Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СПЕРМАТОЗОИДОВ В КАЧЕСТВЕ ПОДВИЖНОГО ВЕКТОРА ДЛЯ ПЕРЕНОСА ЧУЖЕРОДНОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ В ЯЙЦЕКЛЕТКИ КРОЛИКА

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СПЕРМАТОЗОИДОВ В КАЧЕСТВЕ ПОДВИЖНОГО ВЕКТОРА ДЛЯ ПЕРЕНОСА ЧУЖЕРОДНОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ В ЯЙЦЕКЛЕТКИ КРОЛИКА"

А-УШ

ВСЕРОССИИКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСНИЙ ИНСТИТУТ ШЕОТНОБОДЛ'ПА I Ш )

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВА Ирина Владимировна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СПЕРМАТОЗОИДОВ В КАЧЕСТВЕ ПОДЕИДНОГ'О ВЕКТОРА ДЛЯ ПЕРЕНОСА ЧУЖЕРОДНОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОР-ЦАЦИИ В ЯЙЦЕКЛЕТКИ КОЛИКА

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой «тепени кандидата виолагичеених наук

п.Дь'брэвицы, Носковск. об д. 1996 г.

PnOora пнполкена в Государственном научно-исследовательском институте прикладной микробиологии.

Iläv'ttüj'1 руководители: доктор биологических наук,

Гусев Р.В.,

локтор биологических наук, профессор Кононов В.П.

■ Социальные оппонент: лектор биологических. тук,

профессор Клопов W.U.. кандидат биологических наук Андреева Л.Е. *

Ведуиичя организация - ШШИ физиологии, биохимии и питания

сельскохозяйственны* ЖИВОТНЫХ

Защита состоится "ff* ЩОЦлЯ* 1у9,г1 г. в

часов

im заседании Диссертационного тосета Л 020.16.02 при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства по адресу: 14W12, Дубровины, Подольский район, Московская обл.

' С диссертацией можно ознакомиться s библиотеке ВНИИ «и! 4 wr новойст ва.

Ar-Tcp«i-p-ar разослал "

&

нн/ секрйтал. . • ■

до$тор б юл о гибких наук П, А.)1ауменко

у

ОВДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы исследования. Генетическая молиликпш; в млекопитающих путем введения рекомбинантных ДНК шеет больи^ практическое значение, таг, как позволяет лейнться напраглэкких изменений генотипа и фенотипа. Таким способом получены линотные с измененными ростовыми характеристиками, с повышенным мунитетом к вирусным заболеваниям, животные-GHoperiKiorw и «ir вотные с дополнительными метаболическими путями. Аналогичные работы ведутся на.птицах и рыбах (Gannon et al., 1990: Waif], Nanearrow. 1991).

Классическими методами трансгенеэа являются: прямая микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы, ретровирусная инфекция предимплактационных эмбрионов, трансфекция эмбриональных стволовых клегок с последующей пересадкой их в бластошюту (Gros-veld, Kollías, 1992; Brem, 1993). Однако эти методы трудоемки и недостаточно эффективны по выходу трансгенных животных tWall, Seidel, 1992). Из сказанного следует, что в трансгенезе ощущается потребность в универсальном и эффективном векторе для доставки чужеродной ДНК. Таким вектором могут служить сперматозоиды, то есть клетки, специализированные для переноса генетического материала в ооцит. Использование сперматозоидов в качестве дативного вектора для введения экзогенной ДНК в яйцеклетки характеризуется естественность», универсальностью, технологичностью и высокой эффективностью. С помощью трансформированных сперматозоидов были получены трансгенные мыши (La-vi t rano et^al., 1989; de la Fuente, 1991), свиньи (Gandolfí et al., 1989), куры (Fainsold et al., 1990; Grueribaum et al.. 1991), рыбы (Müllerei al., 199g), пчелн (Milne et al., 1989)

ЦЕНТРАЛЬНАЯ

HW4S,vm b?üj>JHüTCKA Mb»*.

и морские ежи (Агегго. 1989). Трансгены, привнесенные в зиготу спермием, экспрессировались и передавались потомству (Lavitra-ао et al., 1969; Fainsold el al.. 1990).

Определились следующие способы включения чужеродной ДНК (ЧДШ) в сперматозоиды: самопроизвольное поглощение и принудительное пропитывание (импрегнация) клеток чДНК. Феномен спонтанного поглощения экзогенной ЛНК в отсутствии семенной плазмы был описан для зрелых спермиев (Lavltrano et al., 1989, 1992). Показано, что сперматозоиды способны переносить "захваченную" чужеродную ЦНК в яйцеклетку. Среди рожденных животных ЭОХ особей содержали экзогенную ДНК (LavitrariO et al., 1969). Однако данный способ, несмотря на высокую результативность, отличается низкой воспроизводимость» (Brlnster et al., 1969). В основа другого подхода (импрегнация спермиев чДНК) лежит использование различных химических и физических факторов, повышающих эффективность проникновения чужередкой ЛИК в сперматозоиды. Для этого применяют диметидсульфоксид (Brackett et al., 1971; Баранов"» др., 1990). злектропорацию (Muller et ai., 19S2; Баранов и др.. 1990; Gagne et al-, 1991; Nakanlshl, lrltanl, 1993), а такие предварительно заключают чужеродную ДНК ь лило • сомы (липофекщш) (Rottmann et al.. 1991; Горлова, 1993; Naka-nlshl, irJtanl, 1993). однако в результате использования этих способов обработки сперматозоидов часто нарушаются фиаиологи-^ ческие функции спермиев: ^-снижается подвижность, разрувается цитоплазматнческэя мембрана, происходит преждевременная акро-сомная реакция, утрачивается оплодотворяющая способность спер-матозомж»в (eagrte et al., l©9l; Bachiller et al., 1991). В связи с этим возникает проблема ло&швекш'^эффективности вклю-

- з -

чения рекомбинантной ДНК в сперматозоиды беа утраты последними биологической полноценности.

Цель работы и задачи исследования. Целью работы было изучение возможности и разработка методических приемов использования сперматозоидов кролика в качестве пдвижного вектора для переноса чужеродной генетической информации в ооииты.

В соответствии с поставленной целью решались следуюсле задачи:

- исследовать процесс взаимодействия экзогенной ДНК со сперматозоидами кролика;

.- разработать метод включения чужеродной ДНК в спермин кролика;

- оценить оплодотворяющую способность сперматозоидов после трансформации и развитие эмбрионов после оплодотворения яйцеклеток такими спермиями;

- доказать факт передачи экзогенной ДНК в ооцитьг кролика после искусственного осеменения трансформированными спермиями.

. Научная новизна. Новизна работы заключается в том, что впервые выяснены условия связывания чДНК со сперматозоидами кролика и факторы, влияющие на этот процесс. Обнаружены две фазы взаимодействия чЛНК со спермиями кролика: быстрая и мед-денная, рассчитана емкость сперматозоидов для чДНК, выявлено ингибирушее действие семенной, жидкости на связывание ДНК со спермиями, отмечена деградация чДНК в семенной цлазме кролика.

С помопью рекомбинантной конструкции рИ<31ас2 (Жаданов, 1991) доказана возможность использования спермиев кролика для передачи чДНК в ооциты в процессе оплодотворения. Об эффективности переноса судили по транзиеитной экспрессии гена (г5У1ас1

- * -

в предишлакташонных эмбрионах кролика.

Практическая значимость. Представлены данные, описывающие процесс взаимодействия чужеродной ДНК со сперииями кролика, которые.* послудили теоретическим фундаментом длй разработки метода трансформации сперматозоидов. разработана методика инкорпорирования чД1!К в сперматозоиды кролика с помощью диметил-еульфоксида пси подобранном температурном режиме, а также процедура искусственного осеменения трансформированными спермия-. ми, lint; а тал метода получения трансгенных животных. Методология иссяедоъашя, предложенная в диссертационной работе, может Cutí, применена к другим ъидам млекопитаощнх, Б том числе к срльссохозяйстиеинш динотным.

Ik'ncJibiíQKtHií»; мужских гшет в качестве естественного вектора длс переноса экзогенной ДЯК, наряду с методом никроинъек--шт. может найти применение при создании трансгенных животных, а также при ибуч*-нин регуляции экспрессии генов в раннем эмб-

РИОГ* ЛеЗе".

Дпрр^ацпд работ» ■ Результата исследований были представ-.йены ил J J конференции по проблемам цитокинов (Смоленск, Ш)2); на шучно-методической конференции аспирантов и молодых учених В!Ша (Дуоровиш), 1994); на межлабораторном семинаре ЕШИУ СХБ aiccKí.-i, 1991) -

Публикации, По датьриадам диссертации опубликовано 4 работы.

Структура ;i c¿>.en работы. Диссертация состоит на введе-лш. оОьсра литературы, описашы материалов и методов исследования, изложения результатов с их обсуздения, выводов и списка цитируемой литератур«, включг^щего 155 источников. Работа из-

дожена на 115 стр. машинописного текста, включает 20 рисунков и 9 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И 1ЕЛЩЫ.

Рекомбинантная плаамида pRK31acZ была любеано предоставлена A.B.Жадановым (1991).

Клонирование ДНК pRK31acZ осуществляли в бактериях Е.соИ НВ101. Трансформаций проводили с применением OaClg (Mandel. Higa, 1970). Трансформаитов отбирали на среде, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Выделение плаэмидной ДНК из штамма Е.соЦ HB101/pRK31acZ осуществляли методом щелочного лизиса (Birnboim и Doll, 1979) с последующей очисткой в градиенте CsCl.

Ликейную ДНК получали пут»! рестрикции плаамиды pí?K31ac2 эндонуклеазами Hindi И и Kpnl» используя рестрикшюнные буферы фирмы Fermentas (Вильнюс). Качество рестрикции проверяли при потаи электрофореза ДНК в агароэном геле (Маниатис и др., 1964).

.ДНК pRK3IacZ (7,1 T.n.Hj метили С«-Э2Р)дЦТФ (И®, г, Обнинск) при помощи реакции ник-трансляции, используя набор НПО "Биопол" (Москва), придерживаясь инструкции производителя. Измерение радиоактивности проводили в сцинтилляционном счетчике "Minibeta" (УФ).

В экспериментах использовались половозрелые кролики породы шиншилла из вивария при ГосНИИ прикладной микробиологии.

Кроличью сперму получали от половозрелых самцов.кролика с помощью искусственной вагины. Кроликов содержали в следующем половом режиме: одна эякуляция не чаще, чем в три дня в нб ре-

- б -

же, чем в неделю. 6 каждом эксперименте использовали эякулят от 2-3 самцов. Подвижность спермиев определяли под микроскопом. подсчитывая долю клеток, двигающихся поступательно. Активные сперматозоиды отделяли от неподвижных флотацией в 10-кратном объеме раствора Эрла. Суспензию подвижных клеток дважды центрифугировали при 200 g на центрифуге ОС-б (Россия) в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали и равводили до конечной концентрации Ю7 кл/мл.

Семенную плазму кроликов получали путем последовательных центрифугирований свежей спермы. Клетки осаждали при вОО g в течение ю -мин. Налосадочную жидкость подвергали дальнейшему центрифугировал ню в течение 15 мин при 10000 g, Использовали конечный супернатант.

Тр:лсфсрмация спермиев проводилась двумя способами: без применения и с применением химических и физических воэдейс-

тгий.

Еакстенпая трансформация. ЛНК в количестве Ю мкг в 50 мля буфера ТЕ tpH'8.0) добавляли к 5-Ю6 сперматозоидов кролика о 500 мг-п растюра Эрла, Для [>аьномерного перемешивания ДНК и спермиев суспензию интенсивно встряхивали в смесителе Vortex Россия1. Инкубшшю проводили в течение 30 мин при комнатной температуре. Оуспенэи» клеток после разведения раствором использовали для искусственного осеменения крольчих (1-2-10s сперматозоидов в &GG мкл на одну самку).

Цскусотж-пния трмсфо^ация. К 500 мкл суспензии сперматозоидов кролика (Ю7 кл/мл) доОз&ляли раствор ДМСО до IX. ДНК (10 мкг а 50 мкл ТЕ) вводили в суспензию и перемешивали в смесителе, Клетки инкубировали при комнатной температуре.- Через

10 мин доводили концентрацию ДМСО до 32. Затем пробирки со слермиями охлаждали в течение 20 мин до 4°С. После этого проводили тепловой шок (42°С, 2 мин).

За 72 часа до осеменения самкам в стадии проэструса внутримышечно вводили по 160 ME фол л ику л ос т иму ."ируквд го гормона (Россия). Сразу после■искусственного осеменения - внутривенно по 100 ME хорионического гонадотропина (Россия). Через 46 часов после осеменения из яйцеводов раствором Хенкса вымывали эмбрионы.

Зародышей фиксировали 2,5Х глутаровым альдегиде«, отмывали фосфатным буфером, содержащим 0,2 М NaCl. 3 Ш КС1, 4 мМ Na2HP04-12H20, 2 мМ КН2РО4 (рН-7,4-7,6) и инкубировали ЭО мин в растворе следующего состава: 4 KaTFefCWe), 4 мМ МГе(С?1)б];6Н20, 2 мМ MgCl2. 0.2Z Тритона Х-100, 150 мкг/мл хлороквина в фосфатном буфере (рН-7,4-7,6). После этого добавляли X-(tal до конечной концентрации 0,4 мкг/мл и проводили окрашивание в течение 8-48 ч при 30°С (Thorey et al., 1993). Эмбрионов отмывали фосфатным буфером и хранили при 4°С в 30% растворе сахарозы с добавлением мертиолята натрия.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Связывание чДНК кроличьими сперматозоидами.

Первоначально исследовали кинетику связывания чДНК кроличьими слермиями. Для этого эякулированные и тщательно отмытые от семенной плазмы сперматозоиды кролика смешивали с ник-транслированной плаэмидной ДНК. На рис.1 представлены типичные кривые поглощения! Процесс не зависит от температуры. ДНК быстро ассоциирует со слермиями в'течение первых 5-15 мин,

- а -

fio

№9мЯ,мии

Рис.1. Зависимость связывания ник-транслированной ДНК pRK31acZ с кроличьими сперматозоидами от времени совместного инкубирования. 1 - при 0°С. 2 - При 37°с, 3 - после обработки глутаровым альдегидом.

а затем наступает стадия насыщения. С клетками связывается 60-70X добавленной в среду инкубирования радиоактивной ДНК. Сперматозоиды, обработанные глутаровым альдегидом, теряют способность поглощать ДНК. Взаимодействие сперматозоидов с экзогенной ДИК ооратнмо. Носде 30 мин. инкубирования спермиев с радиоактивной ЛИК и У последовательных отмывок из клеток вымывается ¿ОХ радиоактивности.

Расчет емкости сперматозоидов кролика проводили, исходя из опытов по связыванию радиоактивной ДНК р!Ж31ас2. При добавлении г ДНК к 8-Ю6 сперматозоидов, на 1 (тетку теоретически приходится 10~1 * г ДНК. Реально со спармиями ассоциировало 602 ДИК (рис.1), нь них связывалось прочно 10Х. Сие-

довательно, 1 спермий содержит

МГ^'в-НГ^КГ^б'ИГ" г чДНК, что составляет

«•«г14 (г)

--- 7,8-10э молекуч рКК31асг,

7,1-е,5-10511б6-10'24 (Г) где 7,1 (т.п.и.) - длима плаамиды рТ?К31асг, 1 т.п.и, ДНК соответствует 6,5*105 дальтон, а 1 дадьтон равен 1,66-Ю"24 г. 2. Факторы, аяопдае на свявшахие чЛНК со стринямм. После того как было показано, что экзогенная ДНК взаимодействует с.кроличьими сперматозоидами, возник вопрос, существуют ли факторы, влияющие на этот процесс. Ответ на него дали эксперименты по изучению действия ДНК-конкурента, заряженных полимеров и тепловой обработки на процесс связывания.

Спермин инкубировали в течение X мин с ник-транслирован-ной плаэмидой в присутствии различных концентраций ДНК-носителя из спермы лосося, эксперименты проводили при 4° и 3?°С. При взаимодействии со сперматозоидами радиоактивная ДНК вступала в кооперативные или конкурентные отношения с ДНК-носителем. На рис.2 показано, что ДНК-носитель в концентрации менее 1 мкг/мл способствовала ассоциации радиоактивной ДНК, при концентрациях больше этой величины она выступала в роли конкурента и препятствовала связыванию, причём этот процесс протекал независимо от температуры. ■ '

Аналогичные эксперименты проводились в присутствии различных концентраций лолившшпирролвдона, поли-Ц-лиэшз и гепарина. Ингибитором поглощения экзогенной ДНК являлся полианнон гепарин в концентрации, превышающей 1 ед/мл. поликатнон по-

§ . -2 0 2 4

Щ№Ш$цт\№И $УК-К0№УРвиТА , МО/МЛ

Рис.2. Ассоциация радиоактивной ДНК со спермиями кролика в присутствии различных концентрацийконкурентной ДНК не спермы лосося. 1 - при 4°С, % - при 37°С,

ли-0-лизин в концентрации, близкой к 10 мг/ил, наоборот, способствовал связыванию чДНК. Поливинилпирролидон не оказывал заметного влияния на ассоциацию радиоактивной ДНК со сперматозоидами (рис.3).

Прогревание спермиев 5 мин при 60°С снимало их способность сьнэывать чДНК примерно в 2 раза, однако, не исключало зту ьоэмшщость вообще.

Для изучения ингибирущего действия семенной плазмы на связывание радиоактивной ДНК. к суспензии отмытых сперматозоидов кролика добавляли семенную жидкость в отношении 1:1 (об/об). Инкубирование проводили при комнатной температуре в

ф коицдитоАцин

„ КОиКУРИРУЮЩИХ П0ЛИМ6Р0&

Рис.3. Ассоциация радиоактивной ДНК со спермиями кролика в присутствии различных концентраций полимеров с положительным, нейтральным и отрицательным еарядом, 1 - по-ЛИ-0-ЛИЗИН, мкг/мл; 2 - поливинилпирролидон, мкг/мл; 3 -гепарин, ед/мл.

течение ЭО мин. В контрольных экспериментах использовали гепарин (1000 ед/мл) и ВСА {10 мг/мл). В таблице 1 показано, что добавление семенной плазмы кролика иди человека уменьшало количество связанной с клетками чднк до 16Х.

Опыты по генетической трансформации теряют смысл, если в среде инкубирования присутствуют агенты, разрушающие ДНК. Поэтому были исследованы семенная плазма кролика и среда, в которой проводят обработку епермиев экзогенной ДНК. ДНК фага X в количестве 10 мкг инкубировали при 37°С в 30 мкл семенной

Таблица 1. Ингибирушее действие семенной плазмы на связывание Э2Р-ДНК со сперыиями кролика.

действующий количество связанной ДНК

фактор имп/ыин г

контроль

(отмытые сперматозоиды) 39446 60,7е

семенная плазма кролика 10944 16,8*

семенная плазма человека 10077 15.б6

бычий сывороточный альбумин 62786 96.6

гепарин 486 0,7

Примечание; а-6 статистически достоверное отличие (Р<0,01. х2-тест)

плаамц или при комнатной температуре в 30 мкл среды для опытов по трансформации. Через 0, 5. 15, 30, 60 и 120 мик реакции останавливали. ДНК экстрагировали смесью фенол/хлороформ и проводили электрофорез в IX агарогном геле. Показано, что в семенной плазме кролика ДНК фага X полностью расщеплялась при З'Г'С за 2 часа. В трансформгщионной смеси & фиксирован приемлемый уровень деградации чДНК (рис,4).

3. Разработка методики включения чДНК в сперыгхозоккы с цеяы« переноса ее в ооциты.

Под трансформацией сперматозоидов мы понимаем процесс зачеата чужеродной ДНК спгршями, перенос ее в яйцеклетку и

/ г 3 Н 5 6 7 9 9Ю и ев Л'

Рис.4. Ецектрофореэ продуктов гидролиза ДИК фага А: дорожка 1 - ДНК Фага X; дорожки 2-7 - гидролиз ДНК Фага х в среде трансформации; 8-13 - гидролиз ДНК Фага Л в семенной жидкости; 14 - Н1псШ1-рестрикты ДНК фага х. время инкубации, мин: О (дорожки £ и 8), 5 (3 и 9), 15 (4 И 10), 30 (5 И 11), 60 (б И 12] и 120 (7 И 13).

экспресс*» в предимплаитациокних змбрион&ч. Эффективность трансформации в случае применения репортерного гена 1ас2 оценивалась по количеству лредимплантационных эмбрионов, экспрес-сируших бактериальную О-галактозидазу, При использовании естественной трансформации вшод таких зародышей был 19Х. Воспроизводимость данного метода чрезвычайно низка. Поэтому для увеличения эффективности трансформации применяли диметилсулъ-Фоксид (ДМОО) и тепловой шок.

Отмечено допустимое снижение подвижности сперматозоидов в присутствии 32 ДМСО (рис,6). Активность клеток постепенно снижалась ь процессе трансформации, однако, после теплового шока подвижность спермиев возрастала почти до первоначального зна-

Время, мин

Рис.5. Зависимость подвижности сперматозоидов кролика от времели инкубации: 1 - в растворе эрла; 2 - в растворе Эрла, содержащем ЗХ ДМСО.

чения.

Показано, что в присутствии 3% ДМСО кривая связывания радиоактивной ДНК со сперматозоидами имеет вид сигмоиды и выходит на плато через 15 мин после смешивания компонентов. Су-

I

щестйующая в самом начаяе процесса временная 'задержка (рис. б) позволяет тщательно перемешать сперматозоиды с чДНК для более равномерного распределения молекул ДНК между клетками.

Влияние ДМСО на проницаемость сперматозоидов (фолика для ЧДНК в присутствии семенной плазмы, изучалось по следующей с\(еме. В качестве положительного контроля использовали спермин, отмытые от семенной жидкости. За 100Х принимали радиоак-

60

Время} мни

Рис.6. Кинетика связывания ник-транслированной ДНК рРК31ас2 с кроличьими сперматозоидами: 1 - в присутствии 3£ ДМСО; 2 - после фиксации глутаровым альдегидом.

тивность положительного контроля в отсутствии ДМСО. Результаты представлены в таблице 2. Добавление 31 ДМСО увеличивает включение чДНК в спермин с 28 до 81Х.

Совместное действие ДМСО и теплового шока на проницаемость сперматозоидов изучалось по аналогичной схеме. Результаты представлены в таблице 3. Присутствие ДМСО и действие теплового шока увеличивали проникновение чДНК в сперматозоиды кролика до 1237. по сравнению с контролем. Отсутствие одного иэ компонентов (ДМСО или теплового шока) значительно снижало эту величину.

Перечисленные выше эксперименты показывают, что ДМСО и

Таблица 2. Влияние ДМСО на проницаемость сперматозоидов кролика для 32Р-ДНК в присутствии семенной плавны.

* без ДМСО ИМП/ИИН (X) с ®С0 ИМЯ/МИН (X)

без семенной плазмы с семенной плазмой 39446 (100) 10944 (28)® 39716 (101) * 32063 (61)6

. в.«

Примечание: (Р<0,01. *2-тест)

статистически достоверное отличие

Таблица 3. Совместное действие ДМСО и теплового «ока на проницаемость сперматозоидов кролика для эгР-ДНК.

без ДШЭ с лмсо

имп/мин (X) имп/мин (?)

без нагревания 551443 (100)* -

с нагреванием 219*18 (40) б?Р±29 (123)в

Примечание:

. а. 6

статистически достоверное отличие

(Р<^,01, Ья^-тест; Р<0,05, х2-тест)

I

тепловой шок не сказывают значительного негативного эффекта на подвижное,п> слгршто&г;идсв и увеличивают их проницаемость для ч.ГНК. Ланн;«? о'сто^т^-ньство позволило невольэти факторн

в методике искусственной трансформации сперматозоидов.

4. Перенос ДНК рИСЗХасг в ооцмты кроликов с помои** спер-ыатоэопяов.

Перенос чДНК в ооциты с помощью сперматозоидов невозможен, если спермии потеряют в результате обработки чДНК оплодотворяющую способность, в связи с чем были проведены следующие эксперименты. В первой серии опытов сперматозоиды, обработанные чДНК. инъецировали в верхушку, середину или основание рога матки. Во всех случаях происходило оплодотворение яйцеклеток и начиналось дробление, во второй серии после введения спермиев во влагалище при помощи катетера были получены пре-димплантащюнние эмбрионы и крольчата, которые росли и нормально развивались.

О .¿акте переноса чужеродной ДИК сперматозоидом в яйцеклетку кролика во время оплодотворения судили по экспрессии ре-портерного гена ¡ВУ1ас2 в 34-часоьих эмбрионах. С пометь» хро-могенього субстрата Х-£з1 было проанализировано 117 опытных и 94 контрольных зародыша на наличие бактериальной в-галактоэи-даьн. 8 опыте от 19 до 622 эмбрионов в реакции с Х-да1 демонстрировали сине-зеленую окраску различной интенсивности и текстуры фис.7>, что говорит о присутствии в них в-галактозидазы. У большинства зародышей, д;шших положительный сигнал, отмечена диффузная окраска олжтомеров или их отдельных частей. Ъ некоторых случаях краситель располагался кластерами размером до 10 мкм. Зеленое окрашивание зафиксировано.как у интактных, так » у начинающих дегенерировать зародышей. находящихся на разных стадиях развития, что согласуется с результатами работы 0е1о-

с соавт. (1932). В контроле 977. эмбрионов имели желтый

■ ■■:

Ч'Л-'.'.^- .

Рис.7. Предимплантационные эмбрионы кролика, зкслрессиру-ющие бактериальную в-галактозидазу после оплодотворения ооцитов трансформированными спермиями.

цвет, что свидетельствует об отсутствии в них в-галактозидаа-ной активности.

Результаты испытания двух- методик трансформации сперматозоидов представлены в таблице 4. В контролях в основном присутствовали неокрашенные зародыши. При естественной трансформации в опыте обнаружено 19,ЗХ эмбрионов, экспрессирукшх 0-ггИактозидаэу. При искусственной - это число составило 61,7^, что свидетельствует об увеличении эффективности процедуры в случае применения ДМСО и теплового шока.. ^ Оценка искусственной трансформации. Выражение гена ЯЗШ^сг зафиксировано у зародышей, находящихся на разных стадиях! развития - от 2. до 16 бластомеров. Из 38 контрольных эмбрионов 8 находились на 8-клеточной стадии, а 30 - имели по 16

Таблица 4. Оценка эффективности переноса ДНК рЙКЗ]ас2 в ооииты кролика с помощью спермиев по экспрессии о-галак-тозидазм в ранних эмбрионах.

э окрашенные м б р и о н ы неокрашенные всего

Естественная 0 11(19,3)® 46(80,7) 57

трансформация К 0(0,0) 56(100) 56

сперматозоидов

Искусственная 0 37 (61,7)6 £3(38,3) 60

трансформация к 2(5.3) 36(94,7) 38

сперматозоидов

Примечание: 0 - опыт, К - контроль, в скобках - процент от общего числа эмбрионов, а' 6 статистически достоверное отличие (Р<0,01, х2-тест!

бластсмеров. Большинство эмбрионов (957.) были желтого цвета. В противоположность этому, из 60 опытных эмбрионов 16 (£б,7Х) имели бледно-зеленый цвет, 16 (26,7%) отличались умеренной си-не-зелеиой окраской и 5 (8,32) были окрашены интенсивно. В опыте эмбрионы незначительно отставали в развитии по сравнению с контролем. На 8-клеточной стадии находились 32 зародыша (53.Ж), на 16-клеточной - 22 (36.7Х), по одному эмбриону обнаружено на стадиях 2-х и 4-х бластомеров' (ло 1,72), .и 4 зародыша (6,7?) оказались фрагментированы. Доля развившихся эмбри-

оноб была высока (97Х), и в большинстве случаев (90Х) они имели интактную морфологию. Это позволяет утверждать, что применение ДМОО и теплового шока существенно не влияет на оплодотворяющую способность спермиев и раннее эмбриональное развитие.

Результаты работы свидетельствуют, что сперматозоиды кролика могут служить естественным вектором для доставки чужеродной ДНК в яйцеклетки. Разработанный нами способ обработки спермиев кролика с целью использования их как подвижных векторов для передачи экзогенной ДНК в ооциты путем искусственного осеменения может быть применен для получения траисгенных животных . Данная процедура отличается от ранее предлагаемых методов большей эффективность» и воспроизводимостью. Предполагается, что этот метод найдет применение в пренатальной геноте-рапии, а также в тератологии и при изучении регуляции экспрессии генов на ранних стадиях эмбриогенеза.

ВЫВОДЫ.

1. Эякулированные сперматозоиды кролика, отмытые от семенной плазмы, спонтанно связывают чужеродную ДНК.. Емкость спермиев составляет 6-1СГ14 г чДНК на 1'клетку. Связывание чДНК со спермиями подавляют глутаровый альдегид, плазма семени и полиалионы, такие как ДИК-конкурент и гепарин, напротив, под жатион поли-О-лиэин способствует процессу связывания.

2, Сперматозоиды кролика способны в процессе оплодотворения переносить экзогенную ДНК в ооиитн Оез потерн ее биологи-чг сксй активности. Об этом свидетельствует экспрессия привнесенной с пери рем ДНК рЖ31ас?. к накоплэли0 а-гагсактозидазы в

3. Воздействие дшетилсульфоксидсы и тепловым шоком на сперматозоида кролика способствует включении в них эквогенной

•ДНК и увеличивает эффективность ее переноса в яйцеклетки.

4. Сперматоеоиды кролика после их обработки рекомбинанг-ной ДНК не теряют свои биологические функции, в результате искусственного осеменения крольчих трансформированными спермиями происходит оплодотворение яйцеклеток, развиваются эмбрионы и рождается потомство. Характеристики этих процессов близки к физиологической норме,

5. Разработан метод использования сперматозоидов кролика в качестве подвижных векторов для переноса чужеродной генетической информации в ооциты.

СЛИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Кузнецова И.В.. Кузнецов A.B., Сигаева В.А., Щит К.Ю. Использование сперматозоидов кролика в качестве вектора для чужеродной ДНК. // Биотехнология. 1993. Т. 11-12. С. 2-5.

Кузнецова И.В. Сравнение двух методик трансформации сперматозоидов кролика по эффективности транзиентной экспрессии репортерного гена RSYlacZ в ранних эмбрионах, - Конференция молодых ученых ВИЖа. Дубровицы. 1904. (в печати).

Кузнецов A.B., Кузнецова И.В. Попытки получения трансгенных животных с помощью подвижных векторов. - В кн.: Генноинже-нерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов. Выпуск 1. М., 1Ö95, С. 173-180.

Кузнецов A.B., Кузнецова И.В. Связывание экзогенной ДШ

С?

pRK31acZ сперматозоидами кролика, ее перепое в ооииты » aicc-прессия в доиыплантащюшш эмбрионах. // Онтогенез. 1995. Т. 26(3). С. 3S-43.

печать офсетная. Тираж Т5 якз. ' 0,65 п.л. эак. У129; -Типография НШ НП0"Луч"