Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация сальмонелл по составу жирных кислот в системе автоматизированного хромато-электрохимического обнаружения возбудителя

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация сальмонелл по составу жирных кислот в системе автоматизированного хромато-электрохимического обнаружения возбудителя"

РГ Б ОД

' 1 МАР 1998

На правах рукописи

КОМАРОВ

Григорий Дмитриевич

ИДЕНТИФИКАЦИЯ САЛЬМОНЕЛЛ ПО СОСТАВУ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В СИСТЕМЕ АВТОМАТИЗИРОВАННОГО ХРОМАТО - ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОКОГО ОБНАРУЖЕНИЯ

ВОЗБУДИТЕЛЯ

03.00.07-Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1998 г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском Орде Трудового Красного Знамени Институте эпидемиологии микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РА^ и Межведомственном инженерном центре по координац медико-экологических и санитарно-эпидемиологических пробле

Научные руководители:

- действительный член Академии медико-технических на> доктор медицинских наук, профессор В.М.Бондаренко,

- доктор технических наук, профессор В.В.Помазанов

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук И.С.Тартаковский,

- доктор медицинских наук, профессор Е.А.Ведьмина

Ведущая организация: Московская Медицинская Академия им. И.М.Сеченова

Защита состоится _в час

на заседании Диссертационного совета К 001.07.01 в Научн исследовательском Институте эпидемиологии и микробиолог] им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул.Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке НИИЭ им. Н.Ф.Гамалеи.

Автореферат разослан ^'_1998 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, доктор медицинских наук

Е.И.Коптелова

Актуальность исследования. В эпидемиологии и инфекционной патологии особое место принадлежит экспресс-индикации и идентификации возбудителей или их специфических продуктов (антигенов, последовательностей ДНК, состава жирных кислот и др.)- Наибольший удельный вес среди острых кишечных инфекций в последнее десятилетие занимают сальмонеллезы, возбудители которых насчитывают более 2200 различных сероваров. Проблема сальмонеллезов тесно связана с высоким уровнем заболеваемости сельскохозяйственных животных, контаминацией сальмонеллами пищевых мясо-молочных продуктов, тушек птиц, готовых изделий и т.д. Актуальной в настоящее время является и проблема внутрибольничных сальмонеллезов, наиболее часто обуславливаемых Salmonella enteritidis и Salmonella typhimurium (Акимкин, Беляков, 1996). Следует отметить, что рост инфекционных заболеваний, связанных с неудовлетворительным микробиологическим качеством продовольственного сырья, пищевых продуктов, питьевой воды непрерывно растет во всем мире, в том числе и Российской Федерации (РФ) .

Анализ эффективности и своевременности применяемых на практике методов бактериологического и серологического выявления сальмонелл и других эпидемиологически значимых патогенных бактерий свидетельствует о том, что в ряде случаев низкая чувствительность методов не всегда позволяет обнаружить возбудителя (Воробьев, Бондаренко, 1997).

В России эпидемиологическая обстановка по кишечным инфекциям неизбежно будет ухудшаться вследствие снижения экономического и социального уровня жизни основной массы населения, а также обвального вытеснения отечественного рынка продуктов на международный (Дмитриева, 1997; Онищенко, 1997).

Обращает на себя внимание факт несоответствия случаев кишечных заболеваний с качеством пищевых продуктов в РФ и за рубежом. Только в Великобритании, в соответствии с Докладом об инфекционных заболеваниях группы PHLS, за июль, август и сентябрь 1996 года отмечено 12642 случая инфицирования продуктов питания сальмонеллами, тогда как за весь 1996 год таких случаев в РФ отмечено всего насколько десятков. При этом число заболеваний сальмонеллезными инфекциями в РФ за последние 5 лет превысило десять тысяч в год.

За рубежом растущее беспокойство по поводу бактериального загрязнения продуктов питания привело к созданию новых технологий, определяющих качественно новый уровень тестирования продуктов питания на наличие патогенных бактерий и в первую очередь сальмонелл (Beumer et al, 1991; Di Falco et al, 1993; Bülte, Jakob, 1995). Начиная с 1978 года в Великобритании, Голландии, Австрии, Франции ведутся методические и

приборные исследования по созданию новых высокопроизводительных И1 трументальных методов контроля контаминации пищи на зараженность М1 роорганизмами. В связи с ростом инфекционных заболеваний, обусловл< ных инфицированной пищей, традиционные методы обнаружения и выделе! патогенных агентов вследствие их трудоемкости и продолжительности 1 чинают не справляться со все возрастающим объемом необходимых иссле; ваний. Стремление микробиологов заменить традиционные методы инст) ментальными технологиями, которые могли бы сократить время микpoбиOJ гического тестирования, не уступая при этом точности определен! чувствительности и воспроизводимости, привело к появлению на заруб« ном приборном рынке новых технических средств, отвечающих этим уело!

ЯМ.

Одним из подходов, направленных на быстрое обнаружение патоген) бактерий в тестируемом материале, является детекция возбудителей профилю жирных кислот, устанавливаемого с помощью метода газовой х) матографии (М^гика, 1974; Помазанов, 1975; Васюренко, 1981; Мещеря! ва, 1984; Бондаренко, 1986). Показано, что контроль химических па] метров и особенностей их изменения в процессе роста микробов гора: легче автоматизировать путем использования техники измерения элект] ческой проводимости среды культивирования бактерий, принцип котор( состоит в том, что при постоянной температуре конечные продукты бак' риального метаболизма изменяют ионную концентрацию среды роста и, п< кольку ионы являются носителями заряда, это приводит к изменению п] водимости. Изменения проводимости свидетельствуют о метаболичес] процессах, обусловленных ростом микробных клеток.

Для профилактики кишечных инфекций у человека, вызываемых бак' риями различных таксономических групп, в том числе и сальмонелла! важными являются эпидемиологический надзор и осуществление санит; но-гигиенических мер и мероприятий, определяющую роль при которых 1 рают методы своевременной индикации и идентификации возбудителя.

Цель работы

Целью настоящего исследования явилась отработка критериев иден' фикации бактерий по профилю жирных кислот и разработка комплексной I томатизированной хемотаксономической (хромато-электрохимической) с! темы для обнаружения сальмонелл и других патогенных бактерий, возбу; телей острых кишечных инфекций.

Задачи исследования

1. Изучить профиль жирных кислот эталонных штаммов энтеробактерий различных таксономических групп с отбором дифференцирующих признаков в отношении сальмонелл.

2. Осуществить аналитический контроль химических соединений, характеризующих таксономическую принадлежность эпидемиологически значимых бактерий, учет которых легко автоматизируется и стабилен в отношении качественной и количественной оценки результатов исследования и их интерпретации.

3. Определить возможность электрохимического метода обнаружения сальмонелл и других патогенных бактерий с использованием селективной среды.

4. Разработать комплексный экспресс метод обнаружения и идентификации сальмонелл путем культивирования бактерий на селективной питательной среде с последующим газохроиатографическим анализом состава их жирных кислот.

5. Осуществить апробацию нового метода экспресс-диагностики сальмонелл по результатам хемотаксономического и импедансного анализов на практике.

Научная новизна. Разработан системный подход в организации крупномасштабных микробиологических исследований качества пищевых продуктов с использованием различных физико-химических методов анализа и их сочетания в масштабах отдельно взятого региона. При этом впервые получены следующие аналитические и экспериментальные данные:

- получены качественные и количественные данные по составу жирных кислот представителей родов Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Haf-nia, Serratia, Citrobacter, Campylobacter, Escherichia, Listeria, Yersinia, Staphylococcus и Francisella и определен хемотаксономический критерий их индикации по профилю насыщенных и ненасыщенных жирных кислот ;

- определены качественные и количественные вариации жирнокислотного состава бактерий в зависимости от качества питательной среды и температуры культивирования;

- отработан системный анализ прохождения пробы, подращивания микроорганизмов на селективных и неселективных средах с одновременным электрохимическим контролем процесса роста по изменению проводимости среды;

- разработана хроматографическая методика и прибор с программа обеспечением для идентификации бактерий по составу их жирных кисло1 химически сложных средах, в том числе для диагностики анаэробных не лостридиальных инфекций;

- предложен новый метод с техническим обеспечением обнаружение идентификации бактерий с помощью электрохимического и хроматографиче кого методов анализа.

Практическая значимость работы. Разработанные методы, программь технические средства использованы для организации тестирования больц го числа проб пищевых продуктов на наличие патогенных и условно-пат генных бактерий с целью сведения к минимуму возможности пищевых отрг лений:

- отработаны методики отбора и прохождения проб к электрохимическс и хроматографическому анализу и тестирования пищевых продуктов с г мощью электрохимических анализаторов;

- разработаные методики идентификации бактерий по профилю их жир! кислот, программа и способ экспресс-обнаружения микробов с использо! нием сочетания кондуктометрической и хроматографической техники по* зали эффективность их использования на практике.

Внедрение в практику. Методические указания, программы и прибс внедрены в практику работы центра санэпиднадзора Юго-Восточного окр> г.Москвы и используется в системе крупномасштабного тестирования П1 дуктов питания на наличие сальмонелл и других патогенных бактерий.

Основные положения, выносимые на защиту:

- критерии хемотаксономической индикации сальмонелл и других пат генных бактерий по спектру их жирных кислот;

- методика и программа обнаружения сальмонелл электрохимическим г тодом;

- идентификация сальмонелл, совмещающая кондуктометрическую и хрог тографическую технику анализа их метаболитов в продуктах питания и С ологических образцах и объектах окружающей среды.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научных конференциях Госкомсанэпиднадзора России {Москва, июнь 1993 г., июль 1994 г., декабрь 1995 г.), VIII съезде гигиенистов и санитарных врачей (Москва, декабрь 1996 г.), итоговой конференции Научного Совета по хроматографии РАН (Москва, апрель 1997 г.), 5 Международном симпозиуме "Экология человека. Пищевые продукты и технологии на пороге XXI века" (Пятигорск, сентябрь 1997 г.), 2 Съезде хроматографистов Украины (Киев, сентябрь 1997 г.), 3 Международной конференции "Проблемы управления качеством окружающей среды" (Москва, октябрь 1997 г.). Научно-практической конференции "Приборное обеспечение науки, промышленного и сельскохозяйственного производства, природопользования, жилищно-коммунального хозяйства" (Москва, ноябрь 1997 г.).

Диссертация апробирована на конференции лаборатории генетики вирулентности бактерий, лаборатории легионеллезов, лаборатории туляремии НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН и отдела новых методов анализа МИЦКоордина-ции.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Разработка защищена патентом России N 97108375 (1997).

Структура и объем. Диссертация изложена на 143 страницах и состоит из Введения, Обзора литературы, 2 Глав собственных исследований, Выводов, Списка литературы (190 наименований). Содержит 21 рисунок и 16 таблиц.

- б -

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Матералы и методы

Хемотаксономическому исследованию были подвергнуты 208 штамп бактерий различных таксономических групп, в том числе представите родов Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Proteus, Provide cia, Campylobacter, Serratia, Citrobacter, Staphylococcus, Listeri Yersinia, Francisella, а также условно-патогенные микроорганизмы, г зывающие развитие анаэробной неклостридиальной инфекции (Bacteroide Fusobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus).

Эталонные штаммы сальмонелл (66) различных сероваров (43), клее елл (К.pneumoniae, K.oxytoca), энтеробактер (E.aerogenes, Е.cloaca« кампилобактерий (С.jejuni, С.coli), серраций (S.marcescens, S.rubic ае), цитробактерий (C.freundii, C.amalonaticus), гафний (H.alvei листерий (L.monocytogenes), иерсиний (Y.enterocolitica, У.pseudotubs culosis), францизелл (F.tularensis различных подвидов), стафилокок] (S.aureus, S.epidermidis) были получены из коллекций НИИЭМ им.И.Ф.1 малеи РАМН, НИИ стандартизации и контроля медицинских иммунобиоло! ческих препаратов им.Л.А.Тарасевич, Центра ВОЗ по эшерихиям и клеб( еллам (Копенгаген) , Института экспериментальной эпидемиологии (Bepi героде, ФРГ), Института экспериментальной патологии и терапии (Вр< лав, Польша), лаборатории объединения Мальтус (Престон, Великобри1 ния) .

Бактериальную массу представителей рода Shigella, Leptospira b lexa, Brucella ovis. Neisseria ovis, Mycobacterium avium, Bacilus a: hracis, Francisella tularensis получали из профильных лабораторий ИЭМ им.И.Ф.Гамалеи РАМН, НИИ биологического приборостроения и учреж, ний Госсанэпиднадзора г.Москвы.

Штаммы анаэробных бактерий, представителей родов Peptococc Peptostreptococcus, Bacteroides fragilis, Fusobacterium mortiferum ли получены из НИИ стандартизации контроля медицинских иммунобиоло ческих препаратов и НИИ хирургии им.А.В.Вишневского; штаммы родов L tobacillus и Bifidobacterium - из коллекции лаборатории генетики ви лентности бактерий НИИЭМ им.И.Ф.Гамалеи.

Методы исследования

В работе использованы методы культивирования, концентрирования и очистки бактерий, их гидролиза, экстракции и получения эфиров жирных кислот, а также анализа клеток и клеточных компонентов методами газовой хроматографии и импеданса (кондуктометрии среды культивирования). Для сравнения при обнаружении сальмонелл использовался метод полиме-разной цепной реакции. ПЦР проводили, определяя наличие последовательностей ДНК invA гена сальмонелл с праймерани sense: 5'-GTGAAATTATC-GCCACGTTCGGGCAA-3' И 51-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3' (Bülte, Jakob, 1995) .

Работа выполнялась в Центре государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Юго-Восточном округе г.Москвы, Межведомственном инженерном центре по координации медико-экологических и санитарно-эпидемиологических проблем. Раздел по отработке методик обнаружения микробов импедансным (кондуктометрическим) методом выполнен совместно с лабораторией-М объединения Мальтус (г.Престон, Великобритания).

Основная часть работы проведена в 1995-1997 годах в соответствии с программой работ по обеспечению микробиологической безопасности продуктов питания (Распоряжения Правительства Москвй от 13.07.95 N 555-РП "Об организации и внедрении социально-гигиенического мониторинга в г.Москве").

Исследуемыми материалами являлись продукты питания как производимые в округе (хлебобулочные, кулинарные, мясные, молочные, колбасные изделия и др.), так и ввозимые из области, России и других государств.

Кроме того, исследовали смывы с технологического оборудования в цехах по разделке и хранению пищи. Отдельным этапом были проведены исследования предлагаемой кондуктометрической и хроматографической техники для изучения внутрибольничных инфекций, в частности, смывов с поверхностей медицинского оборудования и воздуха больничных помещений, а также диагностики анаэробной неклосгридиальной инфекции.

Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили с использованием методических материалов, рекомендованных Минздравом и Госкомсанэ-пиднадзором: Методические указания Госкомсанэпиднадзора России от 29.10.96 N 4.2.581 "Проведение санитарно-бактериологического анализа продовольственного сырья, пищевых продуктов, воды и смывов с поверхностей с использованием бактериологического экспресс-анализаторов "РЭ-БИТ"; Методические рекомендации Госсанэпиднадзора России от 16.01.96 N 01-1916-23 "Проведение бактериологических исследований с использовани-

ем микробиологического экспресс-анализатора "БакТрак 4100"; Методи' кие рекомендации Минздрава СССР от 08.10.86 N 10-1188 "Анаэробная i лостридиальная инфекция в хирургии".

Методы и техника эксперимента

Приборы н материалы. В работе использовалось импортное и отеЧЕ венное аналитическое и вспомогательное оборудование:

- газовый хроматограф модель 3700-2Д ("Хроматограф", Москва);

- газовый хроматограф "Кристалл-2000М" (СКБ Хроматзк, Йошкар-Ола)

- газовый хроматограф модель 8000 ("Файзонс", Англия);

- газовый хроматограф модель 5890А ("Хьюлетт-Паккард", США);

- газовый хромато-масс-спектрометр модель НР-5972А ("Хьюлетт-Г кард", США);

- электрохимический анализатор "БакТрак 4100" (Си Лаб, Австрия) тремя термостатами на 120 ячеек;

- электрохимический анализатор "Мальтус V" (Мальтус, Англия) -ноблок на 60 ячеек;

- "комплект ПЦР" (НПО "Биоген", Санкт-Петербургский филиал РАМН);

- "комплект ПЦР РТС-200" (Ландре, Голландия);

- микробиологический импактор "Флора-100" (ГНИИБП, Москва) для от ра биологических аэрозолей;

- пробоотборное устройство "ПУ-1Б" (ХИМКО, Москва) для отбора био гических аэрозолей;

- высокоэффективные хроматографические капиллярные колонки 0155.863.001-91 (ИНХРОМЭКО, Москва) длиной 25 м и внутренним диамет] 0,2 мм с метилсиликоновой неподвижной фазой;

- поликапиллярные колонки (Сибел, Москва);

- персональные компьютеры ко всем приборам типа IBM РС/486, для 1 педансной техники применялись цветной принтер и дисплей. Использо] лось программное обеспечение Си Лаб, Австрия; РЕБИТ, Англия; Нальт; Англия; Хыолетт-Паккард, США; Карло-Эрба, Италия; Биомерье, Франф Амперсенд, Москва; СКБ Хромагэк, Йошкар-Ола, а также дополненные разработанные в процессе работы;

- питательные среды стандартные - МПА, МПБ, модифицированные, а тг же селективные, поставляемые фирмой Си Лаб (BiMedia 001А/002А - оби микробное число; 160В - колифоркы; 201В - сальмонеллы; 140А - энте^ бактерии; 403А - листерии; 002А/глицерин - стафилококк; 620 - лактоС

циллы; 660Test - сульфатредуцируюгцие клостридии; 301А - энтерококки. Использовали также аналогичные селективные среды 4 фирм: Биомерье, Ре-бит, Мальтус и Миди.

Объекты анализа. Основными объектами исследования являлись продукты питания (мясо и мясные продукты; консервы мясные, рыбные, мясо-растительные; молоко и молочные продукты, кондитерские изделия; яйцо и продукты яичные).

Электрохимический метод. Продукты питания гомогенизировали и засевали жидкую питательную среду по методикам фирм Мальтус и Си Лаб. С помощью электрохимических анализаторов "Бак Трак 4100" и "Мальтус V" фиксировали во времени изменения электропроводности (импеданса) питательной среды под воздействием роста бактерий.

Газохроиатографический метод. Культивирование микроорганизмов проводили как на жидких, так и на плотных питательных средах в соответствии с рекомендациями фирмы Бости (МИДИ - Хьюлетт-Паккард, США), а также с использованием стандартных методик, принятых в ГСЭН. Продукты питания предварительно гомогенизировали. Пробы воздуха отбирались с помощью импакторов "Флора-100" и ПУ-1Б на чашки Петри.

При культивировании бактерий родов Salmonella, Citrobacter, Escherichia, Proteus использовали МПА при 37°С в течение 24 ч. В ряде случаев применяли синтетические среды. Туляремийные бактерии культивировали на желточной среде при 37°С 5 суток или на среде с ами-нопептидом при 37°С 2 суток, Лептоспиры - на среде Терских при 37°С 12 суток.

Методика определения жирных кислот в биологическом материале включает следующие этапы:

- посев биологического материала на питательные среды и термостати-рование;

- стерилизацию культуры автоклавированием;

- обработку культуру щелочью для гидролиза (омыления) липидов;

- обработку гидролизата метилирующим агентом;

- экстракцию и очистку метиловых эфиров жирных кислот;

- ввод пробы в хроматограф;

- сравнение полученной хроматограммы с полученными при тех же условиях при анализе музейных культур.

Методы контроля исследуемого материала и используемых новых мет дов анализа. Подтверждение данных электрохимического и газохроматогр фического определения инфицированности продуктов питания и биологиче ких жидкостей проводились классическими методами анализа путем подр щивания микробов на элективных и селективных средах с последующ идентификацией методами агглютинации, ИФА и др., внесенных в действу щие ГОСТы и Методические указания по микробиологическому контролю качеством пищевых продуктов.

Статистическая обработка результатов и программное обеспечена

Все электрохимические и газохроматографические анализы для индикац (тестирования) и идентификации бактерий в различных средах проводили с 3-5 кратном повтором во времени. Достигнутая вероятность (достове носгь) индикации и идентификации составляла от 0,85 до 0,95. По кол чественным и качественным критериям метода импеданса и состава жирн кислот (и их сочетанию) были разработаны новые и также модифицирова фирменные компьютерные программы идентификации микроорганизмов, пр годные к лабораторному применению в системе санэпидслужбы, а так других профильных лабораторий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация мнкроорганизнов по их жирным кислотам

Жирнокислотный состав бактерий

Хемотаксономические признаки поззол.'.^т вовс. .ь классифи-

кацию микроорганизмов, приближая ее к естественной. В настоящей работе в качестве основного хемотаксономического признака для идентификации бактерий использовали качественный и количественный состав микроорганизмов по их жирным кислотам.

Одной из наиболее сложных проблем таксономии бактерий является определение основной таксономической категории - вида. Не менее трудным является группирование бактерий в таксоны более высокого ранга -род, семейство. Полученный в процессе работы опыт систематизации бактерий по их жирным кислотам, а также данные литературы показывают, что исследованные микроорганизмы можно надежно распределить по определенным группам, которые, на первый взгляд, могут противоречить общепризнанной классификации. В то же время, жирнокислотный состав позволяет получить необходимые для классификации дополнительные признаки, характерные для определенного таксона (систематического ранга) бактерий. Хотя жирнокислотный состав менее информативен, чем нуклеотидный состав ДНК, обязательный при описании бактериальных таксонов, но уже сегодня имеется достаточное количество данных, подтверждающих, что состав клеточных жирных кислот бактерий является ценным таксономическим признаком, который можно использовать как для уточнения классификации бактерий, так и для их идентификации.

На первом этапе был изучен жирнокислотный состав эталонных штаммов бактерий различных таксономических групп, выращенных на традиционно используемых для этих микроорганизмов питательных средах. Исследовали не сами бактериальные клетки, а их автоклавированные гидролизаты.

Табл.1 содержит данные по жирнокислотному составу некоторых патогенных для человека и животных бактерий. Приведенные характеристики (содержание в % и Уотн удерживания) положены в основу идентификаций бактерий. Естественно, от степени чистоты вида или от биохимического качества среды культивирования эти величины могут быть различными, но общая картина индивидуальности видов по качественному и количественному содержанию жирных кислот очевидна.

Дальнейшие исследования бактерий, выращенных на стандартных с лективных средах, используемых для импедансной или газохроматограф ческой техники, позволили разработать унифицированный состав питател ных сред и температурных режимов культивирования, максимально прибл жающихся к требованиям высокопроизводительного инструментального ан лиза.

Таблица 1

Данные жирнокислотного состава, % отн, и характеристик удерживания v0TH некоторых видов бактерий рода Salmonella, Yersinia, Listeria, Enterobacter, Serratia, Hafnia, Staphylococcus и Francisella

Кислота voth S. en- Y.pse- L. E. S. H. S. F.tu-

ter i- udotu- mono- aero- plimu- alvei aureus laren

tidis bercu-losis cytogenes genes thica sis*

10:0 0,24 0,56 8,2

н/и 0,26 1,58 0,35

н/и 0,29 - 0,64 .0,1

н/и 0,36 0,73 0,46 0,2 — — — — —

12:0 0,39 0,77 0,37 0,74 — — 0,72 3,0 0,25

13:0 0,40 1,9 3,91 — — — - 1,5 —

н/и 0,42 0,77 0,84 0,77 — 0,88 - - —

н/и 0,57 0,47

н/и 0,64 0,64 0,57 - — - - - —

14:0 0,66 5,2 3,32 1,93 4,83 3,18 6,04 2,7 9,8

15:1 0,72 0,64 3,91 4,4 — - - 2,1 -

i-15:0 0,77 - 1,01 35,58 6,35 9,67 1,52 36,4 -

15:0 0,82 0,56 1,74 - 1,75 — 0,68 — -

н/и 0,85 - - - — — - — -

16:1 0,91 1,41 6,7 1,64 6,45 2,03 4,08 3,3 -

н/и 0,95 - 8,68 — — - - — -

16:0 1,0 26,93 20,19 6,77 25,13 23,6 33,1 2,1 8,6

н/и 1,07 0,6 0,37 1,71 — — — - -

i-16 :0 1,13 0,38 - 27 ,0 — - — 10 , 3 -

н/и 1,14 - - - - - — — -

17:1 1,15 4 ,79 23,64 0,89 3,34 9,95 17,62 2,7 -

17V 1,25 0,93 - -— 1,85 — - — -

i-17:0 1,3 0,53 0,78 - 3,4 5,16 5,59 16,7 -

18:1 1,32 1,65 1,38 1,19 5,21 3,11 2,72 — 10,6

ОН-18:0 1 ,33 - - - — — - — 7,2

18:0 1,36 19,03 2,5 2,68 11,54 13,62 12, 35 5,8 3,9

19:0 1,52 1,5 - - - 1,52 0,07 - -

20:1 1,76 3,38 0,6 - 0, 16 0,05 - 5,5 2,7

20:0 1,83 25,98 18,4 13,8 29,99 21,96 15, 52 2,4 3,2

* Для F.tularensis характерно также наличие кислот C22-i=3<7° с22: 0 =12,6%; С24: ! =21,455; С24:0=13,0%; С26:1=2,2%.

Как указывалось выше, качественный и количественный состав жирных кислот зависит от примененной среды для культивирования. IIa рис.1 (a,b,c,d) приведены хроматограммы метиловых эфиров жирных кислот Salmonella enteritidis, выращенной на стандартной среде МПА при 37°С (а), на культуральной среде Мальтус (Ь), среде БакТрак (с) и прет, .оженной нами (d) .

Рис.1. Хроматограммы метиловых эфиров жирных кислот Salmonella

enteritidis, полученные на 25 м колонке с метилсилоксано-вой неподвижной фазой SE-54 при программировании температуры от 110°С до 240°С.

Идентификация компонентов анализируемых смесей. Зависимость хро-матографических параметров удерживания от физико-химических свойств разделяемых эфиров жирных кислот бактерий была прослежена на примере большого ряда видов микроорганизмов кишечной группы. Идентификация индивидуальных эфиров жирных кислот осуществлялась с помощью получаемым значений относительных характеристик удерживания эталонных веществ.

Для отнесения компонента, присутствующего в анализируемо", проду:--те к тому или иному классу кислот и для его индивидуальной идентификации применялись также косвенные методы, основанные на использовании зависимости величин удерживания веществ от их температуры кипения

(плавления) для данной неподвижной фазы и рабочей температуры. рис.2, приведен типичный график зависимости нежду относительным у; живаемым объемом и температурой плавления кислот. Из этого rpai следует, что такая зависимость практически линейна как для насыще жирных кислот (С! о : о_с26: 0)' так и Для ненасыщенных кислот с соотв твующим числом двойных связей (отдельно для кислот С1 0 : 1 _С26 : 1 ' дельно для с10:2-с2е:г и т.д.). Графические зависимости, получе для каждого микроорганизма, отличались по наличию на отрезке пр тех или иных точек. Например, для Francisella на графике отсутство точка, принадлежащая С12:0 кислоте-и точки, принадлежащие к кислот нечетным числом атомов (рис.2а).

Полученная зависимость полезна* как для общей оценки жирнокис ного профиля данного бактериального вида (например, наличие или сутствие ira' графике тех или иных кислот, характеризующих видовые л наки), так и для идентификации ранее неидентифицированных компонеь Например, зная время удерживания неизвестного вещества, можно по фику определить его точку плавления, а по справочным данным опреде само вещество (рис.2<3).

Методика и прибор для идентификации никроорганизмов по их Ж1 килотному составу. Разработанная методика анализа бактерий coctoi следующих основных этапов:

- отбор бактериальных аэрозолей на твердую подложку;

- отбор влажной суспензии клеток (петлевой отбор) с твердой пита' ной среды или из реакционной ячейки электрохимического анализа'

- щелочной гидролиз клеток (биомассы);

- метилирование жирных кислот;

- экстракция метиловых эфиров жирных кислот;

- газохроматографическое разделение смеси жирных кислот на высо фективных кварцевых хроматографических колонках с метилсилокса неподвижной фазой.

Рис.2. График зависимости между логарифмом относительного удерж!

ваемого объема V01", числом углеродных атомов в молекуле г (а,Ь,с) и температурой плавления жирных кислот (<3).

Подготовка пробы к анализу-5-10 образцов не превышает одного ч са. Время газохроматографического анализа с автоматической выдачей р зультатов количественного и качественного анализа не превышает тридц ти кинут. При этом, время подготовки проб к анализу можно сократить 2-3 минут при совмещении этапов гидролиза, метилирования и экстракт производных жирных кислот. Порог чувствительности по метилпальмитг составляет 10"6 r/мл или 10"9 г/мкл пробы. Относительная погрешнос определения составляет 2-3% при доверительной вероятности 0,95.

Для газохроматографического анализа нами совместно с СКБ "Хро* тэк" предложен прибор "Кристалл-2000 М/МО", разработанный по наше техническому заданию [Отчет по НИР инв. N 013, 1996] на базе специа; зированного комплекса "Кристалл 2000М", зарегистриванного в Госуда; твенном реестре средств измерений под N 14516-95 для медицинских i лей.

Разработанный комплекс включает в себя блоки и узлы, изображен! на рис.3.

Рис.3. Блок-схема аналитического "Кристалл-2000 М/М0" для составу их жирных кислот.

комплекса хроматографа газог идентификации микроорганизмоЕ

Система обработки хроматографических данных состоит из:

- персонального компьютера PC/IBM 486;

- программа обеспечения для персонального компьютера с файлами' м< дик анализа микроорганизмов по эфирам жирных кислот (содержат pi мы анализов, результаты градуировок, времена удерживания и конЦ| рации тестовых кислот);

- программное обеспечение, реализующие подготовку хроматографа к выполнению анализа и обработку результатов анализа в соответствии с файлом методики анализа.

Для высокоэффективного разделения сложных смесей эфиров жирных кислот использовались кварцевые и стеклянные капиллярные и поликапиллярные колонки.

Разработанный прибор с системой идентификации бактерий автоматизирует определения известных и неизвестных микроорганизмов, проводит поиск, используя базу данных с информацией по жирнокислотному составу известных (искомых) бактерий с целью их точной видовой идентификации. Стандартные условия, используемые для выращивания большинства видов внутри групп бактерий, уменьшает вариации, вызванные изменением температуры или состава среды. Дополнительно используются специальные алгоритмы поиска, снижающие влияние изменений, вызванных условиями культивирования. Разработанная база данных содержит информацию по составу жирных кислот более 200 микроорганизмов, принадлежащих к 12 родам бактерий.

Диагностика анаэробной неклостридиальной инфекции. Определение бактерий, вызывающих развитие анаэробной неклостридиальной инфекции (абсцессы легких, поражения мягких тканей, перитониты и др.) не входило в основное содержание настоящей работы - определения пищевых инфекций, но является утверждением универсальности и достоверности идентификации бактерий различных таксономических групп по их жирным кислотам, а также разработанных на их базе компьютерных программ. Кроме того, методические рекомендации по газохроматографической диагностике неспорообразующих анаэробов являются единственным утвержденным Минздравом нормативным документом, регламентирующим возможность использования газовой хроматографии в микробиологии и медицине. Этот факт является немаловажным при внедрении новых методов анализа в практику здравоохранения и санитарный надзор.

В табл.2 приведены данные качественного и количественного состава летучих жирных кислот ряда анаэробных бактерий, позволяющих идентифицировать их с вероятностью )о,95.

В случае газохроматографической диагностики инфекционных заболеваний нет необходимости подращивания инфицированного материала, который, полученный в количестве одного г, после гомогенизации обрабатывают способом, аналогичным подготовке к газохроматографическому анализу

бактериальных препаратов. Для идентификации используют летучие жирньи кислоты с двумя-шестью и выше атомами углерода в молекуле, а в ряд> случаев токсические метаболиты других классов химических соединенш (фенилпроизводные, фенолы, индол, кетоны и др.). Анализ проводился н. поликапиллярных колонках, позволяющих сократить время анализа д> 1,5-4 мин.

Таблица 2

Данные жирнокислотного состава некоторых анаэробов

Возбудитель Содержание жирных кислот, % отн.

2:0 3:0 i -4 :0 4:0 i -5:0 5:0 i-6 :0 6:0

Peptostreptococcus anaerobius 21,3 4,2 2,7 3,1 17,4 — 9,8 0,9

Peptococcus asaccharolitycus 20,3 — — 3,8 — — — -

Bacteroides fragiIis 19,9 6,2 2,1 — 15,1 — — -

Fusobacterium mortiferum 19,1 7,3 — 8,4 - — — -

обнаружение сальмонелл и других патогенных бактерий по изменению импеданса среды их культивирования

В работе использована модифицированная импедансная техника, фир менные и оригинальные питательные среды для обнаружения ряда патоген ных бактерий в продуктах питания, смывах с поверхности технологическо го оборудования, биологических жидкостях.

Показано, что выявление мезофильных аэробных и факультативны: анаэробных микроорганизмов в таких видах продуктов питания, как ияо замороженное, мясо вареное, мясные консервы, колбасы, рыба, молоко i молочные изделия совпадает с классическим методами определения бакте рии путем посева на плотные питательные среды.

Основными объектами исследования как, и в случае газовой хрома тографии, были бактерии рода Salmonella, потенциальное присутствие ко торых практически во всех основных продуктах питания, фураже, а такж< внешней среде (поверхностные воды) является одной из основных проблем

которой уделяется особое внимание в последние 8-15 лет во всем мире. Традиционная процедура проверки пищевых продуктов на сальмонеллы включает предварительное обогащение проб с последующим селективным обогащением на одной и более средах. Эта процедура может составлять от 3 до 8 суток. Использование приборов для определения импеданса сокращает время тестирования до 48 ч, что крайне важно при организации регулярных поставок продуктов населению, разгрузке таможенных постов и т./;.

Импедансный метод обнаружения сальмонелл требует инокуляции проб на среду предварительного обогащения, содержащую триметил-Л-оксид, в течение 6-18 часов. Затем используется селективная среда, позволяющая воспроизводимо регистрировать изменение импеданса. Селективная среда содержит цистин, триметиламин-И-оксид и дульцитол, в качестве ферментирующего субстрата.

При исследовании образцов пищевых продуктов (мясо, птица, рыба, молоко) большинство из 66 штаммов 43 серотипов Salmonella показали изменение импеданса в этой среде, тогда как другие энтеробактерии дали гораздо меньшие величины изменения электрической проводимости.

Дополнительные исследования показали, что изменение биохимической природы инокулирующего субстрата также влияет на' характер кривой проводимости, что необходимо учитывать при организации исследований различных продуктов питания.

Предложенная ранее фирмой БакТрак среда BiMedia 001А имеет два недостатка - не обнаруживает дульцитоло-негативные сальмонеллы и, главное, порождает ряд ложных позитивных результатов вследствие роста Campylobacter. Модификация среды предварительного обогащения и в среде измерения проводимости позволило обнаруживать дульцит положительные штаммы сальмонелл. Проблему ложных позитивных результатов вследствие роста C.freundii удалось решить при добавлении в среду обогащения (бу-феризированную пептонную воду) лизин и глюкозу.

Разработанный подход позволил обнаруживать в проба;; также и бактерии родов Listeria, Campylobacter и Yersinia. Как и в случае с Salmonella, традиционные методы обнаружения этих микроорганизмов трудоемки и продолжительны.

Программа обнаружения патогенных бактерий с использованием прибора "Мальтус" позволяет в случае наличия Listeria получить сигнал об их присутствии уже через 22 ч, в то время как С.jejuni в пищевых продуктах обнаруживается спустя 10 ч после предварительного обогащения (рис.4).

I I I_ I

I I I I !

&G,¡1S

300

200

-100 -

- С.jejuni

YL

i i

48, ч

Рис.4. Кривые проводимости модифицированной среды Maltus-Campylobacter в различных продуктах, инокулированных С.jejuni в курином мясе (а), потрохах (Ь); с и d - негативные мясные пробы.

Из представителей рода Yersinia наибольший интерес для пищевс промышленности представляет Y .enterocolitica. В попытках сокращени времени тестирования проб, подозреваемых на наличие иерсиний, предлг гается среда на базе пептона и маннитола с добавлением мочевины и аь тибиотиков. Это позволило сократить время обнаружения до 12-18 ч nj концентрации клеток 5'105 в мл и до 33-40 ч при концентрации 10-100 » в мл.

Приведенные примеры наглядным образом подтверждают высокую чувс твительность, селективность и производительность электрохимичесм приборов и методов обнаружения сальмонелл и других патогенных бакте рий, что позволяет построить принципиально новую систему тестировав большого числа проб пищевых продуктов за относительно небольшой промс жуток времени, .что существенно для организации массового санита! но-эпидемиологического надзора в условиях большого города.

Обнаружение и идентификация сальмонелл методом, сочетающий инпедансную и хроматографическую аппаратуру

Санитарно-эпидемиологический контроль требует получения надежной информации о качестве потребляемой продукции на всем протяжении технологической цепочки их производства и потребления.

Газохроматографйческое и электрохимическое оборудование позволяет автоматизировать микробиологический анализ, резко увеличив его производительность и, следовательно, организовать систему широкомасштабного контроля качества пищевой продукции и повысить ее безопасность. Это особенно актуально, так как количество заболевших острыми кишечными заболеваниями сегодня в 100-200 раз превышает количество проб пищевых продуктов, исследованных на их контаминацию. Таким образом можно констатировать, что сегодняшний уровень бактериологического анализа как по производительности, так и достоверности выдаваемой информации не в состоянии обеспечить безопасность потребления населением основных видов пищевых продуктов питания. Например, по ЮВАО г.Москвы в 1995 году было зарегистрировано 355 больных сальмонелезом и только в двух образцах проб этот возбудитель был обнаружен.

Комплексные способ обнаружения и идентификации сальмонелл. Известен способ обнаружения и идентификации бактерий преимущественно в продуктах питания и пищевом сырье путем культивирования клеток на жидких селективных питательных средах с одновременным измерением электрической проводимости во времени. Этот метод позволяет сократить время обнаружения микроорганизмов. Однако, он не обеспечивает надежной идентификации растущей популяции, что требует обязательного применения дополнительных методов идентификации микроорганизмов, основанных на биохимических, серологических и иммунных реакциях. Это также повышает трудоемкость и длительность метода.

Результаты проведенных нами исследований профиля жирных кислот эпидемиологически значимых видов патогенных бактерий позволили предложить способ обнаружения и идентификации бактерий, преимущественно в пищевых средах и пищевом сырье, путем культивирования клеток в жидких селективных (импедансных) средах с одновременным измерением электрической проводимости среды во времени, в котором при достижении значения электрического сопротивления среды культивирования соответствующей концентрации клеток п-105 - п-106 кл/мл, осуществляют отбор газовой

или жидкой пробы субстрата, которую затем анализируют газохроматогрг фически.

В случае газовой пробы, ее непосредственно вводят в дозатор хрс матографа. Жидкой - гидролизуют и метилируют до образования эфире жирных кислот, затем вводят в испаритель хроматографа с последую!^ разделением и идентификацией летучих ингредиентов.

При этом культивированию на селективных средах подвергается нес колько образцов контролируемых материалов в отдельных сосудах и отбе проб субстрата для последующего хроматографического анализа произвол* только из тех сосудов, для которых регистрируемое изменение электр? ческой проводимости среды культивирования имеет вид логарифмическс кривой роста.

На рис.5 приведена схема отбора и анализа газообразных и/или жи; ких проб в процессе импедансного культивирования модельных тест-сист€ в различных средах. В качестве модельных тест-систем использованы Sal monella enteritidis и Escherichia coli.

Электрохимический метод на соответствующих селективных средах дг ет сигнал о наличии в реакционной пробирке Salmonella или Escherich: через 4 и 2 ч соответственно. Газохроматографический анализ позволяе идентифицировать до вида по составу газовой фазы уже через 1,5 мин, по жидкой - через 30 мин. В стандартных условиях весь анализ не превь шает 2,5-4,5 ч.

Система обнаружения сальмонелл и других патогенных бактерий последующей их идентификацией. Основным преимуществом импедансной те? нологии является возможность непрерывной регистрации изменения провс димости среды культивирования, что можно напрямую связать с микроб? альным ростом, и, таким образом, говорить о концентрации клеток и i видовой принадлежности.

S 16 2 4.. Ч 1,5. МММ

Рис.5. Схема импедансно-хроматографического родового и видового определения S.enteritidis и E.coli.

Проведенные сравнительные испытания* двух видов техники - БакТр 4100, фирмы Си Лаб, Австрия и Мальтус V, фирмы Мальтус, Англия, а та же предлагаемых этими фирмами селективных сред показало, что по свое целевому назначению эти приборы являются индикаторами, срабатывающи в определенном интервале концентрации ионов, образующихся в результа культивирования бактерий на селективной среде. Предварительный газо роматографический анализ импедансных сред показал практическое отсут твие как свободных, так и связанных жирных кислот. Субстраты в микр биологических ростовых средах являются не заряженными или слабозар женными, но затем трансформируются в высокозаряженные конечные проду ты при нормальных путях метаболической активности микроорганизмов.

1 этап

2 этап

3 этап

4 этап Принятие противоэпидемических решений

Рис.б. Схема системного подхода к крупномасштабному микробно!

тестированию (индикации) продуктов питания с последующе идентификацией возбудителя.

* В сравнительных испытаниях приняли участие сотрудники следующих у реждений: ВНИИМС Госстандарта России, 33 инженерный центр Миноборо: России, ВЦНЛК МЧС России, МИЦКоординации, Центр Госсанэпиднадзора ЮВАО г.Москвы, Фирма Мальтус, Англия, - за что всем приносится глуб< кая благодарность.

Как видно из рис.6, основными техническими этапами являются второй - индикация и третий - идентификация, на котором кроме традиционных методов предлагается использовать хроматографию.

Полученные результаты являются основой для разработки научно-обоснованной системы эпидемиологического надзора за кишечными и другими инфекциями.

Выводы

1. На основе особенностей состава жирных кислот сальмонелл и других патогенных бактерий разработан метод ускоренной хемотаксономической идентификации возбудителей, апробированный на коллекции эталонных и свежевыделенных культур возбудителей острых кишечных инфекций.

2. Определена зависимость профиля исследованных жирных кислот бактерий от состава стандартных и использованных питательных сред, характера пищевого продукта или биологической пробы, тестируемой на наличие патогенной микрофлоры.

3. У сальмонелл выявлены новые качественные и количественные зависимости хроматографических параметров удерживания жирных кислот различного строения от их структурных и физико-химических характеристик, использованных как для создания алгоритма идентификации кислот, так и для идентификации содержащих их микроорганизмов.

4. Разработан новый способ и комплекс приборов с программным обеспечением для экспресс-индикации сальмонелл и их метаболитов по их химическому составу с использованием хроматографической, а также хрома-то-импедансной инструментальной техники, позволяющей в 3-5 раз сократить время анализа, резко увеличить производительность и надежность определения.

5. Отработана система методического и приборного обеспечения микробиологического контроля, включающего скрининг большого числа проб пищевых продуктов с последующей идентификацией патогенных бактерий, направленная на повышение эффективности противоэпидемических мероприятий санэпидслужбы.

6. Разработаны методические указания по анализу ряда санитарно-показа-тельных, потенциально-патогенных и патогенных бактерий, по их химическому составу и составу среды их культивирования с использованием газохроматографической и импедансной аппаратуры, а также их сочетания.

Список работ, отражающих содержание диссертации

1. Резайкин В.И., Помазанов В.В., Комаров Г.Д. "Инструментальное и м тодическое обеспечение санитарно-эпидемиологического контроля". кн.: "Анализ объектов санитарного надзора", НТС ГКСЭН, 1995, вып. с.194-228.

2. Комаров Г.Д. "Организация международного демонстрационного и нау но-практического центра при Госкомсанэпиднадзоре России. Аналит ческие и микробиологические исследования". Тез.докл. конференц НТС ГКСЭН в кн.: "Анализ объектов санитарного надзора", НТСЧГКСЭ 1995, вып.8, с.28-29.

3. Резайкин В.И., Помазанов В.В., Новиков Ю.П., Комаров Г.Д. "Состо ние и концепция развития инженерно-технического и методическо обеспечения аналитических лабораторий центров Госсанэпиднадзора Заводская лаборатория, 1996, N 10, с.8-12.

4. Komarov G.D. Improvements to a Cystin medium for detection of sa monellae by electric conductans. Prep.docl. Miting. Malthus instr ments Ltd. 1997, Preston. 20 p.

5. Комаров Г.Д., Помазанов В.В. (Россия), Porcius N. (Голландия "Способ анализа и идентификации микроорганизмов". Патент Росси регистр. N 97108375, 1997.

6. Комаров Г.Д., Помазанов В.В. "Значение хроматографического метода санитарно-эпидемиологическом и медико-экологическом контроле Тез.докл. Симп. по хроматографии, посвященный 125-летию М.С.Цвет. М., 1997, С.2-3.

7. Кантере В.М., Комаров Г.Д., Скаженик В.Ю., Федорович В.Ю. "О nepi пективе применения автоматизированных экспресс-систем для контро микробиологических показателей качества продуктов питания1 Тез.докл. 5 Международный Симп. экология человека. Пищевые продук' и технологии на пороге XXI века. Пятигорск, 1997.

8. Комаров Г.Д., Помазанов В.В., Бондаренко В.М. "Газохроматографиче< кий контроль микробиологического качества окружающей среды по хим! ческому составу микроорганизмов". Тез.докл. 3 Международ, коне "Проблемы управления качеством окружающей среды". М., "Прима-эк< пресс", 1997.