Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из сперматозоидов: выделение, свойства и роль в их подвижности

Элькина, Юлия Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из сперматозоидов: выделение, свойства и роль в их подвижности
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из сперматозоидов: выделение, свойства и роль в их подвижности"

МОСКОВСКИМ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Факультет Биоинженерии и Биоинформатики и отдел биохимии животной клетки НИИ Физико-Химической Биологии им. А.Н. Белозерского

На правах рукописи

Юлия Леонидовна Элькина

УДК 577.152.121

ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА ИЗ СПЕРМАТОЗОИДОВ: ВЫДЕЛЕНИЕ, СВОЙСТВА И РОЛЬ В ИХ ПОДВИЖНОСТИ

03.01.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з о СЕН 2010

Москва-2010

004609700

Работа выполнена в отделе биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского Государственной) Университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В.И. Муронец

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.Е. Медведев

кандидат биологических наук, Т.В. Есакова

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится "18" октября 2010 г. в 15 часов 30 минут на заседании Диссертационного совета Д 501.001.71 в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, Большая биологическая аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета

(ББА).

МГУ.

Автореферат разослан_ ССЬа^дАЛ. 2010

г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние несколько десятилетий отмечается ухудшение ситуации с мужской фертильностью. По данным Всемирной Организации Здравоохранения на 1990 год 20% семейных пар бесплодны, и в 50% случаев хотя бы частично причина кроется в мужской репродуктивной способности.

Патологии, лежащие в основе мужского бесплодия, можно разделить на несколько категорий. С одной стороны, это нарушения в репродуктивной системе или дефицит половых гормонов, которые хорошо диагностируются и зачастую поддаются коррекции. Следующий уровень - нарушения в количестве и/или морфологии сперматозоидов. С 1938 по 1990 годы согласно данным из 60 независимых центров концентрация сперматозоидов уменьшилась практически в два раза - со 113 до 66 млн/мл (Carlsen Е. et al, 1992). На сегодняшний день, согласно инструкции ВОЗ, в качестве нормальной принята концентрация не менее 20 млн/мл.

Отдельной категорией следует выделить нарушения фертильности, связанные с дефектами подвижности сперматозоидов (астенозооспермия). Если между количеством/морфологией сперматозоидов и фертильностью не всегда существует строгая корреляция, то неподвижные сперматозоиды абсолютно неспособны к зачатию. В современной медицине существуют подходы, такие как интрацитоплазматическое введение сперматозоида, ИКСИ (IntraCytoplazmic Sperm Injection, ICSI), позволяющие «обойти» этот дефект при наличии хотя бы небольшой доли подвижных сперматозоидов. Однако в силу неизученности молекулярных механизмов, обеспечивающих нормальную подвижность сперматозоидов, медицинских подходов, влияющих на причину подобных патологий, практически не существует.

С другой стороны, знание молекулярных основ процесса подвижности, необходимого для зачатия, позволило бы найти подход к безопасной, целенаправленной и эффективной мужской контрацепции. Например, это возможно при воздействии на белки, специфичные для сперматозоида и отсутствующие в соматических клетках, но необходимые для подвижности, а, следовательно, и функционирования сперматозоидов.

Таким образом, изучение белков, необходимых для подвижности сперматозоида, представляется актуальной задачей современной биохимии. Одним из таких белков является сперматозоидная изоформа глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФДс), которая встречается только в сперматозоидах и существенно отличается от глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы соматических клеток (ГАФД).

*Список сокращений: АФК - активные формы кислорода, ГАФД - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, ГАФДс - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из сперматозоидов, ПААГ г- полиакриламидный гель, 3-ФГА - глицеральдегид-3-фосфат, ChBD-GAPDS -рекомбинантная форма ГАФДс, содержащая хитинсвязыващий домен вместо N-концевог домена, dN-GAPDS - рекомбинантная форма ГАФДс без N-концевого домена.

Свойства ГАФДс практически не изучены, однако ГАФДс является важным объектом для исследования в связи с ее ролью в обеспечении подвижности сперматозоидов. Направленное влияние на активность ГАФДс может быть использовано как для увеличения фертильности, так и для контрацепции.

Цели и задачи исследования. Целью нашей работы было изучение ГАФДс из сперматозоидов человека, а также исследование связи между подвижностью сперматозоидов и активностью ГАФДс.

Были поставлены следующие задачи:

1. Разработка метода выделения ГАФДс и исследование ГАФДс в сравнении с соматической формой фермента. Поиск ингибиторов, специфичных для ГАФДс.

2. Исследование влияния окислителей как потенциальных ингибиторов ГАФДс на подвижность сперматозоидов.

3. Определение активности и содержания ГАФДс в сперме пациентов с астенозооспермией с целью выявления возможной взаимосвязи между неподвижностью сперматозоидов и отсутствием ГАФДс.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В настоящей работе впервые были изучены свойства глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы из сперматозоидов человека. Был выделен активный фрагмент ГАФДс из сперматозоидов человека, а также две рекомбинантные формы ГАФДс. Было показано, что ГАФДс из сперматозоидов обладает повышенной стабильностью по сравнению с ГАФД из мышц кролика. Поскольку подвижность сперматозоида обеспечивается в основном за счет гликолиза, высокая стабильность ГАФДс должна способствовать повышению эффективности оплодотворения. Свойства рекомбинантных форм ГАФДс немного отличаются от соматической изоформы, однако оба изофермента легко окисляются перекисью водорода. Известно, что при воспалительных заболеваниях в сперме повышается уровень лейкоцитов, которые являются продуцентами перекиси водорода. Было показано, что снижение подвижности сперматозоидов в присутствии перекиси водорода коррелирует со снижением активности ГАФДс. Таким образом, было обнаружено, что снижение подвижности сперматозоидов в присутствии перекиси водорода связано с окислением ГАФДс. Была определена активность и содержание ГАФДс в сперматозоидах с дисплазией фиброзного слоя (ДФС). Показано, что содержание ГАФДс в сперматозоидах с ДФС значительно ниже, чем в норме. Тест на содержание ГАФДс может служить биохимическим критерием для обнаружения данного дефекта.

Апробаиия работы. Результаты работы были доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ (2010), а также на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов" (Москва, 2006, 2007, 2009, 2010), пятом съезде общества биотехнологов России им. Ю.А.

Овчинникова (Москва, 2008), 33 FEBS Congress "Biochemistry of cell regulation" (Афины, 2008), 4 ESF Conference "Functional Genomics and Disease" (Дрезден, 2010).

Публикации• По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, включая три журнальные статьи.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем работы составляет 170 стр., содержит 44 рисунка и 9_ таблиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глгщеральдегид-З-фосфатдегидрогеназу из сперматозоидов человека выделяли по методу Вестхоффа и Кампа (Westhoff W. and Kamp G., 1997) с некоторыми модификациями и последующей очисткой на колонке с фенил-сефарозой. Белок хранили при 4°С в виде суспензии в полунасыщенном растворе (NH^SO^ Клонирование рекомбинантных белков. Клон MGC:26494 со штаммом E.coli, содержавшим плазмиду с кДНК вставкой полной кодирующей последовательности спсрмоспецифичной глицеральдегид-3-

фосфатдегидрогеназы человека (GAPDS) был получен через компанию Geneservice Ltd. Фрагмент ДНК, кодирующий GAPDS человека без N-концевого домена (68 аминокислотных остатков), был получен методом ПЦР на матрице плазмиды клона MGC:26494 с использованием праймеров GAPDSdF (5'-GTTTCATGAGTG TGGCCCGGGAGCTGAC-3') и GAPDSR (5'-GTCTCGAGTTCACTT GTCTCGGCTGААСATGTAG). Выделенный фрагмент размером 1020 п.н. после совместного гидролиза рестриктазами BspHI/XhoI был клонирован между сайтами Ncol/Xhol плазмиды pET21d(Novagen, США). Полученная плазмида была обозначена pET21/dGAPDS.

ГАФДс с хитинсвязывающим доменом был получен методом ПЦР на матрице плазмиды клона MGC:26494 с использованием праймеров GAPDS_CBF (5 '-GTTTCATGAGTGTGG ССС GGGAGCTG АС-3') и GAPDS-R (5'-GTCTCGAGTTCACTTGTCTCGGCTGAACATGTAG). Выделенный фрагмент размером 1020 п.н. после совместного гидролиза рестриктазами BspHI/XhoI был клонирован между сайтами Ncol/Xhol плазмиды pETmChBD, содержащей модифицированный хитинсвязывающий домен хитиназы Al В. circuí ans с мутацией W44F в хитин-связывающем сайте. Полученная плазмида была названа pETmChBD/dGAPDS.

Клетки Е.соУи продуцирующие рекомбинантную глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу из сперматозоидов человека с заменой N-концевого домена на хитинсвязывающий домен (ChBD-GAPDS) и ГАФДс без N-концевого домена (dN-GAPDS) выращивали методом аутоиндукции (Studier F., 2005).

Глицерачьдегид-З-фосфатдегидрогеназу из сперматозоидов человека с заменоу N-кониевого домена на хитгтсвязываюишй домен (ChBD-GAPDS) выделяли из клеток U.coli Rosetta 2(DE3)/pETmdiBD/dGAPDHS с последующей очисткой на колонке с хитиновым носителем (Chitin beads, New England Biolabs). ГАФДс без N-кониевого домена (dN-GAPDS) выделяли из клеток E.coli Rosetta 2(DE3)/pET21/dGAPDS, с последующей очисткой на колонке с КМ-целлюлозой.

Глииеральдегид-З-фосфатдегидрогеназу из скелетных мышц кролика выделяли по методу Скоупса (Scopes and Stoter, 1982) с последующей гель-фильтрацией на сефадексе G-100.

Все ферменты хранили при 4°С в виде суспензии в полунасыщенном растворе (NH4)2S04.

Концентрацию белка определяли методом Бредфорд (Bradford, 1976) и спектрофотометрически по поглощению при 280 нм (А °'1% для ГАФД 1,0; ChBD-GAPDS - 1,33; dN-GAPDS - 1,14).

Определение ферментативной активности ГАФД и ГАФДс проводили спектрофотометрически при 22°С, измеряя скорость образования NADH при 340 нм в ходе реакции окисления 3-ФГА. За единицу активности принимали количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль NAD+ в минуту.

Анапа методом дифференциальной сканирующей калориметрии проводили на адиабатическом микрокалориметре DASM-4 (Биоприбор, Пущино, Россия) в кювете объемом 0,47 мл при скорости сканирования 1°/мин. Электрофорез белков в ПААГ в денатурирующих условиях проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970) с использованием прибора для электрофореза "Mini-Protean 3" (BioRad).

Голубой нативный гель-электрофорез проводили в градиенте полиакриламидного геля (5,5 - 12%). Электрофорез проводили при 4°С. Вначале использовали голубой катодный буфер (50 мМ трицин, 15 мМ Бис-трис, 0,02 %-ный Кумасси голубой G 250, pH 7,0 при 4°С ), который через 20 мин меняли на белый - без добавления Кумасси (Schagger Н. et al, 1994). Электроперенос белков Процесс электропереноса белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану проводили при постоянном напряжении 100V и силе тока 150-250 мА в течение 45 мин (Towbin Н. et al, 1979). Иммунохимтеское окрашивание с диаминобензидином. Мембрану инкубировали при постоянном перемешивании в течение 10 мин в растворе 5% обезжиренного сухого молока, затем инкубировали в течение 1 часа с первичными антителами против ГАФДс (1 мкг/мл). Затем мембрану промывали и инкубировали в течение часа в растворе вторичных антител (антитела против антител мыши, конъюгированные с пероксидазой (1 мкг/мл)). После тщательной отмывки мембрану переносили в раствор хромогенного субстрата, содержавший 3 мг диаминобензидина гидрохлорида, 30 мг семиводного сульфата никеля и 10 мкл 30%-ной перекиси водорода в 10 мл 0,1 М трис-HCl, pH 7,6.

Изучение влияния различных факторов на подвижность сперматозоидов. Подвижность каждого сперматозоида классифицируют по категориям <а>, <Ь> и <с>, используя следующие критерии:

а - быстрое поступательное движение или активная прогрессивная подвижность; b - медленное поступательное движение или слабая прогрессивная подвижность; с - непоступательное движение, к которому относится очень медленное движение по прямой (<5 цм/сек) и ротационное движение - движение сперматозоида по окружности с любой ( в том числе и с большой) скоростью.

Образец спермы разбавляли в 2 раза и инкубировали с необходимыми добавками (в зависимости от условий эксперимента) при 37°С или при комнатной температуре. Через определённые промежутки времени исследовали подвижность сперматозоидов в камере Горяева. Процент подвижных клеток рассчитывали как отношения клеток с подвижностями а+Ь к общему числу клеток в большом квадрате камеры Горяева и считали среднее по четырем квадратам.

Определение активности ГАФДс в сперматозоидах. Сперматозоиды из семенной жидкости осаждали центрифугированием. Полученный осадок суспендировали в ~ 100-кратном объеме фосфатно-солевого буфера, затем центрифугировали. К полученному осадку клеток добавляли равный объем 10 мМ калий-фосфатного буфера, pH 7,4, суспензию обрабатывали ультразвуком и центрифугировали. В полученных осадке и экстракте определяли активность ГАФДс.

Метод динамического светорассеяния (ДСР) использовали для определения среднего размера частиц белков. Опыты проводили на приборе «Zetasizer Nano-ZS» (Malvern Instruments, Malvern, Великобритания), используемом для измерения размеров частиц в диапазоне от 2 до 6000 нм.

Термоинактнваиию проводили при 55°С и при 70°С. Для этого исследуемый белок (ГАФД из мышц кролика, ChBD-GAPDS или dN-GAPDS) инкубировали при указанной температуре в ЮмМ калий-фосфатном буфере (pH 7,5). Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты для определения ферментативной активности.

Метод электронной микроскотт. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Reichert III Ultracut, окрашивали цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе Hitachi 700. В каждом образце анализировали не менее 50 поперечных срезов жгутиков сперматозоидов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Одной из основных задач нашей работы было выделение ГАФДс и изучение её свойств в сравнении с мышечной изоформой фермента (ГАФД из мышц кролика). Основная проблема, связанная с изучением этого фермента, состоит в сложности его выделения. Поскольку ГАФДс, в отличие от соматического фермента, связана с цитоскелетом, т.е. находится в

нерастворимой клеточной фракции, выделение полноразмерного активного фермента в растворимой форме является большой проблемой.

Выделение ГАФДс из сперматозоидов человека.

Из литературных данных известно, что ГАФДс не экстрагируется в раствор при обработке буферными растворами. Однако ГАФДс из сперматозоидов хряка высвобождалась в раствор при обработке трипсином или эластазой (Westhoff D. and Camp G., 1997).

Из результатов иммуноблотинга (рис. 1) видно, что после обработки ультразвуком сперматозоидов человека в осадке преимущественно наблюдается полоса 58 кДа, которая соответствует полноразмерной ГАФДс, а также полоса с молекулярной массой 40кДа (рис. 1, дорожка 1). В экстракте после обработки ультразвуком также присутствуют несколько полос ГАФДс: 58, 48, 47 и 40кДа (рис.1 дорожка 2): полноразмерная ГАФДс 58 кДа и продукты ее протеолитического расщепления. Однако в раствор выходит лишь небольшая часть полноразмерного фермента. После обработки трипсином в экстракте значительно увеличивается интенсивность полосы с молекулярной массой 40 кДа (Рис.1 дорожки 3-6). При этом полоса, соответствующая полноразмерному ферменту, пропадает. Возможно, при трипсинолизе происходит отщепление N-концевого домена, который является связующим звеном между ГАФДс и белками фиброзного слоя.

да -р; 1- осадок разрушенных клеток после

ЬЖ обработки ультразвуком

щШ """ 2 - экстракт после обработки клеток

ИВ 9р Зм ¡И» ЦЙ ш! ультразвуком

45 1 |8|| ОТ ? ' 3-6 - супернатанты после 3, 7, 11, и 15

мин инкубации осадка разрушенных клеток с трипсином при 30° (0,5 мт «ж ЦМ» ЩИ ЙМЙ трипсина на 1 мл осажденных клеток)

29 Йшь'тшм* 7-осадок разрушенных клеток после 15

24 мин инкубации с трипсином

Рис. 1. Иммуноблоттинг лизатов сперматозоидов человека после обработки ультразвуком и последующей обработки нерастворимого осадка трипсином.

При выделении фермента мы меняли концентрацию трипсина, чтобы подобрать оптимальный вариант для получения очищенного белка с высокой активностью и максимальным выходом.

Для идентификации выделенного белка проводили иммунохимическое окрашивание полученных препаратов ГАФДс. В качестве первичных антител использовали мышиные моиоклональные антитела против ГАФДс (рис.2).

66 Якмн -45

1 - фрагменты ГАФДс (40 и 43 кДа), (0,2 мг трипсина на 1мл клеток)

2 - фрагмент ГАФДс (40кДа), (0,1 мг трипсина на 1 мл клеток)

3- фрагменты ГАФДс (29 и 40 кДа) (1 мг трипсина на 1 мл клеток)

М 1 2 3

Рис. 2. Иммунохимическое окрашивание препаратов ГАФДс, полученных в результате инкубации сперматозоидов человека с разными концентрациями трипсина и последующей очистки полученного экстракта на колонке с фенил-сефарозой. Представлены копии нитроцеллюлозных мембран после окрашивания антителами против ГАФДс.

Из приведенных на рис.2 данных видно, что активные фракции (дорожки 1-3) содержат фрагменты ГАФДс с молекулярными массами 29,40 и ~43 кДа. На дорожке 3 (рис.2) показан результат выделения ГАФДс при использовании трипсина в концентрации 1мг на 1 мл клеток. При этом происходит более глубокий трипсинолиз и появляется полоса 29 кДа, которая не наблюдается при более низких концентрациях трипсина. Это приводит к снижению активности фермента и ухудшению связывания с субстратом. Поэтому для проведения всех остальных выделений мы использовали более низкую концентрацию трипсина (0,1 -0,2 мг на 1 мл клеток).

Чистоту выделенных препаратов ГАФДс оценивали методом Ов-Ыа-электрофореза. На рис. 3 видно, что выделенные препараты не гомогенны, однако полоса 40кДа является основной. По результатам иммуноблотинга (рис.2) можно сказать, что остальные полосы являются примесями, так как не окрашиваются антителами против ГАФДс.

1-3 - образцы ферментов после очистки на колонке с фенил-сефарозой. 1 - 0,1 мг трипсина на 1мл клеток 50 2 - 0,2 мг трипсина на 1мл клеток 3 - 0,5 мг трипсина на 1мл клеток 36 М- маркеры (60,50,36)

1 2 3 М

Рис. 3. Анализ фракций ГАФДс, полученных в результате нескольких выделений фермента, методом Ов^а-электрофореза.

Результаты 5 выделений ГАФДс представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты пяти выделений ГАФДС из сперматозоидов человека

№ Трипсин, мг/мл осадка клеток Белок, Мг Удельная активность, Ед/мг Общая активность, ед/мл экстракта Кт мМ Кт (ФГА), мМ Выделенные фрагменты ГАФДс, кДа

1 0,1 0,02 19-36 0,18-0,31 - - 40

2 0,1 0,07 10-21 3-4,8 - 1 40

3 0,2 0,03 50 1,5-11 0,0227 0,77 40,43

4 0,5 0,04 19-35 0,8-1,4 - 5 40

5 1 0,26 13-26 3,3-6,7 - 1,7 40,29

Из представленных данных видно, что максимальный выход по активности, а также максимальная удельная активность белка наблюдаются при использовании 0,2 мг трипсина на 1 мл осадка клеток. При использовании более высокой концентрации трипсина (0,5 - 1 мг/мл клеток) растет количество выделенного белка, однако активность его падает, а величина Кт для 3-ФГА растет, что говорит об ухудшении связывания субстрата. Таким образом, для выделения ГАФДс оптимальной оказалась концентрация трипсина 0,1-0,2 мг/мл клеток.

Определение молекулярной массы и олигомерного состава ГАФДс. Известно, что ГАФД из мышц кролика является тетрамером. Поскольку ГАФДс на 68% гомологична мышечному ферменту, то можно предположить, что ГАФДс тоже тетрамер, однако какие-либо данные по этому поводу отсутствуют.

Для того, чтобы исследовать олигомерную структуру ГАФДс, экстракты сперматозоидов, а также препараты очищенного фрагмента ГАФДс, полученного после обработки сперматозоидов трипсином, исследовали методом голубого нативного электрофореза и БОБ-электрофореза.

К осадку клеток добавляли равный объем буфера для лизиса, обрабатывали ультразвуком и центрифугировали. Из супернатанта брали пробу на электрофорез, а осадок инкубировали с трипсином (0,25 мг/мл осадка) 15 мин при 30°С, центрифугировали и из супернатанта брали пробу для электрофореза (рис.4).

8S6 443 232

132

66 45

Рис. 4. Анализ ГАФДс методом голубого нативного электрофореза (А) и SDS-электрофореза (Б).

А: 1 -маркеры (886, 443, 232, 132, 66, 45 кДа) (электрофореграмма, окрашивание Кумасси R250)

2 - ГАФД из мышц кролика (электрофореграмма, окрашивание Кумасси R250)

3 - супернатант, полученный после обработки сперматозоидов трипсином (копия PVDF мембраны после окрашивания антителами против ГАФДс)

4 - супернатант, полученный после обработки сперматозоидов ультразвуком (копия нитроцеллюлозной мембраны после окрашивания антителами против ГАФДс)

5 - ГАФД из мышц кролика (копия нитроцеллюлозной мембраны после окрашивания антителами 6С5 против цитоплазматической ГАФД)

Б: 1 - маркеры (886,443, 232, 132, 66, 45 кДа)

2 - супернатант, полученный после обработки сперматозоидов ультразвуком

3 - супернатант, полученный после обработки осадка клеток трипсином

Из приведенных на рис. 4А результатов видно, что ГАФДс, которая переходит в экстракт после обработки трипсином, при нативном электрофорезе идет одной полосой на одном уровне с ГАФД из мышц кролика и окрашивается антителами к ГАФДс. Известно, что соматическая ГАФД в нативном состоянии существует в виде тетрамера и соответствует молекулярной массе 144 кДа. Следовательно, молекулярная масса растворимого фрагмента ГАФДс, полученного после обработки трипсином, составляет 144-200 кДа (200 кДа по расчёту из калибровочного графика зависимости lgМг от Rf). При SDS-электрофорезе этот же препарат даёт основную полосу с молекулярной массой -40 кДа (рис. 4Б, дорожка 3). Следовательно, препарат фермента, полученный путем трипсинолиза, является скорее всего тетрамером. В экстракте, полученном после обработки ультразвуком, ГАФДс также идёт одной полосой (рис.4А, дорожка 4), но чуть выше, чем фермент, полученный при помощи трипсинолиза. Поскольку содержание ГАФДс в экстракте после обработки сперматозоидов ультразвуком ниже, чем после трипсинолиза, данную полосу можно увидеть только после иммуноблотинга. Из рис. 4А (дорожка 4) видно, что полноразмерная ГАФДс также является тетрамером. Ни в экстракте, ни в

препарате очищенного фермента при нативном электрофорезе не обнаружено димерных или мономерных форм.

В результате нативного электрофореза экстракта после обработки ультразвуком мы получили одну полосу, а при SDS-электрофорезе тот же экстракт даёт 4 полосы с разными молекулярными массами 58, 48, 47 и 40 кДа (рис. 4Б, дорожка 2). Можно предположить, что олигомер ГАФДс образуется из полипептидных цепей разной длины. Возможно, это связано с тем, что не все субъединицы тетрамера связаны с фиброзным слоем, а одна или две. У оставшихся субъединиц N-конец остаётся свободным и поэтому легко отщепляется протеиназами. В результате при SDS-электрофорезе мы видим одну полосу (58 кДа), которая соответствует полноразмерной ГАФД, закреплённой на фиброзном слое, и ряд полос, соответствующих субъединицам с отщепленным N-концом.

Отщепление N-концевой последовательности не препятствует объединению субъединиц в тетрамер, которое мы видим при нативном электрофорезе.

Таким образом, ГАФДс, полученная в результате обработки сперматозоидов трипсином, является тетрамером.

Выделение рекомбинантной ГАФДс из клеток E.colL В ходе работы со сперматозоидами человека и выделения ГАФДс из них, мы столкнулись с рядом проблем. Во-первых, для выделения фермента необходимо достаточное количество клеток (желательно 2-Змл), процесс их накопления требует доноров и времени. Во-вторых, как видно из таблицы 1, в результате выделения получается не более 20-66 мкг белка, что очень мало и такого количества белка недостаточно для изучения свойств фермента. Помимо этого препарат ГАФДс получается негомогенным, а многократные очистки привели бы к потере большей части белка. Поэтому мы решили экспрессировать ГАФДс в клетках E.coli.

Сначала в клетках E.coli клонировали полноразмерную последовательность ГАФДс. Однако выделить фермент в растворимом, активном и очищенном виде не удалось. Мы полагаем, что нерастворимость ГАФДс, а также отсутствие активности полноразмерной ГАФД, связано с наличием N-концевого домена. В процессе сперматогенеза происходит формирование фиброзного слоя и одновременное встраивание в него необходимых ферментов. Новосинтезированная ГАФДс встраивается N-концевым доменом в растущий фиброзный слой, поэтому N-концевой домен не препятствует сворачиванию белка. При экспрессии полноразмерной ГАФДс в клетках E.coli гидрофобный N-концевой домен остается свободным и способствует агрегации белка. Поэтому было решено экспрессировать в клетках E.coli ГАФДс без N-концевого домена. Как было показано выше, фрагмент ГАФДс после отщепления N-концевого домена трипсином сохраняет активность и переходит в раствор. Следовательно, N-концевой домен не взаимодействует с каталитической частью фермента и может быть удален.

Сначала в молекуле ГАФДс природный N-концевой домен был заменен на близкий по размеру, но менее гидрофобный фрагмент - хитинсвязывающий

домен. Мы предположили, что это позволит избежать агрегации фермента и получить растворимую модель ГАФДс.

Выделение СИВО-САРйЯ из клеток Е.соИ ЯоэеИа 2(0 ЕЗ)/ рЕТтСЬВО/сГСАРОШ. Клетки Е.соИ Яовейа 2(0 ЕЗ УрЕТтСЬ В О/сЮАРОНБ экспрессируют человеческую ГАФДс, "Ы-концевой домен которой заменен на хитинсвязывающий домен (СИВО-вАРОв). На рис. 5 представлена последовательность СЬЕЮ-ОАРОБ в сравнении с полноразмерной ГАФДс.

ГАФДс

ИЗКЯ01\^ТЫ7Т\%(,.1ХЬ.1,1'С1-\'ТРЛРРР1'ЕРКАЕУЕРЙРРРЕРТРУКЕЕТКРРРРР1.РР

РРЕУМУУМГКУ

05ТНСКУКСЗУЕГЯЫСдЬУУОЫНЕ13УУасКЕРКС>1РИЯАУ63РУУУЕЗТСУУЬ310ААЗ

С1УЕСЬМТТУНЗУТАТСКТУОСР5ККАИКОвКСАН0Н1ГРАЗТе.адКАУТКУ1РЕ1,КСК.Ъ ТеМАГКУРТР0УЗУУ0ЬТСКЬА0РАРУЗА1КЕАУКАААКеРМА611.АУТЕ0ЕУУ5Т0РЬС ОТ Н 3 ЭI ГОАКАв IА1.ЫШ ЕУКЫ Э И У ОЫ Е УС УЗ Н КУТОИ^И УМГЗ КОК

СЬВ0-САР05

МСАЬТТЫРСУЗАИ0\^ТАУТАО0ЬУттаСКТУКСадРНТЙЬАСГЕР$№/РАЪИС>Ь<20АРЗ

1/АР.ЕЬТУС1Н0Г€Р1СКХ.УЬНАСМЕКСУКУУАУ>10РР10РЕУМУУМН'КУ03ТНСКУКСЗУ ЕРР.Ш<2ЬУУ0ЫНЕ13УУОСКЕРКеХ РИКАУСЗРУУУЕЗТвУУЬЗIОААЗОНIЗАЕАОКУУ 13АРЗРОАРМГУМСУМЕЫОУКР63МН1УЗЫАЗСТТЫС1АРЬАНО/1НЕР.ГСХУЕС1,МТТУН ЗУТАТОКТУОСРЗККАУЛШСЖОАНОЫХ IРАЗТСААКАУТКУХ РЕЬКСК1,ТСМАГКУРТРП УЗ\!Л?ОЬТСК1АОРАРУЗА1КЕАУКАААКСРМАС11,АУТЕОЕУУЗТОРЬСОТН331РОАКА С1АЬЫОНГУКЫЗИУПКЕУ6УЗНаУУОЫ-Р.УМГЗГ<0К

Рис. 5. Аминокислотные последовательности ГАФДс человека и рекомбинантного белка С 1т 151) - С Л Г * [> 8. 1Ч-концевой и хитинсвязывающий домены выделены.

Мы проанализировали содержание и активность СЬЕЮ-ОАРОБ в осадке и супернатанте разрушенных ультразвуком клеток. В данном случае в экстракте трансформированных клеток наблюдалась дегидрогеназная активность 20,4 Ед/мг (по сравнению с 7,76 Ед/мг в контрольной пробе нетрансформированных клеток). По-видимому, хитинсвязывающий домен отличается меньшей гидрофобностью по сравнению с природным "Ы-концевым доменом фермента и не препятствует сворачиванию белка и его экстракции. При БОБ-электрофорезе экстракт трансформированных клеток давал интенсивную полосу с молекулярной массой около 45 кДа (рис. 6, дорожка 1). Это значение приблизительно соответствует молекулярной массе СЬВБ-ОАРБЗ, равной 43 кДа.

1 - экстракт E.coli после обработки ультразвуком

2 - препарат после очистки на колонке с хитиновым носителем

3 - иммуноокрашивание моноклональными антителами на ГАФДс человека

36 ■'SHI;* »

ЯР

М 1 2 3

Рис. 6. Анализ фракций ChBD-GAPDS методом Ds-Na-электрофореза (1,2) п иммуноблотинга (3).

Таким образом, при помощи замены N-концевого домена на хитин-связывающий удалось получить растворимую рекомбинантную форму ChBD-GAPDS.

Рекомбинантный белок ChBD-GAPDS выделяли из экстракта на колонке с хитиновым носителем. Элюат содержал практически чистый белок с молекулярной массой около 45 кДа (рис. 6 дорожка 2), который взаимодействовал с моноклональными антителами к ГАФДс человека (рис. 6 дорожка 3) и проявлял глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназную активность 40-50 Ед/мг.

Поскольку нельзя исключить влияние хитинсвязывающего домена на свойства ГАФДс, был создан другой рекомбинантный белок - ГАФДс без N-концевого домена (dN-GAPDS).

ГАФДс без N-концевого домена (dN-GAPDS). Клетки E.coli Rosetta 2(DE3)/pET21/dGAPDS экспрессировали ГАФДс без N-концевого домена (удалены 68 аминокислот с N-конца), как показано на рис. 7.

MSKRDIVIiTN VTWQLLRQP CPVTRAPPPP EPKAEVEPQP QPEPTPVREE IKPPPPPLPP : 60

BPATPPPKMV SVARELTVGI MGFGRIGRLV LRACMEKGVK WAVNDPFID PEYMVYMFKY 120

DSTHGRYKGS VEFRNGQLVV DNHEISVYQC KEPKQIPWRA VGSPYVVEST GVYLSIQAAS 180

DHISAGAQRV VISAPSPDAP MFVMGVNEND YNPGSMNIVS NASCTTNCLA PLAKVIHERF 240

GIVEGLMTTV HSYTATQKTV DGPSRKAWRD GRVAHQNI1P ASTGAAKAVT KVIPELKGKL 300

TGMAFRVPTP DVSWDLTCR LAQPAPYSAI KEAVKAAAKG PMAGILAYTE DEVVSTDFLG 360

DTHSSIFDAK AGIALNDNFV KLISWYDNEY GYSHRVVDLL RYMFSRDK 408

Рис. 7. Аминокислотная последовательность ГАФДс человека. Выделен фрагмент из 68 аминокислот, отсутствующий в dN-GAPDS.

Клетки разрушали ультразвуком и анализировали на суперэкспрессию ГАФДс и на активность фермента. После обработки ультразвуком экстракт клеток анализировали методом Ds-Na-электрофореза. В экстракте был обнаружен белок с молекулярной массой приблизительно 40кДа (рис.8, дорожка 1). Это близко к рассчитанной молекулярной массе dN-GAPDS, равной 37 кДа. Практически вся ферментативная активность также была обнаружена в

экстракте (24,5 Ед/мг по сравнению с 3,7 Ед/мг в экстракте контрольных нетрансформированных клеток).

Из рис. 8 видно, что в результате выделения был получен гомогенный препарат ГАФДс, который окрашивался моноклональными антителами к ГАФДс. Активность выделенного препарата составляла 45-50 Ед/мг.

1 - исходный экстракт клеток Е.соН

2 - белки, которые не связались с КМ-целлюлозой

3 - препарат ёЫ-ОАРОЗ после элюции с КМ-целлюлозы

4 - очищенный препарат сИЧ-ОАРБв, окрашенный моноклональными антителами против ГАФДс человека.

20-

¿а.

14- Ш ш

М 1 2 3 4

Рис. 8. Выделение (Ш-САРОв. Анализ фракций методом 1)*-\а-электрфоореча (1-3) и иммуноблотинга (4).

Исследование рекомбинантных форм ГАФДс в сравнении с мышечным ферментом ГАФД. В данной работе мы проводили сравнительное исследование рекомбинантных белков СИВБ-САРОБ и ёМ-САРББ с мышечной изоформой ГАФД. Для этого использовали фермент из мышц кролика, поскольку он на 95% гомологичен ГАФД из мышц человека. Каталитические свойства рекомбинантных ферментов. Каталитические свойства рекомбинантных форм ГАФДс по сравнению с ГАФД из мышц кролика приведены в таблице 2. Активность СЬВО-ОАРБЗ и (1Ы-САР05 примерно одинаковы ив 1,7- 2 раза ниже активности ГАФД из мышц кролика. Константа Михаэлиса для 3-ФГА рекомбинантных форм ГАФДс в два раза превышает значение для ГАФД, а константа для приблизительно в три

раза ниже. Все ферменты проявляют чувствительность к окислению перекисью водорода.

Таким образом, СЬВ0-САР08 и с!1М-ОАРВ8 практически не отличаются друг от друга по своим каталитическим характеристикам, но немного отличаются от мышечной ГАФД.

66453629-

Фермент ГАФД из мышц кролика СЫШ-ОАРОБ сИЧ-ОАРБЗ

Оптимум рН 8,9 8,6 8,9

Удельная активность, мкмоль Ь'АОН/ мин мг 80 40-50 45-50

Ктдпя 3-ФГА, мМ 0,29 ± 0,06 0,485 ±0,15 0,54 ± 0,02

Кт для ЫАО+, мМ 0,27±0,1 0,073 ±0,01 0,097±0,05

Окисление Н202,к, мМ"1 * мин"' 0,9±0,06 0,6 ±0,01 0,54 ± 0,02

Анализ размеров частиц. Размеры частиц исследуемых белков определяли методом динамического светорассеяния. Средний диаметр частиц для соматической ГАФД, сМ-ОАРОБ и СЫЮ-ОАРЬб равен соответственно 8,6 нм, 9,3 нм и 9,9 нм (распределение частиц по объему). Так как ГАФД представляет собой тетрамер, близкий размер частиц рекомбинантных белков позволяет говорить о том, что они тоже являются тетрамерами. Увеличение размера молекул рекомбинантных ГАФДс по сравнению с ГАФД по-видимому объясняется наличием хитин-связывающего домена (в случае СЫШ-САРОБ) и нескольких аминокислотных остатков М-концевого домена (в случае (1Ы-САРОБ), экспонированных в раствор.

Термостабильность рекомбинантных форм ГАФДс. Стабильность белков изучали методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Результаты представлены на рис. 9 и в таблице 3. Как видно из таблицы, значения температуры максимума пика (Тт) и калориметрической энтальпии (дад для СЫЮ-ОАРБВ и сМ-ОАРВЗ значительно выше, чем для ГАФД. Эти данные свидетельствуют о повышенной термостабильности этих двух ферментов.

Т,°с

Таблица 3. Параметры, характеризующие стабильность СЬГШ-САРВБ и (Ш-вАРИв в

сравнении с соматической ГАФД

АЯы, кДж/моль Гш, С Термоинактивация А'оЬэ, мин"1 Денатурация в присутствии гуанидингидрохлорида(20°С) к0ы, мин"'

55°С 70°С Без добавок + 50мМ ДТТ

ГАФД 2125 60,8 0,26 ± 0,0047 0,96 ±0,14 2,45 ±0,018 -

СЬВО-ОАРОЭ 3314 67,7 0,0118 ± 0,001 - 0,133 ±0,0076 0,134 ±0,012

вАРОв 2536 67,4 Не инактивиру ется 0,226± 0,02 0,118 ±0,008 0,095 ± 0,0068

Результаты согласуются с данными, полученными в ходе термоинактивации при 55°С (рис. 10). Исследуемые белки термостатировали при 55°С и через определенные промежутки времени отбирали пробы для определения активности. На рис. 10 видно, что ГАФД из мышц кролика при этой температуре инактивируется значительно быстрее, чем рекомбинантные формы ГАФДс. В таблице 3 приведены значения наблюдаемых констант инактивации при 55°С для двух ферментов: ГАФД и СИВО-ОАРЭЗ. Константа инактивации ГАФД в 22 раза выше, чем СЬВО-САРОЗ. Для сПЧ-ОАРБЗ константу инактивации не определяли, поскольку этот белок инактивируется при 55°С только на 20% (рис. 10, кривая 3). Такая значительная разница еще раз подтверждает, что обе рекомбинантные формы ГАФДс стабильнее соматической ГАФД.

Поскольку сШ-ОАРЭЗ не инактивируется полностью при 55°С, мы увеличили температуру инкубации до 70°С. Наблюдаемая константа инактивации сЦ^-ОАРОБ в 4,2 раза ниже, чем константа инактивации соматической ГАФД (табл. 3).

100

Рис. 10. Термоинактивация СМШ-САРБ8 (1) , ГАФД из мышц кролика (2) и «ИУ-САРБЗ (3) при 55°С.

100

Время, мин

150

200

Устойчивость к денатурации. Мы проводили денатурацию исследуемых белков в присутствии 4 М гуанидингидрохлорида. Константа инактивации СЬЕЮ-ОАРОБ и сШ-вАРОЗ в 4 М растворе гуанидингидрохлорида приблизительно в 20 раз ниже, чем для ГАФД (0,133±0,0076, 0,118±0,008 и 2,450±0,018 мин'1, соответственно, данные представлены в табл. 3). Следовательно, рекомбинантные формы ГАФДс значительно устойчивее их соматической изоформы.

Возможность стабилизации САРОБ дисульфидными связями. Мы исследовали возможность стабилизации рекомбинантных белков дисульфидными мостиками. СЫЮ-ОАРОБ содержит три остатка цистеина, отсутствующих в составе соматической ГАФД: С34, расположенный в хитин-связывающем домене, а также С83 и С139, соответствующие остаткам С94 и С150 в полноразмерной человеческой ОАРОБ. Эти остатки могут быть вовлечены в образование дисульфидных связей, оказывающих стабилизирующий эффект на структуру белка. Для проверки этой гипотезы было исследовано влияние восстанавливающего агента дитиотреитола (ДТТ) на денатурацию СЬВО-САРБЗ и ёЫ-САРОБ. Было показано, что инкубация белков в присутствии 50 мМ ДТТ не влияет на скорость инактивации ферментов (см. табл. 3). Кроме того все шесть остатков цистеина, приходящиеся на субъединицу, реагировали с ДТНБ в присутствии гуанидингидрохлорида (рис. 11). Таким образом, дополнительные остатки цистеина СИВО-ОАРОБ не образуют дисульфидных связей, и повышенная стабильность белка обусловлена другими причинами.

Рис. 11. Кривая титрования SH-rpynn ChBD-GAPDS в присутствии ДТНБ.

!з

О 20 40 60 80 100 120 140 160

Время, мин

Заключение. По данному разделу можно сделать следующее заключение. Из сперматозоидов человека был выделен растворимый и активный фрагмент ГАФДс 150 кДа по данным голубого нативного электрофореза и ~40 кДа по данным SDS-электрофореза) путем частичного отщепления N-концевого домена. Этот фрагмент ГАФДс является тетрамером, отщепление N-концевого домена позволяет экстрагировать его в раствор. Для изучения свойств и каталитических характеристик ГАФДс мы использовали рекомбинантные ферменты, выделенные из экстрактов трансформированных клеток E.coli: ГАФДс без N-концевого домена (dN-GAPDS) и ГАФДс с заменой N-концевого домена на хитинсвязывающий домен (ChBD-GAPDS). Мы показали, что наличие хитинсвязывающего домена не влияет на свойства и активность фермента. Оба рекомбинантных фермента являются тетрамерами и обладают повышенной стабильностью по сравнению с соматической ГАФД. С чем связана повышенная стабильность ГАФДс пока не ясно. Поскольку ГАФДс локализована в жгутике сперматозоида и обеспечивает энергией движение сперматозоида, повышенная стабильность фермента может быть необходима для сохранения способности сперматозоидов к успешному оплодотворению в течение всего срока их функционирования.

Исследование роли ГАФДс в подвижности сперматозоидов.

Определение активности ГАФДс в сперматозоидах с высокой и низкой подвижностью. ГАФДс необходима для обеспечения подвижности сперматозоида: разрушение гена Gapds у мышей приводит к утрате подвижности сперматозоидов (Miki К. et al, 2004). Было сделано предположение, что при отсутствии каких-либо наследственных дефектов подвижность сперматозоидов может снижаться вследствие снижения активности ГАФДс.

Для проверки этого предположения, мы определяли активность ГАФДс в сперматозоидах с высокой и низкой подвижностью. Для этого исследовали

подвижность сперматозоидов в образцах человеческой спермы и определяли активность ГАФДс в каждом образце.

Клетки разрушали ультразвуком, осадок разрушенных клеток отделяли центрифугированием и определяли активность ГАФДс отдельно в осадке и в экстракте. Результаты представлены на диаграмме (рис. 12).

Из представленных на рис. 12 данных видно, что активность ГАФДс в экстрактах одинакова в сперматозоидах с высокой и низкой подвижностью. Так как ГАФДс связана с фиброзным слоем, то после обработки ультразвуком большая часть белка остаётся в нерастворимой фракции. Как видно из рис. 12, активность в осадке сперматозоидов с низкой подвижностью в 2-3 раза ниже, чем активность сперматозоидов с высокой подвижностью. Эти данные говорят о том, что именно ГАФДс, прочно ассоциированная с фиброзным слоем, которая не экстрагируется в раствор, имеет значение для обеспечения подвижности сперматозоидов, поэтому в дальнейших экспериментах для определения активности ГАФДс в сперматозоидах использовали только осадки разрушенных клеток.

1 45-55% поступательной подвижности I 2-15% поступательной подвижности

осадок

супернатант

Рис. 12. Активность ГАФДс в экстрактах и осадках

сперматозоидов с высокой и низкой подвижностью.

осадок

супернатант

Высокая подвижность Низкая подвижность

Влияние tf2(h и других окислителей на подвижность сперматозоидов.

Было сделано предположение, что снижение подвижности сперматозоидов может происходить в результате окисления ГАФДс активными формами кислорода (АФК). В литературе пагубный эффект АФК на подвижность сперматозоидов связывают с перекисным окислением жиров в плазматической мембране (Williams A. and Ford W., 2005), а именно с потерей проницаемости плазматической мембраны из-за перекисного окисления мембранных фосфолипидов. Однако остается непонятным, почему снижается подвижность сперматозоидов. Возможно, АФК влияют также на активность ГАФДс, окисляя SH-группы фермента, что способствует снижению подвижности сперматозоидов. Для проверки возможности окисления ГАФДс исследовали действие перекиси водорода на подвижность сперматозоидов с последующим определением активности ГАФДс в осадке разрушенных клеток

после обработки ультразвуком. По результатам были построены диаграммы, которые представлены на рис. 13. Из приведенных данных следует, что подвижность сперматозоидов несколько снижается при инкубации в отсутствие окислителей, а добавление перекиси водорода вызывает существенное уменьшение их подвижности вплоть до полного обездвиживания. Уменьшение активности ГАФД коррелирует со снижением подвижности сперматозоидов.

Заключение. Показано, что в сперматозоидах с высокой подвижностью активность ГАФДс выше, чем в сперматозоидах с низкой подвижностью. Обнаружено, что в присутствии перекиси водорода подвижность сперматозоидов значительно снижается, причем снижение подвижности коррелирует со снижением активности ГАФДс. Вероятно, одной из причин снижения подвижности сперматозоидов в присутствии АФК является окисление ГАФДс. Эти данные свидетельствуют о необходимости ГАФДс для обеспечения подвижности сперматозоидов и ее возможной роли в качестве мишени для активных форм кислорода, которые продуцируются как самими сперматозоидами, так и лейкоцитами.

Исследование содержания ГАФДс в сперматозоидах пациентов с астенозооспермией.

Существуют многочисленные наследственные дефекты сперматозоидов, приводящие к их полной неподвижности (астенозооспермия), которая исключает возможность естественного оплодотворения. Одним из таких дефектов является нарушение структуры жгутика сперматозоида, которое описано в литературе как дисплазия фиброзного слоя жгутиков (ДФС). При этом заболевании сперматозоиды формируются с укороченными, несгибаемыми и неподвижными жгутиками с гипертрофированным и неорганизованным фиброзным слоем (рис. 14). ДФС приводит к почти к полной неподвижности сперматозоида, но ядерная и акросомная структуры могут быть не повреждены (СЬетеэ Н. е1 а1, 1998). Дисплазия фиброзного слоя - это одно из редких

Рис. 13. Соотношение подвижности сперматозоидов и активности ГАФДс после инкубации образцов спермы в присутствии перекиси водорода (коэффициент корреляции Пирсона 0,97).

нарушений, связанных генетическими дефектами жгутика сперматозоида. Как и другие генетические дефекты, ДФС часто носит фамильный характер, однако до сих пор не выявлен ген, ответственный за развитие этого дефекта. Возможно, ДФС - это мультигенное заболевание, вызванное изменениями продуктов нескольких разных генов.

Любая информация относительно изменения белкового состава фиброзного слоя при ДФС может оказаться полезной для установления причин этого дефекта. Поскольку ГАФДс связана с фиброзным слоем, мы предположили, что нарушения в формировании этого компонента жгутика может приводить к нарушению связывания ГАФДс и, как следствие, к снижению ее содержания.

Мы изучали активность ГАФДс в сперматозоидах пациентов с ДФС в сравнении с нормальными сперматозоидами. Образцы спермы пациентов с астенозооспермией исследовали при помощи электронной микроскопии. На рис. 14 Б показаны характерные особенности ультраструктуры жгутиков сперматозоидов пациентов с астенозооспермией. Все эти особенности позволяют сделать вывод, что наблюдаемые дефекты жгутиков связаны с ДФС.

Рис. 14. Продольные срезы через средний и основной отделы жгутиков нормального сперматозоида (А) и с ДФС (Б). Сперматозоид с ДФС с коротким широким митохондриальным слоем и неорганизованным основным участком жгутика. НПФ - наружные плотные фибриллы, MTX - митохондриальный слой, ПР -поперечные рёбра, ЦМ - центральная микротрубочка, Г- головка сперматозоида, ФС -фиброзный слой.

На рис. 15 показано распределение активности ГАФДс между нерастворимой и растворимой фракциями после разрушения сперматозоидов ультразвуком в норме и при ДФС. Основная часть активности ГАФДс в нормальных сперматозоидах ассоциирована с нерастворимой фракцией. Это связано с тем, что ГАФДс находится в фиброзном слое и не экстрагируется водными растворами. В случае сперматозоидов с ДФС, в обеих фракциях образцов была низкая активность. Из рис. 15 видно также, что активность ГАФДс в сперматозоидах с ДФС приблизительно одинакова в супернатанте и осадке. Эти данные не совпадают с нормой, где активность фермента в осадке значительно выше, чем в супернатанте. Это наблюдение указывает на то, что в случае ДФС фермент легче экстрагируется в раствор по сравнению с нормой, следовательно, есть нарушения связывания ГАФДс с белками фиброзного слоя.

Рис. 15. Активность ГАФДс в

разных клеточных фракциях

сперматозоидов

в норме и при ДФС.

(*р<0,01 согласно и-тесту

Манна-Уитни).

Норма

ДФС

Поскольку общая активность ГАФДс в сперматозоидах с ДФС намного ниже, чем в норме, это может быть связано со снижением содержания этого фермента в фиброзном слое. Чтобы это проверить, мы проанализировали содержание ГАФДс в нерастворимых фракциях разрушенных сперматозоидов с ДФС методом иммуноблотинга. Мембрану окрашивали моноклональными антителами против ГАФДс. Было исследовано 5 образцов спермы с ДФС. Контролем служили образцы нормальных сперматозоидов. Интенсивность полос, соответствующих ГАФДс, в случае образцов с ДФС во много раз ниже контроля, а в некоторых случаях полоса ГАФДс вообще отсутствует. Соотношение интенсивности полос показано на рис. 16.

Ам1к Г1Ы

К К 1 2 3 4 5

Рис. 16. А:

Иммуноокрашивание осадков нормальных сперматозоидов (К) и сперматозоидов с ДФС (1-5) моноклональными антителами к ГАФДс.

Б:

Относительная

интенсивность окрашивания образцов с ДФС по отношению к контролю (в каждом эксперименте оптическую плотность полосы в контрольном образце принимали за 100%).

° К ДФС1 2 3 4 5

Таким образом, мы можем заключить, что в сперматозоидах с ДФС наблюдается дефицит ГАФДс по сравнению с нормой.

Можно было бы предположить, что нарушение формирования фиброзного слоя может быть связано именно с недостаточностью ГАФДс. Однако ранее было показано, что при разрушении гена СарЛ у мышей блокируется поступательное движение сперматозоидов у мутантов, но не нарушается формирование фиброзного слоя (М11а К. й а1, 2004). Таким образом, недостаточность ГАФДс в сперматозоидах пациентов с ДФС является не причиной, а следствием ДФС.

Заключение. Дисплазия фиброзного слоя жгутиков сперматозоидов характеризуется почти полным отсутствием подвижности сперматозоидов в связи с серьезными нарушениями в формировании фиброзного слоя. Поскольку ГАФДс связана своим К-концевым доменом с фиброзным слоем, изменения в его формировании приводят к нарушению включения фермента в фиброзный слой на стадии спермиогенеза. Возможно, что свободный фермент легче подвергается деградации. В результате количество фермента в сперматозоидах с ДФС значительно ниже, чем в норме. Известно, что процесс формирования фиброзного слоя и встраивания в него ферментов очень строго регулируется. Нарушения регуляции формирования фиброзного слоя могут быть связаны с недостаточностью неизвестного белка, ответственного за связывание ГАФДс, что и приводит к снижению содержания ГАФДс в сперме пациентов с ДФС.

ВЫВОДЫ

1. Из сперматозоидов человека выделена растворимая и активная ГАФДс без Ы-концевого домена с удельной активностью 10-50 Ед/мг. Показано, что выделенная ГАФДс является тетрамером.

2. Выделены растворимые гомогенные препараты рекомбинантной ГАФДс (СИВО-вАРОв), содержащий хитин-связывающий домен вместо Ы-концевого домена, и рекомбинантной ГАФДс без Ы-концевого домена (сйЧ-ОАРОэ) с удельными активностями 40-50 Ед/мг.

3. Показано, что оба рекомбинантных фермента (СЬВО-САРОх и ёЫ-САРОэ) являются тетрамерами и обладают повышенной стабильностью по сравнению с соматической ГАФД.

4. Показано, что в сперматозоидах с высокой подвижностью активность ГАФДс выше, чем в сперматозоидах с низкой подвижностью.

5. Показано, что в присутствии перекиси водорода подвижность сперматозоидов значительно снижается, что коррелирует со снижением активности ГАФДс.

6. Показано, что при астенозооспермии, связанной с дисплазией фиброзного слоя жгутиков сперматозоидов, значительно снижается содержание и активность ГАФДс.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Щуцкая Ю.Ю., Элькина Ю.Л. Выделение и характеристика глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из сперматозоидов человека. Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», 2006, с. 260.

2. Элькина Ю.Л. Роль глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в регуляции подвижности сперматозоидов. Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», 2007, с. 40.

3. Щуцкая Ю.Ю., Элькина Ю.Л., Куравский М.Л., Брагина Е.Е. и Шмальгаузен Е.В. Исследование глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из сперматозоидов человека. Биохимия, 2008, 73(2), с.228-237.

4. Шмальгаузен Е.В., Элькина Ю.Л., Брагина Е.Е., Шилейко Л.В., Черных В.Б., Курило Л.Ф. Ультраструктурные и биохимические нарушения жгутика сперматозоидов при астенозооспермии. Андрология и генитальная хирургия, 2008, 3, с.25-31.

5. Elkina Y.L., Bragina Е.Е., Schmalhausen E.V. Effect of different factors on the motility of human sperm. Materials of 33 FEBS Congress "Biochemistry of cell regulation", FEBS Journal (supplement), 2008, 275 (1), 398.

6. Элькина Ю.Л. (2008) Препараты, регулирующие подвижность сперматозоидов путем изменения активности спермоспецифичной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Материалы пятого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, 2008, с. 351-352.

7. Куравский М.Л., Элькина Ю.Л., Эльдаров М.А. Сперматозоидная глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа человека: выделение, очистка и исследование влияния на её активность различных факторов. Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», 2009, с. 53.

8. Elkina Yu.L., Bragina Е.Е., Schmalhausen E.V. (2010) Deficiency in the glycolytic enzyme GAPDS in sperms with dysplasia of fibrous sheath. 4th ESF Conference on Functional Genomics and Disease, Germany, Drezden, New Biotechnology, 2010, 27 (1), 65.

9. Куравский М.Л., Элькина Ю.Л. (2010) Специфическое ингибирование сперматозоидной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», 2010, с. 15.

10. Elkina Yu.L., Kuravsky M.L., El'darov M.A., Stogov S.V., Muronetz V.I., Schmalhausen E.V. Recombinant Human Sperm-Specific Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase: Structural Basis for Enhanced Stability. Biochim. Biophys. Acta, 2010, DOI: 10.1016/j .bbapap.2010.09.002.

Заказ № 102-а/09/10 Подписано в печать 15.09.2010 Тираж 75 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 У) www.cfr.ru; e-maihmfo%cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Элькина, Юлия Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Сперматогенез.

Строение сперматозоида.

Строение фиброзного слоя.

Подвижность сперматозоидов.

Механизм движения.

Регуляция подвижности.

Роль кальция в подвижности.

Энергообеспечение движения жгутика сперматозоида.

Доказательства важности гликолиза для движения жгутика.

Соматическая глицеральдегид-3 -фосфатдегидрогеназа.

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа сперматозоидов (ГАФДс).

Регуляция экспрессии ГАФДс.

Активные формы кислорода.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Реактивы.

Аналитические методы.

Определение концентрации белка.

Определение ферментативной активности ГАФДс.

Определение концентраций реагентов.

Определение концентрации перекиси водорода.

Определение Кт для субстратов.

SDS-электрофорез по методы Лэммли.

Голубой нативный гель-электрофорез.

Электроперенос белков с последующим иммунохимическим окрашиванием.

Изучение влияния различных факторов на подвижность сперматозоидов.

Определение активности ГАФДс в сперматозоидах.

Исследование влияния перекиси водорода на подвижность сперматозоидов и активность ГАФДс.

Приготовление пробы для масс-спектрометрического анализа выделенного белка.

Дифференциальная сканирующая калориметрия.

Метод динамического светорассеяния.

Денатурация в 4М гуанидингидрохлориде.

Титрование SH-групп ГАФД.

Окисление перекисью водорода.

Термоинактивация.

Влияние ингибиторов.

Получение поликлональных антител на ГАФДс.

Твёрдофазный иммуноферментный анализ.

Метод электронной микроскопии.

Выделение белков.

Выделение ГАФД из скелетных мышц кролика.

Выделение ГАФДс из сперматозоидов человека.

Клонирование рекомбинантных белков.

Культивирование продуцентов.

Выделение ГАФДс без N-концевого домена (dN-GAPDS).

Выделение ГАФДс с хитинсвязывающим доменом (ChBD-GAPDS).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение ГАФДс из сперматозоидов человека.

Трипсинолиз.

Выделение ГАФДс из сперматозоидов человека.

Чистота препаратов ГАФДс.

Анализ выделенного фрагмента ГАФДс методом, масс-спектрометрии

MALDI).

Зависимость активности от рН.

Определение молекулярной массы и олигомерного состава ГАФДс.

Роль дополнительных цистеиновых остатков в молекуле ГАФДс.

Выделение рекомбинантной ГАФДс из клеток E.coli.

Экспрессия полноразмерной рекомбинантной ГАФДс трансформированными клетками E.coli Rosetta 2(DE3)/ pETGAPDS.

Выделение ChBD-GAPDS из клеток E.coli Rosetta

2(DE3)/ pETmChBD/dGAPDHS.

ГАФДс без N-концевого домена (dN-GAPDS).

Исследование рекомбинантных форм ГАФДс в сравнении с мышечным ферментом ГАФД.

Каталитические свойства рекомбинантных ферментов.

Анализ размеров частиц.

Термостабильность рекомбинантных форм ГАФДс.

Устойчивость к денатурации.

Возможность стабилизации GAPDS дисульфидными связями.

Влияние ароматических SH-содержащих соединений на активность

ChBD-GAPDS и ГАФД.

Получение поликлональных антител на ГАФДс.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из сперматозоидов: выделение, свойства и роль в их подвижности"

Актуальность проблемы инфертильности

В последние несколько десятилетий во всем мире отмечается ухудшение ситуации с мужской фертильностью. По данным Всемирной Организации Здравоохранения на 1990 год 20% семейных пар бесплодны, и в 50% случаев хотя бы частично причина кроется в мужской репродуктивной способности.

Патологии, лежащие в основе мужского бесплодия, можно разделить на несколько категорий. С одной стороны, это нарушения в репродуктивной системе или дефицит половых гормонов, которые хорошо диагностируются и зачастую поддаются коррекции. Следующий уровень — нарушения в количестве и/или морфологии сперматозоидов. Во всем мире наблюдается неутешительная тенденция к снижению концентрации сперматозоидов. С 1938 по 1990 годы согласно данным из 60 независимых центров по всему миру концентрация сперматозоидов уменьшилась практически в два раза - со 113 до 66 млн/мл (Carlsen Е. et al, 1992). На сегодняшний день, согласно инструкции ВОЗ, в качестве нормальной принята концентрация не менее 20 млн/мл.

Нарушение подвижности сперматозоидов

Однако в силу неизученности молекулярных механизмов, обеспечивающих нормальную подвижность сперматозоидов, медицинских подходов, влияющих на причину подобных патологий, практически не существует.

Таким образом, изучение белков, необходимых для подвижности сперматозоида, представляется актуальным вопросом современной биохимии. Одним из таких белков является сперматозоидная изоформа глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФДс), которая встречается только в сперматозоидах и существенно отличается от глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы соматических клеток (ГАФД). Свойства ГАФДс практически не исследованы, однако ГАФДс является очень интересным объектом для исследования в связи с важной ролью в обеспечении подвижности сперматозоидов. Возможность направленного влияния на активность ГАФДс может быть использована как для увеличения фертильности, так и для контрацепции. Целью нашей работы было изучение ГАФДс из сперматозоидов человека, а также исследование связи между подвижностью сперматозоидов и активностью ГАФДс. Были поставлены следующие задачи:

1. Разработка метода выделения ГАФДс и исследование ГАФДс в сравнении с соматической ГАФД. Поиск ингибиторов, специфичных для ГАФДс.

2. Исследование влияния окислителей как потенциальных ингибиторов ГАФДс на подвижность сперматозоидов.

3. Исследование спермы пациентов с астенозооспермией на активность и содержание ГАФДс с целью выявления возможной взаимосвязи между неподвижностью спермы и отсутствием ГАФДс.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Сперматогенез

Сперматогенезом называется процесс развития сперматозоидов из сперматогониальных стволовых клеток. Сперматогенез млекопитающих представляет собой серию высокоспециализированных строго регулируемых процессов, включающих митоз, мейоз и дифференцировку клеток-предшественников сперматозоидов. У человека процесс сперматогенеза начинается в пубертатном возрасте и продолжается в течение всей жизни.

Первичные половые клетки (гоноциты), мигрируют в развивающееся яичко еще в эмбриогенезе. При наступлении половой зрелости гоноциты трансформируются в сперматогонии (Clermont Y., 1972; Rowley М. et al, 1971). Светлые сперматогонии типа А (стволовые клетки сперматогенеза) делятся митотически, дифференцируясь в сперматогонии типа В — клетки со светлым ядром и хорошо выраженным периферическим хроматином.

После ряда митотических делений сперматогонии типа В вступают в мейоз, дифференцируясь в сперматоциты I порядка, которые превращаются в сперматоциты II порядка. Затем в результате еще одного мейотического деления сперматоциты дифференцируются в округлые гаплоидные клетки -сперматиды. Они подвергаются ряду морфологических и биохимических преобразований в процессе спермиогенеза (Ченцов Ю. С., 1984; Millette C.F., 1990; de Kretser D. and Kerr J., 1988; Албертс Б. и др., 1994), в результате которого округлые сперматиды превращаются в удлиненные высокоспециализированные клетки - сперматозоиды (Рис. 1).

В процессе спермиогенеза (последняя фаза сперматогенеза) условно выделяют несколько стадий (рис.1). Внутри них выделяют отдельные этапы на основе изменений, которые наблюдаются в ядре и развивающейся акросомной системе. Первая стадия — фаза интенсивного развития аппарата

Гольджи в цитоплазме сперматиды. Новообразованные сперматиды — сферические или многогранные, с расположенным по центру ядром. Рядом с ядром появляются проакросомные гранулы, содержащие литические ферменты и являющиеся производившей комплекса Гольджи. (этапы 1-3).

На стадии «шапочки» (этапы 4-7) на переднем конце ядра будущего сперматозоида формируется акросома — небольшое электронноплотное полушарие из слившихся в одну проакросомных гранул, контактирующее с ядерной оболочкой.

В фазе формирования удлиненной сперматиды (этапы 8-14) происходит удлинение ядра, сопровождаемое конденсацией хроматина. Ядро теряет центральную позицию, перемещаясь в сторону будущей головки. Пара центриолей мигрирует к хвостовому полюсу ядра, затем одна из центриолей (дистальная) дает начало аксонеме жгутика, а вторая (проксимальная) сохраняется как рудиментарная структура. Растущая аксонема доходит до плазмалеммы и вытягивается, образуя выступ. Митохондрии скапливаются вокруг средней части будущего жгутика.

В заключительной фазе созревания (этапы 15-19) происходит удаление путем экзоцитоза цитоплазматической капли с шейки сперматозоида в виде «остаточных телец» и последующий фагоцитоз таких капель клетками Сертоли или эпителиальными клетками эпидидимиса (Holstein А., 1976).

Сначала созревание сперматозоидов происходит в цитоплазме клеток Сертоли, однако, выходящие в проток семенных канальцев сперматозоиды не способны к успешному оплодотворению в естественных условиях. Для этого они должны пройти в проток эпидидимиса (придатка яичка), где под действием секретируемых эпидидимисом андроген-зависимых факторов происходит окончательное созревание сперматозоидов (Mooney J. et al, 1972; Moore Н., 1996; Moore Н., 1990). После этого сперматозоиды считаются полностью созревшими и способными к оплодотворению.

Аглзрот г«ып Гранулы сливаются и арменифуется эхсонеиэ формируется нэ трубочек детальней центриоли

Рис. 1. Процесс спермиогенеза.

Строение сперматозоида

Процесс сперматогенеза — это необычный процесс клеточной дифференцировки, в результате которого образуются клетки с высокой степенью структурированности и специфичности цитоплазмы. Уникальные компоненты сперматозоида — акросома, жгутик и конденсированное ядро образованы в результате этого процесса. Нормальные зрелые сперматозоиды состоят из головки, шейки и жгутика (рис.2). Плоская головка имеет в плане уплощенную овальную форму, при виде сбоку — удлиненную форму с заостренным передним полюсом. Передняя часть головки покрыта акросомой. Акросома представляет собой плоскую цистерну, содержащую литические ферменты (протеазы, гиалуронидазы, нейраминидазы, кислые фосфатазы), необходимые для процесса проникновения сперматозоида в яйцеклетку (Yanagimachi R., 1994). Акросома занимает 25-60% ядерной поверхности. Ядро занимает большую часть головки зрелого сперматозоида и заполнено плотно упакованным хроматином.

Шейка сперматозоида выглядит как утолщение жгутика и включает в себя перпендикулярно расположенные центриоли, от одной из них (дистальной) отходит аксонема. жгутик головка шейка средний участок основной участок концевой участок акросома ядро центриоли митохондрии

Рис. 2. Морфология сперматозоида [Harun Yahya, 2003].

Жгутик сперматозоида подразделяется на средний, основной и концевой отделы. «Стержнем» жгутика является аксонема, которая расположена по всей длине жгутика. Аксонема состоит из микротрубочек, организованных по универсальной схеме 9 + 2 — центральная пара, окруженная на одинаковом расстоянии 9 парами периферических микротрубочек (рис. 3, A) (Gibbons I., 1981). Каждый периферический дуплет состоит из полной микротрубочки (субъединица А) и примыкающей к ней неполной микротрубочки (субъединица В). От субъединицы А каждого дуплета в сторону субъединицы В следующего по часовой стрелке дуплета отходят две динеиновые ручки, состоящие из белка динеина, проявляющего Mg-зависимую АТР-азную активность. Дуплеты соединены тонкими нексиновыми мостиками, радиальные «спицы» прикреплены к листку, окружающему центральную пару микротрубочек (рис.3, А). Вся эта сложная структура обеспечивает скользящее движение микротрубочек, обеспечивающее ундуляцию жгутика. Микротрубочки аксонемы прикреплены к дистальной центриоли шейки сперматозоида и тянутся до кончика жгутика. В зависимости от строения добавочных структур, окружающих аксонему, морфологически в жгутике выделяют средний, основной и концевой участки (рис.3).

В средней части жгутика аксонема окружена дополнительным слоем из 9 наружных плотных фибрилл и спирально расположенных митохондрий (рис.3, А). Основной участок жгутика характеризуется наличием фиброзного слоя и 7 (вместо 9) наружных плотных фибрилл (рис.3, Б). Концевой участок (рис.3, В) состоит из аксонемы, окруженной плазматической мембраной (FawcettD. W., 1975).

Аксонема высоко консервативна во всех флагеллярных эукариотических клетках, а митохондриальный слой, наружные плотные фибриллы и фиброзный слой - структуры, присутствующие исключительно в жгутике сперматозоидов млекопитающих. средний участок основной участок концевой участок В

ПДМ цпм

PC ДР

НПФ

ПК пм

Рис. 3. Строение жгутика [Turner R., 2003]. А - поперечный срез среднего участка; Б - поперечный срез основного участка; В - поперечный срез концевого участка.

ПМ - плазматическая мембрана; МС - митохондриальный слой; НПФ -наружные плотные фибриллы; ПДМ — периферический дуплет микротрубочек аксонемы; ДР — динеиновые ручки; PC - радиальные спицы; ЦПМ - центральная пара микротрубочек аксонемы; ПК - продольные колонны фиброзного слоя; Г1Р - поперечные ребра фиброзного слоя.

Строение фиброзного слоя

Фиброзный слой - это уникальный компонент цитоскелета, локализованный в основном участке жгутика под плазматической мембраной (рис.3, Б).

Фиброзный слой состоит из дорзальной и вентральной колонн, соединенных поперечными ребрами, как показано на рис. 3, Б (ПК и ПР) (Брагина Е.Е. и Абдурахмаликов Р.А., 2002). Колонны развиваются во время ранних этапов сперматогенеза, а ребра появляются позже и развиваются на поздних этапах (Tanii, I., 2007). Раньше считалось, что фиброзный слой нужен исключительно для модуляции изгиба жгутика у особей с внутренним оплодотворением. Однако растущее количество данных о присутствии в этой структуре белков, участвующих в обеспечивающих движение сигнальных путях и метаболизме, позволяет сделать предположение о другой, дополнительной роли фиброзного слоя. Методы молекулярной биологии привели к определению некоторых компонентов, передающих сигналы. Сейчас стало очевидным, что помимо роли фиброзного слоя в качестве цитоскелета, возможно, он служит каркасом, центром организации множества сигнальных и метаболических путей, необходимых для нормального функционирования жгутика (Turner R., 2003).

Аминокислотный анализ показал, что у крыс фиброзный слой характеризуется высоким содержанием аспартата и глутамата, а также фосфосерина. У человека также показана возможность гликозилирования и фосфорилирования фиброзного слоя (Escalier D., 1997).

Внутримолекулярные дисульфидные связи стабилизируют фиброзный слой, когда сперматозоид проходит придаток яичка и подвергается созреванию (Bedford J. and Calvin H., 1974; Shalgi R. et al, 1989). Фиброзный слой очень устойчив к растворению и это позволило его выделить в достаточно чистом виде для биохимических исследований. На сегодняшний день известно 13 основных белков фиброзного слоя. Ниже будут описаны некоторые из этих белков, а также обсуждена их возможная роль в функционировании жгутика.

Белки, связывающие протеинкиназу А (АКАР. A Kinase Associated Proteins)

АКАР - это семейство белков, связывающих протеинкиназу А (РКА) со специфическими внутриклеточными мишенями. В случае сперматозоидов, белки АКАР связывают РКА с фиброзным слоем, таким образом ограничивая территорию действия протеинкиназы в непосредственной близости от её мишеней в аксонеме, связанных с подвижностью.

Три основных белка фиброзного слоя - АКАР4, АКАРЗ и ТАКАР80 являются сАМР-зависимыми белками, связывающими РКА. Они играют роль каркаса (scaffold) для компонентов сигнальных путей, которые модулируют разные клеточные функции.

Методом иммунофлуоресцентной микроскопии было показано, что АКАР4 находится в основном участке жгутика и синтезируется как предшественник с молекулярной массой 92кДа, который впоследствии превращается в форму с молекулярной массой 80 кДа. Иммуноэлектронная микроскопия показала присутствие АКАР4 как в колоннах, так и в рёбрах фиброзного слоя (Johnson et al., 1997). У АКАР4 есть 2 участка связывания РКА, обладающие разной специфичностью к изоформам регуляторных субъединиц протеинкиназы. Один может связать регуляторные субъединицы RIa и Rlla, а второй специфичен только к RIa (Miki К. and Eddy Е., 1998). АКАР4 связывает АКАРЗ, а также 2 других белка FSEP1 и FSIP2 (Fibrous sheath interacting proteins). Ген Akap4 экспрессируется в постмейотической фазе сперматогенеза (Carrera A. et al, 1994; Fulcher К. et al, 1995) и производит 2 транскрипта, один из которых на 9 аминокислот длиннее другого (Johnson L. et al, 1997). Мутагенез гена Акар4 приводит к тому, что в сперматозоиде формируется предшественник колонн и рёбер, но полностью сформированного фиброзного слоя нет (Miki К. et al, 2002).

АКАРЗ впервые был найден в фиброзном слое сперматозоидов быков. Впоследствии этот белок был открыт в сперме людей, обезьян и мышей. У быков этот белок, названный АКАР110, находится в основном участке жгутика, а также в акросоме. Для человека in vitro было показано, что аналогичный белок, названный FSP95, находится в основном участке жгутика, подвергается тирозиновому фосфорилированию во время капацитации (комплекс последовательных изменений на мембране и в цитоплазме сперматозоида, необходимых для приобретения им способности к оплодотворению) и на 40% идентичен АКАР4 (Mandal A. et al, 1999). Мышиный ген этого белка был назван АкарЗ и впоследствии этот белок из всех объектов был переименован в АКАРЗ. Белок тканеспецифичен, его транскрипты были найдены только в яичках. АКАРЗ человека был найден только в фиброзном слое и локализован в поперечных рёбрах сперматозоидов. Он встраивается в фиброзный слой в процессе образования рёбер и даже вовлечен в синтез их предшественников. С РКА-связывающим доменом АКАРЗ человека взаимодействуют 2 белка: ропоррин -специфичный сперматозоидный белок, участвующий в Rho сигнальном каскаде, и белок, названный AKAP-associated sperm protein (ASP). Возможно, АКАРЗ участвует в Rho пути передачи сигнала (Carr D. et al., 2001).

В сперматозоидах крыс был найден белок ТАКАР80. Между его последовательностью и АКАР4 не было найдено гомологии. На данный момент информации об этом белке нет.

Рофилин - это предполагаемая нисходящая мишень для Rho, маленькой ГТФазы, которая работает как молекулярный переключатель для инициации реорганизации актина и регуляции соединения клетки с субстратом, подвижности и цитокинеза (Bishop A. and Hall А., 2000; Takai Y. et al., 2001). Рофилин — один из нескольких белков, содержащих Rho-связывающий участок, однако он обладает низкой сериновой/треониновой протеинкиназной активностью и, предположительно, является адаптером, связывающим Rho с другими белками. Рофиллин в основном экспрессируется в яичках мышей, и связан с фиброзным слоем (Nakamura К. et al, 1999). Своим С-концом он связывается с еще одним белком фиброзного слоя — роппорином.

Роппорин в свою очередь связывается N-концом с сайтом АКАР, связывающим РКА. Электронная микроскопия показала, что роппорина больше на внутренней поверхности фиброзного слоя, а рофилина больше на наружной поверхности плотных наружных фибрилл (Fujita A. et al, 2000).

Полагают, что фиброзный слой регулирует изгиб и влияет на состояние биения. С этим в значительной степени связана сложность получения доступа к фиброзному слою in situ, чтобы отделить активности одних компонентов жгутика от других.

Присутствие АКАРЗ, АКАР4 и ТАКАР-80 в фиброзном слое четко подтверждает, что одна из его важных ролей — связывание РКА. Основная характеристика АКАР - это наличие амфипатической спирали, которая связывает РКА (Carr D. et al, 1991) в специфичных местах внутри клетки, вследствие чего РКА оказывается в непосредственной близости к белку-мишени (Pawson Т. and Scott J., 1997).

Важность АКАР4, как каркасного белка, участвующего в регуляции подвижности была недавно показана разрушением гена Акар4, продукт которого белок АКАР4 очень близок к АКАРЗ. У мутантных мышей были дефекты жгутика сперматозоида и подвижности, в результате приводящие к бесплодию (Miki К. et al, 2004).

Фиброзный слой служит каркасом для ферментов гликолитического пути, которые обеспечивают сперматозоид энергией для гиперактивированного и поступательного движения. Оно необходимо для достижения яйцевода и проникновения в прозрачную оболочку яйцеклетки. (Eddy Е. et al, 2003, Miki К. et al, 2004 ).

Было показано, что изоформы нескольких гликолитических ферментов экспрессируются генами-паралогами только в сперматозоидах и только во время сперматогенеза (Boer P. et al, 1987; Мс Carrey J. and Thomas К., 1987; Millian J. et al, 1987; Sakai I. et al, 1987; Welch J. et al, 1992), и они связаны с фиброзным слоем. Примерами являются 3-фосфоглицераткиназа, лактатдегидрогеназа и спермоспецифичная глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФДс). ГАФДс — первый гликолитический фермент, для которого доказана связь с фиброзным слоем. Этот фермент синтезируется на поздних стадиях сперматогенеза как интегральный компонент фиброзного слоя и составляет около 16% от всего белка, изолированного из фиброзного слоя мыши (Eddy Е., 1991).

Подвижность сперматозоидов

Сперматозоиды большинства млекопитающих обладают двумя типами физиологической подвижности: активированная и гиперактивированная. В случае активированной (или прогрессивной) подвижности жгутик совершает симметричные, низкоамплитудные волнообразные движения, что приводит к движению сперматозоида по относительно прямой линии. При приобретении гиперактивированной подвижности жгутик бьется асимметрично и с большой амплитудой, совершая круговые движения или движения типа восьмерки.

По существующим представлениям, активированная подвижность позволяет сперматозоиду эффективно продвигаться по женской репродуктивной системе к фаллопиевой трубе, в то время как гиперактивированная подвижность необходима для «отцепления» от эпителия яйцевода, достижения места оплодотворения и пенетрации сперматозоидами фолликулярных клеток яйценосного венца и прозрачной оболочки яйцеклетки. То есть для успешного оплодотворения необходимо, чтобы сперматозоид обладал обоими типами физиологической подвижности с нормальной регуляцией переключения между ними (Turner R., 2003).

Механизм движения

При фосфорилировании динеиновых ручек аксонемы, динеиновая АТРаза активируется и гидролизует ATP (Tash J. et al, 1989; Tash J. and

Bracho G.,1998). Динеиновые ручки взаимодействуют с соседними дуплетами микротрубочек и генерируют движение, которое выглядит как скольжение микротрубочек. Поскольку аксонема связана с основанием головки сперматозоида, эта сила скольжения переходит в изгибание жгутика. Дефосфорилирование динеинов кальнеурином (кальмодулин-зависимая фосфатаза) тормозит этот процесс.

Динеины генерируют однонаправленную силу. Поэтому генерация нормального изгиба аксонемы требует того, чтобы процессы фосфорилирования/дефосфорилирования и связанная с ними активация и инактивация динеиновых ручек происходили в асинхронной манере, как по окружности, так и по всей длине аксонемы. Поэтому каждая динеиновая ручка взаимодействует с соседним дуплетом, генерирует движение этого дуплета и изгиб, затем высвобождает дуплет так, что аксонема может вернуться на свою начальную позицию и изогнуться снова в противоположном направлении.

Регуляция подвижности

На сегодняшний день найдены два основных пути, регулирующих подвижность сперматозоидов млекопитающих - это сАМР- и кальций-зависимые сигнальные пути.

Хотя существуют факты, подтверждающие важность фосфорилирования белков как ключевого процесса в передаче сигналов, стимулирующих подвижность, очень мало известно о том, какие именно протеинкиназы и фосфатазы вовлечены в этот процесс. В основном, подвижность сперматозоидов связана с увеличением фосфорилирования тирозинов специфических белков-мишеней в хвосте сперматозоида. Дефекты такого фосфорилирования специфических ферментов в ответ на капацитацию были описаны у пациентов с астенозооспермией и четко ассоциированы со снижением подвижности и гиперактивации сперматозоидов больных по сравнению с контрольной группой (Yunes R. et al, 2003; Buffone M. et al, 2005).

Фосфорилирование специфичных белков регулируется балансом между активностями протеинкиназ и фосфатаз (Tash J. et al, 1988; Vijayaraghavan S. et al, 1997). В частности, система Аденилатциклаза/сАМР/РКА вовлечена в фосфорилирование тирозина различных белков жгутика, ассоциированных с подвижностью сперматозоида (Саггега A. et al, 1996; Vijayaraghavan S. et al, 1997; Ficarro S. et al, 2003; Luconi M. et al, 2004). Конфокальная микроскопия фиксированных сперматозоидов с проницаемой мембраной подтверждает, что индуцированное капацитацией фосфорилирование тирозинов белков сперматозоидов, в частности АКАРЗ, происходит в основном в хвосте. Мало известно о белках-мишенях РКА, активированной АКАР и сАМР. Одной из таких мишеней является динеин аксонемы, фосфорилирование которого является критическим этапом в инициации подвижности. трансмембранный канал

HCOg I t t подвижность внутренний резерв фиброзный слой сериновая/треониновая фосфатаза тирозиновая протеинкиназа i © t подвижность тирозиновая фосфатаза

Рис. 4. Схематичное изображение наиболее вероятных сигнальных путей, вовлеченных в регуляцию подвижности сперматозоидов млекопитающих [Turner R., 2006].

Помимо классической трансмембранной аденилатциклазы (шАС) в сперматозоидах присутствует другая - растворимая аденилатциклаза (sAC), у которой нет трансмембранного домена, она не чувствительна к регуляции G-белком, но избирательно активируется бикарбонатом и ионами кальция (рис. 4). Исследования in vitro показали, что добавление бикарбоната к сперматозоидам приводит к значительному увеличению подвижности и некоторых параметров гиперактивации. Это происходит за счет активации sAC и фосфорилирования тирозинов АКАРЗ, в конце концов приводя к взаимодействию АКАРЗ и РКА. На такое сосуществование двух типов аденилатциклаз в сперматозоидах нельзя не обратить внимание, оно может быть связано с регуляцией скорости приобретения сперматозоидом максимального потенциала фертильности (Luconi М. et al, 2005). Инактивация гена sAC приводит к мужскому бесплодию и отсутствию поступательного движения, а также функций, производимых под действием НС03". К ним относится активация sAC, увеличение концентрации сАМР, увеличение частоты биения жгутика и индукция ассиметричного биения, изменение в пути фосфорилирования тирозинов и увеличение зависимого от деполяризации входа кальция. Показано, что sAC является основным ферментом, отвечающим за синтез сАМР в сперматозоидах (F. Xie, 2006).

Путь передачи сигнала, использующий сАМР в качестве вторичного мессенджера, вовлечен в регуляцию созревания сперматозоидов, подвижности, гиперактивации и акросомной реакции. РКА фосфорилирует белки по сериновым и треониновым остаткам и это, по всей видимости, активирует неопознанную тирозинкиназу, которая направлена на белки, находящиеся непосредственно в жгутике. РКА является преобладающей мишенью для сАМР (синтезируется из АТР аденилатциклазой, обычно в ответ на внешние стимулы).

Известно, что холофермент РКА состоит из двух каталитических (С) и двух регуляторных (R) субъединиц. Гены кодируют 4 регуляторные субъединицы (RIa, Rip, RIIa,RIip) и 3 субъединицы каталитические (Са,СР и Су) у людей, 2 (Са,СР) - у мышей. Субъединицы R димеризуются своими Nконцевыми последовательностями и связываются с АКАР на N-конце. Помимо этого у субъединиц R есть сАМР связывающий сайт и, когда связывается сАМР, субъединицы С высвобождены и активны. кДНК для единственной изоформы субъединицы С (Cs), обнаруженной в яичках барана, является объединенным вариантом С1а, найденным в других типах клеток (San Agustin J. et al, 1998). Были недавно клонированы кДНК для новых изоформ Са субъединиц в сперматозоидах людей, а также мышей (Сой) (Reinton N. et al, 2000; Desseyn J-L. et al, 2000), гомологичные овечьей к ДНК. Су изоформа была найдена только у приматов (Reinton N.et al, 1998). Пока остается непонятным, для чего необходимо такое разнообразие изоформ РКА сперматогенным клеткам. Возможно, это необходимо для увеличения доступного количества Са субъединиц. А также существуют гипотезы о том, что уникальная N-концевая последовательность РКА даёт уникальные возможности различных взаимодействий, существенных для сперматогенеза (Desseyn J-L. et al, 2000). Например, изменения во взаимодействии с R субъединицами, с другими белками, клеточными мембранами или растворимости ферментов (Reinton N. et al, 2000; Desseyn J-L. et al, 2000). Распределение С и R субъединиц в жгутике согласуется с мнением о важной роли РКА в регуляции подвижности сперматозоидов.

Известен только один пептид S-HT31 (синтетический аналог амфипатической спирали АКАР), проникающий через мембрану сперматозоида, который обратимо ингибирует связывание РКА с АКАР, подавляет движение бычьих сперматозоидов. Ингибирование каталитической активности РКА другими специфическими агентами практически не влияет на подвижность. Эти данные свидетельствуют о том, что именно взаимодействие регуляторной субъединицы РКА с белками АКАР существенно для подвижности (Vijayaraghavan S. et al, 1997).

Роль кальция в подвижности

В физиологических условиях кальций является одним из самых важных ионов, регулирующих подвижность сперматозоидов (Luconi М. and Baldi Е., 2003) . Разные типы кальциевых каналов были найдены по всей длине плазматической мембраны зрелого жгутика. Это говорит о важности проникновения кальция внутрь сперматозоида для обеспечения подвижности. Увеличение уровня внутриклеточного кальция может напрямую или опосредованно активировать аденилатциклазу и фосфолипазы, меняя таким образом активности некоторых ферментов. Для процесса оплодотворения млекопитающим необходимо гиперактивированное движение, которое индуцируется увеличением концентрации кальция в жгутике. Это приводит к переключению биения жгутика из симметричного в ассиметричное, увеличивая изгиб хвоста в одну сторону.

Внутриклеточные концентрации кальция должны строго регулироваться, чтобы активация сперматозоида произошла в нужное время. Известно, что снижение уровня наружного кальция при прохождении сперматозоида через придаток яичка связано с прогрессивным развитием подвижности сперматозоидов и увеличением фосфорилирования тирозинов белков (Lewis A. et al, 2001; Vijayaraghavan S. and Hoskins D., 1990) .

Молекулярные механизмы, лежащие в основе влияния кальция на подвижность сперматозоидов, до сих пор непонятны, хотя похоже, что они связаны с активацией протеинкиназ и фосфатаз. С одной стороны, уровень кальция в клетке должен оставаться низким, чтобы предотвратить активацию таких фосфатаз, как кальнеурин (Саггега A. et al, 1996), которые дефосфорилируют и инактивируют белки жгутика, отвечающие за подвижность (Саггега A. et al, 1996; Tash J. et al, 1988). С другой стороны, поддержание внутриклеточного кальциевого гомеостаза в присутствии высоких концентраций внеклеточного кальция снижает количество АТР, которое необходимо для фосфорилирования тирозинов и, как следствие, подвижности сперматозоидов (Baker М. et al, 2004).

Возможно, для гиперактивированного движения необходимы внутриклеточные запасы кальция. Однако, кроме как в акросоме, в сперматозоиде больше они нигде не найдены, поскольку в жгутике нет ЭПР. Шейка сперматозоида — единственный возможный пул кальция, необходимого для жгутика (Но Н. and Suarez S., 2003).

В сперматозоидах есть разные типы кальциевых каналов (например, потенциал-зависимые, циклонуклеотид-зависимые), но только каналы семейства CatSper (Cation channel of sperm) необходимы для оплодотворения. В сперматогенных клетках встречаются 4 изоформы каналов CatSper. При выключении всех 4 генов наблюдается полная инфертильность. Разрушение генов других типов кальциевых каналов не приводит к бесплодию. CatSper 1 находится в основном участке жгутика и необходим для сАМР индуцированного входа кальция в клетку. При делеции гена CatSperl не наблюдается увеличения концентрации внутриклеточного кальция, стимулирующего сАМР, что в итоге приводит к снижению подвижности сперматозоидов и мужскому бесплодию. Разрушение одного из двух генов {CatSperl или 2) мешает экспрессии второго гена. Сперматозоиды с поврежденными генами CatSperl и 2 in vitro не способны к оплодотворению, если не была удалена прозрачная оболочка яйцеклетки. Вход кальция через CatSper, индуцированный подщелачиванием, необходим для гиперактивированного движения. У мутантов CatSperl и 2 снижена подвижность и низкий уровень АТР, что указывает на возможную регуляцию этими каналами гликолиза, продуцирующего АТР для движения сперматозоида. (Navarro В., 2008).

Кальмодулин (СаМ) — повсеместный, высоко консервативный белок, который служит в качестве классического рецептора внутриклеточного кальция (Means A. et al, 1982). Как минимум некоторое влияние кальция на жгутик опосредовано через кальмодулин (White D. and Aitken R., 1989; Ahmad К. et al, 1995; Si Y. and Olds-Clarke P., 2000). Интересно, что каскад реакций, инициируемый СаМ, не проходит через растворимую аденилатциклазу. Это говорит в пользу наличия двух разобщенных каскадов, использующих кальций в качестве вторичного мессенджера.

Методом иммунофлуоресцентного анализа было показано, что СаМ локализован в основном участке жгутика и в акросоме. В жгутике он ассоциирован как с растворимой, так и с нерастворимой фракциями. Найден СаМ и в аксонеме. Предполагается, что он является сенсором, регулирующим подвижность. Комплекс Са /СаМ вовлечен в разные клеточные функции, в том числе подвижность, капацитацию и акросомную реакцию. Предполагается, что СаМ вовлечен в регуляцию гликолиза или утилизацию АТР, синтезированного во время гликолиза. Дело в том, что при ингибировании СаМ значительно снижается подвижность сперматозоидов. Если в среде присутствует субстрат для гликолиза (глюкоза) и отсутствуют субстраты для кислородного дыхания (лактат, пируват), увеличение уровня сАМР не достаточно для возобновления подвижности сперматозоидов с ингибированным кальмодулином (Schlingmann К., 2007). Уровень кальмодулина снижен у пациентов с астенозооспермией (Reyes R. et al, 1987).

Кальмодулин-зависимая протеинкиназа (СаМК) является мишенью кальмодулина. Изоформы этого белка найдены в сперматозоидах млекопитающих и его ингибиторы снижают подвижность сперматозоида. Исходя из этого, можно предположить, что в сперматозоидах существует каскад реакций, связанный с кальмодулином и нисходящим фосфорилированием белков, приводящий к активации подвижности (рис. 4).

Найден новый спермоспецифичный Са-связывающий белок - кислая изоформа (pi 4.0) белка CABYR (calcium-binding tyrosine phosphorylation-regulated protein) с молекулярной массой 86 кДа. Иммунолокализация CABYR в сперматидах яичек и жгутиках сперматозоидов эякулята показали, что это уникальный белок сперматогенных клеток. Фосфорилирование тирозинов кислой формы белка происходит во время капацитации. Связывание кальция этой изоформой in vitro значительно снижалось в присутствии щелочной фосфатазы. У CABYR найдены возможные участки связывания АКАР, а также участки, богатые пролином, взаимодействующие с SH3 доменами. Такие домены присутствуют во многих белках, и считается, что они являются структурами, связывающими белок, и могут быть вовлечены в передачу сигнала с наружной стороны клетки при участии тирозиновых протеинкиназ. У CABYR есть последовательность, сходная с димеризованными RII регуляторными субъединицами РКА (как у роппорина и ASP), которая, возможно, взаимодействует с АКАРЗ или АКАР4, участвуя в передаче сигнала через фиброзный слой (Naaby-Hansen S. et al, 2002). Найден белок, который взаимодействует с CABYR в фиброзном слое (FSCB). У него также есть кальций-связывающий домен и этот белок является субстратом РКА (Li Y-F. et al, 2007).

Энергообеспечение движения жгутика сперматозоида

Флагеллярная подвижность, обеспечиваемая динеиновыми «ручками» аксонемы, требует большого количества АТР. Источниками АТР в жгутике сперматозоида являются аэробное дыхание и гликолиз.

Митохондрии локализованы в средней части жгутика, образуя в морфологически нормальном сперматозоиде спираль с числом витков от 5 до 14 (Schultz-Larsen J., 1958). Несмотря на то, что их функции аналогичны функциям митохондрий соматических клеток, сперматозоидные митохондрии содержат специфичные белки и изоформы ферментов, найденные только в этих клетках (Turner R., 2003).

Поскольку локализация митохондрий ограничена средней частью жгутика, вырабатываемая АТР должна транспортироваться в дистальные районы. Математические модели, основанные на использовании константы диффузии АТР и морфометрической оценке объема мышиного сперматозоида, показали, что АТР, генерируемая митохондриями среднего участка, не может с нужной скоростью достигать всей аксонемы путем простой диффузии. Следовательно, должны быть механизмы «доставки»

ATP к дистальным участкам и/или метаболические пути генерации АТР участками, не имеющими митохондрий (Turner R., 2003).

Доказательства валсности гликолиза для движения жгутика

Если ранее считалось, что основная энергия при движении сперматозоида обеспечивается за счет митохондриального дыхания, то в последнее время появились работы, которые доказывают существенность вклада гликолиза (Williams A. and Ford W., 2001; Mukai С. and Okuno M., 2004; Miki K., et al, 2004).

Добавление ингибитора окислительного фосфорилирования СССР (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) к сперматозоидам в подходящей среде, содержащей глюкозу, не оказывает значительного влияния на подвижность клеток, а уровень АТР сохраняется таким же, как и в отсутствие СССР. Если в качестве субстрата в среду внести пируват или лактат, то при действии СССР подвижность и количество АТР резко падает. Также показано, что нормальная подвижность не может быть обеспечена в присутствии субстратов окислительного фосфорилирования при подавлении гликолиза. Добавление 2-дезокси-Г)-глюкозы, блокирующей гликолиз, при наличии пирувата или лактата уменьшает количество АТР и подвижность сперматозоидов (Mukai С. and Okuno М., 2004).

Митохондриальные ADP/ATP переносчики (ААС) функционируют как антипортеры, обменивая ADP из цитозоля на АТР из матрикса митохондрий в соотношении 1:1. ААС считаются основными связными между окислительным фосфорилированием и энергозатрачивающими процессами клеточного метаболизма. У людей сейчас известно 4 гена ААС. Один из белков ААС4 (SFEC) найден в жгутике сперматозоида. Известно, что он связан с основным участком жгутика и белками гликолиза. Такое соседство между белками гликолиза и переносчиком АТР подтверждает возможность производства энергии и ее транслокации в основной участок жгутика для поддержания движения и капацитации (Kim Y-H. et al, 2006).

Убедительным доказательством важности гликолиза также явилось получение мышей с нарушенной экспрессией гена Gapds. Выключение глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы привело к абсолютной инфертильности гомозиготных мышей, чьи сперматозоиды демонстрировали вялые движения на минимальные расстояния. В оболочке жгутика сперматозоидов находится МСТ2-транспортер, способный обеспечить доступ экзогенных пирувата и лактата при инкубации сперматозоидов в присутствии субстратов in vitro. Эксперименты показали, что при неизменном уровне потребления кислорода митохондриями и наличии пирувата и лактата в физиологических концентрациях, сперматозоиды Gapds' мышей вырабатывают только 10,4% АТР по сравнению со сперматозоидами мышей дикого типа (Miki К. et al, 2004).

Таким образом, значительная доля АТР для обеспечения подвижности сперматозоидов образуется за счет гликолитического пути.

Соматическая глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа катализирует реакцию окислительного фосфорилирования глицеральдегид-3-фосфата:

Глицеральдегид-З-фосфат +NAD+ + Pi «-> 1,3-дифосфоглицерат + NADH + Н+

К настоящему времени механизм реакции и строение соматического фермента (ГАФД) детально исследованы.

ГАФД состоит из четырех идентичных субъединиц массой по 36 кДа, каждая из которых связывает одну молекулу NAD+. Мономеры связаны между собой нековалентно. Рентгеноструктурный анализ показал, что каждая субъединица состоит из двух доменов: NAD+- связывающего (1-148) и субстрат-связывающего (149-333) (Mercer W.D., et al, 1976; Murthy M.R., et al, 1980; Skarzynski Т., et al, 1987) (рис.5, Б.) Третичная структура NAD+связывающего домена представлена складкой Россмана, типичной для семейства NAD+- зависимых дегидрогеназ (Buehner М., et al, 1973).

Механизм катализируемой реакции, представленный на рис.6, был открыт Варбургом и его сотрудниками в 1937-1938 годах (Warburg О. and Christien W., 1939). На первой стадии происходит связывание кофермента NAD+ в нуклеотид-связывающей области. Оно сопровождается появлением так называемой полосы Рэкера - полосы поглощения при 345-360 нм. Эта полоса обусловлена образованием комплекса с переносом заряда между SH-группой 149 остатка цистеина и NAD+. Взаимодействие субстрата с SH-группой 149 остатка цистеина приводит к формированию тиополуацеталя и сопровождается исчезновением полосы Рэкера (Racker Е. and Krimsky J., 1952). Далее происходит перенос гидрид-иона с субстрата на NAD+ с образованием тиоэфира и NADH. Сродство фермента к восстановленному NADH значительно меньше, поэтому происходит замена NADH на NAD+. Показано, что эта стадия является скорость-лимитирующей для всей реакции. Затем происходит фосфоролиз тиоэфира с образованием продукта — 1,3- дифосфоглицерата и регенерацией SH-группы 149 остатка цистеина (TrenthamD., 1971).

SH-группа цистеина 149, входящая в активный центр, активирована за счет специфического пространственного положения и обладает сильно выраженным нуклеофильным характером, что обеспечивает ее избирательное алкилирование иодацетатом (Macquarrie R. and Bernhard S., 1971).

Каждый мономер содержит 4 SH-группы, две из которых в активном центре (Cys 149 и Cys 153) (Banas Т. et al, 1976). А

CONH, R

7S« f^V-CONHj N I

R' 0 f « ^SH R—C—0P032

CONH,

MAO' ^ NAOH

CONH,

Рис. 6. Механизм реакции, катализируемой ГАФД. [Stryer L., 1995]

ГАФД локализована в цитоплазме и легко экстрагируется буферными растворами. Считается, что ГАФД выполняет функцию катализа, находясь в нативном тетрамерном состоянии, хотя с помощью иммобилизации различных олигомерных форм показано, что каталитической активностью обладают как димер, так и мономер (Nagradova N.K. et al, 1974; Ashmarina L.I. et al, 1982). Доказать активность димеров или мономеров фермента в растворе не удается, т.к. в присутствии кофактора и субстрата происходит ассоциация субъединиц в тетрамер даже при очень низких концентрациях белка.

Имеется целый ряд данных об образовании биферментных комплексов при участии ГАФД. В частности, показано взаимодействие с 3-фосфоглицераткиназой и альдолазой (Sukhodolets M.V. et al, 1988; Khoroshilova N.A. et al, 1992). Интересно, что димерная форма ГАФД из эритроцитов человека взаимодействует с 3-фосфоглицераткиназой или 2,3-бисфосфоглицератмутазой в зависимости от изменения рН среды в пределах физиологических значений (Fokina K.F. et al, 1997). Это подтверждает предположение о возможном значении образования разных биферментных комплексов для регуляции метаболических путей в клетке.

Несмотря на продолжительную историю изучения этого фермента, интерес к самой ГАФД, ее функциям, структуре и внутриклеточной организации в разных тканях в нормальных и патологических состояниях клетки по-прежнему сохраняется. К настоящему моменту продолжают накапливаться данные о разнообразных негликолитических функциях ГАФД (Kim J., and Dang С., 2005; Sirover M., 1999; Sirover M., 2005). Так, существуют данные о её важной роли в мембранном транспорте, в процессе слияния мембран (Могего R. et al., 1985) и сборке микротрубочек (Huitorel Р. and Pantaloni D., 1985). Помимо этого, ГАФД обладает РНКазной активностью (Evguenieva-Hackenberg Е. et al., 2002) и играет особую роль в экспорте тРНК из ядра в цитоплазму. Были выявлены участки тРНК, имеющие сродство к ГАФД (Singh R. and Green M.R., 1993). Также было выявлено взаимодействие ГАФД с одноцепочечной ДНК (Grosse F. et al.,

1986). Ассоциация ГАФД с нуклеиновыми кислотами может играть существенную роль в транскрипции и репликации ДНК благодаря влиянию на структуру ядерного матрикса или хроматина (Ronai Z., 1993). К настоящему времени накопилось много данных об участии ГАФД в апоптозе. Было показано, что при индукции апоптоза увеличивается экспрессия ГАФД (Sunaga К. et al., 1995; Ishitani R. et al., 1997), а добавление антисмысловых олигонуклеотидов против мРНК ГАФД приводит к его блокированию (Ishitani R. and Chuang D.-M., 1996). В ходе апоптоза ГАФД, локализованная в цитоплазме, транслоцируется в ядро (Saunders P. et al., 1997) и связывается с участком ДНК, после чего молекула фермента претерпевает конформационные изменения, и при этом экранируется участок белковой цепи, служащий сигналом для импорта ГАФД вновь в цитоплазму (Brown V. et al., 2004). Кроме того, в последние годы накопилось много данных по исследованию участия ГАФД в нейродегенеративных заболеваниях (Chuang D.-M. et al., 2005).

Действительно, если задуматься, то с сугубо прагматической точки зрения нерационально задействовать 15% всего растворимого белка в клетке для одного метаболического процесса, пусть даже такого важного для жизнедеятельности, как энергетическое обеспечение. И, наверное, вряд ли такая расточительность смогла бы эволюционно закрепиться. На схеме (рис. 7) показано, в какие процессы вовлечена ГАФД по современным представлениям.

Рис. 7. Негликолитические функции ГАФД в клетках млекопитающих.

Глгщералъдегид-З-фосфатдегидрогеназа сперматозоидов (ГАФДс)

ГАФДс - изофермент ГАФД, который встречается только в сперматозоидах. Соматическая ГАФД кодируется у человека на 12 хромосоме, однако у нее существует паралог - ген Gapd2 на 19 хромосоме, который экспрессируется только в сперматозоидах (Li Y. et al, 2004; Welch J.E. et al, 1992; Welch J. et al, 2000). По всей видимости, семейство генов Gapd подверглось обширной дупликации с помощью ретропозонов, так как человеческий геном содержит около 12 псевдогенов, и геном мыши укрывает несколько сотен последовательностей, похожих на ГАФД. И всё же очень маловероятно, что ген Gapd2 возник в результате этого процесса. Он содержит интроны, которые очень редко встречаются в ретропозонах, и его интрон-экзонная структура идентична мышиному гену и отличается от гена Gapd человека. Помимо этого организация экозонов и интронов Gapd2 и Gapds сходна с более примитивным геном gapd цыплят. Исходя из этого, можно предположить, что белки, которые экспрессируются в соматических и половых клетках млекопитающих являются потомками эволюционной дивергенции гена Gapd птиц и млекопитающих (Welch J. et al, 2000).

ГАФДс на 68% идентична соматической ГАФД, также наблюдается высокая степень гомологии с мышиным ортологом — 83% одинаковых аминокислот с продуктом мышиного гена Gapds (у человека ген ГАФДс называют Gapdl). Ген содержит 11 экзонов.

ГАФДс человека состоит из 408 аминокислотных остатков и содержит на N-конце дополнительную последовательность из 72 аминокислот (а у мышей эта последовательность состоит из 105 аминокислот), благодаря которой белок связывается с фиброзным слоем (Bunch D. et al, 1998). Молекулярная масса ГАФДс, рассчитанная из аминокислотной последовательности, составляет примерно 44,5 кДа, однако есть данные, что благодаря обилию остатков пролина молекула обладает аномальной подвижностью при Ds-Na-электрофорезе в полиакриламидном геле и даёт полосу на уровне 56 кДа (Welch J. et al, 2000). N-концевая последовательность обогащена гидрофобными аминокислотными остатками пролина (23) и валина (9), которые обеспечивают гидрофобные взаимодействия с белками фиброзного слоя, а также один цистеиновый остаток (рис. 8).

ГАФДс 1 : MSKMIVLTNVTWQLIiRQPCPVTRAPPPPEPKAEVEPQPQPEPTPVWffi : 80 ГАФД 1 : ------------------------------------------------------------------------MGKVK. .V : 8 *

ГАФДс 81 : NGFGfUGi&VIiKACMEK-GVKVVAVNDPFIDPBTM^ : 159

ГАФД 9 : .Т. .AFNSGK.DI. .1.1Л.Q.KFH.T.KAE. .К.INGNP.TIF.ERD.SK.К.G : 88

ГАФДс 160 : AVGSPYWESTGVYLSIQAASDHISAGAQKVVTSAPSPDAPMFVMGVNEN^ : 239

ГАФД 89 : DA.AE.ETEMEK.GA.LQG. .К. .1.A.HEK.DN-.LK.I.DN : 167

ГАФДс 240 : FGIVEGI^TVHSYTATQKTVDGPSRKAWEDGRGAHQNIIPASTGAAKAVT^ : 319 ГАФД 168 : .AI.G.L.L.G.N.AN. : 247

ГАФДс 320 : lUAQPmSMKEAVKAAAKGEMAGnAZTEDEWSTDFLGDTHSSI^ : 399 ГАФД 248 : .EK.K.DD.KV.Q.SE.LK.G.HQ.S.NS.T.G.H.F. .N. : 327

ГАФДс 400 : LRYMFSRDK : 408 ГАФД 328 : MAH.A.KE- : 335

Рис. 8. Выравнивание ГАФДс и мышечной ГАФД человека. Точками показаны аминокислотные остатки, одинаковые в обоих ферментах. Серым цветом выделен фрагмент, отсутствующий в dN-GAPDS, стрелкой показан сайт расщепления трипсином, звездочками показаны остатки цистеина, характерные для сперматозоидной ГАФД.

Связь белка с фиброзным слоем приводит к тому, что ГАФДс, в отличие от ГАФД цитоплазматической, плохо экстрагируется буферными растворами. После разрушения сперматозоидов ультразвуком существенная доля активности остается связанной с нерастворимыми структурами (осадок разрушенных клеток). В сперматозоидах хряка ГАФДс очень прочно связана с фиброзным слоем и остается в связанном состоянии при обработке различными концентрациями соли, термообработке, обработке химотрипсином и детергентом CHAPS, однако переходит в раствор при обработке трипсином или эластазой (Westhoff D. and Camp G., 1997).

Методом электронной микроскопии с использованием метки золотом было показано, что ГАФДс крыс экспрессируется и встраивается в фиброзный слой во время последних стадий сперматогенеза (16-19). Встраивание других белков в рёбра фиброзного слоя наблюдается на 11-15 стадиях. Следовательно, ГАФДс встраивается в рёбра фиброзного слоя уже после построения основного каркаса цитоскелета (Tanii I., 2007). Методом иммуноэлектронной микроскопии с использованием золота показано, что также как и ГАФДс, AKAP3/FSP95 в основном находится в рёбрах фиброзного слоя в сперматозоидах человека и сперматидах. Судя по предпочтительной локализации этих двух белков в рёбрах фиброзного слоя, можно предположить, что ГАФДс может способствовать передаче сигнала, ассоциированного с АКАРЗ.

Отсутствие энзиматической активности ГАФД в сперматозоидах с нарушенным геном Gapds указывает на то, что соматическая ГАФД в сперматозоидах отсутствует. Мыши с нокаутом гена Gapds инфертильны, подвижность сперматозоидов вялая и редко приводит к поступательному движению. Было показано, что разрушение гена Gapds не приводит к нарушениям в формировании фиброзного слоя. Уровень АТР у таких мутантов 10,4% от нормы (Miki К. et al, 2004)

Фиксация ГАФДс в фиброзном слое в основном участке жгутика сперматозоида может быть нужна для эффективного синтеза и распределения АТР, потребляемого аксонемой.

Показано, что в сперматозоидах хряка ГАФДс связана не только с фиброзным слоем, но и с акросомой. В клетках человека, мыши и крысы ГАФДс в акросоме не была найдена. С чем связано такое появление фермента в другом компартменте пока не ясно, однако существуют предположения о необходимости гликолиза в акросоме хряка для обеспечения энергией ионных насосов (Са, Ыа+/К+-АТРазы) и реакций фосфорилирования, которые вовлечены в процесс инициации и контроля акросомной реакции (Feiden et al, 2008).

ГАФДс является мишенью для нескольких репродуктивных токсикантов, которые нарушают мужскую фертильность. Такие вещества, как а-хлоргидрин, эпихлоргидрин, 6-хлоро-6-дезоксиглюкоза и орнидазол, являются конкурентными ингибиторами ГАФДс, причем в концентрациях, действующих на ГАФДс, они не ингибируют соматическую ГАФД (Bunch D. et al, 1998).

Регуляция экспрессии ГАФДс

Интересно, что экспрессия ГАФДс происходит в определенный период спермиогенеза и происходит строго согласовано с определенными процессами формирования клетки.

Показано, что мРНК гена Gapds у мышей обнаруживается на стадии «шапочки» спермиогенеза (этап 4-7), максимальное количество транскрипта достигается на этапах 9-11 развития сперматид, до 15 этапа это количество остается на одном уровне, а затем не детектируется методом гибридизации in situ. Лактат считается наиболее предпочтительным энергетическим субстратом для сперматид. Инкубация сперматид с глюкозой в отсутствии других субстратов вскоре приводит к исчезновению АТР и смерти клеток. Накопление в клетках фруктозо-1,6-бисфосфата и триоз свидетельствует о том, что гликолиз останавливается на уровне ГАФД, то есть белок не синтезирован. Отсутствие ГАФДс в клетках до этапов 12-13 подтверждено иммуногистохимически (Bunch D. et al, 1998). Факт такого длительного существования транскрипта без появления белка предполагает возможность регуляции транскрипции. Белок транслин (testis brain RNA-binding protein, TB-RBP) является ДНК и РНК-связывающим белком с множеством функций. Хотя TB-RBP экспрессируется в различных соматических тканях, РНК-связываюгцую активность этот белок проявляет в основном в мозге и яичках. В частности, для TB-RBP мыши показана способность селективно образовывать РНК-белковый комплекс с 5' -нетранслируемым участком мРНК ГАФДс in vitro. мРНК ГАФДс содержит два предполагаемых транслин-связывающих участка, но транслин образует комплекс с областью наибольших различий с соматической ГАФД (Yang J. et al, 2003). Таким образом, достигается функциональная селективность - соматическая ГАФД не подвергается подобной регуляции.

Зачем сперматозоидной ГАФД необходима такая регуляция трансляции? Известно, что ГАФДс прочно связана с фиброзным слоем основной части жгутика сперматозоида. Хотя молекулярный механизм образования фиброзного слоя неизвестен, с помощью авторадиографии и электронной микроскопии показано, что у крыс фиброзный слой формируется в направлении от дистального участка к проксимальному на протяжении 15 дней. Наличие N-концевого участка у ГАФДс необходимо для встраивания в фиброзный слой жгутика. Таким образом, ранняя нерегулируемая трансляция ГАФДс может приводить к нарушениям внутриклеточной локализации ГАФДс, так как ограниченная растворимость многих белков, ассоциированных с фиброзным слоем, требует регулируемого постепенного синтеза белка для возможности «вставки» в растущий фиброзный слой (Yang J. et al, 2003).

В нашей лаборатории было показано, что общими для соматической и сперматозоидной ГАФД являются мотивы, обеспечивающие участие в процессе гликолиза. В составе соматической ГАФД выявлены два специфических мотива, связанных с ее ядерными функциями (репарация и репликация ДНК, а также мотив, определяющий внутриклеточную локализацию). Отсутствие этих мотивов в ГАФДс позволяет предположить, что ядерные функции соматической ГАФД для нее нехарактерны. Это согласуется с данными о том, что ГАФДс связана своим N-концевым доменом с нерастворимым компонентом клетки и в силу этого может терять ряд функций, характерных для ГАФД. Возможно, ГАФДс принимает участие в процессе сборки веретена деления в сперматидах. При этом для соматической ГАФД участие в данном процессе (в других типах клеток), по-видимому, нехарактерно (Куравский M.JI. и Муронец В.И., 2007).

Активные формы кислорода

Было показано, что активные формы кислорода (АФК), в частности перекись водорода, продуцируемые как самими сперматозоидами, так и лейкоцитами в семенной жидкости, влияют на разные функции сперматозоида, включая подвижность (Aitken R. et al, 1998). Их эффект двоякий и зависит от концентрации АФК: низкие концентрации могут индуцировать сигнальный каскад сАМР-РКА, приводя к увеличению подвижности сперматозоида и фосфорилированию тирозинов белков, стимулирующих капацитацию, тогда как высокие концентрации играют роль ингибиторов (Aitken R. et al, 2003; Ford W., 2004). Пагубный эффект АФК на подвижность сперматозоидов связан и с перекисным окислением липидов в плазматической мембране (Williams A. and Ford W., 2005),а именно с потерей барьера для проницаемости плазматической мембраны из-за перекисного окисления мембранных фосфолипидов. Инициатором спонтанного перекисного окисления мембран в сперматозоидах млекопитающих является супероксид-анион, который производится в основном как побочная реакция в среднем участке жгутика в митохондриальной электронно-транспортной цепи в процессе образования кислорода. Высокий уровень производства активных форм кислорода может являться причиной некоторых типов астенозооспермии, а также повреждений в системе защиты от окисления; в таких случаях in vitro была показана возможность использования антиоксидантов для нейтрализации активных форм кислорода и соответственно поддержания подвижности сперматозоидов (Martin-Du Pan R. and Sakkas D., 1998; Lenzi A. et al, 1998). В сперматозоидах млекопитающих, также как и в соматических клетках, есть две системы защиты от активных форм кислорода. Первая — фермент супероксиддисмутаза (SOD), которая катализирует реакцию перехода супероксид-аниона в кислород и ингибирует инициацию перекисного окисления (Alvarez J. et al, 1987). Вторая система защиты — глутатион пероксидаза, которая требует снижения внутриклеточной концентрации rayraTHOHa(GSH). Дело в том, что глутатион восстанавливает окисленный липид из ROOH в ROH, в результате чего сам окисляется и превращается в глутатиондисульфид (GS-SG). Фермент глутатион-редуктаза восстанавливает его снова до GSH, используя для этого NADPH. Эта система устраняет начальный продукт окисления, предотвращая дальнейший процесс (Alvarez J. and Storey В., 1995).

Хорошо известно, что соматическая ГАФД обладает высокореакционноспособными сульфгидрильными группами активного центра (прежде всего, 149 остатком цистеина активного центра). Инактивация фермента за счет модификации этих групп происходит в присутствии микромолярных концентраций активных форм кислорода. В активном центре сперматозоидной ГАФД также присутствуют сульфгидрильные группы и, хотя в литературе отсутствует информация об их реакционной способности, можно предположить, что активность этого фермента может также регулироваться активными формами кислорода. Следовательно, описанные в этом разделе системы, контролирующие содержание активных форм кислорода, могут влиять на активность сперматозоидного фермента и, возможно, на подвижность сперматозоидов. Изучение этих аспектов было одной из задач данной работы.

Заключение

Таким образом, анализ литературных данных показывает, что, хотя строение и функции соматической глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы подробно изучены, однако информация о такого рода свойствах ГАФДс практически отсутствует. Поскольку существуют данные о нарушении подвижности сперматозоидов при отсутствии у них сперматозоидной формы фермента, то можно предположить, что изменение активности данного фермента может влиять на подвижность сперматозоидов, увеличивая или уменьшая ее. Мы полагаем, что изучение свойств сперматозоидной ГАФД и выявление корреляции между ее активностью и подвижностью сперматозоидов, которому посвящена данная работа, может являться важным шагом как в создании методов лечения мужского бесплодия, так и в поиске путей направленной мужской контрацепции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реактивы

В работе использовались следующие реактивы: s-Аминокапроновая кислота, Бис-трис ("Sigma", США); глицин ("ICN Biochemicals Inc", США); гуанидингидрохлорид; диаминобензидин гидрохлорид, 5,5'-дитиобис-2-нитробензойная кислота; дитиотреитол (Fluka), КМ-целлюлоза, Кумасси G 250, Кумасси R250, перекись водорода; сульфат аммония ("Sigma"); трипсин ("СПОФА", Чехословакия ); трицин (Serva, США); 3-ФГА ("Sigma"); фенилсефароза 6 Fast Flow, high sub, ("Pharmacia Biotech", Швеция); хитиновый носитель Chitin Beads (New England Biolabs), ЭДТА, NAD+ ("Sigma"), Triton-ХЮО, Tween-20 ("Ferak", Германия); мышиные моноклональные антитела к сперматозоидной ГАФД ("Abnova", Тайвань). Сперматозоиды человека были любезно предоставлены медицинским диагностическим центром «Пастер» (Москва), а также добровольными участниками экспериментов. Трансформированные клоны E.coli штамма Rosetta 2(DE3), продуцирующие полноразмерную ГАФДс человека, а также ГАФДс с заменой N-концевого домена на хитинсвязывающий домен хитиназы Al Bacillus circulans (ChBD-GAPDS) и ГАФДс без N-концевого домена (dN-GAPDS) были предоставлены Эльдаровым М.А. (центр «Биоинженерия» РАН, Москва).

Аналитические методы

Определение концентрации белка

Спектрофотометрическое определение концентрации белка

Спектрофотометрически определяли концентрацию белка при 280 нм.

Q ]П/

Для ГАФД из мышц кролика считали поглощение А280 ' ° равным 1,0. Коэффициент поглощения ChBD-GAPDS, вычисленный по ее аминокислотной последовательности с помощью ProtParam, составил 1,27 (мг/млу'см"1 для апофермента и 1,40 (мг/млу'см"1 для холофермента (в комплексе с четырьмя NAD4). Так как тетрамер ChBD-GAPDS в среднем содержал две молекулы NAD+ (А28о/А.2бо = 1,32), для определения ее концентрации использовалось значение коэффициента поглощения =

1,33 (мг/мл)"'см"'. Коэффициент поглощения dN-GAPDS, вычисленный по ее аминокислотной последовательности с помощью программы ProtParam (составил 1,05 (мг/млу'см"1 для апофермента и 1,23 (мг/млу'см"1 для холофермента (в комплексе с четырьмя молекулами NAD*). Так как тетрамер dN-GAPDS в среднем содержал две молекулы NAD+ (А28о/А2бо ~ 1,32), для определения ее концентрации использовали значение коэффициента поглощения =1,14 (мг/мл)",см"1 (Gasteiger Е. et al, 2005).

Метод Брэдфорд (Bradford М.М., 1976). Калибровочный график для определения концентрации белка по методу Брэдфорд строили по ГАФД из мышц кролика, концентрацию которой определяли спектрофотометрически при 280 нм. Проба содержала 1 мл реактива Брэдфорд и 1-10 мкл раствора белка. В качестве контроля использовали кювету с раствором реактива Брэдфорд без белка. Через 3 мин после добавления белка измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 595 нм. Концентрацию общего белка в экстрактах сперматозоидов определяли методом Брэдфорд.

Определение ферментативной активности ГАФДс

Активность ГАФДс в экстрактах сперматозоидов, а также активность рекомбинантных белков ChBD-GAPDS и dN-GAPDS определяли спектрофотометрически при 340 нм по накоплению NADH, образующегося в ходе реакции окисления 3-фосфоглицеринового альдегида (3-ФГА). Реакционная смесь содержала 0,5 мМ 3-ФГА, 0,5 мМ NAD+, 50 мМ глицин, 50 мМ фосфат калия, 5 мМ ЭДТА, рН 8,5. Измерения проводили в пластиковой кювете на 1 мл, реакцию начинали внесением 3-ФГА. За единицу активности принимали количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль NAD+ в минуту.

Определение концентраций реагентов

Концентрацию NAD+ определяли энзиматически в реакции окисления 3-ФГА, регистрируя увеличение оптической плотности при 340 нм и считая коэффициент молярной экстинкции образующегося NADH равным 6,22х103 М"1см"1. Реакционная среда (рН 8,9) содержала 50 мМ глицин, 100 мМ КН2Р04, 5 мМ ЭДТА, 50 мкг ГАФД, 1 мМ 3-ФГА и 5 мкл исследуемого раствора NAD+. Концентрацию 3-ФГА определяли энзиматически в той же среде, добавляя 1 мМ NAD+ и 5 мкл исследуемого раствора 3-ФГА.

Определение концентрации перекиси водорода

Концентрацию перекиси водорода определяли спектрофотометрически при длине волны 230 нм, считая коэффициент экстинкции равным 72,7 М"

Определение Кт для субстратов

Для определения Кт проводили серию измерений начальной скорости реакции в стандартных условиях, изменяя концентрацию одного из субстратов при насыщающей концентрации второго. Для определения Кт использовали метод нелинейной регрессии согласно уравнению Михаэлиса-Ментен: v=vmax*s/Km+s где V— активность фермента, Vmax — максимальная активность фермента, S— концентрация субстрата, Кт — константа Михаэлиса.

SDS-электрофорез по методу Лэммли

SDS-электрофорез по методу Лэммли проводили согласно описанной методике (Laemmli U., 1970), используя 12,5%-ный и 4%-ный полиакриламидный гель в качестве разделяющего и концентрирующего гелей.

К фракциям клеточных лизатов добавляли Ул объема четырехкратного буфера для образцов (0,25 М Трис-HCl, рН 6,8, 8% SDS, 40% глицерин, 0,04% бромфеноловый синий, 20% (3-меркаптоэтанол) и нагревали пробы в течение 5 мин на кипящей водяной бане.

В лунку вносили по 5-20 мкг белка. В случае использования образцов с неизвестной концентрацией белка (фракции после очистки белков) наносили максимально возможный объем. В качестве маркеров молекулярных весов использовали 3 набора белков: 14-66 кДа ("Biorad", США), 14,4-116 кДа ("Fermentas", Литва) и цветные маркеры для иммуноблотинга 250-4 кДа ("Biorad", США).

Электрофорез проводили при постоянной силе тока 8 мА на одно стекло для концентрирующего геля. После вхождения белков в разделяющий гель силу тока повышали до 16 мА. Гели окрашивали в теплом растворе красителя (0,04%-ный раствор Кумасси R 250 в 10%-ной уксусной кислоте и 20%-ном изопропаноле) и отмывали в 10%-ной уксусной кислоте при нагревании.

Голубой нативный гель-электрофорез

Голубой нативный гель-электрофорез является аналитическим методом для определения молекулярной массы и олигомерного состояния белков. Краситель Кумасси, связываясь с молекулой белка, создает отрицательный заряд на её поверхности, в результате чего белки движутся в геле к положительному электроду со скоростью, обратно пропорциональной их молекулярной массе. По электрофореграмме строят график зависимости lg М = f (Rf), где Rf — отношение расстояния, пройденного данным белком в геле, к расстоянию, пройденному фронтом красителя. Градиентный гель позволяет улучшить качество разделения.

Электрофорез проводили в градиенте полиакриламидного геля (5,5 -12%), используя десятилуночные гребенки. Буфер для геля содержал 200 мМ е-аминокапроновую кислоту и 150 мМ Бис-трис (рН 7,0).

Клетки разрушали в буфере следующего состава: 500 мМ е-аминокапроновая кислота, 20 мМ Бис-трис рН 7,0, 10% глицерин. После удаления разрушенных клеток супернатант наносили на гель.

В лунку вносили не более 5 мкл пробы. В качестве маркеров молекулярных весов использовали смесь овальбумина (45 кДа), БСА (66 и 132 кДа), каталазы (232 кДа) и ферритина (443 и 886 кДа) с концентрациями 5 мг/мл.

Электрофорез проводили при 4°С. Вначале использовали голубой катодный буфер (50 мМ трицин, 15 мМ Бис-трис, 0,02 %-ный Кумасси голубой G 250, рН 7,0 при 4°С ), который через 20 мин меняли на белый (тот же буфер, но без добавления Кумасси). В качестве анодного буфера использовали 50 мМ Бис-трис (рН 7,0 при 4°С). Электрофорез начинали при напряжении 100 V, затем увеличивали напряжение по мере увеличения процентности геля (до 300 V к концу электрофореза). Гели окрашивали в теплом растворе красителя (0,04%-ный раствор Кумасси R250 в 10%-ной уксусной кислоте и 20%-ном изопропаноле) и отмывали в 10%-ной уксусной кислоте при нагревании ( Schagger Н. et al, 1994).

Электроперенос белков с последующим иммунохимическим окрашиванием Подготовка геля и электроперенос белков на мембрану

Для электропереноса использовали нитроцеллюлозную мембрану. Полиакриламидный гель после проведения электрофореза и нитроцеллюлозную мембрану уравновешивали буфером для переноса (25 мМ Трис, 192 мМ глицин, 10% этанол). Процесс электропереноса белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану проводили при постоянном напряжении 100V и силе тока 150-250 мА в течение 45 мин (Towbin Н. et al, 1979).

Иммунохимическое окрашивание с диаминобензидином

Мембрану после электропереноса белков промывали водой, после чего необходимо было удостовериться в том, что белки перенеслись на нитроцеллюлозу. Для этого окрашивали мембрану красителем Ponceau С (0,3%-ный раствор Ponceau С, приготовленный на 3%-ной уксусной кислоте). Мембрану помещали в раствор Ponceau С на 30 секунд, затем краску сливали, а мембрану промывали водой. Краситель, связавшийся с белком, водой не смывается. Но, поскольку его связывание с белками может помешать процессу иммунохимического окрашивания, после того, как перенесенные белки окрасились, мембрану отмывали несколько раз щелочным раствором Триса до полного исчезновения окрашенных белковых полос. Затем мембрану промывали 2-3 раза ФСБТ (фосфатно-солевой буфер с твином: 10 мМ КН2Р04, 150мМ NaCl, 0,1%-ный Tween-20, рН 7,4), после чего инкубировали при постоянном перемешивании в течение 10 мин в растворе 5% обезжиренного сухого молока на ФСБТ для блокировки мест возможного неспецифического связывания антител. Затем мембрану инкубировали в течение 1 часа с первичными антителами против ГАФДс (1 мкг/мл), которые растворяли в ФСБТ, содержавшем 2%-ное сухое молоко. По окончании инкубации мембрану промывали 5 раз ФСБТ и переносили в раствор вторичных антител (антитела против антител мыши, конъюгированные с пероксидазой (1 мкг/мл)). В растворе вторичных антител мембрану инкубировали час при постоянном перемешивании. После тщательной отмывки ФСБТ мембрану переносили в раствор хромогенного субстрата, содержавший 3 мг диаминобензидин гидрохлорида, 30 мг семиводного сульфата никеля и 10 мкл 30%-ной перекиси водорода в 10 мл 0,1 М трис-HCl, рН 7,6.

Изучение влияния различных факторов на подвижность сперматозоидов

Подвижность каждого сперматозоида классифицируют по категориям <а>, <Ь> и <с>, используя следующие критерии: а — быстрое поступательное движение или активная прогрессивная подвижность (>25 мкм/сек при 37°С или >20 мкм/сек при 20°С, 25 мкм примерно соответствует длине 5 головок сперматозоидов или половине хвоста сперматозоида); b - медленное поступательное движение или слабая прогрессивная подвижность (< 25 мкм/сек при 37°С или < 20 мкм/сек при 20°С). с — непоступательное движение, к которому относится очень медленное движение по прямой (<5 |ам/сек) и ротационное движение — движение сперматозоида по окружности с любой (в том числе и с большой) скоростью.

Подвижность каждой категории выражается в процентах относительно посчитанного общего количества клеток, а сумма а и b представляет собой общую подвижность (Брагина Е.Е. и Абдурахмаликов Р.А., 2002).

Сразу после эякуляции сперма здоровых фертильных мужчин коагулирует, превращаясь в желеобразную массу, которая разжижается после попадания во влагалище. Для разжижения в лабораторных условиях образец спермы помещали в термостат при 37°С на 30 мин (Lunenfeld В. and Glezermann М., 1981). Затем отбирали необходимый объем спермы из исходного образца и разбавляли в 2 раза ФСБ, содержавшим необходимые добавки (в зависимости от условий эксперимента). Пробы инкубировали при 37°С или при комнатной температуре. Через определённые промежутки времени исследовали подвижность сперматозоидов в камере Горяева. Для подсчета использовали по 4 больших квадрата, считали отдельно сперматозоиды с подвижностью типа а, Ь, с и неподвижные. Процент клеток с подвижностью a, b и с определяли как отношение числа клеток с подвижностью данного типа к общему числу клеток. Процент подвижных клеток рассчитывали как отношение клеток с подвижностями а+b к общему числу клеток в большом квадрате камеры Горяева и считали среднее по четырем квадратам.

Определение активности ГАФДс в сперматозоидах

Сперматозоиды из семенной жидкости осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 1650g. Полученный осадок суспендировали в ~ 100-кратном объеме фосфатно-солевого буфера, затем центрифугировали в течение 15 мин при 1650 g. К полученному осадку клеток (50 — 100 мкл) добавляли равный объем 10 мМ калий-фосфатного буфера, суспензию обрабатывали ультразвуком два раза по 10 секунд, центрифугировали при 13400g в течение 5 минут и мерили активность ГАФДс и концентрацию белка отдельно в экстракте и в осадке.

Исследование влияния перекиси водорода на подвижность сперматозоидов и активность ГАФДс

Сперму термостатировали 30 минут при 37°С, затем пробу разводили в два раза ФСБ и разделяли на две части — контроль и эксперимент. В экспериментальную пробирку добавляли 1,5 мМ перекиси водорода. Затем обе пробы инкубировали 30 минут при 37°С. Затем считали подвижность сперматозоидов с помощью камеры Горяева и выражали в процентном отношении поступательно двигающихся клеток к общему их количеству. Затем в обе пробирки добавляли 1,5 мМ ДТТ для нейтрализации перекиси водорода и через 1 минуту инкубации осаждали клетки центрифугированием. Затем отмывали осадок в ФСБ от семенной жидкости 3 раза, и потом суспендировали осадки в равном объеме 10 мМ калий-фосфатного буфера. Суспензию обработали ультразвуком два раза по 5 секунд. Осадок отделяли от супернатанта центрифугированием на холоду, промывали тем же буфером и снова в нем суспендировали. Затем измеряли активность ГАФДс (рН 8,9).

Приготовление пробы для масс-спектрометрического анализа выделенного белка

Образец полученного при выделении белка подвергали SDS-электрофорезу, гель окрашивали Кумасси, затем из центра белковой полосы в стерильных условиях вырезали полоску шириной 1 см, разделяли ее на несколько фрагментов по 2-3 мм и помещали в 1,5 мл пробирку, содержавшую 200 мкл воды.

Масс-спектромерический анализ производили в ЗАО «Пинни» («Постгеномные и нанотехнологические инновации») на базе Инновационного центра медицинских нанобиотехнологий ГУ НИИ физико-химической медицины МЗ РФ.

Дифференциальная сканирующая калориметрия

Анализ белков методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии проводили на адиабатическом микрокалориметре ДАСМ-4 (Биоприбор, Пущино, Россия) с капиллярными платиновыми ячейками с рабочим объёмом 0,47 мл при скорости сканирования 1°/мин. Для получения кривых теплопоглощения раствор ГАФД с концентрацией 0,50,9 мг/мл в 10 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,5) помещали в ячейку прибора и прогревали от 20 до 90°С. Термоденатурация белка была необратима. Обработку полученных данных и расчет значений Ттах (максимальная температура перехода) и энтальпии (A Hcai) проводили, используя оригинальную программу Arina, разработанную в НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского и программное обеспечение "OriginPro 7.5" (MicroCal Inc, США).

Метод динамического светорассеяния

Для определения среднего размера частиц в растворах белков мы использовали метод динамического светорассеяния (ДСР). Измерения проводили на приборе «Zetasizer Nano-ZS» (Malvern Instruments, Malvern, Великобритания), используемом для измерения размеров частиц в диапазоне от 1 до 10000 нм. Прибор оснащен He-Ne лазером (длина волны 633 нм, 10 мВт) и оптической системой, позволяющей измерять интенсивность светорассеяния под углом 173°. Для интерпретации полученных данных в основном использовался параметр «распределение числа частиц по объёму», а также «распределение размера частиц по интенсивности светорассеяния». Измерение проводили при температуре 25°С в специальных кюветах на 1 мл. Раствор ГАФД в концентрации 0,7-0,9 мг/мл в 30 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,5 нагревали при указанной температуре в термостатируемой кювете. Каждое приведенное на графиках распределение интенсивности светорассеяния частиц в зависимости от их размера представляет собой среднее значение из 10 измерений, проведенных в течение 30 сек. При анализе размеров частиц каждого из нативных белков проводили как минимум 5 повторных измерений.

Денатурация в 4М гуанидингидрохлориде

Денатурацию ГАФД, а также рекомбинантных белков ChBD-GAPDS и dN-GAPDS проводили в 4 М растворе гуанидингидрохлорида. К раствору белка (1,0 мг/мл) в10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,5, добавляли сухой гуанидингидрохлорид до конечной концентрации 4 М. Через определенные временные интервалы из раствора отбирали аликвоты и измеряли в них глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназную активность. Константы инактивации ферментов определяли методом нелинейной регрессии, используя уравнение экспоненциального убывания:

40=Vй» где А0 — исходная активность, к — наблюдаемая константа инактивации, t — время инкубации.

Титрование SH-групп ГАФД

Титрование SH-групп проводили по методике, предложенной Эллманом (Ellman GL, 1959). Для проведения опыта ДТНБ (реагент Эллмана) растворяли в 10 мМ КН2Р04, рН 7,5. Реакционная смесь содержала 0,95мг/мл ГАФДс. ДТНБ добавляли в 100-кратном избытке по отношению к белку, учитывая, что реакция взаимодействия реагента Эллмана с сульфгидрильными группами белка при большом избытке ДТНБ (при рН 8,0) практически необратима.

В контрольную пробу вместо ГАФД добавляли вышеуказанный буфер. Поглощение образца при 412 нм регистрировали против контроля в двулучевом режиме.

Учитывая, что в химической реакции, на которой основан данный метод, одна SH-группа белка дает один эквивалент аниона 2-нитро-5-тиобензоата (меркаптонитробензоата), коэффициент экстинкции которого при 412 нм равен 13600 M~W (Verger R. et al., 1971; Collier H., 1973), рассчитывали количество SH-групп. Существуют два класса SH-групп: одни можно определить без разворачивания белка, другие спрятаны внутри молекулы белка и становятся доступными только после его разворачивания. Поэтому сначала мы титровали доступные SH-нруппы, а когда оптическая плотность переставала возрастать, к раствору белка добавляли навеску гуанидингидрохлорида до конечной концентрации 4М и определяли общее число SH-групп.

Окисление перекисью водорода

Белок в концентрации 1 мг/мл (ГАФД из мышц кролика, ChBD-GAPDS или dN-GAPDS) инкубировали в 30 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,5) с перекисью водорода (50 jiM — 1мМ). После добавления Н2О2 из пробы отбирали аликвоты для измерения активности через определенные промежутки времени. Константы инактивации ферментов определяли методом нелинейной регрессии, используя уравнение экспоненциального убывания: A(f)=A0e~", где А о — исходная активность, к — наблюдаемая константа инактивации, t — время инкубации.

Термоинактивация

Термоинактивацшо проводили при 55°С и при 70°С. Для этого исследуемый белок (ГАФД из мышц кролика, ChBD-GAPDS или dN-GAPDS) в концентрации 0,5-0,7 мг/мл термостатировали при указанной температуре в ЮмМ калий-фосфатном буфере (рН 7,5). Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты для определения ферментативной активности.

Влияние ингибиторов

Белки с концентрацией 2,1 мг/мл в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,5) инкубировали с исследуемыми ингибиторами при перемешивании и комнатной температуре. Концентрацию ингибиторов брали из расчета 10-кратного избытка по отношению к SH-группам активного центра фермента. Через определенные интервалы времени измеряли активность ферментов.

Получение поликлональных антител на ГАФДс

Кролики в возрасте 3-4 месяцев иммунизировались по следующей схеме. Первая иммунизация: в 8-10 точках верхнего отдела спины животного подкожно вводили 2 мл однородной эмульсии, содержащей 1мл полного адъюванта Фрейнда и 1 мг/мл dN-GAPDS в стерильном ФСБ. Через три недели делали вторую инъекцию внутривенно. Белок в концентрации 0,5 мг/мл и объемом 1 мл в стерильном ФСБ без адъюванта Фрейнда вводили в ушную вену кролика. Через две недели после реиммунизации делали 2-3 забора крови (10 мл) с перерывами в 3 дня. Кровь, собранную в стеклянную пробирку, инкубировали 1 ч при комнатной температуре, затем 1 ч на холоду. После этого отделяли сыворотку крови центрифугированием (10 мин, 3500g). Наличие и специфичность антител в сыворотке крови анализировали методами твердофазного иммуноферментного анализа и иммуноблотинга.

Твердофазный иммуноферментный анализ

Сорбция антигена. В лунки 96-луночного полистирольного планшета вносили по 100 мкл антигена (ГАФДс и ГАФД из мышц кролика в качестве контроля) в концентрации 1-10 мкг/мл. Один ряд заполняли раствором ФСБ без антигена для контроля неспецифической сорбции антител без антигена. Планшет инкубировали при перемешивании при комнатной температуре 30 минут. Затем планшет переворачивали и сливали раствор из лунок, промывали их три раза ФСБТ.

Раститровка антител. В первую лунку каждого ряда вносили сыворотку крови в разведении 1:10. В следующих лунках готовили разведения с шагом 1:2 или 1:3. После ЗОминутной инкубации отмывали лунки ФСБТ 3 раза. Вторичные антитела {антитела против антител кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена), вносили 100 мкл в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали при перемешивании 30 минут. Затем планшет отмывали от антител в ФСБТ.

Ферментативная реакция. Субстратная смесь содержала 10 мл 0,1 М цитратного буфера (рН 4,5), 20 мкл 30%-ной перекиси водорода, 200 мкл 0,ЗМ спиртового раствора ортофенилендиамина. В каждую лунку вносили по 0,1 мл смеси и инкубировали 10 минут при перемешивании. Затем реакцию останавливали внесением в каждую лунку по 50 мкл 1н серной кислоты. Оптическую плотность определяли на планшетном спектрофотометре при длине волны 492 нм, в качестве контроля используя длину волны 630 нм. Титром считали значение, в два раза превышающее уровень фона.

Метод электронной микроскопии

Образцы эякулята фиксировали 2,5% раствором глютарового альдегида на 0,1 М какодилатном буфере и 1% раствором осмиевой кислоты, заливали в эпон. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Reichert III Ultracut, окрашивали цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе Hitachi 700. В каждом образце анализировали не менее 50 поперечных срезов жгутиков сперматозоидов. Исследования были выполнены Брагиной Е.Е.(отдел Электронной Микроскопии института Физико-Химической Биологии им. А.Н. Белозерского).

Выделение белков

Выделение ГАФД из скелетных мышц кролика

ГАФД из скелетных мышц кролика выделяли по методу Скоупса (Scopes R. and Stoter А., 1982) с последующей гель-фильтрацией на носителе сефадекс G-100. Все стадии выделения проводили при 4°С. От задних конечностей и спины кролика отделяли мышцы, очищали от соединительной и жировой ткани, измельчали при помощи мясорубки и заливали 2-х кратным объемом 30 мМ калий-фосфатного буфера, рН7,5, содержащего 5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ ДТТ. Смесь гомогенизировали и экстрагировали белки в течение 20 минут при постоянном перемешивании. Осадок отделяли центрифугированием в течение 30 мин при 5000 g и отбрасывали. Супернатант пропускали через 4 слоя марли для удаления жира. К полученному экстракту медленно при перемешивании добавляли сухой (NH4)2S04 (50,5 г на 100 мл экстракта), поддерживая рН раствора около 7,0 добавлением 35 %-ного раствора аммиака. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием в течение 30 мин при 12000 g. Затем проводили изоэлектрическое осаждение ГАФД, доводя рН в супернатанте до 8,0 концентрированным раствором аммиака. Осадок, сформировавшийся в течение ночи при 4°С, собирали центрифугированием (12000 g, 30 мин) и растворяли в 5 мМ ЭДТА, рН 7,5, содержащем 1 мМ ДТТ, до конечной концентрации белка 18 — 20 мг/мл. Далее проводили перекристаллизацию ГАФД, добавляя по каплям насыщенный раствор (NH^SC^ (рН 8,0) до появления характерного помутнения. На следующий день осадок собирали центрифугированием, растворяли в 5мМ ЭДТА, рН 7,5, содержащем 1 мМ ДТТ, процедуру перекристаллизации повторяли ещё 2 раза. Примесь миоглобина из препарата ГАФД удаляли при помощи гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-100 (Hill E.J.et al., 1975). Колонку (2x68 см) уравновешивали 10 мМ калий-фосфатным буфером, рН 7,5, содержащим 100 мМ (NH4)2S04, 1 мМ ЭДТА, 0,2 мМ ДТТ. Осадок белка после третьей перекристаллизации (половину всего количества) растворяли в минимальном объёме калий-фосфатного буфера и наносили на колонку. Белок элюировали вышеуказанным буфером при скорости тока 0,7 мл/мин, собирая фракции по 3,5 мл. ГАФД элюировалась в первом белковом пике. Фракции с наибольшей активностью объединяли и проводили кристаллизацию добавлением сухого сульфата аммония, поддерживая рН белкового раствора около 8,0. Через 2-3 дня суспензию центрифугировали при 20000 g в течение 60 минут, и полученный осадок суспендировали в небольшом количестве раствора сульфата аммония (383,5 мг/мл (NH4)2S04, содержащий 5 мМ ЭДТА) до получения густой суспензии белка. Выделенный фермент имел удельную активность 120 ед/мг белка и отношение А28о/А26о = 1Д- Белок хранили при 4°С в виде суспензии в полунасыщенном растворе (NR^SC^.

Чистоту препарата выделенного фермента анализировали с помощью электрофореза по методу Лэммли (Laemmli U., 1970).

Выделенный препарат ГАФД перед началом работы подвергали обессоливанию методом гель-фильтрации. Колонку (0,6x8,2 см) с носителем сефадекс G-50 уравновешивали необходимым буферным раствором. Белок растворяли в 0,4 мл того же буфера, наносили на колонку и собирали фракции по 0,5 мл. Концентрацию белка в полученных фракциях определяли спектрофотометрическим методом.

Выделение ГАФДс из сперматозоидов человека

ГАФДс из сперматозоидов выделяли по методике, описанной для выделения ГАФДс из сперматозоидов хряка (Westhoff W. arid Kamp G., 1997), с некоторыми модификациями.

Отмывание клеток

Клетки из семенной жидкости осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 1650g. Полученный осадок суспендировали в ~ 100-кратном объеме фосфатно-солевого буфера (ФСБ: 10 мМ КН2Р04 , 150 мМ NaCl, рН 7,4), затем центрифугировали в течение 15 мин при 1650 g. Процедуру отмывания проводили трижды. Отмытые клетки замораживали.

Лизис клеток

К 0,5-1 мл размороженных клеток добавляли равный объем 10 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,5. Суспензию обрабатывали ультразвуком на льду 3 раза по 20 с, после чего её центрифугировали 10 мин при 13400g, супернатант удаляли, добавляли равный объем калий-фосфатного буфера и центрифугировали еще раз. Далее работали с осадком.

Экстракция ГАФДс с помощью обработки трипсином

Согласно литературным данным, ГАФДс прочно связана с фиброзным слоем, но может быть экстрагирована при обработке трипсином или эластазой (Westhoff D. and Camp G., 1997). Осадок разрушенных сперматозоидов суспендировали в равном объеме калий-фосфатного буфера и добавляли к нему раствор трипсина (из расчета 0,1-1 мг трипсина на 1 мл осадка клеток). Затем образцы инкубировали 15 мин при 30°С, после чего их охлаждали во льду и добавляли PMSF (из расчета 0-0,1 мг на мл суспензии).

Очистка ГАФДс

После обработки осадка разрушенных клеток трипсином суспензию центрифугировали 10 мин при 13400g и собирали супернатант. К супернатанту добавляли сульфат аммония до степени насыщения 0,3 и наносили на колонку, заполненную фенилсефарозой 6 Fast Flow (1x2 см) и уравновешенную 50 мМ калий-фосфатным буфером, рН 7,0, содержавшим сульфат аммония в степени насыщения 0,3. Затем промывали колонку исходным буфером до исчезновения белка в элюате, затем тем же буфером с понижением насыщения сульфата аммония от 30% до 0. После этого элюировали ГАФДс 50 мМ калий-фосфатным буфером без сульфата аммония (рН 7,0). Присутствие ГАФДс во фракциях определяли по активности. Наиболее активные фракции концентрировали на микроцентрифужных фильтрах (MWCO 5000Да) и добавляли к ним дитиотреитол (ДТТ) до 2мМ.

После концентрирования фракции анализировали методом Ds-Na-электрофореза и иммуноблотинга, используя моноклональные антитела против полноразмерной ГАФДс человека.

Клонирование рекомбинантных белков

Клонирование рекомбинантной полноразмерной ГАФДс человека, а также ГАФДс с заменой N-концевого домена на хитинсвязывающий домен (ChBD-GAPDS) и ГАФДс без N-концевого домена (dN-GAPDS) в клетках E.coli было выполнено в Центре Биоинженерии РАН Эльдаровым М.А.

Клон MGC:26494 со штаммом E.coli, содержавшим плазмиду с кДНК вставкой полной кодирующей последовательности спермоспецифичной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека (GAPDS, номер доступа в

Genbank - BC036373) был получен через компанию Geneservice Ltd (http://vmw.geneservice.co.uk/home/aboutus/index.jsp). Фрагмент ДНК, кодирующий GAPDS человека без N-концевого домена (68 аминокислотных остатков), был получен методом ПЦР на матрице плазмиды клона MGC:26494 с использованием праймеров GAPDSdF (5 '-GTTTCATGAGTG TGGCCCGGGAGCTGAC-3') и GAPDSR (5 '-GTCTCGAGTTCACTT GTCTCGGCTGAACATGTAG). Выделенный фрагмент размером 1020 п.н. после совместного гидролиза рестриктазами BspHI/XhoI был клонирован между сайтами Ncol/Xhol плазмиды pET21d(Novagen, США). Полученная плазмида была обозначена pET21/dGAPDS.

ГАФДс с хитинсвязывающим доменом была получена методом ПЦР на матрице плазмиды клона MGC:26494 с использованием праймеров GAPDS CBF (5 '-GTTTCATGAGTGTGG ССС GGGAGCTGAC-3') и GAPDS-R (5'-GTCTCGAGTTCACTTGTCTCGGCTGAACATGTAG). Выделенный фрагмент размером 1020 п.н. после совместного гидролиза рестриктазами BspHI/XhoI был клонирован между сайтами Ncol/Xhol плазмиды pETmChBD, содержащей модифицированный хитинсвязывающий домен хитиназы А1 В. circulans с мутацией W44F в хитин-связывающем сайте. Полученная плазмида была названа pETmChBD/dGAPDS. Кодируемый белок (ChBD-GAPDS) состоит из 397 аминокислот с ожидаемой молекулярной массой 43,19 к Да и изоэлектрической точкой 8.4.

Культивирование продуцентов

Клетки E.coli, продуцирующие рекомбинантные белки, выращивали методом аутоиндукции (Studier F., 2005). Системы с индуцируемой экспрессией, в которых Т7 РНК-полимераза производит транскрипцию кодирующих последовательностей, клонированных под контролем Т7lac промотера, эффективно продуцируют большое количество белков в E.coli. Аутоиндукция экспрессии белка проходит без добавления инициаторов, таких как IPTG, в середине логарифмического роста культуры. Метод основан на буферной среде, содержащей смесь источников углерода, включая лактозу. Бактерии вначале используют глюкозу, а когда она израсходована, лактоза может войти в клетку и индуцировать экспрессию Т7 полимеразы из DE3 lambda lysogen. Среда обеспечивает высокую плотность культуры и большое количество белка, часто в тельцах включения.

Среда ZYP-0,8G предназначена для хранения клеток: в ней не происходит индукция экспрессии плазмиды. Для наращивания клеток в этой среде использовали пробирки на 20 мл, содержащие 2 мл среды. Она содержит 10 г/л триптона, 5г/л дрожжевого экстракта, 1мМ MgS04, 0,8% глюкозы, 25 мМ (NH4)2S04, 50 мМ КН2Р04, 50 мМ Na2HP04, 15% глицерин и 50 мкг/мл ампициллина. Для культивирования клеток, в которых происходит индукция экспрессии плазмиды, использовали колбы объемом 1 л, содержащие 200 мл среды ZYP 5052. Она содержит 10 г/л триптона, 5г/л-дрожжевого экстракта, 1мМ MgS04, 25 мМ (NH^SO», 50 мМ КН2Р04, 50 мМ Na2HP04, 0,5% глицерин, 0,05% глюкозы, 0,2% лактозы и 50 мкг/мл ампициллина. Клетки росли в течение 20 часов при 26°С, затем их собирали центрифугированием (4°С, 5 000 g, 15 мин).

Выделение ГАФДс без N-концевого домена (dN-GAPDS) dN-GAPDS - белок с ожидаемой молекулярной массой 36,9 кДа и изоэлектрической точкой 8,2, состоящий из 339 аминокислотных остатков. Клетки (15 г) суспендировали в 20 мл 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 2 мМ ДТТ и обрабатывали ультразвуком. Осадок удаляли центрифугированием (15 000g, 30 мин). Супернатант диализовали в течение ночи на холоду в 10 мМ Hepes (рН 7,0), содержащем 1 мМ ДТТ. Диализат наносили на колонку с КМ-целлюлозой (3x4 см), уравновешенную тем же буфером, и промывали до момента, когда перестал определяться белок. После промывания колонки 0,5 мМ NAD+ в том же буфере, белки элюировали градиентом сульфата аммония (0-4 М) в 10 мМ Hepes (рН 8,2), содержащем 1 мМ ДТТ. Фракции анализировали методом Ds-Naэлектрофореза и иммуноблотинга, используя моноклональные антитела против полноразмерной ГАФДс человека. Очищенный белок хранили в суспензии 50% сульфата аммония. Выход белка составил 1 мг на 1 г бактериальных клеток.

Выделение ГАФДс с хитинсвязывающим доменом (ChBD-GAPDS)

Собранные клетки 9-10 г) суспендировали в двойном объеме 50 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, содержавшего 1 мМ ЭДТА и 2 мМ дитиотреитол. Затем клетки разрушали ультразвуком (4x20 с) и удаляли клеточные обломки центрифугированием (15000g, 30 мин, 4 °С). Полученный экстракт высаливали сульфатом аммония до степени насыщения 30%. Осадок отделяли центрифугированием и растворяли в 100 мл буфера, содержавшего 50 мМ NaH2P04, 10 мМ ЭДТА, 2% глицерина и 2 М NaCl, рН 8,0. Раствор наносили на колонку (3 хЗ см) с хитиновым носителем (Chitin Beads) при 4°С и промывали десятикратным объемом исходного буфера. Элюцию проводили буфером без NaCl. Фракции, проявлявшие глицеральдерид-3-фосфатдегидрогеназную активность, объединяли и высаливали сульфатом аммония до степени насыщения 50%. Осадок собирали центрифугированием, суспендировали в 50% растворе сульфата аммония и хранили при 4°С. Как правило, выход белка составлял 1,5-2,0 мг на 1 г бактериальных клеток.

Результаты и обсуждение

Изучение ГАФДс из сперматозоидов человека

Одной из основных задач нашей работы было выделение ГАФДс и изучение её свойств в сравнении с мышечной изоформой фермента (ГАФД из мышц кролика). На сегодняшний день о свойствах и каталитических характеристиках сперматозоидной изоформы ГАФД ничего не известно. Основная проблема, связанная с изучением этого фермента, состоит в сложности его выделения. Поскольку ГАФДс, в отличие от соматического фермента, связана с цитоскелетом, т.е. находится в нерастворимой клеточной фракции, выделить полноразмерный активный фермент в растворимой форме является большой проблемой.

Трипсинолиз

Из результатов иммуноблотинга (рис. 9) видно, что после обработки ультразвуком сперматозоидов человека в ЮмМ калий-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 2мМ ДТТ, в осадке преимущественно наблюдается полоса 58 кДа, которая соответствует полноразмерной ГАФДс, а также полоса с молекулярной массой 40кДа (рис. 9, дорожка 1). В экстракте после обработки ультразвуком также присутствуют несколько полос ГАФДс: 58, 48, 47 и 40кДа (рис.9 дорожка 2): полноразмерная ГАФД 58 кДа и продукты ее протеолитического расщепления. Однако в раствор выходит лишь небольшая часть полноразмерного фермента. После обработки трипсином содержание ГАФДс в экстракте значительно увеличивается (Рис.9 дорожки

3-7). Преимущественная полоса 40 кДа. При этом полоса, соответствующая полноразмерному ферменту, пропадает. Возможно, при трипсинолизе происходит отщепление N-концевого домена, который является связующим звеном между ГАФДс и белками фиброзного слоя.

Выделение ГАФДс из сперматозоидов человека

Методика выделения ГАФДс описана в соответствующем разделе. При выделении фермента мы меняли условия эксперимента (концентрацию трипсина) (табл.1), чтобы подобрать оптимальный вариант для получения очищенного белка с высокой активностью и максимальным выходом.

Для идентификации выделенного белка проводили иммунохимическое окрашивание полученных препаратов ГАФДс. В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела на ГАФДс (рис. 10).

Из приведенных на рис.10 данных видно, что активные фракции (дорожки 1-3) содержат фрагменты ГАФДс с молекулярными массами 29,40 и ~43 кДа. На дорожке 3 (рис. 10) показан результат выделения ГАФДс при использовании трипсина в концентрации 1 мг/мл суспензии. При этом происходит более глубокий трипсинолиз и появляется полоса 29 кДа, которая не наблюдается при более низких концентрациях трипсина. Это приводит к снижению активности фермента и ухудшению связывания с субстратом. Поэтому для проведения всех остальных выделений мы использовали более низкую концентрацию трипсина (0,1-0,2 мг/мл).

45 36

29 24 м

2 3

5 6 7

Рис. 9. Иммуноблотинг лизатов сперматозоидов человека после обработки ультразвуком и последующей обработки нерастворимого осадка трипсином. М -маркеры (66,45,36,29,24 кДа).

1 - осадок разрушенных клеток после обработки ультразвуком

2 - экстракт после обработки клеток ультразвуком

3-6 - супернатанты после инкубации с трипсином (0,5 мг на мл осажденных клеток) при 30° 3, 7, 11, и 15 мин соответственно 7 - осадок после 15 мин инкубации с трипсином

66 45

36 29

М 1 2 3

Рис. 10. Иммунохимии ее кое окрашивание препаратов ГАФДс, полученных в результате инкубации сперматозоидов человека с разными концентрациями трипсина и последующей очистки полученного экстракта на колонке с фенил-сефарозой. Представлены копии нитроцеллюлозных мембран после окрашивания антителами против ГАФДс.

М- маркеры (66, 45, 36, 29 кДа)

1 - фрагменты ГАФДс (40 и 43 кДа (0,2 мг/мл трипсина)

2 - фрагмент ГАФДс (40кДа), (0,1 мг/мл трипсина)

3- фрагменты ГАФДс (29 и 40 кДа) (1 мг/мл трипсина)

Чистота препаратов ГАФДс

Чистоту выделенных препаратов ГАФДс оценивали методом Ds-Na-электрофореза. На рис. 11 видно, что выделенные препараты не гомогенны. Однако полоса 40кДа является основной. По результатам иммуноблотинга (рис.10) можно сказать, что остальные полосы являются примесями, так как не окрашиваются антителами против ГАФДс.

Для препаратов ГАФДс мы определяли Кт для NAD+ и ФГА. В результате пяти выделений мы получили препараты ГАФДс, которые отличались по чистоте и активности фермента. Результаты представлены в таблице 1.

Из представленных данных видно, что максимальный выход по активности, а также максимальная удельная активность белка наблюдаются при использовании 0,2 мг трипсина на 1 мл осадка клеток. При использовании более высокой концентрации трипсина (0,5 - 1 мг/мл) растет количество выделенного белка, однако активность его падает, а величина Кт для 3-ФГА растет, что говорит об ухудшении связывания субстрата. Таким образом, для выделения ГАФДс оптимальной оказалась концентрация трипсина 0,1-0,2 мг/мл.

60 50 36 1 2 3 м

Рис. 11. Анализ фракций ГАФДс, полученных в результате нескольких выделений фермента, методом Ds-Na-электрофореза.

1 -3 - образцы ферментов после очистки на колонке с фенил-сефарозой. 1-0,1 мг/мл трипсина

2 — 0,2 мг/мл трипсина

3 - 0,5 мг/мл трипсина М- маркеры (60,50,36)

Таблица 1. Результаты пяти выделений ГАФДС из сперматозоидов человека

Трипсин, мг/мл осадка клеток Белок, мг Удельная активность, Ед/мг Общая активность, Ед/мл экстракта Кт (NAD4), мМ (ФГА), мМ Выделенные фрагменты ГАФДс, кДа

1 0,1 0,02 19-36 0,18-0,31 - - 40

2 0,1 0,07 10-21 3-4,8 - 1 40

3 0,2 0,03 50 1,5-11 0,0227 0,77 40, 43

4 0,5 0,04 19-35 0,8-1,4 - 5 40

5 1 0,26 13-26 3,3-6,7 - 1,7 40, 29

Анализ выделенного фрагмента ГАФДс методом масс-спектрометрии (MALDI)

Фрагмент с молекулярной массой 40 кДа был проанализирован методом масс-спектрометрического анализа (MALDI). Результаты анализа представлены на рис.12. Для исследования полученного фрагмента применялся метод «отпечатков пальцев», который предполагает полное расщепление анализируемого белка трипсином с последующим исследованием полученных пептидов масс-спектрометрическим методом. Сравнение полученного набора пептидов с базой данных показало, что анализируемый белок с молекулярной массой 40 кДа со статистическим показателем достоверности 208 является фрагментом ГАФДс из сперматозоидов человека. Как видно из рис.12, идентифицированные пептиды перекрывают практически всю аминокислотную последовательность ГАФДс. Отсутствуют две относительно длинные последовательности: 189-239 (50 аминокислот) и N-концевая последовательность из 73 аминокислот. Поскольку молекулярная масса полноразмерной ГАФДс, рассчитанная из аминокислотной последовательности, составляет 44,5 кДа, фрагмент с молекулярной массой 40 кДа может быть результатом отщепления полипептида с молекулярной массой 4,5 кДа с одного из концов ГАФДс. Как видно из рис.12, пептиды С-концевой последовательности обнаружены в составе исследуемого белка, а пептиды N-концевого домена отсутствуют. Как видно из рис.12, участок 189—234 (45 аминокислот) не содержит сайтов трипсинолиза. Необходимо отметить, что длинные пептиды (более 3,5 кДа) не анализируют, поскольку они могут являться продуктами неполного расщепления анализируемого белка. Пептид 189-234, вероятно, не идентифицирован именно по этой причине.

MSKRDIVLTN VTWQLLRQP CPVTRAPPPP EPKAEVEPQP QPEPTPVHEE IKPPPPPLPP 60

HPATPPPKMV SVARELTVGI NGFGRIGRLV LRACMEKGVK WAVKDPF1D PEYMVYMFKY 120

DSTHGRYKGS VEFRNGQLW DNHEISVYQC KEPKQIPWRA VGSPYWEST GVYLSIQAAS 180

DHISAGAQRV VISAPSPDAP MFVMGVNEND YNPGSMNIVS NASCTTNCLA PLAKVIHERF 24 0

GIVEGLMTTV HSYTATQKTV DGPSFtKAWRD GRVAHQNIIP ASTGAAKAVT KVIPELKGKL 300

TGMAFRVPTP DVSVVDLTCR LAQPAPYSAI KEAVKAAAKG PMAGILAYTE DEWSTDFLG 360

DTHSSIFDAK AGIALHDNFV KLISWYDNEY GYSHRVVDLL RYMFSRDK 4 08

Рис. 12. Аминокислотная последовательность ГАФДс человека (база данных Swiss Prot, № 014556) Гwww.expasy.org]. Первые 73 аминокислотных остатка соответствуют дополнительному N-концевому домену, характерному для сперматозоидной изоформы фермента (выделены серым). Пептиды, идентифицированные при анализе 40-кДа фрагмента ГАФДс, выделены жёлтым. Все возможные сайты расщепления трипсином подчеркнуты. Красным цветом указаны предполагаемые участки расщепления трипсином, рассчитанные исходя из молекулярной массы (40 кДа) основного продукта трипсинолиза ГАФДс.

Представленные данные позволяют предполагать, что исследуемый белок с молекулярной массой 40 кДа соответствует ГАФДс, частично лишенной N-концевого домена (полное отщепление N-концевого домена по положениям R74-E75 должно приводить к образованию фрагмента с молекулярной массой 36 кДа). Исходя из молекулярной массы фрагмента можно предположить, что отщепление N-концевой последовательности происходит по положениям КЗ 3-A3 4 или R48-E49 (выделены красным на рис.12): в этих случаях должны образоваться продукты с молекулярной массой соответственно 40,8 или 39,4 кДа. Как видно из рисунка, в этих случаях сохраняется небольшой участок N-концевого домена (25-40 аминокислотных остатков), обогащенный остатками пролина, который взаимодействует с фенил-сефарозой при гидрофобной хроматографии. Тот факт, что после обработки трипсином ГАФДс переходит в раствор, также подтверждает сделанное предположение относительно отщепления N-концевой последовательности.

По-видимому, участок, по которому предпочтительно происходит трипсинолиз при обработке трипсином разрушенных клеток, находится в области «ножки», соединяющей глобулярную часть фермента с белками фиброзного слоя, чем и объясняется его повышенная доступность. Другие возможные сайты расщепления трипсином (подчеркнуты на рис.12) экранированы фиброзным слоем или же находятся внутри белковой глобулы и становятся доступными по мере денатурации белка.

Таким образом, можно заключить, что при мягкой обработке осадка сперматозоидов трипсином (0,1-0,2мг трипсина на 1 мл осадка, 30°С,15 мин) происходит отщепление N-концевой последовательности ГАФДс (33-48 остатков) и высвобождение в раствор активного фрагмента ГАФДс.

Зависимость активности от рН

Для выделенных препаратов фермента исследовали зависимость активности от рН (рис.13). Для этого готовили серию буферных растворов

50 мМ КН2Р(\ 50 мМ TAPS, 50 мМ глицин, 5 мМ ЭДТА) с разными значениями рН в интервале от 7,0 до 9,5 и измеряли активность ГАФДс в каждом из них. Построили суммарный график зависимости активности от рН по всем выделениям фермента.

Максимальная активность ГАФДс наблюдается при рН 8,5- 9,0.

Определение молекулярной массы и олигомерного состава ГАФДс

Известно, что ГАФД из мышц кролика является тетрамером. Поскольку ГАФДс на 68% гомологична мышечному ферменту, то можно предположить, что ГАФДс тоже тетрамер, однако какие-либо данные по этому поводу отсутствуют.

К осадку клеток добавляли равный объем буфера для лизиса (500 мМ £-аминокапроновая кислота, 20 мМ Бис-трис рН 7,0, 10% глицерин), обрабатывали ультразвуком и центрифугировали. Из супернатанта брали пробу на электрофорез, а осадок инкубировали с трипсином (0,25 мг/мл осадка) 15 мин при 30°С, центрифугировали и из супернатанта брали пробу на электрофорез (рис.14).

50 -40 зо Ч-*-1-1-1-1-1-■--

6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0

Рис. 13. Зависимость активности растворимого фрагмента ГАФДс от рН. Реакционная среда содержала 50мМ КН2Р04, 50 мМ TAPS, 50 мМ глицин, 5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ NAD+, 1мМ ФГА, 0,36 мкг ГАФДс. А Б

S86

443

232

132

45 I

144

45 36 29 V

2 3 4 3

Рис. 14, Анализ ГАФДс методом голубого нативного электрофореза (А) и SDS-электрофореза (Б). К осадку сперматозоидов добавляли равный объем буфера, содержащего 500 мМ £ -аминокапроновую кислоту, 20 мМ Бис-трис рН 7,0, 10% глицерин, и обрабатывали ультразвуком, затем центрифугировали и полученный осадок инкубировали с трипсином. Супернатанты после обработки ультразвуком и после трипсинолиза исследовали методами голубого нативного электрофореза (А) и SDS-электрофореза (Б). Затем белки переносили на мембрану PVDF и проводили иммуноокрашивание моноклональными антителами к ГАФДс.

А: 1 -маркеры (886, 443, 232, 132, 66, 45 кДа) (электрофореграмма, окрашивание Кумасси R250)

2 — ГАФД из мышц кролика (электрофореграмма, окрашивание Кумасси R250)

4 - супернатант, полученный после обработки сперматозоидов ультразвуком (копия PVDF мембраны после окрашивания антителами против ГАФДс)

5 - ГАФД из мышц кролика (копия PVDF мембраны после окрашивания антителами 6С5 против цитоплазматической ГАФД)

Б: 1 - маркеры (886, 443, 232, 132, 66, 45 кДа)

2 - супернатант, полученный после обработки сперматозоидов ультразвуком

3 - супернатант, полученный после обработки осадка клеток трипсином

Из приведенных на рис. 14А результатов видно, что ГАФДс, которая переходит в экстракт после обработки трипсином, при нативном электрофорезе идет одной полосой на одном уровне с ГАФД из мышц кролика и окрашивается антителами к ГАФДс. Известно, что соматическая ГАФД в нативном состоянии существует в виде тетрамера и соответствует молекулярной массе 144 к Да. Следовательно, молекулярная масса растворимого фрагмента ГАФДс, полученного после обработки трипсином, составляет 144-200 кДа (200 кДа по расчёту из калибровочного графика зависимости lgMv от Щ. При SDS-электрофорезе этот же препарат даёт основную полосу с молекулярной массой ~40 кДа (рис. 14Б, дорожка 3). Следовательно, препарат фермента, полученный путем трипсинолиза, является скорее всего тетрамером. В экстракте, полученном после обработки ультразвуком, ГАФДс также идёт одной полосой (рис.14А, дорожка 4), но чуть выше, чем фермент, полученный при помощи трипсинолиза. Поскольку содержание ГАФДс в экстракте после обработки сперматозоидов ультразвуком ниже, чем после трипсинолиза, данную полосу можно увидеть только после иммуноблотинга. Из рис. 14А (дорожка 4) видно, что полноразмерная ГАФДс также является тетрамером. Ни в экстракте, ни в препарате очищенного фермента при нативном электрофорезе не обнаружено димерных или мономерных форм.

В результате нативного электрофореза экстракта после обработки ультразвуком мы получили одну полосу, а при SDS-электрофорезе тот же экстракт даёт 4 полосы с разными молекулярными массами 58, 48, 47 и 40 кДа (рис. 14Б, дорожка 2). Можно предположить, что олигомер ГАФДс образуется из субъединиц разной длины. Возможно, это связано с тем, что не все субъединицы тетрамера связаны с фиброзным слоем, а одна или две. У оставшихся субъединиц N-конец остаётся свободным и поэтому легко отщепляется протеиназами. В результате при SDS-электрофорезе мы видим одну полосу (58 кДа), которая соответствует полноразмерной ГАФД, закреплённой на фиброзном слое, и ряд полос, соответствующих субъединицам с отщепленным N-концом.

Таким образом, ГАФДс, полученная в результате обработки сперматозоидов трипсином, является тетрамером.

Также мы анализировали методом голубого нативного электрофореза экстракты после обработки ультразвуком и после трипсинолиза, которые были проинкубированы с 2-меркаптоэтанолом для того, чтобы посмотреть не участвуют ли дисульфидные мостики в образовании связей между субъединицами. Однако отличий по сравнению с пробами без меркаптоэтанола не было.

Роль дополнительных цистеиновых остатков в молекуле ГАФДс

Сравнительный анализ первичной структуры ГАФДс млекопитающих показал, что в отличие от соматической ГАФД (код доступа в базе данных Swiss Prot - Р04406) ГАФДс содержит три дополнительных цистеиновых остатка. У ГАФДс человека это - С21, С94 и С150 (Swiss Prot, 014556). Один из них (С21) локализован в N-концевом домене (рис. 3) и, возможно, образует дисульфидную связь с цистеинами белков фиброзного слоя. Два других цистеиновых остатка (С94 и С150) локализованы в NAD-связывающем домене (рис. 15). Остаток, соответствующий С94 ГАФДс человека, присутствует во всех известных последовательностях ГАФДс (11 видов млекопитающих). Остаток С21 N-концевого домена и остаток, соответствующий С150 человека, присутствуют только у плацентарных млекопитающих. Данные результаты позволяют предполагать необходимость указанных остатков для осуществления функций, специфичных для сперматозоидной изоформы фермента, поэтому было сделано предположение об участии данных остатков в образовании связей с фиброзным слоем. На модели трехмерной структуры ГАФДс человека (рис. 15) видно, что остаток С150 расположен на поверхности белковой глобулы, что предполагает возможность его взаимодействия с другими белками. Кроме того, дисульфидные связи с белками фиброзного слоя могут быть образованы при участии цистеинов N-концевого домена, в том числе С21. Для того чтобы проверить возможность участия этих цистеиновых остатков в образовании дисульфидных связей с белками фиброзного слоя, было исследовано влияние (В-меркаптоэтанола на экстракцию ГАФДс. Осадок разрушенных сперматозоидов инкубировали в присутствии 5 мМ (3-меркаптоэтанола в течение 2 ч и исследовали полученный экстракт. Оказалось, что присутствие (3-меркаптоэтанола не оказывает существенного влияния на экстракцию ГАФДс (данные не представлены). Полноразмерная ГАФДс плохо экстрагируется независимо от присутствия (3-меркаптоэтанола, а более короткие 40--48 кДа-фрагменты легко переходят в раствор как в присутствии, так и в отсутствие (3-меркаптоэтанола. Полученные результаты говорят о том, что С150 не образует ковалентных связей с белками фиброзного слоя. В отношении С21 можно сказать, что он может участвовать в образовании дисульфидных связей, однако между N-концевым доменом и фиброзным слоем могут существовать достаточно прочные взаимодействия другой природы, поэтому восстановление дисульфидных связей не способствует переходу белка в раствор. Роль остатков С94 и С150 остается неясной, однако возможно, что присутствие дополнительных цистеиновых остатков делает фермент более чувствительным к окислителям и сульфгидрильным ядам.

N-концевой домен X lC228 \С22Л;

N-концевой домен

C150j

С 94 к

N-концевой домен

Рис. 15. Модель трехмерной структуры ГАФДс человека. 4 субъединицы фермента показаны разными цветами, красными шариками обозначены цистеины, а синими шариками — места прикрепления N-концевых доменов. С94 и С150 — остатки цистеина, характерные для сперматозоидной ГАФД, С224,С228 (активный центр) и С319 - остатки цистеина, присутствующие в обоих изоферментах.

Выделение рекомбинантной ГАФДс из клеток E.coli

В ходе работы со сперматозоидами человека и выделения ГАФДс из них, мы столкнулись с рядом проблем. Во-первых, для выделения фермента необходимо достаточное количество клеток (желательно 2-Змл), процесс их накопления требует доноров и времени. Во-вторых, как видно из таблицы 1, в результате выделения получается не более 20-66 мкг белка, что очень мало и такого количества белка недостаточно для изучения свойств фермента. Помимо этого препарат ГАФДс получается негомогенным, а многократные очистки привели бы к потере большей части белка. Поэтому мы решили экспрессировать ГАФДс в клетках E.coli.

Сначала в клетках E.coli клонировали полноразмерную последовательность ГАФДс.

Экспрессия полноразмерной рекомбинантной ГАФДс трансформированными клетками E.coli Rosetta 2(DE3)/pETGAPDS

Мы проанализировали содержание ГАФДс в клетках Rosetta 2(DE3)/ pETGAPDS, экспрессирующих полноразмерный человеческий фермент с N-концевым доменом (рис.16).

Экспрессия полноразмерного белка ГАФДс клетками Rosetta 2(DE3)/ pETGAPDS была подтверждена иммуноокрашиванием клеточных лизатов моноклональными антителами против ГАФДс. После разрушения клеток ультразвуком и отделения нерастворимого осадка центрифугированием почти вся ГАФДс осталась в осадке (рис. 16, дорожка 1), практически не проявляя при этом глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназную активность. Возможно, причиной отсутствия активности послужило неправильное сворачивание белка.

45 36

М 1 2

Рис. 16. Иммуноокрашивание осадка (1) и супернатанта (2) клеток E.coli Rosetta 2(DE3)/ pETGAPDS после обработки ультразвуком. Клетки суспендировали в ЮмМ калий-фосфатном буфере, содержащем 1мМ ЭДТА и 10 мМ ДТТ и обрабатывали ультразвуком. Затем суспензию центрифугировали и измеряли активность ГАФД отдельно в супернатанте и в осадке.

М - маркеры (66,45,36)

I - осадок после обработки ультразвуком

2- супернатант после обработки ультразвуком

При иммуноблотинге клеточного лизата мы получили полосу на уровне 60 кДа, что согласуется с литературными данными относительно подвижности полноразмерной ГАФДс в полиакриламидном геле (Welch J. et al, 2000).

При экспрессии эукариотических генов в бактериальных клетках часть рекомбинантных эукариотических белков и некоторые прокариотические белки при высоком уровне биосинтеза переходят в нерастворимое состояние, образуя так называемые тельца включения. Поэтому мы предположили, что ГАФДс находится в них. Однако выделить белок из телец включения стандартными методиками не удалось.

Известно, что нерастворимые белки можно экстрагировать в раствор детергентами, такими как мочевина и гуанидингидрохлорид в высоких концентрациях. Мы исследовали влияние 8М мочевины, 4М гуанидингидрохлорида и Triton Х-100 на экстракцию ГАФДс. Для этого клетки E.coli Rosetta 2(DE3)/ pETGAPDS суспендировали в равном объеме калий-фосфатного буфера (рН 7,5), обрабатывали ультразвуком и центрифугировали. К полученному осадку добавляли калий-фосфатный буфер и детергенты, затем инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Полученный после центрифугирования супернатант диализовали против ЮмМ калий-фосфатного буфера на холоду в течение 3 часов, потом диализат изучали методом Ds-Na-электрофореза. Результаты представлены на рис. 17.

66 ч ft М 3 2 М А Б

Рис. 17. Экстракция полноразмерной ГАФДс с помощью детергентов. Клетки суспендировали в равном объеме 50 мМ калий-фосфатного буфера, обрабатывали ультразвуком и полученный после центрифугирования осадок инкубировали 4М гуанидингидрохлоридом (1), 8М мочевиной (2) и 1% Triton Х-100 (3) 30 мин при комнатной температуре. Полученные экстракты диализовали против 10 мМ калий-фосфатного буфера на холоду и анализировали методом Ds-Na-электрофорезэ,

А: 1 - экстракт, полученный после инкубации разрушенных клеток с 4М гуанидингидрохлоридом

2 - экстракт, полученный после инкубации разрушенных клеток с 8М мочевиной

М- маркеры (66,45,36,29,25) Б: М- маркеры (66, 45,36)

3 - экстракт, полученный после инкубации разрушенных клеток с 1% Triton Х-100

В пробе с гуанидингидрохлоридом после диализа образовывались агрегаты и не было активности ГАФДс, тогда как в пробах с мочевиной и Triton XI00 осадка не было, и была зафиксирована низкая активность ГАФД (около 2 Ед/мг). Поэтому мы продолжили попытки выделить полноразмерную ГАФДс, используя мочевину и Triton XI00.

Мочевина:

К полученному после обработки мочевиной супернатанту мы пробовали добавлять равный объем 50 мМ калий-фосфатного буфера, содержащего сульфат аммония в разных концентрациях для нанесения на колонку с фенил-сефарозой. При насыщении сульфатом аммония больше, чем на 10%, белок выпадал в осадок и для дальнейшего выделения необходимо было снова его переводить в растворенную форму. Попытка почистить на колонке белок в буфере, содержащем 10% сульфата аммония, привела к выделению грязного неактивного препарата.

Triton Х-100:

Супернатант после обработки Triton XI00 наносили на колонку, заполненную фенил-сефарозой и уравновешенную 50мМ калий-фосфатным буфером с 30% насыщения сульфатом аммония. Промывали колонку исходным буфером и градиентом сульфата аммония от 30% до 5%. Белок снимали с колонки ЮмМ Hepes и фильтровали на центрифужных фильтрах (MWCO 100 кДа).

По результатам поставили электрофорез и провели иммуноокрашивание антителами к ГАФДс (рис.18).

М1

М2

Рис. 18. Результаты выделения полноразмерной ГАФДс из клеток E.coli, экспрессирующих полноразмерную ГАФДс человека.

1 - препарат ГАФДс после обработки Triton XI00 до нанесения на колонку с фенил-сефарозой

2,3 - препарат ГАФДс после элюдии с колонки (фенил-сефароза) и последующей фильтрации через фильтры 100 кДа (фракция>100 кДа) 1,2- результаты Ds-Na-электрофореза

3 - результат иммуноокрашивания моноклональными антителами против ГАФДс

Ml - маркеры (60,42,30) М2— маркеры (66,45,36)

Полученный препарат окрашивается антителами против ГАФДс (Рис.18, дорожка 3), однако препарат грязный (рис.18, дорожка 2) и активность ГАФД в нём отсутствует. Таким образом, он непригоден для изучения свойств фермента, поскольку не активен, и не применим для получения антител из-за большого количества примесей. Очистить белок от примесей других нерастворимых белков пока не удалось. Мы полагаем, что нерастворимость ГАФДс, а также отсутствие активности полноразмерной ГАФД, связано с наличием N-концевого домена. В процессе сперматогенеза происходит формирование фиброзного слоя и одновременное встраивание в него необходимых ферментов. Новосинтезированная ГАФДс встраивается N-концевым доменом в растущий фиброзный слой, поэтому N-концевой домен не препятствует сворачиванию белка. При экспрессии полноразмерной ГАФДс в клетках E.coli гидрофобный N-концевой домен остается свободным и способствует агрегации белка. Поэтому было решено экспрессировать в клетках E.coli ГАФДс без N-концевого домена. Как было показано выше, фрагмент ГАФДс после отщепления N-концевого домена трипсином сохраняет активность и переходит в раствор. Следовательно, N-концевой домен не взаимодействует с каталитической частью фермента и может быть удален.

Сначала в молекуле ГАФДс природный N-концевой домен был заменен на близкий по размеру, но менее гидрофобный фрагмент -хитинсвязывающий домен. Мы предположили, что это позволит избежать агрегации фермента и получить растворимую модель ГАФДс.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Элькина, Юлия Леонидовна

Выводы

1. Из сперматозоидов человека выделена растворимая и активная ГАФДс без N-концевого домена с удельной активностью 10-50 Ед/мг. Показано, что выделенная ГАФДс является тетрамером.

2. Выделены растворимые гомогенные препараты рекомбинантной ГАФДс (ChBD-GAPDs), содержащей хитин-связывающий домен вместо N-концевого домена, и рекомбинантной ГАФДс без N-концевого домена (dN-GAPDs) с удельными активностями 40-50 Ед/мг.

3. Показано, что оба рекомбинантных фермента (ChBD-GAPDs и dN-GAPDs) являются тетрамерами и обладают повышенной стабильностью по сравнению с соматической ГАФД.

Заключение

Дисплазия фиброзного слоя жгутиков сперматозоидов характеризуется почти полным отсутствием подвижности сперматозоидов в связи с серьезными нарушениями в формировании фиброзного слоя. Поскольку ГАФДс связана своим N-концевым доменом с фиброзным слоем, нарушения в его формировании приводят к нарушению включения фермента в фиброзный слой на стадии спермиогенеза. В результате количество фермента в сперматозоидах с ДФС значительно ниже, чем в норме, и экстракция ГАФДс в раствор после разрушения клеток происходит легче. Известно, что процесс формирования фиброзного слоя и встраивания в него ферментов очень строго регулируется. Нарушения в формировании фиброзного слоя могут быть связаны с нарушениями регуляции этого процесса или с недостаточностью неизвестного белка, ответственного за связывание ГАФДс, что и приводит к снижению содержания ГАФДс в сперме пациентов с ДФС.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Элькина, Юлия Леонидовна, Москва

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж.1994) Молекулярная биология клетки. Мир. Москва.Т.З. С. 7-55.

2. Брагина Е.Е., Абдумаликов Р.А. (2002) Руководство по сперматологии.

3. СОРЕК-полиграфия. Москва. С. 11-18, 18-22, 28.

4. Куравский М.Л. и Муронец В.И. (2007) Соматическая исперматозоидная глицеральдегид-3 -фосфатдегидрогеназа:сравнительный анализ первичных структур и функциональных особенностей. Биохимия. 72(7): 744-749.

5. Ченцов Ю.С. (1984) Общая цитология. Издательство Московскогоуниверситета. С. 320-336.

6. Ahmad К., Bracho G.E., Wolf D.P., Tash J.S. (1995) Regulation of humansperm motility and hyperactivation components by calcium, calmodulin, and protein phosphatases. Arch. Androl. 35(3): 187-208.

7. Aitken R.J., Harkiss D., Knox W., Paterson M., Irvine D.S. (1998) A novelsignal transduction cascade in capacitating human spermatozoa characterized by redox-regulated, c-AMP-mediated induction of tyrosine phosphorylation. J. Cell Science. Ill: 645-656.

8. Aitken RJ. and Sawyer D. (2003) The human spermatozoon-not waving butdrowning. Adv. Exp. Med. Biol. 518: 85-98.

9. Ashmarina L.I., Muronetz V.I., Nagradova N.K. (1982) Evidence for achange in catalytic properties of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase monomers upon their association in a tetramer. FEBS Lett. 144(1): 43-46.

10. Alvarez J.G. and Storey B.T. (1995) Differential incorporation of fatty acidsinto and peroxidative loss of fatty acids from phospholipids of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 42(3): 334-346.

11. Baccetti В., Collodel G., Estenoz M., Manca D., Moretti E., Piomboni P.2005) Gene deletions in an infertile man with sperm fibrous sheath dysplasia. Hum. Reprod. 20(10): 2790-2794.

12. Baker M.A., Hetherington L., Ecroyd H., Roman S.D., Aitken R.J. (2004)

13. Analysis of the mechanism by which calcium negatively regulates the tyrosine phosphorylation cascade associated with sperm capacitation. J. Cell Sci. 117(2): 211-222.

14. Banas Т., Banas В., Wolny M. (1976) Kinetic studies of the reactivity of thesulfhydryl groups of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Eur. J. Biochem. 68: 313-319.

15. Bedford J.M. and Calvin H.I. (1974) Changes in -S-S- linked structures ofthe sperm tail during epididymal maturation, with comparative observations in sub-mammalian species. J. Exp. Zool. 187: 181—204.

16. Bishop A.L. and Hall A. (2000) Rho GTPases and their effector proteins.

17. Biochem. J. 348(2): 241-255.

18. Boer P.H., Adra C.N., Lau Y-F., McBumey M.W. (1987) The testis-specificphosphoglycerate kinase gene pgk-2 is a recruited retroposon. Mol. Cell Biol. 7:3107-3112.

19. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method of quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-due binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.

20. Brown P.R., Miki K., Harper D.B. and Eddy E.M. (2003) A-kinaseanchoring protein 4 binding proteins in the fibrous sheath of the sperm flagellum. Biol. Reprod. 68: 2241-2248.

21. Brown V.M., Krynetski E.Y., Krynetskaia N.F., Grieger D., Mukatira S.T.,

22. Murti K.G., Slaughter C.A., Park H.W., Evans W.E. (2004) A novel CRM 1-mediated nuclear export signal governs nuclear accumulation ofglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase following genotoxic stress. J. Biol. Chem. 279(7): 5984-5992.

23. Buehner M., Ford G.C., Moras D., Olsen K.W., Rossman M.G. (1973) Dglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: three-dimensional structure and evolutionary significance. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 70(11): 3052-3054.

24. Buffone M.G., Calamera J.C., Verstraeten S.V., Doncel G.F. (2005)

25. Capacitation-associated protein tyrosine phosphorylation and membrane fluidity changes are impaired in the spermatozoa of asthenozoospermic patients. Reproduction. 129: 697-705.

26. Bunch D.O., Welch J.E., Magyar P.L., Eddy E.M., O'Brien D.A. (1998)

27. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S protein distribution during mouse spermatogenesis. Biol. Reprod. 58(3): 834-841.

28. Carlsen E., Givereman A., Keiding N., Skakkebaek N. (1992) Evidence fordecreasing quality of semen during the past 50 years. Brit. Med. J. 305: 609-613.

29. Carr D.W., Stofko-Hahn R.E., Fraser I.D., Bishop S.M., Acott T.S., Brennan

30. R.G. and Scott J.D. (1991) Interaction of the regulatory subunit (RII) of cAMP-dependent protein kinase with Rll-anchoring proteins occurs through an amphipathic helix binding motif. J. Biol. Chem. 226(22): 14188-14192.

31. Carrera A., Gerton G.L., Moss S.B. (1994) The major fibrous sheathpolypeptide of mouse sperm: structural and functional similarities to the A-kinase anchoring proteins. Dev. Biol. 165(1): 272-284.

32. Carrera A., Moos J., Ning X.P., Gerton G.L., Tesarik J., Kopf G.S., Moss

33. S.B. (1996) Regulation of protein tyrosine phosphorylation in human sperm by a calcium/calmodulindependent mechanism: identification of

34. A kinase anchor proteins as major substrates for tyrosine phosphorylation. Dev. Biol. 180: 284-296.

35. Chemes H.E., Olmedo S.B., Carrere C., Oses R., Carizza C., Leisner M.,

36. Blaquier J. (1998) Ultrastructural pathology of the sperm flagellum: association between flagellar pathology and fertility prognosis in severely asthenozoospermic men. Hum. Reprod. 13: 2521-2526.

37. Chuang D.M., Hough C., Senatorov V.V. (2005) Glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase, apoptosis, and neurodegenerative diseases. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol 45: 269-90.

38. Clermont Y. (1972) Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferousepithelium cycle and spermatogonial renewal. Physiol. Rev. 52: 198236.

39. Collier H.B. (1973) Letter: A note on the molar absorptivity of reduced

40. Ellman's reagent, 3-carboxylato-4-nitro-thiophenolate. Anal. Biochem. 56:310-311.

41. Desseyn J-L., Burton K.A., McKnight G.S. (2000) Expression of anonmyristylated variant of the catalytic subunit of protein kinase A during male germ-cell development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6433-6438.

42. Eddy E.M., O'Brien D.A., Fenderson B.A., Welch J.E. (1991) Intermediatefilament-like proteins in the fibrous sheath of the mouse sperm flagellum. Ann. NY Acad. Sci. 637: 224-239.

43. Eddy E., Toshimori K., O'Brien, D.A (2003) Fibrous sheath of mammalianspermatozoa. Microsc. Res. Tech. 61(1): 103-115.

44. Ellman G.L. (1959) Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem. and Biophys.82: 70-77.

45. Escalier D., Gallo J-M., Schrevel J. (1997) Immunochemical

46. Characterization of a Human Sperm Fibrous Sheath Protein, Its Developmental Expression Pattern, and Morphogenetic Relationships with Actin. J. of Histochemistry & Cytochemistry. 45(7): 909-922.

47. Evguenieva-Hackenberg E., Schiltz E. and Klug G. (2002) Dehydrogenasesfrom all three domains of life cleave RNA. J. Biol. Chem. 277(48): 46145-46150.

48. Fawcett D.W. (1975) The mammalian spermatozoon. Dev. Biol. 44: 394436.

49. Feiden S., Wolfrum U., Wegener G., Kamp G. (2008) Expression andcompartmentalisation of the glycolytic enzymes GAPDH and pyruvate kinase in boar spermatogenesis. Reprod. Fertil. and Dev. 20: 713—723.

50. Ficarro S., Chertihin O., Westbrook V.A., White F., Jayes F., Kalab P.,

51. Marto J.A., Shabanowitz J., Herr J.C., Hunt D.F., Visconti P. (2003) Phosphoproteome analysis of capacitated human spermatozoa. J. Biol. Chem. 278: 11579-11589.

52. Fokina K.F., Dainyak M.B., Nagradova N.K., Muronetz V.I. (1997) A studyon complexes between human erythrocyte enzymes participating in the conversions of 1,3-diphosphoglycerate. Arch. Biochem. Biophys. 345: 185-192.

53. Ford W.C. (2004) Regulation of sperm function by reactive oxygen species.

54. Hum. Reprod. Update 10(5): 387-399.

55. Fujita A., Nakamura K., Kato Т., Watanabe N., Ishizaki Т., Kimura K.,

56. Mizoguchi A., Narumiya S. (2000) Ropporin, a sperm-specific binding protein of rhophilin, that is localized in the fibrous sheath of sperm flagella. J. Cell Sci. 113: 103-112.

57. Fulcher K.D., Mori C., Welch J.E., O'Brien D.A., Klapper D.G., Eddy E.M.1995) Characterization of Fscl cDNA for a mouse sperm fibrous sheath component. Biol. Reprod. 52: 41-49.

58. Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M. R., Appel R.

59. D., Bairoch A. (2005) Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. In: Walker JM, editor. The Proteomics Protocols Handbook. Humana Press, New York.

60. Gibbons I. (1981) Cilia and flagella of eukariotes. J. Cell Biol. 91: 107-113.

61. Harun Yahya (2003) The miracle of human creation. Goodword books.

62. Hill E.J., Meriwether B.P. and Park J.H. (1975) Purification of rabbit muscleglyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase by gel filtration chromatography. Anal. Biochem. 63(1): 175-182.

63. Ho HC. and Suarez SS. (2003) Characterization of the intracellular calciumstore at the base of the sperm flagellum that regulates hyperactivated motility. Biol. Reprod. 68: 1590-1596.

64. Holstein A. (1976) Ultrastructural observations on the differentiation ofspermatids in man. Andrologia. 8: 157-163.

65. Huitorel P. and Pantaloni D. (1985) Bundling of microtubules byglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and its modulation by ATP. Eur. J. Biochem. 150(2): 265-269.

66. Ishitani R. and Chuang D.M. (1996) Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase antisense oligodeoxynucleotides protect against cytosine arabinonucleoside-induced apoptosis in cultured cerebellar neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93(18): 9937-9941.

67. Ishitani R., Sunaga К., Tanaka M., Aishita H., Chuang D.M. (1997)

68. Overexpression of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is involved in low K+-induced apoptosis but not necrosis of cultured cerebellar granule cells. Mol. Pharmacol. 51(4): 542-550.

69. Jenkins J.L., Tanner J.J. (2006) High-resolution structure of human Dglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 62(3): 290-330.

70. Johnson L.R., Foster J.A., Haig-Ladewig L., VanScoy H., Rubin C., Moss S.

71. Khoroshilova N.A., Muronetz V.I., Nagradova N.K. (1992) Interactionbetween D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and 3-phosphoglycerate kinase and its functional consequences. FEBS Lett. 297(3): 247-249.

72. Kim J.W., Dang C.V. (2005) Multifaceted roles of glycolytic enzymes.

73. Trends Biochem Sci. 30(3): 142-150.

74. Kim Y.H., Haidl G., Schaefer M., Egner U., Mandal A., Herr J.C. (2007)

75. Compartmentalization of a unique ADP/ATP carrier protein SFEC (Sperm Flagellar Energy Carrier, AAC4) with glycolytic enzymes in the fibrous sheath of the human sperm flagellar principal piece. Dev. Biol. 302(2): 463-476.

76. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly ofthe head of bacteriophage T4. Nature. 227(5259): 680-685.

77. Lenzi A., Gandini L., Picaro M.A. (1998) Rationale for glutathione therapy.

78. Hum. Reprod. 13: 1419-1422.

79. Lewis A. and Aitken R.J. (2001) Impact of epididymal maturation on thetyrosine phosphorylation patterns exhibited by rat spermatozoa. Biol. Reprod. 64: 1545-1556.

80. Li Y., Nowotny P., Holmans P., Smemo S., Kauwe J.S., Hinrichs A.L.,

81. Li Y-F., He W., Jha K.N., Klotz K., Kim Y-H., Mandal A., Pulido S.,

82. Digilio L., Flickinger C.J., Herr J.C. (2007) FSCB, a Novel Protein Kinase A-phosphorylated Calcium-binding Protein, Is a CABYR-binding Partner Involved in Late Steps of Fibrous Sheath Biogenesis. J. Biol. Chem. 282(47): 34104-34119.

83. Luconi M. and Baldi E. (2003) How do sperm swim? molecular mechanismsunderlying sperm motility. Cell Mol. Biol. 49: 357-369.

84. Luconi M, Porazzi I., Ferruzzi P., Marchiani S., Forti G., Baldi E. (2005)

85. Tyrosine phosphorylation of the a kinase anchoring protein 3 (АКАРЗ) and soluble adenylate cyclase are involved in the increase of human sperm motility by bicarbonate. Biol. Reprod. 72: 22-32.

86. Macquarrie R.A., Bernhard S.A. (1971) Mechanism of alkylation of rabbitmuscle glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. Biochemistry. 10(13): 2456-2466.

87. Mandal A., Naaby-Hansen S., Wolkowicz M.J., Klotz K., Shetty J., Retief

88. Martin-Du Pan R.C. and Sakkas D. (1998) Is antioxidant therapy apromising strategy to improve human reproduction? Are anti-oxidants useful in the treatment of male infertility? Hum. Reprod. 13: 29842985.

89. McCarrey J.R. and Thomas K. (1987) Human testis-specific PGK gene lacksintrons and possesses characteristics of a processed gene. Nature. 326: 501-505.

90. Means A.R., Tash J.S., Chafouleas J.G. (1982) Physiological implications ofthe presence, distribution, and regulation of calmodulin in eukaryotic cells. Physiol. Rev. 62: 1-39.

91. Mercer W.D., Winn S.I., Watson H.C. (1976) Twinning in crystals of humanskeletal muscle D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Mol. Biol. 104(1): 277-283.

92. Miki K. and Eddy E.M. (1998) Identification of tethering domains forprotein kinase A type la regulatory subunits on sperm fibrous sheath protein FSC1. J. Biol. Chem. 273: 34384-34390.

93. Miki K., Willis W.D., Brown P.R., Goulding E.H., Fulcher K.D., Eddy E.M.2002) Targeted disruption of the Akap4 gene causes defects in sperm flagellum and motility. Dev. Biol. 248: 331-342.

94. Miki K., Qu W., Goulding E.H., Willis W.D., Bunch D.O., Strader L.F.,

95. Perreault S.D., Eddy E.M., O'Brien D.A. (2004) Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 101(47): 16501-16506.

96. Millan J.L., Driscoll C.E., LeVan K.M., Goldberg E. (1987) Epitopes ofhuman testis-specific lactate dehydrogenase deduced from a cDNA sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 5311-5315.

97. Millette C.F. (1990) Reproductive physiology of the male. In: Seibel M. M.ed). Infertility. A comprehensive text. Appleton&Lange, Norwalk, Conneticut. P. 129-147.

98. Mooney J., Horan A., Latimer J. (1972) Motility of spermatozoa in humanepididymis. J. Urol. 108:443-445.

99. Moore H. (1990) The epididymis. In: Chisholm G., Fair W. (eds). Scientificfoundation in Urology. Heinemann Medical, Oxford. P. 399-410.

100. Moore H. (1996) The influence of the epididymis on human and animalsperm maturation and storage. Hum. Reprod. Natl. Suppl. 11: 103-110.

101. Morero R.D., Vinals A.L., Bloj В., Farias R.N. (1985) Fusion ofphospholipid vesicles induced by muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in the absence of calcium. Biochemistry. 24(8): 19041909.

102. Mukai C. and Okuno M. (2004) Glycolysis plays a major role for adenosinetriphosphate supplementation in mouse sperm flagellar movement. Biol. Reprod. 71(2): 540-547.

103. Murthy M.R., Garavito R.M., Johnson J.E., Rossmann M.G. (1980)

104. Structure of lobster apo-D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase at 3.0 A resolution. J. Mol. Biol. 138(4): 859-872.

105. Naaby-Hansen S., Mandal A., Wolkowicz M.J., Sen В., Westbrook V.A.,

106. Shetty J., Coonrod S.A., Klotz K.L., Kim Y.H., Bush L.A., Flickinger C.J., Herr J.C. (2002) CABYR, a novel calcium-binding tyrosine phosphorylation-regulated fibrous sheath protein involved in capacitation. Dev. Biol. 242(2): 236-254.

107. Nagradova N., Golovina Т., Mevkh A. (1974) Immobilized Dimers of D

108. Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase. FEBSLett. 49: 242-245.

109. Nakamura K., Fujita A., Murata Т., Watanabe G., Mori C., Fujita J.,

110. Watanabe N., Ishizaki Т., Yoshida O., Narumiya S. (1999) Rhophilin, a small GTPase Rho-binding protein, is abundantly expressed in the mouse testis and localized in the principal piece of the sperm tail. FEBS Lett. 445(1): 9-13.

111. Navarro В., Kirichok Y., Chung J-J., Clapham D.E. (2008) Ion channels thatcontrol fertility in mammalian spermatozoa. Int. J. Dev. Biol. 52: 607613.

112. Pawson T. and Scott J.D. (1997) Signaling through scaffold, anchoring, andadaptor proteins. Science. 278: 2075-2080.

113. Racker E. and Krimsky J. (1952) The mechanism of oxidation of aldehydesby D- glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Biol Chem. 198: 731-743.

114. Reinton N., Haugen T.B., Skalhegg B.S., Hanson V., Jahnsen T. (1998) Thegene encoding the С gamma catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase of ovine sperm flagella has a unique amonoterminal sequence. Genomics. 49: 290-297.

115. Reinton N., 0rstavik S., Haugen T.B., Jahnsen K., Taske'n K., Skalhegg

116. B.S. (2000) A novel isoform of human cyclic 3',5'-adenosine monophosphate-dependent protein kinase, Ca-s, localizes to sperm midpiece. Biol Reprod. 63: 607-611.

117. Reyes A., Martinez R., Luna M., Chavarria M.E. (1987) Concentrations ofcalmodulin in sperm in relation to their motility in fertile euspermic and infertile asthenozoospermic men. Int. J. Androl. 10: 507-515.

118. Ronai Z. (1993) Glycolytic enzymes as DNA binding proteins. Int. J.

119. Biochem. 25(7): 1073-1076.

120. Rowley M., Berlin J., Heller C. (1971) The ultrastructure of four types ofhuman spermatogonia. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 112: 139-146.

121. Sakai I., Sharief F.S., Li S-L. (1987) Molecular cloning and nucleotidesequence of the cDNA for sperm-specific lactate dehydrogenase-C from mouse. Biochem. J. 242: 619-922.

122. San Agustin J.T., Leszyk J.D., Nuwaysir L.M., Witman G.B. (1998) Thecatalytic subunit of the cAMP-dependent protein kinase of ovine sperm flagella has a unique amino-terminal sequence. J. Biol Chem. 273: 24874—24883.

123. Saunders P.A., Chalecka-Franaszek E., Chuang D.M. (1997) Subcellulardistribution of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in cerebellar granule cells undergoing cytosine arabinoside-induced apoptosis. J. Neurochem. 69(5): 1820-1828.

124. Schagger H., Cramer W.A. and Vonjagow G. (1994) Analysis of Molecular

125. Masses and Oligomeric States of Protein Complexes by Blue Native

126. Electrophoresis and Isolation of Membrane Protein Complexes by Two-Dimensional Native Electrophoresis. Anal. Biochem. 217(2): 220-230.

127. Schlingmann K., Michaut M.A., Mcelwee J.L., Wolff C.A., Travis A.J.,

128. Turner R.M. (2007) Calmodulin and CaMKII in the Sperm Principal Piece: Evidence for a Motility-Related Calcium/Calmodulin Pathway. J. Androl. 28(5): 187-208.

129. Schultz-Larsen J. (1958) The morphology of human sperm. Acta Pathol.

130. Microbiol. Scand. Suppl. 128: 1-121.

131. Scopes R.K. and Stoter A. (1982) Purification of all glycolytic enzymesfrom one muscle extract. Methods Enzymol. 90(E): 479-490.

132. Shalgi R., Seligman J., Kosower N.S. (1989) Dynamics of the thiol status ofrat spermatozoa during maturation: analysis with the fluorescent labeling agent monobromobimane. Biol. Reprod. 40: 1037-1045.

133. Si Y. and Olds-Clarke P. (2000) Evidence for the involvement of calmodulinin mouse sperm capacitation. Biol. Reprod. 62(5): 1231-1239.

134. Singh R. and Green M.R. (1993) Sequence-specific binding of transfer RNAby glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Science. 259(5093): 365-368.

135. Sirover M.A. (1999) New insights into an old protein: the functionaldiversity of mammalian glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochim. Biophys. Acta 1432(2): 159-184.

136. Sirover M.A. (2005) New nuclear functions of the glycolytic protein,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, in mammalian cells. J. Cell Biochem. 95(1): 45-52.

137. Skarzynski Т., Moody P.C., Wonacott A.J. (1987) Structure of hologlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus at 1.8 A resolution. J. Mol. Biol. 193(1): 171-187.

138. Stryer L. (1995) Biochemistry. 4th Edition, W. H. Freeman & Co.

139. Studier F.W. (2005) Protein production by auto-induction in high-densityshaking cultures. Protein Expr. Pur if. 41: 207—234.

140. Sukhodolets M.V., Muronetz V.I., Tsuprun V.L., Kaftanova A.S.,

141. Nagradova N.K. (1988) Association of rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and 3-phosphoglycerate kinase. The biochemical and electron-microscopic evidence. FEBS Lett. 238(1): 161-166.

142. Takai Y., Sasaki Т., Matozaki T. (2001) Small GTP-binding proteins.1. Physiol. Rev. 81:153-208.

143. Tanii, I., Yagura, Т., Inagaki, N., Yoshinaga, K. (2007) Preferential1.calization of Rat GAPDS on the Ribs of Fibrous Sheath of Sperm Flagellum and Its Expression during Flagellar Formation. Acta Histochem. Cytochem. 40(1): 19—26.

144. Tash J. S., Krinks M., Patel J., Means R.L., Klee C.B., Means A.R. (1988)1.entification, characterization, and functional correlation of calmodulin-dependent protein phosphatase in sperm. J. Cell Biol. 106: 1625-1633.

145. Tash J.S. (1989) Protein phosphorylation: the second messenger signaltransducer of flagellar motility. Cell Motil. Cytoskeleton. 14(3): 332339.

146. Tash J.S. and Bracho G.E. (1998) Identification of Phosphoproteins Coupledto Initiation of Motility in Live Epididymal Mouse Sperm. Biochem. Biophys. Res. Commun. 251: 557—563.

147. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. (1979) Electrophoretic transfer ofproteins from SDS and acid/urea gels to nitrocellulose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 4350-4354.

148. Trentham D.R. (1971) Rate-determining processes and the number ofsimultaneously active sties of D-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. Biochem. J. 122(1): 71-77.

149. Turner R.M., Musse M.P., Mandal A., Klotz K., Jayes F.C., Herr J.C.,

150. Gerton G.L., Moss S.B., Chemes H.E. (2001) Molecular genetic analysis of two human sperm fibrous sheath proteins, AKAP4 and АКАРЗ, in men with dysplasia of the fibrous sheath. J. Androl. 22: 302-315.

151. Turner R.M. (2003) Tales from the tail: what do we really know about spermmotility? J. Androl 24(6): 790-803.

152. Turner R.M. (2006) Moving to the beat: a review of mammalian spermmotility regulation. Reprod., Fertil. and Dev. 18: 25-38.

153. Verger R., Sarda, L., Desnuelle P. (1971) On the sulfhydryl groups ofporcine pancreatic lipase and their possible role in the activity of the enzyme. Biochim, Biophys. Acta. 242: 580-592.

154. Vijayaraghavan S. and Hoskins D.D. (1990) Changes in the mitochondrialcalcium influx and efflux properties are responsible for the decline in sperm calcium during epididymal maturation. Mol. Reprod. Dev. 25 (2): 186-94.

155. Vijayaraghavan S., Trautman K.D., Goueli S.A., Carr D.W. (1997) Atyrosine-phosphorylated 55-kilodalton motility-associated bovine sperm protein is regulated by cyclic adenosine 3',5'-monophosphates and calcium. Biol Reprod. 56: 1450-1457.

156. Warburg O. and Christien W. (1939) Isolierung und Kristallisation des

157. Proteins des Oxydierenden Garungsferments. Biochem. Z. 303-340.

158. Welch J.E., Schatte E.C., O'Brien D.A., Eddy E.M. (1992) Expression of aglyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene specific to mouse spermatogenic cells. Biol Reprod. 46(5): 869-878.

159. Welch J.E., Schatte E.C., O'Brien D.A., Eddy E.M. (1992) Expression of aglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene specific to mouse spermatogenic cells. Biol Reprod. 46: 869-878.

160. Welch J.E., Brown P.L., O'Brien D.A., Magyar P.L., Bunch D.O., Mori C.,

161. Eddy E.M. (2000) Human glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-2 gene is expressed specifically in spermatogenic cells. J. Androl. 21(2): 328-338.

162. Westhoff D. and Kamp G. (1997) Glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. J. Cell Sci. 110(15): 1821-1829.

163. White D.R. and Aitken R.J. (1989) Relationship between calcium, cyclic

164. AMP, ATP, and intracellular pH and the capacity of hamster spermatozoa to express hyperactivated motility. Gamete Res. 22(2): 163-177.

165. Williams A.C. and Ford W.C. (2001) The role of glucose in supportingmotility and capacitation in human spermatozoa. J. Androl. 22(4): 680695.

166. Williams A.C. and Ford W.C. (2005) Relationship between reactive oxygenspecies production and lipid peroxidation in human sperm suspensions and their association with sperm function. Fertil. Steril. 83: 929-936.

167. Xie F., Garcia M.A., Carlson A.E., Schuh S.M., Babcock D.F., Jaiswal B.S.,

168. Gossen J.A., Esposito G., Duin M., Conti M. (2006) Soluble adenylyl cyclase (sAC) is indispensable for sperm function and fertilization. Devel. Biol. 296: 353-362.

169. Yanagimachi R. (1994) Mammalian fertilization. In: Knobil E., Neil J., eds.

170. The Physiology of reproduction. 2nd edn. Raven Press, N. Y. P. 189317.

171. Yang J., Chennathukuzhi V., Miki K., O'Brien D.A., Hecht N.B. (2003)

172. Mouse testis brain RNA-binding protein/translin selectively binds to the messenger RNA of the fibrous sheath protein glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S and suppresses its translation in vitro. Biol. Reprod. 68(3): 853-859.

173. Yunes R., Doncel G.F., Acosta A.A. (2003) Incidence of sperm-tail tyrosine phosphorylation and hyperactivated motility in normozoospermic and asthenozoospermic human sperm samples. Biocell. 27: 29-36.

Информация о работе

Элькина, Юлия Леонидовна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из сперматозоидов: выделение, свойства и роль в их подвижности - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы