Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЭКСТРАГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНФОРМАЦИЯ КАК ОДНА ИЗ ПРИЧИН ЭМБРИОНАЛЬНОЙ СМЕРТНОСТИ У СВИНЕЙ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ЭКСТРАГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНФОРМАЦИЯ КАК ОДНА ИЗ ПРИЧИН ЭМБРИОНАЛЬНОЙ СМЕРТНОСТИ У СВИНЕЙ"



№ правах рукописи

ОНДАР Азмймаа Аяк-Хээеаиа

Экстрагекпчеспя информация как одна аз причин эмбриональной смертности у сивей

Специальность 03.00.13 - Физиология

Автореферат

диссертации п соискание ученой степеип кандидата бшмюпгмскп наук

п. Дуброанцы, Московской области

2905 г.

Ж*

Работа выполнена на кафедре воспроизведшая, искусственного осеменения и трансплантации эмбрионов с.-х. животных Российской академии менеджмента в животноводстве и в лаборатории биотехнологии и генетики ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института свиноводства (ВНИИС).

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

Защита состоится

м /Ув

кандидат биологических наук Зыкуиов Николай Петрович доктор биологических наук Субботнн Александр Дяннловнч доктор биологических наук Радченков Виктор Петрович ГНУ Всероссийский НИИ племенвого дела в животноводстве

2005 г. в 10 часов, па заседа-

нии диссертацийнного совета Д 006.013.01 во Всероссийском государственном научно-исследовательском икституте животноводства.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, пос. Дубровины, ВИЖ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан " /9* и^Зсу-С 2005 г.

Ученый секретарь диссертационно] совета, кандидат биологических

В.П. Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальност ь темы.

Проблема повышения уровня воспроизведен ия в свиноводстве до последнего времени остается исключительно актуальной. Среди факторов, обусловливающих эффективность репродуктивного процесса, особое место занимают эмбриональные потери, которые могут достигать почти половины всех оплодотворенных оонитов. Гибель зародышей в период утробного развития является одной из причин расхождения между потенциальным и фактическим многоплодием (Милованов В.К., 1966).

Для успеха в решении этой проблемы, прежде всего, необходимо основательное знание причин прерывания раннего эмбриогенеза. Более глубокие и точные данные относительно этого явления определят реальные пути решения проблемы. Среди множества причин эмбриональной смертности особое место отводится генетическим и микробиологическим факторам (Соколовская ИЛ, 1968). Однако до сих лор нет достаточной ясности в механизмах действия этих факторов. В частности, неизвестно, в какой мере эмбриональная выживаемость связана с числом предшествующих опоросов у маток.

Исследования последних лег, подтвердившие реальность переноса в ооцнты экзогенных нуклеиновых кислот сперматозоидами (Lavitrano М. et. al.,1989; Gondolfi F. et. al,; Arezzo F., 19S9; Hochi S., et al., 1990; Perez A. et. a!., 1991; Кузнецов A.B., 1992; Кузнецова И,В. и др. 1993; Багиров ВА. 1996), навели на мысль, что одной из причин эмбриональной смертности у животных может быть экспрессия в зиготах чужеродной генетической (эюлрзгенетической) информации, занесенной сперматозоидами в процессе оплодотворения, что было показано в опытах с кроликами (Кононов В.П., Багиров В.A., J996).

В процессе технологической обработки семени (разбавление, охлаждение, сохранение in vitro), целостность плазматических мембран сперма-

ЦНБ МСХА

. фонд научной литературы

тозоидов может нарушаться полностью или частично с последующим восстановлением. Вместе с этим, & семя нередко вносится чужеродная генетическая информация с микрофлорой, из отмирающих эпителиальных клеток и других источников. Антимикробные факторы, естественные или искусственно вносимые в виде антибиотиков, сульфаниламидных препаратов и др., губительно действуя на микрофлору семени, освобождают огромное количество нуклеиновых кислот микрофлоры. Возможно, высокая активность пуклеаз в семени (Ро1ак<тЫ К.Ь., Корш М., 1982) - эвояюциоино выработала как средство устранения этих факторов и соответственно причин эмбриональной смертности.

Цель и задачи исследования.

Целью наших исследований было изыскание резервов в реализации приемов повышения уровня воспроизведения путем сокращения эмбриональных потерь. Для достижения этой цели предстояло решить следующие задачи:

1. Изучить динамику проявления репродуктивной функции свиноматок и результативность осеменения, в частности уровень эмбриональной выживаемости, качество приплода в связи с возрастом и особенностями технологического цикла.

2. Определить естественную активность нуклеаз в натквном и разбавленном семени.

3. Выяснить действие разбавления семени различными средами на сохранение в нем нуклеаз, на абсолютный показатель выживаемости живчиков вне организма.

4. Провести экспериментальные исследования эффективности искусственного осеменения свиней семенем, разбавленным средами, обеспечивающими различную нуклеазную активность и эмбриональную выживаемость.

5. Изучить возможность сохранения естественной активности нуклеаз в семени хряка, как средства устранения чужеродной генетической информации.

Научная повита. Впервые выяснено, что в условиях крупных промышленных свиноводческих комплексов более половины перегулов в стаде (52%) происходит вследствие эмбриональных потерь. Сохранение нук-леазной активности в жидкой части семени при его разбавлении средами, tie связывающими ионы щелочноземельных металлов (Са*"\ Mg**), способствует не только сокращению эмбриональных потерь, но и повышению постэмбриональной выживаемости поросят, а также скорости их роста.

Практическая значимость работы. Использование естественной плазмы в качестве разбавителя позволяет улучшить эффективность воспроизведения за счет повышения оплодотворяемостн на 9%, и сохранности поросят на 7%, а также снизить затраты на проведение искусственного осеменения за счет использования в качестве разбавителя натуральной плазмы семени, исключающего закупку синтетической среды.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на ежегодных отчетах лаборатории биотехнологии и генетики ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института свиноводства (ВНИИС), на VHI-ой Международной научно-практической конференции «Перспективы развития свиноводства в XXI веке» (2001 г., н. Быково), на Международной научно-практической конференции «(Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» (2002 г., п. Быково).

Основные положения, выносимые на защиту.

Материалы исследований по динамике проявления репродуктивной функции свиней в течение технологического цикла.

Экспериментальные данные по результативности искусственного осеменения свиней разбавленным семенем хряков с различной нуклеазной активностью.

Публикация результант исслсдоианий.

По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем работы. Диссертация наложена из 101 странице, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материал и методы исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы и (фактические предложения, список литературы, который включает 213 источников. Работа включает 21 таблицу и 12 рисунков,

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в Лаборатории биотехнологии и 1-енетики ШУ Всероссийского научно-исследовательского института свиноводства (ВНИИС) Российской академии сельскохозяйственных наук (РАСХН), на кафелре воспроизведения, искусственного осеменения и'трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных, Российской академии менеджмента в животноводстве (РАМЖ), в ЗАО "Кузнецовский комбинат" в условиях промышленного производства свинины.

Для проведения экспериментов группы животных формировали по принципу аналогов с учетом породности (крупная белая, СМ — специализированная мясная) возраста, живой массы, числа опоросов, предыдущей продуктивности свиноматок: оплодотворяем ости, многоплодия, длительности подсосного и непроизводительного периодов, энергии роста и сохранности поросят.

Условия содержания и ухода за подопытными животными в процессе всего экспериментального периода соответствовали технологическим требованиям производства свинины на крупных промышленных комплексах, а сами животные находились в общем технологическом потоке.

Исследование проводили по схеме, представленной на рисунке 1.

Выяснение величины и возможных причин эмбриональной смертности у

свиней

Анализ сроков перегулов после осеменения, как метод определения эмбриональной смертности

Выяснения естественной нуклеазлой активности плазмы семени

=*_

Изучение действия разных разбавителей на биологическую полноценность сперматозоидов в связи с их влиянием на нук-леазную активность плазмы семени

_;_х_

Выживаемость и оплодотворяющая способность семени после разбавления различными средами

Стандартной средой 1"ХЦС> ингибирую-щей нуклеазы

1% раствором хлористого натрия, снижающим активность нуклеаэ кратно степени разбавления

Натуральной плазмой семени, сохраняющей естественную активность пук-леаз _

Рис. I. Общая схема проведения исследований

Для выяснения средней оплодотворяемости маток и неличины пре-каталыгых потерь был проведен биометрический анализ по 11489 опоросам в связи со сроками пере гулов после осеменения.

Осеменение маток проводили по технологии, описанной в Инструкции по искусственному осеменению свиней. М., 1976.

Семя хряка после органолептической оценки исследовали но трем показателям: объем эякулята, подвижность и концентрация сперматозои-

до». К дальнейшей обработке и использованию допускались эякулята объемом не менее 100 мл.

Концентрацию сперматозоидов в семени определяли по оптической плотности при помощи фотоэлектроколориметра (ФЭК-57) по общепринятой методике.

Для разбавления спермы были использованы разбавители, различающиеся по степени подавления активности нуклеаз в семени. Стандартная среда ГХЦС, блокирующая активность нуклеаз путем связывания ионов Са и Мё-1% раствор химически чистого хлористого натрия, понижающий активность нуклеаз лишь путем снижения их концентрации в семени соответственно степени разбавления. Натуральная плазма семени, полученная от хряков, содержащихся в этом же хозяйстве, сохраняющая активность нуклеаз на уровне неразбавленного семени.

Эякуляты одного или нескольких хряков разделяли на три равные части. Каждая часть исходного семени была разбавлена в соотношении 1:2 средами:

1) средой ГХЦС, где нуклеазная активность была подавлена компонентами среды (ЭДТА, цитрат натрия), связывающими иоггы Са и

2) изотоническим раствором хлористого натрия, где разбавлением концентрация нуклеаз была снижена в 3 раза;

3) естественной плазмой семени, сохраняющей естественную нуклеазную активность в семени.

В лабораторном опыте определяли содержание ДНК в нативных сперматозоидах до и после инкубации разбавленного семени. При этом использовали разные разбавители семени с рН=*7: 1) среда, включающая анионы ЭДТА и цитрат натрия, которые, связывая Са" и Мз++, ингибиру-ют нуклеазы и 2) изотонический раствор гликокола, сохраняющий нуклеа-зы активными.

Для выяснения ДНК-азнон активности плазмы семени хряков применяли методику, где и качестве субстрата использовали убитых сперматозоидов. Для этого сперматозоида отделяли от плазмы центрифугированием семени, убивали их обработкой 96° этанолом, трижды отмывали 1% раствором хлорида натрия. Затем сперматозоиды инкубировали при 37*С в течение 4 часов, как в присутствии плазмы, так и без нее, альтернативно в двух буферах: трис-хларидном при рН=7 и ацетатном при рН=5,б, Во всех образцах определяли концентрацию ДНК до и после инкубации. Для определения ДНК использовали методику Шмидта-Тангаузера н модификации Цанева Р.Г. и Маркова Г.Г. (I960). Особенность этой методики состоит в том, что она выявляет ДНК сколь угодно малой полимерности, исключая лишь отдельные нукпеотнды.

Оценку выживаемости сперматозоидов вне организма проводили после соответствующего разбавления спермы в соотношении 1:2 испытываемыми средами ГХЦС, изотоническим раствором N&C1 и плазмой семени. Образцы разбавленной таким образом спсрмы хранили при 1 6-18"С в специальном термостате. Активность сперматозоидов оценивали под микроскопом но общепринятой методике ежедневно в одно и то же время. Вычисляли абсолютный показатель выживаемости сперматозоидов и сравнивали его по группам.

Семенем разбавленным испытуемыми средами, осеменяли свиноматок, выбранных в состоянии охоты. Спустя 7 дней после осеменения маток постоянно проверяли на проявление охоты и не повторивших ее переводили в цех глубокосупоросных. Перегулы учитывали на протяжении 4 месяцев после осеменения.

Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам (Меркурьева и др., 1991). Расчет средних значений (X) и стандартных отклонений (о) в выборках веян с использованием программы Microsoft Excel, Стандартное отклонение для признаков, выраженных в про-

центах находили по формуле с=^/(р*ч)» гл® Р и Ч - частоты встречаемости признаков, выраженные в процентах. Ошибку средней находили по формуле где п - число значений признака. Достоверность разницы между признаками определяли на основании сравнения коэффициента достоверности (Тц) с коэффициентами ко таблице Стьюдепта.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1, Оценка результативности осеменения свнпоматок разного возраста

В порядке поиска решений проблемы повышения эффективности воспроизводства, целесообразно было выяснить результативность осеменения в стаде свиноводческого комплекса «Кузнецовский комбинат» в связи с возрастом маток. Анализ выявил (табл.1) четкую закономерность -оплодотворяемость маток неуклонно повышается с нарастанием числа предшествующих опоросов. Самая низкая результативность (17,8±0,7% перегулов) была у ремонтных свинок, а самая высокая у маток, имевших наибольшее число предшествующих опоросов, от 7 до 14, (всего 8,б±0,7% перегулов) — разница статистически высоко достоверна (9Д±0,99; 1^=9,3; РХ),999).

Таблица 1

Зависимость результативности осеменения от возраста маток

Число предшествующих опоросов Осеменено маток Супоросных Перегулов во все сроки

число % число %

0 3207 2636 82ДЮ.7 571 17,8±0,7

2125 1808 85,1*13 317 14,9±1,3

Л* 1398 1232 88Л±0,9 166 11,9±0,9

3 1004 909 90,5±0,9 95 9,5*0,9

4-6 2198 1980 90,1 ±0,4 218 9.9±04

7-14 1557 1423 91,4±0,7 134 8,б±0,7

Всего 11489 9988 8<ушй 1501 13,1^3

Традиционная методика определения величины эмбриональной смертности включает убой определенного количества осемеиснных маток, вымывание из половых путей оплодотворенных н неоплодотворенных ооцнтон и сопоставление их числа с количеством родившихся поросят в альтернативной группе маток. Однако, опыт показывает, что при использовании эгой методики трудно получить однозначный ответ, поскольку сравнение числа оплодотворенных оошггоп сопоставляется с числом рожденных поросят на разных группах животных, порой существенно отличающихся по воспроизводительным способностям. Усреднить значения за счет увеличения выборки при этом не представляется возможным в подавляющем большинстве случаев, поскольку по хозяйственным соображениям убой осемененных маток — действие экономически чрезмерно убыточное.

В связи с этим мы решили использовать метод, основанный на сроках нерегулов маток после осеменения. Предварительно был проведен анализ но этому показателю на большом поголовье — 11489 осемененных маток, всех и в разрезе возрастных групп.

Как видно из данных рисунка 2 и таблицы 2, наибольшее число маток перегуляли в сроки 20-30 дней после осеменения. Причем в этот период выявляются два четких пика: первый в пределах 17-22 дня, 31% маток, второй - 23-33 дня, 34,8% маток. Первый пик отражает количество маток, перегулявших спустя натуральный половой цикл, второй - удлиненный цикл. Совершенно очевидно, что в нервом случае были матки, не имевшие оплодотворенных овоцигов, во втором — имевшие зачатие, но развитие зародышей прервалось на самых ранних стадиях.

Кроме того, небольшая часть маток пере!уляла вскоре после осеменения — спустя 7-16 дней. Очевидно, ото были животные, которые имели явное нарушение воспроизводительной функции. Вероятнее всего у этих маток имело место перерождение фолликулов в яичниках в фолликулярные кисты.

Пик, отражающий сроки перегулов 34-44 дня, т.е. 2 нормальных цикла, трудно отнести к животным, потерявшим эмбрионов в результате эмбриональной смертности. Поскольку на такой стадии эмбрионального развития гибель эмрионов - резкое явление. Тогда как в нашем случае таких маток было довольно много—16,1%. Очевидно этих животных следует отнести к трудно оплодотворяющимся, у которых первый пере гул был попросту не замечен, но после второго бесплодного цикла они были выявлены в состоянии охоты.

И, наконец, перегулм в более поздние сроки, после 44 дней, скорее всего, отражают маггок с нл одной смертностью. Это могли быть прерывания сулоросности вследствие травм и заболеваний. Таких животных было 17,4%.

Суммируя животных, не имевших оплодотворений, 31 + 16,1 = 47,1% и потерявших супоросностц 34,8 + 17,4 = 52,2%, можно сделать заключение, что среди перегулявших маток примерно половина не имела оплодотворений, а у второй половины оплодотворение было, но супорос-

ность прервалась из-за пренатальной смертности, произошедшей на разных стадиях эмбрионального развития.

Заметно явное смешение сроков перегулов в связи с возрастом свиноматок. Если у ремонтных наибольшее число перегудов было в срок 17-22 дня после осеменения, то есть в основном в результате отсутствия оплодотворений, то по мере увеличения числа опоросов большинство перегулов все больше смешалось на более поздние сроки, чем один цикл, !>го значит, что с возрастом маток потеря результативности »се больше зависит от эм-* бриональной смертности.

Таблица2

Распределение свиней но срокам перегулов после осеменения

Показатели Число прел-гаествукшшх опоросов Всего Сроки после осеменения дней

7-16 17-22 23-33 34-44 45 и >

Число перегулов 0 571 4 200 164 104 99

% от общего 100 0,7 35 29 18 17

Число нерегулов 1 317 2 102 108 51 54

% от общего 100 0,6 32 34 16 17

Число иерегулов 166 1 47 65 26 27

% от общего 100 0,1 28 39 16 16

Число пере^лоь 3 95 1 31 37 12 14

*в от обшею 100 1 33 39 13 15

Число перегулов 4-6 218 1 55 87 28 47

% от общего 100 0,5 25 40 13 22

Число перегулов 7-14 134 0 31 62 21 20

% от обшего 100 0 23 46 16 15

Число перегулов Все возрасты 1501 9 466 523 242 261

% от общего 100 0,6 31,0 34.8 16,1 17,4

3.2. Нуклеазнан активность плазмы семени

В свете исследований последних лег, проведенных на различных видах млекопитающих (Lavitrano М., et. al,, 1989; Gondolfi F., et. al.; Arczzo F., 1989; Hochi S., et al., 1990; Perez A., et. al., 1991; Кузнецов A.B., 1992) чужеродная генетическая информация в виде генных конструкций может за-

носиться сперматозоидами в процессе оплодотворения в ооцнты и даже включаться в пронуклеусы. Попавшая в зиготы чужеродная генетическая информация может экснрессировать н вызывать нарушения п развитии эмбрионов вплоть до полной их гибели, что показали специальные опыты с кроликами (Кононов В.П., Багиров В.Л., 1996).

Для ответа на поставленный нами вопрос: предотвращают ли нук-леазы плазмы семени возможный -иное чужеродной генетической информации в сперматозоиды хряков и соответственно раннюю эмбриональную смертность, обусловленную ее экспрессией в зиготах, прежде всего, необходимо было убедиться в активности этих ферментов в плазме семени этого вила животных. Результаты исследований нуклеазной активности плазмы семени приведены в таблице 3.

Таблица 3

Изменение содержания ДНК убитых сперматозоидов при инкубации «условиях активности нейтральной и кислой ДНК-аз

Иссле дуемый фермент рН ин-кубани-онной среды Содержание Содержание ДНК в навеске после инкубации (мг)

ДНК в с плазмой семени без плазмы

навеске до инкубации <мг) мг/ сперматозоидов в%%к исходному мг/ сперматозоидов в %% к исходному

ДНК-аза 1 7,0 3,4 2*5 74 3,4 100

ДНК-аза2 5,6 3,2 3,1 97 3,2 100

Результаты, приведенные в таблице 4 показывают, что инкубация мертвых сперматозоидов в присутствии плазмы семени вызывает существенное снижение содержания ДНК при нейтральной реакции среды. Ото означает, что наша гипотеза о возможности деполимеризации ДНК до отдельных иуклелтидов в присутствии плазмы семени подтвердилась.

Таблица 4

Сохранность ДИК в «отмен»« сперматозоидах а связи суаювиями инкубации в присутствии естественной плазмы семени

Среда инкубации Содержание ДНК в сперматозокдах(мг/104 клеток) после инкубанин при 37 С в течение, (часов)

0 3 6

Среда, содержащая ЭДТА и цитрат 3,04*0,03 3,06±0,04 3,00±0,12

2,5% раствор гли-кокола 3,07±0,05 2,85+0,06 2,85±0,08

Как показывают данные таблицы 4, инкубация живых сперматозоидов в среде, содержащей компоненты, денонсирующие Сам и Mg", не привела к потере ДНК в них. Вместе с тем, если инкубацию проводили в среде, где Са" и Mg*~ не были связаны, наблюдалось заметное снижение содержания ДНК уже через 3 часа инкубации, очевидно вследствие денолимерн-зующего действия нуклеаз плазмы семени. Следовательно, среды, содержащие компоненты, связывающие активные центры нуклеаз (Са" и Mg+V) предотвращают деполимеризацию ДНК.

В процессе техловошческой обработки семени - разбавлении, охлаждении, сохранении in vitro целостность плазматических мембран сперматозоидов может нарушаться полностью или частично с последующим восстановлением. Вместе с тем, в семя нередко вносится чужеродная генетическая информация, вышедшая в окружающую среду из разных источников. Естественные и искусственно вносимые антимикробные факторы и виде антибиотиков, сульфаниламидных и других препаратов, губительно действуя на микрофлору семени, освобождают большое количество нуклеиновых кислот из погибших микробом. В определенных условиях появляется возможность проникновения этой чужеродной информации в сперматозоиды и последующего заноса ее в ооциты при оплодотворении.

Однако разбавление семени уменьшает концентрацию нуклеаз пропорционально степени разбавления и снижает их активность в связи с ингибн-

рующнм действием компонентов сред, связывающих ионы калышя и магния - активные центры этих ферментов. Все это вместе взятое может обуславливать присутствие в семени н на сперматозоидах чужеродной генетической информации и последующий занос ее в ооциты при оплодотворении, что может стать причиной эмбриональной смертности.

3.3. Влияние впгибпровання нуклеаз в семени на биологическую полноценность сперматозоидоп

Дня ответа на поставленный выше вопрос мы сравнили действие на биологическую полноценность сперматозоидов разбавителей семени полностью или частично подавляющих нуклеазную активность плазмы семени.

33.1. Выживаемость сперматозоидов в разных разбавителях

Оценку выживаемости сперматозоидов вне организма проводили после соответствующего разбавления расщепленных на три части эякулятов в соотношении 1:2 испытываемыми разбавителями. Вычисляли абсолютный показатель выживаемости сперматозоидов и сравнивали его по группам.

Анализ лабораторных исследование, полученных в ходе проведения эксперимента, показывает, что подвижность сперматозоидов в натианом и разбавленном той или иной средой семени сразу после разбавления была совершенно аналогичной.

Таблица 5

Выживаемость сперматозоидов вне оргаиита в различных разбавителях семени

Среда разбавитель Степень разбавления семя: среда Подвижность свежевзятого семени (балл.) Абсолютный показатель выживаемости Б

ГХЦС 1:2 8 6961

1%ЫаС1 1:2 8 348

Плазма семени 1:2 8 288

Нативное семя - 8 264

Характеризуя выживаемость сперматозоидов вне организма при 16 -18°С в использованных разбавителях следует отметить, что по этому показателю все они сильно различаются между собой (табл.5). 'Гак нативное семя и разбавленное плазмой семени, имеют примерно одинаковый и относительно низкий абсолютный показатель выживаемости 264 — 288. Семя хряка, разбавленное ГХЦС — средой, обладает наибольшей выживаемостью, в 3 раза более высокой: абсолютный показатель выживаемости составляет 696. Промежуточное положение по атому тесту занимает семя, разбавленное изотоническим раствором хлористого натрия, при этом его абсолютный показатель в два раза ниже аналогичного показателя семени, разбавленного ГХЦС - средой.

Однако выживаемость — недостаточный показатель биологической полноценности сперматозоидов, поскольку отражает лишь энергетическую и моторную функции, без которых сперматозоиды не могут произвести оплодотворение и эмбриональное развитие. Для осуществления главных последних функций сперматозоидам необходимы другое нормальные характеристики, не отражаемые подвижностью или выживаемостью. Это и целостность акросомы и содержащегося в ней фермента — гиалуронилазы, необходимой для рассеивания лучистого венца на первом этане оплодотворения, и сохранность фермента второго этапа оплодотворения — прохождения прозрачной оболочки ооцига, и сохранность факторов капацитздни и акросомной реакции и других факторов для осуществления множества функций. В связи с этим окончательное суждение о биологической полноценности сперматозоидов можно сделать лишь по конечным результатам осеменения — получению полноценного потомства.

3.2.2. Влияние разбавителей на результаты «семеисиня

Таблица б

Действие сред на результаты осеменения свиноматок свежевзятым

семенем

Разбави тель Осеменено маток Перегулов, позднее, чем через 21 день после осеменения Опоросив шихся маток Получено живых поросят

число % всего на 1 опорос на осемененную матку

число %

ГХЦС 40 7V 18*6 32 80±6 343 10,7±0,4 8,6

l%NaCl 36 2 6±4 28 78±6 287 10,3*0,5 7,9

Плазма семени 36 1* 3±3 32 89±5 319 10,0±0,5 8,9

*Р=0,92

Анализ результатов осеменения (табл. б) показывает, что процент опоросов от числа осемененных в первых двух вариантах был практически одинаков. Однако в третьей группе маток, где осеменение проводили семенем, разбавленным нзтивной плазмой, видна явная тенденция повышения результативности - процент опоросившихся от числа осемененных был на 9 и 11% выше, чем в I и 2 группах.

Более показательным оказался анализ сроков перегулов после осеменения. Известно, «tro длительность межтечкового периода у свиней находится в пределах 18-21 день. Более продолжительный период означает, что имело место оплодотворение, закончившееся ранней эмбриональной смертностью. Наши результаты в этом плане показывают, что очень высокий процент удлиненных межтечковых интервалов, то есть наибольшая эмбриональная смертность, были в том случае, когда для разбавления семени использовали ГХЦС среду, связывающую Ca** и Mg" и, соответственно, ингибирующую нуклеазы. Это поддерживает нашу гипотезу о возможной причине эмбриональной смертности у млекопитающих — заносе

чужеродной генетической информации сперматозоидами в ооцнг в процессе оплодотворения. Вероятно, присутствие нуклеаз н семени - эволю-ционно выработанное средство зашиты от чужеродной генетической информации.

При использовании в качестве разбавителя естественной плазмы семени проявляется тенденция повышения сохранности поросят в течение 35-дневного подсосного периода как в абсолютном (8,3 поросенка на осемененную матку), так и в процентном (93,0%) отношениях: в группе, где маток осеменяли семенем, разбавленным семенной плазмой эти значения в сравнении с контролем, были 7,4 и 86% соответствен но (табл. 7). При этом, в третьей группе в расчете на одну осемененную матку отнято на 0,9 и 1,5 поросенка больше, чем, соответственно, в 1 и 2 группах. От семени, разбавленного плазмой, были более тяжеловесные новорожденные поросята и масса гнезда в целом (1,43 н 14,6 кг против 1,35 и 14,4 кг), а также масса гнезда, масса одного поросенка при отъеме, и среднесуточный привес поросят: 67,5 кг, 7,3 кг и 169г против 66,4; 7,2 и 166, соответственно н контроле (табл. 8). Вероятно, защит сперматозоидов от чужеродной генетической информации путем сохранения в семени нуклеазной активности положительно отражается не только на эмбриональном, но и на постна-тальном развитии поросят.

Таким образом, анализ результатов проведенного эксперимента показал, что лучший результат (по поздним пере!улам, проценту супоросных и опоросившихся маток и особенно сохранности и массе поросят в период подсоса) получен в группе, где маток осеменяли семенем, разбавленным нативной плазмой семени.

Таблица 7

Сохранность поросят в связи с испил ьусм им и средами для осеменения маток

Среда Родилось поросят 1Ь них жизнеспособных Отнято поросят Сохранность

всего на1 опорос всего на1 опорос % всего ' на 1 осе-менненную матку

ГХЦС 373 11.7 343 10,7 91,9 296 7,4* 86±2

ПШаС1 315 11,25 287 10,25 91,1 245 6,8 - 85±5

Плазма семени 352 11,0 319 10,0 90,6 298 8,3* 93±2

*Р>0,95

Таблица 8

Рост подсосных поросят в связи с применяемыми средами Аля осеменения их матерей

Среда Много-' плодпе, □оросят Вес при * рождении, кг. Подсо СНЫЙ пери- Отнято от матки Вес при отъеме, кг. Среднесуточный привес, г.

гнез да поросенка од (дни) гнезда поросенка

ГХЦС 10,7 14,4 1,35 35,3 9,25 66.4 7.2 166

1%ИаС 1 10,25 14,1 138 34,9 8,75 62,1 7,1 164

I 1лазма семени 10,0 14,6 1,43 34,7 9,3 67,5 73 169

Использование в качестве разбавителя свежевзятого семени изотонического раствора ИаС! несколько снижает результативности искусственного осеменения свиноматок в условиях промышленного воспроизводства.

Эксперимент также показал отсутствие прямой зависимости между абсолютной выживаемостью сперматозоидов в испытанных средах и результативностью искусственного осеменения евнноматок свежевзятым семенем, разбавленным этими средами.

Положительный эффект от использования нативной плазмы семени

для его разбавления невольно приводит к мысли о возможности использования такою рода разбавителя в практике искусственного осеменения. Это можно достигнуть, если каждый раз осеменять маток свежевзятым семенем, разбавленным свежеполученной плазмой семени. Эффект от использования в качестве разбавителя естественной плазмы семени складывается главным образом из лучшей сохранности поросят в процессе подсоса на (0,7 поросенка или 7% больше, чем в контрольной группе, Р>0,95).

Плазму семени всегда можно получить на месте от молодых хрячков, которых приучат к салкам на чучело. Известно, что для ремонта стада на каждого хряка-производите.!я готовят ежегодно трех молодых хрячков а полученные эякуляты в этом случае выбрасывают.. Использование плазмы семени от приучаемых хрячков позволит получить больше поросят при одних и тех же затратах.

Для вычисления экономического эффекта от большею количества поросят за счет большей сохранности в подсосный период, необходимо знать себестоимость одного поросенка. Она складывается из затрат на содержание матки в холостой период (в среднем 20 дней), периода супорос-ности - 114 дней, и периода подсоса (в пашем случае 35 дней). Итого 169 дней. Затраты корма на весь этот период составляют 3 кг* 169 длей~507 кг.

Таблица 9

Экономическая эффективность использования для осеменения маток слежевзятого семени, разбавленного естественной семенной плазмой

Источники затрат Разбавление семени Разница в пользу 2-го варианта

1 -й вариант средой пхцс 2-й вариант семенной плазмой

1. Получено поросят к отъему 1000 маток 7400 8300 900

2. Стоимость одного поросенка, РУб. 587 587 -

3. Стоимость всех поросят, тыс. руб. 4343,8 4872,1 528,3

Современная рыночная иена свиного комбикорма в среднем б руб./кг. Соответственно затраты в рублях будут 507*6=3042 руб. Затраты на корма составляют примерно 70% от всех затрат на содержание маток, следовательно общие затраты будут 3042 руб.:0,7=4346 руб. В среднем от маток к отъему получено 7,4 поросенка, значит стоимость 1 поросенка 4346 руб.:7,4=587 руб. (табл. 9).

Итшс, используя разбавление семени натуральной семенной плазмой, можно сэкономить за один опорос 528,3 тыс. руб. на каждой тысяче маток. Если учесть, что от каждой матки в год получают два опроса, при вычислении годового эффекта эту цифру надо удвоить, т.е. годовая эффективность составляет 5283*2=1056,6 тыс. руб. на каждую тысячу опоросов.

4. Выводы.

1. Результативность осеменения: процент опоросов от числа осемененных, выход поросят на осемененную и опоросившуюся матку (многоплодие) повышаются с возрастом, соответственно с 82,2; 7,4 и 9,02 у первоопоросок до 91,4; 10,1 и 11,2 у маток, имевших 6 и более опоросов.

. 2. С увеличением возраста у маток, начиная с четвертого опороса, повышается процент мертворожденных поросят.

3. Судя по длительности межтечкового интервала, более половины перегулов маток в стаде (52,2%) происходит вследствие эмбриональной смертности.

4. Инкубация мертвых сперматозоидов хряка в семенной плазме, содержащей нативные нуклеазы, обеспечивает существенное снижение в них концентрации ДНК.

5. ГХЦС-среда для разбавления семени хряка, содержащая компоненты, денонсирующие активные центры нуклеаз, (Са** и Мв~), в противоположность изотоническому раствору гликохола ингибирует

тиво1 ¡сложность изотоническому раствору гликокола ншибирует нуклеззную активность семени.

6. Использование для разбавления семени хряка сред, обеспечивающих разную выживаемость сперматозоидов вне организма (264..,,696) не вызывает соответствующего различия в оплодогворяюшей способности спермы при осеменении маток свежевзятым семенем (К9±5 -80±6%). Абсолютный показатель выживаемости спермы хряка, неадекватно отражает ее биологическую полноценность.

7. Естественная семенная плазма хряков, используемая для разбавления семени, обусловливает тенденцию повышения оплодотворяем ости, снижения эмбриональной смертности н увеличивает выживаемость полученного потомства в подсосный период.

5. Практические предложения

Для повышения результативности искусственного осеменения свиней предлагаем проводить осеменение маток свежевзятым семенем, разбавленным естественной семенной плазмой. Для получения семенной плазмы рекомендуем использовать семя проверяемых хряков или специально содержащихся для этих целей.

Слисок опубликованных работ

1. Кононов В.П., Зыкунов НЛ., Багнров БА„ Ондар Л.Л. Экстрм-ене-тическая информация как одна из причин эмбриональной смертности у свиней. //Перспективы развития свиноводства в XXI веке. Тез. докл. Меж-дунар, науч.-прак. хонф., посняш. 5-летию соэд. ВНИИС. Быково-Москва — 2001.-С. 131-137.

2. Зыкунов Н.П., Ондар А.А. Взаимосвязь подвижности и выживаемости семени с результативностью осеменения свиноматок. //Перспективы

развития свиноводства в XXI веке. Тез. докл. Междунар. науч.-прак. конф., посвящ. 5-летию созд. ВНИИС. Быково-Москва- 2001. - С. 204-208.

3. Ондар A.A., Зыкунов Н.П. Выживаемость сперматозоидов хряка в различных разбавителях спермы, //Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения Тез. науч.-прак. конф. РАМЖ. Быково. Москов, обл.-2002. - С. 135-138.

4. Зыкунов Н.П., Кононов В.П., Ондар A.A. Чужеродная ДНК как возможная причина эмбриональной смертности. //Свиноводство. - 2003. - №2. -С. 22-23.

5. Кононов В.П., Зыкунов HJL, Ондар A.A. Чужеродная генетическая информация как одна из причин эмбриональной смертности свиней. //Сельскохозяйственная биология - 2003. - №6. - С. 55-57.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник*» ПД № 1-00007 от 25.06.2000 г. Подписано в печать 13.01.2005 Тираж 100 экз. Усл. веч. л. 1,5

Печать авторефератов 730-47-74, 778-45-60