Хромато-масс-спектрометрическое исследование микроорганизмов и их сообществ

Осипов, Георгий Андреевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Хромато-масс-спектрометрическое исследование микроорганизмов и их сообществ
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Хромато-масс-спектрометрическое исследование микроорганизмов и их сообществ"

РГ6 ОД

- 1 АИВ «96

ОСИПОВ Георгий Андреевич

ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ И ИХ СООБЩЕСТВ

(03.00.07 - микробиология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в ГосНИИ биологического приборостроения

Научные консультанты: член-корр.РАН Г.А.ЗАВАРЗИН

доктор биологических наук Г.И.ЭЛЬ-РЕГИСГАН

Официальное оппоненты:

доктор медицинских наук Меньшиков Д.Д. доктор медицинских наук Анкирская А. С. доктор биологических наук Горленко В.М.

Ведущая организация

Российский государственный университет им.Н.И.Пирогова

Защита диссертации состоится гь января 1995г.

в.14......час на заседании Диссертационного совета Д.074.0510

при Московской Медицинской академии им.И.М.Сеченова по адресу: 119042' Москва, Г-435, Б.Пироговская ул., 2-6

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. И.М.Сеченова по адресу: 119042, Москва, Зубовский бульвар, 37/1

Автореферат разослан "_"_1995г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат медицинских наук . А.Ю.Миронов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Остается актуальным, при всем современной полноте знаний химической природы клетки, исследование состава новых видов микроорганизмов и их отнесение к определенной хемотаксоно-мической группе по струп г .••> ' с; мимическим признакам, сведения о которых ласт к«, кии состав клетки. Изучение состава метаболитов микроорганизмов представляет полезные сведения о физиологии ношх ;шлии и определяет их место в экологической нише, из которой они выделены. При этом, в отличие от структурных компонентов, метаболиты большинства микроорганизмов изу^-ш •■ сл.лю. Метод хромато-масс-спектро-метрии может дать сведспщ о неизвестных ранее метаболитах, которые могут быт;, полезны для решения тех или иных нучно-практических задач.

В природе, в биотехнологических процессах а также в организме человека и житлных микроорганизмы организованы в сообщества и ооьедцнепы общими признаками по условиям среды обитания и зависимы в физиологическом и трофическом отношении. Иссдслог.дние структуры микробных сообществ в свете вышеназванных признаков представляет собой в настоящее время актуальную задачу современной обшей и специальной мик-робиоглогии. Получение сведений о структур'.' сообщества и метаболических связях в нем должно быть актуальным для решения ряда прикладных задач экологии, биотехнологии, медицинской диагностики.

Исследование видового состава микробных ассоциаций методом химических маркеров и профилей с экспрессностью в несколько часов является актуальным и перспективным, так как позволяет впервые использовать исчерпывающие сведения о нем самом и его физиологическом статусе для контроля экологической ситуации, управления биологическим процессом или воздействия на инфекционное заболевание до того, как произошли необратимые изменения в системе.

Защищаемые положения

Микробная клетка содержит достаточное количество специфических лншыных компонентов для хемодиффсрснциации микроорганизмов.

Специфичность компьютерной идентификации микроорганизмов может бьггь повышена н\т с введении и банк данных химического состава чистых культур новых соединений из ряда длиноцепо-чечных жирных кислот и альдегидов, а также применения эффективного алгоритма распознаю: ия ".бра юн при машинной идентификации.

Химический состав микроорганизмов в целом, как профиль или образ, специфичен и может быть использован для качественного и количественного анализа видового состава микробных сообществ без предварительного выделения чистых культур микроорганизмов. Представление химического состава суммарной биомассы сообщества как суперпозиции постоянных химических профилей входящих в него микроорганизмов позволяет разработать соответствующий математический аппарат и программу определения входящих в сообщество видов но данным хромато-масс-спектрометричсского или хроматографического анализа.

Химические маркеры - специфические химические вещества определенных таксономических групп микроорганизмов - перспективны для индикации микроорганизмов в различных ситуациях, особенно в диагностике инфекционных процессов. Можно - разработать метод определения состава микрофлоры в сложных системах на превалирующем фоне биологической жидкости макроорганизма для исследования дисбиозои и определения ведущей микрофлоры при инфекционных заболеваниях, используя комбинированный метод маркера и профиля при анализе суммарной биомассы в режиме ГХ-МГ селективных ионов.

Специфичность диагностики анаэробов по продуктам метаболизма может быть повышена за счет привлечения к диагностике короткоцепочечных дикарбоновых, окси- и кетокислот, аминов и других метаболитов.

Необходима постановка настоящей работы в целом как исследования в области хемодиагностики микроорганизмов - то есть разработки методологии определения их присугствия в различных объектах окружающей среды - экологических, тсхно-

логических и инфекционных процессах по химическим признакам и использование этих признаков для определения вида микроорганизмов и количественной характеристики их сообществ.

Состояние вопроса

Началом использования химического состава микроорганизмов для дифференциации считают работу Абеля (Abel 1969), в которой предложено :ict;- vn.>rм. ->той цели жирнокислот-ный состав лилидо» пи: ... ¡магической мембраны. За последующие 26 лет описан состав жирных кислот почти всех известных и вновь открытых видов микроорганизмов, за исключением некоторых, выделение которых в чистой культуре вызывает затруднения. По литературным данным можно выделить ряд исследователей, которые целенаправленно в течение ряла лет занимаются изучением жирнокислотного состава бактерий и его использования для целей идентификации. Это C.W.Moss и E.Jantzen за рубежом и З.П.Васоренко и Л.В.Андреев у нас в стране. Их работы посвящены в основном клинически значимым микроорганизмам. Работы Васюренко суммированы в монографии "Профили жирных кислот микроорганизмов, патогенных для человека и животных", а Янцсна - в сборнике "Chemical methods in bacterial systematics"(1985). В упомянутом сборнике статей рассмотрены и другие варианты хемодифференциацин. Кроме жирных кислот и Сахаров для этой цели использованы - изопреноидные хиноны, фосфолипиды, нейтральные липиды, основные и кислые продукты метаболизма и другие вещества клетки. Сборник вышел под редакцией M.Goodfellow и D.E.Minnikin, которые сами внесли существенный вклад в изучение химического состава микробной клетки. Методически эти работы выполнены в основном методами газовой хроматографии (ГХ) и газовой хроматографии- масс-спектрометрии. Для индикации микроорганизмов по маркерам использован метод селективных ионов в масс-спектрометрии (масс-фрагментогра-фия - МФ) и детектирование по методу электронного захвата " (ДЭЗ) в хроматографии (Brooks D.B.).

В начале 80-х годов как дискуссионный рассматривался вопрос о представительности жирнокислотного состава и его воспроизводимости в зависимости от условий выращивания микро-

организмов, а также вопрос межлабораторной воспроизводимости анализов. Однако целенаправленных исследований влияния условий выращивания очень мало, а обзорных работ по анализу данных, полученных в разных лабораториях, по-видимому, нет. Тем не менее многие лаборатории используют этот метод, следовательно они для себя приняли положительное решение, а фирма Hewlett-Packard рискнула выпустить в 1987г. специализированный хроматограф с методикой и математическим обеспечением для идентификации бактерий по составу жирных простых и окси- кислот. Наши исследования и области идентификации бактерий были начаты в 1980г. и шли параллельно с исследованиями других отечественных и зарубежных авторов.

Много работ проведено по исследованию метаболитов, в основном ЛЖК анаэробных бактерий, применительно к медицинской диагностики анаэробной инфекции. Довольно скоро был сделан вывод о неспецифичности в родовом и видовом

отношении состава ЛЖК за исключением некотрых частных случаев. Тем не менее метод широко используется в клиниках для качественной индикации анаэробоп вообще и выявления их отдельных групп в частности.

Наличие специфических веществ (маркеров) п клеточных компонентах и метаболитах микроорганизмов открывает возможность для направленного поиска и идентификации микроорганизмов в сообществах или на фоне окружающей среды с использованием подходящих высокочувствительных методов - масс-фрагменто-графии или газовой хроматографии с детектором электронного захвата. Метод МФ применен для диагностики гонококковой инокини (Sud I.J. 1979) и ГХ-ДЭЗ для детектирования в крови -оксимиристиповой кислоты - компонента экзотоксина бактерий семейства Entcrobactcriaccac (A.Sonesson,19S7). Обобщения по методу маркера сделаны S.L.Morgan,I9S9.

С метода маркера начаты работы группы D.С.White и его последователей, пришедших впоследствии к изучению струкгуры микробных сообществ. Метод маркера использован для пзуче-. ния грамотрицательных микроорганизмов »донных отложениях (Parker J.P., 1982). До начала наших работ по сообществам (1984г.) данные по этой проблеме - т.е. определению видового состапа по химическим компонентам суммарной биомассы - отсутствовали. Также отсутствуют сведения об анализе состава клинически значимых микробных сообществ в биологических жидкостях

человека. В России микробиологическими методами изучался состав микроорганизмов метаногенного сообщества. Результаты этих исследований опубликованы в работах А.Н.Ножевниковой и ее докторской диссертации. Вместе с предшествующими работами Г.А.Заварзина, Т.Н.Жилиной, Е.Бонч-Осмоловской, М.Е.-Беккера и его сотрудников в бывшем СССР и зарубежными работами (\ЛК..ВЬагта, П.Муа§а\уа) эти исследования дали исходный материал для определения состава метаногенного сообщества микроорганизмов.

Наконец, в результате анализа состояния работ п области индикации и хемодифференциации микроорганизмов в чистой культуре и ассоциациях можно сделать вывод о том, что работы в этом направлении активно и успешно проводятся в ряде лабораторий мира с использованием ГХ и ГХ-МС методов. На ряде примеров продемонстрированы положительные стороны этих методов в части универсальности и экспрессности, что удачно дополняет классические микробиологические методы контроля микроорганизмов в экологии, биотехнологии и медицине.

Цель работы

1. Получить данные по химическому составу ряда клинически

значимых микроорганизмов, микроорганизмов из экологических и биотехнологических сообществ для их экспрессной идентификации в чистой культуре, а также оценить биохимическое родство вновь выделенных видов.

2. Разработать способ качественного и количественного анализа

микробных сообществ поданным химического состава суммарной биомассы микроорганизмов без предварительного высевания чистых культур микроорганизмов па фоне компонентов биологической пробы.

3. Разработать приемы индикации микроорганизмов по хими-

ческим маркерам при диагностике инфекционных процессов.

4. Исследовать возможность диагностики инфекционных заболеваний, вызываемых грамотрицательными возбудителями, путем детектирования жирных оксикислот липида А их липосахарвдного антигена в крови и других биологических жидкостях человека.

5. Повысить специфичность метода диагностики анаэробной

инфекции за счет привлечения короткоцепочечных дикар-боновых, оксн- и кетокислот и других метаболитов бактерий и микроскопических грибов. 6. Разработать общую методологию определения прнсутстви-я микроорганизмов в различных объектах окружающей среды - экологических, технологических и инфекционных процессах по химическим признакам и использования этих признаков для качественной и количественной характеристики их сообществ.

Научная новизна работы

Впервые сформулированы принципы методологии хсмодиаг-ностики микроорганизмов и их сообществ, проведено обоснование возможности дифференциального определения рода (вида) микроорганизма в чистой культуре и сообществе, исходя из постулата ограниченности видового разнообразия организмов определенной экологической ниши или технологического консорциума.

Определены методологические основы использования метаболитов микроорганизмов для их идентификации в сообществах и на фоне компонентов среды обитания. Впервые сформулированы методологические основы индикации микроорганизмов в инфекционных процессах но структурным компонентам клетки, собственным метаболитам возбудителя и продуктам его взаимодействия с организмом хозяина.

Разработан общий принцип математического анализа данных химического состава суммарной биомассы сообщес ^а микроорганизмов как суперпозиции химических профилей отдельных его членов. В результате предложена программа экспрессного определения родового (видового) состава микробных сообществ по данным хромато-масс-спсктрометрического анализа суммарной биомассы и расчета на персональном компьютере при наличии локального банка данных, содержащего сведения по химическому составу отдельных микроорганизмов - членов сообщества.

Проведенные исследования позволили одновременно с западными лабораториями накопить банк данных по химическому составу микроорганизмов и разработать программу идентификации бактерий в чистой культуре по химическому составу с использованием персонального компьютера. В отличие от извест-

ных аналогов банк данных содержит сведения об альдегидах клеточных липидов, что позволяет повысить специфичность хемо-дифференциации.

Систематизированы и собраны в локальные банки данных сведения о химическом составе микроорганизмов для некоторых микробных сообществ, в том числе мстано[емного, активного ила, сообщества сульфатвосстанавливающих бактерии. Проведена адаптация этих основных банков данных и алгоритма для расчета ассоциаций водных и почвенных микроорганизмов. Для использования метода в медицине подобраны сведения о сообществах микроорганизмов, участвующих в инфекционных процессах организма человека вообще, оральной и вагинальной микрофлоры в частности.

Разработаны принципы анализа микробных сообществ в инфекционных процессах при наличии превалирующего фона биологической жидкости с использованием алгоритма индикации целевых микроорганизмов в рамках техники масс-спектромет-рии селективных ионов маркерных веществ с последующим расчетом на ПК в электронных таблицах Excel.

В клетках микроорганизмов обнаружены не известные ранее липлдные компоненты: фосфоглицеролактоны, фитолфитанил-глицерины и изопреноиды в архебактериях, никлогексановые и оксициклогексановые жирные кислоты в Su'f>: •thermosulfi-dooxidans, альдегиды в психрофильных roMci.iiici.iinwx

бактериях, клостридиях и спирохетах; оксикислоты в гало-фильных эубактериях. Обнаружена высокая метаболическая ак-- тивность керосиновых и сопутствующих им микроскопических грибов, идентифицировано более ста их метаболитов. Найдено более пятидесяти новых веществ в продуктах метаболизма почвенных актиномицетов.

Практическая значимость

Практически значимые научные разработки, изложенные в диссертации, в разное время поддержаны грантами Минэколо-гии РФ (проблема "Экологическая безопасность России"), Му" ниципального предприятия Мосводоканал (Разработка высоких технологий очистки стоков), Фонда Дж.Сороса (проблема "Биоразнообразие"). ГосНИИ патентной экспертизы выдал патент на "Способ диагностики анаэробной клостридиальной инфек-

ции" и принял положительное решение о выдаче патента на "Способ определения родового (видового) состава микробных сообществ".

С помощью известных и усовершенствованных методов хро-мато-масс-спектрометрического анализа дано описание липидов, углеводов и метаболитов новых и известных видов микроорганизмов, имеющих хозяйственное, природоохранное или клиническое значение. Совместно с различными лабораториями Института микробиологии РАН исследованы липидные компоненты штаммов, перспективных для переработки промышленных и коммуначьных отходов, выщелачивания руд, получения полиненасыщенных жирных кислот, повышения нефтеотдачи нефтяных пластов.

Разработана система приемов диагностики инфекционных процессов в организме человека по химическим компонентам клетки и антигена возбудителя, его метаболитам и продуктам взаимодействия с клетками макроорганизма. Предложены новые способы диагностики анаэробной инфекции, позволяющие позволяющие повысить специфичность определения возбудителя по метаболитам. Разработан универсальный способ определения ведущей микрофлоры в очаге инфекции по структурным жирным кислотам, оксикислотам и альдегидам. Этот метод особенно важен для видовой диагностики возбудителей анаэробной инфекции. Все способы экспрессные. Анализ вместе с нробо-подготовкой занимает 1-5 часов в зависимости от сложности. Разработанная программа может быть реализована на псрсональ-- ном компьютере с процессором уровня 386-го. Варианты методик могут быть реализованы на хроматографе с детектором ионизации пламенем или электронного захвата. Практическое использование разработок осуществлено в Институте хирургии им А.В.Вишневского для диагностики для общей и клостридиаль-ной анаэробной инфекции.

Разработанный метод маркера и профиля химических компонентов внедрен в практику исследований Центра анаэробной диа гностики Детской городской клинической больницы им.Н.Ф. Филатова для определения ведущей микрофлоры инфекцион ных процессов. Внедрена методика и программа идентификацш микрорганизмов в чистой культуре при бактериологических ис следованиях.

Разработан алгоритм и программа исследования вагинально

го дисбиоза у женщин и микрофлоры уретры и спермы мужчин. В программу экспрессного исследования входит определение около 30 микроорганизмов из состава нормальной и инфекционной микрофлоры, в том числе грибковой, простейших и возбудителей венерических заболеваний.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены на 10 международных и 5 всесоюзных совещаниях, конференциях и симпозиумах, а именно:

♦ Всесоюзное совещание по архебактериам и проблеме биогаза. Пущино,1983.

♦ 16-я Конференция европейских биохимических обществ (РЕББ). Вена, 1984.

♦ 2-й Всесоюзный симпозиум по жидкостной хроматографии. Рига, 1984.

♦ 2-я Конференция по таксономии и автоматической идентификации бактерий. Прага, 1987.

♦ 8-я Международная конференция стран - членов СЭВ "Пет-ромасс-88". Таллинн,1988.

♦ 13-й Международный симпозиум по применению хроматографии в биомедицинских исследованиях. Таллинн, 1989.

♦ 9-й Международный симпозиум по биогеохимии окружающей среды. Москва, 1989.

♦ Применение хроматографии в пищевой, микробиологической и медицинской промышленности. Всесоюзная конференция. Геленджик, 1990.

♦ Всесоюзная конференция по хроматографии в экологии и охране окружающей среды. Уфа, 1991.

♦ 15-й Специализированный симпозиум по дрожжам. Рига,1991.

♦ Аналитический форум фирмы Хьюлетт-Паккард. Москва,1993.

♦ 2-е Совещание европейского химиотерапевтического общества но инфекционным заболеваниям. Коимбра,1994.

♦ 3-е Совещание европейского химиотерапевтического общества по инфекционным заболеваниям. Париж, 1995.

♦ 7-й Европейский конгресс по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям. Вена, 1995.

МЕТОДИКА ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА МИКРООРГАНИЗМОВ И ИХ МЕТАБОЛИТОВ

Аппаратура. Все исследования проведены на хромато- масс-спектрометре НР-5985В фирмы Хьюлетг-Паккард (США), который состоит из собственно масс-спектрометра, соединенного с ним хроматографа, системы вакуумной откачки и ЭВМ с периферийными устройствами . Масс-спектрометр кп:щрупольпый с диапазоном масс 2 - МООасм имеет разрешающую способность 0,5аем во всем рабочем диапазоне. Предусмотрено два инда ионизации; электронами 12-70эв и химическая с использованием в качестве газа - реагента метана и метанола. Чувствительность прибора 1нг по метилстеарагу в режиме непрерывного сканирования и Юпг в режиме селективных ионов. Хроматографи-рованис проводили в режиме программирования температуры от 50 до 280-325°С (в зависимости от типа неподвижной фазы колонки) со скоростью от 3 до 15град/мин. Температура инжектора 250-300"С, интерфейса 250°С. Использовали два типа колонок; неполярную, с неподвижной фазой типа ОУ-1 с поперечной сшивкой или без нее и полярную типа РРАР или АТ-1000. В качестве газа-носителя использовали гелии при расходе 30 мл/мин через инжектор. Откачка прибора осуществляется двумя пароструйными масляными насосами до остаточного вакуума 10 7торр (в отсутствие напуска гелия через колонку).

Методы подготовки проб. Применяли для извлечения необходимой фракции веществ из биологической пробы.

Экстракция смесью хлороформ-метаиол-вода (метод Фол-ча /Ро!с11,1957/). Метод применен для одновременной экстракции липидов и сахаров из биомассы микроорганизмов. Для проведения экстракции навеску сырой массы клеток 30-70 мг (или 3-7 мг сухих клеток) заливали 0.5-1мл смеси хлороформ-метанол-вода в соотношении 1:2,5:1,25 и выдерживали 3-4 часа при 50°С или оставляли на ночь при комнатной температуре. После экстракции смесь центрифугировали на лабораторной центрифуге при 3000 об/мин. Супсрнатант отделяли, добавляли воду до получения бифазной системы. Нижнюю, хлороформную фазу отделяли микропипеткон или шприцем, упаривали и

использовали для анализа нейтральных и полярных липидов. Водная часть экстракта содержит свободные моно- и полисахариды. Оставшиеся клетки нспол1»зовали для анализа липо-сахарида (ЛГ1С) и материала клеточной стенки.

Экстракция эфиром кислой фракции. Этот способ экстракции применяли для извлечения летучих жирных кислот, а также более сложных дикарбоновых, окси- и кетокислот метаболических циклов, длиноцепочечных кислот, имеющих значение маркеров.

Экстракция аминов хлористым метиленом при подщела-чивании. Этот способ использовали для экстракции аминов из культуральных сред.

Кислый метажшиз целых клеток и их фракций. Осуществляли в 4-6N НО в метаноле (сухом) в течение 4-18 часов при температуре 80-11043. На 3-7 мг сухих клеток брали 100-200мкл реагента. После проведения реакции образовавшиеся метиловые эфиры жирных кислот экстрагировал и гексапом и ана-.".¡«ироьзли, или обрабатывали БСТФЛ для получения летучих производных оксикислот.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ПО ХИМИЧЕСКОМУ СОСТАВУ (ПРОФИЛЮ) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЕРСОНАЛЬНОГО КОМПЬЮТЕРА

Результаты литерагурнот исследования вместе с собственными данными по влиянию условий культивирования и анализа подтверждают межлабораторную воспроизводимость данных по химическому составу микроорганизмов. Это обосновывает возможность формирования банка данных па основе результатов исследований, проведенных разными авторами. Уже отмечалось, что депдрогаммы многих родов бактерий, построенные нумеричес-кими методами на основе сходства жирных кислот, находятся в хорошем соответствии или полностью адекватны результатам видовой идентификации их на основе традиционных культурально - биохимических и других признаков (Лазовская, 1986).

1.1. Влияние различных факторов на состав жирных кислот микробной клетки.

Температурные изменения состава жирных кислот Methylo-coccus capsulatus прослежены в диапазоне or 3.5 до 40"С. При компьютерном сопоставления профилей штаммы, выращенные при разных температурах, распознаются как принадлежащие своему виду с коэффициентами корреляции до 0.85 по отношению к штамму из банка данных (37"С). Температурные эффекты н составе жирных кислот н альдегидов наблюдали в штаммах псих-рофильных гомоацетатных бактерий Acctobacterium, выращенных при 23 и 6°С. Во всех случаях при 6°С примерно вдвое увеличивалось количество основных ненасыщенных кислот - А9 и Д11 гексадсценовых. Другие компоненты вели себя по-разному. Количество альдегидов снижалось при уменьшении температуры, но относительное количество ненасыщенных альдегидов при этом росло. В штамме, выделенном из содержимого метантенка (Acctobacterium fmietaruim) альдегиды пропали вообще при низкой температуре, количество тстрадеценовых кислот в сумме снизилось (14:1 Л9 и Д11). Тем не менее, профиль как образ, сохраняется и распознает ся как принадлежащий к одному виду в каждой паре штаммов, но для A.fimetarium коэффициент корреляции ниже, чем п случае двух других видов.

Мы оценили степень узнаванля бактерий по профилям жирных кислот при выращивании культур па разных средах, использовав литературные данные для СВБ (Taylor, 1983). Замечено, что - данные по сульфагрсдукторам плохо воспроизводятся у разных авторов, особенно в части оксикислот. Данные Ucki (1979) и данные М.Вайнштеина (V;tinshtcm,l992) близки, по расходятся в количественном отношении сданными Iidlimd (1985) по составу оксикислот Desulfovibrio vulgaris. На это обратили внимание в своей более поздней работе A.Ucki и T.Siilo (1983). Они измерили коэффициенты корреляции (подобия) для 21 штамма суль-фатредукторов, выделенных из полы, и показали их близость к Desulfovibrio desulfuricans. И действительно, в работе Тейлора показано, что при использовании в качестве субстрата поочередно пропионата, лактата или Н2+СОг изменяет относительное содержание основных жирных кислот в четыре - пять раз, а минорных и того больше. Мы провели обработку данных Тейлора по принципу распознавания образов и показали, что все три

культуры опознаются правильно как вид. Однако коэффициенты корреляции, изменяясь от 0.98 до 0.61, выходят за пределы обычных межвидовых отличий. В то же время профили из разных лабораторий при тринадцатилетней разнице в проведении исследований без копирования методик согласуются в пределах к=0.82. В этом состоит особенность метода распознавания образов: не столь важны количественные различия сколь сохранение некоего специфичного образа в виде набора существенных признаков, необходимых и достаточных для выражения индивидуальности объекта.

1.2. Вариации химического состава липидных компонентой микроорганизмов

Для решения задачи идентификации микроорганизмов по химическому составу в чистых культурах и в сообществах важно знать, какие вещества каким таксономическим группам присуши н как они отличаются от компонентов клеток высших организмов. Разнообразие липидои прямым образом связано с возможностями аппарата синтеза клетки.

//'Vy'f'Ä!>'JWC_i/.^>AWi??.M<vi/i^/e^Hwoj7jMJ_CyiuccTnycT два пути синтеза жирных.кислот, приводящих к образованию либо пря-моцепочечпмх (нормальных) либо с метильнои группой на конце угродпои цепи молекулы (разветвленных или изо-кислот). По первому из них синтез начинается с ацетил- S-KoA, к нему подсоединяются С2-фрагменты, донором которых служит малонил-S-KoA. По второму пути инициатором цепи являются производные метилразветвленных аминокислот (валика, лсйнииа, изо-лейципа) или короткоцепочечные изокислоты (изомасляная, изо-валерилноная). Этот путь приводит к образованию изо- и антси-зокислот с числом атомов углерода 14-19. У прокариотов он считается самым древним, возникшем в абиотических системах в анаэробных условиях.

Циклыjjuctin. Пиклопронанош.;с кислоты встречаются довольно часто как у грамчоложитсльиых так и у грамотрииатсльпых организмов. Известно также несколько видов, имеющих (о-пик-логексаповьге кольца: Bacillus aciclocaldarius, B.acidotcrrcstris, Cur-tobacterium pusillum и Sulfobacillus thermosulfidooxidans. B.cyclohcptanicus содержит на 90% со-циклогептановые кислоты в составе липидов. Эти кислоты, как правило, имеют 17 или 19

атомов углерода («месте с кольцом). Цнклогексаповое и цикло-гептановые кольца расположены па углеводородном конце молекулы (со), а циклопропановое - в положении 9,10.

Наличие циклов служит хорошим признаком для дифференциации содержащих их микроорганизмов. Циклопроианоиые кислоты содержат многие представители сем. ЕШегоЬа^ласеае, псепдомонады, лактобацнллы и другие организмы. Энтеробакте-рии содержат в основном циклогсптадскановую кислоту (С17сус), а два других рода - циклононадекановум (С19сус).

Оксикислоты. Наличие оксикислот в составе липидов четко связано с одним из основных делений микроорганизмов в соответствии с окраской по Граму. Оксикислоты имеют только гра-мотрицагельпыс микроорганизмы. 3-оксикнслоты находятся в составе линида АЛИС клеточной стенки. Они представляю г фуп-пу отличительных признаков грамотрицательпых бактерии, особенно важных в диагностике инфекционных процессов, гак как клетки высших организмов их не содержат. Наряду с З-оксикне-лотами у некоторых организмов встречаются и 2-оксикислоты. Они составляют небольшую группу микробов, содержащих сфин-голиниды, в состав которых входят 2-оксикислоты. Это собственно ефннгобакгерин (8р1нп^оЬас(сгншО, а также некоторые другие. Разнообразие оксикислот грамотрицательпых микроорганизмов позволило построить их систематику (Janl7.cn, 1985).

Оксикислоты удобны для масс-спсктромстрическою детект ирования, так как их спектры имеют сильные линии, отличные от линий масс-спектра других кислот и компонентов фона. Это важно в диагностике инфекционных процессов и при контроле грамотрицательпых организмов в экологических и биотсхноло-гических сообществах.

Альдегиды мазмо.югена. В цитоплазматичсских мембранах некоторых микроорганизмов пшроксилы глицерина этерпфпци-рованы, наряду с остатками жирных кислот (ацил-радикалами), еще и алк-1-спил-радикалами жирных альдегидов. Такие глице-рофосфолипиды называются нлазмологенами. Они присущи в основном клеткам высших организмов, обнаруживаются в форменных элементах кропи, сперме, миелине, клетках сердца, мозга и нервной ткани.

Наряду с оксикислотами альдегиды дают большую группу маркерных веществ, существенно повышающих специфичность хе-модифференцнации микроорганизмов. Их удобство в практичсс-

ком использовании связано также с тем, что они и шлекаются из липидов в процессе получения метиловых эфиров жирных кислот при кислом метанолизе. Альдегиды при этом трансформируются в димстилацетали.

По разнообразию изомерных и ненасыщенных вариантов альдегиды повторяют номенклатуру жирных кислот. В разных организмах встречаются простые линейные, разветвленные н моно-неиасыщенные альдегиды с длиной цепи 14-18 атомов углерода. Не обнаружены только оке и-альдегиды. Кроме того, альдегиды присущи только грамположительным бактериям.

Нейтральные лип иды. К ним относятся изопреноилы - дитер-пены, сесквитер-пены, сквалены, стераны и гопаны, изопрено-идные хиноны, которые присутствуют в клетках некоторых микроорганизмов и используются как дополнительные признаки для их хемодифферешшашш в отдельных случаях.

Липиды архебактерии. Архебактерии выделены р. самостоятельное царство па основе сравнения с другими микроорганизмами по последовательности нуклеоти-дов в ¡с-.4 и рРНК, а также по составу компонентов клеточных стенок и липидов. Характерной особенностью архебактерии является наличие липидов, н которых с глицерином связаны простыми эфирными связями остатки фитола и сестсрпанола с образованием дифиганил-, фи-танил-, сестсрпанид- дифитанил-диэфиров и дибифитанил-тет-. раэфиров. Их особенностью является также наличие свободных изопреноидов и скваленов. Эти вещества являются маркерами для архсбактерий.

Приведенные выше данные по вариации состава лигтидных компонентов различных классов у микроорганизмов приводят к выводу о принципиальной возможности однозначной идентификации неизвестного штамма, если химически'.! состав липид-пых компонентов вида известен. Действительно, если в результате анализа определен состав липидов, то выглядит реальным путь идентификации через установление сначала групных групп микроорганизмов, в которые попадает данный штамм, а затем постепенное сужение круга вариантов, путем включения специфических признаков вплоть до родовых и видовых маркеров и профилей, но уже в пределах предварительно локализованной, группы организмов. Этапы идентификации можно представить следующим образом:

О выявление наличия жирных кислот или фитанилпишери-

дов, разделение прокариот и архебактерин

О выделение с группу грамотрнцательных микроорганизмов при наличии 3-оксикислот

О определение следующей группы по способности синтезировать разветвленные кислоты

О локализация группы по наличию циклов в цепи жирных кислот

О при наличии альдегидов локализация штамма в группе плаз-мологенсодержащнх организмов

О при наличии 2-оксикислот - в группе организмов, содержащих сфинголинид

О использование маркерных и профильных признаков в пределах выделенной группы микроорганизмов для определения рода или йида организма

По этому принципу мы попытались построить определитель бактерий, позволяющий без компьютера достаточно надежно и быстро определять таксономическую принадлежность микроорганизма поданным ГХ или ГХ-МС анализа жирных кислот, ок-сикислот и альдегидов.

1.3. Организация банка данных и программа идентификации

Практика показывает, что число использованных липпдпых компонентов достаточно для идентификации неизвестных штаммов до вида. Этих веществ, вошедших в банк данных для автома-- тической идентификации около 150. Профиль липидных компонентов вводили в банк данных компьютера в виде двумерного массива данных: кодовый номер вещества и его концентрация в клетках микроорганизма данного вида. В графическом изображении профиль представляет гистограмму, на которой высота линии соответствует концентрации веществ, а положение линии на оси абсцисс - номеру компонента. Дли идентификации неизвестного профиля с профилем из банка данных подобран, готовый алгоритм распознавания образов. Для его адаптации на персональном компьютере разработана вспомогательная программа, которую можно использовать на PC класса по ниже AT 386. Сформирован банк данных, включающий около 600 штаммов 450 видов бактерий, всгречающихся в экологических и биотехнологических сообществах, а также в организме человека. Режим

идентификации регулируется шестью параметрами, определяющими диапазон коэффициентов корреляции (к) неизвестного и стандарта, число подбираемых при поиске похожих видов, допустимые искажения профиля, строгость критериев сопоставления и два параметра, касающихся метода сопоставления.

Разработан также вариант ручного определителя бактерий по составу липидных компонентов. Он представляет собой схему логических путей, изображенных на листе бумаги, которые начинаются с признаков крупных групп бактерий: наличие оксикислот, альдегидов, разветвленных кислот. Затем включаются особенности mopofo плана: наличие киклопропановых кислот, определенных оксикислот, степень ненасышенности и т.п. Это приводит к локализации определяемого штамма п ограниченном круге таксонов, в котором уже по специфическим признакам (наличие конкретных веществ при определенном их соотношении) можно определить конкретный род или вид микроорганизма.

1.4. Корреляционные соотношения химических

профилей микроорганизмов и штаммово-видовой континуум

Замечено, что в ряде случаев штаммовые различия в профилях жирных кислот превышают межвидовые и штамм оказывается как бы не на своем месте. Например, некоторые штаммы Serratia rubidaea (Bergan, 1983) ближе по этому признаку к S.marcescens или к S.liqtiafacicns. Штамм S.rubidaea G864 по содержанию кислот 16:1 и h 14 соответствует профилю S.marcescens, к=0.92, тогда как с другими штаммами своего вида к=0.83. Другой штамм S.rubidaea G377 по содержанию 17сус близок к S.üquafaciens, к=0.87. Ог Serratia в пределах коэффициента корреляции к=0.85 можно перейти к другим родам семейства Еп-tcrobacteriaccae. Например, в пределах интервала внутривидового коэффициента корреляции к=0.98-0.83, к=0:15 оказываются некоторые штаммы Enterobacter, Proteus, Hafnia. От них родственный мостик по такому видовому критерию можно перебросить к Salmonella и E.coli и далее к другим родам семейства. От последних существует аналогичная минимальная дистанция к роду Plesiomonas семейства Vibrio и параллельный мостик от видов с заметным содержанием лактобацилловой кислоты к родам Bordetella и Brucella. Такие родственные связи не прецедент. Тради-

ционное таксономическое отнесение не всегда бывает четким, определенным и неизменным. Род Serratia, с которого мы начали, поначалу состоял из одного вила, но впоследствии был разделен на шесть по результатам ДНК-ДНК гибридизации. Yersinia pestis первоначально была известна как Pasteurella pestis а Gardnerella vaginalis была членом рода Haemophilus.

Такого рода компьютерные сопоставления профилей жирных кислот, окспкислот и альдегидов - липидных компонентов микроорганизмов - приводят к заключению о существовании непрерывности в изменни их состава при переходе от одного таксона к другому. Разница между таксонами по лигшдному составу достаточна для хемодифференциации, но в то же время па штам-моком уровне частные изменения в липидном профиле приводят х размытию этих границ и образованию континуума - непрерывного количественного изменения химических параметров клетки, которые переходят в определенный момент в качественные - меняется вил. Явление континуума возникло из кибернетического представления состава части клетки как образа и математического корреляционного сопоставления с клетками другого сорта - вида. Поэтому, для того , чтобы представит!., что такое континуум и какие выводы для пауки и практики можно извлечь из факта его существования, полезно еще раз воспользоваться математическим приемом, предложив нижеследующую теорему и три вытекающие из нее следствия.

ТЕОРЕМА

Если профили серии штаммов микроорганизмов одного вида - отличаются на величину к, соответствующую критерию внутривидовых отличий, то найдется микроорганизм другого вида или рода, имеющий корреляционное отличие менее Дк хотя бы от одного штамма этого вида.

СмдсшзиеЛ- Для каждого вида микроорганизмов можно найти штамм из другого рода с похожим в пределах Ак профилем жирных кислот. Такие штаммы могут по признаку сходства принадлежать как первому, так и второму виду.

Следствие 2. Клетки микроорганизмов и пределах царства объединены в штаммово-видовои континуум без дискретной грани' цы между видами.

Следствие 3. При сопоставлении но принципу подобия образов можно установить непрерывное родство штаммов, двигаясь с шагом к в поиске подобных профилей липидных компонентов.

Общее следствие научно-практического свойства из факта существовании штаммового континуума среди кочеток микроорганизмов различных таксономических уровней заключается в новом аспекте осмысления происхождения и эволюции микроорганизмов и функциональной значимости отдельных классов лнпид-ных веществ в их физиологии. Некоторые из них носят отпечаток древности: разветвленные кислоты относят своим происхождением к первичной анаэробной стадии зарождения жизни на Земле. Кроме того, им приписывали функцию зашиты цитоплазмы в экстремальных условиях солености, рН и температуры. Однако накопление данных о составе, физиолоши и биохимии микроорншизмои экстремальных экологических ниш показывает, что выживание клетки в этих условиях обеспечивают не они (специфические вещества мембран), или не только они. Например, выяснилось, что экстремальными галофиллми, алкалофи-лами и ацидофилами могут быть не только архсбактерии но и эубактсрии (На!оЬас1егшт, 5рнос11ас(а, Зи1ГоЬасЩш;). К эгому можно добавить, что многие клетки способны синтезировать не свойственные им липидные компоненты (например, разветвленные или циклогексановые кислоты). Напрашивается вывод, что экзотичность состава мембраны связана не с особенностью экологической ниши микроба, а вызвана какими-то другими обсто' ятсльстнами. Из.суммы сведений по современно!! микробиологии и данным анализа древних отложений (сланцы, уголь, нефть) ясно, что признаки химического состава мембран устойчивы, консервативны и существуют с давних времен. Обнаруженное свойство континуума липидиых компонентов свидетельствует о то.м, что в природе микроорганизмов заложены некие универсальные синтетические возможности, которые в разной степени проявляются у разных микроорганизмов, а вариации состава обусловлены питательной средой, температурными условиями и факторами биологического и химического катализа (рН среды, ферменты, металлы, электрохимические потенциалы).

. 2. КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ РОДОВОГО (ВИДОВОГО) СОСТАВА МИКРОБНЫХ АССОЦИАЦИЙ ПО ХИМИЧЕСКОМУ СОСТАВУ СУММАРНОЙ БИОМАССЫ

2.1. Теория и алгоритм расчета

Рассмотрим пример сообщества, состоящего из трех микробов с разными профилями жирных кислот (Рис.2.1). Профили отличаются тем, что у B.fragilis есть разветвленные кислоты, отсутствующие у двух других, а циклононадскановая кислота (лак-тобацилловая) имеется только у Lactobacillus acidophilus. По их концентрации можно сразу вычислить число клеток этих видов сообществе но формуле:

Xj=Ai S/Rij (l)

Эта формула вытекает из очевидной линейной (пропорциональной) зависимости между числом клеток микроба Xj и площадью пика Ai, принадлежащего только одному ему вещества в хроматограмме. В этой формуле S - постоянный коэффициент пропорционачьности, учитывающий условия анализа и чувствительность прибора, a Rij - доля i-того вещества, по которому ведется расчет, в жирнокис-лотном профиле определяемого микроба. В нашем примере для B.fragilis этим веществом могут быть разветвленные кислоты il5, al5, il7, al7 или оксикислоты hl6, - hil7. При этом результат определения в каждом случае должен быть один и тотже. Если возникают расхождения, то их следует отнести к ошибке метода.

Аналогично, L.acidophilus можно расчитать но лактобацилло-вои кислоте (19сус) иди по миристиновой, т.к. у других микробов этих кислот нет. C.albicans определяется по липолевой (18:2) или гептадеценовой кислотам, которые не перекрываются компонентами остальных членов этого модельного сообщества. Таким образом, в нашем случае количество C.albicans

X =A,82 S/20.4 или X=A17:,S/2.5 количество B.fragilis X2=AalJS/41.3 или

X2=A|u|7S/23.2 или др. варианты количество L.acidophilus X3=A19cyc S/39.4 или

! 1 I. аабор№з В В (гаэ^з ЕЗ С а!Ьсапз

Я б ггад^и&

—г-----

п.и,

4. 5 6 7 8 3 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Ц 1.аа<1орМиг

-оДЛ,

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

0 С.а1Ьсап5

т- СМ О

¿-Г СО СО

Рис,2.1* Расчет видового состава микробных сообществ. Демонстрация на примере трех микробов с разными профилями жирных кислот.Верхняя диаграмма является суперпозицией расположенных под ней профилей отдельных микробов и моделирует их наложение в реальных сообществах

X=A,,0S/2.4

Чтобы подойти к решению задачи в случае перекрывании пиков (т.е. когда одно и то же вещество есть у разных членов сообщества), рассмотрим обратную задачу: определение площади ГХ-пика через концентрацию микроба и долю ЖК в его профиле. Возьмем в нашем примере кислоты 16:1 и 18:1. Их пик на хромато-грамме происходит, как видно из двух источников: С.albicans и L.acidophilus.

Из уравнения. (1) в общем виде определим Ai:

Ai=Xj Rij/S.

Но здесь два микроба дают вклад в пики выбранных кислот, и суммарно

AltrX,-R...6,/S+XJ-RJ.,61/S (2)

Отсюда не трудно видеть, что мы получили систему уравнений, по которой можем рассчитать пару микробов, если они оба участвуют в формировании двух пиков. Математически эта система имеет единственное решение, если уравнения не являются линейной комбинацией друг друга. В данном случае это должно означать, что хотя бы одно значение R,j отличается от значений R3j. Т.е. требуется, чтобы соотношение этих веществ в клетках разделяемых микробов было бы различно. Тогда из системы (2) можно найти число клеток X, и Х3, так как остальные величины известны из опыта.

На примере системы (6) нетрудно перейти к общему случаю. Присвоим веществам на хроматограмме (в составе суммарной биомассы) индексы i, а микроорганизмам индексы]. Тогда для m веществ хроматограммы суммарной биомассы сообщества, включающего в качестве членов п родов (видов) микроорганизмов можно составить систему Из m уравнений для п неизвестных:

Alq = X1R|1 + X2R,,+ X3Ru+.........+ XR„n

A2q = X,R2, + X2Ru+X,R2iJ+.........+ ХВК,Д

M (8)

К* = X Rm,

Система имеет единственное решение при ш=п в том случае, если уравнения независимы, то есть любое из них не является линейной комбинацией каких либо других уравнений. В нашем

случае это означает неразличимость (невозможное!ь раздельного вычисления) двух разных видов микроорганизмов с одинаковым профилем жирных кислот и альдегидов.

2.2. Локальные банки данных и расчет отдельных микробных сообществ

Если рассматривать очень широкий круг микроорганизмов, то теряют спою исключительность практически все маркерные вещества, приписываемые одному роду или пилу Последнее и наводит на мысль, что если ограничить используемый для идентификации и расчетов банк данных членами конкретного микробного сообщества, то вероятность такого рода совпадений значительно снизится. Насколько можно судить по литературным данным в настоящей работе впервые ставится вопрос о локализации банков данных. Ранее не возникало такой необходимости, так как не было предложений расчета сообщества метолом математического анализа суперпозиции профилей. Исследователи, изучавшие структуру сообществ по химическим признакам, обсуждали альтернативную принадлежность маркерных веществ, основываясь, новидимому, на своей эрудиции в предмете исследования, не указывая при эгбм ira конкретный круг данных химического состава микроорганизмов. Однако, нет упоминаний о локализации банков данных при интерпретации суммарного со-ства биомассы сообществ.

Анализ особенностей химического состава биомассы ила и формирование банка данных

Первичный анализ состава биомассы ила состоял в рассмотрении химических составляющих пробы и выявлении присутствующих в ней микроорганизмов по специфическим маркерным веществам н их совокупности (коллективным маркерам). Для поиска использовали сформированный ранее банк данных по химическому составу микроорганизмов, предположигельно входящих в сообщество активного ила. Их профили "примеряли" к профилю суммарной биомассы пробы, чтобы выявить организм, состав которого наиболее близок к тому или иному фрагменту химических компонентов биомассы. При повторных анализах расчет их количества проводили по уже отработанноиу ал горит -

му. По хроматограмме каждой конкретной пробы определяли лишь количественный состав химических компонентов.

Для формирования достоверного банка данных привлечены известные сведения из микробиологических исследовании данного сообщества. Для их получения использовали литературный поиск и рассмотрение вариантов состава сообщества со специалистами - микробиологами, работающими с пресноводными, почвенными бактериями и с активным илом. Консультации получены у д.б.н.Разумовского Э.С., к.т.н. Терентьевой H.A., д.б.н. Дубининой Г.А., к.б.н. Лебедевой Е.В., д.б.н.Горленко В.М., чл,-корр.РАН Заварзина Г.А., к.б.н. Марауска М.К., академика Бек-кера М.Я., которым приносим искреннюю благодарность за полезное обсуждение состава микробных сообществ. Таким образом мы составили ориентировочный список микроорганизмов, которые могут быть членами сообщества активного ила. В банке данных по сообществам илов собрано 54 вида микроорганизмов 24 родов.

По специфическим маркерным веществам в сообществе ила . можно определить содержание микроорганизмов Pseudomonas putida по наличию 2-оксилауриновой кислоты (2И12:0), P.multophila по 3-окси-изо-трндекановой кислоте (31iil3), Bacillus ccreus по антсизотридекановой кислоте (а 13:0), K.subtilis по нормальной тридскановой кислоте (13:0). Род Pseudomonas, как и род Bacillus гетерогенны по химическому составу видов, что позволяет, как видно из этих примеров, выделять членов рода и сообществе по видовым маркерам. Аналогично определяется,-но уже по родовым признакам,- Desulfovibrio (изогептадецено-вая кислота, il7:l), Desulfobacter (Ю-метилгсксадск.м.овая кислота, 10Ме16:0), Bacteroides (З-окси-изотетрадекановая, hi 14) и т.д. Некоторые маркеры охватывают более крупные группы микроорганизмов, например, метилотрофные бактерии определяются по 7,8-гексадсцсновой (!6:ld7) кислоте. Микроскопические грибы определяли в целом по линолсвой кислоте (октадек;щиеновой, 18:2). Наличие арахидоновой кислоты в составе суммарной биомассы ила указывает на вклад эукариотных клеток, относящихся, повидимому, к простейшим. Некоторые вещества характерны для всех или большинства микроорганизмов. Это пальмитиновая, стеариновая, миристиновая, олеиновая, лауриповая и некоторые другие. Они неспецифичны и использовались лишь для проверочных расчетов при подведении материального баланса

веществ и выявления не учтенных в банке данных организмов.

Ряд 2- и 3-оксикислот из состава биомассы ила (нечетные и разветвленные с 15 и 17 атомами углерода) указывают на наличие бактероидов и скользящих бактерий. Альтернативы по этоме признаку нет в доступных нам данных по химическому составу микроорганизмов. Скользящие бактерии из активного ила выделяли (Ziegler, 1990), а бактероиды - нет. Однако известна возможному симбиоза аэробов и анаэробов, например, аэробных псевдомонад в анаэробных условиях нефтяных скважин, где их дыхательные потребности обеспечивают сульфатвосстанавливаю-щие бактерии (СВБ) и бактероиды. Аналогично, по-видимому, в частице ила псевдомонады и другие аэробы экранируют анаэробов от воздействия кислорода.

Отметим в составе биомассы еще два маркера. Уникальную изо-гепта-деценовую кислоту, которая известна лишь у представителей родов Desulfovibrio и Flavobacterium - причем в большом количестве - до 35% общего состава их клеточных ЖК. Здесь, в иле, нет условий для развития СВБ, а флавобактерии существуют (Seiler, 1984). Этот маркер можно использовать для их непосредственного контроля. Второй маркер - 10Ме1б:0 также уникален, так как это вещество есть только у другой СВБ - Desulfo-bacter и у нокардиаформ (напр. Nocardiopsis).

Из длиноцепочечных и циклических тяжелых компонентов, биомассы следует отметить ряд интересных для наблюдения объектов. Это 10-оксистеариновая кислота - метаболит клостридий группы C.perfringens и псевдомонад. Как метаболит клостридий ее можно объяснить фекальными стоками, но высокая концентрация этого вещества сохраняется вплоть до стадии отстаивания ила перед сбросом очищенной воды. Поэтому следует отнести 10h 18:0 на счет псевдомонад, которых здесь много. Другой метаболит - стерин копростанол характерен для кишечной микрофлоры. Его концентрация в биомассе ила велика на всех стадиях процесса очистки стоков вплоть до завершения анаэробного сбраживания в метантенке. Наконец, обнаружены длиноцепочечные 2-оксикислоты С20-С24, которые у микроорганизмов не находили. Вещества этого класса характерны для сфинголипидов клеток высших организмов.

Практически оказывается, что решение системы (2) можно свести к решению серии уравнений с одним неизвестным и серии систем с двумя, максимум с тремя неизвестными. Такая уп-

_ > „vniii

явщ

DvUgans

t 2 tä 4 Б

6 Nitcfcacter

□ seiraia

SI Nocatfa

40-f Б Bacteroöii

мюм

12 3 4 6

18Э-, П Ftatea

1334

6о| 0 +

Рис.2.2. Изменение численности микрорганизмов при осаждении активного ила. Курьяновская станция аэрации. Множитель шкалы 105кл/г сухой биомассы. Равномерный отбор проб в процессе оседания ила по окончании аэрации. Время между точками 1-S около трех часов

рощенная система уравнений введена для расчета в программу электронных таблиц Microsoft Excel. Из 54 видов, запланирован-

ных для сообщества ила, на самом деле найдено 34. Для них определен набор тридцати четырех веществ, по которым производится расчет. Все параметры уравнений - коэффициенты и свободные члены расчитаны заранее. При каждом конкретном определении видового состава сообщества остается определить площади 34 пиков на хроматограмме и набрать их в колонке исходных данных Excel затем ввести в уравнения параметр S -чувствительность прибора вдень измерения. Система уравнений в рамках электронных таблиц динамична и мгновенно реагирует (пересчитывает решение) при проведении оптимизации баланса. Это позволяет корректировать решение по отрицательным значениям, возникающим из-за различных естественных погрешностей в измерениях, воспроизводимости процедуры ripo-боподготовки и воспроизводимости химического состава микроорганизмов определенного вида в сообществе по сравнению с данными по чистой культуре, которые введены в банк данных. Полученный на основании расчета состав микробного сообщества активного ила приведен в габл.2.1.

Изменение видового состава активного ила при осаждении

Осаждение активного ила по завершении очистки сточных вод происходит в течение трех часов, после чего воду сбрасывают, а ил частично возвращают в начало процесса, частично направляют на анаэробную переработку. При этом практически - важно знать как меняется состав ила и воды в процессе осаждения. Для анализа ил и воду отбирали пять раз через равные промежутки времени и определяли состав сообщества микроорганизмов по описанной выше методике. Вид полученных диаграмм (Рис.2.2) покатывает возможность фиксировать изменения состава сообщества в пределах короткого (5 часов) времени его жизни. Например, количество псевдомонад, бактероидов и аце-тобактсрий не меняется, число нокардий, грибов в целом и простейших растет. Становится заметным нрисутсвие сульфатвосс-танавливающих бактерий - D.vulgaris, растет концентрация Fla-vobacterium и Nitrobacter.

О возможности определения живых и мертвых клеток. Баланс компонентов химического состава биомассы ила показывает, что в некоторых микробных сообществах возникает диспропорция

Таблица 2.1

Состав ынкробкого сообщества активного ил» аэротеиков Курьяновской станции аэрации. Июнь 1994г.

N, Количество, кл/г еухойбпомассы, xlO*

Род, вид Пшготк Новые 1 Стари« Ноше 2

1 Pseudomonas putida 120 275 23 122

2 P.multcphila 167 464 363 137

3 Bacillus cereuj 235 272 200 204

4 B.subtilu 210 322 163 163

5 Methyloeoccus 3176 2212 1545 583

6 Edellonbno 1810 562 I6J0 312

7 Acetobactenum 636 769 100 1770

8 Nocardia. 44 889 497 148

У . P.STurrrn 148 684 87 21

10 Bactcroidcs (-) 384 1361 3354 467

11 Spirochaeta 440 131 0 260

12 Actinomyces 130 889 462 350

13 Flexybacler 326 485 485 196

14 Flarobactenum 287 417 365 287

15 Desulfovibno 0 11 184 5

16 P.vencularis 792 988 1468 593

17 B.nimmw-ola 454 3S0 742 64

18 B.rummieola ATOC 625 360 . 227 7d 200

19 Nitnobacler 2174 121 1434 584

20 Fungi 1595 934 878 878

21 Butyrvnbrio 1578 392 2511 891

22 Cytcphaga 168 0 282 0

23 P.cepaoea 408 77 654 IP

24 Propionibacterium 1658 794 676 422

25 Ca pncxjl oph a g a 26 120 125 161

26 Deiulfobacter 586 501 833 289

27 Eucanote« 12149 3819 8837 1685

28 Butynvibno 421 957 399 301

Сумма 30748 19186 28317 11103

между количеством грамотрицательиых микроорганизмов, определенных по фосфолниидным нормальным кислотам, с одной стороны, и по оксикислотам липополисахарида. Мы наблюдали такое явление в отстойниках без аэрации и в старых накопительных культурах СВБ. Н.Ргеёпскзоп (1989) сообщает о такой диспропорции в составе озерного ила (мата). Выглядит разумным

предположение о том, что оксикислоты, находящиеся в составе ЛПС клеточной стенки, не утилизируются в процессах катаболизма, или перерабатываются значительно медленнее остальными микробами после лизиса умерших клеток. Это дает шанс оценить соотношение живых и мертвых грамотрицательных микроорганизмов и, следовательно, считать, что при расчете по компонентам фосфолиппда мы определяем количество живых микробов.

Расчет видового состава микроорганизмоп накопительной культуры сульфатвосстанавливающих

бактерий

Эксплуатация нефтяных месторождений с применением заводнения приводит к развитию в пласте активного микробного сообщества. В результате последовательного воздействия на нефть углеводородоокисляющих, сульфатвосстанавливающих (СВБ), бродильных, и метанообразующих бактерий происходит деградация нефти. Образуемый СВБ сероводород ухудшает качество нефтяной продукции, вызывает коррозию оборудования и закупорку пор пласта вследствие осаждения сульфидов.

Работа выполнена совместно с Назиной Т.Н. и Ивановой А.Е. (ИНМИ РАН).

При определении состава микробного сообщества в качестве исходной информации использовали химический состав суммарной биомассы, определенной методом хромато-масс-спектромет-" рии, и химический состав (профиль) отдельных микроорганизмов, вероятных членов сообщества. В работе использовали созданный нами общий банк данных качественного и количественного состава липидных компонентов клеток и локатьный банк сообщества, характерного для СВБ. В банк по литературным данным и собственным измерениям собраны сведения о содержании около 150 липидных веществ для 300 штаммов, принадлежащих к 180 видам микроорганизмов. Банк включает 65 видов СВБ, 31 вид клостридий, 21 вид бактероидов, а также псевдомонады, тиобациллы, скользящие и другие бактерии, встречающиеся в природных и техногенных сообществах.

С помощью банка данных и полученного полного профиля химических компонентов биомассы исследуемого сообщества, проводили идентификацию таксонов. Для этого из состава сум-

марной биомассы выделяли профильные и маркерные признаки отдельных таксонов и проводили их идентификацию. Используя полученные ранее калибровочные данные по количественному составу химических компонентов в микробной клетке, производили определение числа клеток каждого отдельного таксона (рода или вида) в сообществе. Для расчета их количественного соотношения составлены 24 уравнения баланса по отдельным компонентам суммарной биомассы. Методом последовательных приближений определен состав сообщества, представленный в таб.2.2.

Таблица 2.2

Состая накопительной культуры сульфатовосстанавливающих бактерий из Таллинского нефтяного месторождения

Род, вид С, мкг/мл Число кл/мл

Desulfovibrio vulgaris 10.0 1- 10'

Desulfovibrio gipas : 2.2 2.2' 10»

Desulfobacter 1.7 1.7- 108

Pseudomonas (vesicularis+diminuta) 0.5 5 107

Pseudomonas alcaligenes 12 1.2- 108

Pseudomonas diazotrophicus 4.1 4.1 108

Thiobacillus 2.0 г 10«

Bactcroidcs 6.5 6.5 108

Flcxybactcr 02 г 10'

С целью проверки результатов идентификации микроорганизмов с помощью метода ГХ-МС, та же накопительная культура была исследована традиционными методами. Культура была посеяна на плотную среду Видделя и Пфеннига с молочнокислым натрием и ацетатом натрия. Полученные единичные черные колонии СВБ были выделены и исследованы. На основании изучения морфологии, определения размера клеток и спектра используемых диагностически ценных субстратов было подтверждено наличие жизнеспособных бактерий Desulfovibrio vulgaris, Desulfovibrio gigas, Desulfobacter sp. Это свидетельствует о том,

что биомаркеры и профили жирных кислот СВБ позволяют правильно определять состав этой группы бактерий методом ГХ-МС без выделения чистых культур..

Микробные сообщества гранул из ЦАБВ-реакторов. Пробы гранул из метановых реакторов, перерабатывающих отходы молочного и пивного заводов, бумажной фабрики и спирго-лрожже-. вого производства получены от С.ЬеПй^а (Вагенинген, Нидерланды) и А.Н.Ножевниковой (ИНМИ РАН). В этой серии образцов исследованы также экспериментальные гранулы, полученные на культуральной среде с пропионатом, гранулы сульфи-догенного сообщества и гранулы, адоптированные к метанолу. Каждая гранула представляет собой локализованную сбаланси-. рованную по составу ассоциацию микроорганизмов. Гранулирование рабочей биомассы метанового реактора увеличивает его производительность, но для обеспечения сохранности гранул требуется стабильность состава обрабатываемых стоков и соблюдение определенного гидродинамического режима метантенка. В таблице 2.3 приведен расчитанный по методу химического

Таблиц* 2Л

Состав ассоциаций микроорганизмов гранул ИАБВ-реакторов __(х Ю'кл/г сухой биомассы)__

Род, вид Тип отходов Пит. среда

Бумага Пито Спирт Молоко Метанол Пропиоиат СутФЧД

1 Clostridium beijerinkll 240 250 150 210 . 1.3

2 Bacteroides ruminlcola 300 200 220 83 160 8,5 2,8

3 В ruminicola etr. 910 660 160 130 240 6.1 180

4 B.njmlnicola node 1200 400 950 290 600 24 550

5 Butlrtvibrra 4-3-4 - - - 80 - - 53

6 Butinvibrio IS4 - 180 270 110 110 - -

7 Butlnvibrio 1-4-11 4,5 80 49 - 65 - -

8 Cuccinivibno 310 400 490 1100 230 21 63

9 Flavo bacterium 100 250 38 180 150 15 66

10 Cytoptiage 600 250 240 180 250 26 • 300

11 Nitrobacter

12 Methanothrtx 15 60 10 . 150 1000 -

13 Methanobactertum - - - 11 - - 200

14 /^cetobacterium 330 120 230

15 Pcepacee - 82 240 - 72

16 Pseudomonas puttda ■ 48 63 10 - -

17 P multophila 92 100 120 83 440 - 26

18 Lacftnocplra

19 Fungi/уел кл J 63 30

20 Propionibactarlum 33

21 Straptococcui 33 76 65

22 Artinomyce« 67 - 2.4 4

23 Callulomonat 540 500

профиля и маркера родовой и видовой состав исследованных гранул. Наибольшее число видов микроорганизмов найдено в гранулах, перерабатывающих отходы спирто-дрожжевого производства. По числу клеток более четверти приходится на бактероиды. Далее по численности следуют Се11и!отопа.ч, 8исеттЬпо, ВщугтЬпо, Р.ти1Юр1п1а, Р1аУоЬас(спит. В молочной ассоциации по сравнению со снирто-дрожжевой превалирует Се11ц1о-тогш. Остальные бактерии почти на порядок меньше. Это бактероиды и флавобактерни. В ней отсутствует ряд баю ерш! спирто-дрожжсвой ассоциации и появляются другие вицы: Ви1пт-Ьпо, СуЮрИава и вместо МеПшпоШпх - МеЙктоЬа^епшп. Гранулированная ассоциация, адоптированная к метанолу, содержит почти те же пилы организмов и втом же количестве, что и спиртэ-дрожжевая, но метановых бактерий (Ме^ктоЕЬпх) в ней на порядок меньше. На синтетической среде с проиионагом вырос в основном МеишюИнтх (90%), а сульфидогенная ассоциация на среде, с пропионатом содержит более 50% бактероидов и 14% МситапоЬааегшт.Ассоциации микроорганизмов, работающих на отходах бумажной фабрики и пивного завода, похожи, однако в бумажной ассоциации значительно больше цсллюло-литических бактерий - бактероидов и нет ВиЦгтЬпо. Метановые бактерии - Мс1Ьапо1Ипх, но в бумажной ассоциации его на порядок меньше, чем в пивной. Далее в бумажной пет стгрепто-кокков и Р.рШк1а, но зато появляется Вспюсоссия рго1ео1уПсиз и актиномицеты (10Ме16), вдвое увеличивается количество Су-tophaga. Результаты анализа состава ассоциаций микроорганизмов позволяют выявить особенности различных метаногениых сообществ. Можно полагать, что метод можно применять для экспрессного контроля метанового реактора по ступеням и наблюдения, динамики процесса во времени,

3. АНАЛИЗ ВИДОВОГО СОСТАВА КЛИНИЧЕСКИХ АССОЦИАЦИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОД МАРКЕРА

Банк данных состава лииидных компонентов клинически значимых микроорганизмов был сформирован первым, однако практически применен в этой работе позже мстаногениого сообщества. Причиной тому, превалирующий фон среды — то есть ком. понентов клеток организма хозяина, от которых невозможно избавится в процессе пробоподготовки, так как они имеют ту же

природу, что и микробные. Поэтому расчет клинических ассоциаций микроорганизмов требовал особого подхода, который был найден в процессе экспериментов. Он состоит в комбинации метода маркера и изложенного выше метода анализа состава суммарной биомассы как суперпозиции составов микроорганизмов сообщества и клеток организма-хозяина. Метод маркера состоит в поиске и систематизации веществ, специфичных для рода или вида, измерении их концентрации в биологической жидкости пациента и количественном пересчете на число клеток обнаруженных микроорганизмов с использованием калибровки.

Работа по бруцеллезу выполнена совместно с Желудковым М.М. и Драновской Е.А. По газовой гангрене с Истратовым В.Г. (Институт хирургии им А.В.Вишневского), Сергеевой Т.И.,Ба-байцевой В.А, Чириковой Е.В. (НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи). По инфекциям половых органов - с Соколовым Я.А. и Емельяновым Б.А. (Антидопинговый центр ). Исследования метаболитов клостридий методом ГЖХ выполнены Суховой Т.Г. и Ходорков-ской В.А, методом ВЭЖХ - Титковой Н.Ф. (ГосНИИ биологического приборостроения).

3.1. Определение ведущих микроорганизмов в

инфекционных процессах в организме человека

Для обнаружения микроорганизмов в биологических жидкостях человека (моча, гнойное отделяемое, плевральная жидкость, сперма) применен метод селективных ионов (масс-фраг-ментография). Этот метод, отличающийся высокой чувствительностью, селективностью и экспресностью использован для обнаружения в липидных экстрактах из исследуемых жидкостей маркерных веществ, присущих определенным видам микроорганизмов. В результате изучения химического состава чистых культур микроорганизмов определены структурные маркерные вещества из ряда жирных кислот, оксикислот и альдегидов клеточной мембраны и липополисахарида. Полученные данные использованы для индикации микроорганизмов на превалирующем фоне биологической жидкости. Разработанная методика позволяет в течение нескольких часов определить ведущие микроорганизмы, инфекционных процессов при их содержании более 1& клеток в пробе. Способ универсален, и при существующем дефиците экспрессных методов диагностики анаэробов может быть особенно

эффективен для их индикации.

Возможности метода маркера в области практической медицины мало изучены. Известна диагностика кандидомикоза по арабинитолу /Malivan, 1984/. Попытки обнаружения мнк- ' роорганизмов, содержащих p-оксимиристиновую кислоту /Mait-za, 1978/, диагностика видов Haemophylus по специфическим ок-сикислотам /Sugimoto,1982; Brondz. 1986/. Наконец, недавно опубликована работа по дифференциации видов Campylobacter при бактериологическом исследовании в одной из Швейцарских клиник /Denneinont,1992/. Поскольку обнаружение проводится на фоне биологической жидкости, то требуется учет мономерных компонентов сложных липидов самой жидкости. Водорастворимые белки, углеводы, липиды, метаболиты и пр. не мешают анализу, т.к. удаляются с супернагантом. Клеточные углеводы, белки также не участвуют в процессе, т.к. остаются в кислой фракции при экстракции липидов гсксаном после мстаполиза. Не удастся избавиться лишь от некоторых МЭЖК, и ДМ А биологической жидкости, т.к. они тождественны аналогичным микробным компонентам. В наших опытах мешающим клеючным материалом являются лейкоциты, эритроциты, клетки эпителия и сперматозоиды.

Клетки клинически важных микроорганизмов, собранных в нашем банке, содержат 140 веществ, среди которых могуг быть обнаружены маркеры. Этого достаточно (около120 веществ за вычетом фона) для обнаружения микроорганизмов на фоне биологической жидкости.

Примеры диагностики

С помошью метода индивидуального и коллективного маркера проводили определения ведущей микрофлоры в гнойном отделяемом. Например, по профилю простых и оксикпслот плевральной пункции больного Л. с диагнозом рак легких с плевритом определены Fusobacterium и Actinomyces группы bovis. В гное из челюстного абсцесса (проба 19П, представлена Пашковым 1л.П.', ММА им.И.М.Сеченова) по компонентам отмерших клеток микроорганизмов определено, что первичное воспаление вызвано бактериями вида Capnocytophaga ochraceac. По компонентам жизнеспособных клеток найдено, что к моменту анализа ведущим микроорганизмом стал Bacteroidcs fragilis. В пробе мочи

Соотношение Ь16/17:0

0 2 4

14 20 30

Время, суток

Рие.3.1. Кривые изменения концентрации маркера бруцелл -оксипальмитиповой (И 16) кислоты от времени в крови морских свинок при экспериментальном бруцеллезе

больной с воспалением мочевого пузыря не обнаружены окси-кислоты, что свидетельствует об отсутствии грамотрицательной микрофлоры. Анализ разветвленных ЖК показал, что воспаление вызвано стрептококковой инфекцией при наличии стафилококка.

Кровь. Определение возбудителя по компонентам эндотоксина

Пример 1. Бруцеллез. Для проведения этой работы специально изучен состав липида А бруцелл. Серия из пяти животных (морских свинок), инфицированных возбудителем бруцеллеза при одном контрольном, наблюдалась в течении трех месяцев. У всех животных периодически брали кровь и определяли содержание основной оксикислоты антигена бруцелл-р-оксипальмнтиновой кислоты влипидной фракции метанолизата форменных элементов крови. Для количественных оценок взято соотношение концентраций Ы6 и гептадекановой кислоты, которая наименее подвержена вариациям-у млекопитающих.

На рисунке 3.1 приведены три кривые изменения относительной концентрации Ы6, представляющих два типа протекания болезни. У двух животных из пяти инфицированных кривая имела один максимум (например, свинка 2). Для грех других наблюдались кривые с двумя максимумами концентрации антигена в крови в районе 8 и 44 суток от момента инфицирования (свинки 1 и 8). Достаточно заметное изменение соотношения И16/17:0 - 1.5-2 раза от исходного уровня наблюдалось уже на 2- 4 сутки, что в случае бруцеллеза можно считать ранней диагностикой.

Сальмоиелчез. У сальмонелл основной оксикислотой в ЛПС является р-оксимиристиновая. Поэтому, для оценки диагностической значимости метода масс-фрагментографии в отношении сальмонеллеза сопоставляли концентрацию этой кислоты, как меры содержания антигена сальмонелл в сыворотке крови больных людей, с величиной титра иммунного метода. Результаты приведены в таблице 3.1.

Таблица 3.1

Сопостаигсяше татро» вмиуниого метода я концентрации р-оксиыиристиноаой кислоты а сиаоротхе хроая больных салыионеллсзон

№ пробу Здороаыс доноры 1 2 3 Вольные сальыонсолсэоы . 4 5 6 7 8 9 10 11

Величина обратного татра ООО 0 11) 10 20 160 640 (40 320

Кояпеятр»цн« Ы4/Ы6 02 02 0.7 1.1 0.7 0.8 0.7 12 1.3 2.0 2.0

Для количественной оценки выбрано соотношение ИМ/Ыб, позволяющие получить наилучшую корелляцию с титрами. Из таблицы видно, что у здоровых людей выбранное соотношение меньше 1, а у больных с ярко выраженным иммунным ответом оно больше единицы.

3.2. Экспресс -диагностика анаэробной микрофлоры по продуктам метаболизма

Диагностика анаэробов по летучим продуктам метаболизма -наиболее распространенный и доступный метод медицинской диагностики с использованием газовой хроматографии. Продукты, образуемые анаэробами в процессе их жизнедеятельности

известны и используются для хемодифференпиании видов. Например, вид C.peгfгingens образует в результате ферментации субстрата масляную нрогшоновую и уксусную кислоты. Однако эти вещества продуцируют и другие виды клостридий, а также микроорганизмы других родов. Поэтому,для повышения специфичности диагностики анаэробной инфекции необходимо привлечение дополнительных признаков.

Изменение состава нелетучих метаболитов. В изучаемых пробах найдены кислоты, характерные для тканей животных в норме, а именно: молочная, фумаровая, яблочная, янтарная, бензойная оксимасляная и другие. В присутствии клостридий дополнительно обнаружены: 2-окси-2-метнлмаслянаи, 2-окси-2,3-мстилмасляная, 2-окси-2-мстилвалериановая, 10-оксистеарино-вая, 10-оксиоктадецсновая. В отдельных случаях наблюдались фе-нилпропионовая, оксифенилпропионовая, фенилмолочная, ок-сифенилмолочная, фенилуксусная и кетоизокапроноиая. Наблюдали увеличение содержания 2-оксимасляной кислоты п патологии по сравнению с нормой. В опытах на животных воспроизводимо по сравнению с нормой появлениеР-фенилэтиламина, изо-бутиламина и двух неизвестных аминов. В двенадцати опытах ' на животных, инфицированных С.регГппЕепя (6 животных), С.ЬуяЮ^'Псшп (2 животных), С.оес1ета11сп8 (2 животных), при . двух контрольных-, фенилэтиламин найден в пяти случаях, изо-бутиламин - в четырех, амин N1 - в четырех и амин N2-8 пяти. У контрольных животных амины не обнаружены. Летучие кислоты одинаковы во всех трех случаях - уксусная масляная и про-пионовая. Соотношение двух последних можно использовать для диагностики с разной степенью специфичности в зависимости от среды, в которой развиваются микроорганизмы. В искусственных средах, при инфицировании животных и при подращивании микроорганизмов из патологического материала соотношение пропионовой кислоты к масляной специфично для вызывающих гангрену клостридий вида СрсгГиг^епя и С.осскта^егю, и составляет величину 0,4-11 и 0,1-0,3 соответственно и отличается от видов С.яерИсит и С.ЫяМШсит, для которых она лежит в пределах 40-130. При газовой гангрене у людей соотношение этих кислот не меняется на фоне неклостридиальной инфекции. Их наличие в патологическом материале можно рассматривать лишь как повод для подозрения на заболевание ган-феной, так как пропионовая кислота обнаруживается в 27% слу-

чаев раневой инфекции, а заболевание газовой гангреной происходит лишь в 10% случаев. Для уточнения диагноза нужен дополнительный фактор. Таким дополнительным признаком, маркером заболевания, может быть наличие в тканях больных людей ¡0-оксикислот, которые зафиксированы нами впервые в продуктах метаболизма клостридий. Сами клетки клостридпй не содержат оксикислот. 10-оксистеариноваи и 10-оксиоктадецено-вая кислоты образуются в присутствии клостридий независимо от среды обитания. Следует отметит), при этом, что 10-окспкис-лоты С18 уносятся кровотоком из очага поражения, о чем свидетельствует их обнаружение в крови морских свинок при использовании метода МФ. Это дает возможное! ь проводить диагностику гангрены но анализу крови.

Проведенное нами исследование в целом показывает, что химические диагностические маркеры мпкрооркшизмов тесно связаны с их физиологией и биохимией и процессами взаимодействия с организмом хозяина. Возникновение инфекции приводит не только к физиологическим изменениям организма и вызывает реакцию его иммунной системы, которая обнаруживается с помощью соответствующих реакций, но одновременно отражается в составе биологических жидкостей организма. Как пока чано, эти изменения могут быть зафиксированы хроматографически-ми методами. Из литературных и приведенных здесь данных следует, что действие патогенных микроорганизмов обнаруживается но трем химическим проявлениям. Первое: собственные клеточные структурные и функциональные компоненты - жирные - кислоты, сахара, оксикисл'бты, токсины. Второе: продукты собственного метаболизма - ЛЖК, амины, дикарбоповые и окси-кислоты метаболических циклоп. Третье: продукты специфического взаимодействия с организмом-хозяином - в данном случае длнноцепочечные С18 и короткоцепочечные С4,С5 оксикнсло-ты. Можно полагать, что любое инфекционное заболевание обнаружит себя хотя бы в одном из этих проявлений и может быть выявлено хроматографическимп методами. Что касается химических признаков газовой гангрены, то ЛЖК и моноамины следует отнести к собственным продуктам метаболизма, поскольку они являются непременным признаком существования анаэробов вообще - по принципу дыхания и катаболизма, независимо от питательной среды. Дикарбоновые кислоты занимают, по-видимому, промежуточное положение: есть собственные, но до-

полняются и усиливаются новыми при паразитировании на клетках хозяина. Оксикислоты и диамины, по-видимому, следует отнести к третьему проявлению биохимических процессов при инфекции - деградации клеток ткани хозяина под действием ферментной системы возбудителя.

3.3. Химические профили и маркеры микроорганизмов в диагностике инфекции мочеполовой сферы

Вагинальный дисбиоз

Вагинальная микрофлора женщин, а также микроорганизмы уретры и спермы мужчин представляют собой определенное локальное сообщество. Участие в нем разнородных бактерий, простейших и внутриклеточных паразитов делает затруднительным анализ микрофлоры традиционными методами. Некоторые организмы медленно растут, другие требуют сложных искусственных сред, третьи не высеваются вообще, так как паразитируют внутри клеток макроорганизма.

С учетом особенностей химического состава данного микробного сообщества составлена программа контроля маркеров при ГХ-МС исследовании с таким расчетом, чтобы предотвратить наложение компонентов фона биологической жидкости. Для получения количественных данных разработан алгоритм вычислений с помощью электронных таблиц Microsoft Excel на персональном компьютере. В Табл. 3.2. приведен перечень определяемых микроорганизмов, вещество и ион масс-спектра, по которому контролируется каждый организм, а также расчетная формула, включающая площадь пика соответствующего иона и коэффициенты, учитывающие условия измерений и чувствительность. Учтен фон биологической жидкости и перекрывание маркеров в случае Propionibacterium, Fusobacterium, Pcptostreptococ-cus. Neisseria и Candida. Основное время анализа приходится на пробоподготовку (примерно 4 часа), анализ - 1час, измерение площадей нужных пиков на масс-фрагментограмме -1час. Всего б часов, в том числе приборное время - 2 часа. Ввод данных в подготовленную шаблонную таблицу Excel и расчет занимает 5-Юмин. В основном это ввод данных; результат в ячейках с формулами против названий организмов возникает мгновенно после

Таблица 3.2 Формулы для расчета микробного сообщества вагинальной жидкости и спермы

Na Род, вид Ai Формула

1 Clostridium perfringens A273/10M8 доач'вз

г BactaroWes fragiüs A17SW17 .0.25VS4

3 Bacillus Aa13+A13/87 • 1.3VB5

4 Stapiiyloccccus epidermidis А312Л19 .э.г-з'ВБ

5 Bifidobacterium A18:1a/Tl .0,55*s*B7

б Propionibacterium Ai 15/256 .(Ю'Вв-З.ГВбГЕ'О,^

7 Chlamidia trachomatis Ah22/175 ,0.6"s'B9

а Lactobacillus A19V310 2-s'Bio

9 Enterobacteriaceae h13/h14/17*=1/1/5 A17V282 .4VB11

10 Fusobacterium/Haemophyius Ah14/175 .(B12-0,2"B9)*0.13's

11 Peptostreptoccccus.if no hFA Aa15/256 (B13-1,35"B8)M,2*s

12 Neisseria goncrrtioae AM 2/175 .0,6*s*(B14-0(4*B21-0,2*B12)

13 Mycobacteria A10M18/312 ,4*s'B15

14 Candida albicans A17:1/282 :24V(B1S-0,irB25)

15 Nocardia asteroides АШМ1 .14VB17

16 Actinomyces Ai 16/87 ,0,16's'B18

17 Prevotela irielaninogenica Ahi15/175 ,0,3VB19

18 Capnocytophaga W15 .0,8's'B20

19 Pseudomonas Ah 10/175 ,1.2*S*B21

20 Flavobacterium Ai17:1/282 ,3,5*s*B22

21 id А2Ы15/285 ,0,2*S*B23

22 Myxococcus,Stlgmatella А2Ы17/313 .0,S"s*B24

23 17:0/284 AI 7:0/284

В хопошсе & через дробь указаны соответственно всшссгво и вон. иаощадь пика которого надо измени по иасс-фрамштограиие.

В колонке "Формула" (Вз+Вв) - концентрации Маркиных и фоновых веществ,используемых в расчете и сведении баланса; 5 - сумма параметров конкретней ссрии анализов.

ввода. Результаты анализа микрофлоры вагинальной жидкости пациентки Ф. до и после лечения и в сравнении с нормой приведены в табл.3,3 вместе с диаграммами, которые наглядно показывают соотношение числа клеток разных организмов и позволяют сразу увидеть ведущий организм микрофлоры.

Сперма представляет собой сложный объект для диагностики микроорганизмов из-за многовариантного ({юна, обусловленного липидами сперматозоидов и других клеточных элементов, секретов различных желез и неклеточных образований, а также свободных веществ нейтрального и кислого характера - метаболитов арахидо-новой кислоты и стероидных гормонов. Кроме того, она наименее инфицирована по сравнению с другими жидкостями организма человека. Состав спермы в целом хорошо изучен, однако в частности для данного рода анализа требуется сопоставление конкретных фракций (жирных кислот, альдегидов и оксикислот) спермы в норме и патологии. Поэтому для начала приведем пример анализа инфицированной спермы больного C.B. и здорового донора К. При сопоставительном анализе взяты три фракции: фракция свободных компонентов (водно-этанольная), гексановая фракция продуктов кислого метанолиза липидов и соответствующий ей остаток моносахаров. В свободной фракции (водно-этанольный экстракт) у инфицированного больного наблюдается снижение содержания пи-роглутаминовой кислоты, глутаминовой кислоты, лизина и дигид-роксифенилаланина. Резко уменьшается концентрация лимонной кислоты - более чем в 10 раз. В связанной фракции моносахаридов и аминокислот (фракции полисахаридов и гликопептидов - белок при этом режиме не гидролизуется) в пробе больного также отсутствуют те же аминокислоты, что и в свободной фракции. Кроме того, здесь обнаруживается существенное снижение инозита и де-оксиманнитола. По сравненю с нормой у больного выявлены окси-кислоты hi 13, hl3, hl4, hi 15, hal5, hil7 и hal7. С учетом деталей банка данных следует констатировать наличие Bacteroides fragilis как ведущего микроорганизма, так как его маркеры - hi 17 и hi7 -на порядок больше остальных оксикислот. Пики hi 15 и hal 5 в данном случае обусловлены B.melaninogenicus, h 14 - Fusobacterium, hi 13 принадлежит P.multophila, a h 13 связана с небольшим количеством грамотрицательных бактерий из семейства Enterobacteriaceae. После курса лечения больного метринидазолом, эффективным в отношении Bacteroides, при повторном анализе маркерные вещества бактерий этого рода уже не были обнаружены.

TuG.mu'.i 3.3.

■ ПРИМЕР

Результаты исследования видового состава микрофлоры вагинальной жидкости методом газовой хроматографии - мзсс-спектромвтрии. Проба УЯ~417. Ф-а. Повторный анализ.

Число клеток, t/мл

Мг Род. вид До .ucr M 3 После JWÍOUIJ

1 C'CStniliUTI resua ;oc.oo soaejo

Z 4310 0 0

7 вэс ; uc 115?iJO 10COO:) 2К5СП

11 MiJO :ocoo 6I51C0J

Í-V.-bííO-.J'ri ?'Л75 300-^0 d43?M

6 С i 0l 2J50;0

7 С"'~т г. я rrschr.rrst.£ 33900 0 6000

S "vBi'CO! 0

'Ó -''1".!гг.5.- rssnoc MCÍi'l ЭООС.О

C! 217Í5

I L- 0 960Í0

IT 53700 0 60

or-' 10C 0 720000

',4 Сз^с ¿a i:oao 0

1£ м.-к-.гп'л т. ' "У:ir. ICO J с 7COO,

1* Г -■"iWÍ'S icr.f^í) с 314140

pe¡?r ->.:«-«• -ис-э 1С »101 CÍ '-.."''"O

5 3J.) '■"1С i с с

i 0!

! Г С ;t;30l 'i! ГбКО

¡ Г1' ^ / огтег^": /¿"•с"" ate,la 0 0

Ir? rrarcescens 12:00 0¡ UC0

6СООСО

1I0C000

3 с

6 7 3 3 10 11 !2

16 17 !В

20 :i

72]

ДО ПЕЧЕНИЯ , _ _ ____________________

Но обнаружены. т.е. содержание не превышает 1000 |ЭТш^ГТГавторНу1йО>ёропвта, Candida. Mycobacteria.

[Ът. чсннь:к состав отличается от нормы повышенным содержанием Becillus, Staphylococcus, Actinomyces, а также наличием гонококка и хламидий. Сильно »анижоно гсдержзчие лзктобацилл.

ПОСЛЕ ЛЕЧЕНИЯ (подавление гонококки и хламидий)

На обнаружены, т.е. содержание не превышает 1000 кл'ил: Hacmophylus, Treponema, Candida, Nfeii^ena gonontioae.

По сравнению с предыдущим анопиаом на порядок уменьшилось количество хламидий. бацилл я энтеро&вктерий.

Актаимкровались и преобладают в микрофлоре микроскопические грибы, Сифидовбктерии, (мико бактерии), клостридии и Propionibactenum.

4. ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ ВИДОВ БАКТЕРИЙ ПО СОСТАВУ ЛИПИДНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КОМПОНЕНТОВ

При описании и таксономическом отнесении новых штаммов микроорганизмов используют методы тестирования, связанные с морфологическими, культурально-биохимическими, антигенными и другими свойствами бактерий. Существенными являются и химические признаки: наличие специфических биополимеров в клеточной стенке и мембране, тип белков, стерино-в, каротиноидов. Немаловажное значение в классификации микроорганизмов принимает в последнее время профиль жирных кислот и Сахаров, а также наличие маркерных веществ. Некоторые лаборатории создают или приобретают банки данных жир-нокислотных профилей микроорганизмов и используют их для предварительной идентификации выделенных штаммов с применением компьютера. Для освоения имеющихся методов распознавания бактерии по химическому составу и создания собственного банка данных мы пропели изучение ряда новых и известных штаммов архебактсрий, эксгремадыю-ьалофильных эу-бактерий, бацилл, СВГ>, клосгрилии, микроскопических грибов, дрожжей и других организмов. Идентифицированы компоненты, которые не были обнаружены ранее в микроорганизмах. Всего найдено около шестидесяти компонентов - дифитанилглинери-ды, сестертерпепы, скиалсны, глнкофосфаты, углеводороды и жирные кислоты. Этот раздел выполнен совместно с сотрудниками ИНМИ РАН Жилиной Т.Н., Эль-Регистан Г.И. Симань-ковой М.В., Коцюрбенко О.Р., Цаплиной H.A., Богдановой Т.И., Назиной Т.Н., Горленко В.М., Дубининой Г.А.

При изучении архебактсрий показано что изопреноилы и жирные кислоты входят в состав свободной, то есть не связанной в составе сложных липидоп, фракции. Дифитанилы глицерина соответствуют предполагаемой структуре и молекулярному весу, что подтверждено спектрами химической ионизации. В число изучаемых архебактсрий были включены два штамма Mcthano-bacterium tliermoautotrophicum (All) и Mcthanosarcina barken DSM-800, углеводородная часть лшшдного состава которых известна (Holzer, 1979). Сопоставление наших данных с литературными показывает, что по качественному и количественному составу они близки, что при определении в разных лабораториях взаимно подтверждает корректность полученных результатов.

В клетках представителей трех семейств, семи родов метаио-генных галофильных архебактерий обнаружен фосфоглицерог-люконолактон (ФГГЛ), который претендует на роль химического маркера этой группы микроорганизмов. Действительно, при последующих исследованиях галофилов родов На1оЬааеп-ит, На1ососсш, алкалофилов №1гопососсш и ЫаиопоЬасТепит, и метаногена рода МеИтапоИтх этот лактон не был найден. Предполагаемое строение вещества

0__О О

1 I II И о=с-снгсн-сн-снсн2-о-р-о-снгс-сн2он

I I I

он он он

основано на данных масс-спектрометрической фрагментации.

В промышленных мстановах реакторах метанообразующими бактериями обычно являются МеИтапо^тх - в термофильных условиях и МеПтпояагста - в мезофильных. В отличие от МаИ-апояагсша, МеИшпоМтх не содержит в своем составе изопренои-дов и ФГГЛ. Кроме того впервые в этом эксперименте установлено, что фитанилглицерины имеют семь вариантов, отличающихся, повидимому, разветвлениями в цепи и наличием двойных связей. Найден новый вид липида - фитолфитанилглицсри-д, отличающийся тем, что один из фитольных остатков глицери-да является терминальным диоксифтолом, один из гидрокси-лов которого участвует в образовании эфирной связи с глицерином, а другой свободен. Исследованы аналогичные экстракты галофильных архебактерий. В отличие от метанообразующих архебактерий галоалкалофилы (натропококки и патроиобактерии родов На1оЬас1спит, На1ососсш, ЫаПопососсик и МНгопоЬасСс-пит) содержат только бифиганильпые диглицериды в клеточной мембране. По сквалснам дифференциацию галофильных архебактерий провести не удастся: все они содержат сквалсн С30:6, дигидросквалсн С30:5 и тстрагидросквалсн С30:4.

Изучено восемь штаммов галофильных эубактерий, которые по сумме признаков определены как представители родов На1о-Ьас(его1<Зе5, На1отсо1а (новый род) и Асс1оЬа1оЬ1ит. При таксономическом отнесении новых видов использованы данные состава жирных кислот мембраны и клеточной стенки. Один из

них, Halobacteroi'des lacunaris - сахаролитический анаэробный экстремально галофильный организм был выделен in лаянного гинерсоленого озера Чокрак (Жилина,1991). При анализе липид-ных экстрактов из клеток штамма Z-7888 этой бактерии не было обнаружено скваленов, изопренов и дифитанильных глицероэ-фиров, характерных для архебактернй. Полученные экстракты содержали жирные простые и окси-кислоты, присущие мембранам и клеточным стенкам эубактерий. Состав ЖК использован также для таксономического изучения штаммов умеренно гало-фильной анаэробной сахаролитической бактерии (Zhi!ina,1992). В результате исследования бактерия была выделена в отдельный род Haloincola сем. Haloanaerobiaceae и названа H.saccharoiytica, Штаммы Z-7487, Z-7587, Z-"687, Z-7787 этой бактерии были выделены в процессе изучения сахлролитических галофильных анаэробов. Их объединяло несходство с представителями рода Halobactcroides. Таким образом, состав липидных компонентов подтверждает обоснованность выделения изученных штаммов бактерий в самостоятельный род Haloincola. В результате сопоставления коэффициентов корелляции компонентов липидного профиля мы пришли к выводу, что изученные восемь штаммов можно разделить на четыре группы ( Габ.4.1.)

Как видно, дифференциация по химическому составу близка, к классическому таксономическому отнесению. Штамм Z-7787 по нашим меркам выходит за пределы межвидовых отличий, но это не прецедент. Род Bacteroitles, гетерогенный вообще и по

Таблица 4.1.

Хемодифференциация и таксономическое отнесение штаммов галофильных эубактерий

Группа по ЖК составу Штзик Таксономическое отнесение

1 2.-1 т Haloincola saccharolytica

2 Z-7487 Z-7587 Z-7687 Haloincola saccharolytica

3 £-7287 Z-7J87 7.-1 т Halobactcroides halobius Вид,? Halobactcroides lacunaris

. 4 Z-7288 Acetohalobium arabaticum

химическому составу в частности, не так давно был поделен на три рода. При этом новая классификация в большей степени кореллирует с химическими признаками отдельных видов.

Состав липидных компонентов был использован для описания выделеного из болота нового психроактиииого анаэробного руминикокка, штамм Z-7189. В составе экстрактов клеточных лнпидов этого штамма найдены жирные кислоты, альдегиды и оксикислоты. По качественному набору образуемых продуктов, за исключением сукцината, а также по профилю клеточных жирных кислот и альдегидов штамм оказался близок с видами рода Bifidobacterium, выделенными из рубца. С другой стороны, по сг.оим геномным и морфо-фг.зиологическим характеристикам выделенный шгамм имеет сходство с некоторыми видами Runii-nococtus. По сумме признаков, оптимальным был признан вариант выделения его в самостоятельный вид, названный по месту выделения Ruminococcus palustrus (Жилина, 1995).

Исследованная группа нсихрофильпы.ч анеччненов представляет дройкий научный и практический интерес. С одной стороны как ниихршкьшкыс оркшизмм, оола.чаницие способноегыо расти в широком интервале температур, а с другой • как важная группа микроорганизмов метаноюнных сообществ, способных работать при температуре окружающей среды. Общими признаками асстогсиов чвдяется прежде всего большое количество альдегидов, происходящих ну алк-Ьснилммлх радикалов плазме-лсд ела, причем длл видов A.bak» и A.'unetam'.m пальмитиновый альдегид явтяется основным в профиле. Второй особенностью является разнообразие моиинсписишснкмх кислит и альдегидов, особенно у A.fimctarium, содержащем в клетках Д9 и All изомеры тстрлдсценовои кислоты и соответствующего альдегида. К настоящему времени известно немного родов микроорганизмов, имеющих в составе мембраны плазмологен. Ни один, из них не имеет профилей, подобных представленным здесь ацстогсиам. Поэтому не случайно они определены в самостоятельный род.

Анализ лнпидов штамма Z-2189, определенном впоследствии как Clostridium fimetarium, показал присутствие жирных кислот с четным числом атомов углерода от 14 до 18. Отличительной особенностью является наличие мононенасыщенных reксадеценовых кислот С16:1 с двойными связями в положениях Д7, Д9 и All. Установлено присутствие нормальных альдегидов С14, С16

и С18 и мононенасыщенных С16:1 и С18:1 с положением связей Д7 и Д9. Согласно действующей таксономической классификации, штамм Z-2189 был отнесен к роду Clostridium. В дополнение липидпый состав его клеточной стенки оказался близким к ли-пидному составу C.butiricum, типовому виду этого рода (Johnston, 1983).

Методом ГХ-МС изучена умеренно термофильная бактерия Suifobacillus thermosulfidooxydans ВКМ В-1269. Обнаружено, что состав жирных кислот трех исследованных культур - спорообра-зующей, аспорогенной и термоголсрантной - имеет обшие принципиальные признаки. При всех условиях выращивания в профиле жирных кислот присутствуют 11 одинаковых компонентов. Основными веществами являются циоогексаиовые кислоты (ЦГК). Все бактерии способны их синтезировать и в большинстве случаев на их долю приходится более половины всех клеточных жирных кислот. ю-Циклогсксаповые кислоты - это алифатические кислоты, имеющие пиклогексанпвое кольпо на конце углеводородной части молекулы. Такие кислоты ранее были обнаружены в клетках двух термоацидофильных бактерий: Bacillus (Alicyclobacillus) acidocaklarius, Bacillus (Alicyclobacillus) acidoter-restris и обитающей в обычных температурных условиях при нейтральном pl 1 бактерии Curtobacterium piisillum. В и ¡ученных нами штаммах сульфобацилл, так же как и у вышеназванных бактерий, найдены -циклогексилундекановая и -никлогексилтриде-кановая кислоты, которые являются основными в профиле. Однако в отличие от известных видов клетки сулы|)обанилл содержат в гетеротрофных условиях -циклогексилдодскановую кис-доту, а также не известную ранее пиклогсксановую 2-оксикис-лоту с 17 атомами углерода: ю-цикло1сксил-2-оксиундекановую.

По-видимому, накопление в клеточных мембранах -никло-гексановых кислот у разных но условиям оби танин бактерий отражает в большей мерс многообразие биосиптстичсскпх механизмов клетки и их гибкость. Можно творить о том, что сшгтез со-ЦГК. характерен для бактерий, система синтеза которых производит разветвленные жирные кислоты, т.е. действует через ацил-СоА. Ферменты этого пути синтеза обладают низкой активностью по сравнению с наиболее распространенной схемой получения нормальных кислот через ацетил-СоА. Вероятно, в связи с отсутствием у S.thermosulfidooxydans видимой активности пиру-ватдегидрогеназы, синтез ацстил-СоА затруднен. Соотношение

скоростей реакций с ацил-СоА и с ацегил-СоА оценивается как 1/50. Поэтому существенными в развитии такого рола бактерий становятся факторы температуры и катализа. Последнее можно предполагать и в нашем случае, когда в зависимости от источника энергии ( ионов железа, сера или органических веществ), возможно, меняется активность ферментной системы липндпого синтеза.

Уникальный жирнокислотный состав липидов сульфобацилл, включающий маркерные жирные кислоты, может служить в качестве одного из хемотаксономических признаков и подтверждает правомочность их выделения в отдельную группу бацилл. Именно липидный состав, включающий ю-ииклогексановые кислоты, вместе с необычной последовательностью нуклеотидов 163 рРНК, послужили основанием для реклассификации гетеротрофных аци-дотермофильных бацилл (B.acidocaldarius и др.) в новый род АИ-сус!оЬаа11ия.

На примере 5.111епио$и1Гк1оох>ч.1аш продемонстрированы возможности, которые представляет липидный профиль для выявления биохимических и физиологических особенностей новых штаммов микроорганизмов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

МЕТОДОЛОГИЯ ХЕМОДИАГНОСТИКИ

МИКРООРГАНИЗМОВ

В связи с тем, что работа в целом единая в методическом подходе является разноплановой в практическом приложении, вряд ли будет оправданным совместное обсуждение, например, вагинального дисбиоза и особенностей консорциума микроорганизмов в метаптенке. Поэтому заключения по конкретным направлениям исследований оставлены при соответствующих главах, а в общее заключение вынесено теоретическое обобщение литературных и собственных данных по предмету исследования в виде методологии хемодиагностики микроорганизмов. Последнее включает совокупность приемов для обнаружения, идентификации и определения численности микроорганишов по их химическим признакам независимо от их физиологических особенностей и характера их экологической ниши.

!. Методология идентификации микроорганизмов по химическим признакам

Жирнокислотный состав особенно специфичен, если он дополнен оксикислотами и другими липидными компонентами - альдегидами, углеводородами, стсринами, которые методически, как правило, экстрагируют вместе с алифатическими жирными кислотами в органической фракции. Вообще для хемо-дифферепциации используют в разных случаях широкий набор клеточных веществ - липидов, Сахаров, белков, летучих метаболитов, - которые в совокупности, очевидно, могут однозначно определять вид микроорганизмов при всем их многообразии в природе. Однако, практически трудно, даже нереально получить полный или близкий к полному химический состав конкретной пробы микроорганизмов.

В связи с этим следует отметить первый аспект хемодиагностики; как способа определения вида микроорганизмов по их химическим признакам, который заключается в следующем: в каждой реальной ситуации существует необходимый и достаточ-

ный набор химических компонентов микроорганизмов, но которому может быть установлен их вид.

В каждом конкретном случае мы имеем дело с конечным числом видов микроорганизмов и определенной химической и биологической ситуацией окружающей среды. Например, в организме млекопитающих не может быть микробов, обитающих в соленых озерах или горячих источники. паи нефтяных скважинах и т.д. Сообщества микрооргани !мо;; различны у животных и человека, различны в разных органах. Можно ограничить круг возможных микроорганизмов и ятя любой биотехнологической-задачи. Например, в такой сложной системе, как метантепк, можно определить довольно строго труппы работающих микробов. Во-первых, круг их сразу ограничивается тем, что все они -анаэробы, а далее они делятся на группы г идролитических, сип-трофных и метанообразующих микроорганизмов, для каждой из которых можно назвать предположительный состав по родам, видам и лр\гим таксономическим рангам.

Конечно, есть сложные стучаи, когда в одной ассоциации могут присутствовать бактерии разных родов с казалось бы близкими профилями. Например, обширная ассоциация бактерий полости рта, для которой мы нашли в литерат уре данные по 33 родам микроорганизмов, содержит представители с разветвленными жирными кислотами; Сирг.осу/орка.ца, ПоШа, 1\'<каг-сИа, РгорютЫ:аспит. Ис;а1шх, Баасга'к'.сх. По при ближайшем рассмотрен1, 5и они также не создают опасности перекрестною определения, т.к. часть из них анаэробы и при локальном отборе не попадут в одну ассоциацию, СарпосушрНа^а и Вас!сго;с1с.% - гра-мотрицатслыш и имеют специфику в оксикнслогпу и, нагажен, если два рода из перечисленных имеют вероятность вс третит ься в одной пробе, то у них есть отличительные признаки. Например, бациллы имеют изо- и антензо С13 кислоты, а пропноно-бактсрии - не'г, нокардин имеют изопальмитиповую кислоту, а у Шю11иа только аитсизокислоты (изо-кислот нет). Определение рода бактерий с такими различиями в профиле жирных кислот при анализе чистой культуры предстаетясгея возможным.

Таким образом, второй аспект хемодиапгостики заключается в том, что микроорганизмы дифференцированы по трофическим признакам и условиям среды обитания и поэтому при ограниченном числе возможных таксономических единиц в каждом конкретном случае обеспечивается возможность их обнаружения и

идентификации по химическим признакам.

Третий методологический аспект состоит в том, что сопоставление профилей химических компонентов микроорганизмов должно производиться с помощью компьютера по методу распо-зповаиия образов, поскольку все другие способы, начиная с внешнего сопоставления типа "похож или не похож" и кончая сопоставительными прописями и диагностическими матрицами в конечном счете субъективны и кроме того не дают количественной характеристики соответствия стандарту. Эта техника в настоящее время все чаше используются при идентификации микроорганизмов. Как показывают приведенные в работе данные, метод распознавания образов, которыми являются химические состав!.! микроорганизмов, позволяет проводит!, их правильную идентификацию независимо, в определенных пределах, от фазы роста, условий культивирования, способа определения состава и лаборатории, в которой оно производилось. Таким образом, этот аспект хемолиагностики утверждает возможность ее реализации при использовании ЭВМ, что обеспечивает быстрое и объективное определение вида данного микроорганизма независимо от его возраста и происхождения при ре;шизации межлабораторной воспроизводимости.

По профилю штаммы одною вида, как правило, не отличаются друг от друга, а по отдельным химическим компонентам (одному или нескольким) могут отличаться от других представителей вида. Может создаться впечатление, что рахтичие между некоторыми штаммами выходят за пределы видовых, и это ставит под сомнение систему дифференциации по химсоставу. Однако, в такой спорной ситуации можно предположить, что небольшие штаммовые изменения, накапливаясь, переводят организм после преодоления определенных качественных и количественных барьеров на другой видовой уровень. В этом может заключаться одно из перефирийпых молекулярных проявлений эволюции видов микроорганизмов. Иначе говоря, если и таксоны высокого ранга являются дискретным выражением классификации микроорганизмов и под"еркивают их отличия, то изменения на шгаммовом уровне отражают их биологическое родство и наличие непрерывного молекулярного штаммово-видового биологического континуума. Отсюда вытекает еще один важный аспект хемодиагностики микроорганизмов, четвертый по нашему счету, заключающейся в том, что возможные перекрестные

определения при хемодиапюстике на видовом уровне не являются дефектом метода (если его техническая сторона выполнена корректно), а отражают непрерывность перехода качественных и количественных химических признаков микроорганизмов в физиологические и общебиологические признаки.

II. Методология хемодиагностики инфекционных заболеваний

Деятельность патогенного микроба в организме хозяина многообразна по своим биохимическим проявлениям. С момента попадания в организм человека или животного микроорганизмы выделяют специфические по химическому строению антшены, токсины, метаболиты своих жизненных циклов, а также изменяют профиль метаболитов хозяина. Вирусы, кроме того, оказывают специфическое, присущее им одним воздействие на клетку - вмешиваются в процесс передачи информации о синтезе биологических макромолекул. Под действием вирусной нуклеиновой кислоты генетический аппарат клетки не только инициирует производство вирионов, но и запускает механизм синтеза ингибиторов собственных жизненно-важных процессов, что приводит к изменению химического состава тканей и биологических жидкостей организма.

Из сказанного выше следует, что при поиске хсмодиаг-ностичсских маркеров инфекционного процесса надо обратить внимание на химические компоненты самих микрдорганиз-" мов, которые могут попасть в диагностируемую биологическую жидкость, их собственные метаболиты и возможные продукты измененного в результате инфекции состава тканей и биологических жидкостей организма-хозяина.

Каждый возбудитель имеет свои характерные особенности в составе жирных кислот и моносахаридов. Микроорганизмы можно специфически диагностировать в чистой культуре но профилю фракции компонентов в целом, распознавая его по образу. Однако обший профиль клеточных компонентов микроба ранее не использовали для диагностики без выделения его из очагов локализации в чистом виде. Сами клетки микроорганизмов-возбудителей редко попадают в удобные для исследования жидкости -кровь или мочу. Но один вид клеточных компонентов попадает в них в силу своего функционального назначения. Это антигены

и токсины. Общепринята диагностика инфекционных заболеваний но реакции антиген-антитело в крови. Поскольку такая реакция существует, то значит в крови присутствует антиген с его химическими проявлениями. Наиболее известны антигены грамотрицательных бактерий. Это липополисахарнды (ЛПС), имеющие в составе полисахарида сахара, а в составе лииида Л жирные оксикислоты, специфичные для определенных таксономических групп микроорганизмов. В нашей работе показано, что эти компоненты могут быть обнаружены в крови животных и людей при использовании хромато-масс-спектро-метрии. У людей с сальмонеллезом по мере заболевания растет содержание в крови р-оксимиристиновой кислоты, а у животных больных бруцеллезом, увеличивается доля характерной для антигена бруцелл р-окси-пальмитнновой кислоты. Способ хе-модиагностики по компонентам антигена хорош, поскольку он теоретически обоснован - отражает существо физиологии и биохимии воздействия микроорганизма-возбудителя и организма хозяина.

Вторым из перечисленных выше способов хсмодиагностики является обнаружение в биологических жидкостях метаболитов, специфичных для данного организма. Методология поиска маркеров в этой области химических составляющих основывается на общих закономерностях клеточных циклов и их специфических особенностях для данного возбудителя. Наиболее известна и развита диагностика по летучим, кислым и нейтральным, а также основным продуктом метаболизма. Диагностика скрытых анаэробных процессов в организме человека может быть проведена и но анализу летучих метаболитов в крови. При тяжелых состояниях их удается обнаружить методом хромато-масс-снектрометрии по селективным ионам. Этот анализ даст возможность судить о характере анаэробного процесса и близости организма к септическому состоянию. Кроме летучих жирных кислот в крови пациентов в таких случаях наблюдаются крезо-лы и другие фенольные соединения. По известным конечным метаболитам проведена диагностика клостридиальной инфекции, бактероидов и фузобактерий в очагах их жизнедеятельности, а при использовании чувствительных методов - в крови больных людей и животных. Это два из трех источников маркеров микроорганизмов при диагностике инфекционных заболеваний, о которых говорилось выше. Третий источник - продукты изме-

нения метаболизма клеток организма - хозяина под действием возбудителя. Так, обнаружение при ряде инфекций изменений в составе стеринов относится к нарушению метаболических процессов синтеза и функционирование гормонов под действием возбудителя. Образование длиноцепочных дикарбоновых кислот может быть связано с нарушением процесса р-окислсния жирных кислот и его замену на а-окисление, а появление корот-коцепочечной днкарбоновой яблочной кислоты - с нарушением цикла Кребса в результате подавления деятельности сукцинат-дегнлрогеназы. Для выявления маркеров, связанных с нарушением нормального клеточного метаболизма, разработано ранее, а также предложено нами ряд методических приемов.

Нами показана эффективность метода компьютеризованной хром;.то-масс-спектрометрии в поиске маркеров, содержащихся в малых количествах в биологических жидкостях пли замаскированных их основными компонентами. С помощью штатных программ нповодят реконструирование масс-спектров, записанных з процессе хроматографирования пробы, и получают масс-хроматограммы экстрактов биологических жидкостей по селективным нонам или целым участкам масс-спектра. При этом алгоритм поиска состоит в следующем: из поиска исключают характерные сильные ионы основных компонентов изучаемой биологической жидкости, тем самым добиваясь устранения их из профиля. Используя известные сведения о биохимических изменениях при изучаемой инфекции, прогнозируют возможные классы веществ, среди которых могут быть маркеры, и проводят скрининг массива записанных при хроматограф гро-вании пробы масс-спектров гго специфическим ионам этих классов веществ. Если такое прогнозирование сделать не удастся, нетрудно в рамках этого метода провести с номощзыо ЭВМ скрининг по всем возможным группам веществ, в которых вообще бывают маркеры инфекционных заболеваний. Например, поок-сикислотам, спиртам, аминосачарам, летучим жирным кислотам, альдегидам и т.д. Если эм не даст результата, проводят последовательное реконструирование хроматограммы по участкам масс-спектра в 20-50 массовых единиц гго всему диапазону масс, выявляют диапазон, где есть изменения по сравнсни-ю с контролем и выявляют с помощью известных в масс-спскт-ромстрни приемов вещества, с которыми эти изменения связаны. Этот процесс нетрудно автоматизировать, запрограмировав

все тестовые наборы попов и алгоритм скрининга. Наконец, маркеры могут быть определены при просмотре данных по химическому составу биологической жидкости на основе списка традиционных веществ, не входящих в число синтезируемых клетками млекопитающих в норме. Это, аминосахара, оксикислоты, арабит, альдогептозы, дидеоксис&чара, оксикислоты, метилразвет-вленные кислоты, некоторые нечетные кислоты, полиеновые и кето-производные холестерина, летучие жирные кислоты, спирты, некоторые альдегиды.

III. Методология изучения структуры микробных сообществ

В отличие от чистых культур видовая дифференциация в сообществе требует двух постулатов. Первый предполагает, что химический состав микроорганизмов сообщества соответствует таковому в чистой культуре при выращивании на искусственной среде. Второй, очевидный, состоит в том, что химический состав суммарной биомассы сообщества есть суперпозиция составов входящих в него микроорганизмов. Задача выделения профилей химических составляющих отдельных вило» микроорганизмов из известного состава суммарной биомассы, как показано в данной работе, имеет решение. Отметим некоторые обстоятельства, важные в методологическом отношении.

Первое. Выбор тактики анализа в зависимости от его цели.

> Анализ широкого диапазона концентраций микроорганизмов требует двойного исследования: во-первых общего профиля компонентов при непрерывном сканировании, и во-вторых - анализа минорных компонентов методом селективных ионов. При таком подходе диапазон измерений числа клеток в пробе составит шесть порядков: от lO* до 10ш клеток.

> Если требуется контроль отдельных видов микроорганизмов - задача упрощается. Можно сделать программу поиска и измерения определенных маркерных веществ для определения концентрации искомых организмов.

> Если присутствуют клеточные компоненты среды обитания (например биологическая жидкость организма-хозяина при инфекционном процессе), то фон.учитывается введением в уравнение данных по клеткам среды и учетом

их как равноправного члена сообщества, или ориентироваться на метод МФ и поиск маркеров в программе, которая игнорирует интенсивные пики фона.

Второе. Следует стремиться ограничить локальный банк данных по химическому составу чистых культур микроорганизмов только теми представителями, которые действительно могут быть в данном сообществе.

Третье. Алгоритм расчета должен включать кроме рабочих уравнений дополнительные уравнения для наведения материального баланса по наиболее интенсивным кикам хроматограммы, относящимся, как правило, к наиболее распространенным веществам в клетках микроорганизмов.

Четвертое. Хроматограмма должна быть снята таким образом, чтобы зафиксировать необходимые для решения конкретной задачи вещества. Это п веществ, которые входят в п уравнений для расчета целевых веществ и несколько веществ для оптимизации вычислений и баланса.

Практика конкретных анализов показывает, что все это можно сделать на хроматографе без масс-спектрометра, используя обычные в хроматографии приемы: смену колонок, разные летучие производные, фракционирование и очистку пробы от метающих фоновых веществ.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Сформулированы принципы методологии хемодиагностики микроорганизмов и их сообществ, проведено обоснование возможности дифференциального определения рода (вида) микроорганизма в чистой культуре и сообществе, исходя из постулата ограниченности видового разнообразия организмов определенной экологической ниши или технологического консорциума.

2. Разработана собственная версия процесса компьютерной идентификации микроорганизмов при повышении его специфичности путем введение и банк данных и программу поиска новых соединений из ряда оксикислот и альдегидов и применения эффективного алгоритма. Показана достаточность используемого в банке данных списка веществ для идентификации

бактерии до вида с использованием машинного поиска пли с помощью определителя вручную.

3. Выполнена основная задача исследования: разработка теории и осуществление практики экспрессного анализа родового (видового) состава сообществ микроорганизмов по данным химического состава суммарной биомассы (без выделения чистых культур) с использованием маркерных веществ и методом анализа суперпозиции профилей жирных кислот, ок-сикислот и альдегидов. Получено положительное решение о выдаче патента Российской Федерации на способ.

4. Показана возможность контроля процесса нитрификации по концентрации клеток бактерий рода Nitrobacter и денитри-фикации по количеству Pseudomonas stutzeri в составе активного ила. Их концентрации в составе биомассы ила могут быть определены по маркерным веществам экспрессно в течение нескольких часов на хроматографе с капиллярной колонкой.

5. Процедура определения полного состава сообщества занимает двое суток на три пробы биомассы сообщества. Показана возможность мониторинга практически любого микроорганизма в его составе. Обнаружен ряд метаболитов в биомассе и субстрате, но которым можно осуществлять контроль физиологическою состояния сообщества. Показана возможность определения живых клеток и соотношения живых и мертвых клеток ("теней") грамотрицательных микроорганизмов.

6. Показана возможность экспрессного определения функционально значимых микроорганизмов метаногенных сообществ, в том числе гранул UASß-реакторов. Определено количество и видовой состав метаногенных, целлюлолитических, гомоа-цетатпых, и других групп бактерий.

7. Повышена специфичность диагностики анаэробной инфекции по метаболитам за счет включения в число определяемых веществ короткоцепочечных дикарбонопых, окси- и кето-кис-лот и других метаболитов возбудителя и продуктов его взаимодействия с клетками организма-хозяина.

8. Усовершенствован метод маркера путем трансформации его в метод коллективного маркера, что позволяет обеспечить селективность определения возбудителя в реальных инфекционных сообществах на фоне нормальной микрофлоры и компонентов биологической жидкости.

9. Практически осуществлено определение малых концентраций клеток микроорганизмов (КРкл/мл) на преобладающем фоне биологической жидкости (до 104крат) при одновременном количественном детектировании более двадцати микроорганизмов сообщества.

Ю.Идсшификация микроорганизмов по профилю жирных кислот, оксикислот и альдегидов является универсальным методом, одинаково эффективным как для аэробных, так и для анаэробных, быстро или медленно растущих, образующих или не образующих споры микроорганизмов.

11.Его универсальность оказывается преимуществом в сопоставлении с методом ДНК-ДНК гибридизации и ампликации гена, так как изложенный здесь метод не нуждается в постоянном исполыованнн реперных ДНК всех определяемых организмов и ферментных меток. Кроме того, он превосходит конкурирующий метод в экспрессности и возможное! и проведения количественного анализа.

12.В настоящее время для проведения анализа требуется примерно 3 часа на I образец, или 7 часов нл »с5н.:о из 5 проб, тогда как бактериологическое исследование занимает , как минимум, сутки.

13.Наличие 10-окснкислотс восемнадцатью атомами углерода в очаге анаэробной инфекции является специфическим признаком кдос.филиальной иифекпии. И» способ диагностики по этому признаку получен патент Российской Федерации.

И.Соогношение оксикислот ЛПС клеточной сгепки и компонентов фосфолипида дает возможность оценивать соотношение живых и мертвых грамотрицагельных микроорганизмов.

15.Профили липидных компонентов вновь выделенных, штаммов позволяют определить положение микроорганизма в схеме классификации бактерий или определить родственные виды при его таксономическом отнесении.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Осипов Г.А. Шабанова Е.А. Морозов О.В. Эль-Регистр и Г. И. и др. //Липи-ды Methanosarc'ma vacuolata и Methanococcus halophylus.// Микробиология.-1984.-Т.53.-С.633-638./6/

2. Осипов Г.А. Жилина Т.Н. Кохюва Д.Н. Эль-Рсгнстан Г.И.// Распознавание образов архсблктерий по липшшому профилю.// В сб. Архебактерии. Пу-ЩШЮ.-1988.-. 126-134.

3. Эль-Регистаи Г.И. Дуда В.И. Осипов Г.А. и др./Способ хранения микроорганизмов. //Авт.свид.СССР №1412287 AI, C12N 1/4, C12R 1:00, заяв-л.19.12.86. опубл.22.03.88.//

4. Жилина Т.Н. Мирошникова Л.В. Осипов Г.А. Заварзин Г.А. // Halobader-oides lacunaris sp.nov новая сахаролитическая анаэробная экстремально-га-лофильная бактерия из птерсоленого озера Чокрак. // Микробиология. -

1991.-T.60.-C.704-714.

5. Осипов Г.А. Недорезова Т.П. Ходорковская В А. Свидин Ю. В//Разработка экспресс-системы анализа состава сложных микробных сообществ с использованием масс-спектромстрических методов.// Отчет о выполнении НИР по ГНТП "Экология России",-1992,-Проект №7.8.4./156/

6. Осипов Г.А. Назина Т.Н. Иванова А.И. Изучение видового состава микробного сообщества заводняемого нефтяного пласта методом хромато-масс-спсктро-метрии.// Микробиология.-1994.-Т.63.-Вып.5.-С.876-882.

7. Осипов Г.А. Шабанова Е.А. Бабайцсва В.А. Недорезова Т.П. Ходорковская В.А. Истратов В.Г., Сергеева Т.И. Чирикооа Е.В. // Способ диагностики клостри-диалыгой анаэробной газовой инфекции.// Патент РФ №2021608 ioi.GOIN 33/50.- Зарегистрировано в гос.ресстрс 15.10.94.- Бюл.№19.

8. Осипов Г.А. Демина А.М.//Хромато-масс-спсктрометрическое обнаружение микро-оргпнизмов в анаэробных инфекционных процессах. //Вестник РАМН. -1996.-№!.//

9. Осипов Г.А. // Способ определения родового (видового) состава ассоциации микроорганизмов. //Положительное решение ВНИИГПЭ о выдаче патента РФ по заявке №057595/13 от 24.12.93.

10. ZhilinaT.N. Zav.'ir/.in O.A. Bulygina E.S. Kcvbrin V.V. Osipov G.A. Chumakov K.M. // Ecology, physiology and taxonomic studies on a new taxon of Haloa-naerobiaccac, Haloincola saccharolytica gen. nov., sp. nov. // Syst.Appl.Microbio!.-

1992,-Vol. 15.-P.275-284.

11. Kotzyurbenko O.R. Simankova M.V. Nozhevnikova A.N. Zhilina T.N. Bolotina N.P. Lyscnko A.M.Osipov G.A.//New species of psychrophilic acctogens: Ac-etobactcrium bakii sp. nov., A.paludosum sp. nov., A.fimetarium sp.nov.//

Arch.Microbiol-1995.-Vol. 163.Р.29-34.

12. Тснцова A.II. Брапшцена Jl.M. Осипов Г.Л. it др.//СиосоГ> получения лсцитииовых производных нростаглапдипо»// Авт.свид.СССР №1264426 А, Л61К37/22. Заявл.ЗО. 12.83. Выдано 15.0b.fib.

13. Белова М.В. Осипов Г.Л. Устьшюк Т.К. Брапищева Л.М.// Получение и исследование фосфолипидов, этерифицироваиных простаглакдинами // Фармация.-19S4.-T.XXXUl.-№5.-С.25-28

'14. Иевлева II.Р. Белова М.В. Осипоп Г.Л. Праги и цепа Л.М.//Устойчнрость липидов гриба Fusarium sambucinum против окисления в процессе хранения// Микология н фитопатология.-1984.-N96.-C.474-478.

15. Изотоп Б.Н. Бурыкина Т.П. Па&чик А.Н. Осипов Г.А. //Сравнительная характеристика сорбционной способности сополимеров стирола и дпвииилбензола по отношению к морфину, фенобарбиталу и фепазспаму./ / Сб.: Современные проблемы допипг-коитроля в спорте. -М.1985.

16. Эль-Рогнстаи Г.И. Спеглкчнии В.А. и др.//0 химической природе авторегулятор и о го фактора d, Pseudomonas carboxydoflava// Микробиология.-1985.-Т.54.-Иып.2

17. Бондарь F.. Осипов Г А. Куулик М.//"Гетра- и пентациклическис углеводороды п битумоидс ropxvtcro слаипп красам (IIP Болгария)// Известия Ali ЭССР.-!986.-Т.35.-№4.

■ 18. Главки Г.Г. Крыло» Ю.А. Осипов Г.А. и др.//Прммснснис насадоччых и капиллярных колонок для хромато-масс-спектромегричсс-кой идентификации микропримесе1'|//Журн.шгал!1т.хнм1ш.-1981. №5

19. Помаззноч B.il. Осипов I.A. Шаба нона ЕЛ. Демина A.M. Зль-Рсгистан Г.И.//О возможности использования мог.осзхзридиого состава бактерий для их иденшфнклции// Микробиология.-i-Т.jЛ-Ш.ш.1.-С. 107-113.

20. Миронов В.Л. Гуссва-Донская Т.Н. Осипов Г.Л и др.// Химический со-cr.m и биологическая активность экс!рактоп из компонентов пдздоп облепихи// Хим.фарм.журнал,-1989.-№ 11. -1357-1364.

21. Бабусенко B.C. Эль-Рсгистан Г.И. Грздова Г.Ь. Осипов Г.А. //Исследование мембраиотропных ауторегуляториых факторов мстаноокисляющих бак-тсри»// Успехи химии.-1991.-Т.60. - 1)ьш. 11.-С.2362-2373.

22. Кспбрин В.В. Дубинин A.B. Осипов Г.А. //Осморсгуляция у морской циа-нобактсрии Microcolcuschtltonoplastcs.// Микробиодошя.-1991.-Т.60.-Вып.4.-С.596-600.

23. Бабусенко Е.С. Эль-Рсгистаи Г.И. Осипов Г.А. и лр.//Изучение влияния внеклеточных метаболитов на развитие метапоокисляющей бактерии Metli-ylococcus capsulatus //Прикл.биохпм.микроб.-1992.-Т.28.-Вып.5.-С.752-759,

24. Осипов Г.А. //Определение состава микробных ассоциаций в экологии, биотехнологии и медицине с использованием хромато-масс-спсктромст-

рии// Peak.Hewlett-Packard, (на рус.яз.).-1993.-№2.-С. i I-13

25. Осипов Г.А. Нсдорсзова Т.П. Демина A.M. и др.//Хромато-масс-спектро-мет-рическое изучение химических веществ, обуслашшвагощих запахи водопроводной воды// Peak. Hewlett-Packard, (на рус.яз.).-1994.-№5.-С.5-8.

26. Жилина Т.Н. Кощорбенко О.Р. Осипов Г.А. Кострпкина H.A. Запарзин Г.А.// Ruminococcus pahistrus sp.nov. - психроактивный анаэробный организм из болота.// Микробиология. 1995. В печати.

27. Ежова И.П. Осипов Г.А. Куликов Г.В. Липинский А.И.// Гель для ног с дезодорирующим и фунгицидным действием// Положительное решение ВНИИГПЭ о выдаче патента РФ по заявке №012222/14 от 25.02.94.

28. Ежова И.П. Осипов Г.А. Куликов Г.В. Липинский А.И.//Косметический гель для ухода за кожей // Положительное решение ВНИИГПЭ о выдаче патента РФ по заявке №012223/14 от 27.01.95.

Информация о работе

Осипов, Георгий Андреевич
доктора биологических наук
Москва, 1995
ВАК 03.00.07

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Хромато-масс-спектрометрическое исследование микроорганизмов и их сообществ ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Хромато-масс-спектрометрическое исследование микроорганизмов и их сообществ"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Хромато-масс-спектрометрическое исследование микроорганизмов и их сообществ
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология