Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЛИЯНИЕ ЧУЖЕРОДНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В СЕМЕНИ ЖИВОТНЫХ НА ОПЛОДОТВОРЕНИЕ И ЭМБРИОГЕНЕЗ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ВЛИЯНИЕ ЧУЖЕРОДНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В СЕМЕНИ ЖИВОТНЫХ НА ОПЛОДОТВОРЕНИЕ И ЭМБРИОГЕНЕЗ"

Л- з/^

На правах рукописи

БАГИР08 Вугар Аятняз огли

ВЛИЯНИЕ ЧУЖЕРОДНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В СЕМЕНИ ЖИВОТНЫХ НА ОПЛОДОТВОРЕНИЕ Я ЭМБРИОГЕНЕЗ

Специальность: 03.00.13 - физиология человека и животных 03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы - 1996

Работа выполнена в отделэ биологии воспроизведения и искусственного осеменения сельскохозяйственных животных Всероссийского научно-исследовательского института животноводства.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

B.П.КОНОНОВ .

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ю.Д.КЛИНСКИЙ

доктор биологический наук.

C.В-СОВЕТКИН

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Защита диссертации состоится " " ^¿¿¿¿¿АЛ 1996 г. в ¿О часов на заседании диссертационного Совета Д 020.16.02 при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес: 142012, пос. Дубровицы Подольского района Московской области.

Автореферат разослан /,/ » ГШ.syvfW iqqfi Г.

Ученый секретарь 4

диссертационного Совета

профессор П. А.Науыенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Известно, что значительные резервы повышения воспроизводительных способностей животных 'заключены в снижении эмбриональных потерь, которые у отдельных, видов- могут достигать почти половины всех оплодотворенных ооцитов, особенно после осеменения криоконсервированным семенем. Однако для решения этой проблемы необходимо знание причин прерывания эмбриогенеза. Исследования последних лет, подтвердившие реальность переноса в. ооциты экзогенных нуклеиновых кислот сперматозоидами (Lavitrano eVal: Gondoifi F. et al; Arezzo F., 1989; Hochi S. et al.. 1990; Perez A. et al., 1991; Кузнецов A.B. ,1993), навели на мысль, что одной из причин эмбриональной смертности у животных может, быть экспрессия в зиготах чужеродной генетической информации, занесенной сперматозоидами. Видимо высокая активность нуклеаз в семени (Polafcovskl K.L.. Kopta' М.. 1982) - эволюционно выработанное средство устранения этих факторов как причин эмбриональной смертности. Известно, что при замораживании семени из сперматозоидов могут вытекать крупномолекулярные полимеры (Кононов и др., 1978). Это значит, что в мембранах сперматозоидов при этом образуются значительные бреши. Логика подсказывает, если через.эти повреждения мембран могут вытекать крупномолекулярные полимеры, то и во внутриклеточное пространство из внешней среды могут проникать нуклеиновые кислоты и экспрессия чужеродной ДНК (чДНК) может стать.одной из причин эмбриональной смертности. Для проверки этой гипотезы и были выполнены исследования, приведенные в настоящей диссертации.

Цель и задачи исследований. Цель нашей работы состояла в выяснении причин эмбриональных потерь у млекопитающих после осеменения самок криоконсервированным семенем. Для достижения этой це-. ли были поставлены следующие задачи:

- выяснить возможность связывания. чДНК сперматозоидами в

процессе замор аживайШг'АЯзанесёнт ее в ооциты при оплодотворения и шст ъЖтт ё'дащА

гмоос. . ...ь- oioj ачалемии

академии

»■ «v- /ч. ivy"

Ине,

- разработать эффективный метод криоконсервации семени кроликов;

т усовершенствовать способ индукции суперовуляции у крольчих

Научная новизна. Доказано, что одна из причин эмбриональной смертности у млекопитающих после осеменения криоконсервированным семенем: - перенос*чужеродного генетического материала сперматозоидами в яйцеклетку при оплодотворении и последующая экспрессия с синтезом в зиготах факторов, препятствующих нормальному эмбриональному развитию.

Практическая значимость. Разработан оригинальный метод криоконсервации семени кроликов, позволяющий получать достаточно высокую результативность осеменений; . включающий новый состав про-, тектора. оптимальный режим замораживания, новый способ оттаивания. Создан банк семени трансгенных кроликов. Усовершенствован способ индукции суперовуляции у крольчих, позволяющий более чем в 4 раза увеличить выход биологически полноценных ооцитов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных конференциях отдела биологии воспроизведения (1993-1996 гг). на второй международной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (Боровск, 1995 г), на научно-практической конференции "Проблемы обогащения генофонда в животноводстве и задачи кадрового обеспечения отрасли" (Быково 1995 г), на научно-практической конференции " Современные проблемы воспроизводства стада с.-х. животных и задачи кадрового обеспечения". (Быково 1996 г). По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

Объем работы. Диссертация изложена на__Х__ страницах машинописного текста, содержит таблиц. фотографий. графиков. Состоит из введения, обзора литературы, целей и задач исследования, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, выводов и практических предложений. Список литературы содержит наименований, в том чисде на иностранном^ языке.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материал и методы исследования

Работа выполнена в!.Отделе биологии воспроизведения ВЙКа 1993-1996 годах и включала три этапа: 1) совершенствование метода индукции суперовуляции у крольчих; 2) разработку эффективного метода криоконсервации семени кролика; -3) исследование возможности заноса чужеродного генетического материала сперматозоидами в оо-циты как одну из причин эмбриональной смертности после осеменения криоконсервированным семенем (см.- схему исследований).

Все опыты проведены на кроликах породы шампань и калифорнийская в виварии Отдела. Для опытов использованы go самцов кроликов. 150 самок, 4 вазэктомированных самца. Животные были в возрасте 1-4 лет.

Разработка методики криоконсервации семени кролика включала разработку более эффективной.защитной среды, а также щадящих режимов замораживания и оттаивания семени. Разработку новой криоп-ротективной среды проводили с использованием метода треугольных графиков по В.К.Нилованову (1962) для нахождения оптимального соотношения испытуемых компонентов. Оптимальный режим замораживания находили путем изменения объема замораживаемых на фторопластовой пластине гранул семени.

Дуплетные'эякуляты. взятые от кроликов в режиме два раза в неделю, смешивали и подсчитывали концентрацию сперматозоидов при помощи камеры Горяева.~ Для замораживания использовали эякуляты содержащие не менее 100 млн/мл сперматозоидов. Семя.делили на две части и разбавляли одну часть испытуемой, а другую' контрольной {известной) средами. В качестве контрольной использовали среду, предложенную н.А.комбаровой (1993).

Разбавленное семя охлаждали в течение 4 часов в бытовом холодильнике до 4°С. предварительно поместив пробирки с семенем в поролоновый теплоизолирующий штатив. Затем семя охлаждали до 0°С в смеси вода-тающий лед.

Замораживание семени проводили на охлажденной в-жидком азоте Фторопластовой пластине'(Ющенко Н.П. и др., 1968). Оттаивание се-

, _ С.хеиа н,с с л е д о в а н и й

мени осуществляли сухим методом с помощью оттаивателя, предложенного Кононовым В.П.И Нарижнда А.Г.. (1986). ■

; Оттаянное семя оценивали по подвижности, переживаемости при +38° С и морфологической сохранности акросом акроскопическим методом (Соколовская И.И. и др. 1981),. Для осеменения использовали семя с подвижностью не ниже 25%, переживаемостью не менее 3 часов и содержащего не менее 5035 морфологически интактных акросом.

Для повышения выхода ооцитов были испытаны два способа индукции суперовуляции у крольчих.

Первый способ осуществляли по упрощенной схеме. Самкам -в стадии' проэструса внутримышечно инъецировали 40 ME на 1 кг живой массы ГСЖК и через 72 часа внутривенно- вводили 30 ME на 1 кг живой массы хорионического гснадотропина (Кузнецова И.В., 1995). .

Второй способ- предусматривал усложненную схему обработки (Christians Е. et al..•(1994). 'Крольчихам внутримышечно инъецировали ФСГ: 0.250 мг в.1-й день, 0,250 и 0,625 мг на 2-Й день, 0,625 и 6,250 мг на 3-й день. Через 12 часов от последней инъекции ФСГ внутривенно вводили хорионический гонадотропин в дозе 30 НЕ.на 1 кг живой массы вместо рекомендованного авторами ЛГ.

В том . и другом случае крольчих осеменяли, сразу после иньек-. ции хорионического гонадотропина. В качестве контрольного варианта для индукции овуляции использовали спаривание крольчих с ва-зэктомированным самцом и через 5 часов осеменяли.

Результат осеменения . учитывали по. данным окрола, определяя процент окролившихся маток и численность новорожденных в гнезде.

для исследования возможности переноса сперматозоидами чДНК в ооциты были проведены опыты с использованием в качестве чДНК ре-портерного гена pCMVlacZ. кодирующего фермент . р-галактозидазу. Раствор pCMVlacZ в трис-ЭДТА буфере добавляли к семени из расчета 1 мкг/млн сперматозоидов на этапе криопротективной обработки после охлаждения его до 0°С. В контрольные образцы семени добавляли только растворитель. В 'обоих случаях семя выдерживали при.0°С 10-15 мин и подвергали глубокому охлаждению.

' Крольчих с индуцированной и естественной овуляцией осеменяли семенем экспериментальных и контрольных образцов, оттаянным не-

посредственно перед введением в половые пути.

Извлечение и тестирование .эмбрионов проводили .после__ убоя крольчих через 44-46 часов после осеменения, определяли число оплодотворенных яйцеклеток, сопоставляя его с числом вскрытых:фолликулов в яичниках. После морфологического тестирования зигот их подвергали гистохимической реакции на активность продукта экспрессии pCMVlacZ -ß-галактозидазы (Гоголевский п.А.. 1991; Кузнецов A.B.. 1993).

Генная конструкция pCMVLacZ была любезно предоставлена кандидатом биологических наук, зав, лабораторией перспективной биотехнологии ГосНИИ прикладной микробиологии A.B.Кузнецовым.

Все вычисления и статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерной программы Statgraph.

Результаты, приведенные в таблице 1, показывают, что второй способ индукции суперовуляции с применением ФСГ оказался - более эффективным в сравнении с упрощенным способом - однократной инъекцией ГСЖК. ■ В этом случае от каждой крольчихи было получено в 2 раза больше, овуляций - этот способ обработки позволил получить от каждой крольчихи в три-четыре раза больше ооцитов, чем при естественной овуляции. ■

Результаты исследований

Совершенствование метода индукции суперовуляции

Таблица 1

Эффективность способов индукции суперовуляции

Способ Осеме- Выявлено Выявлено овуляций

вызывания нено маток с —:--:

овуляции маток овуляцией всего _____

осем! крольную

Вазэктомиро-ванным самцом 15

15 "14 ' ■ 135 .. 9±0,7 10+0,4 14 12 202 14+1,6*' 17+0,5***

5 5 171 34+0,5*" 34+0,5***

Инъекцией гсжк

Инъекциями ФСГ

'** Р>0,99; ***Р>0,999

Оплодотворяемость от осеменения краоконсервированным семенем крольчих как с натуральной овуляцией, и индуцированной суперовуляцией была практически на одном.уровне, что указывает на способность оплодотворяться суперовулированных ооцитов (табл. 2)

Таблица 2

Влияние способов .индукции суперовуляции на способность . к оплодотворению ооцитов

Способ вызывания овуляции Осеменено маток Из них сукрольных Извлечено Оплодотво ряемость. ' %

число % зигот ооцитов

Вазэктомиро- 14 93+7 102 11 * ■ 90+3

вашшм самцом 15

Инъекцией.

гсжк 14 - 12 85+10 173 18 91+2

Инъекцией

ФСГ 5 ■ 5 100 * 138 19 88+3 •

Для более точной информации о биологической полноценности тех и других ооцитов провели сравнение интенсивности развития зигот. полученных от естественно и гормонально индуцированных овуляций.

Таблица 3

Влияние гормональной индукции суперовуляции на интенсивность развития зигот

Способ вызывания овуляции Всего исследовано зигот Из них на стадиях развития

4-8 бластомеров более 8 бластомеров

число число Я

Естественная

овуляция ' 18 1 6+6 17 94+6

Индуцированная 81 . 12 69

суперовуляция 15+4 85+4

Результаты, приведенные в таблице 3, показывают, что нет статистически достоверной разницы между процентами зигот, достигших разных стадий, развития в связи со способами индукции овуляции. ; Это-значит, что и.в.этом отношении зиготы, получившиеся-из суперовулировавших ооцитов,' вполне полноценны.

В связи с этим в последующих исследованиях, для повышения эффективности экспериментальной работы мы смогли применять индукцию суперовуляции по усложненной схеме с применением ФСГ.

разработка метода криоконсервации селены кролика

В качестве базовых при разработке среды были взяты компоненты, хорошо зарекомендовавшие себя в работе с семенем других видов животных. В качестве неэлектролита была использована лактоза как дисахарид. обладающий-высокими антиоксидантными свойствами и способный особо прочно связывать свободную воду. Как электролитную часть среды использовали цвиттбрионный трис-цитратный буфер, способный устойчиво удерживать концентрацию водородных ионов при охлаждении семени за счет сопряженного подавления констант.диссоциации трис-катиона и лимоннокислого аниона (Кононов В.П.. 1977).

В связи с особым значением специфических криопротекторов для защиты семени при замораживании методом треугольных графиков были ^ найдены оптимальные концентрации' криопротекторов глицерола и ди- ■ метилсульфоксида (ДМСО): судя по подвижности - 2 и 2%. по выжива-. емости сперматозоидов - 2-й 2.1%, по сохранности акросом - 2 и 2,5%. усредненные по всем трем показателям - 2 и 2,535 соответственно. В результате разработанная среда имела следующий состав.

. Лактоза 2.17 г

Лимонная кислота - 1,52 г"

Трис(оксиметил)аминометан 2,74 г

Желток куриного яйца 15.О мл

Глицерол * ■ ■ 2.0 мл

ДЧСО • 2.5 мл

Вода дистиллированная 100,0 - мл

рН г"""'' - 7.05

На следующем этапе исследований находили оптимальный режим глубокого охлаждения семени, замораживая его гранулами разного объема. Результаты приведены на рис.

Данные рис.1 показывают, что обьем' замораживаемых гранул имеет решающее значение для выживаемости сперматозоидов. Чем больше объем гранулы в пределах до 0.25-0,3 мл. тем лучше сохранность биологической полноценности сперматозоидов. ■

Семя, замороженное по разработанному методу, было исследовано основными тестами в сравнении с замороженным по известному методу (Комбарова Н.А., 1993). Результаты, приведены в таблице 4.

Таблица,4

Изменение характеристик семени кроликов на разных этапах криоконсервации Сданные 5 повторностей) .

Этапы криоконсервации"- Подвижность % Сперматозоидов с интактными ■ акросомами, % Подвижных спермото-зоидов с интактными акросомами, %

0 к 0 к 0 К

Свежевзятое семя 82 74 85±2 82+3 100 100

После разбавления ' 78 74 83+3 78+4 98+0,6 95+1,0

После эквилибрации ' 73 ' 73 82±3 73+3 96+0,9 89+1,4 "

После оттаивания 25 15 ■ 73+2 55+3 .86+1.6 '67+2,1

"Р>0,99; *"Р>0,999 О - опыт, замораживание семени по нашему методу К - контроль, замораживание семени по методу-прототипу

Из данных таблицы 4 видно, что разработанный нами.метод значительно лучше защищает сперматозоидов при замораживании, чем аналог, разработанный ранее.

Видно (табл.5). что криоконсервация семени нашим методом сохраняет высокую оплодотворяющую способность сперматозоидов. При этом не. имеет значения способ индукции овуляции. Вместе с тем видно, что величина гнезда в случае естественного осеменения была выше на статистически достоверную величину в сравнении с полученной от замороженного семени, но по проценту окролов в этой связи различий не было.

. ■ ' . Таблица 5

Результативность,осеменения крольчих семенем, замороженным разными методами, в сравнении с естественным покрытием

Метод замораживания семени и осеменения - Осеменено крольчих Из них окролились Родилось.крольчат

число % всего на 1 матку

Новый метод■ Известный метод Естественное осеменение 35 111 12 29 67 и 83+6 60+5" 92+8 172 329 82 5,9+0.3 4.9+2,0 7,5+0.4'"

"Р>0,99; *"Р>0.999

Получение трансгенного животного сложный и трудоемкий процесс. поэтому ставится задача - максимального тиражирования его в потомстве. Решить эту задачу дает возможность разработанный нами метод криоконсервации семени,, позволяющий накапливать семя от таких уникальных индивидов в периоды не использования его для осеменения самок по тем или иным причинам:'в сезон депрессии эструса или в отсутствии необходимого числа маток в воспроизводительный сезон и др. Резервы семени от трансгенных кроликов, заготовленного нами приведены в таблице 6.

Таблица 6*

Банк замороженного семени трансгенных кроликов

Заготовлено семени Подвижность. % •

до замс-роживание после оттаивание

МЛ )Д03

Имплантированный ген

^-интерферона ^-интерферона

17 78 130

61 167 415

80 80 80

25 30 30

Сохранность акросом, %

58 64 61

Изучение возможности переноса чДНК в ооцшпы сперматозоидами и влияние ее на эмбриогенез

Результаты исследований возможности заноса чДНК в ооциты сперматозоидами, подвергнутыми.замораживанию как одной'из причин эмбриональной смертности, приведенные в таблице 7. показывают, что добавка чужеродной генетической информации к семени при'заблокированной .охлаждением активности нуклеаз не повлияла на опло-дотворяемость. но оказала существенное влияние на качество зигот (табл.8) И'их развитие..(табл.9); . . •

Видно, что добавление чДНК к семени перед замораживанием привели к появлению большого числа дегенерированных зигот, свидетельствуя тем самым о высокой эмбриональной-смертности. Поскольку такого явления.не было в контрольных образцах, случившуюся эмбриональную смертность мы однозначно можем объяснить действием экс- ■ трагенетической информации, заключенной в гене рСМУЬас2. *

Таблица 7

Влияние ■ добавки генной конструкций рСМУЬасг к семени . перед замораживанием на оплодотворяемость

Заморажи- Способ Число Извлечено оонитов и зигот Оплодот-

вание се- вызывания маток всего число воряе-

мени овуляции зигот ооцит мость, %

Без Естест-

рСМУЬасг венный ■ ' 3' 21 18 3 86+8

Индуци-

рованная 5 87 81 6 93+3

Всего по группе 8 108 99 ■■ 9 92+3

С добав- Естест-

кой венная • 7 61 56 5 92+3

рСНУЬасг Индуци- 169 149 20

рованная 9- 88+2

Всего по группе 16 ■ 230 = . 205 25 89+2 .

В приведенном опыте выявился один феномен, требующий специального объяснения: процент разрушающихся зигот был статистически достоверно выше среди взятых от крольчих с естественной овуляцией. Выяснение причин этого явления требует дополнительных иссле-. дований, но на этот счет предположительно мы даем следующее объяснение..* . ..

Таблица 8

" ■ Результаты морфологического тестирования зигот . ' в связи с добавкой к семени чднк

Замораживание семени. Способ вызывания овуляции Всего исследовано зигот ■Из них дегенерированных

число % •

Без рСНУЬасг Естественный Индуцированная ' 21 . 87 . о 0 0 >

Всего по группе 108 0 0 . ■

С добавкой рСМУЬасг Естественная Индуцированная 56 149. 25 ;; 43 .45+7*'* . 29+4* * *

Всего по группе 205 68 зз+з* * *

'Р>0,999

Вероятно у самок с гормонально индуцированным эструсом период от осеменения до овуляции был примерно в 2 раза'больше, чем у маток с натуральной овуляцией; Соответственно сперматозоиды в половых путях у первых^сохранялись в 2 'раза дольше, что привело к значительно большей пропорции погибших. Снижение дегенерированных зйгот при этом:наводит на мысль, что раньше других погибали сперматозоиды, нагруженные чужеродной ДНК и пропорция тех и других сместилась в,сторону увеличения ненагруженных.

Таблица 9 '

Развитие зигот в связи добавлением к семени перед замораживанием генной конструкции рСМУЬасг

Замораживание семени Способ вызывания овуляции Всего исследо- ■ вано зигот Число бластомеров в зиготах

1-2 2-4 4-8 8-16

Без Естест- ■ рСМ1/Ьасг венный Индуцированная Всего по группе 18 81 99 0 0 .0 0 •0 ' 0 . 1 12 13 17 69 .86

С добав- Естест-

кой венная ' 56 4 9 12 31

рСМУЬасг Индуци- 149 - 22 . 39 73

рованная 15

Всего по группе ' 205 19 31 51 104

Таким образом, что добавка к семени чужеродной генной конструкции перед замораживанием повлияла на развитие полученных зародышей - наблюдается явная задержка в развитии зигот в сравнении .: с контрольным вариантом. Предположительно это явление мы объясняем следующим образом. Экспрессия занесенной в'зиготу чужеродной информации потребовала для синтеза соответствующего белка (Р-га-лактозидазы) расхода необходимых аминокислот, что привело к истощению их запасов в ооците.' Известно, что на первых порах до ста' дии бластоцисты развитие зародышей идет, за счет запасов пластических и энергетических компонентов ооцита и этими резервами в значительной мере определяется, интенсивность развития. . Непредвиденный расход запасов питательных веществ вследствие синтеза чу7 жеродного белка создает в определенной мере дефицит в метаболизме

зародыша и этим задерживает его развитие.

И. наконец, прямое тестирование на возможность заноса сперматозоидами чужеродной генетичесой информации в ооциты и последующей ее экспрессией путем гистохимической реакции на присутствие в них активности р-галактозидазы. показало (табл.10), что у отдельных зигот, полученных от семени, обработанного чДНК, в цитоплазме проявилась положительная реакция на галактозидазу. Это означает, что наша рабочая гипотеза подтвердилась - в процессе криоконсервации семени генетическая конструкция , рСМУЬасг была связана со сперматозоидами и занесена в яйцеклетки в процессе оплодотворения с последующей экспрессией, продуцирующей'чужеродный белок, что и стало причиной ранней эмбриональной смертности.

Таблица 10

Частота проявления экспрессии гена-рСМУЬасг в зиготах

Замораживание семени Способ вызывания овуляции Всего исследовано зигот Из них с положительной реакцией на р-галактозидазу число | %

Без Естест-

рСМУЬасг венный 21 0 0

Индуци- 92

- рованная 0 0 ■

Всего по группе .113 0 0

С добав- Естест-кой венная рСМУЬасг Индуцированная Всего по группе 68 184 252 7 22 29 10+4** 12+2"* 12+2'**

"Р>0.99; ***Р>0,999

Результаты наших исследований показывают также, что процент зигот, проявивших положительную реакцию на р-галактозидазу. значительно меньше, чем с дегенерированными бластомерами. Этот факт позволяет предположить, что для гибели зигот в ряде случаев достаточно проникновения чужеродной генетической информации без проявления ее экспрессии. Вместе с тем зиготы, положительно прореа-'гировавшие на присутствие продукта экспрессии, не все были деге-нерированы. Среди них были и такие, .что развивались-- нормально.

Следовательно, не всякий раз проникновение в ооцит чужеродной генетической информации приводит к гибели зародыша. Возможно, это имеет место в том случае, когда запасы пластических и энергетических компонентов в них повышено. В том случае, когда этих запасов достаточно их хватает и на ненужную экспрессию экстрагенетической, информации. и на-собственные нужды для развития эмбриона. Это обстоятельство оставляет надежду, что нагрузкой сперматозоидов рекомбинантной ДНК при замораживании можно получать трансгенное потомство, ,..*'.

Выполненные нами исследования дали вполне однозначный ответ на главный вопрос: возможно ли включение носителей чужеродной генетической информации в сперматозоидов при замораживании семени и если да. то влияет ли это информация на оплодотворяющую способность и последующее эмбриональной развитие. Действительно экстрагенетическая информация способна включиться в сперматозоидов при криоконсервации семени. При этом она практически не изменяет оплодотворяющую способность сперматозоидов, но существенно снижает эмбриональную выживаемость зародышей.

ВЫВОДЫ

1. В процессе криоконсервации семени кроликов присутствующий в жидкой части чужеродный генетический материал способен связываться со спермотозоидами или проникать в их эндоцеллюлярное пространство и заноситься в ооциты в процессе оплодотворения с последующей экспрессией.

2. Экстрагенетическая информация, занесенная сперматозоидами в ооциты в процессе оплодотворения часто вызывает раннюю эмбриональную смертность.

3. Связанная со сперматозоидами или проникшая в них чужеродная генетическая информация не изменяет их оплодотворяющей способности.

4. занесенный в ооциты чужеродный генетический материал задерживает развитие зародышей.

5. Оплодотворяемость ооцитов и последующая эмбриональная выживаемость не зависят от способа инициации овуляции: естественно - спаривание с самцом или искуственно - гормональной обработкой.

6. Комбинация крипротекторов глицерола и ДМСО лучше защищает сперматозоидов кроликов при замораживании в сравнении с каждым из них в отдельности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для повышения эффективности и расширения возможностей селекционно-племенной работы в кролиководстве предлагаем оригинальный метод криоконсервации семени кроликов,' позволяющий" получать достаточно высокую результативность осеменения.

2. Предлагается эффективная схема обработки крольчих ФСГ и хорионическим гонодотропином для получения суперовуляции биологически полноценных ооцитов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Багиров В.А. Возможность проникновения экстрагенетической информации в сперматозоиды при криоконсервации семени // Вторая международная конференция "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" Боровск 5-8 сентября 1995 г.- С. 169-170.

2. Багиров В.А. Новый метод криконсервации.семени кроликов '//Зоотехния. 1996 г. N 6.- С. 28-29.

3. Багиров В.А., Кононов в.П. сперматозоиды как векторы для переноса чужеродного генетического материала // "Современные проблемы воспроизводства стада сельскохозяйственных- животных и задачи кадрового обеспечения". Быково. 17-21 июня 1996 г. С. 21-22.

Зви./УДО Тир./де Щ«р6»и«»«