Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетические и эпигенетические особенности генома сперматозоида и их влияние на раннее эмбриональное развитие человека

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетические и эпигенетические особенности генома сперматозоида и их влияние на раннее эмбриональное развитие человека"

Ha npqeax рукописи

Шильникова Евгения Михайловна

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНОМА СПЕРМАТОЗОИДА И ИХ ВЛИЯНИЕ НА РАННЕЕ ЭМБРИОНАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ ЧЕЛОВЕКА

специальность 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 ДПР 2015

Санкт-Петербург 2015

005568027

005568027

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет» и в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д. О. Отта».

Научный руководитель: Член-корр. РАН, з.д.н., д.м.н., профессор

Владислав Сергеевич Баранов, заведующий лабораторией пренатальной диагностики наследственных и врожденных заболеваний человека ФГБНУ «НИИ АГиР им.Д.О. Отта»

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор

Евгений Львович Паткин, заведующий лабораторией молекулярной цитогенетики развития млекопитающих ФГБНУ

«Институт экспериментальной медицины» (г. Санкт-Петербург)

Кандидат медицинских наук Вячеслав Борисович Черных, старший научный сотрудник лаборатории генетики нарушений репродукции ФГБНУ «Медико-генетический научный центр» (г. Москва)

Ведущее учреждение: ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской генетики», г. Томск

Защита диссертации состоится « Я » г. в '^исов на заседании

совета Д 212.232.12. по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, СПбГУ, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского Государственного университета и на сайте Санкт-Петербургского государственного университета (http://spbu.ru/).

Автореферат разослан Ъ&^Ь&^О 15 1

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 212.232.12 доктор биологических наук

Людмила Андреевна Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень разработанности проблемы

Сперматогенез человека - сложный многоэтапный процесс, в результате которого путем последовательных делений и преобразований из диплоидных клеток формируются высокоспециализированные гаплоидные половые клетки - сперматозоиды, основной функцией которых является хранение и транспортировка наследственной информации. К изменению морфо-функциональных характеристик сперматозоидов и структурно-функционального состояния их генома могут приводить возникающие на любом из этапов сперматогенеза нарушения, вызванные как наследственными, так и экзогенными факторами.

Среди наследственных факторов выделяют нарушения кариотипа, в том числе числовые и структурные аномалии. Хромосомные перестройки нарушают процесс нормальной конъюгации и синапсиса хромосом, что приводит к блоку сперматогенеза, и, соответственно, снижению спермопродукции. В то же время у носителей структурных аномалий кариотипа повышена частота образования несбалансированных гамет, которые могут принять участие в оплодотворении, увеличивая вероятность появления эмбрионов с хромосомным дисбалансом. Другой причиной снижения фертильности у мужчин являются микроделеции хромосомы Y в локусе AZF. Продукты более 2000 генов обеспечивают дифференцировку и созревание мужских половых клеток. Установлено, что от 10% до 50% случаев нарушения сперматогенеза вызвано изменениями кариотипа пациента и/или мутациями отдельных генов (Ferlin, 2012).

Немаловажную роль в нарушении сперматогенеза играют неблагоприятные факторы внешней среды, курение, ожирение, стресс, которые приводят к образованию активных форм кислорода (АФК) в клетке. Последние, в свою очередь, напрямую связаны с процессом активного деметилирования ДНК, являющегося одним из основных эпигенетических механизмов регуляции функции генов. В процессе активного деметилирования происходит превращение 5-метилцитозина в цитозин. При этом в ходе последовательных биохимических реакций образуются кислородсодержащие производные 5-метилцитозина, в том числе 5-гидроксиметилциозин. Для изучения гидроксиметилирования ДНК разработан ряд подходов, одним из которых является иммуноцитохимическая детекция 5-гидроксиметилцитозина с помощью высокоспецифичных антител. Использование иммуноцитохимического подхода для оценки эпигенетического статуса генома особенно целесообразно при работе с отдельными клетками, в том числе половыми.

Другой мишенью АФК является ДНК половых клеток. Действительно, 20% случаев идиопатического бесплодия обусловлено нарушением целостности ДНК сперматозоидов (SCSA, 2005). Одним из основных методов оценки фрагментации ДНК сперматозоидов является метод

флуоресцентного мечения одно- и двунитевых разрывов ДНК (TUNEL -Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick-End Labelling). Фрагментация ДНК сперматозоида влияет на первые деления дробления зародыша, частоту имплантации и наступления беременности (Shamsi et al., 2008). Вероятно, нарушение целостности ДНК сперматозоида может приводить к изменению его морфологии. В связи с этим, изучение взаимосвязи между морфологическими характеристиками сперматозоидов и структурно-функциональными и эпигенетическими особенностями их генома является актуальным. Выявление такой взаимосвязи важно для направленного отбора сперматозоидов в условиях искусственного оплодотворения и реализации программ вспомогательных репродуктивных технологий. Тем более что нарушение сперматогенеза - одна из основных причин бесплодия, частота которого во многих странах, в том числе и в России, достигает 15% (WHO, 2010). При этом вклад мужского фактора в этиологию бесплодия составляет 50-60% (WHO, 2010), и в последние десятилетия отмечается снижение основных показателей спермограммы -концентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов (Slama et al., 2002; Cooper et al., 2010; Jorgensen et al., 2011; Rolland et al., 2013).

В связи с этим цель настоящего исследования - оценить взаимосвязь между морфо-функциональными характеристиками сперматозоидов, целостностью их ДНК и уровнем ее гидроксиметилирования, а также эффективностью оплодотворения, способностью к развитию эмбрионов, полученных от пациентов с нормальным и аберрантным кариотипами. В рамках этой цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести анализ кариотипа пациентов с нарушением фертильности.

2. Провести сравнительный анализ уровня фрагментации ДНК сперматозоидов у пациентов с различными нарушениями параметров спермограммы.

3. Проанализировать взаимосвязь между степенью фрагментации ДНК сперматозоидов и преобладанием различных форм аномалий их головок.

4. Проанализировать долю сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациентов с нарушениями конституционального кариотипа.

5. Сопоставить уровень фрагментации ДНК с уровнем гидроксиметилирования генома сперматозоидов у пациентов с нарушением фертильности.

6. Оценить влияние нарушения целостности ДНК сперматозоидов на эффективность оплодотворения и развитие эмбрионов, полученных с помощью вспомогательных репродуктивных технологий.

Научная новизна. Впервые установлено, что для носителей числовых и структурных нарушений кариотипа характерно варьирование как уровня фрагментации ДНК сперматозоидов, так и параметров спермиологического анализа. Уверенно доказано, что увеличение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК характерно для пациентов со сниженным содержанием морфологически нормальных сперматозоидов. Кроме того, выявлен морфологический маркер нарушения целостности ДНК

сперматозоидов - вакуолизированная головка. Впервые показано, что высокий уровень фрагментации ДНК соответствует высокому уровню содержания гидроксиметилированных сперматозоидов в эякуляте. Доказано, что нарушение целостности ДНК сперматозоидов не снижает эффективности оплодотворения, но приводит к нарушению развития эмбрионов при культивировании in vitro.

Теоретическая и практическая значимость. Настоящее исследование выполнено в рамках изучения взаимоотношения генотип -фенотип при формировании сложных признаков. Результаты настоящего исследования вносят существенный вклад в понимание взаимосвязи между морфологическими характеристиками сперматозоидов и структурно-функциональными и эпигенетическими особенностями их генома.

Понимание этой взаимосвязи позволит осуществлять направленную селекцию сперматозоидов, используемых для оплодотворения с целью повышения его эффективности и вероятности развития нормальных эмбрионов. Результаты проведенного исследования могут быть использованы для разработки алгоритма обследования пациентов с нарушением фертильности, что особенно актуально для пар, прошедших ряд неудачных попыток ЭКО.

Положения, выносимые на защиту:

1. Частота аномалий кариотипа у пациентов с нарушением фертильности, нуждающихся в применении вспомогательных репродуктивных технологий, составляет 10,78%.

2. Нарушение фертильности у мужчин в 70% случаев обусловлено снижением показателей спермиологического анализа, проведенного в соответствии с нормативами ВОЗ 2010 года, и в 95% случаев — в соответствии с нормативами ВОЗ 1999 года.

3. Увеличение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК характерно для пациентов со сниженным содержанием морфологически нормальных сперматозоидов в эякуляте.

4. Вакуолизированная форма головки сперматозоида является морфологическим маркером нарушения целостности его ДНК.

5. Для носителей числовых и структурных нарушений кариотипа характерен широкий диапазон варьирования как параметров спермиологического анализа, так и уровня фрагментации ДНК сперматозоидов в эякуляте.

6. Для пациентов, в эякуляте которых повышено содержание сперматозоидов с фрагментированной ДНК, характерен высокий уровень содержания 5-гидроксиметилированных сперматозоидов.

Апробация работы. Результаты работы опубликованы в виде пяти статей (три из них - в отечественных изданиях, рекомендованных ВАК, две - в международных научных рецензируемых журналах). Материалы диссертации были представлены на различных международных конференциях и семинарах, в том числе 5-ом конгрессе по репродуктивной медицине WARM (Москва, Россия, 2010 г.), 8-ой конференции по цитогенетике человека ЕСА (Порто, Португалия, 2011 г.), 10-ой конференции

средиземноморского общества репродуктивной медицины MSRM (Будва, Черногория, 2012 г.), 3-ей конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых» (Санкт-Петербург, Россия, 2012 г.), 46-ой конференции по генетике человека ESHG (Нюрнберг, Германия, 2012 г.), 22-ой конференции репродуктивной ассоциации репродукции человека (Геленджик, Россия, 2012 г.), первый национальный форум «Репродуктивное здоровье как фактор демографической стабилизации» (Ростов-на-Дону, Россия, 2012 г.), 47-ой конференции по генетике человека ESHG (Париж, Франция, 2013 г.), первом российско-азиатском уро-андрологическом конгрессе (Санкт-Петербург, Франция, 2014 г.), 17-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, Россия, 2014 г.), 48-ой конференции по генетике человека ESHG (Милан, Италия, 2014 г.).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материал и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы (274 источника), приложение (содержит 10 таблиц). Работа содержит 15 таблиц и 16 рисунков.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования служили образцы периферической крови 204 пациентов и 12 доноров спермы, направленных на кариотипирование, образцы эякулята 274 пациентов и 12 доноров спермы отделения ВРТ НИИ АГиР им. Д. О. Отта.

Лимфоциты периферической крови культивировали по стандартной методике с модификациями (Кузнецова и др., 1999). Идентификацию QFH-окрашенных метафазных хромосом проводили руководствуясь стандартами международной цитогенетической номенклатуры хромосом человека (ISCN, 2009). Гибридизацию с зондами проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя зондов (Vysis, Abbott Molecular, США). Спермиологический анализ проводили согласно рекомендациям ВОЗ (WHO, 1999). Препараты из эякулята готовили по методике Кузнецовой с соавторами (Кузнецова и др., 1990). Флуоресцентное мечение одно- и двунитевых разрывов ДНК сперматозоидов проводили методом TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick-End Labelling) (Negoescu et al., 1996). Детекцию 5-метилцитозина (5-МеС) и 5-гидроксиметилцитозина (5-hMeC) на препаратах проводили с помощью специфических антител (Efimova et al., 2015).

Анализ препаратов проводили с помощью микроскопов: ЕС ЛЮМАМ-РП011 (ЛОМО) с объективами СХ 20х/0,45 и М-флюар ЮОх/1,30 с тубусной оптикой с линзами от 1,1х до 1,6х, черно-белой CCD камерой накопления сигнала (Chiper); Zeiss Axiostar Plus, оборудованного объективами Zeiss А-plan 1 Ox,0,25 и lOOx/1,25 oil; LEICA DM LS, оборудованного объективами FLUOTAR 20х/0,40 и 100х/1,30-0,060, автоматической фотонасадкой,

цветной камерой Leica DFC Twain. Для получения фотоизображения использовали программное обеспечение Leica DFC Twain. Для анализа видеоизображения использовали программное обеспечение Adobe Photoshop CS5. Отбор индивидуальных сперматозоидов проводили с помощью микроскопа LEICA DMI 3000В, оборудованного объективами 5х, 10х, 20х/0,4, 40х/0,60, L63x и микроманипулятором Narishige IM-6.

Данные эмбриологических протоколов, а также результаты предимплантационной генетической диагностики любезно предоставлены сотрудниками ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д. О. Отта».

Статистический анализ данных проводили на ПК с помощью программ StatGraphics и GraphPadSoftware.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Частота и спектр аномалий кариотипа у пациентов с нарушением фертильности

В результате анализа кариотипа 204 пациентов, обратившихся в отделение вспомогательных репродуктивных технологий НИИ АГиР им. Д. О. Отта в связи с бесплодием, у 22 выявлены числовые и структурные аномалии (Рис. 1 и 2).

структурная перестроГтха половых хромосом. 4,55%

дополнительный материал на '<

хромосоме 4 55% - \ сверхчислеюше маркерные хомосомы,

\ \ 18.17%

рештрокные траяслокашш 22.72%

дисомля Y. 4.55% мозаичный вариант дисошш X, 4.55%

сочетанная чисяовая и структурная аномалия подовых хромосом, 4.55°о

инверсии. 13,64%

робертсоновские транслокашш, 22.72%

Рисунок 1. Частота и спектр аномалий кариотипа у мужчин с нарушением фертильности

Аномалии кариотипа выявляют в 2 - 19% случаев нарушения фертильности, при этом числовые аномалии встречаются чаще, чем структурные (Shi and Martin, 2001; Ferlin et al., 2006, Martin, 2008; Huleyuk et al., 2010). В нашем исследовании структурные аномалии, напротив, встречались чаще, чем числовые (п=15 и п=7, соответственно), что, скорее всего, связано с особенностями выборки: носители структурных аномалий, в отличие от носителей числовых, не имеют выраженных фенотипических особенностей и направляются на кариотипирование только при возникновении репродуктивных проблем.

В отдельных случаях, для уточнения результатов кариотипирования и локализации точек разрыва, был проведен ряд дополнительных исследований с использованием флуоресцентной гибридизации in situ.

Рисунок 2. Метафазные хромосомы из лимфоцита периферической крови пациента с

кариотипом

46,XY,inv(4)(p 12;q21 ),inv( 10)(р 11 ;q21) после QFH/AcD окрашивания (ув. 10x100)

i V m\( 10) И) imi Hi) J,

и .. ..

4 in\|4) f

• «■ "Zi '

К. С у

tv*.» * r

% f f

Л

A-

Таким образом, у мужчин с нарушением фертильности частота аномалий кариотипа составила 10,78% с преобладанием структурных перестроек хромосом.

Вопрос о частоте образования эмбрионов с хромосомным дисбалансом в супружеской паре, в которой мужчина является носителем структурных или числовых аномалий кариотипа, остается открытым. В рамках настоящего исследования были проанализированы результаты 8 эмбриологических протоколов с предимплантационной генетической диагностикой, проведенной в НИИ АГиР им. Д. О. Отта. Критериями включения в исследование являлись следующие параметры: нормальный кариотип супруги и ее возраст менее 35 лет, и известный кариотип супруга. В группе пациентов со структурными аномалиями кариотипа отмечено увеличение доли эмбрионов с хромосомных дисбалансом и снижение доли морфологически нормальных эмбрионов на 4 - 5 сутки развития in vitro, что, наиболее вероятно, связано с аномальным кариотипом эмбриона (Рис. 3 и 4).

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

ваш

шшмшшш ■■■■И в

■¡иИ

■ЯП

ssKí-s; %¡

ВИЯ

гщ f

-а.--.

пациенты со структурными аномлаиями хромосом (п-Ц)

пациенты с нормальным кариотипом (п=3)

8 доля эмбрионов с хромосомным дисбалансом доля эмбрионов со сбалансированным кариотипом

Рисунок 3. Соотношение эмбрионов со сбалансированным кариотипом и хромосомным дисбалансом в группах пациентов со структурными аномалиями хромосом и нормальным кариотипом

100% 80% 60% 40% 20% 0%

7ЧЙ1

I: .

16.83

пациенты со структурными аномлаиями хромосом (п=4)

пациенты с нормальным кариотипом (п-3)

Рисунок 4. Доли морфологически нормальных эмбрионов в группах пациентов со структурными аномалиями хромосом и

нормальным кариотипом

2. Фрагментация ДНК сперматозоидов пациентов с нарушением фертильности

Помимо наследственных, к нарушению сперматогенеза приводит влияние негативных факторов внешней среды: инфекционных агентов, физических и химических факторов, токсинов, которые могут вызывать окислительный стресс. В результате этого процесса нарушается окислительно-восстановительный статус клетки, происходит образование АФК, мишенью которых являются липиды и нуклеиновые кислоты. Показано, что действие АФК является основной причиной повреждения ДНК сперматозоидов (Shamsi et al., 2008). В свою очередь, с нарушением целостности ДНК сперматозоидов связано до 20% случаев идиопатического, то есть без видимой причины, мужского бесплодия (SCASA, 2005). В настоящем исследовании с помощью метода флуоресцентного мечения одно-и двунитевых разрывов ДНК - TUNEL - была проведена оценка доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте пациентов с

нарушением фертильности с учетом результатов спермиологического анализа. Показано, что наименьшая доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК характерна как для доноров спермы, так и для пациентов с нормозооспермией, а наибольшая - для пациентов с тератозооспермией (достоверно значимые отличия, критерий Краскела-Уоллиса, р<0,05) (Табл. 1).

Таблица 1. Доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациентов с нарушением фертильности__

Результат спермограммы (нормативы ВОЗ, 1999 г.) Число пациентов (п) Доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК (%)

Нормозооспермия 9 0,39±0,12

Тератозооспермия 53 0,79±0,08

Олигоастенотератозооспермия 11 0,51±0,16

Астенотератозооспермия 13 0,50±0,11

Астенозооспермия 2 1,04±0,28

Олигоастенозооспермия 1 0,1

Олиготератозооспермия 2 0

Доноры спермы (контрольная группа) 12 0,19±0,03

Примечание: тератозооспермия - снижение доли морфологически нормальных сперматозоидов, олигоастенотератозооспермия - снижение концентрации, подвижности и доли морфологически нормальных сперматозоидов, астенотератозооспермия - снижение подвижности и доли морфологически нормальных сперматозоидов, астенозооспермия - снижение подвижности, олигоастенозооспермия - снижение концентрации и подвижности, олиготератозооспермия - снижение концентрации и доли морфологически нормальных сперматозоидов

Спермиологический анализ, проводимый в соответствии с нормативами ВОЗ, является основным методом оценки сперматогенеза. В руководстве ВОЗ 1999 года за норму были приняты следующие показатели спермиологического анализа: концентрация сперматозоидов более 20 млн/мл, подвижность - категории А более 25% (прогрессивно-подвижные сперматозоиды, двигающиеся со скоростью более 25 мкм/с при 37°С), или суммарно категории А и В более 50% (прогрессивно-подвижные сперматозоиды и медленные прогрессивно-подвижные сперматозоиды), доля морфологически нормальных сперматозоидов более 14% от их общего числа в эякуляте (WHO, 1999). В руководстве ВОЗ 2010 года пороговые значения основных параметров спермиологического анализа были снижены. Так, концентрация сперматозоидов - с 20 млн/мл до 15 млн/мл, доля морфологически нормальных сперматозоидов - с 14% до 4% (WHO, 2010). В настоящей работе группы сравнения сформированы согласно нормативам ВОЗ 1999 года, поскольку исследование начато в 2008 году. Интересно отметить, что при использовании новых нормативов ВОЗ 2010 года в 35,1%

случаев одинаковые результаты спермограмм были интерпретированы по-разному (Табл. 2).

Таблица 2. Результаты спермограмм пациентов с нарушением фертильности согласно нормативам ВОЗ 1999 и 2010 годов__

Результат спермограммы Нормативы ВОЗ 1999 г. Нормативы ВОЗ 2010 г.

п % п %

азооспермия 8 3,19 8 3,19

олигоастенотератозооспермия 48 19,12 30 11,95

олигоастенозооспермия 1 0,4 4 1,59

олиготератозооспермия 5 1,99 10 3,98

олигозооспермия 0 0 4 1,59

астенозооспермия 3 1,2 9 3,59

тератозооспермия 125 49,8 83 33,07

астенотератозооспермия 48 19,12 36 14,34

нормозооспермия 13 5,18 67 26,7

ИТОГО (I) 251 100 251 100

Примечание: азооспермия - отсутствие сперматозоидов в эякуляте, олигозооспермия - снижение концентрации сперматозоидов

Таким образом, нарушение фертильности у мужчин в 70% случаев сопровождалось снижением показателей спермиологического анализа, проведенного в соответствии с нормативами ВОЗ 2010 года, и в 95% случаев — в соответствии с нормативами ВОЗ 1999 года.

Изучение сперматогенеза у пациентов с аномалиями кариотипа представляет особый интерес. В настоящем исследовании для носителей числовых и структурных нарушений кариотипа отмечено варьирование всех показателей спермиологического анализа, от нормальных до патологичных. Таким образом, аномалии кариотипа не во всех случаях сопровождаются снижением концентрации сперматозоидов, что вероятно, может быть обусловлено, в том числе, и абортивным апоптозом, при котором половые клетки, в которых процесс программируемой клеточной гибели был запущен, но не до конца завершен, попадают в эякулят. В данной работе для носителей числовых и структурных аномалий кариотипа была проанализирована доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК, которая, как было показано, варьировала значительно, вне зависимости от типа аномалии (Табл. 3).

Таблица 3. Доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациентов с аномалиями кариотипа__

Кариотип Доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК (%)

47,ХУУ 0,2

46,ХУ/47,ХХУ 0,38

46,ХУ,асИ(22)(р11) 0,05

46,ХУ,1пу(7Хр22;я11.2) 2,27

45,ХУ,с1ег(13;14)(Ч10;Ч10) 1,07

45 ,ХУ,(1ег( 13; 14)(я 10;я 10) 0,68

45,ХУ,с1ег(14;21Хя10;я10) 0,34

46,ХУ,«1;5)(р22;д32),1(6;12)(д15;Ч21) 0,45

46,ХУД1;7)(Ч42;р22) 0,09

46,ХУД(6; 19)(р22;д 12) 0,45

В настоящем исследовании проведена оценка морфологии головок эякулированных сперматозоидов. Согласно «строгому критерию Крюгера» выделяют следующие формы головок: нормальная, с небольшой патологией, маленькая, большая, удлиненная, грушевидная, вакуолизированная, аморфная, двойная, точечная, округлая, с патологией акросомы (Кпщег е! а!., 1986) (Рис. 5).

% # #

нормальная с небольшой патологией маленькая большая

9 # *

удлиненная грушевидная вакуолизированная аморфная

0 т

двойная округлая патология акросомы точечная

Рисунок 5. Формы головок сперматозоидов (ув. 10x100)

Было показано, что в эякуляте пациентов с нарушением фертильности наиболее часто встречаются сперматозоиды с аморфной и грушевидной формами головок (Рис. 6).

30%

25% - i

: ;

О % ч.И 1 _

»1 н.''п б м окр ам гр уд ли рак т п/ак

Рисунок 6. Частота встречаемости различных форм головок сперматозоидов в эякуляте пациентов с нарушением фертильности

Примечание: н - нормальная, н/п - небольшая патология, б - большая, м -маленькая, окр — округлая, ам - аморфная, гр — грушевидная, уд -удлиненная, дв - двойная, вак - вакуолизированная, т - точечная, п/ак - с патологией акросомы

Таким образом, грушевидные и аморфные формы головок сперматозоидов можно рассматривать в качестве мажорных форм, характерных для сперматогенеза человека. В таком случае, преобладание той или иной формы головок сперматозоидов редко встречающихся в норме может свидетельствовать об изменении характера спермиогенеза и быть связано с нарушением генома и эпигенома половой клетки.

Наличие связи между морфологическими особенностями сперматозоида и его геномом и эпигеномом представляет большой практический интерес. Так, наличие вакуолей в головке сперматозоида связывают с декомпактизацией ДНК, с нарушением соотношения гистонов и протаминов и разрывами ДНК (Chemes and Rawe, 2003; Boitrelle, 2011; Bartoov, 2003; Boitrelle, 2011; deVos, 2013). Для проверки данного утверждения была проанализирована доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациентов, в эякуляте которых преобладали сперматозоиды с теми или иными патологическими формами головок. Было установлено, что наибольшая доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК характерна для пациентов, в эякуляте которых доминировали вакуолизированные формы головок (достоверно значимые отличия, ANOVA, р<0,05) (Табл. 4). Также между этими параметрами была выявлена положительная корреляция (коэффициент корреляции Спирмена г=0,33, р<0,05) (Рис. 7).

Таблица 4. Доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК при

преобладании определенной юрмы головок сперматозоидов

Форма головки Доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК (%)

Аморфная 0,62±0,07

Грушевидная 0,65±0,13

Вакуолизированная 1,02±0,17

С патологией акросомы 0,46±0,12

g 0 80 § 1 1 £ 60 О JS 5 = 40 а. я а» к = 5 ■-> g- 20 Ж S О § 4 1 0 Рисунок 7. Эмпирические данные и линия регрессии доли сперматозоидов с вакуолизированной формой головки по доле сперматозоидов с фрагментированной ДНК

к О 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 я

- доля сперматозоидов с

фрагментированной ДНК (%)

В настоящей работы также проведен анализ фрагментации ДНК индивидуальных эякулированных сперматозоидов (Рис. 8). С помощью микроманипулятора были отобраны 89 сперматозоидов с нормальной формой головки и 196 - с вакуолизированной. Флуоресцентный сигнал, свидетельствующий о фрагментации ДНК, в сперматозоидах с нормальной головкой обнаружен лишь в одном случае из 89 (1,12%) и в 28 из 196 (14,29%) сперматозоидов с вакуолизированной головкой. Таким образом, доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК среди форм с вакуолизированной головкой оказалась достоверно выше (точный тест Фишера, р=0,0008).

Рисунок 8. Флуоресцентное мечение разрывов ДНК сперматозоидов методом TUNEL. Сперматозоиды с

фрагментированной (флуоресцируют в зеленом спектре) и интактной ДНК (флуоресцируют в синем спектре) (ув. 10x100x0,5)

Таким образом, вакуолизированная форма головки сперматозоида является морфологическим маркером фрагментации ДНК. Поиск маркеров фрагментации ДНК сперматозоидов особенно актуален в связи с бурным

развитием вспомогательных репродуктивных технологий. Несомненно, при выборе сперматозоида для оплодотворения предпочтение отдается морфологически нормальным, однако в случае тератозооспермии, когда в эякуляте присутствуют только аномальные сперматозоиды, вопрос выбора стоит особенно остро.

В настоящей работе была проанализирована взаимосвязь между долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК и долей сперматозоидов, содержащих 5-гидроксиметилцитозин. Основанием для анализа этой взаимосвязи было предположение о влиянии АФК как на возникновение разрывов ДНК, так и на активацию процесса активного деметилирования ДНК с образованием 5-гидроксиметилцитозина.

Для достижения этой цели была проанализирована доля сперматозоидов, содержащих 5-гидроксиметилцитозин, и доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте доноров спермы (контрольная группа) и в эякуляте пациентов с нарушением фертильности. Доля сперматозоидов, содержащих 5-ЬМеС, как в контрольной группе доноров спермы, так и у пациентов с нарушением фертильности, варьировала (от 0,06% до 4,03% у доноров спермы, от 0,3% до 13,89% у пациентов с нарушением фертильности) (Рис. 9).

Рисунок 9. Сперматозоиды из эякулята после окрашивания ОАР1 (А), с помощью антител к 5-МеС (Б) и 5-ЬМеС (В) (ув. 10x100)

По результатам корреляционного анализа была выявлена прямая положительная корреляция между долей сперматозоидов, содержащих 5-гидроксиметилцитозин, и долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК (коэффициент корреляции Спирмена 1=0,52, р=0,0152) (Рис. 10).

а з

§ С о 4 8 и 16 л

'-> «А доля сперматозоидов с ; фрагментированной ДНК (%)

Рисунок 10. Эмпирические данные и линия регрессии доли

сперматозоидов, содержащих 5-ЬМеС, по доле сперматозоидов с фрагментированной ДНК

линия

доли

Таким образом, высокая доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК сочетается с высокой долей сперматозоидов с 5-гидроксиметилированной ДНК.

3. Влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на эффективность оплодотворения и морфологические характеристики эмбрионов, культивируемых in vitro

Вопрос о влиянии фрагментации ДНК сперматозоида на оплодотворение ооцита, ключевые этапы доимплантационного развития, имплантацию и исход программ экстракорпорального оплодотворения остается открытым. Действие АФК является основной причиной нарушения целостности ДНК сперматозоида (Shamsi et al., 2008). Помимо ДНК сперматозоида, мишенью АФК также являются липиды плазматической мембраны. Перекисное окисление липидов приводит к нарушению плазматической мембраны, препятствует акросомной реакции и слиянию плазматических мембран сперматозоида и ооцита при оплодотворении. Нарушение цитоплазматической мембраны сперматозоидов может являться причиной снижения их подвижности и, как следствие, эффективности оплодотворения. Можно предположить, что при оплодотворении методом ЭКО, максимально приближенному к условиям оплодотворения in vivo, эффективность должна быть ниже, поскольку сперматозоиды с фрагментированной ДНК, при условии, что фрагментация обусловлена действием АФК, должны двигаться медленнее вследствие перекисного окисления липидов плазматической мембраны. Вместе с тем при оплодотворении методом ICSI, или внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида, эффективность должна быть выше.

Для оценки влияния фрагментации ДНК сперматозоидов на оплодотворение и морфологические характеристики эмбрионов были проанализированы данные 54 эмбриологических протоколов, в 20 из которых оплодотворение ооцитов проводили методом ЭКО, в 34 — методом внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (метод ICSI).

Эффективность оплодотворения рассчитывали как отношение числа двупронуклеарных зигот к числу полученных ооцит-кумулюсных комплексов. Эффективность оплодотворения оценивали в группах ЭКО и ICSI, отличающихся методом оплодотворения и содержанием сперматозоидов с фрагментированной ДНК: менее 0,35% и более 0,35% (пороговое значение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК у доноров спермы) (Табл. 5).

Таблица 5. Доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК и эффективность оплодотворения в группах ЭКО и ICSI_

Метод Число протоколов (П) Доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК (%) Эффективность оплодотворения (%)

ЭКО 11 0,07±0,02* 64,15±7,59

9 1,24±0,29* 54,51±13,23

ICSI 17 0,1±0,03** 65,23±5,67

17 1,08±0,15** 62,71±6,22

*,** достоверно значимые отличия, критерий Краскела-Уоллиса, р<0,0001

В настоящем исследовании при сравнении эффективности оплодотворения в зависимости от доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК, как при оплодотворении методом ЭКО, так и при оплодотворении методом ICSI, достоверных отличий обнаружено не было (р=0,3977 ANOVA).

В то же время между показателями доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК и долей морфологически нормальных эмбрионов, которую рассчитывали как отношение числа эмбрионов на стадии морулы на 4 сутки развития (Grade 4, Тао et al., 2002) к числу двупронуклеарных зигот, была выявлена отрицательная взаимосвязь (коэффициент корреляции Спирмена г= - 0,51, р=0,0001) (Рис. 11). Вероятно, часть разрывов ДНК сперматозоида может быть репарирована ферментами ооцита вскоре после оплодотворения до стадии 4-8 клеток, когда происходит зиготическая трансформация (MZT, maternal to zygotic transformation) (Braude et al., 1988; Ménézo et al., 2010). В то время как нерепарированные разрывы ДНК сперматозоида могут привести к нарушению работы генома эмбриона и остановке развития на ранних этапах эмбриогенеза.

20 40 60 SO 10(1 доля морфологически нормальных эмбрионов на 4 сутки развития in vitro (%)

Рисунок 11. Эмпирические данные и линия регрессии доли эмбрионов высшего качества по доле сперматозоидов с фрагментированной ДНК

Таким образом, было показано, что увеличение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК не снижает эффективности оплодотворения, но приводит к нарушению развития эмбрионов при культивировании in vitro.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем исследовании установлено, что около 11% мужчин с нарушением фертильности являются носителями числовых и структурных аномалий кариотипа. При этом, для таких пациентов характерно варьирование как уровня фрагментации ДНК сперматозоидов, так и параметров спермиологического анализа, от нормальных до патологичных. Таким образом, показано, что аномалии кариотипа, как числовые, так и структурные, не всегда сопровождаются нарушением сперматогенеза. В тоже время для пациентов со структурными аномалиями отмечено увеличение доли морфологически аномальных эмбрионов и эмбрионов с хромосомным дисбалансом.

В настоящем исследовании было показано, что нарушение фертильности в 70% случаев сопровождается снижением показателей спермиологического анализа, проведенного в соответствии с нормативами ВОЗ 2010 года, и в 95% - в соответствии с нормативами ВОЗ 1999 года. При сравнительном анализе было показано, что более строгие критерии оценки морфо-функциональных характеристик сперматозоидов наиболее точно отражают качество гамет.

Анализ фрагментации ДНК эякулированных сперматозоидов показал, что для пациентов со сниженным содержанием морфологически нормальных сперматозоидов характерно увеличение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК. При этом при анализе фрагментации ДНК сперматозоидов с учетом морфологии их головок был выявлен морфологический маркер нарушения целостности ДНК — вакуолизированная головка сперматозоида. Кроме того, было показано, что высокая доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК сочетается с высокой долей сперматозоидов с 5-гидроксиметилированной ДНК.

На основании полученных в настоящей работе данных можно предположить, что фрагментация ДНК сперматозоидов, вероятно, не снижает эффективности оплодотворения, но в то же время приводит к нарушению развития эмбрионов, культивируемых in vitro.

Таким образом, результаты настоящего исследования вносят существенный вклад в понимание взаимосвязи между морфологическими характеристиками сперматозоидов и структурно-функциональными и эпигенетическими особенностями их генома. Охарактеризованные в работе морфологические маркеры сперматозоида позволят осуществлять направленную селекцию клеток, используемых для оплодотворения с целью повышения его эффективности и вероятности развития нормальных эмбрионов. Результаты проведенного исследования могут быть

использованы для разработки алгоритма обследования пациентов с нарушением фертильности, что особенно актуально для пар, прошедших ряд неудачных попыток ЭКО.

ВЫВОДЫ

1. Около 11% мужчин с нарушением фертильности являются носителями числовых и структурных аномалий кариотипа.

2. Увеличение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК характерно для пациентов со сниженным содержанием морфологически нормальных сперматозоидов.

3. Вакуолизированная форма головки сперматозоида является морфологическим маркером нарушения целостности ДНК.

4. Для пациентов с аномалиями кариотипа характерен как широкий диапазон варьирования всех параметров спермиологического анализа, так и уровня фрагментации ДНК сперматозоидов.

5. У пациентов с нарушением фертильности высокая доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК сочетается с высокой долей сперматозоидов с 5-гидроксиметилированной ДНК.

6. Нарушение целостности ДНК сперматозоидов не снижает эффективности оплодотворения, но приводит к нарушению развития эмбрионов при культивировании in vitro.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Efimova О.A., Pendina А.А., Tikhonov A.V., Fedorova I.D., Krapivin M.I., Chiryaeva О.G., Shilnikova E.M., Bogdanova M.A., Kogan I.Y., Kuznetzova T.V., Gzgzyan A.M., Ailamazyan E.K., Baranov V.S. Chromosome hydroxymethylation patterns in human zygotes and cleavage-stage embryos // Reproduction. 2015. № 149. P. 223-33.

2. Pendina A.A., Efimova O.A., Fedorova I.D., Leont'eva O.A., Shilnikova E.M., Lezhnina J.G., Kuznetzova T.V., Baranov V.S. DNA methylation patterns of metaphase chromosomes in human preimplantation embryos // Cytogenetic and Genome Research. 2011. V. 132(1-2). P. 1-7.

3. Шильникова E.M., Мазилина M.A., Федорова И.Д. Нарушение целостности ДНК сперматозоидов человека: причины, методы исследования, влияние на исход программ вспомогательных репродуктивных технологий // Медицинская генетика. 2014. Т. 13. № 4. С. 11-19.

4. Шильникова Е.М., Федорова И.Д., Гзгзян A.M. Анализ доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте пациентов с нарушением фертильности // Журнал акушерства и женских болезней. 2012. T. LXI. В. 3. С. 141-147.

5. Федорова И.Д., Шильникова Е.М., Гзгзян A.M. Принципы отбора сперматозоидов по морфологическим, физиологическим и биохимическим признакам для проведения внутрицитоплазматической инъекции сперматозоидов в ооцит // Журнал акушерства и женских болезней. 2012. Т. LXI. В.З. С. 123-131.

Тезисы:

1. Shilnikova Е.М., Mazilina M.A., Fedorova I.D., Gzgzyan A.M. Sperm head morphology as a predictive mark of DNA fragmentation // European Journal of Human Genetics. 2014. Vol. 22. Suppl.l. P. 384.

2. Mazilina M.A., Shilnikova E.M., Fedorova I.D., Gzgzyan A.M. Reduced fertility and sperm DNA fragmentation // European Journal of Human Genetics. 2014. Vol. 22. Suppl. 1. P. 372-373.

3. Мазилина M.A., Шильникова E.M. Морфология головки сперматозоида как маркер нарушения целостности ДНК сперматозоида // СПб: Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье. XVII Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей (Санкт-Петербург., Россия). 2014. т. 17. С. 279-280.

4. Shilnikova Е.М., Mazilina М.А., Fedorova I.D, Gzgzyan A.M. Correlation between sperm DNA fragmentation and sperm head morphology // European Journal of Human Genetics. 2013. V. 21. Suppl. 2. P. 595.

5. Mazilina M.A., Shilnikova E.M., Fedorova I.D., Gzgzyan A.M. Sperm DNA fragmentation rate among patients with reduced fertility // European Journal of Human Genetics. 2013. V.21. Suppl.2. P. 597-598.

6. Shilnikova E.M., Fedorova I.D., Gzgzyan A.M. Vacuole sperm heads as a possible marker of sperm DNA fragmentation. // Mediterranean society for reproductive medicine (Budva, Montenegro). 2012. P. 19.

7. Шильникова E.M. Целостность ДНК сперматозоида как новый критерий оценки репродуктивной функции мужчины // Репродуктивная медицина: взгляд молодых (Санкт-Петербург, Россия). 2012. С. 57.

8. Shilnikova Е.М., Fedorova I.D., Gzgzyan A.M. DNA fragmentation in chromosomal translocation carriers // European Journal of Human Genetics. 2012. V. 20. Suppl.l. P.142-143.

9. Shilnikova E.M., Fedorova I.D., Kuznetzova T.V. Robertsonian translocation carrier: do such aberrations influence sperm quality? A case report // Chromosome Research. 2011. V. 19. Suppl. 1. P. 59-60.

10.Shilnikova E.M., Fedorova I.D., Chiryaeva O.G., Petrova L.I., Dudkina V.S., Sadik N.A., Kuznetsova T.V. Sperm DNA fragmentation as a possible test for evaluation male fertility status // 5th Congress of World Association of Reproductive Medicine (Moscow, Russia). 2010. V. 20. Suppl. 3. P. 3233.

11.Shilnikova E.M., Fedorova I.D., Chiryaeva O.G., Petrova L.I., Dudkina V.S.,.Sadik N.A, Bogdanova M.A. Assosiation of semen parameters variation with genetic abnormalities of spermatozoa // Chromosome research. 2009. V. 17. Suppl. 1. P. 60-61.

12.Fedorova I.D., Shilnikova E.M., Chiryaeva O.G., Petrova L.I.,. Dudkina V.S, Sadik N.A., Bogdanova M.A., Kuznetzova T.V. Abnormal karyotype rate in men from infertile couples // European Journal of Human Genetics. 2009. V. 17. Suppl. 2. P. 109.

13.Shilnikova E.M., Fedorova I.D., Sadik N.A. A two chromosome inversions 46,XY,inv(4)(pl2;q21),inv(10)(pll;q21) associated with spermatogenetic failures // European Journal of Human Genetics. 2008. V.16. Suppl. 2. P.171.

14.Fedorova I.D., Shilnikova E.M., Chiryaeva O.G., Petrova L.I., Dudkina V.S., Smirnova T., Bogdanova M.A. Analysis of heteroploidy frequency in sperm from man with chromosome rearrangements // European Journal of Human Genetics. 2008. V.16. Suppl.2. P.169-170.

и др.

Подписано в печать 01.04.2015 Формат 60x84 1/16 Цифровая Печ. л. 1.2 Тираж 100 Заказ №01/04 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2, Сайт: falconprint.ru)