Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методов для неинвазивной диагностики рака предстательной железы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов для неинвазивной диагностики рака предстательной железы"

На правах рукописи

□□3451378

Васильева Евгения Борисовна

Разработка методов для нешшазивной диагностики рака предстательной железы

03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

3о о;ц2осз

003451378

Работа выполнена на кафедре биологической химии ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии им. И.М.Сеченова Росздрава, г. Москва.

Научные руководители:

член-корреспондент РАН, профессор, доктор химических наук кандидат биологических наук

Северин Евгений Сергеевич Савватеева Мария Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук кандидат биологических наук

Хомяков Юрий Николаевич Розов Федор Николаевич

Ведущая организация:

ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН

Защита диссертации состоится » 008 г. на заседании

диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, Медицинский факультет, улица Миклухо-Маклая, 8, Москва.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, Д. 6.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.203.13 профессор, доктор биологических наук

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

В связи со старением населения развитых стран и, соответственно, ростом онкологической заболеваемости, на сегодняшний день остро стоит проблема диагностики. И если инструментальные методы позволяют диагностировать заболевание на поздней стадии, то задача молекулярной биохимии - разработать методы, позволяющие диагностировать заболевания на возможно более ранней стадии, а также - дифференцировать злокачественные опухоли от заболеваний доброкачественной природы.

Рак предстательной железы представляет собой самое распространенное онкологическое заболевание мужской половой сферы. В последние годы много работ направленно на изучение этиологии и патогенеза РПЖ, однако, до сих пор не существует единой общепризнанной концепции причины развития данного заболевания. Научные открытия последних лет позволили по-новому рассмотреть патогенез РПЖ с позиции нарушений различных регуляторных звеньев метаболизма предстательной железы.

В настоящее время во многих клиниках по всему миру активно развивается молекулярная диагностика онкологических заболеваний, в том числе и рака предстательной железы. Особенностью данной патологии является отсутствие четкой симптоматической картины опухолевого процесса и, в связи с этим, поздняя диагностика и лечение РПЖ. Использование различных молекулярных маркеров для диагностики аденокарциномы предстательной железы позволит в будущем диагностировать самое начало опухолевого процесса. На сегодняшний день открыты и изучаются десятки молекулярных маркеров, в т.ч. и маркеров РПЖ. Нами были отобраны 2 таких маркера: метилированная форма гена, кодирующего глутатион-5-трансферазу класса (08ТР1) и сериновая протеаза II типа хепсин.

Одним из наиболее значимых механизмов регуляции процессов канцерогенеза в организме является метилирование СрО - островков, расположенных в промоторной области генов-супрессоров. Инактивация генов-супрессоров опухолевого роста в результате метилирования промоторных областей широко распространена в опухолях различного типа, в том числе и при аденокарциноме предстательной железы. Одним из первых генов, для которых при данном заболевании было показано гиперметилирование промоторной области, является ген СБТР1. С8ТР1 - это фермент, отвечающий за детоксикацию электрофильных и кислых ксенобиотиков и выполняющий антиоксидантную роль в организме человека. Метилирование промоторной области гена СБТР! является одним из наиболее

частых событий из когда-либо описанных при образовании аденокарциномы предстательной железы, а также наиболее ранним.

Сериновая протеаза хепсин в норме экспрессируется клетками предстательной железы на очень низком уровне, но при развитии РПЖ ее экспрессия значительно увеличивается и коррелирует со стадией заболевания. Также из литературных данных известно, что уровень мРНК хепсина в 90% образцах опухолей простаты возрастает примерно в 10 раз по сравнению с нормой. Что касается роли хепсина в процессах канцерогенеза, то предполагают, что хепсин участвует в разрушении белков межклеточного матрикса и облегчает тем самым миграцию опухолевых клеток предстательной железы. Также высказывается предположение о том, что хепсин может быть активатором фактора роста гепатоцитов. HGF экспрессируется клетками разных тканей, в том числе клетками предстательной железы. Известно, что экспрессия HGF увеличивается при РПЖ. HGF является потенциальным стимулятором рецептора тирозинкиназы C-met, и играет важную роль в развитии опухолевого процесса. Таким образом, активация HGF хепсином - это один из возможных механизмов, приводящих к развитию онкологического процесса. Как и большинство сериновых протеаз, хепсин обладает узкой субстратной специфичностью и преимущественно гидролизует пептидную связь Р5-Р4-РЗ-Р2-Р1 между Р2 и Р1, где Р5 - Lys, Pro, Р4 - Lys, Gin, РЗ - Asn, Leu, Thr, P2 - Arg, PI - X. Именно это свойство хепсина было нами использовано при подборе субстрата. В качестве последнего, в эксперименте был использован коммерческий субстрат SPECTROZYME® РСа, который специфично гидролизуется хепсином. Мы остановили свой выбор на этом субстрате, т.к. известно, что SPECTROZYME® РСа используется для контроля активности рекомбинантного хепсина.

Важным преимуществом нашей работы явилась неинвазивность используемых методов: клетки предстательной железы, используемые для анализа, получены нами из мочи после пальцевого ректального исследования. Очевидно, что в настоящее время при диагностике невозможно избежать биопсии, но мы надеемся, что данная методика позволит пациентам хотя бы на ранних стадиях избежать этой процедуры.

Цель работы и задачи исследования.

Целью данной работы явилась разработка новых методов неинвазивной диагностики РПЖ на ранних стадиях заболевания. Для выполнения цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методику определения метилированного статуса промоторного участка гена GSTP1 и оценить эффективность ее применения при

исследованиях мочи больных с различными патологиями предстательной железы.

2. Проанализировать и оценить статус метилирования гена gstpl у пациентов с различными патологиями предстательной железы.

3. Разработать методику определения активности сериновой протеазы хепсин в моче больных с различными патологиями предстательной железы.

4. Провести исследование амидолитической активности хепсииа в моче пациентов с раком и другими патологиями предстательной железы.

5. Оцепить и сравнить диагностическую точность и положительную прогностическую ценность индивидуального и совместного применения исследуемых маркеров при раке предстательной железы.

Научная новизна исследования.

Впервые была разработана и использована методика определения метилированного статуса гена gstpl в моче пациентов с подозрением на рак предстательной железы.

Впервые была разработана методика определения активности сериновой протеазы хепсин на клетках предстательной железы человека. Данный метод является неиивазивным и удобным в применении, что выгодно отличает его от биопсии и анализа крови на ПСА.

Впервые для больных раком предстательной железы и простатической интраэпителиальной неоплазией применена методика определения активности сериновой протеазы хепсин.

Практическая значимость работы.

Разработана и предложена в клиническую практику современная методика ранней диагностики РПЖ методом определения амидолитической активности сериновой протеазы хепсин.

Разработана и апробирована методика совместной оценки амидолитической активности хепсина и метилированного статуса гена для диагностики рака

предстательной железы. Апробация работы.

Результаты работы были доложены и обсуждены на:

1. Заседании кафедры биологической химии ММА им. И. М. Сеченова (май 2008 г., г. Москва)

2. Конференции кафедры урологии ММА им. И. М. Сеченова (февраль 2008 г., г. Москва)

3. X урологической конференции молодых ученых (сентябрь 2007г, г. Москва).

4. XXXII конгрессе FEBS «Molecular Machines» (июль 2007 г., г. Вена).

Публикации. Г1о теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 в центральных периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Метилирование промоторной области гена gstpl является значимым показателем оценки состояния предстательной железы в норме и при патологических процессах в ткани предстательной железы.

2. Определение активности сериновой протеазы хепсин является специфичным при онкологических заболеваниях предстательной железы.

3. Изменение активности сериновой протеазы хепсин на поверхности клеток предстательной железы является маркером патологического процесса в ткани.

4. Предпочтительно совместное использование исследуемых маркеров для диагностики патологического состояния предстательной железы.

5. Использование предложенной методики исследования мочи для ранней диагностики РПЖ и ПИН является более информативным, чем применяемый на сегодняшний день метод определения ПСА в крови.

Структура и объем работы. Диссертация содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы; список литературы содержит 162 ссылки. Работа изложена на 117 страницах, содержит 6 таблиц и 29 рисунков.

Материалы и методы исследования.

Забор биологических образцов. Образцы мочи для исследования были получены в клинике урологии им. Р. М. Фронштейна ММА им. И. М. Сеченова. Определение стадии заболевания производилось на основании клинических и гистологических исследований пациентов сотрудниками клиники под руководством заведующего кафедрой урологии ММА, член-корреспондента РАМН, профессора Аляева Ю.Г.

Возраст обследуемых был от 19 до 87 лет. Больные находились на лечении в стационаре клиники урологии с 2004 по 2008 годы. Все исследования проводились с обязательного добровольного согласия пациентов. Все дополнительные данные о состоянии пациентов были получены из истории болезни.

Контрольная группа была сформирована из практически здоровых добровольцев без патологических состояний предстательной железы в количестве 6 человек. Мочу собирали в количестве 50 мл после пальцевого ректального исследования и, не замораживая, подвергали обработке. Все исследования проводились с обязательного добровольного согласия пациентов. Все

дополнительные данные о состоянии пациентов, в том числе и значения ПСА, были получены из истории болезни.

Клеточные линии. В работе были использованы следующие клеточные линии, любезно предоставленные ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН: LnCaP clone FGC, HeLa, HEK293, HT1080, HepG2.

Пробонодготовка. Образцы мочи центрифугировали. Осадок промывали в фосфатно-солевом буфере и делили на две части. Одну часть ресуспевдировали в RIPA-буфере с добавлением ингибиторов протеиназ. Смесь центрифугировали. Супернатант сливали и использовали для оценки активности белка. Вторую часть осадка использовали для исследования метилирования ДНК.

Определение метилирования промоторной области гена глутатион-S-трансферазы класса Р1. Выделение геномной ДНК. Геномную ДНК человека выделяли из лимфоцитов здоровых доноров, клеток LnCaP и клеток мочи, полученных от здоровых доноров и больных с хроническим простатитом и подозрением на рак предстательной железы. Выделение лимфоцитов проводили в градиенте плотности фиколл - верографина [Бейум,1980]. Выделение ДНК проводили фенольным методом после предварительной обработки ингибиторами протеиназ [Василева Е.Б. и др., 2008].

Метабисульфитная конверсия. Конверсия ДНК проводилась в «полусферах» из легкоплавкой агарозы. Геномная ДНК перед конверсией расщеплялась на фрагменты средней длины рестриктазой ВашШ (Fermentas) согласно рекомендациям производителя.

ПЦР-амплификация. Амплификацию материала проводили с использованием термостабильной Taq полимеразы BioTaq (Dialat) в соответствии с рекомендациями производителя. При проведении ПЦР нами использовались две пары ДНК-специфичных праймеров для определения метилированния промоторной области гена GSTP1 в образцах.

Праймеры для метилированной ДНК:

Melh 1 (5'-AAGGTGTGGTGAGTGTAGTTTG-3'), Meth2(5'-CATCCCCAATACCATTAACAAC-3'). Праймеры для неметилировалной ДНК:

Unmethl (5'-GGGTTTAGGGGATTTAGGATGT-3'), Unmeth2 (5 '-ATAААСАСААТСТАСССССССТ-3'). Подбор праймеров осуществлялся исходя из того, что в ходе модификации неметилированные цитозины трансформируются в урацилы, а метилированные цитозины трансформации не подвергаются. При этом в соответствующих участках

праймера для амплификации модифицированной ДНК находятся аденины вместо гуанинов. 35 циклов амплификации состояли из: преденатурации при 95°С в течение 5 мин, денатурации при 95°С в течение 30 сек, отжига праймеров Unmeth при 58°С в течение 1 мин и элонгации цепей при 72°С в течение 1 минуты 20 сек.; далее 34 цикла:денатурация 95°С -30 сек, отжиг 58°С - 40 сек., элонгация 72°С - 50 сек. Программа для Unmeth составлялась аналогично, с той только разницей, что температура отжига составляла 48°С, а общее количество циклов - 45. Полученные фрагменты разделяли в 2% агарозном геле для амплификатов на Meth-праймсрах и в 4% агарозном геле для амплификатов на Unmeth-праймерах, затем окрашивали бромидом этидия и визуализировали в УФ свете. В качестве положительного контроля были использованы ДНК клеточных линий LnCaP. В качестве отрицательного контроля использовалась ДНК здоровых доноров.

Определение активности белка хспсина в моче пациентов с хроническим простатитом, с подозрением на рак предстательной железы и здоровых доноров.

Выбор клеточной линии в качестве положительного контроля. Обработка клеток линий LnCaP clone FGC, HeLa, HEK293, HEPG2, HT1080 проводилась аналогично обработке образцов мочи пациентов.

Определение активности хспсина в образцах мочи и клетках линии LnCaP. Определение оптической плотности проводили на спектрофотометре при длинах волн 260 и 280 нм.Определение активности хепсина основано на оценке изменения оптической плотности раствора при 405 нм в течение 15 минут в результате расщепления хепсином субстрата Spectrozyme РСа.

Расчет активности фермента. Расчет активности фермента проводили по формуле:

Д,5«60*1000»3

А. —-

103.63*/*С* V ^ где d415. рост поглощения за время t; 60 - 1 час;1000 - в нмолях; С - исходная концентрация белка в мг/мл; 3 - объем инкубации в мл; V -объем хромогенного субстрата Spectrozyme ® РСа в мл; t - промежуток времени инкубации, за которое произошло изменение оптической плотности; 103,63 -оптическая плотность, которую дает 1 мкмоль хромогенного субстрата.

Статистическая обработка результатов. Статистические методы обработки полученных результатов включали вычисление средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (т), среднего квадратичного отклонения (с). Для оценки достоверности различий между средними арифметическими был использован параметрический критерий Стьюдента (t), достоверными считали отличия при Р< 0,05.

Результаты исследовании.

Определение метилированного статуса промоторного участка гена GSTP1 в разных биологических жидкостях при различных патологиях предстательной железы.

Из литературных данных известно, что метилирование промоторной области гена GSTP1 при РПЖ происходит в 70-96% случаев [Lee W.H., Isaacs W.B. et all, 1997]. С другой стороны, существуют данные о том, что частота метилирования повышается с возрастом, независимо от развития патологического процесса в органе. Нами была разработана методика оценки статуса метилирования промоторного участка гена GSTP1 в моче, собранной после ПРИ предстательной железы.

Подбор условий для исследования метилирования промоторной области гена GSTP1.

В различных жидкостях организма, в том числе в моче и в секрете предстательной железы, опухолевые клетки находятся наряду с клетками нормальной ткани. Соответственно, при анализе мы обнаруживаем как метилированную, так и неметилированную форму гена gstpl. Для того, чтобы избежать как ложно позитивной, так и ложно негативной диагностики РПЖ, необходимо проводить анализ промоторной области исследуемого гена на отсутствие метилирования, т.е. отрицательного контроля.

В качестве положительного контроля были использована ДНК клеток LnCap В качестве отрицательного контроля использована ДНК, выделенная из венозной крови здоровых доноров в возрасте от 18 до 25 лет.

Основным методом детекции нами был выбран метод метил-специфической ПЦР.

На основе проведенного компьютерного анализа промоторной области гена gstpl, были выделены несколько CpG-островков для анализа которых были подобраны пары праймеров (Unmeth - для детекции неметилированных участков и Meth — для детекции метилированных участков) (Рис. 1).

В результате проведенного анализа образцов клеток LnCaP и клеток здоровых доноров было показано, что ДНК клеток LnCap была почти полностью метилирована. При амплификации ДНК здоровых доноров наблюдалась обратная картина, следовательно, контроли были подобраны нами адекватно (Рис.2).

В результате проведенного ПЦР - анализа ДНК из образцов мочи здоровых доноров и больных аденокарциномой было показано, что предложенная нами методика позволяет детектировать метилирование промоторной области гена gstpl (Рис. 3).

г

Рисунок 1. Анализ промотора гена GSTPI на наличие CpG островков. GC percentage I - % GC, Input sequence - анализируемая последовательность, MSP primer set - подбор

праймер для анализа присутствия и отсутствия метелирования, CpG island - CpG островок.

Рисунок 2. ПЦР-анализ образцов ДНК из клеток LnCap и клеток здорового донора. M - маркер, I - анализ ДНК из клеток LnCap с Unmeth-парой праймеров, 2 - анализ ДНК из клеток LnCap с Meth-парой праймеров, 3 - анализ ДНК из клеток здорового донора с Unmeth-napou праймеров, 4 - анализ ДНК из клеток здорового донора с Meth-парой праймеров.

M ! 2 3 4 5 S 7 si

MM С -Л,

■A 1

Рисунок 3. ПЦР-анализ образцов ДНК из мочи больного аденокарциномой простаты и здорового донора. М - маркер, I - анализ ДНК из клеток ЬпСар с иптеИг-парой праймеров, 2 - анализ ДНК из клеток ЬпСар с МеШ-парой праймеров, 3 - анализ ДНК из клеток здорового донора с иптеЛ-парой праймеров, 4 - анализ ДНК из клеток здорового донора с МеМ-парой праймеров, 5,7 - анапиз ДНК из клеток мочи больных аденокарциномой простаты с иптеМ-парой праймеров, 6, 8 - анализ ДНК из клеток мочи больных аденокарциномой простаты с МеМ-парой праймеров.

£

а ^

Input Sequence

MSP Priner Set tetfylated-Sfecific

Urnett-ylatecbSpecific a—

Оценка различных методов забора биоматериала для исследования метилирования промоторной области гена С81Р1.

Для выявления наиболее подходящего биоматериала нами было проведено исследование образцов секрета предстательной железы, полученных после ПРИ. а также анализов мочи, собранных после биопсии, до и после ПРИ. В ходе проведенных исследований было установлено, что метилирование гена одинаково оценивается как при исследовании мочи, полученной после процедуры ПРИ, так и в случае исследовании мочи, забранной после процедуры биопсии (Рис.4). Рисунок 4. Метилирование промоторной области гена gstpl в образцах больных аденокарциномой предстательной железы, собранных различными методами.

Использование в исследовании анализов мочи, полученных до проведения процедуры ПРИ и секрета предстательной железы представляется нам нецелесообразным, так как метилирование в клетках, полученных из этих образцов выявлялось реже, чем в образцах, полученных после процедур биопсии предстательной железы или ПРИ. Мы считаем, что это может быть связано с тем, что в анализе мочи, полученной до процедуры ПРИ и секрете простаты содержится меньшее количество клеток, чем в образцах мочи тех же пациентов, но собранных после процедур биопсии и ПРИ.

Также было показано, что при исследовании образцов мочи без предварительного воздействия на предстательную железу, полученный сигнал является недостаточно интенсивным для достоверной детекции.

При проведении гистологического анализа образцов мочи и секрета после процедур ПРИ и биопсии было показано, что в образцах мочи полученных до процедуры ПРИ и секрете простаты количество клеток составляет около 0,1 *104 клеток/мл мочи, а в образцах, полученных после процедур биопсии и ПРИ 0,4*105 и 0,8*104 клеток/мл мочи соответственно. Кроме того, исследование секрета ПЖ

секрет ПЖ, собранный после ПРИ; 42%

моча, собранная

после биопсии; 67%

до ПРИ; 33%

моча, собранная после ПРИ; 67%

представляет ряд трудностей, связанных с высокой вязкостью данной жидкости и необходимостью проведения длительной процедуры лизиса клеток.

С точки зрения чувствительности анализа использование образцов мочи, полученных после выполнения процедур ПРИ и биопсии, оказалось равноценным (Рис.4). Однако, одним из требований, предъявляемых нами к исследованию, была разработка неинвазивной методики определения, поэтому мы приняли решение отказаться от использования образцов мочи, полученных после процедуры биопсии для анализа.

Таким образом, мы пришли к заключению об использовании в дальнейшем анализе образцов мочи, полученных после выполнения пациентам процедуры ПРИ.

Определение частоты метилирования промоторной области гена СБТР! при различных патологических состояниях предстательной железы.

Определение метилированного статуса гена С8ТР1 проводилось на материале, полученном от 16 практически здоровых лиц, без выявленных патологий предстательной железы после процедуры ПРИ и 91 пациента с патологией предстательной железы. Возраст обследуемых от 19 до 87 лет. У 12 человек моча на исследование отбиралась трижды: до проведения процедуры ПРИ предстательной железы, после проведений процедуры ПРИ, после биопсии предстательной железы, а также у этих же лиц анализировался секрет предстательной железы после проведения процедуры ПРИ ПЖ для отработки условий проведения анализа. В группе больных (72 человека) исследовался только анализ мочи, полученный после процедуры ПРИ. Все исследования проводились с обязательного добровольного согласия пациентов.

В результате проведенных исследований было установлено, что метилирование промоторной области гена 08ТР1 наблюдалось чаще при различных патологиях предстательной железы, чем в норме и при хроническом простатите. (Рис. 5).

Рисунок 5. Анализ частоты метилирования промоторной области гена С8ТР1 при различных патологических состояниях

предстательной железы.

Оценка диагностической точности метода мет-ПЦР при исследовании метилирования иромоторной области гена С8ТР1.

При оценке диагностической точности метода мет-ПЦР для исследования частоты метилирования промоторной области гена С5ТР1 мы определяли чувствительность теста (долю истинноположительных ответов среди больных), специфичность теста (долю истинноотрицательных тестов среди здоровых), предсказательную ценность положительного теста (долю истинноположительных ответов среди всех положительных, положительная прогностическая ценность, ППЦ), предсказательную ценность отрицательного теста (долю истинноотрицательных ответов среди всех отрицательных, отрицательная прогностическая ценность, ОПЦ), диагностическую точность метода (долю истинных результатов среди всех результатов теста) [Ригельман Р., 1994]. Результаты отражены на рис. 6. Также была показана достоверная прямая корреляция между обнаружением РПЖ и частотой метилирования С8ТР1 (11=0.73, р<0.05). По данным разных авторов, частота метилирования 08ТР1 выявляется в 70-100% случаев РПЖ, а также обнаруживается при изменении ПИН и пролиферативной атрофии, следовательно, наши данные совпадают с литературными. При этом нами не было обнаружено корреляции между

Рисунок 6. Прогностическая ценность теста определения метилирования ОБТР1. ППЦ -положительная прогностическая ценность, ОПЦ - отрицательная прогностическая ценность, ДТМ -диагностическая точность

метода.

амидолитической активности сериновои протеазы хепсин.

В качестве второго маркера для неинвазивной диагностики РПЖ нами был предложен белок хепсин. Для обнаружения хепсина в биологическом материале нами была разработана методика определения амидолитической активности белка с применением хромогенного субстрата БРЕСПЮгУМЕ® РСа. Из литературных данных нам было известно, что 8РЕСТЯ02УМЕ® РСа является наиболее

метилированием данного гена и уровнем ПСА.

параметр

\ о Чувствительность □ Специфичность с ППЦ О ОПЦ в Д"Ш |

Разработка методики определения

специфичным субстратом из известным нам коммерческих субстратов для хепсина. Эти данные нам удалось подтвердить в ходе эксперимента: мы установили, что при добавлении субстрата к предварительно обработанным клеткам ЬпСаР происходит изменение окраски раствора. Аналогичная ситуация наблюдалась нами при добавлении субстрата к клеткам выделенным из мочи пациентов с клинически верифицированным РПЖ (данные не приведены). Эти данные позволили нам придти к выводу, что БРЕС'ПЮ/УМЕ® РСа может быть использован в качестве субстрата сериновой протеазы хепсин. Преимуществом данной методики является возможность определять хепсин в опухолевых клетках предстательной железы в моче после массажа предстательной железы, то есть метод забора материала не является инвазивным.

В результате проведенного анализа основных лабораторных методов детекции хепсина было выяснено, что использование методов ИФА и ОТ ПЦР невозможно, т.к. белок синтезируется как зимоген, т.е. в виде функционально не активного предшественника, а данными методами невозможно отличить активную форму белка от не активной. Кроме того, принцип кинетического определения активности ферментов широко представлен в современной клинической практике и легко в нее внедряется.

Для определения минимального детектируемого количества клеток в образце клетки линии ЬпСар были разведены до концентраций 0.1, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2*106 клеток/л. Было установлено, что минимально детектируемое количество клеток -0.25* 106 клеток/л.

При гистологическом исследовании образцов мочи больных аденокарциномой предстательной железы и хроническим простатитом было показано, что после пальцевого ректального исследования (ПРИ) в образце обнаруживается не менее 0.25* 106 клеток предстательной железы/л, следовательно, наш метод детекции позволяет определять хепсин в образцах мочи.

В результате определения активности хепсина в различных опухолевых линиях было показано, что хепсин наиболее активен в клетках аденокарциномы предстательной железы и, следовательно, может быть использован как высоко специфический маркер для диагностики данного заболевания (Рис. 7).

Измерение активности хепсина в клетках различных опухолевых линий показало, что клетки линии ЬпСаР могут являться положительным контролем при определении активности хепсина в образцах мочи больных аденокарциномой предстательной железы после массажа простаты.

Рисунок 7. Определение активности хепсина в различных опухолевых линиях. LnCap -аденокарг/инома предстательной железы, HeLa - аденокарцинома шейки матки, НЕК 293 первичный рак почки, HEP G2 -карцинома печени, НТ1080 -фибросаркома.

Анализ и оценка активности хепсина у больных с различными патологиями предстательной железы.

При анализе активности хепсина в разных группах больных было показано, что активность хепсина в группе пациентов с РПЖ не отличается от активности в группе пациентов с ПИН, достоверно отличается от таковой в группе ДГПЖ+ХП (р=0.032) и группе контроля (р<0,05) (табл.1). Активность в группе ДГПЖ+ХП также достоверно отличалась от контроля (р<0,05) (табл. 1). Следовательно, применение данного маркера для диагностики патологий предстательной железы позволяет с высокой степенью достоверности отличить аденокарциному и ПИН от доброкачественной гиперплазии предстательной железы и хронического простатита. А также, вероятно, существует возможность выявления доброкачественной гиперплазии простаты.

Нами было показано, что при анализе ПСА существуют достоверные различия между всеми тремя подгруппами и группой контроля, но между самими подгруппами достоверных различий не выявлено. Вероятно, данный параметр может свидетельствовать о нарушении функций предстательной железы в целом, но не достаточно информативен для дифференциальной диагностики рака предстательной железы.

В ходе корреляционного анализа мы установили, что активность хепсина у пациентов из подгруппы «РПЖ» и уровень ПСА в этой же подгруппе никак не связаны.

Таблица 1. Определение активности хепсина и концентрации ПСА у больных с различными патологиями предстательной железы и здоровых доноров.

Параметр Контроль Группы пациентов Достоверность, Р

п=16 РПЖ(1) п=33 ПИН(2) п=36 ДГПЖ+ХП (3) п=6

Хепсин (нмоль/ч*мг белка) 4,1±3,4 385,4±56* 335,9±45* 140,1±39* Р1.2>0,05, Р! з<0,05, Р2,з<0,05

ПСА (нг/мл) 2,8±1,3 21,4±18 11±4,3* 9,8±3,7* Р)д>0,05, Р] з>0,05, Р2)3<0,05

* - достоверность различий с нормой ( р<0,05)

При дальнейшем корреляционном анализе мы установили, что в группе пациентов с аденокарциномой предстательной железы не существует прямой корреляции между активностью хепсина и объемом предстательной железы, что вполне оправдано с нашей точки зрения, так как увеличение объема предстательной железы обычно связано с доброкачественной гиперплазией (Рис.8а).

а НРМ/аозрастпацкентов □ ЛСЛвозрасг пациентов |

НРМ/объеи железы в ПСМ)6ьен железы

а. б.

Рисунок 8. Корреляционный анализ активности хепсина и концентрации ПСА в зависимости от объема предстательной железы (а) и от возраста пациентов (б).

Однако, нами была показана средняя прямая корреляция между концентрацией ПСА и объемом предстательной железы в группе с доброкачественной гиперплазией (Рис.8а). Полученные нами данные совпадают с литературными и доказывают, что данный маркер обладает недостаточной специфичностью для диагностики

опухолевых процессов в предстательной железе, т.к. не всегда увеличение объема железы свидетельствует о наличии злокачественного процесса.

При анализе зависимости активности хепсина от возраста было показано достоверное отсутствие корреляции во всех группах, а при аналогичном анализе зависимости концентрации ПСА, была выявлена достоверная средняя прямая корреляция (Рис. 86). Следовательно, вне зависимости от возраста и гормональных изменений, активность хепсина способна достоверно описывать злокачественные процессы в предстательной железе. Также эти данные позволяют нам сделать вывод, что не существует положительной взаимосвязи между активностью хепсина и андрогензависимыми белками предстательной железы.

Определение предсказательной ценности положительного теста, предсказательной ценности отрицательного теста и диагностической точности метода измерения активности хепсина.

Нами было показано, что диагностическая точность метода составляет 85,7 % (Рис.8), что значительно выше данного показателя для ПСА (около 50% по литературным данным), следовательно, предлагаемая нами методика является более предпочтительной для использования в дифференциальной диагностике патологий предстательной железы.

Нами было установлено, что частота метилирования йвТР! достоверно и положительно коррелировала с активностью хепсина у больных с патологией предстательной железы (11=0.55, р<0.05).

Рисунок 9. Прогностическая и диагностическая ценности теста измерения активности хепсина у пациентов с аденокарциномой предстательной железы. ППЦ -положительная прогностическая ценность, ОПЦ - отрицательная прогностическая ценность, ДТМ -диагностическая точность

метода.

Итак, нами было показано, что ППЦ определения метилирования промоторной области гена gstpl и диагностическая ценность этого метода составляют соответственно 75% и 72% (Рис.6). ППЦ определения активности хепсина и

диагностическая ценность этого метода составляют соответственно 82,6% и 85,7% (Рис. 9). Для ПСА ППЦ составляет, по литературным данным, порядка 50 %. Мы установили, что наши методы не позволяют диагностировать между собой РПЖ и ПИН, но позволяют диагностировать эти состояния от ДГПЖ и ХП с большей вероятностью, чем измерение абсолютной концентрации ПСА в сыворотке крови.

Анализ одного биомаркера для диагностики рака предстательной железы, даже такого информативного как хепсин, не является целесообразным вследствие его недостаточной специфичности. Проведенный нами анализ совместных прогностической и диагностической ценности анализов активности хепсина и определения частоты метилирования промоторной области гена gslpl показал, что совместное ППЦ составляет 92,8%, а совместная диагностическая точность - 94,6%, следовательно, сочетанное использование данных маркеров является более информативным для диагностики рака предстательной железы, чем их индивидуальное использование (Рис.10).

Рисунок 10. Оценка

прогностической ценности

(ППЦ) и диагностической точности (ДТ) различных

методов диагностики рака предстательной железы.

Полученные нами результаты показали возможность применения для ранней диагностики патологий предстательной железы маркеров альтернативных используемым на сегодняшний день в широкой клинической практике.

Выводы.

1. Метилирование промотрной области гена gstpl наблюдалось чаще при различных патологиях предстательной железы, чем в норме и при хроническом простатите.

2. Определение метилированного статуса гена не позволяет диагностировать между собой РПЖ и ПИН, но позволяет различать эти состояния от ДГПЖ и ХП с большей вероятностью, чем измерение абсолютной концентрации ПСЛ в сыворотке крови.

3. Активность хепсина специфически увеличивается при РПЖ, и не наблюдается или наблюдается незначительно при других онкологических заболеваниях.

4. Активность хепсина в моче пациентов изменяется в зависимости от патологического состояния предстательной железы, что позволяет с высокой степенью достоверности отличить аденокарциному и ПИН от доброкачественной гиперплазии предстательной железы и хронического простатита.

5. Активность хепсина не зависит от возраста пациента и объема предстательной железы и является объективным критерием присутствия злокачественных клеток в предстательной железе.

6. Методика, основанная на определении активности белка хепсина и метилирования промоторной области гена gstpl в моче пациентов, может быть использована для ранней неинвазивной диагностики рака предстательной железы.

Список работ соискателя, опубликованных по теме диссертации:

1. Васильева Е.Б., Ляшенко A.A., Барановский П.М., Винаров А.З., Северин Е.С. Диагностические возможности использования ПЦР, ИФА и иммуносцинтиографии для обнаружения GSTP1 и сериновой трансмембранной протеиназы II типа у больных раком предстательной железы. Аллергология и иммунология. - 2005. - том 6. - № 2. - С. 183 - Москва.

2. Васильева Е.Б.,Савватеева М. В., Ляшенко А. А., Абакумова О. Ю., Фиев Д. Н., Винаров А. С., Северин Е.С., Аляев Ю. Г. Сериновая протеаза хепсин -молекулярный маркер для неинвазивной диагностики рака предстательной железы. Малоинвазивные методы диагностики и лечения в современной урологии. Материалы IV Международной научно-практической конференции. -2007. - С.52 - Санкт-Петербург.

3. Васильева Е.Б., Ляшенко A.A., Саватеева М.В., Абакумова О.Ю,

Фиев Д.Н., Северин Е.С., Винаров А.З. Диагностические возможности детекции метилированого гена GSTP1 и амидолитической активности хепсина при заболеваниях предстательной железы. Материалы II Конгресса Российского общества онкоурологов. - 2007 - С. 23-24 - Москва

4. Васильева Е.Б., Фиев Д.Н., Саватеева М. В. Белок хепсин как маркер для неинвазивной диагностики рака предстательной железы. Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии. Метериалы VI Всероссийской конференции молодых ученых.- 2007. -С.101-102 - Москва.

5. Васильева Е.Б., Savvateeva М., Kuznetsova Е., Fiev D., Abakumova О., Liachenko A., Vinarov А., Severin Е. Combined detection of GSTP1 hypermethylation and hepsin activity for prostate non-invasive cancer diagnostic. The FEBS Journal. -2007. - Vol. 274, Suppl. 1. - P. 280. - Vienna

6. Васильева Е.Б., Savvateeva M., Kuznetsova E., Fiev D., Abakumova O., Liachenko A., Vinarov A., Severin E. Detection of GSTP1 hypermethylation and hepsin activity for prostate non-invasive cancer diagnostics. The Journal of Urology. - 2008. -Vol. 179,N4.-P. 685

7. Васильева Е.Б., Саватеева М.В., Кузнецова Е.М., Северин С.Е., Северин Е.С., Фиев Д.Н., Аляев Ю.Г., Винаров А.З. Диагностические возможности сочетанной детекции амндолитичсской активности хепсина и метилирования гена 08ТР1 при раке и других заболеваниях предстательной железы. Онкоурология, 2008; N 3. - С. 50-53

8. Васильева Е.Б., Саватеева М.В., Кузнецова Е.М., Северин С.Е., Северин Е.С., Фиев Д.Н., Аляев Ю.Г., Винаров А.З. Определение амидолитической активности белка хепсина при различных патологиях предстательной железы. Апдрология и Генитальная хирургия, 2008; N. 3 .- С. 46-49

9. Васильева Е.Б., Савватеева М.В., Кузнецова Е.М., Фиев Д.Н., Аляев Ю.Г., Винаров А.З. Определение метилированного статуса промоторного участка гена С8ТР1 при патологических состояниях предстательной железы. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии 2008; N .5 - С. 39-41.

Евгения Борисовна Васильева «Разработка методов для неинвазивной диагностики рака предстательной железы».

Данная диссертационная работа посвящена разработке методов неинвазивной диагностики рака предстательной железы. В работе было показано, что активность хепсина специфически увеличивается при раке предстательной железы (РПЖ), и не зависит от возраста пациента и объема предстательной железы, а, следовательно, может являться объективным критерием присутствия злокачественных клеток в организме. Установлено также, что активность хепсина в моче пациентов изменяется в зависимости от патологического состояния предстательной железы, что позволяет с высокой степенью достоверности отличить РПЖ и простатическую интраэпителиальную неоплазию (ПИН) от доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ) и хронического простатита (ХП). Также в нашей работе было изучено метилирование промоторной области гена GSTP1 при РПЖ и показано, что метилирование промоторной области гена gstpl наблюдалось чаще при различных патологиях предстательной железы, чем в норме. Также мы установили, что определение метилированного статуса гена gstpl не позволяет диагностировать между собой РПЖ и ПИН, но позволяет различать эти состояния от ДГПЖ и ХП с большей вероятностью, чем измерение абсолютной концентрации ПСА в сыворотке крови. На основании полученных данных мы считаем, что методика, основанная на определении активности белка хепсина и метилирования промоторной области гена gstpl в моче пациентов, может быть использована для ранней неинвазивной диагностики рака предстательной железы.

Eugene В. Vasilcva «Development of methods for noninvasive diagnostics of prostate cancer».

The current PhD thesis is devoted to the development for methods for noninvasive diagnostics of prostate cancer. In the thesis it's shown that hepsin activity specifically increases in case of prostate cancer (PCa), and doesn't depend on the age of the patient or the volume of prostate which is an impartial criteria of malignant cells presence in prostate. It is also shown that hepsin activity in patients' urine changes depending on the pathological condition of prostate, it allows with high probability value to distinguish PCa and prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) from adenoma and chronic prostatitis. Also the promoter region of GSTP1 methylation in case of PCa was studied and it was shown, that methylation of promoter region of gstpl occurred in prostate pathologies more often than in case of normal. We have also found that determination of methylation status of gstpl does not allow to distinguish PCa and PIN, but allows to distinguish both pathologies from adenoma and chronic prostatitis with higher probability than changes in PSA concentration in blood serum. Based on the received data, we consider that the method based on the determination of hepsin activity and methylation status of promoter region of gstpl in patients' urine, can be used for for early non-invasive diagnostics of prostate cancer.

Подписано в печать 15.10.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 963 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Васильева, Евгения Борисовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Введение.

1.2. Морфологические, гистологические и цитохимические аспекты патологических состояний предстательной железы.

1.3. Онкомаркеры рака предстательной железы.

1.4. Роль системы глутатиона в регуляции опухолевого роста.

1.5. Биологические свойства, структура и функции хепсина.

1.6. Подходы к повышению эффективности диагностики и прогнозирования РПЖ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Забор биологических образцов.

2.2. Клеточные линии.

2.3. Пробоподготовка.

2.4. Определение метилирования промоторной области гена глутатион-S-трансферазы класса Р1.

2.4.1. Реактивы.

2.4.2. Выделение геномной ДНК.

2.4.3. Метабисульфитная конверсия.

2.4.4. ПЦР-амплификация.

2.5. Определение активности белка хепсина в моче пациентов с хроническим простатитом, с подозрением на рак предстательной железы и здоровых доноров.

2.5.1. Выбор клеточной линии в качестве положительного контроля.

2.5.2. Определение концентрации белка в растворе.

2.5.3. Определение активности хепсина в образцах мочи и клетках линии LnCaP.

2.5.3.1. Постановка реакции.

2.5.3.2. Расчет активности фермента.

6. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Определение метилированного статуса промоторного участка гена gstpl в разных биологических жидкостях при различных патологиях предстательной железы.

3.2. Подбор условий для исследования метилирования промоторной области гена gstpl.

3.3. Оценка различных методов забора биоматериала для исследования метилирования промоторной области гена gstpl.

3.4. Определение частоты метилирования промоторной области гена gstpl при различных патологических состояниях предстательной железы.

3.5. Оценка диагностической точности метода мет-ПЦР при исследовании метилирования промоторной области гена gstpl.

3.6. Разработка метода определения активности сериновой протеазы хепсин.

3.7. Анализ и оценка активности хепсина у больных с различными патологиями предстательной железы.

3.8. Определение предсказательной ценности положительного теста, предсказательной ценности отрицательного теста и диагностической точности метода измерения активности хепсина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методов для неинвазивной диагностики рака предстательной железы"

Актуальность проблемы.

В связи со старением населения развитых стран и, соответственно, ростом онкологической заболеваемости, на сегодняшний день остро стоит проблема их диагностики. И если инструментальные методы позволяют диагностировать заболевание на поздней стадии, то задача молекулярной биохимии - разработать методы, позволяющие диагностировать заболевания на возможно более ранней стадии, а также - дифференцировать злокачественные опухоли от заболеваний доброкачественной природы.

Рак предстательной железы представляет собой самое распространенное онкологическое заболевание мужской половой сферы. В последние годы много работ направленно на изучение этиологии и патогенеза РПЖ, однако, до сих пор не существует единой общепризнанной концепции причины развития данного заболевания. Научные открытия последних лет позволили по-новому рассмотреть патогенез РПЖ с позиции нарушений различных регуляторных звеньев метаболизма предстательной железы.

В настоящее время во многих клиниках по всему миру активно развивается молекулярная диагностика онкологических заболеваний, в том числе и рака предстательной железы. Особенностью данной патологии является отсутствие четкой симптоматической картины опухолевого процесса и, в связи с этим, поздняя диагностика и лечение РПЖ. Использование различных молекулярных маркеров для диагностики аденокарциномы предстательной железы позволит в будущем диагностировать самое начало опухолевого процесса. На сегодняшний день открыты и изучаются десятки молекулярных маркеров, в т.ч. и маркеров РПЖ. Нами были отобраны 2 таких маркера: метилированная форма гена, кодирующего глутатион-8-трансферазу класса к\ (GSTP1) и сериновая протеаза П типа хепсин.

Одним из наиболее значимых механизмов регуляции процессов канцерогенеза в организме является метилирование CpG - островков, расположенных в промоторной области генов-супрессоров. Инактивация генов-супрессоров опухолевого роста в результате метилирования промоторных областей широко распространена в опухолях различного типа, в том числе и при аденокарциноме предстательной железы. Одним из первых генов, для которых при данном заболевании было показано гиперметилирование промоторной области, является ген GSTPL GSTP1 - это фермент, отвечающий за детоксикацию электрофильных и кислых ксенобиотиков и выполняющий антиоксидантную роль в организме человека. Метилирование промоторной области гена GSTP1 является одним из наиболее частых событий из когда-либо описанных при образовании аденокарциномы предстательной железы, а также наиболее ранним.

Сериновая протеаза хепсин в норме экспрессируется клетками предстательной железы на очень низком уровне, но при развитии РПЖ ее экспрессия значительно увеличивается и коррелирует со стадией заболевания. Таюке из литературных данных известно, что уровень мРНК хепсина в 90% образцах опухолей простаты возрастает примерно в 10 раз по сравнению с нормой. Что касается роли хепсина в процессах канцерогенеза, то предполагают, что хепсин участвует в разрушении белков межклеточного матрикса и облегчает тем самым миграцию опухолевых клеток предстательной железы. Также высказывается предположение о том, что хепсин может быть активатором фактора роста гепатоцитов. HGF экспрессируется клетками разных тканей, в том числе клетками предстательной железы. Известно, что экспрессия HGF увеличивается при РПЖ. HGF является потенциальным стимулятором рецептора тирозинкиназы C-met, и играет важную роль в развитии опухолевого процесса. Таким образом, активация HGF хепсином - это один из возможных механизмов, приводящих к развитию онкологического процесса. Хепсин обладает узкой субстратной специфичностью и преимущественно гидролизует пептидную связь Р5-Р4-РЗ-Р2-Р1 между Р2 и Р1, где Р5 - Lys, Pro, Р4 - Lys, Gin, РЗ - Asn, Leu, Thr, P2 - Arg, PI - X. Именно это свойство хепсина было нами использовано при подборе субстрата. В качестве последнего, в эксперименте был использован коммерческий субстрат

SPECTROZYME® РСа, который специфично гидролизуется хепсином. Мы остановили свой выбор на этом субстрате, т.к. з литературных данных нам известно, что SPECTROZYME® РСа используется для контроля активности рекомбинантного хепсина.

Важным преимуществом нашей работы явилась неинвазивность используемых методов: клетки предстательной железы, используемые для анализа, получены нами из мочи после пальцевого ректального исследования. Очевидно, что в настоящее время при диагностике невозможно избежать биопсии, но мы надеемся, что данная методика позволит пациентам хотя бы на ранних стадиях избежать этой процедуры.

Цель работы. Разработать новые методы неинвазивной диагностики РПЖ на ранних стадиях заболевания. Задачи исследования.

1. Разработать методику определения метилированного статуса промоторного участка гена GSTP1 и оценить эффективность ее применения при исследованиях мочи больных с различными патологиями предстательной железы.

2. Проанализировать и оценить статус метилирования гена gstpl у пациентов с различными патологиями предстательной железы.

3. Разработать методику определения активности сериновой протеазы хепсин в моче больных с различными патологиями предстательной железы.

4. Провести исследование амидолитической активности хепсина в моче пациентов с раком и другими патологиями предстательной железы.

5. Оценить и сравнить диагностическую точность и положительную прогностическую ценность индивидуального и совместного применения исследуемых маркеров при раке предстательной железы.

Научная новизна исследования.

Впервые была разработана и использована методика определения метилированного статуса гена gstpl в моче пациентов с подозрением на рак предстательной железы.

Впервые была разработана методика определения активности сериновой протеазы хепсин на клетках предстательной железы человека. Наиболее удобным и прогностически удовлетворительным методом определения активности белка хепсина на сегодняшний день является определение амидолитической активности протеазы в моче пациентов.

Впервые для больных раком предстательной железы и простатической интраэпителиальной неоплазией применена методика определения активности сериновой протеазы хепсин.

Практическая значимость работы.

Разработана и предложена в клиническую практику современная методика ранней диагностики РПЖ методом определения амидолитической активности сериновой протеазы хепсин.

Разработана и апробирована методика совместной оценки амидолитической активности хепсина и метилированного статуса гена gstpl для диагностики рака предстательной железы.

Апробация работы.

Результаты работы были доложены и обсуждены на:

1. Заседании кафедры биологической химии ММА им. И. М. Сеченова (май 2008 г., г. Москва)

2. Конференции кафедры урологии ММА им. И. М. Сеченова (февраль 2008 г., г. Москва)

3. X урологической конференции молодых ученых (сентябрь 2007 г., г. Москва).

4. ХХХП конгрессе FEBS «Molecular Machines» (июль 2007 г., г. Вена).

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 в центральных периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Метилирование промоторной области гена gstpl является значимым показателем оценки состояния предстательной железы в норме и при патологических процессах в ткани предстательной железы.

2. Определение активности сериновой протеазы хепсин является специфичным при онкологических заболеваниях предстательной железы.

3. Изменение активности сериновой протеазы хепсин на поверхности клеток предстательной железы является маркером патологического процесса в ткани.

4. Предпочтительно совместное использование исследуемых маркеров для диагностики патологического состояния предстательной железы.

5. Использование предложенной методики исследования мочи для ранней диагностики РПЖ и ПИН является более информативным, чем применяемый на сегодняшний день метод определения ПСА в крови.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Васильева, Евгения Борисовна

Выводы. Нами предлагается новая тест-система для неинвазивной диагностики карциномы предстательной железы, основанная на определении и оценке амидолитической активности сериновой протеазы II типа хепсина и метилированного статуса гена gstpl в моче больных с подозрением на рак предстательной железы.

Заключение.

Рак предстательной железы (РПЖ) - одно из наиболее распространенных опухолевых заболеваний у мужчин. Частота развития рака предстательной железы растет с возрастом. У молодых людей он встречается крайне редко. Однако примерно с 45 лет заболеваемость растет в геометрической прогрессии. Клиническая картина РПЖ не обладает ярко выраженной симптоматикой. Тем не менее, смертность от РПЖ составляет примерно 4% от всего объема выявляемых онкологических заболеваний, а распространенность составляет примерно 15 человек на 100 ООО мужчин.

В настоящее время во многих клиниках активно развивается молекулярная диагностика онкологических заболеваний, в том числе и рака предстательной железы. Преимущество данной системы диагностики перед традиционными методами заключается в том, что она позволяет диагностировать рак на ранних стадиях. Самый распространенный тест для диагностики РПЖ, основанный на определении простат-специфического антигена в крови, обладает низкой специфичностью. В связи с этим, на сегодняшний день остро стоит необходимость создания новых неинвазивных методов ранней диагностики РПЖ и выбора новых, более специфичных маркеров данного заболевания. В качестве таких маркеров нами предлагается определение активности сериновой протеазы хепсин и частоты метилирования промоторной области гена gstpl в образцах мочи пациентов с подозрением на рак предстательной железы отобранных после пальцевого ректального исследования.

В ходе проведенных исследований, нами показано, что активность хепсина действительно специфически увеличивается при РПЖ, и не наблюдается или наблюдается незначительно при других онкологических заболеваниях. Измерение активности хепсина в клетках различных опухолевых линий показало, что клетки линии LnCaP могут являться положительным контролем при определении активности хепсина в образцах мочи больных аденокарциномой предстательной железы после массажа простаты. В ходе проведенных экспериментов была установлена принципиальная возможность детекции хепсина в образцах мочи больных раком простаты.

При анализе активности хепсина в разных группах больных было показано, что активность хепсина в группе пациентов с РПЖ не отличается от активности в группе пациентов с ПИН, достоверно отличается от таковой в группе ДГПЖ+ХП (р=0.032) и группе контроля (р<0,05).

В результате проведенного ПЦР - анализа ДНК из образцов мочи здоровых доноров и больных аденокарциномой было показано, что предложенная нами методика позволяет детектировать метилирование промоторной области гена gstpl.

В результате проведенных исследований было установлено, что метилирование промоторной области гена GSTP1 наблюдалось чаще при различных патологиях предстательной железы, чем в норме и при хроническом простатите. Метилирование промоторной области гена gstpl у пациентов с аденокарциномой предстательной железы наблюдалось в 73% случаев, у пациентов с ПИН в 61 % случаев, у пациентов с ДГПЖ в 26% случаев, и в 17% случаев при хроническом простатите. Метилирование промоторной области гена GSTP1 у добровольцев из контрольной группы не наблюдалось.

Проведенный нами анализ совместных прогностической и диагностической ценности анализов активности хепсина и определения частоты метилирования промоторной области гена gstpl показал, что совместное ППЦ составляет 92,8%, а совместная диагностическая точность -94,6%, следовательно, сочетанное использование данных маркеров является более информативным для диагностики рака предстательной железы, чем существующие на сегодняшний день тесты.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васильева, Евгения Борисовна, Москва

1. Аляев Ю.Г., Винаров А.З., Безруков Е.А.: Рак предстательной железы. Врач : научно-практический и публицистический журнал. 2003 - М.: № 10. - С. 24-2

2. Бормотин А.В., Говоров А.В., Пушкарь Д.Ю. Алгоритм ранней диагностики рака предстательной железы. Русский медицинский журнал. 2003- М.: № 8.

3. ВелиевЕ.И. Ранняя диагностика локализованных форм рака предстательной железы. Журнал "Ремедиум" 2004; 3

4. Гарин A.M. Факты, достижения и неудачи современной онкологии. Алма-Ата: Казахстан, 1980.

5. Залуцкий И.В., Жаврида Э.А. Алгоритмы диагностики и лечения злокачественных новообразований,- Минск. 2007. -510 с

6. Заридзе Д. Г. // Арх. пат. — 1996. — Вып. 3. С 49.

7. Заридзе Д.Г. Эпидемиология, механизмы канцерогенеза и профилактика рака // 1П съезд онкологов и радиологов СНГ. -Материалы съезда, Ч.1.- Минск, 2004.- С.42-46.

8. Киселев В.И., Ляшенко А.А. Молекулярные механизмы регуляции гиперпластических процессов. Москва. - 2005. -348 с.

9. Мазо Е.Б., Мешков В.В.; Простатическая интраэпителиальная неоплазия. -М., Гэотар Медицина 2001г. - 80 с.

10. Матвеев Б.П., Бухаркин Б.В., Матвеев В.Б. Рак предстательной железы М. - 1999,- 153с.

11. Патрушев Л.И. Экспрессия генов, М., Наука. 2000г. - 528 с.

12. Ригельман Р. Как избежать врачебных ошибок. Книга практикующего врача / Пер. с англ. М.: Практика, 1994.

13. Руднов В.А. Пути оптимизации диагностики, прогноза и интенсивной терапии сепсиса с органной дисфункцией автореф. диссертации. Екатеринбург; 1995.

14. Сивков А.В., Аполихин О.И. Рак предстательной железы http://wwvv.uro.ru/society/plenum/cancer.php3.-2002

15. Трапезников Н. Н., Кушлинский Н. Е. «Потенциальный убийца номер один» Вестник Российской академии наук, том 71, №6. с. 503-509,2001 г.

16. Черешнев В.А., Гусев Е.Ю. Системное воспаление как иммунопатобиологический феномен. Цитокины и воспаление 2002; Т.1(2): 17.

17. Чиссов В.И., Дарьялова C.JI. Клинические рекомендации. Онкология. М. - 2008. - 720с.

18. Abrahamsson P.A. Neuroendocrine cells in tumour growth of the prostate. Endocr Relat Cancer. 1999 Dec;6(4):503-19.

19. Arnold J. Т., Isaacs J. T. Mechanisms involved in the progression of androgen-independent prostate cancers:it is not only the cancer cell's fault Endocrine-Related Cancer (2002) 9 61-73 не использовала в ссылках

20. Balk SP, Ко YJ, Bubley GJ. Biology of prostate-specific antigen. J Clin Oncol 2003;21:383-91

21. Barclay L. End of an Era for PSA Screening: A Newsmaker Interview With Thomas Stamey, J Urol. 2004;172(4, part 1 of 2):1297-1301

22. Baron E, Angrist A. Incidence of occult adenocarcinoma of the prostate after 50 years of age. Archives of Pathology. 1941; 32:78793.

23. Bean M., Yatani R., Liu P. et al. Prostatic carcinoma at autopsy in Hiroshima Nagasaki Japanese // Cancer. 1973. - Vol. 32. - P. 498.

24. Berenblum I. Carcinogenesis as a Biological Problem. -Amsterdam: North Holland Publ., 1974. P. 204.

25. Birchmeier, C., W. Birchmeier, E. Gherardi & G. F. Vande Woude: Met, metastasis, motility and more. Nat RevMol Cell Biol, 4, 91525 (2003)

26. Bolduc S., Lacombe L., Naud A., Gregoire M., Fradet Y., Tremblay R. R. Urinary PSA: a potential useful marker when serum PSA is between 2.5 ng/mL and 10 ng/mL. CUAJ 2007; 1:377-81.

27. Bostwick D.G. Progression of prostatic intraepithelial neoplasia to early invasive adenocarcinoma. Eur. Urol. 1996;30(2):145-52. Review.

28. Buchanan G., Greenberg N.M., Scher HI, et al. Collocation of androgen receptor gene mutations in prostate cancer. Clin Cancer Res 2001;7:1273-81.

29. Carter B.S., Beaty Т.Н., Steinberg G.D., Childs В., Walsh P.C. Mendelian inheritance of familial prostate cancer. Proc Natl Acad SciU S A. 1992 Apr 15;89(8):3367-71.

30. Carter B.S., Steinberg GD, Beaty TH, Childs B, Walsh PC. Familial risk factors for prostate cancer.Cancer Surv. 1991;11:5-13. (нет полного текста)

31. Catalona W.J., Smith D.S., Ratliff T.L., Basler J.W. Detection of organ-confined prostate cancer is increased through prostate-specific antigen-based screening. JAMA 1993;270:948—54.

32. Chautard D.,. Daver A, Mermod В., Tichet A., Bocquillon V., Soret J.-Y. Values for the Free to Total Prostate-Specific Antigen Ratio as a Function of Age: Necessity of Reference Range Validation Eur Urol 1999;36:181-186

33. Chen C.D., Welsbie D.S., Tran C., et al. Molecular determinants of resistance to antiandrogen therapy. Nat Med 2004;10:33-9.

34. Chen C.D., Welsbie D.S., Tran C., et al. Molecular determinants of resistance to antiandrogen therapy. Nat Med 2004;10:33-9.

35. Chen, Z., Z. Fan, J. E. McNeal, R. Nolley, M. C. Caldwell, M. Mahadevappa, Z. Zhang, J. A. Warrington & T. A. Stamey: Hepsin and rnaspin are inversely expressed in laser capture microdissectioned prostate cancer. J Urol, 169, 1316-9 (2003)

36. Cho S-G, Lee Y.H., Park H-S., Ryoo K., Kang K.W., et al. 2001. Glutathione S-transferase Mu modulates the stressactivated signals by suppressing apoptosis signal-regulating kinase 1. J. Biol.Chem. 276:12749-55

37. Coley C.M., Barry M.J., Fleming C., Mulley A.G. Clinical guideline: Part I. Early Detection of Prostate Cancer. Part I: Prior Probability and Effectiveness of Tests. Ann Intern Med 1997;126:394-406.

38. Coombs G.S., Bergstrom R.C., Pellequer J.L., Baker S.I., Navre M., Smith M.M., Tainer J.A., Madison E.L., Corey D.R. Substrate specificity of prostate-specific antigen (PSA). Chemistry & Biology September 1998, 5:475-488

39. Costa J., Prostate Cancer Screening in the PSA Era. Northeast Florida Medicine2007, Vol. 58, No. 1

40. Dano, K., N. Behrendt, G. Hoyer-Hansen, M. Johnsen, L. R. Lund, M. Ploug & J. Romer: Plasminogen activation and cancer. Thromb Haemost, 93, 676-81 (2005)

41. Davie, E. W., Fujikawa, K., and Kisiel, W. (1991). The coagulation cascade: initiation, maintenance, and regulation. Biochemistry 30, 10363-10370.

42. Debes J.D., Tindall D.J. Mechanisms of androgen-refractory prostate cancer. N Engl J Med 2004;351:1488-90.

43. Dhanasekaran, S. M., T. R. Barrette, D. Ghosh, R. Shah, S. Varambally, K. Kurachi, K. J. Pienta, M. A. Rubin & A. M. Chinnaiyan: Delineation of prognostic biomarkers in prostate cancer. Nature, 412, 822-6 (2001)

44. Dodd J.G., Paraskevas M., McNicol P.J. Detection of human papillomavirus 16 transcription in human prostate tissue // J. Urol. -1993.-Vol. 149.-P. 400.

45. Dong Z.Y., Liu Y., Lu S„ Wang A., Lee K., Wang L.H., Revelo M., Lu S. Vav3 oncogene is overexpressed and regulates cell growth and androgen receptor activity in human prostate cancer. Mol Endo 2006, 20:2315-2325.

46. Eaton D.L., Bammler Т.К. Concise review of the glutathione S-transferases and their significance to toxicology. Toxicol Sci. 1999 Jun;49(2): 156-64.

47. Feldman B.J., Feldman D. The development of androgen-independent prostate cancer. Nat Rev Cancer 2001;! :34—45.

48. Gann P.H., Hennekens C.H., Stampfer M.J. A prospective evaluation of plasma prostate-specific antigen for detection of prostatic cancer. JAMA 1995;273:289-94.

49. Garnick M.B. Prostate cancer: screening, diagnosis, and management. Ann Intern Med 1993;118:804-18

50. Gelmann E.P. Molecular biology of the androgen receptor. J Clin Oncol 2002;20:3001-15.

51. Gonzalgo M.L., Isaacs W.B.: Molecular pathways to prostate cancer. J Urol. 2003 Dec;170(6 Ptl):2444-52.

52. Gregory C.W., Johnson R.T., Jr., Mohler J.L., et al. Androgen receptor stabilization in recurrent prostate cancer is associated with hypersensitivity to low androgen. Cancer Res 2001;61:2892-8.

53. Hannappel E., Huff T. The thymosins. Prothymosin alpha, parathymosin, and betathymosins: structure and function. 2003,Vitam Horm 66:257-296

54. Haritos A.A., Goodall G.J., Horecker B.L. Prothymosin alpha: isolation and properties of the major immunoreactive form of thymosin alpha 1 in rat thymus. 1984, Proc Natl Acad Sci US A 81:1008-1011

55. Hayes J.D., Flanagan J.U., Jowsey I.R. Glutathione transferases. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2005;45:51-88.

56. Herbet J., Birkhoff J., Feorino P., Caldwell G. Herpes simplex virus type 2 and cancer of the prostate // J. Urol. 1976. - Vol. 116. - P. 611.

57. Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Sep 3;93(18):9821-6.

58. Hessels D, Klein Gunnewiek JMT, van Oort I, Karthaus HFM, van Leenders GJL, van Balken B, Kiemeney LA, Witjes JA, Schallcen JA. DD3PCA3-based molecular urine analysis for the diagnosis of prostate cancer. Eur Urol 2003;44:8-16 .

59. Hooper J.D., Clements J.A., Quigley J.P., Antalis T.M., Type II transmembrane serine proteases, J. Biol. Chem. 276 (2001) 857860

60. Ibrahim G.K., Gravitt P.E., Dittrich K.L. et al. Detection of human papillomavirus in the prostate by polymerase chain reaction and in situ hybridization // J. Urol. 1992. - Vol. 148. - P. 1822.

61. Jiang X., Kim H.E., Shu H., Zhao Y., Zhang H., Kofron J., Donnelly J., Burns D., Ng S.C., Rosenberg S., Wang X. Distinctive roles of PHAP proteins and prothymosin-alpha in a death regulatory pathway. 2003, Science 299:223-226

62. Jiang Z., Woda B. A, Wu C.-L., Yang X. J. Discovery and Clinical Application of a Novel Prostate Cancer Marker a-Methylacyl Co A Racemase (P504S) Am J Clin Pathol 2004;122:275-289

63. Joyce, J. A. & D. Hanahan: Multiple roles for cysteine cathepsins in cancer. Cell Cycle , 3, 1516-619 (2004)

64. Kirchhofer, D., M. Peek, M. T. Lipari, K. Billeci, B. Fan & P. Moran: Hepsin activates pro-hepatocyte growth factor and is inhibited by hepatocyte growth factor activator inhibitor-IB (HAI-1B) and HAI-2. FEBS Lett, 579, 1945-50 (2005)

65. Kirschenbaum A, Itzkowitz SH, Wang JP, Yao S, Eliashvili M, Levine AC. MUC1 Expression in Prostate Carcinoma: Correlation with Grade and Stage. Mol Urol. 1999;3(3): 163-168.

66. Kitamoto, Y., Veile, R. A., Donis-Keller, H., and Sadler, J. E. (1995). cDna sequence and chromosomal localization of human enterokinase, the proteolytic activator of trypsinogen. Biochemistry 34,4562-4568.

67. Kitamoto, Y., Yuan, X., Wu, Q., McCourt, D. W., and Sadler, J. E. (1994). Enterokinase, the initiator of intestinal digestion, is a mosaic protease composed of a distinctive assortment of domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7588-7592.

68. Klezovitch, O., J. Chevillet, J. Mirosevich, R. L. Roberts, R. J. Matusik & V. Vasioukhin: Hepsin promotes prostate cancer progression and metastasis. Cancer Cell, 6, 185-95 (2004)

69. Knudsen, B. S. & M. Edlund: Prostate cancer and the met hepatocyte growth factor receptor.Adv Cancer Res, 91, 31-67 (2004)

70. Kraut, J. (1977). Serine proteases: structure and mechanism of catalysis. Annu. Rev. Biochem. 46, 331-358.

71. Kurachi, K., Torres-Rosado, A., and Tsuji, A. (1994). Hepsin. Methods Enzymol. 244, 100-114.

72. Lai, Y., B. Wu, L. Chen & H. Zhao: A statistical method for identifying differential gene-gene co-expression patterns. Bioinformatics, 20, 3146-55 (2004)

73. Lattouf J.-B., Srinivasan R., Pinto P. A., Linehan W. M., Neckers L. Mechanisms of Disease: the role of heat-shock protein 90 in genitourinary malignancy Nature Clinical Practice Urology (2006) 3, 590-601

74. Lawson D. A. Witte O. N. Stem cells in prostate cancer initiation and progression J Clin Invest. 2007 August 1; 117(8): 2044-2050.

75. Leytus, S.P., Loeb, K.R., Hagen, F.S., Kurachi, K., and Davie, E.W. (1988). A novel trypsin-like serine protease (hepsin) with a putative, transmembrane domain expressed by human liver and hepatoma cells. Biochemistry 27, 1067-1074.

76. Light, A., and Janska, H. (1989). Enterokinase (enteropeptidase): comparative aspects. Trends Biochem. Sci. 14, 110-112.

77. List, К., Т. H. Bugge & R. Szabo: Matriptase: potent proteolysis on the cell surface. Mol Med, 12, 1-7 (2006)

78. Liu L, Yoon JH, Dammann R and Pfeifer GP: Frequent hypennethylation of the RASSF1A gene in prostate cancer. Oncogene 21: 6835-6840, 2002

79. Lu, D., and Sadler, J. E. (1998). "Handbook of Proteolytic Enzymes." Academic Press Ltd., London.

80. Lucia M.S., Torkko K.C.: Inflammation as a target for prostate cancer chemoprevention: pathological and laboratory rationale. J Urol. 2004 Feb;171(2 Pt 2):S30-4; discussion S35.

81. Luo J., Zha S., Gage W. R., et al.: a-Methylacyl-CoA Racemase: A New Molecular Marker for Prostate Cancer Cancer Res. 62, 22202226, April 15, 2002

82. Luo, J., D. J. Duggan, Y. Chen, J. Sauvageot, С. M. Ewing, M. L. Bitt ner, J. M. Trent & W. B. Isaacs: Human prostate cancer and benign prostatic hyperplasia:molecular dissection by gene expression profiling. Cancer Res, 2001, 61, 4683-8.

83. Lyons L.S., Burnstein K.L.: Vav3, a Rlio GTPase Guanine Nucleotide Exchange Factor, Increases During Progression to Androgen Independence in Prostate Cancer Cells and Potentiates Androgen Receptor Transcriptional Activity. Mol Endocrinol 2005. Dec. 29

84. Mann, N. S., and Mann, S. K. (1994). Enterolcinase. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 206, 114-118.

85. Matthews P., Jones C. J.: Clinical implications of telomerase detection Histopathology 2001, 38, 485±498

86. McMenamin M.E., Soung P., Perera S., Kaplan I., Loda M., and Sellers W.R. Loss of PTEN expression in paraffin-embedded primary prostate cancer correlates with high Gleason score and advanced stage. Cancer Res 1999, 59, 4291^1296.

87. McNicol P.J., Dodd J.G. High prevalence of human papillomavirus inprostate tissues // J. Urol. 1991. - Vol. 145. - P. 850.

88. Mettlin C., Jones G.W., Murphy G.P. Trends in prostate cancer care in the United States, 1974—1990: observations from the patient care evaluation studies of the American College of Surgeons Commission on Cancer. CA Cancer J Clin 1993;43:83—91.

89. Meyer HA, Alirens-Fath I, Sommer A, Haendler B. Novel molecular aspects of prostate carcinogenesis. Biomed Pharmacother. 2004 Jan;58(l):10-6.

90. Mignatti, P., and Rifkin, D. B. (1993). Biology and biochemistry of proteinases in tumor invasion. Physiol. Rev. 73, 161-195.

91. Miyamoto K. and Ushijima Т.: Diagnostic and Therapeutic Applications of Epigenetics Jpn J Clin Oncol 2005;35(6)293-301 doi:10.1093/jjco/liyi088

92. Molinie V, Baumert H. New markers in prostate biopsies Actas Urol Esp. 2007;31(9): 1009-1024

93. Montironi R, Bostwick DG, Bonkhoff H, Cockett AT, Helpap B, Troncoso P, Waters D. Origins of prostate cancer. Cancer. 1996 Jul 15;78(2):362-5.

94. Mullins, D. E., and Rohrlich, S. T. (1983). The role of proteinases in cellular invasiveness. Biochim. Biophys. Acta 695, 177—214.

95. Nelson P.S., Gleason T.P., Brawer M.K. Chemoprevention for prostatic intraepithelial neoplasia // Eur. Urol. 1996. - Vol. 30. -P. 269-278.

96. Nelson W.G., De Marzo A.M., Isaacs W.B. Prostate cancer. N Engl JMed 2003;349:366-81.

97. Nelson, W. G., De Marzo A.M., Isaacs W. B. Prostate Cancer. N Engl JMed 2003;349:366-81.

98. Neurath, H. (1986). The versatility of proteolytic enzymes. J. Cell. Biochem. 32, 35^19.

99. Nijs H.G., Essink-Bot M.L., DeKoning H.J., Kirkels W.J., Schroder F.H.: Why Do Men Refuse or Attend Population-Based Screening for Prostate Cancer? The Journal of Urology 2000, Volume 168 , Issue 2 , Pages 883 883.

100. Olek A., Oswald J., Walter J.: A modified and improved method for bisulphate based cytosine methylation analysis Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, No. 24

101. Overall, С. M. & C. Lopez-Otin: Strategies for MMP inhibition in cancer: innovations for the post-trial era. Nat Rev Cancer, 2, 657-72 (2002)

102. Parr С., Jiang W.G.: Hepatocyte growth factor activation inhibitors (HAI-1 and HAI-2) regulate HGF-induced invasion of human breast cancer cells. Int J Cancer. 2006 Sep 1;119(5):1176-83.

103. Perera F. P. // Cancer Epidemiology and Prevention / Eds D. Schottenfeld, J. Fraumeni. — New York, 1996. — P. 406—417.

104. Pienta K. J., Bradley D. Mechanisms Underlying the Development of Androgen-Independent Prostate Cancer Clinical Cancer Research Vol. 12, 1665-1671, March 2006

105. Rawlings N.D., Barrett A.J., MEROPS: the peptidase database, Nucleic Acids Res. 27 (1999) 325- 331

106. Rein Т., DePamphilis M. L., Zorbas H.: Identifying 5-methylcytosine and related modifications in DNA genomes Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, No. 10 2255-2264

107. Richie J.P., Catalona W.J., Ahmann F.R., Hudson M.A., Scardino P.T., Flanigan R.C., et al. Effect of patient age on early detection of prostate cancer with serum prostate-specific antigen and digital rectal examination. Urology 1993;42:365—74.

108. Riegman PH, Vlietstra RJ, Suurmeijer L, Cleutjens CB, Trapman J. Characterization of the human kallikrein locus. Genomics. 1992 Sep;14(l):6-ll.

109. Rooseboom M., Commandeur J. N. M., Vermeulen N. P. E.: Enzyme-Catalyzed Activation of Anticancer Prodrugs. Pharmacol Rev 56:53-102,2004

110. Sanford E., Geder L., Laychock A. et al. Evidence of the association of cytomegalovirus with carcinima of the prostate // J. Urol. 1977. -Vol. 118.-P. 789.

111. Sarkar F.H., Sakr W.A., Li Y.W. et al. Detection of human papillomavirus (HPV) DNA in human prostatic tissues by polymerase chain reaction (PCR) // Prostate. 1993. - Vol. 22. - P. 171.

112. Schalken JA, Hessels D, Verhaegh G.: New targets for therapy in prostate cancer: differential display code 3 (DD3(PCA3)), a highly prostate cancer-specific gene. Urology. 2003 Nov;62(5 Suppl 1):34-43.

113. Schmidt J.D., Mettlin C.J., Natarajan N., Peace B.B., Beart R.W. Jr., Winchester D.P., et al. Trends in patterns of care for prostat ic cancer, 1974—1983: results of surveys by the American College of Surgeons. J Urol 1986;136:416-21.

114. Shan K., Palma L., Murphy G. The occurrence of SV40 neutralizing antibodies in sera of patients with genitourinary carcinoma // J. Surg. Oncol. 1971. - No. 3. - P. 443.

115. Sheikh S. S., Romanska H. M., Abel P., Domin J., Lalani N. Predictive Value of PTEN and AR Coexpression of Sustained Responsiveness to Hormonal Therapy in Prostate Cancer-—A Pilot Study Neoplasia. 2008 September; 10(9): 949-953.

116. Shi X.B., Ma A.H., Xia L., et al. Functional analysis of 44 mutant androgen receptors from human prostate cancer. Cancer Res 2002;62:1496-502.

117. Silman A.J., Hochberg M.C. Epidemilogy of rheumatic disease. — Oxford: Oxford University Press.,1993.

118. Singal R., Ferdinand L., Reis I. M., Schlesselman J. J.: Methylation of multiple genes in prostate cancer and the relationship with clinicopathological features of disease. Oncology Reports 12: 631637, 2004

119. Sloane, B. F., S. Yan, I. Podgorski, В. E. Linebaugh, M.L. Cher, J. Mai, D. Cavallo-Medved, M. Sameni, J.Dosescu & K. Moin: Cathepsin В and tumor proteolysis: contribution of the tumor microenvironment. Semin Cancer Biol, 15, 149-57 (2005)

120. Srikantan V, Valladares M, Rliim JS, Moul JW, Srivastava S. HEPSIN inhibits cell growth/invasion in prostate cancer cells.Cancer Res. 2002 Dec l;62(23):6812-6.

121. Sternlicht, M. D. & Z. Werb: How matrix metalloproteinases regulate cell behavior. Annu Rev Cell Dev Biol, 17, 463-516 (2001)

122. Stroud, R. M. (1974). A family of protein-cutting proteins. Sci. Am. 231,74-88.

123. Taille A., Vacherot F., Salomon L., Druel C., Gil Diez de Medina S., Abbou C., Buttyan R., Chopin D. Hormone-refractory prostate cancer: a multi-step and multievent process Prostate Cancer and Prostatic Diseases (2001) 4, 204-212

124. Tanimoto, H., Yan, Y., Clarke, J., Korourian, S., Shigemasa, K., Pannley, Т. H., Parham, G. P., and TJ, О. B. (1997). Hepsin, a cell surface serine protease identified in hepatoma cells, is overexpressed in ovarian cancer. Cancer Res. 57, 2884-2887.

125. Taplin M.E, Balk S.P. Androgen receptor: a key molecule in the progression of prostate cancer to hormone independence. J Cell Biochem 2004;91:483-90.

126. Torres-Rosado, A., KS, O. S., Tsuji, A., Chou, S. H., and Kurachi, K. (1993). Hepsin, a putative cell-surface serine protease, is required for mammalian cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,7181-7185.

127. Townsend D.M. and Tew K.D.: The role of glutathione-S-transferase in anti-cancer drug resistance Oncogene (2003) 22, 7369-7375.

128. Tsuji, A., Torres-Rosado, A., Arai, Т., Le Beau, M. M., Lemons, R. S., Chou, S. H., and Kurachi, K. (1991). Hepsin, a cell membrane-associated protease. Characterization, tissue distribution, and gene localization. J. Biol.'Chem. 266, 16948-16953.

129. Uhland, K.: Matriptase and its putative role in cancer.Cell Mol Life Sci, 63, 2968-78 (2006)

130. Vasianov A.F., Romanenko A.M., Zabarko L.B. et al. Prostatic intraepithelial neoplasia and apoptosis in benign prostatic hyperplasia before and after the Chernobyl accident in Ukrane // Pathol. Oncol. Res. 1999. - Vol. 5, No. 1. - P. 28-31.

131. Vu, Т. К. H., Liu, R. W., Haaksma, C. J., Tomasek, J. J., and Howard, E. W. (1997). Identification andcloning of the membrane-associated serine protease, hepsin, from mouse preimplantation embryos. J. Biol. Chem. 272, 31315-31320.

132. Walsh P.C., Partin A.W. Family history facilitates the early diagnosis of prostate carcinoma. Cancer. 1997 Nov 1;80(9):1871-4.

133. Weber M.J., Gioeli D. Ras signaling in prostate cancer progression. J Cell Biochem 2004;91:13-25.

134. Weinstein L. В., Santella R. M., Perera F. // Cancer Prevention and Control / Eds P. Greenwald, B. Kramer, D. Weed. — New York, 1995. —P. 83—110.

135. Wesseling J, van der Valk SW, Vos HL, Sonnenberg A, Hilkens J. Episialin (MUC1) overexpression inhibits integrin-inediated cell adliesion to extracellular matrix components. J Cell Biol. 1995 Apr;129(l):255-65.

136. Wilding G., Chen M., Gelmann E.P. Aberrant response in vitro of hormone-responsive prostate cancer cells to antiandrogens. Prostate 1989;14:103-15.

137. Wu Q, Parry G. Hepsin and prostate cancer. Front Biosci. 2007 Sep l;12:5052-9.

138. Wu Q. Type II transmembrane serine proteases. Curr Top Dev Biol. 2003;54:167-206.

139. Zacharski, L. R., Ornstein, D. L., Memoli, V. A., Rousseau, S. M., and Kisiel, W. (1998). Expression of the factor VII activatingprotease, hepsin, in situ in renal cell carcinoma letter. [In Process Citation], Thromb. Haemost. 79, 876-877.

140. Zhao X.Y., Malloy P.J., Krishnan A.V., et al. Glucocorticoids can promote androgen-independent growth of prostate cancer cells through a mutated androgen receptor. Nat Med 2000;6:703-6.

141. Zhukov, A., Hellman, U., and Ingelman-Sundberg, M. (1997). Purification and characterization of hepsin from rat liver microsomes. Biochim. Biophys. Acta 1337, 85-95.