Идентификация новых потенциальных генов-супрессоров опухолевого роста, метилированных при раке предстательной железы

Ибрагимова, Ильсия Ильясовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация новых потенциальных генов-супрессоров опухолевого роста, метилированных при раке предстательной железы
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Идентификация новых потенциальных генов-супрессоров опухолевого роста, метилированных при раке предстательной железы"

На правах рукописи

Л ■---

□□3448318

Ибрагимова Ильсия Ильясовна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВЫХ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ГЕНОВ-СУПРЕССОРОВ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА, МЕТИЛИРОВАННЫХ ПРИ РАКЕ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

03.00.04-биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2008 1 6 ОПТ 200В

003448318

Работа выполнена на кафедре биохимии ГОУВПО «Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина»

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Фаттахова Альфия Нурлимановна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Лобкарев Олег Александрович (доцент кафедры урологии и нефрологии Казанской государственной медицинской академии, г. Казань)

кандидат биологических наук Сатарова Лилия Ирековна (врач высшей категории межрегионального клинико-диагностического центра, г. Казань)

Ведущая организации: Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН

Защита состоится «30» октября 2008г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, Казань, ул. Кремлевская, д. 18, ауд.209.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И.Лобачевского Казанского государственного университета

Автореферат разослан «27» сентября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Абрамова З.И.

Посвящается памяти моего научного руководителя, безвременно ушедшего из жизни, Аскаровой Алъфии Наримановны, а также памяти профессора Винтера Виктора Георгиевича

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Рак предстательный железы является одной из главной причин смертности среди мужчин от злокачественных новообразований. В последние годы наблюдается значительный рост данного заболевания. В США рак предстательной железы занимает первое место в структуре онкологических заболеваний (более 186 тыс. новых случаев в 2008 г) и второе место по частоте летальных исходов среди мужчин (около 29 тыс. смертей в 2008 г) (Jemal et al., 2008). По величине прироста показателя заболеваемости в России РПЖ занимает 1-е место за период 1996-2006 гг. (величина прироста составила 128,26%) и во многом превосходит такие распространенные новообразования, как меланомы кожи и злокачественные заболевания легких и желудка (Чиссов, 2008).

Несмотря на успехи фармакологии в разработке противоопухолевых препаратов, до сих пор не было отмечено выраженного снижения смертности от рака простаты. Надежды сократить число смертей от данного заболевания основаны на раннем выявлении патологии, точности прогноза и эффективном лечении болезни в ее начальной стадии. Но ранняя диагностика крайне затруднена вследствие бессимптомного протекания болезни. В настоящее время для диагностики опухолей предстательной железы используются следующие методы: определение уровня простат-специфического антигена в плазме крови, пальцевое ректальное исследование, трансректальное ультразвуковое исследование и биопсия предстательной железы. Однако каждый из этих методов имеет ряд своих недостатков, что делает их использование не всегда эффективным (Lilja et al., 2008). Таким образом, очевидна необходимость поиска и внедрения в клиническую практику новых, более чувствительных и специфичных маркеров ранней диагностики рака предстательной железы.

эпигенетических изменений является локальное гиперметилирование специфических последовательностей - CpG-островков, расположенных в 5'-регуляторных районах многих генов, которое влечет за собой подавление экспрессии гена либо в результате прямого ингибирования связывания транскрипционных факторов с ДНК, либо в результате привлечения корепрессоров транскрипции (Klose et al., 2006). До сих пор остается открытым вопрос о механизмах инициации гиперметилирования CpG-островков в процессе образования опухоли.

На данный момент известен ряд генов-супрессоров опухолевого роста, экспрессия которых нарушена вследствие гиперметилирования их CpG-островков и показана их ассоциация с различными видами опухолей (Esteller, 2002). Но в настоящее время все более актуальным становится поиск новых, ранее неизученных генов-супрессоров опухолевого роста, метилирование которых специфично для опухолей определенных видов, т.к. результаты подобных исследований открывают новые возможности, как для изучения механизмов канцерогенеза, так и для разработки методов диагностики, мониторинга, прогноза и терапии опухолей.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы состояла в идентификации потенциальных генов-супрессоров опухолевого роста, метилированных при раке предстательной железы.

Для ее достижения нами были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Провести ингибирование процесса метилирования ДНК в двух андроген - зависимых клеточных линиях рака предстательной железы LNCaP и MDA2b и в двух андроген - независимых клеточных линиях рака предстательной железы DU-145 и РС-3;

2. Идентифицировать гены, экспрессия которых увеличилась вследствие ингибирования процесса метилирования;

3. -Провести скрининг идентифицированных генов ,на предмет их экспрессии в клетках морфологически нормальной предстательной железы и наличия CpG-островка в составе их промоторов;

4. Исследовать статус метилирования CpG-островков отобранных генов в клеточных линиях рака предстательной железы и морфологически нормальной ткани предстательной железы;

5. Провести анализ частоты метилирования в клинических образцах простатической интраэпителиальной неоплазии и рака предстательной железы различных стадий.

Научная новизна

В двух андроген - зависимых клеточных линиях рака предстательной железы LNCaP и MDA2b и в двух андроген - независимых клеточных линиях

рака предстательной железы Би-145 и РС-3 идентифицировано 170 генов, экспрессия которых увеличилась в результате ингибирования процесса метилирования ДНК. Из них промоторы двадцати пяти генов имели в своем составе СрО-островки, удовлетворяющие необходимым условиям, и их экспрессия в клетках нормальной предстательной железы была выше, чем при раковой патологии.

Впервые при анализе статуса метилирования Срв-островков двадцати пяти отобранных генов в клеточных линиях рака предстательной железы и морфологически нормальной ткани предстательной железы было показано, что гены ТАСБТШ, №130, КЯТ7, АИХА2, АС^РЗ, Р01ЛМ4, 8ЬС15АЗ, СА0045Ь метилированы в клеточных линиях РПЖ, но не метилированы в норме.

Впервые проведен анализ частоты метилирования СрО-островков генов ТАСБТ02, №130, КЯТ7, АИХА2, АОРЗ, РОЫМ4, 51.С15АЗ, САББ45Ь в клинических образцах простатической интраэпителиальной неоплазии и рака предстательной железы различных стадий. Высокая частота метилирования генов РБЫМ4, КЯТ7 и 8ЬС15АЗ при раке предстательной железы говорит о потенциальной возможности использования вышеперечисленных генов в качестве биологических маркеров ранней диагностики рака предстательной железы.

Практическая значимость

По результатам исследования получены данные, которые могут служить для разработки скрининговых тест-систем ранней диагностики рака простаты, использование которых может служить вспомогательным инструментом в выявлении раковых патологий на самых ранних стадиях, когда результаты патогистологических исследований не могут дать уверенного ответа о наличии или отсутствии новообразования.

Материалы исследования также представляют интерес в свете расширения понимания роли эпигенетических факторов в регуляции экспрессии ряда клеточных генов при злокачественной трансформации клетки, а также получения новых дополнительных знаний об участии.некоторых клеточных генов в процессе канцерогенеза.

Положения, выносимые на защиту:

1. Из 170 генов, экспрессия которых увеличилась в результате эпигенетической реактивации генома клеточных линий рака предстательной железы, двадцать пять генов имеют в составе своих промоторов СрО-островки и транскрипционно активны в клетках морфологически нормальной предстательной железы. Гены ТАСБТБг, РШЛМ4, АНХА2, №130, 0А0045Ь, АС2РЗ, КЖ7, 8ЬС15АЗ метилированы в клеточных линиях рака предстательной железы,

2. Частота метилирования генов ТАСБТОг, ОАГЮ45Ь, КЕ.Т7, 8ЬС15АЗ, РБЫМ4 при простатической интраэпителиальной неоплазии

варьируется от 5% до 53%, при раке предстательной железы ранней стадии - от 10% до 70%; при раке предстательной железы поздней стадии - от 6% до 82%.

3. Гены ANXA2, IFI30, AQP3 метилированы в клеточных линиях рака предстательной железы, но не метилированы в клинических образцах простатической интраэпителиальной неоплазии и рака предстательной железы различных стадий.

Апробация работы

Основные результаты работы докладывались на международных конференциях: «Postdoctoral and Graduate Student Research Conference» (Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, USA, 2007-2008); XLVI международная научная студенческая конференция "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2008); I Всероссийский конгресс студентов и аспирантов -биологов «Симбиоз-Россия-2008» (Казань, 2008); II международная конференция «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 1 статья в реферируемом журнале.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Работа содержит 37 рисунков и 8 таблиц. Список литературы содержит 222 цитированных работ, из них 207 иностранных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Клинические образцы рака предстательной железы (РПЖ), простатической интраэпителиальной неоплазии (ПИН) и морфологически нормальной предстательной железы были получены в госпитале ракового центра Фокс Чейз (Филадельфия, США) в результате .оперативных вмешательств. Клинический . диагноз .был подтвержден патоморфологическим исследованием в отделении патоморфологии ракового центра Фокс Чейз. В общей сложности в работе было использовано 37 образцов ДНК, выделенной из опухолей пациентов с диагнозом РПЖ и 19 образцов - с диагнозом ПИН. В ходе исследования образцы РПЖ были разделены на две подгруппы. Первую подгруппу составляли образцы опухолей ранних стадий с суммой баллов по шкале Глисона не более 7; во вторую подгруппу были включены образцы опухолей с суммой баллов по шкале Глисона от 8 и выше. Средний возраст больных в первой подгруппе составил 55,9 лет (42-67 лет); во второй подгруппе - 64,1 года (54-82 года). Средний возраст больных ПИН на момент биопсии был 58,7 лет (50-74 лет). Также в работе были использованы три образца ДНК, выделенной из морфологически нормальной ткани

предстательной железы (ПЖ), полученной от пациентов с диагнозом рак мочевого пузыря в результате оперативного вмешательства. Средний возраст пациентов составил 70 лет (63-81 год). Отсутствие новообразований в ПЖ было подтверждено патоморфологическим исследованием. Также для исследования были отобраны андроген - зависимые ЫЧСаР и МБА2Ь и андроген -независимые РС-3 и 017-145 клеточные линии РПЖ.

Методы исследования. В работе были использованы следующие методы исследования: гшсгоаггау, реакция обратной транскрипции, выделение ДНК и РНК из клеточных культур, выделение ДНК из тканевых срезов, зафиксированных в парафине и из замороженных срезов тканей, бисульфитная модификация ДНК, гель-электрофорез нуклеиновых кислот, выделение продуктов ПЦР из агарозного геля, секвенирование, ПЦР, ПЦР в реальном времени. Оценку транскрипционной активности клеточных генов в клетках ПЖ и анализ их СрО-островка проводили с помощью он-лайн ресурсов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Отбор клеточных линий и ингибиторов процесса метилирования.

В работе были использованы следующие клеточные линии РПЖ: андроген - зависимые клеточные линии ЬпСар и МБА2Ь, полученные из метастаз лимфатических узлов и костей; и андроген - независимые клеточные линии РС-3 и Би-145, полученные из костных метастаз и метастаз головного мозга соответственно. Наш выбор был обусловлен быстрой прогрессией опухолей предстательной железы от андроген - зависимого типа к андроген -независимому, что затрудняет их лечение вследствие потери чувствительности к гормональной терапии (ВокЬоуеп й а1., 2003).

В качестве ингибиторов процесса метилирования ДНК в работе были использованы 5-аза-2-деоксицитидин, представляющий собой химический аналог цитидина, обладающий способностью встраиваться в цепочку ДНК при репликации, вызывая ингибирование метилтрансферазной активности путем образования стабильного комплекса между 5-аза-2-диоксицитидиновым остатком в ДНК и активным центром фермента ДНК-метилтрансферазы (Мотраг1ег, 2005). Вторым ингибитором, также использованным в нашей работе, был трихостатин А - высокоспецифичный ингибитор гистондеацитилаз. Гистондеацитилазы синтезируются в большом количестве при различных видах опухолей. Эти ферменты катализируют процесс деацитилирования гистонов, в результате чего гистоны приобретают положительный заряд и прочно взаимодействуют с витками нуклеосомной ДНК. Таким образом, нуклеосомы приобретают компактное состояние и теряют способность взаимодействовать с факторами транскрипции (Бе Кш^ег й а1., 2003).

На предварительном этапе работы была определена оптимальная концентрация 5-аза-2-деоксицитидина, не вызывающая токсического эффекта. Было установлено, что концентрация 5 мкМ/л вызывает деметилирующий эффект с минимальным токсическим эффектом.

Microarray.

На первом этапе клетки клеточных линий РПЖ LNCaP, DU-145, РС-3 и MDA2b инкубировались в присутствии 5-аза-2-деоксицитидина (5 мкМ/л) и трихостатана А (500 нМ/л). Клетки контрольной группы инкубировались с эквивалентным количеством PBS и этанола. Из двух групп клеток, экспериментальной и контрольной, выделяли РНК, с последующим проведением реакции обратной транскрипции. Далее полученную кДНК метили с использованием флуоресцентных меток - производных индокарбоксицианина СуЗ и индодикарбоксицианина Су5, и проводили реакцию гибридизации с ДНК чипом (MWG Biotech, Inc., High Point, USA), с иммобилизованными на нем 15 тыс. ДНК-зондами. Процесс гибридизации повторяли дважды с использованием метода flip-dye, при котором производилась взаимная замена использованных флуоресцентных меток. Одновременная детекция обоих сигналов в каждой из ячеек позволяет прямо сравнить их интенсивность и избежать ошибок, связанных с неполной воспроизводимостью результатов.

В ходе анализа результатов, полученных при двукратном повторении процесса гибридизации (рис. 1), были получены следующие данные. В клеточной линии РПЖ LNCaP двукратное увеличение экспрессии было зафиксировано в 663-х генах; в клеточной линии MDA2b - в 366 генах; в клеточной линии DU-145 - в 293-х генах; в клеточной линии РС-3 - в 641-м гене.

Рисунок 1. Результат сканирования слайда, полученного в результате гибридизации кДНК и ДНК чипа. Ячейки красного цвета соответствуют генам, экспрессия которых повысилась в результате ингибирования процесса метилирования ДНК. Ячейки зеленого цвета - генам с пониженной экспрессией. Ячейки желтого цвета - гены, экспрессия которых не изменилась.

Анализ экспрессии генов в клетках морфологически нормальной предстательной железы.

Для дальнейших исследований были отобраны 170 генов, экспрессия которых повысилась как минимум в три раза в трех из четырех клеточных линиях РПЖ. Далее был проведен сравнительный анализ уровня экспрессии идентифицированных генов в клетках морфологически нормальной ПЖ и ПЖ, пораженной раком. Используя базу данных Cancer Genome Anatomy Project (CGAP), где представлены результаты исследований уровней экспрессии генов в различных органах, как в норме, так и при раковой патологии (http://cgap.nci.nih.gov), мы проанализировали экспрессию каждого гена в клетках нормальной ПЖ и ПЖ, пораженной раком. Отсутствие экспрессии в клетках морфологически нормальной ПЖ было показано для 103-х генов.

Анализ CpG-островков.

При анализе CpG-островков использовались три основных критерия: распределение CpG динуклеотидов по нуклеотидной последовательности, GC состав и длина последовательности.

Так, для оценки распределения CpG динуклеотидов вычисляется показатель Н/Т по следующей формуле:

Н ц xN T'NcxNG

где Н - наблюдаемое число CpG динуклеотидов; Т - теоретическое число CpG динуклеотидов; п - число CpG в последовательности; N - общее число нуклеотидов в последовательности; Nc - число остатков цитозинов; Nq - число остатков гуанина. Для CpG-островка этот показатель должен быть > 0,6. GC состав - доля цитозиновых и гуаниновых нуклеотидов в составе последовательности для CpG-островка должна быть не меньше 55%. Длина CpG-островка варьирует от 200 п.н. до несколько тысяч, составляя в среднем 1000 п.н. (Gardiner-Garden et al., 1987).

Данные условия отбора также способствуют исключению большинства Alu-повторяющихся элементов, которые могут входить в состав промоторов некоторых кодирующих белков генома человека и перекрываться с CpG-островками и цис-регуляторными модулями, представляющими собой кластеры сайтов связывания транскрипционных факторов, тем самым, влияя на экспрессию генов (Oei et al., 2004). Дополнительно с той же целью была использована компьютерная программа обнаружения повторов Repeat Masker (www.repeatmasker.org).

При анализе нуклеотидных последовательностей промоторов исследуемых генов на наличие CpG-островков в их составе использовалась компьютерная программа Webgene CpG island prediction (www.itb.cnr.it/sun/webgene/).

В результате анализа было установлено, что 16 генов не имеют в своем составе CpG островков; гены TLH29, APOD и CRYAB имеют в составе промоторов CpG-островки, не удовлетворяющие критериям отбора; ген TIMP1 располагается на X хромосоме; ген IGF2R является импринтированным, а ген JUNB - онкогеном. Анализ литературы показал, что 20 генов ранее были изучены и результаты исследований опубликованы.

Таким образом, для дальнейшей работы были отобраны 25 генов (табл. 1), большинство из которых представляет собой гены, кодирующие транскрипционные факторы, а также рецепторы, белки-переносчики, белки цитоскелета и иммунного ответа.

Таблица 1. Хромосомная локализация и краткая характеристика отобранных генов.

Ген Хромосомная локализация Функция гена

1 H1F2 6р22.2 Конденсация нуклеосом

2 ТВХ1С 22qll.21 Транскрипционный фактор

3 ID1 20qll.21 Негативная регуляция транскрипции

4 GNAI3 17q24.1 Связывание нуклеотидов

5 RELB 19ql3.32 Транскрипционный фактор

6 BASP1 5ql5.1 Связывание ДНК в клетках НС

7 FOSL2 2p23.2 Транскрипционный фактор

8 IRF6 lq32.2 Транскрипционный фактор

9 GADD45b 9q22.2 Регуляция клеточных процессов

10 CTSD llpl5.5 Протеолиз

11 IFI30 19pl3.11 Иммунный ответ

12 DAF lq32.2 Активация комплиментов

13 FXYD5 19ql3.12 Клеточная адгезия

14 KRT7 12ql3.13 Организация цитоскелета и биогенез

15 PDLIM4 5q23.3 Организация цитоскелета

16 TACSTD2 lp32.1 Рецептор, регулятор уровня Са2+

17 ANXA2 15q22.2 Связывание иона кальция

18 ITGA3 17q21.33 Рецептор

19 ECGF1 22ql3.33 Фактор роста

20 ARL6IP 16pl2.3 Транспорт белков, клеточный сигналинг

21 AQP3 9pl3.3 Транспорт белков, клеточный сигналинг

22 SLC15A3 llql2.2 Транспорт белков

23 ARL7 2q37.1 Связывание ГТФ и ГДФ

24 АСАА2 18q21.1 Ацетил-КоА-ацилтрансферазная активность

25 ASNS 7q21.3 Аспартатная и аспарагиновая активность

Определение статуса метилирования Срв-островков отобранных генов в клеточных линиях РПЖ и морфологически нормальной ткани ПЖ.

Для определения статуса метилирования СрО-островков отобранных генов в клеточных линиях РПЖ и морфологически нормальной ткани ПЖ были использованы методы бисульфитной модификации ДНК и секвенирования. При обработке ДНК бисульфитом натрия все неметилированные цитозины конвертируются в урацил, в то время как метилированные цитозины в составе Срв динуклеотидов остаются неизменными. В дальнейшем при амплификации исследуемого участка ДНК все остатки урацила и тимина амплифицируются как тимин и только 5-метилцитозин воспроизводится как цитозин.

В результате секвенирования промоторных участков двадцати пяти генов было установлено, что СрО-островки генов А№СА2, АС>РЗ, 1П30, К11Т7, РБЬШМ, ТАС5ТБ2, 8ЬС15АЗ, ОАБВ45Ь метилированы в клеточных линиях РПЖ, но неметелированы в морфологически нормальной ткани ПЖ. Ген ВА5Р1 метилирован и при патологии и в норме. Это связано, видимо, с тем, что продукт данного гена представляет собой белок аксонных окончаний нейронов и главным образом синтезируется в клетках нервной системы, т.е. ген ВА8Р1 является тканеспецифическим геном, что и объясняет его метилированное состояние в морфологически нормальной ткане ПЖ. Результаты секвенирования остальных генов показали отсутствие метилирования и в клеточных линиях РПЖ и в морфологически нормальной ткани ПЖ (табл. 2).

Таблица 2. Статус метилирования СрО-островков в клеточных линиях РПЖ и морфологически нормальной ткани ПЖ.

Ген ¿А>СаР №-145 МТ)А2Ъ РС-3 НП1 НП2 НПЗ

1 Н1Б2 - - - - - - -

2 ТАС8ТБ2 + - - - - - -

3 ШЗО + - - + - - -

4 БАР - - - - - - -

5- АЫЬбП» - - - - - - -

6 БХУБ5 - - - - - - -

7 СТ8Б - - - - - - -

8 КЯТ7 + + + - - - -

9 ТВХ1С - - - - - - -

10 АЯХА2 + - - - - - -

11 ГО1 - - - - - - -

12 АСЗРЗ + + + - - - -

13 РОЫМ4 + + + + - - -

14 ЕСОР1 - - - - - - -

15 АСАА2 - - - - - - -

16 ITGA3 - - - - - - -

17 GNAI3 - - - - - - -

18 RELB - - - - - - -

19 BASP1 + + + + + + +

20 ARL7 - - - - - - -

21 ASNS - - - - - - -

22 FOSL2 - - - - - - -

23 SLC15A3 + + + + - - -

24 IRF6 - - - - - - -

25 GADD45g + + + - - - -

(+) - образец метилирован; (-) - образец неметилирован; НП - образец нормальной ПЖ.

Анализ частоты метилирования генов PDLIM4. KRT7, SLC15A3. TACSTD2. AQP3, ANXA2, IFI30 в клинических образцах простатической интраэпиталеальной неоплазии и рака предстательной железы ранней и поздней стадий.

Ген PDLIM4. Ген PDLIM4 локализован на 5 хромосоме в районе q23.3. Представляет собой двудоменный белок длиной 330 а.о. Ген PDLIM4 был идентифицирован как потенциальный ген-супрессор опухолевого роста, участвующий в поддержании нормального клеточного роста (Vallenius et al., 2004). Было установлено, что продукт данного гена модулирует работу нитей актина и ассоциирован с цитоскелетом клетки. Также PDLIM4 способен модулировать активность TRIP6 (транскрипционного коактиватора v-ге1/ядерного фактора-кВ) (Cuppen et al., 2000; Zhao et al., 1999) и белка PTP-BL, участвующий в FAS-модулируемом апаптозе (Sato et al., 1995). Таким образом, PDLIM4 участвует в регуляции апоптоза по FAS/NF-кВ пути. Также было показано, что восстановление экспрессии изучаемого гена в опухолевых клетках кишечника приводит к уменьшению пролиферации и к снижению способности клонообразования, а также более чем двукратному увеличению -частоты апоптоза, ^вызванного ультрафиолетовым облучением .(Boumber et al., 2007). Учитывая, что PDLIM4 проявляет проапоптические функции, подавление экспрессии данного гена может способствовать ускорению роста раковых клеток.

В результате эпигенетической реактивации было показано увеличение уровня экспрессии PDLIM4 в клеточных линиях рака предстательной железы в среднем в 3,5 раза. Характеристики CpG островка, входящего в состав промотора PDLIM4: Н/Т = 0,73, состав GC = 73%, длина 801 п.н. В ходе секвенирования промоторного участка метилирование было обнаружено во всех четырех клеточных линиях рака предстательной железы (рис. 2).

_J_L_J_I j_l l

T С спстлссйтттп с стс стс с с с с т с сттс с а я с g с сссс

J_I I_1 I 11_

i сп стп с 6 а т т i и cgtt стт cccstt сттт спят ctgccc

.ЛЛлЛл^ААГЛАЛЛЛд^МйЛллллАЛЛЛллул,Л/УллЛлЛ/

Рисунок 2. Хроматограммы сиквенсов продуктов ПЦР, полученных при амплификации бисульфит-модифицированной ДНК промоторного участка гена PDLIM4 в клеточной линии РПЖ MDA2b и в нормальной ткани предстательной железы (НП).. Стрелками отмечено присутствие цитозина (С) в CpG-динуклеотидах в клеточной линии РПЖ и тимина (Т) - в нормальной ткани.

В ходе анализа частоты метилирования в клинических образцах было установлено, что в случае ранней стадии РПЖ метилированными были 65% образцов (13/20), на поздней стадии - 82% образцов (14/17). При ПИН метилирование было обнаружено только в 1 образце из 19 (5%). Такие результаты, по-видимому, связаны с тем, что ПИН, хотя и имеет большое количество общих иммунофенотипических и цитологических черт с карциномой, а также связана с ней территориально, все же не является предшественником развития рака. Высказывается мнение, что они обе вызываются одинаковыми этиологическими факторами, но наличие ПИН недостаточно и необязательно для возникновения карциномы простаты (Пожарисский и др., 2001). Обнаруженный наш факт сниженной частоты метилирования в образцах ПИН по сравнению с метилированием при РПЖ свидетельствует о том, что ген PDLIM4 специфично метилирован при РПЖ и о потенциальной возможности его использования в диагностике рака простаты.

Ген KRT7. Ген КРТ7 принадлежит семейству кератинов, представляющих собой большое семейство 8-нм промежуточных филаментов цитоскелета эпиталеальных клеток: КРТ7 представляет собой кератин П типа, состоящий из четырех а-спиральных сегментов с гептановыми повторностями гидрофобных остатков, характерных для биспирального участка. Цитокератины относятся к маркерам клеток эпителиальной природы. В процессе злокачественной трансформации клеток способность экспрессировать определенный спектр цитокератинов, характерных для данного типа тканей, сохраняется и в клетках опухоли, развившейся в этих тканях (Moll et al., 1982). Так, муцинозная аденокарцинома яичников экспрессирует цитокератины простого эпителия (в том числе цитокератин 7) (Vang et al., 2006). При раке толстого кишечника сохраняется специфический набор цитокератинов, характерный для кишечника (включая цитокератин 20, но не цитокератин 7) (Cerna et al., 2006). В настоящий момент данных о спектре кератинов, синтезирующихся при РПЖ, нет.

В ходе обработки клеточных линий РПЖ ингибиторами метилирования 5-аза-2-деоксицитидином и трихостатином А, уровень экспрессии гена КРТ7 повысился приблизительно в семь раз в трех клеточных линиях (LNCaP - в 5 раз, MDA2b - в 12 раз, РС-3 - в 3 раза). Промоторная область данного гена содержит CpG островок длиной 952 п.н., GC состав = 68%, Н/Т = 0,76. Результаты секвенирования участка длиной 290 п.н., содержащего в своем составе 32 CpG динуклеотида, показали метилирование гена KRT7 в трех клеточных линиях LNCaP, DU-145, MDA2b, образцы нормальной ДНК и клеточной линии РС-3 были неметилированы (рис. 3).

_1_1_J_1_1 1 1

TICGETfil ТТКТ TTC GCG11 ! rf G Г С G Г t T T T iCGGGTCGTG

_1_Li_i_1 1 1

ttt gg*rttti1tt tt gt gttirgti gttttttt с g g t г gt g

ш -^АЛ/УУ(УЧ:/УУwwyvv ^/УЛАУ^/УУ^А/учул/ЪЛ

Рисунок 3. Хроматофаммы сиквенсов продуктов ПЦР, полученных при амплификации бисульфит-модифицированной ДНК промоторного участка гена KRT7 в клеточной линии РПЖ MDA2b и в нормальной ткани предстательной железы (НП).. Стрелками отмечено присутствие цитозина (С) в CpG-динуклеотидах в клеточной линии РПЖ и тимина (Т) - в нормальной ткани.

Результаты анализа частоты метилирования гена KRT7 в клинических образцах показали метилирование гена KRT7 в 53% случаев ПИН (10/19), в 70% случаев ранней стадии рака простаты (14/20), в 35% случаев поздней стадии (6/17). Таким образом, частота метилирования гена KRT7 при ПИН говорит о том, что изменение экспрессии гена KRT7, вызываемое эпигенетическими факторами, уже имеет место быть на стадиях, предшествующих раку предстательной железы. А высокий показатель метилирования при РПЖ ранней стадии свидетельствует о возможности использования гена KRT7 при ранней диагностике РПЖ.

Ген SLC15A3. Ген SLC15A3 является одним из четырех представителей SLC15 семейства, главной функцией которого является транспорт коротких пептидов в различные клетки. SLC15A1 преимущественно встречается в клетках эпителия кишечника и в протоках желчного пузыря, SLC15A2 - в эпителии почек, глии, легких, хороидного сплетения и молочной железы. SLC15A3 и SLC15A4 были открыты сравнительно недавно (Daniel et al., 2004), Их функция состоит в транспорте гистидина, но до сих пор остается не выясненным вопрос об их локализации. Предполагается, что они являются лизосомальными переносчиками гистидина из лизосом в цитоплазму, в качестве источника энергии использующие протонный потенциал. SLC15A3

преимущественно экспрессируется в эпителии легких, сердца, кишечника, предстательной железы и других органов. Изучение паттерна метилирования данного гена особенно интересно в свете последних данных, согласно которым переносчики семейства SLC15 участвуют в транспорте лекарственных препаратов (Li et al., 2006)

Эпигенетическая реактивация генома клеточных линий РПЖ явилась причиной повышения уровня экспрессии данного гена в 2,8-3,2 раза по сравнению с контрольными клетками. В ходе анализа CpG-островка, входящего в состав промотора было установлено, что первый экзон содержит в себе два CpG-островка. Первый CpG-островок имел следующие характеристики: длина -211 п.н., состав GC = 52%; Н/Т = 0,57. Длина второго CpG-островка составляла 651 п.н., состав GC был равен 69%; Н/Т = 0,73. Для дальнейшей работы был выбран второй CpG-островок, так как он имел лучшие показатели и располагался ближе к сайту старта транскрипции. Результаты секвенирования показали метилирование во всех четырех клеточных линиях рака предстательной железы. На рис. 4 приведены хроматограммы сиквенсов участка CpG-островка гена SLC15A3.

1 I 1_|_1_1_1_

Б С С С етс СТ ТТ ТТТ ТС ССС STIftT С СТ !flf!T Т 1 с GTGTT стп

DW45 'A/vwwv^/w,

1 1 1_1 I_!_i_

6 1*1 с t t cttittttt cgt g 1 1чтт cttr4t tt tg-ctt S l я

ra ЛА/У\ЛЛЛ/У\АЛАЛААДЛл.,^А.^ААЛ^ЛОоЛАЛАЛ^Л^ЛА-^-

Рисунок 4. Хроматограммы сиквенсов продуктов ПЦР, полученных при амплификации бисульфит-модифицированной ДНК промоторного участка гена SLC15A3 в клеточной линии РПЖ DU-145 и в нормальной ткани предстательной железы (НП).. Стрелками отмечено присутствие цитозина (С) в CpG-динуклеотидах в клеточной линии РПЖ и тимина (Т) - в нормальной ткани.

В ходе анализа частоты метилирования гена SLC15A3 в клинических образцах было установлено, что в случае РПЖ ранней стадии частота метилирования составила 70% (14/20), РПЖ поздней стадии - 65% (11/17). В случае ПИН было метилировано 37% образцов (7/19). Такие высокие показатели метилирования в образцах рака предстательной железы различных стадий, как и в случае гена PDLIM4, свидетельствуют о возможности использования данного гена в качестве биологического маркера РПЖ в диагностике заболевания.

Ген TACSTD2. Ген TACSTD2 располагается на первой хромосоме в районе участка р32.1. TACSTD2 представляет собой трансмембранный гликопротеин клеточной поверхности. На данный момент о функциях этого

гена известно немногое. Предполагается, что он участвует в регуляции уровня кальция в клетке и выполняет функции рецептора (Ripani et al., 1998). Было обнаружено, что TACSTD2 экспрессируется в больших количествах в активно-растущих тканях, поэтому вероятно он участвует в процессе морфогенеза. Белок TACSTD2 содержит N-термальную сигнальную последовательность, имеющую в своем составе EGF (эпидермальный фактор роста) - подобный и тиреоглобулиновый повторы, а также сайт связывания PIP2 (фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат), который в свою очередь, является одним из важнейших липидов клеточной мембраны и принимает участие во многих клеточных процессах, таких как эндо- и экзоцитозы, активация ферментов и вторичных мессенджеров, организация цитоскелета и т.д. (McLaughlin et al., 2005). El Sewedy et al. показали, что сайт связывания PIP2, входящий в состав TACSTD2, способен фосфорилироваться протеинкиназой С, что может иметь определенные последствия при опухолеобразовании (El Sewedy et al., 1998).

В ходе эпигенетической реактивации генома клеточных линий РПЖ значительное повышение уровня экспрессии TACSTD2 было отмечено для клеточной линии LNCaP - в 9,9 раз. Исследуемый CpG-островок длиной 1768 п.н. содержал в себе 173 CpG динуклеотида, состав GC = 64%, Н/Т = 0,94. Секвенирование участка длиной 366 п.н. показало метилирование в клеточной линии LNCaP, три другие клеточные линии РПЖ и образцы нормальной ПЖ были неметилированы (рис. 5).

_i_1 1 1_1 1_J_

с сстттс сс g 7 с сттйтс6т т g с с g т 1 стс gttgtt стт g

"" /\ААЛАААМАааАлААДАААА/У\ААЛАМАААДАААДААА

А_1 i 1_I 1_i_

г fifilttt gt6tt gttbttgttgtggil 6 т т gtt git git gg

ш А А Ал / \ А А АА АА А Л'"\ Л,М/\ ЛЛ А Ал А Лл А ла л. Ал А Ал А AvA ft А

Рисунок 5. Хроматограммы сиквенсов продуктов ПЦР, полученных при амплификации бисульфит-модифицированной ДНК промоторного участка гена TACSTD2 в клеточной линии РПЖ LNCaP и в нормальной ткани предстательной железы (НП).. Стрелками отмечено присутствие цитозина (С) в CpG-динуклеотидах в клеточной линии РПЖ и тимина (Т) - в нормальной ткани

Далее был проведен анализ частоты метилирования в клинических образцах. На ранних стадиях РПЖ метилирование было зафиксировано лишь в 10% образцов (2/20); на более поздних стадиях РПЖ частота метилирования составила 23,5% (4/17), при заболевании ПИН ни один образец не был метилирован. Таким образом, можно сделать вывод о небольшом вкладе эпигенетических механизмов в регуляцию экспрессии данного гена. Так, несколько работ по определению уровня экспрессии гена TACSTD2 в

опухолевых клетках разной локализации показали гиперэкспрессию данного гена при раке толстого кишечника, яичников, мочевого пузыря и пищевода, причем в последнем случае размер опухоли коррелировал с титром белка TACSTD2 в крови (Alberti et al., 1992, Miotti et al., 1987, Fradet et ai„ 1984, Nakashima et.al., 2004). Однако, согласно Ют et al, данный ген гиперметилирован в 68% случаях злокачественных глиом (Kim et al., 2006). До сих пор нет сведений об уровне экспрессии TACSTD2 при патологиях предстательной железы. Наши результаты демонстрируют отсутствие метилирования при ПИН, а небольшие показатели метилирования в образцах РПЖ возможно объяснить возрастными причинами: средний возраст пациентов, у которых было зафиксировано метилирование, составлял 60 лет в группе ранней стадии РПЖ и 72 года в группе поздней стадии РПЖ.

Ген GADD45b. Ген GADD45b располагается на участке 19р13.3 и кодирует белок весом 17,8 кДа и длиной 160 а.о. GADD45b принадлежит к группе генов, транскрипция которых повышается в ответ на стресс или воздействие ДНК-разрушающих веществ через активацию p38/JNK сигнального пути. Регуляция данного сигнального пути осуществляется путем связывания и индукции МТК1/МЕКК4 киназ, которые, в свою очередь, являются активаторами р38 и JNK МАР-киназ. Таким образом, GADD45b участвует в регуляции процессов клеточного роста, репарации ДНК, клеточной выживаемости и апаптоза (Takekawa et al., 1998; Zhang et al., 1999). Было показано, что мутации в гене р53 могут вызывать снижение экспрессии гена GADD45b (Zhan Q. et al., 1994).

В результате обработки данных microarray анализа было установлено повышение экспрессии гена GADD45b в трех клеточных линиях в среднем в три раза. Анализ промоторного участка показал наличие CpG-островка длиной 1674 п.н., содержащего 145 CpG динуклеотидов. Результаты секвенирования продемонстрировали гиперметилирование в трех клеточных линиях РПЖ LNCaP, MDA 2b, DU-145 (рис. 6).

1)11 I_J_1_L

_1111 1 11 1_

ilcgßänttttgtgtgt стгтт grfittgt ggttt ggtt ct

л А А А"A" А А А А Ал Aa А А AA А А А. АА А лЛМЛ А А Л М Л Л"

Рисунок 6. Хроматограммы сиквенса продуктов ПЦР, полученных при амплификации бисульфит-модифицированной ДНК промоторного участка гена GADD45b в клеточной линии РПЖ LNCaP и в нормальной ткани предстательной железы (НП). Стрелками отмечено присутствие цитозина (С) в CpG динуклеотидах в клеточной линии РПЖ и тимина (Т) - в нормальной ткани.

Дальнейшее исследование паттерна метилирования в клинических образцах методом ПЦР в реальном времени показало метилирование только одного образца опухоли простаты поздней стадии. Для подтверждения статуса метилирования, данный образец был просеквенирован (рис. 7).

1111 1 1

>üTTTc¡cef6ftTT.T i íiit.tt t

Рисунок 7. Хроматограмма сиквенса продукта ПЦР, полученного при амплификации образца №2545. Стрелками отмечено наличие цитозина в составе CpG-динуклеотида.

Таким образом, результаты нашего исследования продемонстрировали повышение экспрессии, последовавшее после эпигенетической реактивации генома клеточных линий РПЖ, но результаты анализа клинических образцов показал минимальное значение метилирования при различных патологиях ПЖ.

Ген AQP3. Ген AQP3 располагается на участке хромосомы 9р21.1. Аквапорин 3 (AQP3) представляет собой мембранный белок, принадлежащий семейству аквапоринов, белков водных каналов, благодаря которым осуществляется пассивное перемещение воды по осмотическому градиенту (Agre et al., 1993). К настоящему времени идентифицировано 11 членов данного семейства, которые можно разделить на 2 большие подгруппы. В целом, все аквапорины имеют схожую структуру и распределены между различными тканями организма. Белок аквапорин 3 чаще всего обнаруживается в базолатеральных плазматических мембранах клеток почек, эпидермиса, легких, кишечника и т.д. Хотя аквапорины не являются единственными молекулами, отвечающими за транспорт воды в ,клетку, предполагается, что они принимают участие в развитии ряда наследственных и приобретенных заболеваний, в том числе таких, как отек мозга, цирроз, сердечная недостаточность, глаукома, различные новообразования. Было показано отсутствие экспрессии гена AQP3 при мелкоклеточной карциноме легкого, плеоморфной карциноме и при метастазировании рака толстого кишечника (Liu et al., 2007).

В ходе нашего исследования в результате ингибирования процесса метилирования было установлено повышение уровня экспрессии гена AQP3 в 3,32-6,55 раз в трех клеточных линиях рака предстательной железы (LNCaP - в 3,32 раза, MDA2b - в 3,82 раза, РС-3 - в 6,55 раза). Исследуемый CpG-островок имел длину 544 п.н. и соответствовал всем критериям CpG-островка (состав GC = 70%, Н/Т = 0,65). Результаты секвенирования показали, что промоторная

область гена AQP3 метилирована в клеточных линиях рака предстательной железы LNCaP и MDA2b, в то время как в двух других клеточных линиях и в нормальной ткани метилирование обнаружено не было (рис.8)

_!_I_I_\ 1_1

я с С BIT с С R С СТССТТ OTT с С Т 1 С с G Т Т Т CGTTTTT С GM

Рисунок 8. Рисунок б. Хроматограммы сиквенса продуктов ПЦР, полученных при амплификации бисульфит-модифицированной ДНК промоторного участка гена А(}РЗ в клеточной линии РПЖ 1ЛЧСаР и в нормальной ткани предстательной железы (НП). Стрелками отмечено присутствие цитозина (С) в Срв динуклеотидах в клеточной линии РПЖ и тимина (Т) - в нормальной ткани.

Далее в ходе анализа клинических образцов ПИН и РПЖ различных стадий с помощью методов количественной ПЦР в реальном времени и секвенирования было показано отсутствие локального гиперметилирования при различных патологиях ПЖ (рис. 9).

Рисунок 9. Хроматограммы сиквенса продуктов ПЦР, полученных при амплификации бисульфит-модифицированной ДНК промоторного участка гена АС2РЗ в клинических образцах РПЖ (а, б) и ПИН (в) Стрелками отмечены наличие тимина в составе Срй-динуклеотида, что означает отсутствие метилирования в образце.

Ген ШЗО. ИЗО принадлежит семейству сульфогидрилредуктаз, способных катализировать процесс разрыва дисульфидных связей, преимущественно при нейтральных рН, однако №130 является уникальным ферментом, выполняющим свои функции при кислых значениях рН (4,5-5,5) (АгипасЬа1ат е! а1., 2000). Преимущественно данный белок синтезируется в

антиген-представляющих клетках, но при этом обнаруживается во многих типах клеток. Его экспрессия индуцируется при действии таких цитокинов как интерферон-у, интерлейкин 1 и др. IFI30 играет ключевую роль в денатурации антигенов, предшествующей протеолизу и презентации фрагментов главным комплексом гистосовместимости II (Phan et al., 2000). Было продемонстрировано, что при различных меланомах уровень экспрессии гена IFI30 либо полностью прекращается, либо снижается до минимальных значений (Haque et al., 2002)

В результате microarray анализа было показано, что уровень экспрессии в клеточных линиях РПЖ LNCaP, РС-3, DU-145, MDA2b возрос в 5,2; 4; 2 и 3 раза соответственно. Исследованный CpG-островок находится в первом экзоне и имеет длину 353 п.н. GC состав = 67%, Н/Т = 0, 58. В результате секвенирования участка промотора длиной 279 п.н. было продемонстрировано метилирование в клеточных линиях LNCaP и РС-3 (рис. 10).

1 1 1_1_!_

г 1 s с с с cgc сст g г я cgc gtt т гтгтт g т « в gc g т т я g ft т т

lNCaP 'УАМ\/Ч\а\уууАЛЛС^'-лаV4/YY УЛлл-УЛ-Х^ _i_I_1_I_!_

т й ^ ест ggt ggï g т и g б i g т * т т ^ т тт етрпстстчя ватт

" м;\адллдллдлмллд^маалаа/\ам-уадллалалу\/

Рисунок 10. Рисунок 6. Хроматограммы сиквенса продуктов ПЦР, полученных при амплификации бисульфит-модифицированной ДНК промоторного участка гена IFI30 в клеточной линии РПЖ LNCaP и в нормальной ткани предстательной железы (НП). Стрелками отмечено присутствие цитозина (С) в CpG динуклеотидах в клеточной линии РПЖ и тимина (Т) - в нормальной ткани.

Результаты анализа частоты метилирования показали отсутствие метилирования в клинических образцах ПИН и РПЖ различных стадий. На рис. 11 представлены хроматограммы сиквенсов трех клинических образцов.

11вт}стгс1тст4 cirtiT ctiilciTT—I I >1 ( С С 1 С С 1—П"

шммл/^лмлллла^лмплл/шллл^лл

iratlcil til tii cilcTT ccfll с i ) I i i я I e e { e с i ce

y/v\a /у\л д-\л /у,л мл m а л am мл аллла л аЛ ллЛ ла

I Ï Я t I С I { (il!—¡ГГ~|—С I I 5 1—I сел} С I I—Г—Г 7 ft I—с с f с с г с е

Рисунок 11. Хроматограммы сиквенса продуктов ПЦР, полученных при амплификации бисульфит-модифицированной ДНК промоторного участка гена IF130 в клинических образцах РПЖ (а, б) и ПИН (в) Стрелками отмечены наличие тимина в составе CpG-динуклеотида, что означает отсутствие метилирования в образце.

Ген ANXA2. Ген ANXA2 располагается на пятнадцатой хромосоме, на участке q22.2. Аннексины - семейство Са2+-зависимых белков с фосфолипидо-связывающей активностью. На данный момент открыто более 20 различных анексинов (Morgan et al., 1997). ANXA2 , известный также как р36, липокортин II и калпактин I, изначально был идентифицирован как одна из главных мишеней для фосфорилирования белком ррбО (Erikson et al., 1980). ANXA2 существует в формах мономера, гетеродимера и гетеротетрамера (соместно с белком pli). До сих пор функция ANXA2 до конца не выяснена. Предполагается, что он принимает участие в Са2+-зависимом экзо-, эндоцитозах, в клеточной адгезии (Mai J. et al., 2000), пролиферации (Chiang Y. et al., 1999), фибринолизе клеточной поверхности (Hajjar К.А. et al., 2000), a также в формировании остеокластов и костной ресорбции (Takahashi S. et al., 1994). Было показано, -что в опухолевых-клетках предстательной железы снижена или полностью отсутствует экспрессия ANXA2, и что реэкспрессия данного гена приводит к замедлению метастазирования опухоли, но не влияет на пролиферацию и выживаемость опухолевых клеток (Liu et al., 2003). Обработка клеток клеточных линий РПЖ ингибиторами процесса метилирования вызвала повышение экспрессии гена ANXA2 в 3,1-3,6 раз. Анализ промоторного участка показал наличие CpG-островка длиной 912 п.н. Состав GC = 65,9%, Н/Т = 0,68. Для анализа статуса метилирования гена ANXA2 были сконструированы праймеры для участка длиной 391 п.н., содержащего 41 CpG динукпеотидов. Результаты секвенирования представлены ниже на рис.12.

J_J_Il M 1

J_t_11 11 1_L

Рисунок 12. Рисунок б Хроматограммы сиквенса продуктов ПЦР, полученных при амплификации бисульфит-модифицированной ДНК промоторного участка гена ANXA2 в клеточной линии РПЖ LNCaP и в нормальной ткани предстательной железы (НП). Стрелками отмечено присутствие цитозина (С) в CpG динуклеотидах в клеточной линии РПЖ и тимина (Т) - в нормальной ткани.

Метилирование CpG-островка гена ANXA2 было показано только для клеточной линии РПЖ LNCaP. Анализ клинических образцов РПЖ и ПИН с использованием методов секвенирования и ПЦР в реальном времени продемонстрировал отсутствие метилирования (рис.13).

Gel—С Ii С т i—Е с с et—гг II С 1—Г л ^ Т 1—I—f S й !—I I С С S~Irl в e с » с

Ам AAmû лдлм ладла-'У\АААА Д/^лалллмаллал

I_i_1_I_1 1 ..... _

CCI—s С С Т I—С—С С—П—С В С 1 1—I I )—I—I—Т—IUI Г в й G U 1 С G С A G

^ААМААаамалМАМААААА#ЛАААА\ААААА

eel—С G G 1—I С G С G t-G ft G T t ft T 1-1-r-4—С 1 T T !-G G С t i G G G fl G

АДЛААА^ААААМЛАМАМААААД^ААААлдлАМА/

Рисунок 13. Хроматограммы сиквенса продуктов ПЦР, полученных при амплификации . бисульфит-модифицированной.ДНК лромоторного участка гена ANXA2 в .клинических образцах РПЖ (а, б) и ПИН (в) Стрелками отмечены наличие тимина в составе CpG-динуклеотида, что означает отсутствие метилирования в образце.

Таким образом, отсутствие метилирования в генах AQP3, IFI30, ANXA2 в клинических образцах ПИН и РПЖ различных стадий свидетельствуют о минимальном влиянии эпигенетических механизмов на регуляцию экспрессии вышеперечисленных генов.

выводы

1. В двух андроген - зависимых клеточных линиях рака предстательной железы ЬКСаР и МБА2Ь и в двух андроген - независимых клеточных линиях рака предстательной железы 011-145 и РС-3 идентифицировано 170 генов, экспрессия которых увеличилась в результате ингибирования процесса метилирования ДНК.

2. Из 170 генов, экспрессия которых увеличилась в результате ингибирования процесса метилирования ДНК, 25 имеют в составе своих промоторов СрО-островки и транскрипционно активны в клетках морфологически нормальной предстательной железы;

3. Гены ТАСБТОг, Р01ЛМ4, АЮСА2, №130, ОАОБ45Ь, А(ЗРЗ, КК.Т7, 8ЬС15АЗ метилированы в клеточных линиях рака предстательной железы, в отличие от морфологически нормальной ткани простаты, где метилирование данных генов обнаружено не было;

4. Срв-островок промотора гена РШЛМ4 гиперметилирован в образцах рака предстательной железы. Частота метилирования гена РШЛМ4 составила 65% при раке предстательной железы ранней стадии и 82% при раке предстательной железы поздней стадии. Такие высокие показатели частоты метилирования свидетельствует о потенциальной возможности использования гена РБЫМ4 в ранней диагностике рака предстательной железы.

5. Частота метилирования гена КШ7 в образцах рака предстательной железы ранней стадии составила 70%, в образцах рака предстательной железы поздней стадии - 35%, при простатической интраэпителиальной неоплазии -53%.

6. Частота метилирования гена 8ЬС15АЗ составила 70% при раке предстательной железы ранней стадии, 65% при раке предстательной железы поздней стадии, 37% при простатической интраэпителиальной неоплазии.

7. Анализ частоты метилирования генов ТАСБТВ2 и 0А0045Ь в клинических образцах простатической .интраэпителиальной неоплазии и рака предстательной железы продемонстрировал невысокий показатель метилирования, что говорит о небольшом вкладе эпигенетических механизмов в регуляцию экспрессии данных генов.

8. Анализ частоты метилирования в клинических образцах простатической интраэпителиальной неоплазии и рака предстательной железы различных стадий показал отсутствие метилирования генов АЫХА2, АС^РЗ, №130.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ

1. Ibragimova LI. Methylation of tumor-suppressor genes in prostate cancer / I.I. Ibragimova, PJ. Cairns // abstracts / Postdoctoral and Graduate Student Research Conference. - Philadelphia (USA), 2007.

2. Ibragimova I.I. Methylation of PDLIM4 gene in prostate cancer / I.I. Ibragimova, PJ. Cairns // abstracts / Postdoctoral and Graduate Student Research Conference. - Philadelphia (USA), 2008.

3. Ибрагимова И.И. Метилирование промоторного участка гена PDLIM4 при раке предстательной железы / И.И. Ибрагимова, А.Н. Фаттахова // Материалы XLVI международной научной студенческой конференций "Студент и научно-технический прогресс". - Новосибирск, 2008. - С.37-38.

4. Ибрагимова И.И. Изучения статуса метилирования генов BASP1, PDLIM4, IFI30, ARL6IP при раке предстательной железа / И.И. Ибрагимова, А.Н. Фаттахова // Сборник материалов I Всероссийского конгресса студентов и аспирантов - биологов «Симбиоз-Россия-2008». - Казань, 2008. - С. 14-15.

5. Ибрагимова И.И. Анализ метилирования генов-супрессоров опухолевого развития при раке предстательной железы / И.И Ибрагимова, А.Н. Фаттахова // Материалы научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». - Казань, 2008. - С.34

6. Ibanez de Caceres I. Identification of novel tumor suppressor genes by epigenetic reactivation in prostate cancer /1. Ibanez de Caseres, I. Ibragimova, A. Hoffman, P. Cairns, A.N. Fattahova // Материалы научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». -Казань, 2008. -С.159-160.

7. Ибрагимова И.И. Анализ метилирования промоторного участка гена PDLIM4 при раке предстательной железы / И.И. Ибрагимова, А.Н. Фаттахова // Ученые записки Казанского Государственного Университета. - 2008. - Т.150. -№2. -С.136-143.

8. Акберова Н.И. Метилирование генов-супрессоров при раке простаты / Н.И. Акберова, И.И. Ибрагимова // Учебное пособие по курсу «Биоинформатика». - Казань, 2008.

Отзывы на автореферат просьба отправлять по: e-mail; il siya20@rambler.ru факсу: (843)238-71-21

Подписано в печать 27 09 08. Размер бумаги 60x80 1/16 Печать на RISO Уел печ л 1,5. Заказ № 200 Тираж 100

С готового оригинал - макета отпечатано в ГУПП «Аэрон»

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ибрагимова, Ильсия Ильясовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Рак предстательной железы.

1.2 Простат-специфический антиген.

1.3 Метилирование ДНК.

1.3.1 Ферменты метилирования.

1.3.2 Семейство метил-СрО-связывающих белков.

1.3.3 Функция метилирования.

1.3.4 Роль метилирования в канцерогенезе.

1.4 Гены-супрессоры опухолевого роста.

1.5 Методы идентификации и анализа метилирования ДНК.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Клинический материал.

2.2 Клеточные линии рака предстательной железы.

2.3 Мюгоаггау.

2.3.1 Обработка клеток ингибиторами процесса метилирования.

2.3.2 Реакция обратной транскрипции.

2.3.3 Олигонуклеотидная гибридизация.

2.4 Выделение нуклеиновых кислот.

2.4.1 Выделение ДНК из клеточных культур.

2.4.2 Выделение РНК из клеточных культур.

2.4.3 Выделение ДНК из тканевых срезов, зафиксированных в парафине.

2.4.4 Выделение ДНК из замороженных срезов тканей.

2.5 Бисульфитная модификация ДНК.

2.6 Полимеразная цепная реакция.

2.6.1 Бисульфитная ПЦР.

2.6.2 Метилспецифическая ПЦР.

2.6.3 Метилспецифическая ПЦР в реальном времени.

2.7 Гель-электрофорез.

2.8. Выделение продуктов амплификации из агарозного геля.

2.9 Секвенирование.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Поиск генов, метилированных в клеточных линиях рака предстательной железы.

3.1.1 Схема эксперимента.

3.1.2 Ингибиторы процесса метилирования ДНК.

3.1.3 Определение оптимальной концентрации 5-аза-2-диоксицитидина.

3.1.4 Эпигенетическая реактивация генома и анализ полученных данных.

3.2 Анализ экспрессии генов в клетках морфологически нормальной предстательной железы.

3.3 Анализ Срв-островков.

3.4 Определение статуса метилирования СрО-островков отобранных генов в клеточных линиях рака предстательной железы и морфологически нормальной ткани предстательной железы.

3.5 Анализ частоты метилирования генов РОЫМ4, КЯТ7, 8ЬС15АЗ, ТАС8ТБ2, ОАВБ45Ъ, А()РЗ, АМХА2, 1И30 в клинических образцах простатической интраэпителиальной неоплазии и рака предстательной железы различных стадий.

3.5.1 ГенРШЛМ4.

3.5.2 Ген КЮ7.

3.5.3 Ген 8ЬС15АЗ.

3.5.4 ГенТАС8ТБ2.

3.5.5 Ген ОАЕ)Б45Ь.

3.5.6 ГенАСМРЗ.

3.5.7 ГенШЗО.

3.5.8 Ген АЫХА2.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация новых потенциальных генов-супрессоров опухолевого роста, метилированных при раке предстательной железы"

Актуальность проблемы

Известно, что одной из важнейших причин перерождения нормальной клетки в неопластическую является нарушение функционирования генов-супрессоров опухолевого роста. Изменения в работе этих генов приводят к возникновению и прогрессии развития рака, а восстановление функции - к существенному замедлению пролиферации опухолевых клеток. Исследования последнего десятилетия показали, что наряду с генетическими событиями, обуславливающими инактивацию клеточных генов вследствие изменения последовательности ДНК, важную роль в процессе канцерогенеза играют также эпигенетические явления, не затрагивающие первичную структуру ДНК, но влияющие на экспрессию генов (Jones et al., 2002). Одним из таких эпигенетических изменений является локальное гиперметилирование специфических последовательностей - CpG-островков, расположенных в 5'-регуляторных районах многих генов, которое влечет за собой подавление экспрессии гена либо в результате прямого ингибирования связывания транскрипционных факторов с ДНК, либо в результате привлечения корепрессоров транскрипции (Klose et al., 2006). До сих пор остается открытым вопрос о механизмах инициации гиперметилирования CpG-островков в процессе образования опухоли.

Цель и задачи исследования

Для ее достижения нами были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Провести ингибирование процесса метилирования ДНК в двух андроген - зависимых клеточных линиях рака предстательной железы ЫМСаР и М1)А2Ь и в двух андроген - независимых клеточных линиях рака предстательной железы Би-145 и РС-3;

2. Идентифицировать гены, экспрессия которых увеличилась вследствие ингибирования процесса метилирования;

3. Провести скрининг идентифицированных генов на предмет их экспрессии в клетках морфологически нормальной предстательной железы и наличия СрО-островка в составе их промоторов;

4. Исследовать статус метилирования СрО-островков отобранных генов в клеточных линиях рака предстательной железы и морфологически нормальной ткани предстательной железы;

Научная новизна

В двух андроген — зависимых клеточных линиях рака предстательной железы Ь>ГСаР и МОА2Ь и в двух андроген — независимых клеточных линиях рака предстательной железы Би-145 и РС-3 идентифицировано 170 генов, экспрессия которых увеличилась в результате ингибирования процесса метилирования ДНК. Из них промоторы двадцати пяти генов имели в своем составе СрО-островки, удовлетворяющие необходимым условиям, и их экспрессия в клетках нормальной предстательной железы была выше, чем при раковой патологии.

Впервые при анализе статуса метилирования Срв-островков двадцати пяти отобранных генов в клеточных линиях рака предстательной железы и морфологически нормальной ткани предстательной железы было показано, что гены ТАС8ТБ2, Ш130, КЯТ7, А№СА2, А(ЗРЗ, тЫМ4, 8ЬС15АЗ, ОАОЭ45Ь метилированы в клеточных линиях РПЖ, но не метилированы в норме.

Впервые проведен анализ частоты метилирования Срв-островков генов ТАС8ТБ2, Ш130, КШ7, АЖА2, А(ЗРЗ, тЫМ4, 8ЬС15АЗ, вАВВ45Ъ в клинических образцах простатической интраэпителиальной неоплазии и рака предстательной железы различных стадий. Высокая частота метилирования генов РБЫМ4, К11Т7 и 8ЬС15АЗ при раке предстательной железы говорит о потенциальной возможности использования вышеперечисленных генов в качестве биологических маркеров ранней диагностики рака предстательной железы.

Практическая значимость

Материалы исследования также представляют интерес в свете расширения понимания роли эпигенетических факторов в регуляции экспрессии ряда клеточных генов при злокачественной трансформации клетки, а также получения новых дополнительных знаний об участии некоторых клеточных генов в процессе канцерогенеза.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ибрагимова, Ильсия Ильясовна

выводы

1. В двух андроген - зависимых клеточных линиях рака предстательной железы LNCaP и MDA2b и в двух андроген - независимых клеточных линиях рака предстательной железы DU-145 и РС-3 идентифицировано 170 генов, экспрессия которых увеличилась в результате ингибирования процесса метилирования ДНК.

2. Из 170 генов, экспрессия которых увеличилась в результате ингибирования процесса метилирования ДНК, 25 имеют в составе своих промоторов CpG-островки и транскрипционно активны в клетках морфологически нормальной предстательной железы.

3. Гены TACSTD2, PDLIM4, ANXA2, IFI30, GADD45b, AQP3, KRT7, SLC15A3 метилированы в клеточных линиях рака предстательной железы, в отличие от морфологически нормальной ткани простаты, где метилирование данных генов обнаружено не было.

4. CpG-островок промотора гена PDLIM4 гиперметилирован в образцах рака предстательной железы. Частота метилирования гена PDLIM4 составила 65% при раке предстательной железы ранней стадии и 82% при раке предстательной железы поздней стадии. Такие высокие показатели частоты метилирования свидетельствует о потенциальной возможности использования гена PDLIM4 в ранней диагностике рака предстательной железы.

5. Частота метилирования гена KRT7 в образцах рака предстательной железы ранней стадии составила 70%, в образцах рака предстательной железы поздней стадии — 35%, при простатической интраэпителиальной неоплазии - 53%.

6. Частота метилирования гена SLC15A3 составила 70% при раке предстательной железы ранней стадии, 65%) при раке предстательной железы поздней стадии, 37%) при простатической интраэпителиальной неоплазии.

7. Анализ частоты метилирования генов ТАС8Т02 и ОАОБ45Ь в клинических образцах простатической интраэпителиальной неоплазии и рака предстательной железы продемонстрировал невысокий показатель метилирования, что говорит о небольшом вкладе эпигенетических механизмов в регуляцию экспрессии данных генов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Последние годы ознаменовались значительными успехами молекулярно-генетических исследований в области эпигенетики. Интенсивное изучение метилирования ДНК, в том числе в процессе канцерогенеза, дает основание полагать, что в ближайшем будущем откроются новые возможности для разработки эффективных методов диагностики, мониторинга, прогноза и терапии опухолей. Гиперметилирование Срв-островков имеет несколько принципиальных отличий от других генетических изменений, происходящих в многостадийном процессе опухолеобразования, дающим ему неоспоримое преимущество: гиперметилирование случается в пределах одного и того же региона определенного гена, что облегчает исследователям работу с ним; на данный момент разработаны высокочувствительные методы детекции на основе ПЦР, позволяющие распознавать метилированный аллель в присутствии большего количества нормальной ДНК; гиперметилирование обратимо, т.е. существует возможность восстановить функционирование прежде молчащего гена.

В настоящее время существует несколько основных областей применения результатов исследований абберантного метилирования генов. Во-первых, ранняя диагностика на начальном этапе опухолеобразования, причем акцент делается на поиск маркеров, метилированных при определенных типах рака. Так, например, было установлено, что ген в8ТР1 метилирован в 70-90% случаях РПЖ; ген Т1МРЗ - в 60-80% случаях рака почки и т.д. Разработка таких методов как МС-ПЦР, МС-ПЦР в реальном времени позволяют быстро и легко анализировать ДНК, выделенную из слюны, мочи, соскобов слизистой ткани и других жидкостей тела, что делает возможным увеличить специфичность диагностики. Помимо этого, идентификация абсолютно новых маркеров метилирования стало возможным благодаря технологии ДНК чипов.

Следующее направление исследований — это прогнозирование течение болезни и возможной реакции опухоли на лекарственную терапию. Было показано, например, что гиперметилирование генов ЭАРК и р16ШК4а ассоциировано с агрессивно-метастазирующими опухолями легких и толстого кишечника. Также ведутся активные исследования в разработке лекарственных препаратов, использование которых вызывало бы деметилирующий эффект. Разработанные к настоящему времени ингибиторы метилирования являются причиной тотального гипометилирования генома, что, в свою очередь, имеет негативные последствия. До сих пор остается неразрешенной проблемой избирательная реактивация определенных генов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Клинический материал

Клинические образцы рака предстательной железы (РПЖ), простатической интраэпителиальной неоплазии (ПИН) и морфологически нормальной предстательной железы были получены в госпитале ракового центра Фокс Чейз в результате оперативных вмешательств. Клинический диагноз был подтвержден патоморфологическим исследованием в отделении патоморфологии ракового центра Фокс Чейз. В общей сложности в работе было использовано 37 образца ДНК, выделенной из опухолей пациентов с диагнозом аденокарцинома предстательной железы и 19 образцов — с диагнозом ПИН. В ходе исследования образцы РПЖ были разделены на 2 подгруппы. Первую подгруппу составляли образцы опухолей ранних стадий с суммой баллов по шкале Глисона не более 7; во вторую подгруппы были включены образцы опухолей с суммой баллов по шкале Глисона от 8 и выше. Средний возраст больных в первой подгруппе составил 55,9 лет (42-67 лет); во второй подгруппе — 64,1 года (54-82 года). Средний возраст больных ПИН на момент биопсии был 58,7 лет (50-74 лет). Также в работе были использованы 3 образца ДНК, выделенной из морфологически нормальной ткани предстательной железы, полученной от пациентов с диагнозом рак мочевого пузыря в результате оперативного вмешательства. Средний возраст пациентов составил 70 лет (63-81 год). Отсутствие новообразований в предстательной железе было подтверждено патоморфологическим исследованием.

2.2 Клеточные линии рака предстательной железы В данной работе были использованы следующие клеточные линии РПЖ: андроген-независимые клеточные линии РС-3 и Би-145, полученные из костных метастаз и метастаз головного мозга соответственно; и андрогензависимые клеточные линии LNCaP и MDA2b, полученные из метастаз лимфатических узлов и костей.

2.3 Microarray

2.3.1 Обработка клеток ингибиторами процесса метилирования ДНК

Суспензии клеток клеточных линий рака предстательной железы LNCaP, DU-145, РС-3 и MDA2b обрабатывались ингибиторами метилирования - 5-аза-2-диоксицитидин и трихостатин А. 5-аза-2-диоксицитидин (Sigma, St. Louis, USA) растворяли в PBS до конечной концентрации 5 мМ/л и в таком виде хранили при -80°С. Трихостатин А (Walco, Richmond, USA) растворяли в этаноле до концентрации 330 мкМ/л и хранили при -20°С.

На первом этапе работы к суспензии с клетками добавляли 5-аза-2-диоксицитидин до конечной концентрации 5 мкМ/л, далее через 24 часа процедуру повторяли вновь и, если это необходимо, то еще раз до тех пор, пока клетки не пройдут два цикла удвоения. За 24 часа до выделения РНК из клеточного материала, клетки также обрабатывались трихостатином А (конечная концентрация 500 нмоль/л). Контрольные образцы клеток, обработанные эквивалентным количеством PBS и этанола, культивировались идентичное количество времени, что и обработанные 5-аза-2-диоксицитидином и трихостатином А клетки.

На следующем этапе эксперимента мы выделяли РНК из обработанных 5-аза-2-диоксицитидином и трихостатином А и контрольных клеток, с последующей очисткой РНК с использованием набора RNAeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, USA) в соответствии с протоколом производителя. Качество РНК подтверждали электрофоретическим разделением 28S и 18S-субъединиц рРНК в агарозном геле. Далее 20 мкг тотальной РНК подвергали реакции обратной транскрипции с целью получения кДНК, которая впоследствии использовалась для олигонуклеотидной гибридизации.

2.3.2 Реакция обратной транскрипции

Реакция обратной транскрипции представляет собой метод создания комплементарной ДНК (кДНК) на основе матричной РНК (мРНК) с помощью фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы и специального Олиго(сГГ)24 праймера, представляющий собой олигонуклеотид длиной 24 п.н., комплементарный poly(A) хвосту м-РНК.

Для получения к ДНК, к 20 мкг РНК добавляли 1 мкл Олиго(сГГ)24 праймера (500 нг/мл), инкубировали 8 мин при 70°С, далее быстро охлаждали на льду с целью предотвращения отжига праймера на матрице. Далее в раствор добавляли 4 мкл ОТ-буфера; 2 мкл дитиотреитола (0,1 М); 2 мкл дНТФ; 1 мкл RNasin (ингибитор рибонуклеаз); 1 мкл SuperScript II обратной транскриптазы (все производства Invitrogen), смесь инкубировали при 42°С в течение 1,5 ч. Образцы откручивали, добавляли 10 мкл NaOH (1 М), инкубировали 10 мин при 70°С. Далее для осаждения кДНК, к образцам добавляли 10 мкл НС1 (1 М), 4 мкл ацетата натрия, 1 мкг гликогена, 100 мкл охлажденного этанола (100%), инкубировали при -20°С в течение ночи. Далее образцы центрифугировали 30 мин при 14000 об/мин, супернатант отбирали, осадок промывали 70% охлажденным этанолом, вновь центрифугировали при тех же условиях, супернатант отбирали, осадок сушили и разводили в 20 мкл воды. Полученную кДНК использовали для гибридизации с ДНК чипом для последующего анализа экспрессии генов.

2.3.3 Олигонуклеотидная гибридизация

Теоретическая основа метода ДНК чипов базируется на принципе комплементарной гибридизации одноцепочечных полинуклеотидных цепей нуклеиновых кислот. Полученную в результате реакции обратной транскрипции кДНК метили с использованием флуоресцентных меток -производных индокарбоксицианина СуЗ и индодикарбоксицианина Су5 (Amersham Bioscience, Piscataway, USA). Далее меченая кДНК гибридизовалась с 15К ДНК чипом (MWG Biotech, Inc., High Point, USA) в течении 18 часов при 42°С в соответствии с протоколом производителя. Гибридизацию повторили дважды, при этом меняя флуоресцентные красители (dye flip) для каждой клеточной линии. Далее слайды, полученные при гибридизации, сканировались с использование сканера GMS 428 (Affymetrix, Santa Clara, USA) для получения изображений высокого разрешения для обоих СуЗ и Су5 красителей. Анализ изображений проводили с использованием пакета программ ImaGene (BioDiscovery, Inc., El Segundo, USA).

Гены, соответствующие определенной ячейке с олигонуклеотидной последовательностью на ДНК чипе, идентифицировались с использованием оптимизированного алгоритма сегментации. Из анализа были исключены ячейки с сигналом плохого качества, а также сигналом, уровень которого не превышает фоновый шум. Полученные изображения ДНК чипов использовались для анализа данных с применением пакета программ GeneSight (BioDiscovery, Inc., El Segundo, USA), включающий в себя учет фонового шума, нормализацию данных (трансформация Лоуесса) и статистический анализ данных.

2.4 Выделение нуклеиновых кислот 2.4.1 Выделение ДНК из клеточного материала

Предварительно перенеся среду с клетками из чашки Петри в пробирку, чашку Петри обрабатывали 0.25% раствора трипсина и ЭДТА с последующей инкубацией в течение 5 мин при 40°С. Затем проинкубированную смесь переносили в пробирку со средой. Далее образец центрифугировался при 4°С в течение 5 мин при 1000 об/мин, надосадок сливали, к полученному осадку добавляли 1 мл PBS, вновь центрифугировали при тех же условиях. Процедуру повторяли дважды. После этого к образцу добавляли 200 мкл смеси PBS и ЭДТА (250:1), 350 мкл буфера 1, 40 мкл (10%), 10 мкл протеиназы К и инкубировали в течение ночи при 37°С. На следующем этапе добавляли 400 мкл смеси фенол-хлороформа и центрифугировали ДНК в течение 5 мин при 14000 об/мин. Затем отбирали верхнюю фазу и процедуру повторяли. На последнем этапе центрифугирования к раствору добавляли равный объем смеси хлороформа -изоамилового спирта (24:1) и вновь центрифугировали ДНК. Далее ДНК преципитировали 2,5 объемами холодного этанола (96%). Выпавшую в осадок ДНК извлекали при помощи стеклянной палочки, сушили на воздухе и растворяли в 100 мкл ТЕ буфера.

2.4.2 Выделение РНК из клеточного материала

На первом этапе работы удаляли ростовую среду из чашки, далее обрабатывали чашку тризолом и хлороформом и переносили лизат в пробирки, центрифугировали 15 мин при 4000 об/мин. Далее переносили супернатант в чистые пробирки, добавляли изопропанол (их расчета '/г от объема используемого тризола), инкубировали при комнатной температуре 10 мин, затем вновь центрифугировали 10 мин при 4000 об/мин. Сливали супернатант, промывали осадок 70% этанолом, еще раз центрифугировали при тех же условиях. Сливали этанол, осадок сушили и разводили в 40 мкл ОЕРС-воде.

2.4.3 Выделение ДНК из тканевых срезов, зафиксированных в парафине

Образец ткани, зафиксированный в парафине, измельчали в чашке Петри и переносили в пробирку с добавлением 1 мл ксилола. Тщательно перемешивали и инкубировали в теченне 10 мин при комнатной температуре. Затем образец центрифугировали в течение 5 мин при 14000 об/мин, сливали супернатант и повторяли процедуру еще раз. Добавляли 1 мл 96% этанола, вновь центрифугировали, сливали супернатант и полученный осадок сушили на воздухе.

На следующем этапе мы добавляли 350 мкл буфера 1, 40 мкл 10% SDS, 10 мкл протеииазы К и инкубировали при 50°С до полного растворения осадка (процесс может длиться от нескольких часов до нескольких дней). Затем к образцу добавляли равный объем смеси фенол-хлороформа, тщательно мешали и центрифугировали в течение 5 мин при 14000 об/мин, процедуру повторяли дважды. После этого к раствору добавляли эквивалентный объем смеси хлороформа - изоамиловго спирта (24:1) и вновь экстрагировали ДНК. ДНК осаждали 2,5 объемами холодного 96% этанола с добавлением 3 мкл гликогена и 27 мкл ацетата аммония с последующим хранением образца при -20°С в течение 24-72 часов. Далее образец центрифугировали 20-30 мин при 14000 об/мин. ДНК сушили на воздухе и растворяли в 20 мкл ТЕ буфера (pH 8.0).

2.4.4 Выделение ДНК из замороженных срезов тканей

С использованием лезвия замороженный материал гомогенизировали в чашке Петри и переносили гомогенат в раствор буфера 1 (350 мкл), затем добавляли 40 мкл 10% SDS и 10 мкл протеиназы К. Инкубировали в течение ночи при 37°С. На следующий день образец переносили в пробирки с фазоблокирующим гелем (phase lock gel), служащим разделительным барьером между двумя фазами. Далее добавляли 400 мкл смеси фенол-хлороформа и центрифугировали ДНК в течение 5 мин при 14000 об/мин. Затем отбирали верхнюю фазу и процедуру повторяли. На последнем этапе центрифугирования к раствору добавляли равный объем смеси хлороформа -изоамилового спирта (24:1) и вновь экстрагировали ДНК. Далее ДНК преципитировали 2,5 объемами холодного этанола (96%). Выпавшую в осадок ДНК извлекали при помощи стеклянной палочки, сушили на воздухе и растворяли в 100 мкл ТЕ буфера.

2.5 Бисульфитная модификация ДНК

Данный метод основан на способности иона гидросульфита, получающегося при растворении бисульфита натрия в воде, взаимодействовать с цитозином, с превращением последнего в урацил, таким образом, при бисульфитной модификации ДНК, все неметилированные цитозины конвертируются в урацил, в то время как метилированные цитозины в составе СрО-островков остаются неизменными (Науа1зи е1 а1., 1970). В дальнейшем при амплификации исследуемого участка ДНК все остатки урацила и тимина амплифицируются как тимин и только 5-метилцитозин воспроизводится как цитозин (рис. 9).

Рис.9. Общая схема превращения цитозина в урацил в ходе бисульфитной модификации ДНК.

1 мкг геномной ДНК денатурировали 0.2М раствором NaOH в течение 10 мин при 37°С, затем модифицировали гидрохиноном и Na2S2C>3 (pH 5.0) в течение 16-18 часов при 50°С. Модифицированную ДНК очищали с использованием набора Wizard DNA Clean-Up system (Promega, Madison, WI) в соответствии с протоколом производителя. Далее образец обрабатывался О.ЗМ NaOH с последующим осаждением ДНК 96% этанолом в присутствии гликогена и ацетата аммония. Осадок высушивали и разводили в 25 мкл дистиллированной воды.

2.7 Полимеразная цепная реакция

2.6.1 Бисульфитная ПЦР

Бисульфитная ПЦР представляет собой процесс амплификации бисульфитно-модифицированной ДНК. В ходе конструирования праймеров к данному виду ПЦР были учтены следующие требования: исключение вторчных структур в составе праймеров, отсутствие комплементарных участков в паре праймеров, длина не должна превышать 25-27 нуклеотидов, содержание CpG динуклеотидов в составе праймеров должно быть минимальным. Для оценки структуры праймеров была использована программа, представленная на сайте www.genelink.com.

Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала 3 нг бисульфитно-модифицированной ДНК, по 500 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеотид-трифосфатов, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы (Invitrogen), по 35-50 пмоль у соотвествующих праймеров, 1 буфер для ПЦР. Условия ПЦР: начальная денатурация - 5 мин, 94°С; затем 35-38 циклов: денатурация - 1 мин, 94°С, отжиг — 1 мин при соотвествующей температуре (см. табл. 2) и элонгация - 1 мин при 72°С; далее заключительные 10 мин элонгации при 72°С. Аплифицирование проводили с использованием амплификаторов «Mastercycler gradient» (Eppendorf, Germany) и «PCR Sprint Thermal Cycler» (Thermo electron corporation, USA).

Состав праймеров, использованных для амплификации бисульфитно-модифицированной ДНК, температура отжига и размер продукта амплификации представлены в таблице 2.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ибрагимова, Ильсия Ильясовна, Казань

1. Ванюшин Б.Ф. Материализация эпигенетики, или небольшие изменения ДНК с большими последствиями / Б.Ф. Ванюшин // Химия и жизнь. - 2004. - Т.2. - С.32-37.

2. Гайворонский И. В. Нормальная анатомия человека / И. В. Гайворонский. М.:СпецЛит, 2007. - 560с.

3. Гвоздев В. А. Регуляция активности генов, обусловленная химической модификацией (метилированием) ДНК / В.А. Гвоздев // Соросовский образовательный журнал. 1999. - №10. - С. 11-17.

4. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза / Б.П. Копнин // Биохимия. 2000. - Т.65. - С.5-33.

5. Красный С.А. Внутриполостное ультразвуковое исследование в диагностике рака мочевого пузыря и предстательной железы / С.А. Красный, С.Л. Поляков // Новости лучевой диагностики. 2001. - Т.2. -С.40-46.

6. Лоран О.Б. Дифференциальная диагностика опухолей предстательной железы с помощью определения уровня простатспецифического антигена сыворотки крови / О.Б. Лоран, Д.Ю. Пушкарь, В.Н. Степанов. М.:Медпресс - 2000. - 143с.

7. Лихтенштейн A.B. Метилирование ДНК и канцерогенез / A.B. Лихтенштейн, Н.П. Киселева//Биохимия. -2001. -Т.61. -С.235-255.

8. Матвеев Б.Л. Рак предстательной железы / Б.Л. Матвеев, Б.В. Бухаркин. -М. -2000. 153с.

9. Пожарисский K.M. Патоморфологическая характеристика и особенности карциномы предстательной железы. Значение простатической интраэпителиальной неоплазии / K.M. Пожарисский, A.B. Воробьев // Практическая Онкология. 2001. - №2. - С. 17-23.

10. Плохов В.Н. Онкология. Полный справочник / В.Н.Плохов, Т.Н.Попова, С.В.Аверьянова, В.Ю.Барсуков, Ю.П.Дугин и др.; под ред. Ю.Ю. Елисеева. М.:Эксмо, 2007. - 736с.

11. Пушкарь Д.Ю. Простатспецифический антиген и биопсия предстательной железы / Д.Ю. Пушкарь, А.В. Говоров, А.В. Бормотин. — М.:Медпресс-информ, 2003. 160с.

12. Чемерис А.В. Секвенирование ДНК / А.В. Чемерис, Э.Д.Ахунов,

13. B.А. Вахитов. М.:Наука, 1999. - 429с.

14. Чиссов В.И. Клинические рекомендации. Онкология / В.И. Чиссов. М.: Гэотар-Мед, 2008. - 720с.

15. Чумаков П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью / П.М. Чумаков // Биохимия. 2000. - Т.65. - С.34-47.

16. Шульпекова Ю.Р. Рак предстательной железы / Ю.Р. Шульпекова //РМЖ. 1999. Т.7 - №10 -С.22-29.

17. Agre P. Aquaporins: a family of water channel proteins / P. Agre, S. Sasaki, M.J. Chrispeels // Am J Physiol. 1993. - V.265. - No.3. - P.461 -466.

18. Alberti S. Biochemical characterization of Trop-2, a cell surface molecule expressed by human carcinomas: formal proof that the monoclonal antibodies T16 and MOv-16 recognize Trop-2 / S. Alberti, S. Miotti, M. Stella,

19. C.E. Klein, M. Fornaro, S. Menard, M.I. Colnaghi // Hybridoma. 1992. -V. 11. - No.5. - P.539-545.

20. Antequera F. Number of CpG islands and genes in human and mouse / F. Antequera, A. Bird // Proc Natl Acad Sci U S A. 1993. - V.90. - No.24. -P.11995-11999.

21. Batzer M.A. Alu repeats and human genomic diversity / M.A. Batzer, P.L. Deininger // Nat Rev Genet. 2002. - V.3. - No.5. - P.370-379.

22. Baylin S.B. in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia / S.B. Baylin, J.G. Herman, J.R. Graff, P.M. Vertino, J.P. Issa // Adv Cancer Res.- 1998. V.72. — P. 141-196.

23. Bednar M. DNA microarray technology and application / M. Bednar // Med Sci Monit. 2000. - V.6. - No.4. - P.796-800.

24. Behr M.A. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray / M.A. Behr, M.A. Wilson, W.P. Gill, H. Salamon, G.K. Schoolnik, S. Rane, P.M. Small // Science. 1999. - V.284. - No.5419. -P.1520-1523.

25. Bestor T.H. Creation of genomic methylation patterns / T.H. Bestor, B. Tycko // Nat Genet. 1996. - V.12. - No.4. - P.363-367.

26. Bhattacharya S.K. A mammalian protein with specific demethylase activity for mCpG DNA / S.K. Bhattacharya, S. Ramchandani, N. Cervoni, M. Szyf//Nature. 1999. - V.397. -No.6720. - P.579-583.

27. Bird A.P. Gene number, noise reduction and biological complexity / A.P. Bird // Trends Genet. 1995. - V.l 1. -No.3. -P.94-100.

28. Bird A.P. The relationship of DNA methylation to cancer / A.P. Bird // Cancer Surv. 1996. - V.28. — P.87-101.

29. Bird A.P. Non-methylated CpG-rich islands at the human alpha-globin locus: implications for evolution of the alpha-globin pseudogene / A.P. Bird, M.H. Taggart, R.D. Nicholls, D.R. Higgs // EMBO J. 1987. - V.6. - No.4. -P.999-1004.

30. Bolden J.E. Anticancer activities of histone deacetylase inhibitors / J.E. Bolden, MJ. Peart, R.W. Johnstone // Nat Rev Drug Discov. 2006. - V.5.- No.9. — P.769-784.

31. Bubendorf L. High-throughput microarray technologies: from genomics to clinics / L. Bubendorf// Eur Urol. 2001. - V.40. - No.2. - P.231-238.

32. Buttrick G.J. Akt regulates centrosome migration and spindle orientation in the early Drosophila melanogaster embryo / G.J. Buttrick, L.M. Beaumont, J. Leitch, C. Yau, J.R. Hughes, J.G. Wakefield // J Cell Biol. 2008.- V.l 80. No.3. - P.537-548.

33. Caims P. Gene methylation and early detection of genitourinary cancer the road ahead / P. Cairns // Nature Review Cancer - 2007. - V.7. -P.531-543.

34. Cameron E.E. Synergy of demethylation and histone deacetylase inhibition in the re-expression of genes silenced in cancer / E.E. Cameron, K.E.

35. Bachman, S. Myohanen, J.G. Herman, S.B. Baylin // Nat Genet. 1999. -V.21. — No.l. - P. 103-107.

36. Campbell A.M. Public access for teaching genomics, proteomics, and bioinformatics / A.M. Campbell // Cell Biol Educ. 2003. - V.2. - No.2. -P.98-111.

37. Catteau A. Methylation of the BRCA1 promoter region in sporadic breast and ovarian cancer: correlation with disease characteristics / A. Catteau, W.H. Harris, C.F. Xu, E. Solomon // Oncogene. 1999. - V.18. - No.ll. -P.1957-1965.

38. Chen R.Z. DNA hypomethylation leads to elevated mutation rates / R.Z. Chen, U. Pattersson, C. Beard, L. Jackson-Grusby, R. Jaenisch // Nature. -1998. -No.395. -P.89-93.

39. Chen W.G. Derepression of BDNF transcription involves calcium-dependent phosphorylation of MeCP2 / W.G. Chen, Q. Chang, Y. Lin, A. Meissner, A.E. West, E.C. Griffith, R. Jaenisch, M.E. Greenberg // Science. -2003. V.302. - No.5646. - P.885-889.

40. Chiang Y. Specific down-regulation of annexin II expression in human cells interferes with cell proliferation / Y. Chiang, A. Rizzino, Z.A. Sibenaller, M.S. Wold, J.K. Vishwanatha // Mol Cell Biochem. 1999. -V.199. - No.1-2. — P.139-147.

41. Cobrinik D. Pocket proteins and cell cycle control / D. Cobrinik // Oncogene. -2005. -V.24. No.l7. -P.2796-2809.

42. Cunningham J.M Hypermethylation of the hMLHl promoter in colon cancer with microsatellite instability / J.M. Cunningham, E.R. Christensen, D.J. Tester, C.Y. Kim, P.C. Roche, L.J. Burgart, S.N. Thibodeau // Cancer Res. -1998. V.58. -No.15. -P.3455-3460.

43. Dahia P.L. PTEN, a unique tumor suppressor gene / P.L. Dahia // Endocr Relat Cancer. 2000. - V.7. - No.2. - P. 115-129.

44. Daniel H. The proton oligopeptide cotransporter family SLC15 in physiology and pharmacology / H. Daniel, G. Kottra // Pflugers Arch. 2004. -V.447. -No.5. - P.610-618.

45. De Marzo A.M. Abnormal regulation of DNA methyltransferase expression during colorectal carcinogenesis / A.M. De Marzo, V.L. Marchi, E.S. Yang, R. Veeraswamy, X. Lin, W.G. Nelson // Cancer Res. 1999. -V.59. -No.16. -P.3855-3860.

46. De Ruijter A.J. Histone deacetylases (HDACs): characterization of the classical HDAC family / A.J. de Ruijter, A.H. van Gennip, H.N. Caron, S. Kemp, A.B. van Kuilenburg // Biochem J. 2003. - V.370. - No.Pt 3. - P.737-749.

47. De Vitis L.R. Screening for mutations in the neurofibromatosis type 2 (NF2) gene in sporadic meningiomas / L.R. De Vitis, A. Tedde, F. Vitelli, F. Ammannati, P. Mennonna, U. Bigozzi, E. Montali, L. Papi // Hum Genet. -1996. V.97. - No.5. - P.632-637.

48. Debouck C. DNA microarrays in drug discovery and development / C. Debouck, P.N. Goodfellow // Nat Genet. 1999. - V.21. - No.l Suppl. - P.48-50.

49. Didenko V.V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications / V.V. Didenko // Biotechniques. -2001. V.31. - No.5. - P. 1106-1116.

50. Dimova D.K. The E2F transcriptional network: old acquaintances with new faces / D.K. Dimova, N.J. Dyson // Oncogene. 2005. - V.24. -No.17. -P.2810-2862.

51. Dobrovic A. Methylation of the BRCA1 gene in sporadic breast cancer / A. Dobrovic, D. Simpfendorfer // Cancer Res. 1997. - V.57. - No. 16. -P.3347-3350.

52. Downward J. PI 3-kinase, Akt and cell survival / J. Downward // Semin Cell DevBiol. -2004. V.15. -No.2. - P. 177-182.

53. Dulami E/ Detection of bladder cancer in urine by tumor suppressor gene hypermethylation panel / E/Dulami, R.C.Uzzo, R.E. Greenberg, T. Al-Saleem, P.J. Cairns // Clin. Cancer Res. -2004. No. 10. - P. 1887-1893.

54. El Sewedy T. Cloning of the murine TROP2 gene: conservation of a PIP2-binding sequence in the cytoplasmic domain of TROP-2 / T. El Sewedy, M. Fornaro, S. Alberti // Int J Cancer. 1998. - V.75. - No.2. - P.324-330.

55. Erikson E. Identification of a cellular protein substrate phosphorylated by the avian sarcoma virus-transforming gene product / E. Erikson, R.L. Erikson // Cell. 1980. - V.21. - No.3. - P.829-836.

56. Esteller M. CpG island hypermethylation and tumor suppressor genes: a booming present, a brighter future / M. Esteller // Oncogene. 2002. - V.21. - No.35. - P.5427-5440.

57. Esteller M. MLH1 promoter hypermethylation is associated with the microsatellite instability phenotype in sporadic endometrial carcinomas / M. Esteller, R. Levine, S.B. Baylin, L.H. Ellenson, J.G. Herman // Oncogene. -1998. V.17. -No.18. -P.2413-2417.

58. Esteller M. A gene hypermethylation profile of human cancer / M/ Esteller, P.C. Corn, S.B. Baylin, J.G. Herman // Cancer Res. V.61. - P. 32253229.

59. Fishbein L. Analysis of somatic NF1 promoter methylation in plexiform neurofibromas and Schwann cells / L. Fishbein, B. Eady, N. Sanek, D. Muir, M.R. Wallace // Cancer Genet Cytogenet. 2005. - V.157. - No.2. -P.181-186.

60. Freedberg I.M. Keratin: a journey of three decades / I.M. Freedberg // J Dermatol. 1993. - V.20. -No.6. -P.321-328.

61. Gardiner-Garden M. CpG islands in vertebrate genomes / M. Gardiner-Garden, M. Frommer // J Mol Biol. 1987. - V.196. - No.2. - P.261-282.

62. Ge Y.Z. Chromatin targeting of de novo DNA methyltransferases by the PWWP domain / Y.Z. Ge, M.T. Pu, H. Gowher, H.P. Wu, J.P. Ding, A. Jeltsch, G.L. Xu // J Biol Chem. 2004. - V.279. - No.24. - P.25447-25454.

63. Gnarra J.R. Mutations of the VHL tumour suppressor gene in renal carcinoma / J.R. Gnarra, K. Toiy, Y. Weng, L. Schmidt, M.H. Wei, H. Li, F. Latif, S. Liu, F. Chen, F.M. Duh//Nat Genet. 1994. - V.7. - No.l. -P.85-90.

64. Gonzalez-Zulueta M. Methylation of the 5' CpG island of the pl6/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing / M. Gonzalez-Zulueta, C.M. Bender, A.S. Yang,

65. T. Nguyen, R.W. Beart, J.M. Van Tornout, P.A. Jones // Cancer Res. 1995. -V.55. - No.20. - P.4531-4535.

66. Goodrich D.W. The retinoblastoma tumor-suppressor gene, the exception that proves the rule / D.W. Goodrich // Oncogene. 2006. - V.25. -No.38. - P.5233-5243.

67. Gowher H. DNA of Drosophila melanogaster contains 5-methylcytosine / H. Gowher, O. Leismann, A. Jeltsch // EMBO J. 2000. -V.19. -No.24. - P.6918-6923.

68. Greger V. Epigenetic changes may contribute to the formation and spontaneous regression of retinoblastoma / V. Greger, E. Passarge, W. Hopping, E. Messmer, B. Horsthemke // Hum Genet. 1989. - V.83. - No.2. -P.155-158.

69. Gurin C.C. Causes and consequences of microsatellite instability in endometrial carcinoma / C.C. Gurin, M.G. Federici, L. Kang, J. Boyd // Cancer Res. 1999. - V.59. - No.2. - P.462-466.

70. Hackman P. A human compound heterozygote for two MLH1 missense mutations / P. Hackman, P. Tannergard, S. Osei-Mensa, J. Chen, M.F. Kane, R. Kolodner, B. Lambert, D. Hellgren, A. Lindblom // Nat Genet. -1997. V.17. -No.2. - P.135-136.

71. Hajjar K.A. Annexin II and regulation of cell surface fibrinolysis / K.A. Hajjar, S.S. Acharya // Ann N Y Acad Sci. 2000. - V.902. - - P.265-271.

72. Hayatsu H. Reaction of sodium bisulfite with uracil, cytosine, and their derivatives / H. Hayatsu, Y. Wataya, K. Kai, S. Iida // Biochemistry. -1970.-V.9.-P. 2858.

73. Hendrich B. Identification and characterization of a family of mammalian methyl-CpG binding proteins / B. Hendrich, A. Bird // Mol Cell Biol. 1998. - V.18. -No.11. -P.6538-6547.

74. Hendrich B. The thymine glycosylase MBD4 can bind to the product of deamination at methylated CpG sites / B. Hendrich, U. Hardeland, H.H. Ng, J. Jiricny, A. Bird//Nature. 1999. - V.401. -No.6750. -P.301-304.

75. Herman J.G. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation / J.G. Herman, S.B. Baylin // N Engl J Med. 2003. - V.349. -No.21. - P.2042-2054.

76. Herman J.G. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands / J.G. Herman, J.R. Graff, S. Myohanen, B.D. Nelkin, S.B. Baylin // Proc Natl Acad Sci USA.- 1996. V.93. - No.18. -P.9821-9826.

77. Kunkel, S.B. Baylin // Proc Natl Acad Sci U S A. 1998. - V.95. - No. 12. -P.6870-6875.

78. Hermann A. The human Dnmt2 has residual DNA-(cytosine-C5) methyltransferase activity / A. Hermann, S. Schmitt, A. Jeltsch // J Biol Chem.- 2003. V.278. - No.34. - P.31717-31721.

79. Horike S. Loss of silent-chromatin looping and impaired imprnting of DLX5 in Rett syndrome / S. Horike, S. Cai, M. Miyano, J.F. Cheng, T. Kohwi-Shigematsu // Nat Genet. 2005. - V.37. -No.l. - P.31-40.

80. Hotclikiss R.D. The mode of action of chemotherapeutic agents / R.D. Hotchkiss // Annu Rev Microbiol. 1948. -V.2 (1 vol.). —P. 183-214.

81. Hung M.S. Drosophila proteins related to vertebrate DNA (5-cytosine) methyltransferases / M.S. Hung, N. Karthikeyan, B. Huang, H.C. Koo, J. Kiger, C.J. Shen // Proc Natl Acad Sci USA.- 1999. V.96. - No.21. - P.11940-11945.

82. Hunt N.C. Loss of E-cadherin expression associated with lymph node metastases in small breast carcinomas / N.C. Hunt, A.G. Douglas-Jones, B. Jasani, J.M. Morgan, M. Pignatelli // Virchows Arch. 1997. - V.430. - No.4.- P.285-289.

83. Jemal A. Cancer statistics, 2008 / A. Jemal, R. Siegel, E. Ward, Y. Hao, J. Xu, T. Murray, MJ. Thun // CA Cancer J Clin. 2008. - V.58. - No.2. -P.71-96.

84. Jones P.A. Cancer epigenetics comes of age / P.A. Jones, P.W. Laird // Nat Genet. 1999. - V.21. -No.2. - P. 163-167.

85. Jones P.A. The fundamental role of epigenetic events in cancer / P.A. Jones, S. Baylin // Nature Genetics Review. 2002. - Vol.3. - P.415-428.

86. Jost J.P. Mechanism of active DNA demethylation during embryonic development and cellular differentiation in vertebrates / J.P. Jost, Y.C. Jost // Gene. 1995. - V. 157. -No.1-2. -P.265-266.

87. Kafri T. Developmental pattern of gene-specific DNA methylation in the mouse embryo and germ line / T. Kafri, M. Ariel, M. Brandeis, R. Shemer, L. Urven,* J. McCarrey, H. Cedar, A. Razin // Genes Dev. 1992. - V.6. -No.5. -P.705-714.

88. Kanai Y. The E-cadherin gene is silenced by CpG methylation in human hepatocellular carcinomas / Y. Kanai, S. Ushijima, A.M. Hui, A. Ochiai, H. Tsuda, M. Sakamoto, S. Hirohashi // Int J Cancer. 1997. - V.71. - No.3. -P.355-359.

89. Kandel E.S. The regulation and activities of the multifunctional serine/threonine kinase Akt/PKB / E.S. Kandel, N. Hay // Exp Cell Res. 1999. - V.253. - No.l. -P.210-229.

90. Kawasaki H. Induction of DNA methylation and gene silencing by short interfering RNAs in human cells / H. Kawasaki, K. Taira // Nature. -2004. V.431. - No.7005. - P.211-217.

91. Khan J. Expression profiling in cancer using cDNA microarrays / J. Khan, L.H. Saal, M.L. Bittner, Y. Chen, J.M. Trent, P.S. Meitzer // Electrophoresis. 1999. - V.20. - No.2. - P.223-229.

92. Kim T.Y. Epigenomic profiling reveals novel and frequent targets of aberrant DNA methylation-mediated silencing in malignant glioma / T.Y. Kim, S. Zhong, C.R. Fields, J.H. Kim, K.D. Robertson // Cancer Res. 2006. - V.66. -No.15.-P/7490-7501.

93. King l.S. Pathophysiology of the aquaporin water channels / L.S. King, P. Agre // Annu Rev Physiol. 1996. - V.5 8. - - P.619-648.

94. Klose RJ. MeCP2 behaves as an elongated monomer that does not stably associate with the Sin3a chromatin remodeling complex / R.J. Klose, A.P. Bird // J Biol Chem. 2004. - V.279. - No.45. - P.46490-46496.

95. Klose R.J. Genomic DNA methylation the mark and its mediators / / R.J. Klose, A.P. Bird // Trends in Biochemical Sciences 2006. - Vol.31. No.2. - P.89-97.

96. Kriaucionis S. DNA methylation and Rett syndrome / S. Kriaucionis, A. Bird // Hum Mol Genet. 2003. - V.12 Spec No 2. - - P.R221-227.

97. K.A. Wetterstrand, A. Patrinos, M.J. Morgan, P. de Jong, J.J. Catanese, K. Osoegawa, H. Shizuya, S. Choi, Y.J. Chen // Nature. 2001. - V.409. -No.6822. — P.860-921.

98. Latif F. Identification of the von Hippel-Lindau disease tumor suppressor gene / F. Latif, K. Tory, J. Gnarra, M. Yao, F.M. Duh, M.L. Orcutt, T. Stackhouse, I. Kuzmin, W. Modi, L. Geil, et al. // Science. 1993. - V.260. -No.5112. - P. 1317-1320.

99. Li E. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality / e. Li, T.H. Bestor, R. Jaenisch // Cell. 1992. - V.69. -No.6. -P.915-926.

100. Hibshoosh, M.H. Wigler, R. Parsons // Science. 1997. - V.275. - No.5308. -P.1943-1947.

101. Li M. Interactions of amoxicillin and cefaclor with human renal organic anion and peptide transporters / M. Li, G.D. Anderson, B.R. Phillips, W. Kong, D.D. Shen, J. Wang // Drug Metab Dispos. 2006. - V.34. - No.4. -P.547-555.

102. Lilja H. A kallikrein-like serine protease in prostatic fluid cleaves the predominant seminal vesicle protein / H. Lilja // J Clin Invest. 1985. - v.76. -No.5. -P.1899-1903.

103. Lilja H. Testing new PSA sub forms to enhance the accuracy of predicting cancer risk and disease outcome in prostate cancer / H. Lilja // Clin Chem. 2008. - V.54. - No.7. - P. 1248-1249.

104. Lilja H. Prostate-specific antigen and prostate cancer: prediction, detection and monitoring / H. Lilja, D. Ulmert, A.J. Vickers // Nat Rev Cancer. 2008. - V.8. - No.4. - P.268-278.

105. Lindahl T. DNA excision repair pathways / T. Lindahl, P. Karran, R.D. Wood // Curr Opin Genet Dev. 1997. - V.7. - No.2. - P.158-169.

106. Lyko F. DNA methylation in Drosophila melanogaster / F. Lyko, B.H. Ramsahoye, R. Jaenisch // Nature. 2000. - V.408. - No.6812. - P.538-540.

107. Lyon M.F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L.) / M.F. Lyon // Nature. 1961. - V.190. - P.372-373.

108. Maehama T. The tumor suppressor, PTEN/MMAC1, dephosphorylates the lipid second messenger, phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate / T. Maehama, J.E. Dixon // J Biol Chem. 1998. - V.273. -No.22. -P.13375-13378.

109. Mai J. Cell surface complex of cathepsin B/annexin II tetramer in malignant progression / J. Mai, D.M. Waisman, B.F. Sloane // Biochim Biophys Acta. -2000. V. 1477. - No. 1-2. -P.215-230.

110. Maloisel L. Suppression of crossing-over by DNA methylation in Ascobolus / L. Maloisel, J.L. Rossignol // Genes Devel. 1998. - No. 12 -P.1381-1389.

111. Martinowich K. DNA methylation-related chromatin remodeling in activity-dependent BDNF gene regulation / K. Martinowich, D. Hattori, H. Wu, S. Fouse, F. He, Y. Hu, G. Fan, Y.E. Sun // Science. 2003. - V.302. -No.5646. - P.890-893.

112. Maurer-Stroh S. The Tudor domain 'Royal Family': Tudor, plant Agenet, Chromo, PWWP and MBT domains / S. Maurer-Stroh, N.J. Dickens, L. Hughes-Davies, T. Kouzarides, F. Eisenhaber, C.P. Ponting // Trends Biochem Sci. 2003. - V.28. - No.2. - P.69-74.

113. Mayer W. Demethylation of the zygotic paternal genome / W. Mayer, A. Niveleau, J. Walter, R. Fundele, T. Haaf // Nature. 2000. - V.403. -No.6769. - P.501-502.

114. McGall G. Light-directed synthesis of high-density oligonucleotide arrays using semiconductor photoresists / G. McGall, J. Labadie, P. Brock, G. Wallraff, T. Nguyen, W. Hinsberg // Proc Natl Acad Sci USA.- 1996. V.93. -No.24. -P.13555-13560.

115. McKeon C. Unusual methylation pattern of the alpha 2 (1) collagen gene / C. McKeon, H. Ohkubo, I. Pastan, B. de Crombrugghe // Cell. 1982. -V.29. - No. 1. - P.203-210.

116. McLaughlin S. Plasma membrane phosphoinositide organization by protein electrostatics / S. McLaughlin, D. Murray // Nature. 2005. - V.438. -No.7068. — P.605-611.

117. Miotti S. Characterization of human ovarian carcinoma-associated antigens defined by novel monoclonal antibodies with tumor-restricted specificity / S. Miotti, S. Canevari, S. Menard, D. Mezzanzanica, G. Porro,

118. S.M. Pupa, M. Regazzoni, E. Tagliabue, M.I. Colnaghi // Int J Cancer. 1987.- V.39. -No.3. -P.297-303.

119. Moll R. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells / R. Moll, W.W. Franke, D.L. Schiller, B. Geiger, R. Krepler // Cell. 1982. - V.31. - No.l. - P. 11-24.

120. Morgan R.O. Annexin gene structures and molecular evolutionary genetics / R.O. Morgan, M.P. Fernandez // Cell Mol Life Sci. 1997. - V.53. -No.6. -P.508-515.

121. Morris K.V. Small interfering RNA-induced transcriptional gene silencing in human cells / K.V. Morris, S.W. Chan, S.E. Jacobsen, D.J. Looney // Science. 2004. - V.305. -No.5688. - P.1289-1292.

122. Neddermann P. Cloning and expression of human G/T mismatch-specific thymine-DNA glycosylase / P. Neddermann, P. Gallinari, T. Lettieri, D. Schmid, O. Truong, J.J. Hsuan, K. Wiebauer, J. Jiricny // J Biol Chem. -1996. -V.271.-No.22. P. 12767-12774.

123. Ng H.H. MBD2 is a transcriptional repressor belonging to the MeCPl histone deacetylase complex / H.H. Ng, Y. Zhang, B. Hendrich, C.A. Johnson,

124. B.M. Turner, H. Erdjument-Bromage, P. Tempst, D. Reinberg, A. Bird // Nat Genet. 1999. - V.23. -No.l. - P.58-61.

125. Ohtani-Fujita N. CpG methylation inactivates the promoter activity of the human retinoblastoma tumor-suppressor gene / N. Ohtani-Fujita, T. Fujita, A. Aoike, N.E. Osifchin, P.D. Robbins, T. Sakai // Oncogene. 1993. - V.8. -No.4. -P.1063-1067.

126. Okano M. Dnmt2 is not required for de novo and maintenance methylation of viral DNA in embryonic stem cells / M. Okano, S. Xie, E. Li // Nucleic Acids Res. 1998. - V.26. - No.l 1. - P.2536-2540.

127. Paulsen M. DNA methylation in genomic imprinting, development, and disease / M. Paulsen, A.C. Ferguson-Smith // J Pathol. 2001. - V.195. -No.l. -P.97-110.

128. Paz M.F. A systematic profile of DNA methylation in human cancer cell lines / M.F. Paz, M.F. Fraga, S. Avila, M. Guo, M. Pollan, J.G. Herman, M. Esteller // Cancer Res. 2003. - V.63. - No.5. - P. 1114-1121.

129. Pease A.C. Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis / A.C. Pease, D. Solas, E.J. Sullivan, M.T. Cronin, C.P. Holmes, S.P. Fodor // Proc Natl Acad Sci USA.- 1994. V.91. - No.ll. -P.5022-5026.

130. Pfeifer G.P. p53 mutational spectra and the role of methylated CpG sequences / G.P. Pfeifer // Mutat.Res. 2000. - No.450. - P. 155-166.

131. Phan U.T. Gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT). Maturation, activity, and mechanism of action / U.T. Phan, B. Arunachalam, P. Cresswell // J Biol Chem. 2000. - V.275. - No.34. -P.25907-25914.

132. Plass C. DNA methylation, imprinting and cancer / C. Plass, P.D. Soloway // Eur J Hum Genet. 2002. - V. 10. - No. 1. - P. 16-21.

133. Pogribny I.P. Differential sensitivity to loss of cytosine methyl groups within the hepatic p53 gene of folate/methyl deficient rats // Carcinogenesis. -1995.- No.16. -P.2863-2867.

134. Postma R. Cancer detection and cancer characteristics in the European Randomized Study of Screening for Prostate Cancer (ERSPC)--Section Rotterdam. A comparison of two rounds of screening / R. Postma, F.H.

135. Schroder, G.J. van Leenders, R.F. Hoedemaeker, A.N. Vis, M.J. Roobol, T.H. van der Kwast 11 Eur Urol. 2007. - V.52. - No. 1. - P.89-97.

136. Qiu S.D. In situ hybridization of prostate-specific antigen mRNA in human prostate / S.D. Qiu, C.Y. Young, D.L. Bilhartz, J.L. Prescott, G.M. Farrow, W.W. He, D.J. Tindall // J Urol. 1990. - V.144. - No.6. - P. 15501556.

137. Radu A. PTEN induces cell cycle arrest by decreasing the level and nuclear localization of cyclin D1 / A. Radu, V. Neubauer, T. Akagi, H. Hanafusa, M.M. Georgescu // Mol Cell Biol. 2003. - V.23. - No. 17. -P.6139-6149.

138. Raitio M. Y-chromosomal SNPs in Finno-Ugric-speaking populations analyzed by minisequencing on microarrays / M. Raitio, K. Lindroos, M. Laukkanen, T. Pastinen, P. Sistonen, A. Sajantila, A.C. Syvanen // Genome Res. 2001. - V.l 1. - No.3. - P.471-482.

139. Rampal J.B. DNA arrays: methods and protocols / Totowa:Humana Press, 2001.-264p.

140. Rice J.C. Aberrant methylation of the BRCA1 CpG island promoter is associated with decreased BRCA1 mRNA in sporadic breast cancer cells / J.C. Rice, K.S. Massey-Brown, B.W. Futscher // Oncogene. 1998. - V.17. -No.14. -P.1807-1812.

141. Riggs A.D. X chromosome inactivation, differentiation, and DNA methylation revisited, with a tribute to Susumu Ohno / A.D. Riggs // Cytogenet Genome Res. 2002. - V.99. - No. 1-4. - P. 17-24.

142. Ripani e. Human Trop-2 is a tumor-associated calcium signal transducer / e. Ripani, A. Sacchetti, D. Corda, S. Alberti // Int J Cancer. 1998. — V.76. — No.5. -P.671-676.

143. Samaco R.C. Epigenetic overlap in autism-spectrum neurodevelopmental disorders: MECP2 deficiency causes reduced expression of UBE3A and GABRB3 / R.C. Samaco, A. Hogart, J.M. LaSalle // Hum Mol Genet. 2005. - V.14. - No.4. - P.483-492.

144. Sarraf S.A. Methyl-CpG binding protein MBD1 couples histone H3 methylation at lysine 9 by SETDB1 to DNA replication and chromatin assembly / S.A. Sarraf, I. Stancheva // Mol Cell. 2004. - V.15. - No.4. -P.595-605.

145. Sato T. FAP-1: a protein tyrosine phosphatase that associates with Fas / T. Sato, S. Irie, S. Kitada, J.C. Reed // Science. 1995. - V.268. - No.5209. -P.411-415.

146. Schena M. Genome analysis with gene expression microarrays / M. Schena // Bioessays. 1996. - V. 18. - No.5. - P.427-431.

147. Schena M. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray / M. Schena, D. Shalon, R.W. Davis, P.O. Brown// Science. 1995. - V.270. -No.5235. -P.467-471.

148. Schena M. DNA microarrays: a practical approach / M. Schena. — Oxford: Oxford University Press, 1999. -209p.

149. Schena M. Microarray biochip technology / M. Schena. Natick: Eaton Publishing, 2000. - 298p.

150. Selker E.U. Gene silencing: repeats that count / E.U. Selker // Cell. -1999. V.97. -No.2. -P.157-160.

151. Sevenet N. DNA microarrays in clinical practice: past, present, and future / N. Sevenet, O. Cussenot // Clin Exp Med. 2003. -V.3.- No.l. - P. 1-3.

152. Sidransky D. Emerging molecular markers of cancer / D. Sidransky // Nature Cancer Reviews. 2002. - V.2. - P.210-219.

153. Simpson D.J. Loss of pRb expression in pituitary adenomas is associated with methylation of the RBI CpG island / D.J. Simpson, N.A.

154. Hibberts, A.M. McNicol, R.N. Clayton, W.E. Farrell // Cancer Res. 2000. -V.60.-No.5.-P.1211-1216.

155. Soares M.B. Identification and cloning of differentially expressed genes / M.B. Soares // Curr Opin Biotechnol. 1997. - V.8. - No.5. - P.542-546.

156. Stamey T.A. Prostate-specific antigen as a serum marker for adenocarcinoma of the prostate / T.A. Stamey, N. Yang, A.R. Hay, J.E. McNeal, F.S. Freiha, E. Redwine // N Engl J Med. 1987. - V.317. - No.15. -P.909-916.

157. Stears R.L. A novel, sensitive detection system for high-density microarrays using dendrimer technology / R.L. Stears, R.C. Getts, S.R. Gullans // Physiol Genomics. 2000. - V.3. - No.2. - P.93-99.

158. Stiles B. PTENless means more / B. Stiles, M. Groszer, S. Wang, J. Jiao, H. Wu // Dev Biol. 2004. - V.273. - No.2. - P. 175-184.

159. Stokoe D. Pten / D. Stokoe // Curr Biol. 2001. - V. 11. - No. 13. -P.R502.

160. Strathdee G. Epigenetic versus genetic alterations in the inactivation of E-cadherin / G. Strathdee // Semin Cancer Biol. 2002. - V.12. - No.5. -P.373-379.

161. Suetake I. DNMT3L stimulates the DNA methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3b through a direct interaction / I. Suetake, F. Shinozaki, J. Miyagawa, H. Takeshima, S. Tajima // J Biol Chem. 2004. - V.279. - No.26. -P.27816-27823.

162. Takai D. Comprehensive analysis of CpG islands in human chromosomes 21 and 22 / D. Takai, P.A. Jones // Proc Natl Acad Sci U S A. -2002. V.99. - No.6. -P.3740-3745.

163. Takekawa M. A family of stress-inducible GADD45-like proteins mediate activation of the stress-responsive MTK1/MEKK4 MAPKKK / M. Takekawa, H. Saito //Cell. 1998. - V.95. -No.4. -P.521-530.

164. Tamura M. Tumor suppressor PTEN inhibition of cell invasion, migration, and growth: differential involvement of focal adhesion kinase and pl30Cas / M. Tamura, J. Gu, T. Takino, K.M. Yamada // Cancer Res. 1999. -Y.59. - No.2. - P.442-449.

165. Telesca D. Estimating lead time and overdiagnosis associated with PSA screening from prostate cancer incidence trends / D. Telesca, R. Etzioni, R. Gulati // Biometrics. -2008. -Y.64. -No.l. -P.10-19.

166. Toth M. Genomic sequencing reveals a 5-methylcytosine-free domain in active promoters and the spreading of preimposed methylation patterns / M. Toth, U. Lichtenberg, W. Doerfler // Proc Natl Acad Sci USA.- 1989. V.86. -No.10. -P.3728-3732.

167. Turker M.S. The establishment and maintenance of DNA methylation patterns in mouse somatic cells / M.S. Turker // Semin Cancer Biol. 1999. -V.9. - No.5. - P.329-337.

168. Tweedie S. Vestiges of a DNA methylation system in Drosophila melanogaster? / S. Tweedie, H.H. Ng, A.L. Barlow, B.M. Turner, B. Hendrich, A. Bird // Nat Genet. 1999. - V.23. - No.4. - P.389-390.

169. Vallenius T. The PDZ-LIM protein RIL modulates actin stress fiber turnover and enhances the association of alpha-actinin with F-actin / T.

170. Vallenius, B. Scharm, A. Vesikansa, K. Luukko, R. Schafer, T.P. Makela // Exp Cell Res. 2004. - V.293. -No.l. - P. 117-128.

171. Vivanco I. The phosphatidylinositol 3-Kinase AKT pathway in human cancer / I. Vivanco, C.L. Sawyers // Nat Rev Cancer. 2002. - V.2. - No.7. -P.489-501.

172. Wade P.A. Mi-2 complex couples DNA methylation to chromatin remodelling and histone deacetylation / P.A. Wade, A. Gegonne, P.L. Jones, E. Ballestar, F. Aubry, A.P. Wolffe // Nat Genet. 1999. - V.23. - No.l. - P.62-66.

173. Walsh C.P. Transcription of LAP endogenous retroviruses is constrained by cytosine methylation / C.P. Walsh, J.R. Chaillet, T.H. Bestor // Nat Genet. 1998. - V.20. - No.2. - P. 116-117.

174. Watt F. Cytosine methylation prevents binding to DNA of a HeLa cell transcription factor required for optimal expression of the adenovirus major late promoter / F. Watt, P.L. Molloy // Genes Dev. 1988. - V.2. - No.9. - P.l 1361143.

175. Yoon H.G. N-CoR mediates DNA methylation-dependent repression through a methyl CpG binding protein Kaiso / H.G. Yoon, D.W. Chan, A.B. Reynolds, J. Qin, J. Wong //Mol Cell. -2003. V. 12. -No.3. -P.723-734.

176. Zhang W. CR6: A third member in the MyD118 and Gadd45 gene family which functions in negative growth control / W. Zhang, I. Bae, K. Krishnaraju, N. Azam, W. Fan, K. Smith, B. Hoffman, D.A. Liebermann // Oncogene. 1999. - V. 18. - No.35. - P.4899-4907.

177. Zhang Y. Analysis of the NuRD subunits reveals a histone deacetylase core complex and a connection with DNA methylation / Y. Zhang, H.H. Ng, H. Erdjument-Bromage, P. Tempst, A. Bird, D. Reinberg // Genes Dev. 1999. -V.13. -No.15. -P.1924-1935.

178. Zhang Y. Multiplexed automated DNA sequencing directly from single bacterial colonies / Y. Zhang, H. Tan, e.S. Yeung // Anal Chem. 1999.- V.71. -No.22. -P.5018-5025.

179. Zhao M.K. LIM domain-containing protein trip6 can act as a coactivator for the v-Rel transcription factor / M.K. Zhao, Y. Wang, K. Murphy, J. Yi, M.C. Beckerle, T.D. Gilmore // Gene Expr. 1999. - V.8. -No.4. -P.207-217.

180. Zhong S. Silencing of GSTP1 gene by CpG island DNA hypermethylation in HBV-associated hepatocellular carcinomas / S. Zhong, M.W. Tang, W. Yeo, C. Liu, Y.M. Lo, P.J. Johnson // Clin Cancer Res. 2002.- V.8. No.4. - P. 1087-1096.

Информация о работе

Ибрагимова, Ильсия Ильясовна
кандидата биологических наук
Казань, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Идентификация новых потенциальных генов-супрессоров опухолевого роста, метилированных при раке предстательной железы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы