I

эту ъозмсшюсть вообще.

Для изучения ингибирующего действия семенной плазмы на связыв&чие радиоактивной ДНК, к суспензии отмытых сперматозоидов кролика добавляли семенную жидкость в отношении 1:1 (.об/об). Инкубирование проводили при комнатной температуре в

§ кшцеитоАции ., конкурирующих полимероь

Рис.3. Ассоциация радиоактивной ДНК со спермиями кролика в присутствии различных концентраций полимеров с положительным, нейтральным и отрицательным зарядом. 1 - поли- 0- лизин, мкг/мл; 2 - поливинилпирролидон, мкг/мл; 3 -гепарин, ед/мл.

течение 30 мин. В контрольных экспериментах использовали гепарин (1000 ед/мл) и БСА (10 мг/мл). В таблице 1 показано, что добавление семенной плазмы кролика или человека уменьшало 1со-личество связанной с клетками чДНК до 16%.

Опыты по генетической трансформации теряют смысл, если в среде инкубирования присутствуют агенты, разрушающие ДНК. Поэтому были исследованы семенная плазма кролика и среда, в которой проводят обработку спермиев экзогенной ДНК: ДНК фага А в количестве 10 мкг инкубировали при 37°С в 30 мкл семенной

- \г -

Таблица 1. Ингибирующее действие семенной плазмы на связывание 32Р-ДНК со спермиями кролика.

действующий количество связанной ДНК

фактор имп/мин X

контроль

(отмытые сперматозоиды) 39446 60,7®

семенная плазма кролика 10944 16,8б

семенная плазма человека 10077 15,56

бычий сывороточный альбумин 62786 96,6

гепарин 486 0,7

Примечание: а*6 статистически достоверное отличие (Р<Р,01. х2-тест)

плазмы или при комнатной температуре в 30 мкл среды для опытов по трансформации. Через 0 , 5, 15 , 30 , 60 и 120 мик реакцию останавливали. ДНК экстрагировали смесью фенол/хлороформ и проводили электрофорез в \Х агарозном геле. Показано, что в семенной плазме кролика ДНК фага X полностью расщеплялась при 37°С за £ часа. В трансформгщионной смеси зафиксирован приемлемый уровень деградации чДНК (рис.4).

3. Разработка методики включения чДИК в сперыгхозоады с целью переноса ее в ооциты.

Под трансформацией сперматозоидов мы понимаем процесс захвата чужеродной ДНК спермиями, перенос ее в яйцеклетку и

12 3* 5 6 7 8 910 Н 12. В Ш

•1 ш т,

■

■ 1 ■

Рис.4. Электрофорез продуктов гидролиза ДНК фага X: рожка 1 - ДНК фага "

ной жидкости; 14 инкубации, мин: О

'Идрс

среде трансформации; 8-13 - гидролиз ДНК фага X в семен-Н1псЛ 11-рестрикты ДНК фага X. Время " и 8), 5 (3 и 9). 15 (4 и

до-

а Х;^дорожки 2-7 - гидролиз ДНК фага X в

- ...... - „,орожки 2 и 8), 5 (3 и 9).

10). 30 (5 и И), 60 (6 и 12) И 120 (7 и 13).

экспрессию в предимплантационных эмбрионах. Эффективность трансформации в случае применения репортерного гена 1асг оценивалась по количеству предимплантационных эмбрионов, экспрес-сирующих бактериальную б-гадактозидазу, При использовании естественной трансформации выход таких зародышей был 19%. Воспроизводимость данного метода чрезвычайно низка. Поэтому для увеличения эффективности трансформации применяли диметилсуль-фоксид (ДМСО) и тепловой шок.

Отмечено допустимое снижение подвижности сперматозоидов в присутствии 37. ДМСО (рис.5). Активность клеток постепенно снижалась в процессе трансформации, однако, после теплового шока подвижность спермиев возрастала почти до первоначального зна-

Время, мин

Рис.5. Зависимость подвижности сперматозоидов кролика от времени инкубации: 1 - в растворе Эрла; 2 - в растворе Эрла, содержащем 3% ДМСО.

чения.

Показано, что в присутствии 3% ДМСО кривая связывания радиоактивной ДНК со сперматозоидами имеет вид сигмоиды и выходит на плато через 15 мин после смешивания компонентов. Су-

I

шествующая в самом начале процесса временная «задержка (рис.6) позволяет тщательно перемешать сперматозоиды с чДНК для более равномерного распределения молекул ДНК между клетками.

Влияние ДМСО на проницаемость сперматозоидов кролика для чДНК в присутствии семенной плазмы, изучалось по следующей сУ.еме. В качестве положительного контроля использовали спермин.. отмытые от семенной жидкости. За 100Х принимали радиоак-

г\ ........... 7

/ О - -/ -

9.-2 -

. — -

Л-1...... 1.1 1 1 1

30

60

время , мин

90

о

• 5

ЗП 3

сс гО о

10 ^

Рис.6. Кинетика связывания ник-транслированной ДНК р1?К31ас2 с кроличьими сперматозоидами: 1 - в присутствии 37. ДМСО; 2 - после фиксации глутаровым альдегидом.

тивность положительного контроля в отсутствии ДМСО. Результаты представлены в таблице 2. Добавление 2Х ДМСО увеличивает включение чДНК в спермии с 28 до 81%.

Совместное действие ДМСО и теплового шока на проницаемость сперматозоидов изучалось по аналогичной схеме. Результаты представлены в таблице 3. Присутствие ДМСО и действие теплового шока увеличивали проникновение чДНК в сперматозоиды кролика до 123% по сравнению с контролем. Отсутствие одного из компонентов (ДМСО или теплового шока) значительно снижало эту величину.

Перечисленные выше эксперименты показывают, что ДМСО и

Таблица 2. Влияние ДМСО на проницаемость сперматозоидов кролика для 32Р-ДНК в присутствии семенной плазмы.

без ДМСО с ДМСО

имп/мин (%) имп/мин {%)

без семенной плазмы 39446 (100) 39716 (101)

с семенной плазмой 10944 (28 )а 32063 (81)6

. а. 6

Примечание: (Р<0,01, х2-тест)

статистически достоверное отличие

Таблица 3. Совместное действие ДМСО и теплового шока на проницаемость сперматозоидов кролика для 32Р-ДНК.

без ДМСО имп/мин (%)

с ДМСО имп/мин (X)

без нагревания с нагреванием

551±43 (100)а 219±18 (40)

б?8±29 (123)

Примечание: а-6 статистически достоверное отличие (Р<6,01, и^-тест; Р<0,05, х2-тест)

I

тепловой подвижное чЛНК. Лан:

лок не оказывают значительного негативного аффекта на ть сперматозоидов и увеличивают их проницаемость для иое обстоятельство позволяло использовать эти факторы

в методике искусственной трансформации сперматозоидов.

4. Перенос ДНК pRK31acZ в ооцитм кроликов с помощь» сперматозоидов.

Перенос чДНК в ооциты с помощью сперматозоидов невозможен, если спермии потеряют в результате обработки чДНК оплодотворяющую способность, в связи с чем были проведены следующие эксперименты. В первой серии опытов сперматозоиды, обработанные чДНК, инъецировали в верхушку, середину или основание рога матки. Во всех случаях происходило оплодотворение яйцеклеток и начиналось дробление. Во второй серии после введения спермиев во влагалище при помощи катетера были получены пре-димплантационные эмбрионы и крольчата, которые росли и нормально развивались.

О ^акте переноса чужеродной ДНК сперматозоидом в яйцеклетку кролика во время оплодотворения судили по экспрессии ре-портерного гена RSVlacZ в 34-часовых эмбрионах. С помощью хро-могенного субстрата Х-gal было проанализировано 117 опытных и 94 контрольных зародыша на наличие бактериальной 3-галактози-дазн. В опыте от 19 до 622 эмбрионов в реакции с Х-gal демонстрировали сине-зеленую окраску различной интенсивности и текстуры срис.7), что говорит о присутствии в них 0-галактозидазы. У большинства зародышей, давших положительный сигнал, отмечена диффузная окраска блостомеров или их отдельных частей. В некоторых случаях краситель располагался кластерами размером до 10 мкм. Зеленое окрашивайте зафиксировано как у интактных, так и у начинающих дегенерировать зародышей, находящихся на разных стадиях развития, что согласуется с результатами работы Delo-tjis с соавт. 11992). В контроле 97% эмбрионов имели желтый

е

т.н

?

▼ - -4»—

Рис.7. Предимплантационные эмбрионы кролика, экспрессиру-ющие бактериальную о-галактозидазу после оплодотворения ооцитов трансформированными спермиями.

цвет, что свидетельствует об отсутствии в них в-галактозидаз-ной активности.

Результаты испытания двух: методик трансформации сперматозоидов представлены в таблице 4. В контролях в основном присутствовали неокрашенные зародыши. При естественной трансформации в опыте обнаружено 19,3% эмбрионов, зкслрессирующих 8-г^лактозидазу. При искусственной - это число составило 61,7^, что свидетельствует об увеличении эффективности процедуры в случае применения ДМСО и теплового шока.. ^ Оценка искусственной трансформации. Выражение гена (?БУ1ас2 зафиксировано у зародышей, находящихся на разных стадиях развития - от 2.до 16 бластомеров. Из 38 контрольных эмбрионов 8 находились на 8-клеточной стадии, а 30 - имели по 16

Таблица 4. Оценка эффективности переноса ДНК рИ<31ас:г в ооциты кролика с помощью спермиев по экспрессии 0-галак-тоэидазы в ранних эмбрионах.

3 окрашенные м б р И 0 н ы неокрашенные всего

Естественная 0 11(19,3)а 46(80,7)' 57

трансформация К 0(0,0)' 56(100) 56

сперматозоидов

Искусственная 0 37(61,7)6 23(38,3) 60

трансформация К 2(5,3) 36(94,7) 38

сперматозоидов

Примечание: О - опыт, К - контроль, в скобках - процент от общего числа эмбрионов, а" 6 статистически достоверное отличие (Р<0,01, хй-тест)

бластсмтров. Большинство эмбрионов (957.) были желтого цвета. В противоположность этому, из 60 опытных эмбрионов 16 (26,7%) имели бледно-зеленый цвет, 16 (26,7%) отличались умеренной сине-зеленой окраской и 5 (8,37.) были окрашены интенсивно. В опыте эмбрионы незначительно отставали в развитии по сравнению с контролем. На 8-клеточной стадии находились 32 зародыша (53.3%), на 16-ь5лёточной - 22 (36,7%), по одному эмбриону обнаружено на стадиях 2-х и 4-х бластомеров' (по 1,7%)..и 4 зародыша (6,7%) оказались фрагмеитированы. Доля развившихся эмбри-

онов была высока (97%), и в большинстве случаев (90%) они имели интактную морфологию. Это позволяет утверждать, что применение ДМСО и теплового шока существенно не влияет на оплодотворяющую способность спермиев и раннее эмбриональное развитие.

Результаты работы свидетельствуют, что сперматозоиды кролика могут служить естественным вектором для доставки чужеродной ДНК в яйцеклетки. Разработанный нами способ обработки спермиев кролика с целью использования их как подвижных векторов для передачи экзогенной ДНК в ооциты путем искусственного осеменения может быть применен для получения трансгенных животных. Данная процедура отличается от ранее предлагаемых методов большей эффективностью и воспроизводимостью. Предполагается, что этот метод найдет применение в лренатальной геноте-рапии, а также в тератологии и при изучении регуляции экспрессии генов на ранних стадиях эмбриогенеза.

ВЫВОДЫ.

1. Эякулированные сперматозоиды кролика, отмытые от семенной плазмы, спонтанно связывают чужеродную ДНК.. Емкость спермиев составляет 6-10~14 г чДНК на 1'клетку. Связывание чДНК со спермиями подавляют глутаровый альдегид, плазма семени И: полианионы, такие как ДНК-конкурент и гепарин, напротив, по-Л1катион поли-0-лизин способствует процессу связывания.

2. Сперматозоиды кролика способны в процессе оплодотворения переносить экзогенную ДНК в ооциты без потери ее биологи-ч;ской активности. Об этом свидетельствует экспрессия привнесенной спермием ДНК рИ<31ас:г и накопление о-галактозидазы в пр'^импламтачиэччях эмбрионах кро.ожз.

3. Воздействие диметилсудьфоксндом и тепловым шоком на сперматозоиды кролика способствует включению в них экзогенной •ДНК и увеличивает эффективность ее переноса в яйцеклетки.

4. Сперматозоиды кролика после их обработки рекомбинант-ной ДНК не теряют свои биологические функции. В.результате искусственного осеменения крольчих трансформированными спермиями происходит оплодотворение яйцеклеток, развиваются эмбрионы и ровдается потомство. Характеристики этих процессов бливки к физиологической норме.

5. Разработка метод использования сперматозоидов кролика в качестве подвижных векторов для переноса чужеродной генетической информации в ооциты.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Кузнецова И. В., Кузнецов A.B., СигаевзВ.А., Щит И.Ю. Использование сперматозоидов кролика в качестве вектора для чужеродной ДНК. // Биотехнология. 1993. Т. 11-12. С. 2-5.

Кузнецова И.В. Сравнение двух методик трансформации сперматозоидов кролика по эффективности транзиентной экспрессии репортерного гена RSVlacZ в ранних эмбрионах. - Конференция молодых ученых ВИЖа. Дубровицы. 1994. (в печати).

Кузнецов A.B., Кузнецова И.В. Попытки получения трансгенных животных с помощью подвижных векторов. - В кн.: Генноинже-нерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов. Выпуск 1. М., 1995. С. 173-180.

Кузнецов A.B., Кузнецова И.В. Связывание экзогенной ДНК pRK31acZ сперматозоидами кролика, ее перенос в ооциты и экспрессия в доимплантационных эмбрионах. // Онтогенез. 1995. Т. 26(3). С. 35-43.

печать офсетная. Тираж 75 зкз. ' 0,65 п.л. зак. У129: • - ' Типография НИИ НПО"Луч"