Идентификация, локализация и функции 2`,3`-циклонуклеотид-3`-фосфодиэстеразы (CNP) в митохондриях крыс

Бабурина, Юлия Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация, локализация и функции 2`,3`-циклонуклеотид-3`-фосфодиэстеразы (CNP) в митохондриях крыс
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Идентификация, локализация и функции 2`,3`-циклонуклеотид-3`-фосфодиэстеразы (CNP) в митохондриях крыс"

На правах рукописи

БАБУРИНА ЮЛИЯ ЛЕОНИДОВНА

Идентификация, локализация и функции 2',3'-циклонуклеотид-З'-фосфодиэстеразы (CNP) в митохондриях

крыс

03.01.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2011

1 7 [."АР 2011

4840657

Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Азарашвили Тамара Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор

Акатов Владимир Семенович,

Защита диссертации состоится «_30» марта 2011 г. в 13-30 часов на заседании совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, ул. Институтская, 3,

доктор биологических наук Опанасенко Вера Константиновна

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии

им. А.Н.Белозерского, МГУ

ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан « » февраля 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физ.-мат. наук

Ланина Н.Ф.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В настоящее время установлено, что митохондрии участвуют в клеточной гибели и играют ключевую роль в выживаемости и гибели клеток мозга. Обнаружено, что программируемая гибель нейронов и других клеток мозга происходит как при остром (ишемия, травма, инфекции ЦНС) так и при хроническом (Болезнь Альцгеймера, Паркинсона, старение) повреждении мозга. Последние сведения о молекулярных механизмах, лежащих в основе нейродегенеративных заболеваний, указывают на непосредственное вовлечение в эти процессы митохондриальных путей апоптоза.

Так как формирование неселективной поры в результате увеличения проницаемости внутренней мембраны (Permeability Transition Pore - РТР), считается начальной стадией апоптоза, то полагают, что функционирование неселективной поры может инициировать гибель нейрональных клеток. Структурное формирование митохондриальной поры индуцируется ионами кальция и происходит после накопления в матриксе митохондрий пороговых концентраций кальция, инициирующих падение мембранного потенциала, набухание митохондрий и выход про-апоптических белков. В результате этих событий запускается целый каскад реакций, вызывающих апоптоз. Аналогичные процессы могут происходить в митохондриях и в ответ на окислительный стресс. Поэтому инициация функционирования поры считается одной из ключевых стадий развития программируемой гибели клеток. Несмотря на многолетние исследования, к настоящему моменту не установлены ни точный состав поры, ни механизм регуляции ее функционирования.

До недавнего времени считалось, что пора формируется из потенциал-зависимого анионного канала (VDAC) и 18 кДа белка (белок-транслокатор, TSPO) внешней мембраны, транслоказы адениновых нуклеотидов (ANT) внутренней мембраны и циклофилина D матрикса. А регуляция осуществляется гексокиназой, креатинкиназой и белками семейства Вс12. Однако эксперименты, выполненные на мышах с выключенными генами VDAC и ANT, показали, что эти два белка не входят в структуру поры, но до сих пор считаются основными его модуляторами (Kokoszka, 2004, Baines, 2007). Поскольку точный состав поры не установлен до настоящего времени, представляется актуальным не только исследование структуры РТР, но и механизма ее регуляции.

С точки зрения механизма регуляции поры наиболее важным представляется возможное вовлечение в этот процесс реакции

фосфорилирования/дефосфорилирования митохондриальных белков, поскольку этот вид посттрансляционной модификации является самым мощным механизмом регуляции многих функций в клетке.

фосфорилирования/дефосфорилирования митохондриальных белков является одним из возможных путей регуляции функционирования поры. Данное предположение подтверждается тем фактом, что VDAC, TSPO и ANT фосфорилируются протеинкиназой А и тирозиновой протеинкиназой, обнаружены также фосфорилированные формы регуляторных белков РТР таких, как Bcl-2, Bid, Bad, Вах семейства и каспаз, участвующие в апоптозе. Однако, ранее из спектра обнаруженных фосфобелков была идентифицирована только субъединица с F0Fr АТРазы, уровень фосфорилирования которой снижался в присутствии пороговых концентраций Са2+ (Азарашвили, 2002). Наибольший интерес представляло обнаруженное увеличение включения меченного фосфата в белки с молекулярной массой 46 кДа. Фосфорилирование этого белка зависело от кальция и изменялось в присутствия циклоспорина А, поэтому он рассматривался нами как пороспецифичный. В связи с этим, следует упомянуть работы С. Папа и др. (Papa, 2000), которые показали, что 43 кДа фосфобелок, обнаруженный в митохондриях сердца, изменяет уровень фосфорилирования в присутствии сАМР, а также взаимодействует с Функциональными Комплексами митохондрий. Кроме того, среди белков с молекулярной массой 46 кДа была описана 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиэстераза (CNP), имеющая аминокислотную последовательность, направляющую ее к митохондриям для ассоциации с ними (Lee, 2002).

В связи с этим, идентификация 46 кДа белка в митохондриях, как нового компонента/регулятора РТР представлялась важной и актуальной.

Цель и основные задачи исследования.

В связи с вышеизложенным была сформулирована цель настоящей работы -идентификация 46 кДа фосфобелка как 2',3'-циклонуклеотид-З'-фосфодиэстеразы (CNP), его локализация и функции в митохондриях крыс

Согласно поставленной цели, были сформулированы задачи исследования:

1. Идентифицировать фосфобелок 46 кДа в митохондриях мозга методом двумерного электрофореза с последующим проведением масс-спектрометрии и western blot анализа (иммуноблот) с использованием специфических антител, выработанных к CNP.

2. Выяснить присутствие CNP в митохондриях, изолированных из разных тканей и клеток и выявить локализацию CNP внутри митохондрий.

3. Исследовать влияние субстратов CNP (2',3'-сАМР и 2',3'-cNADP) на параметры открытия РТР (Са2+-индуцированный выход Са2+, изменение мембранного потенциала и набухание) и установить корреляцию активности фосфодиэстеразы с функционированием РТР.

4. Исследовать влияние пониженной экспрессии CNP на активность фосфодиэстеразы и параметры открытия РТР в митохондриях, изолированных из трансфецированных и нетрансфецированных клеток олигодендроцитов.

5. Изучить способность CNP к ассоциации с Функциональными Комплексами (IV) в митохондриях и выяснить влияние 2',3'-сАМР и 2',3'-cNADP на ассоциацию CNP с Комплексами в контрольных условиях и в присутствии пороговых концентраций Са2+, инициирующих открытие РТР.

6. Выявить возможный выход CNP из митохондрий мозга в присутствии пороговых концентраций кальция и в присутствии субстратов CNP.

Научная иовизнп.

В рамках выполнения диссертации впервые был идентифицирован фосфобелок с молекулярной массой 46 кДа как 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиэстераза (CNP, ЕС 3.1.4.37). Обнаружено, что CNP присутствует в митохондриях, изолированных из мозга, печени, сердца крыс, а также клеток олигодендроцитов и глиомы Сб. В митохондриях она локализуется в мембранных фракциях. Впервые получены данные, показывающие, что субстраты CNP (2\3'-сАМР и 2',3'-cNADP) в низких микромолярных концентрациях являются индукторами открытия РТР. Ферментативная активность CNP в митохондриях мозга, нагруженных кальцием, уменьшается. Пониженная экспрессия CNP в культуре клеток олигодендроцитов приводит к уменьшению активности фосфодиэстеазы в митохондриях, изолированных из трансфецированных клеток и снижению пороговых концентраций кальция в них. Установлено, что во внутренней мембране митохондрий CNP может ассоциироваться с функциональными Комплексами митохондрий (I-V) и это взаимодействие регулируется 2',3'-сAMP и 2',3'-cNADP.

Научно-практическая ценность.

Выявление новых фосфорилированных белков митохондрий мозга и корреляции между уровнем их фосфорилирования и индукцией неселективной митохондриальной поры указывает на существование нового механизма регуляции РТР. Обнаруженная стимуляция открытия РТР циклонуклеотидами - субстратами CNP дает возможность рассматривать белок как возможный регулятор поры. Так как функционирование РТР рассматривают как начальную стадию, инициирующую апоптоз, полученные данные позволяют выявить новые возможные механизмы регуляции клеточной гибели, вовлечение CNP в процессы нейропротекции и противоопухолевые механизмы.

Связь CNP с Комплексами внутренней митохондриальной мембраны позволяет предположить ее участие в функционировании митохондриальной дыхательной цепи, а также в деградации РНК и биосинтезе белка в митохондриях и связанных с ними митохондриальных болезнях.

Апробация работы.

Материалы работы были представлены на Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (2007, 2009), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии»(2008, 2009, 2010), 5th International Symposium «Neuroprotection and Neurorepair Cerebral Ischemia and Stroke», International conference "Neurodegenerative diseases: molecular mechanisms in a functional genomics framework", National conference «Molecular pathways in health and disease of the nervous system».

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 21 печатных работ из них^статей и 1 ^тезисов.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на__страницах машинописного текста и состоит

из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (_ссылок). Диссертация иллюстрирована_рисунками.

МЕТОДЫ

Выделение митохондрий из мозга, сердца и печени крыс линии Вистар проводили методом стандартного дифференциального центрифугирования, несинаптические и сиинаптичнские митохондрии мозга крыс очищали в градиенте плотностей Percoll. (Sims, 1990).

Митохондрии из клеток олигодендроцитов и глиомы С6 выделяли по методу Almeida (Almeida, Medina, 1997) в нашей модификации (Azarashvili, 2009).

Субмитохондриальные фракции (митопласты и внешнюю мембрану) выделяли согласно методике Раиса и Линдсэй (Rice and Lindsay, 1997).

Содержание белка в суспензии митохондрий определяли по методу Лоури.

Фосфорилирование изолированных митохондрий проводили с помощью [у-32Р]АТР по методу, используемому в нашей лаборатории (Азарашвили и др. 1999). Для разделения митохондриальных белков применяли электрофорез в ПААГ (10-15%) в присутствии SDS в системе Лэммли (Laemmli, 1970).

Для получения авторадиограмм высушенные между листами целлофана гели экспонировали 3-4 дня на рентгеновской плёнке Kodak X-Omat AR-5 (Sigma, США). Оптическую плотность рентгеновских плёнок в зоне локализации [у-32Р]АТР-меченых белков определяли с помощью сканирующего денситометра фирмы «BioRad».

Очистку фосфобелка с молекулярной массой 46 кДа осуществляли методом диагонального 2D электрофореза, разработанного Райсом (Rais, 2004).

Иммуноблот митохондиальных белков выполняли после электрофоретического разделения митохондриальных белков с последующим переносом белков митохондрий на нитроцеллюлозную мембрану (0.2 мкм), при величине тока 400 мА в течение 60 мин. В качестве маркера был использован набор Precision Pre-stained Standards фирмы Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA), включающий белки с молекулярной массой 250-10кДа. Для детекции порина (VDAC), супероксиддисмутазы (SOD2), цитохромоксидазы IV (СОХ IV) и цитохрома с были использованы соответствующие стандартные коммерческие антитела, а для идентификации CNP использовали высокоочищенные моноклональные антитела (Mab-46), любезно предоставленые проф. Г. Райзером (Институт Нейробиохимии (Магдебург, Германия). Иммунореактивность детектировали при помощи вторичных антител, связанных с пероксидазой хрена. Пероксидазную активность определяли с помощью хемилюминесцентного реагента ECL (Pierce Chemical Со), в соответствии с инструкцией изготовителя.

Blue Native Electrophoresis (BNE) Нативные митохондриальные дыхательные комплекы (I-IV) и F0F1-ATP синтетазный Комплекс (V) разделяли методом, разработанным Шэггером и Яго (Schagger and Jagow, 1991).

Изменение параметров РТР в митохондриях оценивали по изменению потоков кальция, регистрируемых с помощью Са2+-селективного электрода.

Изменения митохондриального потенциала оценивали по перераспределению ТРР+ при нагрузке митохондрий кальцием с использованием ТРР+-чувствительного электрода (Kamo et al., 1989). Митохондрии (1 мг белка/мл среды) инкубировали при комнатной температуре в изотонической среде, содержащей 10 мМ Tris-HCL (рН 7.4), 125 мМ КС1, 0.4 мМ КН2Р04, 5 мМ сукцинат калия и 2 цг/мл ротенон.

Набухание митохондрий регистрировали по снижению светопоглощения в суспензии митохондрий при 540 нм с использованием спектрофотометра Specord М40 (США).

Активность CNP определяли по методике Брэдбери и Томпсона (Bradbury & Thompson, 1984) - с помощью цветной реакции используя тетразолиум Нитро Блю [3.3'(3,3'-диметокси-4.4'-дифенилен)2,2'-ди-/>нитрофенил-5,5'-дифенилдитетразолиум] с добавлением феназин метосульфата для выявления NADPH в ферментативной реакции с CNP

Для статистического анализа брали среднее значение параметров из 5 экспериментов ±SD. Статистическую достоверность считали с использованием I-теста Стьюдента. На рисунках показаны результаты типичных экспериментов, на диаграммах представлены средние данные не менее, чем из 5-ти экспериментов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Глава 1. Выделение, очистка и идентификация 46 кДа фосфобелка в митохондриях.

В результате многолетних исследований, проводимых в нашей лаборатории, был выявлен спектр митохондриальных белков, подверженных фосфорилированию в присутствии пороговых концентраций кальция, осуществляемого эндогенными протенкиназами митохондрий. Была также установлена корреляция степени фосфорилирования/дефосфорилирования этих белков в митохондриях с индукцией открытия РТР и инициацией апоптоза (Азарашвили и др 2000, 2003, 2007). Среди обнаруженных белков, фосфобелок с молекулярной массой 46 кДа представлял наибольший интерес, поскольку уровень его фосфорилирования оказался Са2+- и циклоспорин A (CsA) -зависимым. В связи с этим мы рассматривали 46 кДа белок как пороспецифичный. На основании этих результатов было сделано предположение, что механизм фосфорилирования/дефосфорилирования мембранных белков в митохондриях включается в регуляцию функционирования поры, поэтому было логичным попытаться идентифицировать 46 кДа фосфобелок. Данное предположение нашло подтверждение в фактах, описанных в литературе, согласно которым активность многих белков, вовлекаемых в функционирование/регуляцию поры, таких как VDAC, TSPO, ANT, Bid, Bad, Вах, Bcl-2, а также каспаз модулируется посредством

фосфорилирования/дефосфорилирования, осуществляемого различными протеинкиназами (Вега, 1995; Lui and Papandopoulos, 2003; Bradford, 1986).

На Рисунке 1 А приведен спектр митохондриальных фосфобелков в контрольных условиях и в условиях открытой поры. Работа была выполнена на несинаптических митохондриях, т.к. именно этот пул митохондрий обычно используют в исследованиях митохондрий мозга. Очищенные несинаптические митохондрии мозга крыс, использованные нами в дальнейшей работе, не содержат посторонних загрязнений, что было доказано методом иммуноблота с

использованием соответствующих антител к белкам - маркерам а также методом электронной микроскопии, проведенной совместно с Мошковым Д. А. (показано в работе).

Как следует из рисунка, в присутствии пороговых концентраций Са2+, индуцирующих РТР (открытие поры, столбик 2), происходит повышение уровня фосфорилирования 46 кД по сравнению с контрольными условиями (столбик 1). Для идентификации 46 кДа белка необходимо было получить препарат в чистом виде.

кДа

21 17

3.5

*»

кДа 5037252015-

Окрашивание на белок (серебром)

Авторадиограмма Анти CNP

Рисунок 1. Идентификация 46 кДа белка. А - Спектр митохондриальнх фосфобелков в контрольных условиях (1) и в условиях открытой поры (2). Б-Диагональный 2D электрофорез 1- детекция белка, 2- включение [у-32Р]АТР, 3-Western blot части препарата, взятого из Б1 и идентифицированного с использованием антител, выработанных к CNP.

Очистку белка проводили следующим образом: фосфорилированные митохондрии разделяли методом электрофореза в присутствии SDS в системе Лэммли и после получения авторадиограммы вырезали белковую зону 46 кДа, строго соответствующую меченому белку. После этого вырезанный меченый 46 кДа фосфобелок разделяли методом диагонального двумерного электрофореза. На Рисунке 1 Б показана электрофореграмма, полученная после проведения электрофореза во втором измерении. Гель был окрашен на белок (серебром, Б1) и экспонирован для визуализации меченного материала (получения авторадиограммы). После экспонирования геля на пленке Кодак (Б2), было выявлено несколько близких по расположению пятен. Мы проводили идентификацию очерченной полосы с наиболее сильным сигналом радиоактивного фосфора. Половина пятна из геля (Б 1) была вырезана для идентификации методом масс-спектрометрии, которую проводили совместно с сотрудниками Магдебургского Университета, а оставшуюся часть использовали для проведения Western blot анализа (БЗ). Для этого проводили еще раз электрофорез в 15% SDS-ПААГ геле с последующим иммуноблотом. После переноса белка на мембрану, ее обрабатывали специфическими антителами к CNP при разведении 1:10000.

Результаты масс-спектрометрии и иммунноблота показали, что 46 кДа - это фосфорилированная форма 2\3'-циклонуклеотид фосфодиэстеразы (CNP, ЕС 3.1.4.37). CNP -это белок, осуществляющий гидролиз циклических нуклеотидов до соответствующих монофосфатов. CNP гидролизует все четыре 2',3'-циклических субстрата - A, G, С, U. При исследовании кинетических свойств было показано, что 2',3'-сАМР является наиболее предпочтительным субстратом для CNP, а продуктом этой реакции является 2'-АМР (Whitefeld, 1955).

Согласно литературным данным, CNP является одним из основных миелиновых белков, локализованных в основном в олигодендроцитах и его содержание в центральной нервной системе составляет 2-5 %. Вне ЦНС CNP обнаружена в гораздо меньших количествах. В митохондриях CNP-азная активность была обнаружена в изолированных митохондриях печени (Dreiling, 1981), но не была идентифицирована там. Впервые ассоциация CNP с митохондриями показана на клетках надпочечников (McFerran, 1997). Позднее появилось еще несколько работ, показывающих способность CNP к ассоциации с митохондриями (Lee, 2006, Wu, 2006).

Обнаружив CNP в митохондриях мозга, необходимо было выяснить, присутствует ли эта фосфодиэстераза в митохондриях, изолированных из других тканей. Для решения этой задачи мы выделяли митохондрии из поджелудочной железы, печени, сердца крыс, а также из клеток глиома С6 и культивированных олигодендроцитов. Присутствие CNP определяли методом иммуноблоттинга с использованием антител, выработанных к CNP. (Рисунок 2 А). Было найдено, что CNP существует во всех тестируемых изолированных митохондриях. Кроме этого,

CNP—> антитела

¿f А ^

CNP

VDAC

SOD2

м иго пласты

Внешняя мембрана

Рисунок 2. Определение локализации СЫР в митохондриях. А - СЫР в митохондриях, изолированных из различных тканей. Б - определение субмитохондриальной локализации С1ЧР/

СИР детектировали в митохондриях, изолированных из клеток Ы2а (не показано).

Следующей стадией настоящей работы, было выяснение локализации СЫР внутри митохондрий. До настоящего времени существовала единственная работа

(Dreiling, 1981), в которой было показано, что CNP-азная активность в изолированных митохондриях печени сосредоточена только в мембранных фракциях (во внешней и внутренней). Распределение CNP внутри митохондрий было показано на полученных суб-митохондриальных фракциях. Для этого из митохондрий мозга были получены митопласты, содержащие внутреннюю мембрану с заключенным в ней матриксом; и внешнюю мембрану (Rice and Lindsay, 1997). В полученных субфракциях CNP была детектирована методом Western blot с помощью антител, выработанных к CNP.

Для подтверждения чистоты полученных фракций, их тестировали методом Western blot с помощью антител, выработанных к белкам, характерным для каждой фракции. Соответствующим маркером на митопласты использовали антитела к SOD2, а в качестве маркера на внешнюю мембрану - антитела к VDAC. На Рисунке 2 видно, что в мембранной фракции практически отсутствует SOD2, что свидетельствует о чистоте полученных препаратов. Наличие же небольшого количество VDAC в митопластах можно объяснить присутствием контактных сайтов. В результате эксперимента впервые было показано присутствие CNP как во внутренней, так и во внешней мембранах митохондрий мозга почти в равных количествах (Рисунок 2 Б).

Глава 2. Влияние субстратов CNP на функционирование Са2+-индуцируемой и CsA-чувствительной поры.

Локализация CNP в мембранных фракциях указывает на ее возможное участие в регуляции проницаемости митохондриальных мембран и, в частности, в функционировании РТР. Так как никогда ранее не было исследовано влияние 2',3'-сАМР и других 2',3'-циклонуклеотидов на функции митохондрий, мы исследовали влияние субстратов CNP на параметры индукции поры в митохондриях мозга.

В частности, мы исследовали влияние 2',3'-сАМР, 2',3'-cNADP и 2',3'-cGMP на Са2+-индуцированные и CsA-чувствительные изменения мембранного потенциала, Са2+-индуцируемого выхода Са2+ из митохондрий и сопряженное с этим набухание митохондрий. Изменения мембранного потенциала, индуцируемые циклонуклеотидами, оценивали по изменению распределения ТРР+ в митохондриях, которое регистрировали с помощью ТРР+-селективного электрода. Изменение потоков ионов кальция, вызванное присутствием циклонуклеотидов, - с помощью Са2+-селективного электрода. Оба параметра регистрировали одновременно.

На Рисунке 3 показана стимуляция Са2+-индуцируемого открытия РТР разными субстратами CNP, т.е. 2',3'-сАМР, 2',3'-cGMP, а также 2',3'-cNADP. Из рисунка видно, что все исследованные субстраты CNP способны индуцировать открытие РТР с разной эффективностью. В экспериментах была подобрана пороговая концентрация Са2+, которая индуцировала открытие поры, и добавки кальция делали таким образом, чтобы после второй добавки инициировалось открытие поры. На Рисунке 3 А видно, что первая добавка Са2+ приводит к поглощению его митохондриями, а после второй добавки Са2+ аккумулируется в митохондриях и удерживается в матриксе, но после некоторого периода (лаг-фазы), он начинает высвобождаться из митохондрий, это сопровождается и выходом ТРР+, что отражает падение мембранного потенциала. На панели 3 Б показано влияние 2',3'-сАМР на Са2+-стимулируемое открытие РТР. Видно, что время удержания

кальция перед открытием РТР (лаг-фаза) уменьшается, а скорость выхода увеличивается. Таким же свойством стимулировать открытие поры обладает и 2',3'-сЫАОР (3 В), а 2',3'-сОМР (3 Г) не влияет на открытие РТР.

400

S i

100

400 300

100

2'3icAMl' cV

0.6

t I

_ I I V 0.411 I a. I H

0.2

Ca ---ITWijiM.

I [ IcV'i.i'M

1 "—'

400

300 400 500 600 700

Время, с

2'3'-cNADP (V

100

0.6

Сч0.4

0.0

- [TI'f*|.nM 1.ЦМ

Г bz.....|C"!;

1 * ! ¡If

400 300

+~200 rt

я О

100

300 400 500 600 700 800

Время, с 2'3'-cGMP

, с."

Ъ.0.4

с-

0.0.

-- ril'P'ljiM - [C.'*l,|iM

300 400 500 600

Время, с

700 800

300 400 500 600 700 800 Время, с

Рисунок 3. Влияние субстратов CNP на индукцию открытия РТР в митохондриях мозга крыс. Концентрация Са2+ 400 цМ, концентрация нуклеотидов -5цМ.

А - открытие РТР, индуцируемое Са2*. Схематически показаны параметры транспорта Са2+.

Б - влияние 5 мкМ 2',3'-сАМР на индуцируемое Са2+открытие РТР. В - влияние 5 мкМ 2',3'-cNADP на индуцируемое Са2+открытие РТР. Г - влияние 5 мкМ 2',3'cGMP на индуцируемое Са2+открытие РТР.

Как следует из полученных данных, наиболее эффективным субстратом CNP в митохондриях мозга оказался 2',3'-сАМР. Количественные изменения показаны на диаграмме, представленной на Рисунке 4 А, из которой следует, что лаг-фаза в присутствии 2',3'-сАМР сокращается на 50%, а скорость выхода кальция увеличивается на 40-50%. В присутствии 2',3'-cNADP лаг-фаза уменьшалась приблизительно на 35%, а скорость выхода кальция увеличивалась приблизительно на ту же величину. В случае же с 2',3'-cGMP изменения этих параметров не превышало нескольких процентов.

Далее мы проверили влияние различных концентраций 2',3'-сАМР на активацию открытия РТР (Рисунок 4, панель Б). Как видно из Рисунка, значимые изменения в стимуляции открытия поры, наблюдаемые в присутствии 2',3'-сАМР происходят, начиная с 0,5 |1М до 5 цМ и удерживается на одном уровне до 10 цМ. При этом лаг-фаза уменьшается, а скорость выхода Са2+ из митохондрий увеличивается максимально, в 2 раза. Дальнейшее увеличение концентрации циклонуклеотида с 10 цМ до 50 цМ ведет к уменьшению наблюдаемого эффекта.

'£ 3 & я

2 г

Лаг-фаза ■ Скорость выхода Са^ 150

>К 3 » Я

о- я 5 у

"200

V л.

Я150

Л л & ^

& £100 % к £¡50

С ё о

I Лаг-фаза

5 Скорость выходаСа2+

* Г* ■

2',3'-сАМР, К °'1 °'5 2'5 5 10 20 50 цМ

Рисунок 4. Влияние субстратов С№ на индукцию открытия РТР в митохондриях мозга крыс. А - Концентрационный эффект 2',3'-сАМР. Б - Влияние 5 цМ 2',3'-сЫАОР, 2',3'-сАМР, п=5.

Чтобы подтвердить причастность 2',3'-сАМР- 2',3'-сЫАОР-активируемой поры в присутствии пороговой концентрации кальция к феномену РТР, мы исследовали влияние специфического ингибитора поры, СбА, на стимулирующий эффект циклонуклеотидов. На Рисунке 5 показано, что в присутствии СбА после добавки пороговой концентрации Са2+ (вторая добавка) не происходит ни выброса Са2+ их митохондрий, ни падения мембранного потенциала, как в контрольном случае (сравнить панели Б и А), на панели В можно увидеть аналогичное действие СвА в присутствии 2\3'-сАМР. Таким образом, ингибитор РТР, СбА предотвращает стимуляцию выхода кальция в присутствии 2',3'-сАМР , что указывает на причастность этого эффекта к РТР.

Также мы исследовали действие субстратов СЫР на параметры, характеризующие индукцию открытия поры в митохондриях, изолированных из печени и сердца крыс (показано в диссертации). Было установлено, что оба субстрата исследуемого фермента стимулируют открытие поры в митохондриях

печени и сердца, понижают лаг-фазу и увеличивают скорость выхода Са2+ из митохондрий. Следует отметить также, что в митохондриях сердца 2',3'-сАМР и 2',3'-сЫАОР обладают примерно одинаковым стимулирующим эффектом, а в митохондриях печени сильнее действует 2',3'-сЫАОР.

Контроль

400 0.8 С-л2+

300 0.6 1

S S п

А А 1 1

+—200 ■ЪГо.4

я ft. • 1!

у_ '! 1 , ], 1 "

100 0.2 ___

\ Ч "м

о п п

300 400

|ТРГ*|.,,М| |Са2<|. |iM

Время, с CsA +2',3'-сАМР

CsA

'ft. 0.4 о.

0.2

Си

---[ПТ';,цМ

1С«"!. |.м

300 400 500 600 700 800 Время, с

а. 0.4 с* Н

0.2

ОД

---[ТРРЧцМ

ы'а

300 400 500 600 700 800

Время, с

Рисунок 5. Ингибирование CsA (1|jM) открытия РТР в митохондриях мозга. А - открытие РТР под действием Са2+(200 рМ). Б - в присутствии CsA. В - в присутствии CsA и 5цМ 2':3'-сАМР.

Известно, что одним из параметров функционирования РТР является Са"+ индуцированное высокоамплитудное набухание митохондрий, поэтому следующим доказательством, подтверждающим модулирующее действие циклонуклеотидов и СЫР на функционирование РТР является исследование их влияния на набухание митохондрий мозга и печени крыс. На Рисунке 6 показано влияние субстратов СЫР, а также специфических антител, выработанных к СЫР, на набухание митохондрий мозга и печени крыс.

Для количественного определения изменения в набухании мы использовали полупериод набухания. Расчет полупериода набухания проводили как показано на панели А.

—control

............. Са2*

- 2\3'-cA.WiCiT2*

--------- 2',3'-cNADP+Ca2+

---— CNP аититела

--------2'„V-cAMP+CNP янтитела+Ci?*

2\3'-cNADP+CNP антител a+Ci+

0.60

I 0.5: <§

J 0.50|

о 0.45

0.40 0.3:

'"■"v.*.

.-¡Ill 400 600 800 Время,с

Митохондрии мозга крысы

Оо.б

0.4 0.2

v-S^....--

200 40(1 600 800 1000

Время, с Митохондрии печени крысы

+ + + + + пороговая [Са2+|

+ + 2',3'-сАМР

+ + 2'3'-cNADP

+ + + CNP антитела

Рисунок 6. Влияние 2',3'-сАМР, 2',3'-cNADP и антител к CNP на набухание митохондрий мозга и печени крыс в присутствии пороговых [Са2+]. А - набухание митохондрий печени и мозга (слева) Б - полупериод набухания. Пороговые [Са2+] для митохондрий мозга 400 цМ и 200 ^iM для митохондрий печени, концентрация нуклеотидов - 5(j.M, п=5

В результате проведенных экспериментов была обнаружена способность циклонуклеотидов ускорять открытие РТР в митохондриях выделенных из обоих видов тканей, что позволило рассматривать 2',3'-сАМР и 2',3'-cNADP как индукторы неспецифической поры. Стоит отметить также, что митохондрии мозга и печени обладают разной амплитудой набухания (порядка 0.3 и 0.6-0.8 оптических единиц соответственно), что находится в соответствии с литературными данными. Относительно небольшую разницу в инициации набухания митохондрий мозга по сравнению с митохондриями печени можно объяснить высокой скоростью и низкой амплитудой набухания митохондрий мозга. Так, время набухания митохондрий мозга снижается от 400-410 секунд при инициации только Са2+ до 200-230 секунд в присутствии субстратов CNP в среде инкубации. В митохондриях печени время

снижается от 700 секунд для контрольного эксперимента до 180-200 секунд при инициации набухания нуклеотидами. Тканевой специфичности в стимуляции набухания циклонуклеотидами не обнаружено, то есть, действие 2',3'-cNADP и 2',3'сАМР на набухание митохондрий печени крыс аналогично их воздействию на митохондрии мозга.

Таким образом, было показано, что субстраты CNP способны модулировать функционирование РТР, влияя на скорости выхода Са2+, падение мембранного потенциала и стимулируя набухание митохондрий, изолированных из разных тканей. Так как мы предполагаем, что эти эффекты опосредованы через CNP, мы исследовали также влияние специфических антител, выработанных к CNP, взятых в низкой концентрации 1/10000 (1,8 мг/мл) на 2',3'-cNADP и 2',3'сАМР- зависимое стимулирование набухания. Было обнаружено, что антитела обладают ингибирующим действием на эффект 2',3'-cNADP и 2',3'сАМР. Время полупериода набухания повышается практически до уровня контроля и в митохондриях мозга и в митохондриях печени. Однако, наблюдается неполное подавление набухания, что отражает эффект антител только на пул CNP, локализованный во внешней мембране митохондрий. Чтобы проверить специфичность CNP антител и исключить неспецифический эффект белка мы использовали БСА (бычий сывороточный альбумин V фракция) той же концентрации, что и CNP антитела. В результате было установлено, что БСА не влиял на набухание митохондрий, что говорит о специфичном действии CNP антител, используемых в эксперименте. Все вышеописанные эффекты блокируются в присутствии CsA (не показано), что подтверждает причастность наблюдаемых эффектов к функционированию митохондриальной РТР. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что функционирование РТР может модулироваться 2',3'-циклонуклеотидами, и эта регуляция может осуществляется посредством гидролазной активности фосфодиэстеразы.

Глава 3. Определение активности CNP.

Определив локализацию CNP в митохондриях и влияние ее субстратов на параметры РТР, было целесообразно выяснить изменяется ли фосфоэстеразная активность CNP в контрольных и в нагруженных кальцием митохондриях. Ферментативную активность CNP в митохондриях определяли стандартной методикой, описанной Брэдбери и Томпсоном (Bradbury & Thompson, 1984), с использованием Western blot анализа. Метод основан на появлении окрашенной полосы на мембране в результате протекания реакции ферментативного гидролиза 2',3'-cNADP фосфодиэстеразой, которая сопровождается закислением среды, детектируемое с помощью краски тетразолиевый нитроголубой [3.3'(3,3'-диметокси-4.4'-дифенилен)2,2'-ди-р-нитрофенил-5,5'-дифенилдитетразолий].

Количественное изменение активности определяли по изменению оптической плотности окрашенных полос. После определения ферментативной активности те же самые мембраны подвергали обработке специфическими антителами к CNP для сравнения уровня белка в образцах.

Результаты проведенных экспериментов представлены на Рисунке 7, из которого следует, что активность CNP в условиях открытия РТР уменьшается (Панель А). На нижней части панели А представлена количественная

характеристика данного изменения, демонстрирующая снижение относительного уровня активности более чем на 50% в присутствии пороговых концентраций Са2+.

На панели Б показан уровень содержания белка в этих же препаратах митохондрий в контрольных условиях и условиях открытия поры. Видно, что уровень содержания белка в тех же условиях не изменяется. Таким образом, в условиях функционирования РТР, индуцированного 2',3'-сАМР, способность CNP гидролизовать циклонуклеотиды уменьшается, это может приводить к активации фукционирования поры, а при достижении высоких концентраций циклонуклеотидов и к ингибированию РТР. До сих пор одним из важных вопросов представлял собой вопрос о существовании природных субстратов CNP, т.к. ее ферментативная активность была обнаружена in vitro. В митохондриях основным источником субстратов для CNP может быть деградация РНК (в частности, в ответ на оксидативный стресс). Большинство мРНК в клетке содержит поли-А-хвост из 150 повторов аденинов, служащих источником олигонуклеотидов, содержащих 2',3'-сАМР, которые могут быть субстратами для CNP.

Са1+ - + Са2+ - +

Рисунок 7. Определение активности CNP в митохондриях крыс в контрольных условиях и в присутствии пороговых [Са2+], т.е. в условиях РТР. Для данного эксперимента такая концентрация Са2+ составляла 400 (дМ, а число экспериментов п=5.

Глава 4. Исследование влияния снижения экспрессии CNP в клетках олигодендроцитов на активностьи и пороговую концентрацию Са2+.

Для дополнительного доказательства причастности CNP к функционированию неселективной поры были выполнены эксперименты на

митохондриях, изолированных из трансфецированных олигодендроцитов, со сниженной экспрессией CNP.

CNP -SOD2-

Активность_ CNP

в S4 » §100 Ь О.

я в о

в *

2 fS о

J чО

н О.

и Z о О

В О

40-

«а л s в a s

§ х

О ¡5 ню

х 3 g a

В aj

■ Контроль Ш неспецифич. siRNA I I CNP siRNA

: -о

-< ^

а ч

Н 3 40

« н В В «| 20 я В С ё о

Лаг-фаза Скорость выхода Са2+

Рисунок 8. Исследование параметров митохондрий, изолированных из олигодендроцитов с пониженным содержанием СЫР. А - иммуноблот с использованием антител, выработанных к СЫР. Б - определение активности СЫР. В - параметры открытия митохондриальной поры.

Мы исследовали содержание СЫР а также его ферментативную активность в митохондриях, выделенных из клеток олигодендроцитов. Также мы проанализировали данные параметры в митохондриях, выделенных из клеток с пониженной экспрессией CNP (knockdown). Для этого клетки олигодендроцитов были трансфецированны с помощью пула химически синтезированного siRNA специфических к CNP. В качестве контроля были использованы 1) клетки дикого типа (wild type), а также 2) клетки, трансфецированные неспецифическим

(scrambled) siRNA. Как видно из рисунка (Панель А и Б), снижение экспрессии CNP приводит к уменьшению синтеза CNP и снижению ее содержания как в олигодендроцитах (не показано), так и в митохондриях, изолированных из трансфецированных олигодендроцитов. Снижение уровня CNP в knockdown клетках коррелирует также с уменьшением активности фермента в этих клетках и в митохондриях, в то время как в контрольных клетках и митохондриях, изолированных из них, эти параметры не изменяются. В дополнение к этому, мы изучили влияние уменьшения экспрессии CNP на параметры открытия РТР в митохондриях. На панели В можно увидеть, что в knockdown клетках лаг-фаза (время удержания кальция в матриксе) уменьшается, а скорость выхода кальция увеличивается по сравнению с митохондриями, выделенными из клеток дикого типа. Полученные результаты позволяют предположить, что уровень и активность CNP влияют на функционирование митохондриальной неспецифической поры.

Глава 5. Ассоциация CNP с Функциональными Комплексами митохондрий (I-V).

Так как одним из мест локализации CNP являются внутренние мембраны митохондрий, в которых располагается вся дыхательная цепь и АТР синтетазный Комплекс митохондрий, следующей нашей задачей было проверить возможную ассоциацию фосфодиэстеразы с этими важнейшими Комплексами. Основанием для проведения таких экспериментов послужили следующие предпосылки: а) данные Papa и др. (1995) о взаимодействии 43 кДа с дыхательными Комплексами, б) синтез многих субъединиц цитохромоксидаз происходит в митохондриях и митохондриальные РНК могут быть субстратами для CNP. Таким образом, CNP может вмешиваться в синтез белка этих субъединиц.

А Б

1 V III IV И

V III IV II

кДа

669— CJ ш I V

440—» ES I III

232 — GEE 1 IV

140 , I 1II

66 —

3 2,0

Я Я я

s 1 5

Я 1,0

■о

Я 0,5 и о Я

О О

„у

Са* - +

Рисунок 9. Ассоциация СЫР с Комплексами дыхательной цепи митохондрий мозга крысы, концентрация Са2+ 400 рМ, п=5.

2 2,0

1.5

1,0

т £ 0,5

Са

2\3'-cNADP

2',3-сАМР

CsA

- 2 2,0

1« я

С 2

= Щ

Г ^

5 «

е> &

* ¡1,0

я -а

v 5

г Ё0,5

Са 4

2',3'cNADP 2',3-сАМР CsA

+ + + +

• 3 2,0 £ I

I §1,5

в 1,0

Ё0,5

t- 2

Са

+ + + +

2',3'-cNADP +

2',3-сАМР

CsA

2,0

1,5

Г 3

I | 0,51

Са + + + +

2',3'cNADP + 2',3-сАМР +

Ыа +

"1,5

а ч 1,0

В 2 0.5

1_1

Са + + + +

2',3'-cNADP + 2',3-сАМР + CsA +

Рисунок 10. Изменение ассоциации СЫР с Комплексами дыхательной цепи митохондрий в присутствии субстратов СЫР и СбА. Римскими цифрами (I - V) обозначены функциональные митохондриальные Комплексы. Концентрация 2',3'-сАМР, 2',3'-сЫАОР 5[М, Са2+ 400 цМ, СбА 1 цМ, п=5.

Ассоциацию CNP с функциональными Комплексами митохондрий (I-V) исследовали методом Blue Native электрофореза, позволяющем разделить белки митохондрий на высокомолекулярные нативные функциональные Комплексы (1-V) с молекулярной массой (600 кДа-140 кДа). После проведения такого электрофореза, каждый Комплекс вырезали и проводили одномерный электрофорез в системе Лэммли, с последующим переносом белков на мембрану. В результате обработки мембран антителами, выработанными к CNP, была установлена ассоциация CNP со всеми Комплексами митохондрий мозга крысы (Рисунок 9). Подобные результаты были получены и при исследовании митохондрий печени и сердца крысы (показано в диссертации), а именно, с Комплексами дыхательной цепи (I-IV) и АТР-синтетазным Комплексом V. Из результатов следует, что CNP ассоциирует предпочтительнее с Комплексами I, III и V, чем с Комплексами II и IV как в контрольных условиях, так и в присутствии пороговой концентрации кальция. Однако, в условиях открытой поры было обнаружено уменьшение ассоциации

митохондриальных Комплексов с CNP , в частности, было установлено значительное снижение ассоциации CNP с Комплексами I, III и V по сравнению с контрольными условиями, что указывало на причастность обнаруженного явления к функционированию РТР, поскольку Комплексы I и III являются в митохондриях источниками образования активных форм кислорода, которые также инициируют открытие неселективной поры.

Для подтверждения нашего предположения о причастности феномена ассоциации/диссоциации CNP к функционированию РТР, мы исследовали влияние субстратов CNP и CsA, ингибитора РТР, на ассоциацию исследуемого фермента с дыхательными Комплексами. Для выполнения поставленной задачи были выбраны 2',3'-cNADP и 2',3'сАМР, как индукторы РТР и CsA, ингибитор поры. Наши результаты показывают, что ассоциация CNP со всеми Комплексами уменьшается в присутствии ее субстратов. Присутствие CsA увеличивает степень ассоциации CNP почти до контрольного уровня. Ассоциация фермента с Комплексами I и III возрастает. Суммируя эти результаты, можно заключить, что ассоциация/диссоциация CNP с функциональными Комплексами зависит от концентрации кальция и от CsA, т.е. может быть связана с феноменом РТР.

Эти результаты представляют значительный интерес с точки зрения вовлечения Комплексов I, III в функционирование РТР и подтверждают результаты, обсуждаемые в литературе (Fontaine and Bernardi 1999, Marcil, 2006). Ассоциация CNP с Функциональными Комплексами показывает возможное вовлечение ее не только в регуляцию РТР, но и в регуляцию энергопреобразования в митохондриях, т.е. в функционирование АТР синтетазы. Возможно, это происходит посредством регуляции уровня 2',3'-сАМР в митохондриях в результате протекания реакции гидролиза, а 2',3'-сАМР, возможно, следует рассматривать как новый вторичный мессенджер.

Глава 6. Выход CNP из митохондрий.

Как упоминалось ранее, одной из характеристик функционирования РТР является выход из митохондрий апоптогенных факторов, таких как цитохром с (Cyt с), апоптоз-индуцирующего фактора (AIF) и эндонуклеазы G (endo G). Поскольку CNP является РНК связывающим белком, мы предположили, что в митохондриях CNP может связываться с РНК и в таком состоянии подвергаться активности endo G, вследствие чего могут накапливаться доступные для гидролиза 2',3'-сАМР остатки, стимулирующие функционирование РТР. Мы предположили также, что при этом CNP может высвобождаться из митохондрий. Это соответствовало бы уменьшением ассоциации CNP с Комплексами. Поэтому следующей задачей было исследовать влияние субстратов CNP на выход CNP и Cyt с из митохондрий мозга крысы.

На Рисунке 11 представлены данные по выходу CNP и Cyt с из митохондрий мозга. Для проведения этого эксперимента после индукции открытия РТР, суспензию митохондрий отбирали из ячейки, центрифугировали и получали супернатант, в котором после электрофоретического разделения белков и их переноса на мембрану определяли содержание Cyt с и CNP. Эти же образцы обрабатывали антителами к СОХ IV (цитохромоксидазе) - митохондриальному

маркеру для подтверждения чистоты супернатанта и отсутствия примеси мембран митохондрий.

Как видно на Рисунке 11 (Панель А) в контрольных условиях, в отсутствие добавленного кальция было обнаружено незначительное высвобождение Cyt с из митохондрий мозга крысы, в то время как значительное количество CNP выходит из митохондрий в этих условиях. Однако, в присутствии пороговой концентрации Са2+ выход CNP значительно увеличивался параллельно с увеличением выхода Cyt с. Добавление 2',3'сАМР и 2',3'-cNADP, ускоряющих открытие РТР, вызывало увеличение выхода CNP. Наличие СОХ IV в супернатанте в этих условиях не обнаружено. Из диаграммы (панель Б) видно, что выход CNP, стимулируемый 2',3'-cNADP увеличивался в 2 раза, а 2',3'сАМР в 2.5 раза. В этих же условиях выход Cyt с не изменяется. Увеличение выхода CNP коррелирует и с уменьшением ее | ассоциации с Комплексами электронно-транспортной цепи. Таким образом, полученные данные указывают на существование механизма выхода CNP из ! митохондрий при инициации открытия РТР, коррелирующего с выходом I проапоптических белков, в частности, цитохрома с. Циклонуклеотиды не влияют на выход Cyt с из митохондрий, что позволяет нам говорить о причастности CNP к каспаз-независимому пути апоптоза.

ЯВИ iH&te ^Ийа "itiir 11 in

щящр ^вР

CNP

Рисунок 11. Выход СКР из митохондрий в присутствии субстратов СЫР в условиях открытия РТР. Концентрация 2',3'-сАМР, 2\3'-сЫАЭР 5цМ, Са2+ 400 цМ, п=5

Таким образом, суммируя полученные результаты, можно констатировать, что митохондрии содержат СЫР, и она может находиться в фосфорилированной форме, причем уровень ее фосфорилирования увеличивается при открытии РТР. СЫР локализуется в мембранах митохондрий и ее гидролазная активность снижается в присутствии пороговых концентраций кальция. Субстраты СЫР являются индукторами открытия РТР. Они стимулируют снижение мембранного потенциала, снижают пороговую концентрацию кальция, увеличивают скорость Са2+-индуцированного выхода кальция из Мх и стимулируют набухание митохондрий. СЫР способна к ассоциации с Функциональными Комплексами митохондрий, причем ассоциация регулируется кальцием, ее субстратами и СбА. Все эти данные могут служить основанием для того, чтобы считать СЫР регулятором/модулятором функционирования митохондрий (РТР и энергопродукции).

На основании полученных данных предлагается схема, демонстрирующая локализацию СЫР в митохондриях и возможную регуляцию функционирования митохондриальной неселективной СбА-

Су1с-цитохром с

АЫТ-адениннуклеотид - транслоказа

ЛТЭАС-потенциал -зависимый анионный канал

ТБРОбелок - транслокатор

1-У- комплексы дыхательной цепи

Сур1>-циклофилин Д

Р] -переносчик фосфата

Внутренняя

2',3'-сАМР 2'-АМР

Внешняя

Рисунок 12. Предположительная схема участия СЫР в функционировании Са2+-зависимой, СвА-чувствительной поры.

чувствительной поры в митохондриях (Рисунок 13). Как видно на схеме, СЫР локализована на мембранах митохондрий, где она может находиться во взаимодействии с порином внешней мембраны и с транслокатором адениновых нуклеотидов во внутренней мембране. Несмотря на то, что структурная роль этих

белков в формировании РТР подвергается сомнению, оба они являются основными модуляторами РТР и колокализация CNP с этими белками подтверждает ее вовлеченность в регуляцию поры. На схеме показано также, что субстраты CNP могут инициировать открытие митохондриапьной поры, что также подтверждает участие CNP в функционировании РТР, а также указывает на возможную регуляцию поры и начальных стадий апоптоза циклическими нуклеотидами.

Выход CNP из митохондрий также зависит от функционирования поры и коррелирует с выходом из митохондрий Cyt с, что предполагает участие исследуемого фермента в инициации апоптических путей.

Связь CNP с Комплексами внутренней митохондриапьной мембраны позволяет предположить ее участие не только в РТР, но и в регуляции энергопреобразования в митохондриях. Кроме того, уменьшение ассоциации с комплексами при открытии поры, коррелирует с выходом CNP из митохондрий а также с уменьшением ее ферментативной активности, что также является доказательством причастности CNP к регуляции РТР. Влияние 2',3'-сАМР на процесс ассоциации/диссоциации CNP с Функциональными Комплексами митохондрий указывает и на возможную регуляцию функций митохондрий (дыхание, синтез АТР и РТР) 2',3'-циклическими нуклеотидами. В частности, возможно, это происходит посредством регуляции уровня 2',3'-АМР в митохондриях, который вероятно является новым вторичным мессенджером.

ВЫВОДЫ

1. Фосфобелок 46 кДа в митохондриях мозга был идентифицирован как 2',3'-циклонуклеотид фосфодиэстераза.

2. Установлено, что CNP присутствует не только в мх мозга, но и в митохондриях, изолированных из сердца, печени, поджелудочной железы крыс, а также клеток линии глиома С6 и локализована в мембранных фракциях митохондрий.

3. Обнаружено, что циклические нуклеотиды (2',3'-сАМР и 2',3'-cNADP), являющиеся субстратами CNP, ускоряют открытие РТР, снижая пороговую концентрацию кальция, увеличивая скорость выхода Са2+ из митохондрий, а также стимулируя набухание. Выявлено, что фосфодиэстеразная активность CNP в митохондриях мозга крыс снижается в присутствии пороговых концентраций кальция, т.е. в условиях открытой поры.

4. Показано, что снижение экспрессии CNP в культуре олигодендроцитов приводит к уменьшению уровня CNP в митохондриях, изолированных из трансфецированных клеток, снижению фосфодиэстеразной активности в этих митохондриях, уменьшению пороговой концентрации кальция и ускорению открытия поры

5. Показано, что CNP может быть ассоциирована с Функциональными Комплексами митохондрий. Ассоциация/диссоциация CNP с Комплексами I, III и V может быть механизмом регуляции функций митохондрий и зависит от пороговой концентрации кальция, циклических нуклеотидов и CsA.

6. Показано, что выход CNP увеличивается при открытии РТР, а также в присутствии ее субстратов.

7. Исходя из полученных результатов, предложена схема участия CNP в функционировании митохондриальной неспецифической поры.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1. Azarashvili Т., Krestinina О., Galvita A., Grachev D., Baburina Y., Strieker R., Evtodienko Y., Reiser G. Ca2+-dependent permeability transition regulation in rat brain mitochondria by 2',3'-cycIic nucleotides and 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase. Am. J. Cell Physiol., 2009, 296, p. 1428-1439.

2. Galvita A, Grachev D, Azarashvili T, Baburina Y, Krestinina O, Strieker R, Reiser G The brain-specific protein, p42(IP4) (ADAP 1) is localized in mitochondria and involved in regulation of mitochondrial Ca2+. J. Neurochem., 2009,109(6), p. 1701-13.

3. О. В. Крестинина, А. Г. Круглое, Д. E. Грачев, Ю. Л. Бабурина, Ю. В. Евтодиенко, Д. А. Мошков, И. М. Сантапова, Т. С. Азарашвили. Возраст-зависимые изменения функций митохондрий при Са2+-индуцируемом открытии поры. Биологические Мембраны, 2010, т. 27, № 2, с. 1-7

4. Т. С. Азарашвили, И. В. Одинокова, О. В. Крестинина, Ю. Л. Бабурина, Д. Е. Грачев, В. В. Теплова, Э. Л. Холмухамедов Роль фосфорилирования пориновых белков в регуляции проницаемости внешней мембраны митохондрий в норме и при алкогольной интоксикации. Биологические Мембраны, 2011, т. 28, № 1, с. 14-24.

Тезисы докладов

1. A. Galvita, Т. Azarashvili, R. Strieker, L. Schild, О. Krestinina, D. Grachev, Y. Baburina, G. Reiser. Brain IP4 and PtdInsP3-binding protein, p42IP4, is involved in the regulation of Ca2+ transport in mitochondria. International conference "Neurodegenerative diseases: molecular mechanisms in a functional genomics framework", September 6-9, 2006, Berlin, p. 61.

2. Бабурина Ю.Л., Грачев Д.Е., Крестинина O.B., Райзер Г, Азарашвили Т.С. Идентификация 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиэстеразы (CNP) в митохондриях мозга. Международная Конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 5-7 июня 2007, Пущино, с. 210-212.

3. Грачев Д.Е., Крестинина О.В, Бабурина Ю.Л, Райзер Г., Азарашвили Т.С. Периферический бензодиазепиновый рецептор и коннексин-43 как возможные мишени карбеноксолона в митохондриях. Международная Конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 5-7 июня 2007, Пущино, с. 212-215.

4. Grachev D.E, Krestinina O.V., Baburina Yu.L., Evtodienko Yu.V., Papadopoulos V, Reiser G, Azarashvili T.S. Role of the Peripheral Benzodiazepine Receptor in initiation of apoptosis. Нейронаука для медицины и психологии. Третий Международный Междисциплинарный Конгресс, Судак, Крым, Украина, 12-20 июня 2007, с. 85-86.

5. Бабурина Ю.Л., Крестинина О.В., Грачев Д.Е., Азарашвили Т.С. Влияние субстратов 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиестеразы (CNP) на индукцию открытия РТР в митохондриях. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008, Новосибирск, с. 319.

6. Азарашвили Т.С., Бабурина Ю.Л., Грачев Д.Е., Крестинина О.В. ПБР как регулятор РТР в митохондриях. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008, Новосибирск, с. 328.

7. Galvita A., Baburina Y., Grachev D., Krestinina 0., Azarashvili Т., Stricker R., Reiser G. Novel subcellular localization of two brain specific proteins, p42IP4 (Centaurin-alphal) and CNP (2',3'-cyclic nucleotide 3-phosphodiesterase) in mitochondria. 5th International Symposium «Neuroprotection and Neurorepair Cerebral Ischemia and Stroke», 17-20 May, 2008, Magdeburg, Germany, p. 18.

8. Бабурина Ю.Л., Грачев Д.Е., Крестинина O.B., Евтодиенко Ю.В., Райзер Г., Азарашвили Т.С. Роль 2',3>-циклонуклеотид-3'-фосфодиестеразы в митохондриях мозга. IV международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», 10-20 июня 2008, Судак, Украина, с. 57-58.

9. Galvita A., Grachev D., Baburina Y., Krestinina О., Azarashvili Т., Strieker R., Reiser G. Mitochondrial localization and interaction of Centaurin-alphal (p421P4) and CNP (2',3'-cyclic nicleotide 3-phosphodiesterase) and their involvement in regulation of mitochondrial Ca2+ and control permeability transition. National conference «Molecular pathways in health and disease of the nervous system», September 11-13, 2008, Homburg/Saar, Germany, p. 14

10. Galvita A., Grachev D., Baburina Y., Krestinina O., Azarashvili Т., Strieker R., Reiser G. The neuron-specific protein, p42IP4 (Centaurin-alpha 1) is localized in mitochondria, interacts with 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase and is involved in regulation and control of mitochondrial Ca2+. The 12th STS Meeting «Signal Transduction - Receptors, Mediators and Genes», 29-31 October, 2008, Weimar, Germany, p. 107.

11. Грачев Д.Е., Крестинина O.B., Бабурина Ю.Л., Райзер Г., Азарашвили Т.С. PBR-модулируемое фосфорилирование белков в митохондриях астроцитов. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 2-4 июня 2009, Пущино, с. 575-581.

12. Крестинина О.В., Круглов А.Г., Грачев Д.Е., Бабурина Ю.Л., Мошков Д.А., Санталова И.М., Азарашвили Т.С. Возрастно-зависимые изменения функций митохондрий при Са2+-индуцируемом открытии поры. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 2-4 июня 2009, Пущино, с. 594-598.

13. Грачев Д.Е., Крестинина О.В., Одинокова И.В., Бабурина Ю.Л., Азарашвили Т.С. FiFo-АТРаза как возможная мишень для лигандов периферического бензодиазепинового рецептора. IV съезд Российского мозга. V международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», 3-13 июня 2009, Судак, Украина, с. 85-86.

14. Бабурина Ю.Л., Крестинина О.В., Грачев Д.Е., Галвита A.B., Райзер Г., Азарашвили Т.С. Участие 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиестеразы в регуляции митохондриального Са2+ и в изменении проницаемости внутренней мембраны митохондрий мозга. V международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», 3-13 июня 2009, Судак, Украина, с. 48-49.

15. Крестинина О.В., Бабурина Ю.Л., Грачев Д.Е., Азарашвили Т.С. Участие 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиестеразы в возраст-зависимых изменениях индукции митохондриальной неспецифической поры. V международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», 3-13 июня 2009, Судак, Украина, с. 131-132.

16. Бабурина Ю.Л., Крестинина О.В., Грачев Д.Е., Азарашвили Т.С. Роль 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиестеразы в регуляции митохондриальной

неспецифической поры. VI международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», 5-15 июня 2010, Судак, Украина, с. 6061.

17. Крестинина О.В., Бабурина Ю.Л., Грачев Д.Е., Галвита А.В., Райзер Г Азарашвили Т.С. Предполагаемая роль 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиестеразы в изменениях функционального состояния митохондрий мозга крыс при старении. VI международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», 5-15 июня 2010, Судак, Украина, с. 175-176.

Заказ № 188-1/02/2011 Подписано в печать 17.02.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

^"ч;. ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

)} www.cfr.ru; e-mail.info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бабурина, Юлия Леонидовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиэстераза.

1.1.1. Молекулярная структура и физико-химические свойства СИР.

1.1.2. Субстраты и факторы, влияющие на ферментативную активность СЫР.

1.1.3. Взаимодействие с белками и нуклеиновыми кислотами.

1.1.4. Пост-трансляционная модификация СИР.

1.1.5. Локализация С№ в олигодендроцитах.

1.1.6. Роль СЫР в патогенезе заболеваний нервной системы.

1.1.7. Локализация С№ вне нервной системы.

1.2. Структура и функции митохондрий.

1.3. Неспецифическая кальций-индуцируемая, циклоспорин А-чувствительная пора внутренней мембраны Мх (РТР).

1.4. Регуляция митохондриальных функций.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Химические препараты и биологические объекты, использовавшиеся в экспериментах.

2.2. Выделение митохондрий из мозга крыс.

2.3. Выделение митохондрий из клеток, а также печени и сердца крыс.

2.4. Выделение Мх из олигодендроцитов, а также культур клеток глиомы С6.

2.5. Определение белка по Лоури.

2.6. Фосфорилирование митохондриальных белков.

2.7. Измерение величины трансмембранного потенциала и транспорта Са" в митохондриях.

2.8. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.9. Метод очистки 46 кДа фосфобелка.

2Л L Метод Blue Native электрофореза в нативных условиях.

2.12. Определение набухания митохондрий мозга.

2.13. Определение выхода цитохрома с и CNP.

2.14. Определение активности CNP.

2.15. Электронная микроскопия изолированных митохондрий.

2.16. Трансфекция олигодендроцитов.

2.17. Статистический анализ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Выделение, очистка и идентификация 46 кДа фосфобелка в митохондриях.

3.2. Влияние субстратов CNP на функционирование Са -индуцируемой и CsA-чувствительной поры.

3.3. Определение активности CNP.

3.4. Исследование влияния снижения экспрессии CNP в клетках олигодендроцитов на активностьи и пороговую концентрацию Са2+.

3.5. Ассоциация CNP с Функциональными Комплексами митохондрий (IV).

3.6. Выход CNP из митохондрий.

3.7. Роль CNP в митохондриях при старении.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация, локализация и функции 2`,3`-циклонуклеотид-3`-фосфодиэстеразы (CNP) в митохондриях крыс"

Актуальность проблемы.

В настоящее время установлено, что митохондрии участвуют в клеточной гибели и играют ключевую роль в выживаемости клеток мозга. Обнаружено, что программируемая гибель нейронов и других клеток мозга происходит как при остром (ишемия, травма, инфекции ЦНС) ,так и при хроническом (Болезнь Альцгеймера, Паркинсона, старение) повреждении мозга. Последние сведения о молекулярных механизмах, лежащих в основе нейродегенеративных заболеваний, указывают на непосредственное вовлечение в эти процессы митохондриальных путей апоптоза.

Так как формирование неселективной поры в результате увеличения проницаемости внутренней мембраны (Permeability Transition Pore — РТР), считается начальной стадией апоптоза, то полагают, что функционирование неселективной поры может инициировать гибель нейрональных клеток. Структурное формирование митохондриальной поры индуцируется ионами кальция и происходит после накопления в матриксе митохондрий пороговых концентраций кальция, инициирующих падение мембранного потенциала, набухание митохондрий и выход про-апоптических белков. В результате этих событий запускается целый каскад реакций, вызывающих апоптоз. Аналогичные процессы могут происходить в митохондриях и в ответ на окислительный стресс. Поэтому инициация функционирования поры считается одной из ключевых стадий развития программируемой гибели клеток. Несмотря на многолетние исследования, к настоящему моменту не установлены ни точный состав поры, ни механизм регуляции ее функционирования.

С точки зрения механизма регуляции поры наиболее важным представляется возможное вовлечение в этот процесс реакции фосфорилирования/дефосфорилирования митохондриальных белков, поскольку этот вид посттрансляционной модификации является самым мощным механизмом регуляции многих функций в клетке.

Предыдущие исследования, проводимые в нашей лаборатории, выявили спектр митохондриальных фосфобелков с молекулярной массой в 65-67 кДа, 43-46 кДа и 3.5 кДа, изменение статуса фосфорилирования которых коррелировало с индукцией открытия РТР в митохондриях (Azarashvili, 1999, 2002, 2003). На основании этих результатов было сделано предположение, что механизм фосфорилирования/дефосфорилирования митохондриальных белков является одним из возможных путей регуляции функционирования поры. Данное предположение подтверждается тем фактом, что VDAC, TSPO и ANT фосфорилируются протеинкиназой /V и тирозиновой протеинкиназой, обнаружены также фосфорилированные формы регуляторных белков РТР таких, как Bcl-2, Bid, Bad, Вах семейства и каспаз, участвующие в апоптозе. Однако, ранее из спектра обнаруженных фосфобелков была идентифицирована только субъединица с F0F|-ATPa3bi, уровень фосфорилирования которой снижался в присутствии пороговых концентраций Ca2* (Азарашвили, 2002). Наибольший интерес представляло обнаруженное увеличение включения меченного фосфата в белки с молекулярной массой 46 кДа. Фосфорилирование этого белка зависело от кальция и изменялось в присутствия циклоспорина А, поэтому он рассматривался нами как пороспецифичный. В связи с этим, следует упомянуть работы С. Папа и др. (Papa, 2000), которые показали, что 43 кДа фосфобелок, обнаруженный в митохондриях сердца, изменяет уровень фосфорилирования в присутствии сАМР, а также взаимодействует с Функциональными Комплексами митохондрий. Кроме того, методом конфокальной микроскопии в клетках олигодендроцитов и других глиальных клетках была обнаружена ассоциация 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиэстеразы (CNP) с митохондриями. Было установлено, что CNP обладает аминокислотной последовательностью, направляющей ее к митохондриям для ассоциации с ними (Lee, 2002).

Цель и основные задачи исследования.

В связи с вышеизложенным была сформулирована цель настоящей работы - идентификация 46 кДа фосфобелка как 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиэстеразы (CNP), его локализация и функции в митохондриях крыс.

Согласно поставленной цели, были сформулированы задачи исследования:

3. Исследовать влияние субстратов CNP (2',3,-сАМР и 2',3'

О-*. cNADP) на параметры открытия РТР (Са~ -индуцированный выход Са~ , изменение мембранного потенциала и набухание) и установить корреляцию активности фосфодиэстеразы с функционированием РТР.

4. Исследовать влияние пониженной экспрессии СЫР на активность фосфодиэстеразы и параметры открытия РТР в митохондриях, изолированных из трансфецированных и нетрансфецированных клеток олигодендроцитов.

5. Изучить способность СЫР к ассоциации с Функциональными Комплексами (1-У) в митохондриях и выяснить влияние 2',3'-сАМР и 2',3'-сЫАБР на ассоциацию С1ЧР с Комплексами в контрольных условиях и в присутствии пороговых концентраций Са2+, инициирующих открытие РТР.

6. Выявить возможный выход СЫР из митохондрий мозга в присутствии пороговых концентраций кальция и в присутствии субстратов СЫР.

Научная новизна.

В рамках выполнения диссертации впервые был идентифицирован фосфобелок с молекулярной массой 46 кДа как 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиэстераза (СЫР, ЕС 3.1.4.37). Обнаружено, что СЫР присутствует в митохондриях, изолированных из мозга, печени, сердца крыс, а также клеток олигодендроцитов и глиомы Сб. В митохондриях она локализуется в мембранных фракциях. Впервые получены данные, показывающие, что субстраты СЫР (2',3'-сАМР и 2',3'-сЫАОР) в низких микромолярных концентрациях являются индукторами открытия РТР. Ферментативная активность СЫР в митохондриях мозга, нагруженных кальцием, уменьшается. Снижение экспрессии СИР в культуре клеток олигодендроцитов приводит к уменьшению активности фосфодиэстеазы в митохондриях, изолированных из трансфецированных клеток и снижению пороговых концентраций кальция в них. Установлено, что во внутренней мембране митохондрий СЫР может ассоциироваться с функциональными Комплексами митохондрий (1-У), и это взаимодействие регулируется 2',3'-сАМР и 2',3'-сЫАОР. Впервые проведено сравнительное исследование содержания и активности СЫР в митохондриях, изолированных из животных разного возраста.

Научно-практическая ценность.

Выявление новых фосфорилированных белков митохондрий мозга и корреляции между уровнем их фосфорилирования и индукцией • неселективной митохондриальной поры указывает на существование нового механизма регуляции РТР. Обнаруженная стимуляция открытия РТР циклонуклеотидами - субстратами СИР дает возможность рассматривать белок как возможный регулятор поры. Так как функционирование РТР рассматривают как начальную стадию, инициирующую апоптоз, полученные данные позволяют выявить новые возможные механизмы регуляции клеточной гибели, вовлечение СЫР в процессы нейропротекции и противоопухолевые механизмы.

Связь СКР с Комплексами внутренней митохондриальной мембраны позволяет предположить ее участие в функционировании митохондриальной дыхательной цепи, а также в деградации РНК и биосинтезе белка в митохондриях и связанных с ними митохондриальных болезнях.

Обнаруженные изменения уровня и активности фермента в митохондриях при старении, указывает на его роль в возраст-зависимых процессах, что, возможно, будет способствовать пониманию механизма старения.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Бабурина, Юлия Леонидовна

выводы

1. Фосфобелок 46 кДа в митохондриях мозга был идентифицирован как 2',3'-циклонуклеотид фосфодиэстераза.

2. Установлено, что CNP присутствует не только в мх мозга, но и в митохондриях, изолированных из сердца, печени, поджелудочной железы крыс, а также клеток линии глиома С6 и< локализована в мембранных фракциях митохондрий.

6. Показано, что выход CNP увеличивается при открытии РТР, а также в присутствии ее субстратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бабурина, Юлия Леонидовна, Пущино

1. Adams,C.W., Davison A.N., Gregson N.A., 1963. Enzyme inactivity of myelin: histochemical and biochemical evidence. J. Neurochem. 10, 383395.

2. Agrawal,H.C., Sprinkle,T.J., Agrawal,D., 1990. 2',3'cyclic nucleotide-3'-phosphodiesterase in peripheral nerve myelin is phosphorylated by a phorbol ester-sensitive protein kinase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 817-823.

3. Anderson,B.M., Kahn,D.W., Anderson,C.D., 1985. Studies of the 2':3'-cyclic nucleotide phosphodiesterase of Haemophilus influenzae. J. Gen. Microbiol. 131,2041-2045.

4. Azarashvili,T., Krestinina,0., Odinokova,!., Evtodienko,Y., Reiser,G., 2003. Physiological Ca2+ level and Ca2+-induced Permeability Transition Pore control protein phosphorylation in rat brain mitochondria. Cell Calcium 34, 253-259.

5. Baines,C.P., Kaiser,R.A., Sheiko,T., Craigen,W.J., Molkentin,J.D., 2007. Voltage-dependent anion channels are dispensable for mitochondrial-dependent cell death. Nat. Cell Biol. 9, 550-555.

6. Basso,E., Petronilli,V., Forte,M.A., Bernardi,P., 2008. Phosphate is essential for inhibition of the mitochondrial permeability transition pore by cyclosporin A and by cyclophilin D ablation. J. Biol. Chem. 283, 2630726311.

7. Beatrice,M.C., Palmer,J.W., Pfeiffer,D.R., 1980. The relationship between mitochondrial membrane permeability, membrane potential, and the retention of Ca2+ by mitochondria. J. Biol. Chem. 255, 8663-8671.

8. Bera,A.K., Ghosh,S., Das,S., 1995. Mitochondrial VDAC can be phosphorylated by cyclic AMP-dependent protein kinase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 209, 213-217.

9. Bera.A.K., Ghosh,S., 2001. Dual mode of gating of voltage-dependent anion channel as revealed by phosphorylation. J. Struct. Biol. 135, 67-72.

10. Beutner,G., Ruck,A., Riede,B., Welte,W., Brdiczka,D., 1996. Complexes between kinases, mitochondrial porin and adenylate translocator in rat brain resemble the permeability transition pore. FEBS Lett. 396 , 189-195.

11. Bifulco,M., Laezza,C., Stingo,S., Wolff,J., 2002. 2',3'-Cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase: a membrane-bound, microtubule-associated protein and membrane anchor for tubulin. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 99, 18071812.

12. Bostwick,D.G., 1992. Prostatic intraepithelial neoplasia (PIN): current concepts. J. Cell Biochem. Suppl 16H, 10-19.

13. Braun,P.E., De,A.D., Shtybel,W.W., Bernier,L., 1991. Isoprenoid modification permits 2',3-cyclic nucleotide 3-phosphodiesterase to bind to membranes. J. Neurosci. Res. 30, 540-544.

14. Brdiczka,D., Beutner,G., Ruck,A., Dolder,M., Wallimann,T., 1998. The molecular structure of mitochondrial contact sites. Their role in regulation of energy metabolism and permeability transition. Biofactors 8, 235-242.

15. Broekemeier,K.M., Dempsey,M.E., Pfeiffer,D.R., 1989. Cyclosporin A is a potent inhibitor of the inner membrane permeability transition in liver mitochondria. J. Biol. Chem. 264, 7826-7830.

16. Chalmers,S., Nicholls,D.G., 2003. The relationship between free and total calcium concentrations in the matrix of liver and brain mitochondria. J. Biol. Chem. 278, 19062-19070.

17. Cho,S.J., Jung,J.S., Shin,S.C., Jin,I., Ko,B.H., Kim,K.Y., Suh-Kim,H., Moon,I.S., 2003. Nonspecific association of 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase with the rat forebrain postsynaptic density fraction. Exp. Mol. Med. 35,486-493.

18. Crompton,M., Ellinger,H., Costi,A., 1988. Inhibition by cyclosporin A of a Ca2+-dependent pore in heart mitochondria activated by inorganic phosphate and oxidative stress. Biochem. J. 255, 357-360.

19. Domanska-Janik,K., Bourre,J.M., 1987. Effect of mercury on rabbit myelin CNP-ase in vitro. Neurotoxicology 8, 23-32.

20. Douglas,A.J., Thompson,R.J., 1993. Structure of the myelin membrane enzyme 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase: evidence for two human mRNAs. Biochem. Soc. Trans. 21, 295-297.

21. Dreiling,C.E., Schilling,R.J., Reitz,R.C., 1981. 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphohydrolase in rat liver mitochondrial membranes. Biochim. Biophys. Acta 640, 114-120.

22. Gillespie,C.S., Bernier,L., Brophy,P.J., Colman,D.R., 1990. Biosynthesis of the myelin 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterases. J. Neurochem. 54, 656-661.

23. Giulian,D., Iwanij,V., Dean,G., Drummond,R.J., 1983. Localization of 2',3'-cyclic nucleotide-3'-phosphohydrolase within the vertebrate retina. Brain Res. 265,217-225.

24. Gravel,M., DeAngelis,D., Braun,P.E., 1994. Molecular cloning and characterization of rat brain 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase isoform 2. J. Neurosci. Res. 38, 243-247.

25. Gravel,M., Robert,F., Kottis,V., GallouziJ.E., PeIletier,J., Braun,P.E., 2009. 2',3'-Cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase: a novel RN4-binding protein that inhibits protein synthesis. J. Neurosci. Res. 87, 1069-1079.

26. Guha,A., Moore,S., 1975. Solubilization of 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphohydrolase from bovine brain without detergents. Brain Res. 89, 279-286.

27. Halestrap,A.P., Brenner,C., 2003. The adenine nucleotide translocase: a central component of the mitochondrial permeability transition pore and key player in cell death. Curr. Med. Chem. 10, 1507-1525.

28. Hansford,R.G., 1994. Physiological role of mitochondrial Ca2+ transport. J. Bioenerg. Biomembr. 26, 495-508.

29. Haworth,R.A., Hunter,D.R., 2000. Control of the mitochondrial permeability transition pore by high-affinity ADP binding at the ADP/ATP translocase in permeabilized mitochondria. J. Bioenerg. Biomembr. 32, 9196.

30. Heaton,P.A., Eckstein,F., 1996. Diastereomeric specificity of 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase. Nucleic Acids Res. 24, 850-853.

31. Hofmann,A., Zdanov,A., Genschik,P., Ruvinov,S., Filipowicz,W., \Vlodavver,A., 2000. Structure and mechanism of activity of the cyclic phosphodiesterase of Appr>p, a product of the tRNA splicing reaction. EMBOJ. 19,6207-6217.

32. Jansen,R.P., 1999. RNA-cytoskeletal associations. FASEB J. 13,455-466.

33. Juhaszova,M., Wang,S., Zorov,D.B., Nuss,H.B., Gleichmann,M., Mattson,M.P., Sollott,S.J., 2008. The identity and regulation of the mitochondrial permeability transition pore: where the known meets the unknown. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1123, 197-212.

34. Kato,M., Shirouzu,M., Terada,T., Yamaguchi,H., Murayama,K., Sakai,H., FCuramitsu,S., Yokoyama,S., 2003. Crystal structure of the 2'-5' RNA ligase from Thermus thermophilus HB8. J. Mol. Biol. 329, 903-911.

35. Kier,L.D., Weppelman,R., Ames,B.N., 1977. Resolution and purification of three periplasmic phosphatases of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 130, 399-410.

36. Kim,S.U., McMorris,F.A., Sprinkle,T.J., 1984. Immunofluorescence demonstration of 2':3'-cyclic-nucleotide 3-phosphodiesterase in cultured oligodendrocytes of mouse, rat, calf and human. Brain Res. 300, 195-199.

37. Kim,T., Pfeiffer,S.E., 1999. Myelin glycosphingolipid/cholesterol-enriched microdomains selectively sequester the non-compact myelin proteins CNP and MOG. J. Neurocytol. 28, 281-293.

38. KokoszkaJ.E., Waymire,K.G., Levy,S.E., SlighJ.E., Cai,J., Jones,D.P., MacGregor,G.R., Wallace,D.C., 2004. The ADP/ATP translocator is not essential for the mitochondrial permeability transition pore. Nature 427, 461-465.

39. Kozlov,G., Lee,J., Elias,D., Gravel,M., Gutierrez,P., Ekiel,I., Braun,P.E., Gehring,K., 2003. Structural evidence that brain cyclic nucleotide phosphodiesterase is a member of the 2H phosphodiesterase superfamily. J. Biol. Chem. 278, 46021-46028.

40. Kroemer,G., ReedJ.C., 2000. Mitochondrial control of cell death. Nat. Med. 6,513-519.

41. Kurihara,T., Nishizawa,Y., Takahashi,Y., 1977. The use of non-aqueous chloroform/methanol extraction for the delipidation of brain with minimal loss of enzyme activities. Biochem. J. 165, 135-140.

42. Kurihara,T„ Nishizawa,Y., Takahashi,Y., Odani,S„ 1981. Chemical, immunological and catalytic properties of 2':3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase purified from brain white matter. Biochem. J. 195, 153157.

43. Kushnareva,Y.E., Haley,L.M., Sokolove,P.M., 1999. The role of low (< or = I mM) phosphate concentrations in regulation of mitochondrial permeability: modulation of matrix free Ca2+ concentration. Arch. Biochem. Biophys. 363, 155-162.

44. Laemmli,U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

45. Laezza,C., Wolff,J., Bifiilco,M., 1997. Identification of a 48-kDa prenyiated protein that associates with microtubules as 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase in FRTL-5 cells. FEBS Lett. 413, 260264.

46. Lappe-Siefke,C., Goebbels,S., Gravel,M., Nicksch,E., Lee,J., Braun,P.E., Griffiths,I.R., Nave,K. A., 2003. Disruption of Cnpl uncouples oligodendroglial functions in axonal support and myelination. Nat. Genet. 33,366-374.

47. Lee,J., Gravel,M., Zhang,R., Thibault,P., Braun,P.E., 2005. Process outgrowth in oligodendrocytes is mediated by CNP, a novel microtubule assembly myelin protein. J. Cell Biol. 170, 661-673.

48. Lees,M.B., Samiullah,M., Laursen,R.A., 1984. Structural analogies between myelin basic protein and proteolipid. Prog. Clin. Biol. Res. 146, 257-264.

49. Leung,A.W., Varanyuwatana,P., Halestrap,A.P., 2008. The mitochondrial phosphate carrier interacts with cyclophilin D and may play a key role in the permeability transition. J. Biol. Chem. 283, 263 12-26323.

50. Liu,J., Li,H., Papadopoulos,V„ 2003. PAP7, a PBR/PKA-RIalpha-associated protein: a new element in the relay of the hormonal induction of steroidogenesis. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 85, 275-283.

51. Lowry O.H., Rosebrough N.L., Farr A.L., Randall R.J., 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275.

52. Mazumder,R., Iyer,L.M., Vasudevan,S., Aravind,L., 2002. Detection of novel members, structure-function analysis and evolutionary classification of the 2H phosphoesterase superfamily. Nucleic Acids Res. 30 , 52295243.

53. McFerran,B., Burgoyne,R., 1997. 2',3'-Cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase is associated with mitochondria in diverse adrenal cell types. J. Cell Sei. 110 ( Pt 23), 2979-2985.

54. MuIler,H.W., CIapshaw,P.A., Seifert,W., 1981. Two molecular forms of the isolated brain enzyme 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase. FEBS Lett. 131,37-40.

55. Muller,H.W., 1982. Dissociation of CNPase dimer into catalytically active monomers by 1,4-dithiothreitol and urea. Protein-promoted reassembly. FEBS Lett. 144, 77-80.

56. Nichols,B.J., Denton,R.M., 1995. Towards the molecular basis for the regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Mol. Cell Biochem. 149-150,203-212.

57. Nishizawa,Y., Kurihara,T., Masuda,T., Takahashi,Y., 1985. Immunohistochemical localization of 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase in adult bovine cerebrum and cerebellum. Neurochem. Res. 10, 1107-1118.

58. Persson,H., Corneliuson,0., 1990. Separation and identification of 2',3'-cyclic nucleotide 3-phosphodiesterase on isoelectric focusing gels. Anal. Biochem. 186,90-94.

59. Peters,A., Rosene,D.L., Moss,M.B., Kemper,T.L., Abraham,C.R., Tigges,J., Albert,M.S., 1996. Neurobiological bases of age-related cognitive decline in the rhesus monkey. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 55, 861-874.

60. Rais,I., Karas,M., Schagger,H., 2004. Two-dimensional electrophoresis for the isolation of integral membrane proteins and mass spectrometric identification. Proteomics. 4, 2567-2571.

61. Rasband,M.N., Tayler,J., Kaga,Y., Yang,Y., Lappe-Siefke,C., Nave,K.A., Bansal,R., 2005. CNP is required for maintenance of axon-glia interactions at nodes of Ranvier in the CNS. Glia 50, 86-90.

62. Rice JE,L.J., 1997. Subcellular fractionation of mitochondria. Subcellular Fractionation: A Practical Approach.

63. Sardanelli,A.M., Technikova-Dobrova,Z., Scacco,S.C., Speranza,F., Papa,S., 1995. Characterization of proteins phosphorylated by the cAMP-dependent protein kinase of bovine heart mitochondria. FEBS Lett. 377, 470-474.

64. Schagger,H., von,J.G., 1991. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anai. Biochem. 199, 223-231.

65. Schlaepfer,W.W., 1977. Structural alterations of peripheral nerve induced by the calcium ionophore A23187. Brain Res. 136, 1-9.

66. Shapira,R., Mobley,W.C., Thiele,S.B., Wilhelmi,M.R., Wallace,A., Kibler,R.F„ 1978. Localization of 2',3'-cyclic nucleotide-3'-phosphohydrolase of rabbit brain by sedimentation in a continuous sucrose gradient. J. Neurochem. 30, 735-744.

67. Shoshan-Barmatz,V., Gincel,D., 2003. The voltage-dependent anion channel: characterization, modulation, and role in mitochondrial function in cell life and death. Cell Biochem. Biophys. 39, 279-292.

68. Sims,N.R., 1990. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation. J. Neurochem. 55, 698-707.

69. Sinensky,M., 2000. Recent advances in the study of prenylated proteins. Biochim. Biophys. Acta 1484, 93-106.

70. Sloane,J.A., Hinman,J.D., Lubonia,M, Hollander,W., Abraham,C.R., 2003. Age-dependent myelin degeneration and proteolysis of oligodendrocyte proteins is associated with the activation of calpain-1 in the rhesus monkey. J. Neurochem. 84, 157-168.

71. Sogin.D.C., 1976. 2',3'-Cyclic NADP as a substrate for 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphohydrolase. J. Neurochem. 27, 1333-1337.

72. Sprinkle,T.J., Grimes,M.J., Eller,A.G., 1980. Isolation of 2',3'-cyclic nucleotide 3-phosphodiesterase from human brain. J. Neurochem. 34, 880887.

73. Sprinkle,T.J., Knerr,J.R., 1981. Inhibition of 2',3'-cycIic nucleotide 3'-phosphodiesterase activity from bovine, human and guinea pig brain. Brain Res. 214,455-459.

74. Sprinkle,T J., 1989. 2',3-cyclic nucleotide 3-phosphodiesterase, an oligodendrocyte-Schwann cell and myelin-associated enzyme of the nervous system. Crit Rev. Neurobiol. 4, 235-301.

75. Steenaart,N.A., Shore,G.C., 1997. Mitochondrial cytochrome c oxidase subunit IV is phosphorylated by an endogenous kinase. FEBS Lett. 415, 294-298.

76. Struglics,A., Fredlund,K.M., Moller,I.M., Allen,J.F., 1998. Two subunits of the F0F1-ATPase are phosphorylated in the inner mitochondrial membrane. Biochcm. Biophys. Res. Commun. 243, 664-668.

77. Struglics,A., Fredlund,K.M., Konstantinov,Y.M., Allen,J.F., MLller,I.M., 2000. Protein phosphorylation/dephosphorylation in the inner membrane of potato tuber mitochondria. FEBS Lett. 475, 213-217.

78. Technikova-Dobrova,Z., Sardanelli,A.M., Papa,S., 1993. Phosphorylation of mitochondrial proteins in bovine heart. Characterization of kinases and substrates. FEBS Lett. 322, 51-55.

79. Technikova-Dobrova,Z., Sardanelli,A.M., Stanca,M.R., Papa,S., 1994. cAMP-dependent protein phosphorylation in mitochondria of bovine heart. FEBS Lett. 350, 187-191.

80. Tyc,K., Kellenberger,C., Filipowicz,W., 1987. Purification and characterization of wheat germ 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase. J. Biol. Chem. 262, 12994-13000.

81. Vogel,U.S., Thompson,R.J., 1988. Molecular structure, localization, and possible functions of the myelin-associated enzyme 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase. J. Neurochem. 50, 1667-1677.

82. Whitefeld,P.R., Heppel L.A., Markham R., 1955. The enzymic hydrolysis ofribonucleoside-2':3' phosphates. Biochem. J. 60, 15-19.

83. Yin,X., Peterson,J., Gravel,M., Braun,P.E., Trapp,B.D., 1997. CNP overexpression induces aberrant oligodendrocyte membranes and inhibits MBP accumulation and myelin compaction. J. Neurosci. Res. 50, 238-247.

84. Yoshino,J.E., Dinneen,M.P., Sprinkle,T.J., Devries,G.H., 1985. Localization of 2',3'-cyclic nucleotide 3-phosphodiesterase on cultured Schwann cells. Brain Res. 325, 199-203.

85. Yu,H., Lee,I., Salomon,A.R., Yu,IC., Huttemann,M., 2008. Mammalian liver cytochrome c is tyrosine-48 phosphorylated in vivo, inhibiting mitochondrial respiration. Biochim. Biophys. Acta 1777, 1066-1071.

86. Yu,W.P., Collarini,E.J., Pringle,N.P., Richardson,W.D., 1994. Embryonic expression of myelin genes: evidence for a focal source of oligodendrocyte precursors in the ventricular zone of the neural tube. Neuron 12, 13531362.

87. Zaid,H., bu-Hamad,S., Israelson,A., Nathan,I., Shoshan-Barmatz,V., 2005. The voltage-dependent anion channel-1 modulates apoptotic cell death. Cell Death. Differ. 12, 751-760.

88. Zoratti,M., Szabo,I., 1995. The mitochondrial permeability transition. Biochim. Biophys. Acta 1241, 139-176.1. БЛАГОДАРНОСТЬ

89. С чувством глубокой признательности выражаю благодарность руководителю моей работы Азарашвили Тамаре Сергеевне за чуткое отношение, руководство и помощь в работе.

90. Я благодарна моим рецензентам и оппонентам доктору наук Опанасенко Вере Константиновне и профессору, доктору наук Акатову Владимиру Семеновичу за время, уделенное моей работе, и за полезные замечания.

Информация о работе

Бабурина, Юлия Леонидовна
кандидата биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Идентификация, локализация и функции 2`,3`-циклонуклеотид-3`-фосфодиэстеразы (CNP) в митохондриях крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы