Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Прикладные аспекты применения сперматозоидов в качестве переносчика чужеродной ДНК

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Прикладные аспекты применения сперматозоидов в качестве переносчика чужеродной ДНК"

?Т5 ОД 1 О ФЕВ 1998

На правах рукописи

Щит Ирина Юрьевна

ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ В КАЧЕСТВЕ ПЕРЕНОСЧИКА ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК

03.00.23 - биотехнология '

Автореферат диссертации на соискание ученой стапзни кандидата биологических наук

Дубров.чцы, Московская область 19Э7 г

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте прикладной микробиологии..

Научны* руководители: доктор биологических наух, Гусев В.В.

кандидат биологически* наук, Кузнецов А.в.

Официальны* оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Сергеев Н.И. кандидат Биологических наук, Багиров В.А.

Ведущая организация • ВНИИ физиологии, биохимии и питания

сельскохозяйственных животных /£-

Защита состоится «^"Ср 1898 г в часов на .

заседании Диссертационного соаета Д 020.16.02 при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства по адресу: 142012, Дуброоицы, Подольский район, Московская область.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ животноводства

Автореферат разослан Ь^ВЭ7 г.

Ученый секретарь диссертационного созата, доктор сельскохозяйственных наук

И.О.Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы исследования. Успехи генной инженерии сделали озможным получение животных, содержащих в своем геноме чужеродную ДНК фНК), так называемых трансгенных животных. Большое значение имеет получение :ивотных с генетически запрограммированными свойствами: заданным отенциалом продуктивности и качеством продукции (Ward, Nancarrow, 1991), зтойчивых к различным заболеваниям (Muller, Brem, 1991), а также использование заметенных животных в качестве живых биореакторов, т. е. способных эодуцировать биологически активные вещества (Clark., 1989).

Животные-биореакторы, полученные при помощи трансгенной технологии, огут стать новым источником производства рекомбинантных белков для медицины, зрректная посттрансляционная модификация белков в тканях трансгенных лвотных делает эту технологию более предпочтительной по сравнению с лкробиологическим синтезом (Meade, 1997).

. Существующие в настоящее вреия методы переноса экзогенной ДНК в геном ¡лятся на инструментальные (прямая микроинъекция клонированной ДНК в юнуклеус зигот), биологические (ретровирусная инфекция предимллантэционных (брионов) и Комплексные (трансформация эмбриональных стволовых клеток (ES-еток) и их перенос в бяастоцисту, пересадка ядер из ES-кпеток в уклеированные зиготы). Данные методы, наряду с преимуществами, имеют ряд достатков, связанных с трудоемкостью операций и сложностью применения их я крупных животных (Brem, 1993).

В связи с этим, актуальной становится необходимость разработки простого, фиктивного и широко применяемого метода для встраивания чужеродных генов в юмы различных видов млекопитающих, птиц и рыб.

Таким методом является процесс введения клонированной ДНК в клетки (ных видов животных с помощью сперматозоидов. В основе этого метода лежит «обность спермиев поглощать ДНК. Эта особенность, свойственная спермиям этих видов животных, была использована для введения в мужкие гаметы чДНК и г переноса ее в яйцеклетки при оплодотворении. При такой процедуре рмэтозоцды выполняют рель вектора для переноса чДН!С Эффективность еноса экзогенной ДН1С с помощью этого метода составляет 30-60% (Gruenbaum I.. 1991) претив 25% (ßrinsler et at.. 1S85) в результате микроинъецирования

Этот метод в перспективе может быть применен для введения нужных генов в геномы сельскохозяйственных животных для крупномасштабного производства белков. Переход на технологию получения трансгенных животных с помощью трансформированных сперматозоидов (возможно с использованием техники замораживания спермиев для создания криобанков семени) позволит значительно ускорить процедуру и снизить стоимость работ по созданию трансгенных животных, а также снизить цену получаемых при этом , биологически важных белков.

Цель настоящей работы - разработать технологические основы генетической трансформации животных с использованием сперматозоидов кролика в качестве модели вектора для экзогенной ДНК.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

разработать систему неинвазивной доставки экзогенной ДНК гетерологичными спермиями в ооциты золотистого хомячка;

- изучить векторные свойства спермиев кролика при помощи рекомбинантных

ДНК;

- оценить эффективность- переноса чужеродной ДНК;

- исследовать интеграцию экзогенной ДНК в геном реципиентных животных припомощи Саузерн-блотинга;

провести анализ зоотехнических преимуществ использования трансформированных сперматозоидов по сравнению с микроинъекцией для получения трансгенных животных.

Новизна работы заключается в том, что впервые рассматривается понятие состояния компетентности сперматозоидов к экзогенной ДНК. В связи с этим, определено влияние половых режимов самцов кролика на связывание ДНК с кроличьими спермиями. Обнаружена разница начальных скоростей связывания ДНК спермиями, обусловленная различными режимами полового использования доноров спермы. Впервые выявлены 4 участка связывания меченой дигоксигенином ДНК с головкой сперматозоида кролика. В серии экспериментов обнаружено отсутствие корреляции между подвижностью мужских гамет и их способностью связывать ДНК.

Впервые показана ... возможность тестирования векторных . свойств сперматозоидов с помощью ооцитов золотистого хомячка.

Проведен анализ зоотехнических" преимуществ использования трансформированных спермиев для получения трансгенных животных по сравнению с методом микроинъекции.

Практическая значимость работы состоит в том, что в результате проведенных исследований разработана система неинвазивной доставки экзогенной ДНК мужскими гаметами кролика в яйцеклетки золотистого хомячка.

Предложенная методика интродукции чДНК в ооциты с помощью трансформированных спермиев кролика может быть использована для получения трансгенных особей у других видов сельскохозяйственных животных, птиц и рыб. Разработанный метод в будущем позволит специалистам сельского хозяйства получать млекопитающих, птиц и рыб с более продуктивными свойствами, для биотехнологов появится возможность создания нового поколения биопрепаратов для медицины и ветеринарии, используя трансгенных животных в качестве живых биореакторов.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых ВИЖа (Дубровицы, 1994 г.); на Международной научно-практической конференции "Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства" (Степногорск, 1995 г.); на Eurasian Symposium оп Current Trends in Biotechnology: Gene Diagnostics, Gene Therapy and Informational Immunity. The First Turkish - Russian Meeting (Ankara, 1995); на Международной конференции, посвященной памяти акад A.A. Баева [Москва, 1996 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора питературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов i их обсуждения, выводон и списка цитируемой литературы, включающего 205 1СТОчников, и приложения. Работа изложена на 120 страницах машинописного екста, включает 19 рисунков и 14 таблиц

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

)бщий план работы представлен на рис. 1.

4 Получение трансгенных кро ликов !-

¡Изучемие процесса взаимодействия I чДНК со сперматозоидами кролика

[Трансформация сперииев!

X

Генная конструкция pCMVIacZ

т

| Микроинъекцня]

Генные конструкции pRKJIacZ, pCMVlscZ. pMTIacZ. pGEM4Z

Тестирование векторных свойств сперииев с помо<цы* овцитов хомячка

Искусственное

осеменение

крольчих

Ыбой животных.

вымывание

8-16 и. эмбрионов

ПЦР яйцеклеток хомяка

Генные конструкции pRKSIacZ. cas-faGH. РВ1534. PB39JS. P814J3. 7957BG. PB140MLC. PB1S9

|Рождение крольчат] [Рождение крольчат]

Анализ экспрессии гена в преАимшинтацяонных эмбрионах кролика

Анализ интеграции

»Сравнение«

Анализ I интеграции. (ена |

Рис. 1 Общая схема проведенных исследований.

Эксперименты проводили на популяции . кроликов породы советская шиншилла питомника ГНЦ ПМ (Оболенск). Сперму для опытов по получению трансгенных животных брали при помощи искусственной вагины от самцов-доноров.

В работе использовали: коммерческий вектор pGEM-42 (Promega, США), плазмиды pRK3lacZ и pMTIacZ (предоставлены Жадановым А.Б.), а также pCMVIacZ (получена от Чумакова Г.М.). Трансформацию сперматозоидов проводили по методике Кузнецовой и соант. (1993).

Для опытов по тестированию векторных свойств спермиев кролика с помощью ооцитов хомяка капацитацию сперматозоидов проводили в среде BWW с 3,5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) по методу Rogers (1979). После проведения капацитации проводили трансформацию сперматозоидов экзогенной ДНК. ■ .

Ооциты хомяка получали от 8-12 нед самок-доноров после обработки фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ-супер, Россия) и хорионическим гонадотропином (чХГ, Россия). Животных убивали через 15-17 ч после инъекции

4ХГ, яйцеводы удаляли и помещали в среду BWW с 0,3% БСА. Для высвобождения' 4йцехлеток кумулюсные массы обрабатывали 10 мин 0,1% гиапуронидазой при 37°С. Чтобы удалить zona peltucida ооциты помещали на 5 мин в 0,1% раствор •чроназы в среде В WW.

Для оплодотворения ооцитов в каплю (200 мкл) капацигированных спермиев 1Ü' кп/мл) под вазелиновым маслом помещали 20-25 яйцеклеток хомяка, лишенных :опа pellucida, и инкубировали при 37° С в течение 3 ч. После отмывки от налипших спермиев яйцеклетки фиксировали в 1% глутаровом альдегиде (ГА) и готовили препараты, которые просматривали под фазово-контрастным микроскопом Opton .Германия) при увеличении хЗОО и фотографировали. Ооциты золотистого хомячка были исследованы на содержание чужеродной ДНК pCMVIacZ при помощи яопимеразной цепной реакции (ПЦР).

ДНК pRK31acZ (7 kb) метили а-32Р{СТР] (ИЯФ, Обнинск) в реакции ник-транс-пяции с помощью набора фирмы Fermentas (Литва). Для определения мест связывания экзогенной ДНК на сперматозоидах кролика ДНК pROäcZ метили 0IG-УТР, используя кит №1175033 фирмы Boehring,er Manheim (Германия).

В опытах по определению участков связывания суспензию отмытых спермиев л DIG-ДНК инкубировали при комнатной'температуре а течение 30 мин. Цветную реакцию проводили по методике в соответствии с наставлением к киту №1175041 фирмы Boehringer Manheim (Германия).

Суперовуляцию у крольчих вызывали в стадии (проэструса при помощи знутримышечиой инъекции фолликулостимупирующего гормона (по 20 ME на кг живой мзссы) (Intergonan, Германия) за 96 часов до осеменения. Животных осеменяли пластиковыми катетерами, затем инъецировали внутривенно по 100 ME хсрионичесхого гонадотропина (Ekluton, Германия). Через 46 часов после осеменения из яйцеводов раствором Хенкеа вымывали предимплантационные эмбрионы.

Выявление бактериальной ß-галактозидазы в ранних эмбрионах кролика проводили с помощью гистохимического окрашивания X-gal (Кузнецова и др., 1993; Кузнецова, 1995) и выявляли с помощью MUG (Харди, 1990).'

Выделение хромосомной ДНК (Маниатие, 1984), точковую гибридизацию (Мазин и др.... 1990) и Сауэерн-блотинг (Девис и др., 1984) осуществляли по общепринятым методикам.

в

РЕЗУЛЬТАТЫ

Эксперименты по получению трансгенных кроликов методом, микроинъекции

В опытах по микроинъекции с использованием хирургической техники имплантации эмбрионов, проведенных совместно с П.А. Гоголевским (с геном RSV-lacZ) после пересадки 199 инъецированных зигот крольчихам-реципиентам родилось всего 6 крольчат, 2 из которых были мертворожденными (табл.1). Трансгенных животных получено не было. В другой серии экспериментов- вместе с Л.Е. Андрбевой (при использовании гена cas-bGH) было имплантировано 205 инъецированных зигот, но у полученных 9 особей трэнсген не был .-обнаружен (см. табл.1). В этих двух опытах использовали 118 животных-доноров и реципиентов, проинъецировали 545 яйцеклеток, родилось всего 15 крольчат.

Таблица 1

Результаты опытов по получению трансгенных кроликов методом микроинъекции.

Опыт (соавтор) П.А. Гоголевский Л.Е. Андреева G. Brem

Используемые генные конструкции RSV-LTR-lacZ* cas-bGH РВ1433.830J5, РВ15Э, 7957BG, РВ1534, РГ5/34, PB140MLC:

Инъецированные зиготы Трансплантированные 265 (100,0) 199(75,1) 280(100,0) 205 (73,2) ДО

Общее число реципиентов 20 203

Родившиеся крольчата ; 6 (100,0) 9(100,0) 416 (100,0)

Исследованные особи 6 (100,0) Выявленные особи - С интеграцией гена 0(0,0) S" (100,0) 0(0,0) 416 (ШЩ 5(1,4)

Примечание: ДО - данные отсутствуют

В экспериментах, проведенных совместно с G. Brem, применение лапароскопии позволило значительно увеличить количество беременностей и ускорить процедуру микроинъекции. Было использовано большое количество животных (см. табл. 1). В двух сериях экспериментов было получено^ трайегенных крольчат (1,4%-от числа новорожденных особей). Даже с усовершенствованием

техники манипулирования эмбрионами и уменьшении трудоемкости процедуры аикроинъекции-частота получения трансгенных животных остается низкой.

Топография связывания чужеродной ДНК сперматозоидами

В опытах по определению участков связывания ДНК исследовано 1184 ягерматоэоида (5£4 - контрольных и 620 - опытных). В пробах не было аномальных |»рм слермиавг обнаружены лишь отдельные клетки с утраченными хвостами. Экрашивание выявлено в виде полосок на головке сперматозоида. Выделено 5 гкрашенных, четко видимых областей: I - акросомный участок, II - экваториальный :егмент. III * постакросомальная область, IV - задняя часть головки и V - шейка этерыия. В опытной пробе окрашивание отмечено у 35,3% клеток. С зоной I ¡вязалось 6,5%. чДНК, с зоной II - 3.8%. Большинство экзогенной ДНК было )бнаружено иа зоне III - 62,3%. В зоне IV находилось 22,9% чДНК. Небольшое :опичсстоо ДНЮ (4,5%) связалось с шейкой спермия - зона V. На препарате этэрматозоидоа, обработанных гепарином, окрасилось лишь 4,5% клеток. Данные статистической обработки контрольных и опытных сперматозоидов представлены в вдв гистограмм (рис. 2).

t II I В IV V

III

III

— %

Б too

м ш га <9

М 40 JS

I И HI (V »

Распределение красителя по »нам

о

■ я а я » Распределение красителя по гояяи

'ис. 2 Результаты опытов по определению участков связывания чДНК на псрматозоидах кролика: А - опыт; Б - контроль (обработка гепарином).

Тест-система для характеристики векторных свойств спермиев

Схема экспериментов по оплодотворению in vitro яйцеклеток хомячка трансформированными спермиями кролика приведена на рис. 3.

Для обнаружения перенесенной ДНК применяли технику ПЦР. Были проведены 10 различных экспериментов, в которых было исследовано 100 яйцеклеток. Результаты опытов представлены на рис. 4.

После амплификации трансген был обнаружен в положительной пробе №1, где ДНК добавляли непосредственно к яйцеклеткам и не обрабатывали их ДНКазой!. Кроме того, положительный сигнал зарегистрирован в пробах №6-9, где сперматозоиды после калацитации подвергали искусственной трансфекции и затеи обрабатывали ДНКазойГ либо сами спермии (проба 9), либо оплодотворенные ими яйцеклетки (пробы 6-8). Размеры амплифицированного фрагмента соответствовали ожидаемому величиной 369 пн. Сигналы не были зарегистрированы в образцах 6ei добавления ДНК как при использовании необработанных слермиев (проба 2), так i •после их обработки 3% ДМСО и теплового шока (проба 5). Кроме того, сигналы не

J1-,

фяатаЦМ (20. ЯТ) Э<«1мык»

4-

nw «•* »ВИИ с 3JV. ЕС* I »меч, зЛ»

I

цктсфориц«« Д* (Г/. Д^СОЛШ: 0"-»»А)

I

дами I |«вонгпл. «sar.3i*ci

пир

. трипом (24'. ЗТ°С)

0.1*. пввкан. 60*

т

0.г ниалл>«нидэ14.10'. ЗГЪ

t ; . вттш 9 uptftmc*

т

W к ten Кв. чц>» Ml Ш ME DT • »

. :r

сама мямка ■ оадяв дкэстртс*

Рис. 3. Схема опытов по тестированию векторных свойств спермиев кролика при помощи яйцеклеток золотистого хомячка. 'л

обнаружены в пробах Na 3,4,10 с естественной трансфекцией капацитированных спермиев, причем не только в образце без удаления сперматозоидов с поверхности яйцеклеток трипсином (проба 4), но и без обработки прилипших к яйцам сперматозоидов ДНКазой! (проба 3).

Проведенные исследования дают основания утверждать, что оплодотворение яйцеклеток золотистого хомячка, лишенных zona pellucida, можно использовать как тест-систему для характеристики векторных свойств спермиев разных животных:

12 3 4 5 6 7 8 9 10111213

^: & о й oa oQCi -l

Рис. 4. ПЦР-анализ ооцитов золотистого хомячка, оплодотворенных сперматозоидами кролика, трансформированными.плазмидой pCMVIacZ: 1 - zona-free ооциты хомяка с добавлением ДНК pCMVIacZ; 2 - ооциты хомяка, оплодотворенные спермиями кролика; 3,4,10 - ооциты, оплодотворенные спермиями, которые инкубировали с плазмидой pCMVIacZ; 5 - ооциты, оплодотворенные спермиями, на которые действовали ДМСО и тепловым шоком; 69 - то же, с ДНК pCMVIacZ; 11 - отрицательный контроль без ДНК; 12 - контрольная ДНК трансгенного животного с геном lacZ; 13 - ДНК фага >., рестрицированная Pstl.

Идентификация репортерной ДНК по экспрессии гена lacZ в . доимплантационных эмбрионах кролика

Флуориметрия с использованием MUG. Через 48 ч после осеменения крольчих сперматозоидами, обработанными плазмидой pMTIacZ, в отдельных эмбрионах с помощью хромогенного субстрата MUG была зарегистрирован^ р-галактозидазная активность. Уровень флуоресценции в некоторых пробах с ДНК pMTIacZ достоверно отличался от флуоресценции в образцах без ДНК или в пробах с плазмидой pGEM-4Z, несущей делегированный вариант гена lacZ без эукарйотического промотора (рис. 5).

Гистохимическое выявление В-галактозидазы при помощи «гомогенного субстрата Х-оа1. В экспериментах по переносу сперматозоидами рекомбинантной ДНК рЯК31ас£, в отличие от контрольных эмбрионов, подопытные зародыши после инкубации с Х-да! демонстрировали равномерное окрашивание бластомеров разной степени интенсивности. В одном из экспериментов после обработки спермиев плазмидой было получено 18 эмбрионов с интенсивной (++), 18 с умеренной (+) и 1 с неопределенной окраской (±). В случае использования сперматозоидов, не подвергавшихся обработке, только 1 зародыш обладал умеренной окраской и 1-неопределенной, а у 16 эмбрионов сине-зеленое окрашивание отсутствовало. В ряде случаев в окрашенных. зародышах краситель образовывал кластеры. Большинство интенсивно и слабо окрашенных опытных эмбрионов имели интактную морфологию и были покрыты муциновой оболочкой.

».07 ----------- ------------------

0,0{

е,в5"

К

| 0.04

л

0,02

в.О* 0

• О ■ .

Рис. 5 Активность бактериальной р-галактозидазы в отдельных эмбрионах кролика: а •* После осеменения слврмиями, обработанными ДНК рМТ1ас£; б - ДНК р6ЕМ4г; в • буфер ВО;тп - статистически достоверное отличие (Р <0,05; ^-тест).

Использование различных генетических конструкций, кодирующих (V-галактозндазу С помощью реяомбинантмых конструкций, содержащих^ различные

регуляторные области и релортерный ген lacZ (pGEM4Z, pRK3lac2. pCMVIacZ, pMTIacZ), был проведен комбинаторный анализ влияния регуляторных элементов на экспрессию гена lacZ в предимплантационных эмбрионах (табл. 2). Полученные данные указывают на специфичность экспрессии гена lacZ в сочетании с. RSV-LTR, CMV и МТ1 промоторами и, соответственно, проявления признака |!-gal* в ранних эмбрионах кролика после применения трансформированных сперматозоидов.

Таблица 2

'Экспрессия гена 1ас2 под различными промоторами в ранних эмбрионах кролика.

Название генной конструкции Промотор Репортерный ген Обнаружение (5-gal в предимплантационных эмбрионах

pRK3lacZ RSV-LTR lacZ* (i-gal*»

pCMVIacZ CMV lacZ* П-даГ*

pMTIacZ МТ1 lacZ* Р-да»*'

pGEM4Z - lacZ" p-gar"

Примечание: *- гистохимическое окрашивание X-gal, использованием MUG. - флуориметрия с

Воспроизводимость опытов по переносу чДНК сперматозоидами в ооциты кролика с помощью искусственного осеменения изучали с помощью плазмид рЯК31ас2 и рСМУ1ас2. 8 результате гистохимического окрашивания :шбрионов Х-да1 показано, что в отдельных экспериментах частота встречаемости зародышей, накапливающих (иапакгозидззу составляет от 0 до 97%- при средней величине 31,6±16,1 и ассимметрии распределения 0,96 для рЯОасг, а также 37,7124,3 и 0,44 для рСМ\Лэс2 соответственно (рис. 6).

■а

2

100 30

i? ?0

Е- t

z * « i í í i i i! SS

•

• •

•

•

• «1 # •

»

ш 9 • 1 • О • •

. ■ а . ...

Рис. 6. Воспроизводимость опытов по переносу ДНК рЯК31ас2 и рСМ\/1ас2 сперматозоидами в ооциты кролика: а - с ДНК р1ЧК31асг, в - с ДНК рСМУ1асг; б,г -без ДНК.

Генетическая трансформация животных с помощью спермиев

Общие итоги опытов, результаты точковой гибридизации с зондом ta-32PI-pRK3lacZ. Было проведено три опыта по получению трансгенных кроликов. В первом эксперименте из 10 самок, осемененных трансформированными спермиями, 4 крольчихи (А2, АЗ, А8 и А9) родили 26 крольчат, которые были исследованы при помощи, дот-гибридизации на содержание чужеродных последовательностей ДНК Положительные сигналы зарегистрированы не были. Во бтором эксперименте в результате осеменения 8 крольчих (D7-D14) было получено 35 крольчат, из которых 29 особей исследовали с помощью дот-гибридизации. Как и в предыдущем случае позитивные животные выявлены не были.

В третьем опыте 3 самки, осемененные трансформированными сперматозоидами, родили 30 крольчат (табл. 3), 27 из которых исследованы при .помощи дот-гибридизацйи на содержание последовательности pRK3lacZ (рис. 7). В 19 случаях (70,4%) зарегистрирован положительный сигнал. В этих образцах обнаружено 0,1-1 пг искомой ДНК на 10 мкг хромосомной ДНК, что соответствует примерно 1-10 копиям плазмиды pRK3lacZ на геном. Зонд не гибридизовался с ДНК из контрольных животных.

Таблица 3

Итоги опыта Na3.

ДНК Реципиент Число крольчат

рожденных исследованных с положительным

{№} <%) сигналом (%)

pRK3lacZ С1 14 12 (№ 1-12} 9

pRK3lacZ С2 8 7 (№13-19} 5

pRK3lac2 СЗ 8 8 (Ns 20-27} 5

всего 30 27 (100%) 19(70.4%)

• #

й © ¿

1шт ЮОнг 10нг 1нг 190лг tOnr 1мг 10вфГ 10(tJf

м

С1

ФФвФФФФО —

8

1С

Т 2 3 4 5 6

@ ф ф - о - о о -сзо

11 12" 13 14 15 16 17 18 19 20

0$$|--ОООФ

21 22 23 24 25 2Б 27

---о О О О

Б

Pite. 7. Дот-гпбридиэац!-!Я [ *P]-pRK3lacZ с хромосомной ДНК. А - радиоавтогрзфия. Б - схема расположения эбразцов; К - ДНК контрольного кролика; М - мзркер разведения плазмнды ;)RK3tac2: С1. С2, СЗ - самки, осемененные трансформированными сперматозоидами; 1-27 - ДНК полученных крольчат.

Интеграция в геном интродуцированной последовательности. Хромосомная ДНК из ушей 3 животных (№2.5.14) гидролизована рестриктазой EcoRI, а потом проанализирована прк помощи Саузерн-блотинга и тбркдиззции с зондом [о-3'Р]-

pRK3lac2 (рис. в), в пробах, обнаружени я» два^тяжелемных фрагмента; более 23 leb и> около- И' КЬ, что свидетельствует а- сашчзтецифической имавграадга; акэогенной ДНК а: геном- и- присутствии", т трансг-ене тальке одного1 EcoRI-самта. Помимо этого-, замечено равномерное: распределение- сигнала в aünaaw, заключенной междууказанными; растриктами. Такая. карти«*а характерна! для рассеянны* по геному повторов. Подученный- результат псаааляет предположите чтет учаегш. -в которые произошла встраивание грансгена содержат повторяющиеся последоаательности,

Рис. 8, Дот-П4бридюация рР]грйЮ1ас2 с хрошзс0мнойДНК:кралико&.№2-, 5,14, ™драшзсшзш+ойрестриктазой ЕсоЯ1, маркеры, смесь НотсШГ н НшсШ1, Крп! растриктш- ллазмиды рЯК31ас2; 2,5, 14 - ДНК'трансгенных кроликов; ВМ!-фрагмент болей' 23 Ий; НМ> - рестрикт — ТОкЬ.

Возможные аричмны: гибели првдаитшзнгхцдоиных зглСриаиов после опподотварвния яйцакпатокк^явкзтраисформирода иными сперматозоидами

При изучении морфологии вымытых- из яйцеводов крольчих- эмбрионов, полученных* после осеменения трансформированными спермиями; замечен ряд нарушений развития зародышей-, связанны» с остановкой на разных стадиях развития (от одноклеточной до яорупы включительно) и фрагментацией отдельных бластомеров. После обработки- Х-да( зеленая окраска зафиксирована как у

ш г s и

/■;

-морфологически нормальных эмбрионов, так и у .аномальных опытных зародышей (табл. 4).

-Было исследовано 284 деимплантационных эмбриона кролика, полученных а результате осеменения -самок -сперматозоидами, трансформированными ллазмидой рПКЗ!эс2, и .98 зародышей тосле трансформации ;ДНК рСМУ1ас2. В результате -обработки эмбрионов хромогенным субстратом ¡(Ьталактозидззы - Х^да! в первом случае зарегистрирован "131 '(46,1%) -окрашенный зародыш, а во втором - "39 (39.8%). При нтом в случае ¡использования плазмиды:рНК31ас2, нормальный :ритм дробления демонстрировали 125 (44,0%) эмбрионов, а в случае рСМ\/!ас2 - 20 (20,4%). При -11сполмойа!1И11.ДНК рСМ\/(ас2'С бопее'атьны1и промотором число аномалий было

Таблица 4

Развитие и окрашивание Х-да1 доммляактацетонных -эмбрионов кролика -после искусственного -осеменения -трансформированными -слермиями.

:рЯКЗ!ас2 ■рСМ\/1ас2

Параметры *

развития •окрашенные всего окрашенные всего

Нормальный «3(15/3%) 125-(Я4?0%) 2(2;0%) 20 (20,4%)

ригарзззитня.

Аномалии 151 (53,2%) 37 (37,4%) 78 (79.6%) ;

развития

Всего 131 (46,1%) 284 (100%) ; 39 (39,3%) 96 (~00%)

Хзолыае, че» ® случае применения шпезмиды рР.К31ао2, Доля- зародышей с ¡различным« анаматями развития я -случае .составил® 79,6%, ,а для

р!7Юзс2 - '53,2%. При ;работе с ДНК грЯК31эс2 обнаружено; что 38,4% нормально дробящихся-эмбрионов -окрашиваются '(1Б;9% -от -общего числа зародышей), а Среди -зародышей -с гадоржкой в -ржшкгкя доля зелен«« зкбршяязв -составляпа Е-3,;Э7о (27,8% дат тгбщвго числа зародышей). Эти «факты смогут (указывать на вегало&нуга связь таежду равней экс^рвссш привнесвжкгго -гвиа и нарушения»» т

. Результаты впмпзв с "ДИК яз -еггермы «зевся -ггоказзли, что ДНК чиожет ЬсгатиЕно ¡воздейств :^вять на окизнвспосавяость сперматозоидов. '.При ■инкуЩрезаши "СПйргл'вв с аысокиВи 'Кзмце*трацир«и ДИК их .подвижность ситегаэтся. При ссииечени»! крольчих гслеринтагтдэмп, трансформированными

высокой (0,5 мг/мл) концентрацией ДНК из спермы лосося, увеличивается количество неопподотворенных яйцеклеток. Возможной причиной потери слерыиями оплодотворяющей способности может быть связывание деэоксирибонукпеиновой кислоты с молекулами МНС II. участвующими в межклеточном узнавании при оплодотворении (Mori et al., 1990; Wu et at.. 1990) Следует отметить, что в экспериментах с применением низкой концентрации ДНК после искусственного осеменения трансформированными спермиями был отмечен нормальный уровень оплодотворяемости яйцеклеток. Вероятно, что при искусственной трансформации (ДМСО и тепловой шок) ДНК, минуя молекулы МНС II, проникает внутрь клеток (Кузнецова, 1995; Кузнецов, Кузнецова, 1995а).

Следует отметить, что в результате микроинъекции ДНК в зиготы гибнет много эмбрионов. В наших экспериментах уровень гибели предимплантационных эмбрионов после оплодотворения яйцеклеток трансформированными сперматозоидами кролика был значительно ниже, чем при микроинъекции Кроме того, из проведенных исследований следует, что в отдельных опытах эффективность получения трансгенных животных с помощью трансформированных сперматозоидов значительно выше по сравнению с методом микроинъекции. В двух сериях опытов с G. Brem было получено 6 трансгенчых крольчат (1,44% от числа новорожденных особей), а в эксперименте с использованием искусственного осеменения трансформированными сперматозоидами из 27 крольчат 19 оказались трансгенными (70,4%). При этом не требовалось большого количества животных, дорогого оборудования, а сама процедура намного легче и'проще микроинъекции. Искусственное осеменение трансформированными спермиями могло бы использоваться в будущем как элемент программ по массовому получению трансгенных сельскохозяйственных животных, птиц и рыб, в т. ч. "живых биореакторов".

ВЫВОДЫ

1. В результате экспериментов по оплодотворению in vitro обнаружено, что слермии кролика способны проникать в лишенные блестящей оболочки ооциты золотистого хомячка и вносить чужеродную ДНК в яйцеклетку. Преренесенная спермиями плазмида pCMVIacZ' выявлена в ооцитах хомячка с помощью лолимеразной цепной реакции.

2. В опытах по искусственному осеменению крольчих показано, что трансформированные сперматозоиды кролика способны переносить различные генетические конструкции (pVP7, pRK3lacZ, pCMVIacZ и pMTIacZ) в яйцеклетки.

3. Определена эффективность переноса рекомбинантных ДНК спермиями кролика, оцениваемая долей окрашенных X-gal доимплантационных эмбрионов. В отдельных опытах эффективность переноса колеблется от 0 до 97,3% (при средней величине 31,6±16,1) при использовании ппазмиды pRK3lacZ и от"О до 85,7% (со средним значением 37,7±24,Э) для ппазмиды pCMVIacZ.

4. Переносимая сперматозоидами кролика экзогенная ДНК способна интегрировать в геном реципиентных животных с вероятностью до 70,4%, в отличие от 2,03% в опытах по микроинъекции.

5. При исследовании развития предимплантациоиных эмбрионов после осеменения крольчих трансформированными спермиями замечен ряд нарушений развития зародышей, которые могут быть связаны с действием высоких концентраций ДНК на спермии, с экспрессией перенесенных генов и зависеть от типа промотора используемой генетической конструкции.

6. Проведенные исследования дают основания утверждать, что искусственное осеменение трансформированными сперматозоидами может быть' использовано для доставки рекомбинантных ДНК в яйцеклетки и получения генетически модифицированных животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Кузнецова И.В., Кузнецов A.B., Смгаева В.А, Щит И.Ю. Использование сперматозоидов кролика в качестве вектора для чужеродной ДНК. // Биотехнология. 1993. Т. 11-12. С. 2-5.

2. Щит И.Ю. Определение участков связывания чужеродной ДНК на сперматозоидах кролика. - Конференция молодых ученых ВИЖа. Дубровицы. 1993.

3. Щит И.Ю., Гусеп В.В., Кузнецова И.В., Сигаева В.А, Кузнецов A.B. Мобильные реакторы на осюве трансгенных животных. - Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства. 4.I. Материалы междунар. научно-практич. конф. Степногорск. 2-4 августа 1995 г. С. 170.

4. Кузнецов A.B., Сигаева В.А.,, Кузнецова И.В., Щит И.Ю. Сперматозоиды кролика способны связывать чужеродную ДНК II Проблемы репродукции. 1996. Т. 1. С. 7-10.

5. Щит И.Ю., Кузнецова И.В., Денисова Т.С., Кузнецов A.B. Сперматозоид -подвижный вектор для рекомбинантной ДНК. - Международная конференция, посвященная памяти акад. A.A. Баева. Москва. Россия. 20-22 мая 1996 г. С. 66.