Обнаружение и функциональное исследование нейропептидов, гомологичных пептидам CNP улитки Helix lucorum L., в нервной системе других беспозвоночных

Асеев, Николай Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Обнаружение и функциональное исследование нейропептидов, гомологичных пептидам CNP улитки Helix lucorum L., в нервной системе других беспозвоночных
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Обнаружение и функциональное исследование нейропептидов, гомологичных пептидам CNP улитки Helix lucorum L., в нервной системе других беспозвоночных"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ

на правах рукописи

АСЕЕВ Николай Александрович

ОБНАРУЖЕНИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЙРОПЕПТИДОВ, ГОМОЛОГИЧНЫХ ПЕПТИДАМ CNP УЛИТКИ HELIXLUCORUM L., В НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ ДРУГИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

03.00.13 — физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 2005

Работа выполнена в лаборатории клеточной нейробиологии обучения (заведующий — д. б. н., профессор П. М. Балабан) в Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (директор — д. б. н, профессор П. М. Балабан).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор П. М. Балабан.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В. П. Никитин; кандидат биологических наук Д. Д Воронцов.

Ведущее учреждение: кафедра физиологии высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ.

Защита состоится 28 декабря 2005 г. в 14 часов на заседании специализированного ученого совета (Д-002.044.01) при Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (г Москва, ул. Бутлерова, 5а). Факс: (095) 338-85-00 Е-таП: admin@ihna.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИВНД и НФ РАН. Автореферат разослан 25 ноября 2005 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук О. X. Коштоянц

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

В последние несколько десятилетий нейробиология, начинавшаяся с изучения методами клеточной электрофизиологии простейших поведенческих актов на беспозвоночных животных (Kandel and Taue, 1965), с одной стороны, впитала в себя методы молекулярной биологии (Boguski and Jones, 2004), а с другой стороны, её приёмы стали применяться для изучения таких сложных явлений, как выбор поведения и механизм принятия решений (Briggman et al., 2005). Это означает, что в рамках нейробиологического подхода становится возможным изучение роли отдельных генов и их пептидных продуктов в механизмах реализации сложных функций нервной системы. Образно говоря, современные методы физиологии позволяют построить мостик между генами и поведением.

Наиболее хорошо изученным механизмом, по которому гены влияют на фенотип, является классический путь с образованием полипептидных продуктов путём транскрипции ДНК и последующей трансляции РНК клеточным аппаратом. Белки и пептиды влияют на функции нервной системы непосредственно являясь нейромедиаторами (инсулин), нейромодуляторами (FMRF-амид), а также рецепторами к ним; будучи включёнными в каскады передачи сигналов (протеинкиназы) или метаболизма классических медиаторов и других нейроспецифичных веществ (ацетилхолинэстераза). Кроме этих, очевидных, путей известны также белки, действующие в нервной системе через другие механизмы, например регуляторы экспрессии генов (CREB, Notch), белки цитоскелета (тубулин) или транспортные белки.

Эндогенные биоактивные вещества белковой (как и любой другой) природы распределены в нервной системе неравномерно, их содержание специфично в каждой структуре и даже в отдельных клетках мозга. Это позволяет говорить о клеточном фенотипе, который по-разному проявляется, например, в дофаминергических нейронах активирующей системы мозга или нектин-иммунореактивных стволовых клетках нервной системы. На позвоночных животных знание паттернов распределения нейроспецифичных веществ позволяет ставить эксперименты с экстирпацией или стимуляцией исследуемых структур. Нервная система беспозвоночных, которая характеризуется относительно малым количеством относительно крупных нейронов, позволяет ставить прямые физиологические эксперименты над клетками с известными нейрохимическими фенотипами.

В последнее десятилетие огромное число исследований посвящено изучению локализации и функции эндогенных биоактивных веществ различной природы в ЦНС беспозвоночных животных' моллюсков, нематод, кольчатых червей, насекомых, ракообразных (недавние обзоры: Nusbaum et al., 2001; Homberg, 2002; Nassel, 2002; Skiebe, 2003; Hummon et al., 2005). Значительное

РОС. НАЦИОНАЛЫ!AC

БИБЛИОТЕКА 99 т^шЦ

' > M 11

место в указанных работах занимает изучение паттернов распределения и механизмов действия нейропептидов.

Вещества этого класса широко распространены в нервных системах различных животных, начиная с диффузной нервной сети таких примитивных организмов, как кишечнополостные (Bosch and Fujisawa, 2001) и заканчивая ЦНС человека (Storm and Tecott, 2005). При этом разнообразие нейропептидов позволяет им выполнять широкий диапазон функций в нервной системе. В основном, нейропептиды выбрасываются в синаптическую щель вместе с основным медиатором и играют модулирующую роль — меняют временные или амплитудные параметры постсинаптического ответа, влияют на выброс медиатора из пресинаптической терминали. Кроме того, нейропептиды могут распространяться далеко от места секреции, в таком случае их обычно называют нейрогормонами.

Действуя как модуляторы синаптических связей и нейрогормоны, пептиды участвуют в сложнейших функциях нервной системы и организма в целом. Для примера можно привести пептид NPY, участвующий в организации пищевого поведения у человека (Ramos et al., 2005) или пирокинины, без которых не может пройти развитие насекомых с полным превращением (Altstein, 2004) Нейропептиды могут иметь одинаковую или близкую структуру у беспозвоночных и млекопитающих. Необходимость исследования нейропептидов подчёркивается также тем, что нарушение их нормальной функции лежит в основе некоторых заболеваний нервной системы человека, таких как болезнь Альцгеймера, эпилепсия или гипералгезия (Carro and Torres-Alemán, 2004; Baraban and Tallent, 2004; King et al, 2005).

CNP1 MFYPRP 6 ак Mw=810.0

CNP2 DYPRL- Ш2 5 ак Mw=660.81

CNP3 SFFTTVNGNHYPRI- nh2 14 ак Mw=1651.01

CNP4 GVFTQGAHGSYPRV Ш2 14 ак Mw=1473.81

Рисунок 1. Пептиды CNP виноградной улитки. Аминокислотные последовательности пептидов CNP получены трансляцией insilico нуклеотидной последовательности гена HCS2 с учётом эндопептидазных сайтов и сайтов амидирования (Bogdanov et al., 1998).

Одной из недавно открытых групп нейропептидов является семейство CNP (Command Neuron Peptides, Рис. 1), предсказанное по нуклеотидной последовательности гена HCS2 и после обнаруженное иммунохимическими методами в ЦНС виноградной улитки Hellх lucorum L. (Bogdanov et al., 1998; Balaban et al., 2001). Эти пептиды локализованы в нейронах сети

оборонительного поведения улитки (ген НСБ2 был выделен из командных нейронов этой сети); также недавно было исследовано распределение пептидов СЫР в ЦНС другого моллюска, Ар1уя1а саЬ/огтса (¡егизаНтвку е! а1., 2003). Изучение функций пептидов СИР только началось, однако уже показана их функция в модуляции оборонительной моторной программы, а также нейроростовые свойства (Коршунова и др., 2005). На данный момент неизвестно, ограничивается ли распространение семейства нейропептидов СЫР нервной системой моллюсков или они свойственны также нервной системе других беспозвоночных животных.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью настоящей работы является поиск и исследование представителей нового семейства нейропептидов СИР в разных группах беспозвоночных животных. В соответствии с такой, поисковой, целью, в первую очередь необходимо было:

1. Выяснить, являются ли пептиды СЫР уникальными для ЦНС улитки, или же гомологичные им пептиды присутствуют также в нервной системе других беспозвоночных животных.

Когда результаты иммуноблоттинга подтвердили предположение о широкой распространённости пептидов семейства СОТ, нами были поставлены следующие задачи:

2. Выяснить, какие клетки нервной системы содержат гомологичные СЫР пептиды — являются ли эти пептиды неспецифическими маркёрами всех клеток нервной ткани, локализованы в определённых клеточных типах (например, в глии или мотонейронах) или образуют ещё более специфичный паттерн распределения.

3 Провести сравнительный анализ паттерна СКГР-иммунореактивных клеток с картами идентифицированных нейронов, известными для некоторых беспозвоночных. Охарактеризовать и, по возможности, идентифицировать СЫР-иммунореактивные клетки, которые не обозначены на таких картах.

4. Так как, исходя из структуры, СЫР являются секретируемыми пептидами, то возникает задача проверить эффекты аппликации синтетических пептидов СЬГР на нервную систему в физиологических концентрациях.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Пептиды CNP не являются уникальными для ЦНС улитки: это семейство нейропептидов представлено в нервной системе беспозвоночных животных разных типов

2. В нервной системе пиявки гомологичные CNP пептиды локализованы высокоспецифично: в строго определённых кластерах с небольшим количеством идентифицируемых нейронов.

3. Синтетический пептид CNP4 оказывает модулирующее тормозное влияние на деятельность сердца пиявки.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Нами впервые показано широкое распространение пептидов, гомологичных пептидам CNP улитки, в нервной системе беспозвоночных, не принадлежащих к типу МоПичса Применённая модификация метода иммуноблоттинга с поликлональными антителами к пептидам CNP2 и CNP4 выявила присутствие гомологичных полипептидов в центральных ганглиях Lymnaea stagnalis, Lumbricus terrestris, Drosophila melanogaster и позволила определить их молекулярную массу.

С использованием иммуногистохимической техники окрашивания клеток, в ганглиях центральной и периферической нервной системы медицинской пиявки, Hirudo medicinalis, были впервые обнаружены CNP-иммунореактивные нейроны; на основе анализа большого количества препаратов была построена суммарная схема распространения таких нейронов в нервной системе пиявки В нервной системе пиявки — так же, как и в ЦНС виноградной улитки — паттерн локализации CNP-иммунореактивных нейронов высокоспецифичен: пептиды выявляются в строго определённых кластерах с небольшим количеством идентифицируемых нейронов.

В нашей работе впервые предпринята попытка выяснить функции CNP-иммунореактивных нейронов и определить мишени биологического действия гомологичных CNP пептидов в организме представителя типа Annelida, пиявки Hirudo medicinalis Электрофизиологическими методами были идентифицированы связи CNP-иммунореактивных интернейронов № 254, описана часть нервной сети, в которую они включены В нашем исследовании не было обнаружено влияния пептида CNP4 на фасилитацию двух известных моносинаптических связей N-AE и N-CV Показаны тормозные модулирующие эффекты на сердце и возбуждающие его мотонейроны НЕ Существование физиологических эффектов подтверждает выдвинутую нами

гипотезу о широком распространении пептидов семейства CNP в нервной системе беспозвоночных животных.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

Обнаруженное распространение нейропептидов CNP в нервной системе нескольких типов беспозвоночных расширяет представления о родстве эволюционных групп исследованных животных Разработанный метод относительных автофлуоресцентных ориентиров может быть применён для более точной идентификации нейронов по положению в ЦНС медицинской пиявки и других животных. Данные о распространении CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе медицинской пиявки прямо подтверждают представление о слиянии нервных узлов нескольких сегментов с образованием новых ганглионарных структур в процессе эволюции типа Annelida.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные материалы диссертации докладывались на международных конференциях (2,7), всероссийских конференциях и конференциях стран СНГ (3, 6), на молодёжных научных конференциях разного уровня (1,4, 5, 8,9).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликована 1 статья и тезисы 9 докладов.

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы Работа изложена на 148 страницах машинописного текста, содержит 1 таблицу и иллюстрирована 27 рисунками. Список литературы содержит 135 источников.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для поиска гомологичных CNP пептидов мы применили метод иммуноблотгинга ("western blotting") Для иммуноблоттинга нервной системы были взяты образцы нервной ткани нескольких типичных представителей разных типов беспозвоночных животных: виноградная улитка Helix lucorum, большой прудовик Lymnaea stagnalis, дождевой червяк Lumbricus terrestris, плодовая мушка Drosophila melanogaster, медицинская пиявка Hirudo medicmahs Ганглии гомогенизировались гомогенизатором Поттера в течение 30 минут, из полученного гомогената центрифугированием осаждались митохондриальные, ядерные и другие мембранные структуры (14000g, 30 минут). Супернатант, содержащий белковую фракцию, смешивался 1:1

с 2* буфером для проб; для денатурации и линеаризации белков пробы нагревались до 95°С в течение 5 минут, после чего наносились в кармашки полиакриламидного геля Гель заливался с расчётом разделить полипептиды массой 4-20 кД: концентрирующий гель 20%, разделяющий гель 4%. Электрофорез проводился в малой форезной камере в трис-глициновом рабочем буфере. После выхода бромфенолового синего электрофорез останавливали, гель вынимали и подвергали процессу переноса белков HaPVDF мембрану (блоттинг) в течении 1 часа при токе 350 мА. Дорожка с маркёрами молекулярного веса окрашивалась на неспецифический белок амидо чёрным, остальная мембрана инкубировалась с первичными поликлональными антителами к пептидам CNP2 или CNP4 (1:1000). В качестве вторичных антител использовались коммерческие антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена. Визуализация проводилась набором реактивов ECL+ Kit, фиксация на рентгеновскую плёнку в кассете Phosphoimager.

Для серии иммуногистохимического окрашивания нервной системы препараты фиксировали в течение 2 часов при комнатной температуре 4% параформальдегидом, растворённом в 0.1М фосфатном буфере PBS. Препарат отмывали большим количеством РТА и после блокирования неспецифических сайтов связывания помещали в раствор первичных поликлональных антител к пептидам CNP2 или CNP4 (1:200). После отмыва первичных антител в РТА проводили инкубацию с раствором 1:200 вторичных коммерческих антител, конъюгированных с AlexaFluor™ 488 или FITC. Часть иммуногистохимических экспериментов проводилась на ультратонких срезах. Срезы (12-25 мкм) готовились двумя классическими способами: заливкой фиксированных препаратов в парафин с последующей нарезкой блоков на ручном микротоме и замораживанием живого препарата в сахарозном градиенте и приготовлением срезов на автоматическом замораживающем микротоме. Для ретроградного окрашивания нейронов был использован 5% раствор нейробиотина в дистиллированной воде, который «загружался» в коннективу М4-М5 в течение 3-4 дней при температуре 4°С. Препараты фиксировали как обычно, отмывали в PBS и подвергали иммуногистохимическому окрашиванию на пептиды CNP. После этого, дня достижения двойного мечения, нейробиотин визуализировался авидином, конъюгированным с красным красителем Texas Red, 1:200 раствор в PBS, инкубация 12 часов при комнатной температуре. Распределение иммунореактивных клеток в препаратах изучалось на люминесцентном микроскопе AxioPlan (Zeiss, Germany)

Внутриклеточная регистрация производилась стеклянными микроэлектродами, заполненными ЗМ ацетатом калия (сопротивление 30-50 МОм). Электрический контакт индифферентного электрода с раствором Рингера в ванночке и электродов с ацетатом калия обеспечивался хлорированными серебряными проводниками Активность нейронов

регистрировалась в режиме фиксации потенциала по мостовой схеме. Сигнал усиливался в 10 раз (усилители BRAMP-01R, NPI electronics, Germany) и оцифровывался с частотой дискретизации 3.3 кГц (АЦП DIGIDATA 1320, Axon Instruments, USA) Оцифрованные данные записывались на жёсткий диск и обрабатывались на компьютере при помощи программы Axoscope 8.0. Для регистрации движений сердца использовался фотодиод, улавливающий изменение количества света, проходящего через сердечную трубку. Для подачи стимула в экспериментах с сенситизацией моносинаптических ответов использовался программируемый стимулятор Master-8 (A.M.P.I., USA). Аппликация пептидов производилась микропипеткой в экспериментальную ванночку с препаратом, в количестве необходимом для достижения конечной концентрации пептида в ванночке 5х10"5М. Состав раствора Рингера для медицинской пиявки (концентрации компонентов в ммоль): 115.0 NaCl, 4.0 KCl, 1.8 СаС12,10.0 HEPES; рН=7.4.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Поиск гомологичных CNP полипептидов в белковых фракциях, выделенных из нервной системы беспозвоночных разных типов.

С целью разрешить вопрос, являются ли пептиды CNP уникальными дляЦНС улитки, или же гомологичные им пептиды присутствуют также в нервной системе других беспозвоночных животных, нами были взяты образцы нервной ткани Helix lucorum, Lymnaea stagnalis, Lumbricus terrestris, Drosophila melanogaster, Hirudo medicinalis. Для поиска гомологичных CNP пептидов в нервной системе вышеперечисленных животных мы применили метод иммуноблоттинга с поликлональными антителами к пептидам CNP2 и CNP4. При использовании поликлональных антител метод иммуноблоттинга выявляет не только полипептиды, против которых были выработаны антитела, но также и гомологичные им.

Мы обнаружили гомологичные CNP полипептиды в центральных ганглиях большого прудовика Lymnaea stagnalis, дождевого червя Lumbricus terrestris, и плодовой мушки Drosophila melanogaster (Рис. 2). Сравнение полученных на мембране полос белков с полосами стандартных маркёров молекулярной массы и полосой белка-предшественника нейропептидов CNP из ЦНС виноградной улитки (масса которого известна) позволило нам определить их молекулярную массу.

На дорожке, соответствующей пробе из нервной системы большого прудовика Lymnaea stagnalis, выявляется жирная полоса на уровне 3.5 к Да, также видны две более слабые полосы с массой 14 и 17 кДа, соответствующие, видимо, массе белка-предшественника и продуктам его полного или частичного процессинга. В белковой фракции из нервной системы плодовой мушки Drosophila melanogaster поликлональные антитела к пептиду CNP4

связываются с двумя белками массой 19 и 25 кДа В нервной системе дождевого червя иммуноблоттингом выявляется один гомологичный СОТ полипептид с массой 14 кДа.

3.5

ЩИ*

Helix Lymnaea Drosophila Lumbricus Hirudo

Рисунок 2. Иммуноблоттинг белковых фракций, выделенных изЦНС различных беспозвоночных. В этом эксперименте использовались первичные поликлональные антитела к синтетическому пептиду CNP4 и вторичные антитела, конъюгированые с пероксидазой хрена. Визуализация с использованием ECL+ Kit

В нервной системе другого представителя типа кольчатых червей, медицинской пиявки Hirudo medicinalis, методом иммуноблотгинга нами не было обнаружено CNP-гомологичных полипептидов (п=8). Мы считаем, что в данном случае отрицательный результат связан с ограничениями метода, так как иммуноблоттинг не выявляет полипептидов с массой, меньше ~3 кДа. Если белок-предшесгвенник не накапливается в клетках нервной системы, а сразу подвергается процессингу до коротких нейропептидов, то иммуноблоттинг не выявит специфических полос гомологичных белков. Мы проверили наше предположение методом иммуногистохимии — с использованием тех же поликлональных антител, мы обнаружили CNP-иммунореактивные клетки в нервной системе пиявки (см. следующую главу). Кроме того, существование физиологических эффектов пептида CNP4 в организме пиявки косвенно подтверждает существование эндогенных нейропептидов, гомологичных CNP, в нервной системе пиявки

Описанные результаты позволяют нам сделать вывод: пептиды CNP не являются уникальными для ЦНС улитки; они представляют семейство нейропептидов, широко распространённое в нервной системе беспозвоночных животных.

2 Поиск CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе медицинской пиявки

2.1. Иммуногистохимическое окрашивание нервной системы медицинской пиявки whole-mount Исследование различий в числе CNP-иммунореактивных клеток при окрашивании антителами к CNP4 и CNP2 Влияние модулирующих воздействий.

В целях изучения распределения гомологичных CNP пептидов в нервной системе пиявки мы провели иммуногистохимическое окрашивание целых ганглиев (whole-mount) применяя первичные антитела к пептидам CNP2 (п=12) и CNP4 (п=26). При этом нами не было отмечено различий между паттернами CNP2- и СЫР4-иммунореактивных нейронов, то есть оба вида имеющихся антител специфически связываются с одним и тем же эпитопом в нервной системе пиявки. Это обстоятельство позволило нам объединить данные, полученные на пиявке с использованием антител к пептидам CNP2 и CNP4.

На препаратах нервной системы улитки и аплизии ранее было показано, что травматическое воздействие на животное перед экспериментом вызывает увеличение числа CNP-иммунореактивных нейронов за счёт определённых групп нейронов, где при нормальных условиях уровень экспрессии гена HCS2 и кодируемых им пептидов CNP слишком низок для детектирования. Тот же эффект достигался двухчасовой инкубацией ганглиев ЦНС в растворе Рингера с 10_5М серотонина или 10_5М кофеина перед фиксацией препарата. Мы провели аналогичные эксперименты с этими тремя видами воздействия на пиявке (п=12), но обнаружили только незначительное варьирование числа CNP-иммунореактивных нейронов, обычно отмечаемое от препарата к препарату.

Можно предположить, что отсутствие такого механизма регулирования экспрессии CNP-гомологичных пептидов в нервной системе пиявки связано с различиями на уровне генов. Известно, что ген, кодирующий пептиды семейства CNP у виноградной улитки (и, как недавно стало известно, аплизии) уникален тем, что в отличие от всех известных генов, кодирующих белки-предшественники нейропептидов, содержит последовательность Са2+-связывающего домена EF-hand Мы не знаем структуры гена, кодирующего CNP-гомологичные пептиды у пиявки, но наши данные об отсутствии эффектов серотонина и кофеина (веществ, увеличивающих концентрацию внутриклеточного кальция в нервной системе) на количество CNP-иммунореактивных клеток, могут служить основой для предположения о том, что в структуре белка-предшественника нет Са2+-связывающих доменов

2 2 Иммуногистохимическое окрашивание нервной системы медицинской пиявки на последовательных срезах.

При проведении иммуногистохимической реакции in situ, в целых ганглиях нервной системы (whole-mount preparation) наблюдаемая нами

разница в числе CNP-иммунореактивных клеток может быть вызвана меняющейся от препарата к препарату проницаемостью для антител соединительно-тканных и глиальных оболочек ганглиев Проведение иммуногистохимической реакции на срезах ганглиев является стандартным приёмом, позволяющим гарантировано избежать зависимости уровня реакции от проницаемости ганглионарных оболочек.

Мы провели серию иммуногистохимических экспериментов с ультратонкими срезами ЦНС пиявки (п=10). В этой серии нами также наблюдалось варьирование числа CNP-иммунореактивных клеток от препарата к препарату. Таким образом, отмеченная нестабильность паттерна не связана с проницаемостью оболочек ганглия, а обусловлена неизвестными внутренними факторами.

Паттерны распределения клеток, полученные проведением иммунореакции на срезах и whole-mount препаратах нервной системы пиявки, полностью совпадают.

3. Идентификация CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе пиявки. 3.1. Анализ распределения CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе пиявки и сопоставление с картой расположения нейронов.

Мы построили схему распределения CNP-иммунореактивных нейронов, проанализировав данные, полученные нами на whole-mount препаратах и последовательных срезах ЦНС пиявки, Рис. 3.

На этой схеме отображено положение тел и отростков CNP-иммунореактивных нейронов, которые воспроизводились от препарата к препарату. Нами не было отмечено CNP-иммунореактивных глиальных клеток или волокон соединительной ткани, формирующей оболочку ганглиев и нервов. Более того, число CNP-иммунореактивных нейронов оказалось небольшим по сравнению с общим числом нейронов в нервной системе пиявки. Так, например, в одном сегментарном ганглии пиявки по литературным данным содержится порядка 300 нейронов, а CNP-иммунореакгивными являются только 8-15 из них. Разброс в численности пула CNP-иммунореактивных нейронов отражён на схеме цветовым кодированием — чёрным закрашены сомы нейронов, которые стабильно выявляются иммуногистохимически, серым — встречающиеся только в некоторых препаратах. Аналогичные вариации в численности нейронов, выкрашиваемых методом иммуногистохимии, были показаны как другими исследователями, так и в нашей лаборатории при исследовании распределения пептидов CNP в ЦНС разных видов моллюсков.

Несмотря на относительно малое количество CNP-иммунореактивных клеток, они присутствуют во всех ганглиях центральной нервной системы пиявки, а также в периферических ганглиях переднего корешка (ARG). Описанный нами паттерн CNP-иммунореактивных нейронов пиявки хорошо

соответствует представлениям о билатеральной симметрии и метамерном строении нервной системы кольчатых червей.

dorsal

Ixh ,

VlC^WA^i

ОЗч^у---V2 V

ventral

*< 5/

/Я

V. -Г-CúD

- »:- rc

R3 *

4 Л A

1 Í r

^ « t 4

r . Q-j '^--z. %

ir/

. ¥

^ i \ >

(¡—

=5""

M2-M21

/i Ж

Рисунок 3. Схема распределения CNP-иммунореактивных нейронов в нервной системе медицинской пиявки Hirudo medicinalis (из Aseyev et al, 2005).

Так, большая часть CNP-иммунореактивных нейронов парные (две клетки-исключения, по нашему глубокому убеждению, также образуют пару, оказавшуюся в соседних сегментах Ml-R4b в процессе онто-или филогенеза). Нами показано, что число CNP-иммунореактивных нейронов в ганглиях, которые считаются образованными слиянием нескольких сегментов, увеличивается кратно числу слившихся сегментов (4 для субэзофагеального ганглия и соответствующих ему периферических ганглиев ARG; 7 для хвостовой ганглионарной массы).

Проанализировав паттерн распределения С№-иммунореактивных клеток, мы можем сделать вывод, что гомологичные СЫР пептиды являются специфическими маркёрами определённых нейронных кластеров в нервной системе пиявки, так же, как и в ЦНС моллюсков. Кроме того, мы предполагаем функциональное единство СОТ-иммунореактивных нейронов, основанное на общей химической специфичности нейронов кластера. Ранее в нашей лаборатории были получены данные о модуляторных и нейроростовых свойствах пептидов группы СИР в нервной системе моллюсков Для выяснения роли, которую играют пептиды семейства (ЖР в нервной системе пиявки, необходимо поставить прямые эксперименты с аппликацией этих пептидов или провести идентификацию СЫР-иммунореактивных нейронов

3 2. Разработка и применение метода относительных автофлуоресцентньгх ориентиров.

В качестве одного из основных критериев при идентификации нейронов в ЦНС пиявки используется размер и расположение сомы (по литературным данным, для некоторых клеток использование одного только этого критерия обеспечивает удачную идентификацию в 100% случаев) Электрофизиологами широко используется такой способ утешить положение исследуемых клеток на поверхности ганглиев- живой препарат подкрашивают очень слабым раствором витального красителя нейтральный красный, который накапливается только в моноаминергических нейронах пиявки В каждом ганглии пиявки локализовано всего несколько хорошо изученных моноаминергических нейронов (серотонин-, дофамин- и окатопаминергических), относительно которых исследователи могут задавать положение любых исследуемых клеток К сожалению, витальные красители не выдерживают фиксации, что не позволяет впоследствии идентифицировать эти клетки на иммуногистохимически окрашенных препаратах.

С целью уточнить положение СМР-иммунореактивных клеток, нами был разработан очень простой вариант этого метода для фиксированных препаратов. Из литературы известно, что после альдегидной фиксации (к которой относится используемая в нашем иммуногистохимическом протоколе фиксация параформальдегидом) все живые клетки приобретают свойство автофлуоресценции в жёлто-зелёном спектре В наших экспериментах было показано, что этот автофлуоресцентный сигнал проходит как через зелёный, так и через красный фильтр люминесцентного микроскопа. Оказалось также, что автофлуоресценция клеток, которые были прижизненно окрашены нейтральным красным, многократно усиливается По этому свойству моноаминергические клетки легко обнаруживаются в фиксированном препарате при наблюдении с красным фильтром люминесцентного микроскопа Так как сигнал автофлуоресценции значительно слабее флуоресцентного сигнала иммуногистохимической реакции, то невозможно перепутать их

со специфическим окрашиванием антителами при наблюдении с зелёным фильтром (см. цветной Рис. 3.3.2.1 в диссертации).

На схеме распространения СМР-иммунореактивных клеток (Рис. 3) клетки-ориентиры обозначены контурами. Нами не было отмечено случаев локализации СЫР-гомологичных пептидов в мопоаминергических нейронах ^ Разработанный нами метод позволил значительно уточнить положение

СМР-иммунореактивных нейронов в медиальной части субэзофагеального гатгглия относительно серотонинергических нейронов Ретциуса, в латеральной ^ части относительно клеток IX В сегментарных ганглиях точная локализация

СМР-иммунореактивных нейронов определялась относительно серотонинергических нейронов 21 и 61, октопаминергических БШ.

3 3 Исследование природы СТЯР-иммунореактивности в межсегментарных коннективах.

На наших иммуногистохимических препаратах, помимо тел нейронов, в нейропиле на дорзальной поверхности всех ганглиев выкрашивается также обильное ветвление СЫР-иммунореактивных волокон и синаптические бутоны В медиальной части межсегментарных коннектив и в передних корешках сегментарных ганглиев, в нервах 02 окологлоточного комплекса ганглиев (субэзофагеальный и церебральные ганглии, Рис. 3) выявляются СМР-иммунореактивные отростки Некоторые из СМР-иммунореактивных нейронов в наших препаратах имеют далеко идущие СМР-иммунореактивные отростки, у других выявляются только сомы К сожалению, мы не видим способа выяснить, с чем это связано: с функционально различной внутриклеточной локализацией СМР-гомологичных пептидов в разных нейронах, или с ограниченной чувствительностью метода

Для уточнения морфологии СМР-иммунореактивных отростков нами была проведена специальная серия экспериментов (п=6). Целью серии было выяснить, в каком направлении происходит транспорт пептида, гомологичного пептидам (ЖР, в межсегментарных коннективах. В экспериментах с длительным (до 48 часов) переживанием препаратов после перерезки брюшной нервной цепочки, было выяснено, что СМР-иммунореактивные варикозы образуются с каудальной стороны от перерезки. Из общих 4 соображений (центрифугальное распространение секретируемых веществ

в аксоне, уоллеровская дегенерация отсечённого периферического отростка) мы делаем вывод, что СМР-иммунореактивные волокна в медиальной части каждой коннективы являются аксонами нижележащих нейронов В противоположном направлении, от головы к хвосту, в каждой латеральной коннективе обнаруживается по одному очень тонкому СМР-иммунореактивному волокну Это волокно идёт по медиальному краю нерва и образует короткие ветвления, заканчивающиеся бутонами

Появление CNP-иммунореактивных варикозов и ветвлений волокон в месте перерезки коннектив свидетельствует о происходящих процессах регенерации нерва. Учитывая известные нейроростовые свойства пептидов CNP в нервной системе улитки, можно предположить, что в нервной системе пиявки гомологичные CNP пептиды активно участвуют в регенерации волокон нерва.

3.4. Эксперименты с двойным мечением нейронов пиявки.

Среди CNP-иммунореактивных нейронов, найденных нами в субэзофагеальном ганглии, особый интерес представляют клетки двух кластеров: в вентральном медиальном пакете R1 и в латеральном дорзальном R3b. Именно в этих кластерах в литературе описаны одни из немногих идентифицированных нейронов субэзофагеального ганглия Trl и Тг2, R3bl. Нейроны кластера Тг способны запускать и останавливать локомоторную программу плавания, а недавно открытый нейрон R3bl является триггерным нейроном, переключающим поведение между плаванием и ползанием в зависимости от окружающей животное среды. По сути, эти нейроны являются командными нейронами в нервной сети локомоции пиявки. Так как в ЦНС улитки пептиды CNP локализованы в командных нейронах оборонительного поведения (втягивания тела в раковину), то нами было сформулировано предположение о том, что пептиды семейства CNP могут быть маркёром (или даже механизмом функционирования) интернейронов высшего уровня в нервных сетях оборонительной локомоции.

Для проверки этой привлекательной гипотезы мы провели серию экспериментов, основанную на знании морфологии клеток Trl, Тг2 и R3bl: эти три нейрона имеют длинные проекционные аксоны, проходящие по всем сегментам нервной системы пиявки. Мы сделали двойное иммуногистохимическое мечение на whole-mount препаратах (п=4) и последовательных срезах (п=2, В. Н. Иерусалимский) мозга пиявки, в которых зелёный флуоресцентный краситель выявлял CNP-иммунореактивные нейроны, а красный связывался с нейробиотином, загружавшимся ретроградно в течение 36-48 часов в межсегментарные коннективы posterior от МЗ или М4. Ни в одном из препаратов не было обнаружено колокализации красителей. Полученные результаты трактуются к

нами следующим образом: ранее известные субэзофагеальные интернейроны локомоции пиявки не являются CNP-иммунореактивными; однако, для того, чтобы окончательно отвергнуть или подтвердить высказанную нами гипотезу, i

необходимо идентифицировать все CNP-иммунореактивные нейроны — возможно среди них есть клетки, обладающие командными функциями в локомоции пиявки.

Эксперименты с двойным мечением также прояснили морфологию некоторых CNP-иммунореактивных нейронов в других ганглиях. В наших

экспериментах выяснилось, что отросток CNP-иммунореактивной клетки в ганглиях переднего корешка ARG проходит через сегментарный ганглий и спускается по межсегментарным коннективам в каудальном направлении как минимум на один сегмент тела. В сегментарном ганглии было точно определено положение клеток №254, и показано, что они являются единственными CNP-иммунореактивными нейронами сегментарных ганглиев, посылающими отросток в каудальном направлении на один сегмент.

3 5 Физиологическая идентификация CNP-иммунореактивных нейронов 254. 226 и 227 сегментарных ганглиев.

254, 254 Р,

lyv1

Jfll

254, 254

0.5 нА

I-

электрическим синапс

тормозным

химический

синапс

возбуждающий

химический

синапс

Рисунок 4. Функциональная идентификация

СЫР-иммунореактивных нейронов 254, расположенных на вентральной поверхности сегментарных ганглиев пиявки.

В кластере СЫР-иммунореактивных нейронов вентральной поверхности сегментарных ганглиев наиболее стабильно и ярко окрашиваются методом иммуногистохимии клетки 226, 227 и пара клеток 254 Клетки имеют характерное положение в медиальной части ганглия, но из-за малого размера сомы и связанных с этим трудностей при внутриклеточной регистрации, не вызывали интереса исследователей и не были ранее идентифицированы.

Используя идентификацию по размеру и положению, мы зарегистрировали электрофизиологическую активность клеток 254. Для идентификации использовалось положение относительно а) крупных нейронов Ретциуса;

б) средних по размеру, но всегда легко узнаваемых по положению и активности мотонейронов АЕ и расположенных строго рострально от них клеток 251;

в) искомые клетки 254 находятся на воображаемой оси между двумя моноаминергическими клетками 61, выкрашиваемых на живом препарате нейтральным красным; г) клетки 254 парные, их сомы обычно расположены рядом, на оси билатеральной симметрии ганглия. В дальнейших экспериментах мы учитывали также наличие возбуждающего химического синапса между парой клеток 254, характер их ответов на сенсорный приток и отросток идущий в каудальном направлении.

Мы впервые описали часть нейронной сети, в которой работают СЫР-иммунореактивныс нейроны 254 (Рис. 4), включая взаимодействие между двумя клетками 254 и существование возбуждающего и тормозного притока от сенсорных нейронов разной модальности. В поисках мишеней клеток 254 мы проводили их одновременную регистрацию с известными мотонейронами АЕ и СУ, многофункциональными нейронами Ретциуса и нейросекреторными клетками Лейдига, но никаких синаптических связей обнаружено не было.

Две другие клетки сегментарных ганглиев, 226 и 227, также как и нейроны 254 имеют малый размер (-15 мкм у взрослых животных весом 2-5 грамм), но произвести сколько-нибудь серьёзное изучение их свойств нам не удалось из-за сложностей с нахождением, уверенной идентификацией и, тем более, длительной регистрацией внутриклеточной активности от мелких клеток, расположенных ростральнее мотонейронов СУ (кластер 224 - 231).

4. Исследование физиологических эффектов пептида СИР4 в нервной системе пиявки.

4.1. Аппликация пептида СЫР4 в модели сенситизашш моносинаптических ответов.

В поисках физиологических эффектов пептидов семейства СКР нами была поставлена серия экспериментов с аппликацией пептида С1МР4 на изолированную нервную систему медицинской пиявки. В качестве модели была выбрана фасилитация двух известных моносинаптических связей, между сенсорным нейроном N2 и мотонейронами АЕ и СУ Мы одновременно регистрировали активность этих трёх клеток и вырабатывали сенситизацию

ВПСП в мотонейронах по схеме, разработанной Мюллером и Никколзом в 1974 году. При сравнении группы препаратов, в которой апплицировался пептид CNP4 с контрольной группой, не было обнаружено никаких достоверных различий в амплитуде или временных параметрах ответов.

4.2 Аппликация пептида CNP4 на полуинтактных препаратах «сердце-мозг».

У большинства представителей типа Кольчатые черви (Annelida) сердце не способно к самостоятельным сокращениям, ритм сокращений сердечной трубки является нейрогенным. В случае медицинской пиявки сердечный ритм задаётся активностью хорошо известных мотонейронов НЕ. В некоторых препаратах эти нейроны были CNP-иммунореакгивны, что подсказало нам идею проверить физиологические эффекты пептидов CNP в сети нервно-гуморальной регуляции сердечной деятельности. В поисках физиологических эффектов пептидов семейства CNP нами были поставлены эксперименты с аппликацией пептида CNP4 на полуинтактных (редуцированных) препаратах медицинской пиявки. Мы регистрировали одновременно электрическую активность мотонейронов НЕ и механограмму сокращений сердечной трубки.

Рисунок 5. На верхней записи приведена активность левого мотонейрона НЕ в четвёртом СГ, на нижней— механограмма левого сердца в том же сегменте (направленные вниз пики соответствуют сокращениям; в механограмму также вносит вклад движение сердечной трубки в соседних сегментах) Вертикальной линией отмечен момент аппликации пептида С1ЯР4

НЕ

Сер

(5х10"5М).

На механограмме сердца (нижняя запись, Рис. 5) видно быстрый тормозный эффект пептида СМР4 на сердечную мышцу. Изменения на уровне мотонейронов сердца не столь очевидны. Однако, статистический анализ параметров ритма в мотонейронах сердца НЕ выявляет достоверное уменьшение числа спайков в пачке, увеличение фазы гиперполяризации и снижение мембранного потенциала после аппликации пептида С№4 до конечной концентрации в ванночке 5x10-5 М. При этом частота сердечных сокращений остаётся неизменной, что говорит об отсутствии эффектов пептида СЖЧ на интернейроны Н>1, осцилляции в которых задают временные параметры сердечного ритма, Рис. 6 .

Аппликация ЗДР4 меняет МП в нейронах НЕ

ЗД1Р4 меняет наполненность пачки в нейронах НЕ

| ¡33 среднее, 8ЕМ |

4л

| -в

хмо-

4.0

О ЗЛ

Е м

1 2.0

1 1Л

ол

ол-

С№4 удпинняет фазу ГП в нейронах НЕ

| ШИ сроднее, ЭЕМ)

СЫР4 не меняет период ритма в нейронах НЕ

Л *

Рисунок 6 Гистограммы изменения параметров активности нейронов НЕ при аппликации пептида СЖЧ. Номера на столбиках гистограммы соответствуют номеру периода ритма после аппликации, то есть, по категориальной оси абсцисс отложено нормализованное время после аппликации. По оси ординат отложена разница между средним значением параметра в периоде с данным номером после аппликации и средним значением параметра по пяти периодам до аппликации. Приведены средние значения изменения параметров по шести экспериментам с указанием стандартной ошибки среднего.

Таким образом, мы обнаружили две мишени тормозного действия пептида СМ>4 у пиявки- сердечная трубка и мотонейроны НЕ, Рис. 7 Замедление активности СЫР-иммунореактивных нейронов НЕ, происходящее при аппликации пептида СЫР4 мы трактуем как проявление отрицательных обратных связей, широко распространённых в биологических системах регуляции, деятельности сердца в том числе.

левая сердечная трубка

осциллирующие (ритмозадающие) интернейроны

мотонеироны сердца

правая сердечная трубка

Рисунок 7 Гипотетическая схема участия пептидов СИР в регуляции сердечной деятельности пиявки.

Интересно, что обнаруженный нами тормозный эффект пептида CNP4 на сердечный ритм пиявки находится в соответствии с наблюдаемыми И С. Захаровым эффектами при введении этого пептида улиткам. После введения CNP4 в гемолимфу улитки наблюдается связанное с торможением сердечной деятельности падение тургора — подтягивается голова и провисают щупальца Известно, что этот эффект снижения сердечной активности обусловлен тем, что сердце обеспечивает у всех мягкотелых животных гидроскелет (Dale, 1973,1974; Sommerville, 1973).

Гидроскелет активно используется при движениях животного, например для сокращения участка тела животного требуется не только сокращение продольной и расслабление кольцевой мускулатуры тела, но также и приостановка нагнетания гемолимфы по сосудистой системе в сокращаемый

отдел тела. Участие гидроскелета в движениях требует согласованного управления гомеостазом (сокращение сердца) и управления поведением (сокращение двигательных мышц) со стороны нервной системы.

В качестве примера можно привести недавнее исследование, в котором было показано торможение активности сердца садовой улитки со стороны нервной системы в первую фазу реализации оборонительного поведения (Weatherill and Chase, 2005). Хотя у пиявки, в отличие от улиток, оборонительное поведение заключается в активном избегании оборонительных стимулов, первой реакцией на сильные тактильные стимулы всегда являются замирание животного и сокращение стимулированного участка тела (Kristan et al., 2005). Также как у моллюсков, в реализации этих форм поведения пиявки значительную роль играет гидроскелет (Kristan et al., 2000).

В свете литературных данных показанный нами тормозный эффект пептида CNP4 на деятельность сердца пиявки можно рассматривать более широко: это не только регуляция гомеостаза, но и возможное участие в организации оборонительного поведения. Если участие пептидов CNP в управлении поведением пиявки требует дальнейших исследований, то сходство наблюдаемых эффектов пептида CNP4 на активность сердца пиявки и улитки уже сейчас является хорошей иллюстрацией единства механизмов действия CNP-гомологичных пептидов у разных типов животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Полученные в настоящей работе результаты гармонично дополняют имеющиеся литературные данные о распространении в животном мире, локализации в нервной системе и физиологических функциях нейропептидов семейства CNP. Необходимо отметить, что изучение пептидов CNP имеет своей целью не одно только расширение знаний об этом конкретном семействе пептидов, как и любое фундаментальное исследование, оно вносит вклад в решение общих задач биологии.

К примеру, обнаружение гомологичных нейропептидов в разных типах беспозвоночных животных может рассматриваться как ещё одно свидетельство раннего эволюционного возникновения пептидных медиаторов. Учитывая, что расхождение типов беспозвоночных, представителей которых мы исследовали, датируется докембрием, можно предположить, что уже 600 миллионов лет назад существовали формы, использующие пептиды семейства CNP для передачи сигналов в нервной системе.

такого распределения (например, дофаминергические клетки в ядрах ствола мозга позвоночных — substantia nigra). Мы считаем, что данные о строгом распределении биологически активных веществ аргументируют концепцию идентифицируемых нейронов (в современном её прочтении) Первоначальный вариант нейронной концепции был сформулирован Рамон-и-Кахалем, в противовес ретикулярной теории, предложенной Камилло Гольджи. С точки зрения ретикулярной теории, отдельные нервные клетки равноправны и дают ничтожный вклад в функционирование целой нервной сети. Напротив, само название концепции идентифицируемых нейронов подразумевает возможность идентифицировать, описать нейрон по свойствам, которыми обладает только он.

Крайним вариантом применения концепции идентифицируемых нейронов, наверное, являются «клетки моей бабушки» — нейроны способные кодировать сложные стимулы, целые образы — такие, например, как образ хищника для грызунов и птиц. Роль и сама идея существования гностических нейронов вызвала бурные обсуждения в конце 60-х годов XX века (Конорский, Барлоу, Леттвин и другие). Однако, наибольшее распространение концепция идентифицируемых нейронов получила в нейробиологических работах 70-х, когда стало ясно, что для реализации многих видов поведения беспозвоночных животных достаточно активировать всего одну клетку (командный нейрон этого вида поведения). Термин «командный нейрон» введён в обиход нейробиологов Вирсмой, а его критерии и классическое определение концепции (теперь она называлась концепцией командного нейрона) были даны Купферманном и Вейссом в 1978 году. На современном этапе развития науки спор о распределении функций между элементами нервной системы, начатый Гольджи и Кахалем, продолжается на новом уровне, между сторонниками теории клеточных ансамблей (Miguel A Nicoleiis, György Buzsáki и другие) и теории оркестрирования (основатель Graham Hoyle, сторонники теории' С. J H Elliott, Hans J. Pfluger, Eve Marder и другие) Хотя теория оркестрирования рассматривает вопрос управления в нервных сетях с иных позиций, чем концепция командного нейрона, в последнее время наметилась тенденция к объединению этих двух теорий в одну (Купферманн и Вейсс, 2001)

В более широком аспекте, применительно ко всем типам нейронов, соотношение химической специфичности и функциональной специализации было проанализировано Д А Сахаровым в 1974 году Противопоставляя функциональную и генетическую гипотезы происхождения нейронов, Д А Сахаров приходит к выводу, что нейроны, использующие определённый медиатор, могут иметь совершенно разные функции В первую очередь это связано с эволюцией постсинаптического механизма — рецепторных белков и других элементов каскада передачи сигнала Однако в ряду гомологичных нейронов, таких например, как гигантские метацеребральные клетки моллюсков, наблюдается единство функций. Гомология этих нейронов

прослежена в представителях разных надотрядов моллюсков и везде их активирующее действие связано с медиатором серотонином. Интересно, что у других типов животных аналогичная функция также связана с моноаминами: у насекомых с октопамином, а у позвоночных с дофамином.

или распространяющихся в организме более широко. При этом окончательный физиологический эффект зависит как от рецепторов-мишеней, так и от комбинации медиаторов, среди которых важную роль играют вещества пептидной природы. Учитывая большое разнообразие нейропептидов, становится очевидной необходимость их изучения для решения вопроса о соотношении функции нейрона и его химической специфичности.

Пожалуй, не будет преувеличением сказать, что до полного понимания вклада медиаторной специфичности в функциональную специализацию нейрона ещё очень далеко. В то же время ясно, что это ключевой вопрос концепции идентифицируемых нейронов на текущем этапе развития. Практически все нейробиологи сейчас так или иначе пытаются понять, каким образом в нервной системе сочетаются химическое кодирование сигнала и система связей между нейронами Пока оптимального баланса, логично объясняющего всё наблюдаемое разнообразие паттернов физиологически активных веществ и распределение функций в нервной системе не найдено.

Подводя общий итог, можно сказать, что одной из глобальных задач нейробиологии является изучение физиологических механизмов, связывающих гены и поведение. В настоящей работе, усилия были сконцентрированы на исследовании функций нейронов с определённой химической специфичностью — содержащих нейропептиды семейства СМ\ Было продемонстрировано, что пептиды этого семейства распределены сходным образом в нервных системах животных, принадлежащих к разным таксономическим типам и что по крайней мере какая-то часть функций нейропептидов семейства СМ> может быть общей у разных животных В основе работы лежит концепция идентифицируемых нейронов и её более поздние надстройки; мы полагаем, что полученные результаты поддерживают и развивают эти теоретические построения.

выводы.

1. Пептиды CNP не являются уникальными для ЦНС улитки: это семейство нейропептидов представлено в нервной системе беспозвоночных животных разных типов.

3. Известные по литературе командные нейроны локомоции пиявки Tri, Тг2 и R3bl не являются CNP-иммунореактивными.

4. Впервые идентифицированные CNP-иммунореактивные клетки №254 сегментарного ганглия связаны между собой возбуждающими химическими синапсами и получают входы от сенсорных нейронов трёх разных типов.

5 Синтетический пептид CNP4 не оказывает модулирующего действия на фасилитацию двух известных моносинаптических связей N-AE hN-CV.

6. Синтетический пептид CNP4 оказывает модулирующее тормозное влияние на деятельность сердца пиявки непосредственно и через мотонейроны НЕ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи

1) Aseyev N, Ierusalimsky V N, Boguslavsky D V, Balaban P M Snail peptide expression pattern in the nervous system of the medicinal leech Molecular Brain Research, 2005 Volume 140, Issues 1-2, pp 99-105

Тезисы конференций.

1) Асеев H А Обнаружение пептидов, гомологичных пептидам CNP улитки, в ЦНС других беспозвоночных Научная конференция молодых учёных, 8-9 октября 2003 года, Москва Тезисы докладов, стр 35

2) Aseyev N, Boguslavsky D, Ierusalimsky V , Balaban P M Finding snail's neuropeptides in other invertebrates, '4th Forum of European Neuroscience', Lisbon, Portugal, July 10-14, 2004 FENS Forum Abstracts, vol 2, A115 2, 2004

3) Асеев H A, Богуславский Д В , Иерусалимский В Н Балабан П М Обнаружение нейропептидов улитки в ЦНС других беспозвоночных «XIX Съезд Физиологического Общества им И П Павлова», Екатеринбург, 19-24 сентября 2004 года Тезисы докладов Рос физиол журн им И М Сеченова Т 90 № 8(1), стр 237, 2004

4) Асеев Н А Иммуногистохимическое исследование распределения пептидов CNP в нервной системе пиявки Научная конференция молодых ученых, б октября 2004 года, Москва Тезисы докладов, стр 5

5) Aseyev N, Boguslavsky D , Ierusalimsky V , Balaban P M Finding snail's neuropeptides in other invertebrates 'International Workshop in Cell Physiology', St Petersburg, October 13-17, 2004 Abstracts, p. 25

6) Асеев H A , Богуславский Д В , Иерусалимский В Н, Балабан П М Обнаружение и исследование функции нейропептидов улитки CNP в нервной системе пиявки «Нейрохимия фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 14-16 марта 2005 года Тезисы докладов и стендовых сообщений, стр 78

7) Aseyev N , Boguslavsky D, Ierusalimsky V, Balaban P M Finding snail's neuropeptides in other invertebrates a physiological study, '7th Annual Meeting of the International Behavioural and Neural Genetics Society', Sitges, Spain, June 9-12, 2005 Abstracts, №33, p 30

8) Aseyev N, Boguslavsky D , Ierusalimsky V, Balaban P M Finding snail's neuropeptides in other invertebrates a physiological study 'IBRO-CEERC Summer School 2005 Research strategies for the study of complex neural networks From synaptic transmission to seeing the brain in action', Debrecen, Hungary, July 11-22,2005 Program, p 8

9) Aseyev N, Boguslavsky D , Ierusalimsky V, Balaban P M Finding snail's neuropeptides in other invertebrates a physiological study 'International Summer School in Behavioural Neurogenetics', Moscow State University, Russia, September 12-16, 2005

Оригинал-макет разработан Николаем Асеевым <aseyev@ihna ru> Заказ N° 2216 Подписано в печать 23.11.2005 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1

^iT/ N ООО "Цифровичок", тел. (095) 797-75-76; (095) 778-22-20 v'v у) www.cfr.ru ; e-mail: info@cfr.ru

р Р 4 9 2 I

РНБ Русский фонд

2006-4 26112

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Асеев, Николай Александрович

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ H УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Физиологически активные пептиды в нервной системе беспозвоночных.

1.1.1. Нейропептиды семейства CNP.

1.1.2. Эволюционый аспект функционирования нейропептидов.

1.2.0бщее строение медицинской пиявки.

1.2.1. Нервная система медицинской пиявки.

1.2.1.1. Идентифицированные нейроны сегментарных ганглиев.

1.2.1.2. Идентифицированные нейроны субэзофагеального ганглия.

1.2.2. Лакунарная (сосудистая) система медицинской пиявки.

2. МЕТОДИКА.

2.1. Животные и препарирование.

2.2. Иммуноблоттинг.

2.3. Иммуногистохимия.

2.4. Электрофизиология.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Поиск гомологичных CNP полипептидов в белковых фракциях, выделенных из нервной системы беспозвоночных разных типов.

3.2. Поиск CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе медицинской пиявки.

3.2.1. Иммуногистохимическое окрашивание нервной системы медицинской пиявки whole-mount.

3.2.1.1.Исследование различий в уровне иммунореакции при окрашивании антителами к пептидам CNP4 и CNP2.

3.2.1.2.Влияние модулирующих воздействий на уровень иммунореакции.

3.2.2. Иммуногистохимическое окрашивание нервной системы медицинской пиявки на последовательных срезах.

3.3. Идентификация CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе пиявки.

3.3.1. Анализ распределения CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе пиявки и сопоставление с картой расположения нейронов.

3.3.2. Разработка и применение метода относительных автофлуоресцентных ориентиров.

3.3.3. Исследование природы CNP-иммунореактивности в межсегментарных коннективах.

3.3.4. Эксперименты с двойным мечением нейронов пиявки.

3.3.4.1. Двойное мечение нейронов субэзофагеального ганглия.

3.3.4.2. Двойное мечение нейронов других ганглиев.

3.3.5. Идентификация CNP-иммунореактивных нейронов 254, и 227 сегментарных ганглиев.

3.4. Исследование физиологических эффектов пептида CNP4 в нервной системе пиявки.

3.4.1. Аппликация пептида CNP4 в модели сенситизации моносинаптических ответов.

3.4.2. Аппликация пептида CNP4 на полуинтактных препаратах «сердце-мозг».

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Поиск гомологичных CNP полипептидов в белковых фракциях, выделенных из нервной системы беспозвоночных разных типов.

4.2. Поиск CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе медицинской пиявки.

4.2.1. Иммуногистохимическое окрашивание нервной системы медицинской пиявки whole-mount.

4.2.1.1. Исследование различий в уровне иммунореакции при окрашивании антителами к пептидам CNP4 и CNP2.

4.2.1.2. Влияние модулирующих воздействий на уровень иммунореакции.

4.2.2. Иммуногистохимическое окрашивание нервной системы медицинской пиявки на последовательных срезах.

4.3. Идентификация CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе пиявки.

4.3.1. Анализ распределения CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе пиявки и сопоставление с картой расположения нейронов.

4.3.2. Разработка и применение метода относительных автофлуоресцентных ориентиров.

4.3.3. Исследование природы.CNP-иммунореактивности в межсегментарных коннективах.

4.3.4. Эксперименты с двойным мечением нейронов пиявки.

4.3.4.1. Двойное мечение нейронов субэзофагеального ганглия.

4.3.4.2. Двойное мечение нейронов других ганглиев.

4.3.5. Идентификация CNP-иммунореактивных нейронов 254, и 227 сегментарных ганглиев.

4.4. Исследование физиологических эффектов пептида CNP4 в нервной системе пиявки.

4.4.1. Аппликация пептида CNP4 в модели сенситизации моносинаптических ответов.

4.4.2. Аппликация пептида CNP4 на полуинтактных препаратах сердце-мозг».

Введение Диссертация по биологии, на тему "Обнаружение и функциональное исследование нейропептидов, гомологичных пептидам CNP улитки Helix lucorum L., в нервной системе других беспозвоночных"

Наверное, не осталось в биологии такой области, в которой можно было бы пренебречь влиянием эндогенных химических веществ. Однако, во многих направлениях науки о живом ввиду сложности изучаемого объекта описать этот вклад можно только в общем, лишь примерно указав на возможность влияния со стороны генов и неизвестных внутренних факторов. Именно поэтому очень перспективно выглядят исследования в области нейробиологии, изучающей такие сложные феномены, как поведение, обучение или память на клеточном и молекулярном уровне.

На данный момент имеется два методологических подхода к изучению поведения и других сложных функций нервной системы на уровне молекул. Один из успешно развивающихся подходов носит название нейрогенетики и использует методы классической и обратной генетики, такие как картирование хромосом или выведение нокаутных линий животных. Применяя этот подход, исследователи, как правило, изучают корреляции между различными параметрами поведения и генотипом животного. При этом реальные физиологические механизмы, связывающие гены с этологическим фенотипом либо не обсуждаются, либо остаются в области предположений.

Другим принципиальным подходом к изучению поведения является нейробиология. Начинавшаяся с изучения методами клеточной электрофизиологии простейших поведенческих актов на беспозвоночных животных (Kandel and Tauc, 1965), в последние несколько десятилетий эта область с одной стороны впитала в себя методы молекулярной биологии (Boguski and Jones, 2004), а с другой стороны её методы стали применяться для изучения таких сложных явлений, как выбор поведения и механизм принятия решений (Briggman et al., 2005). Так как основой нейробиологии являются физиологические методы, то в рамках этого подхода становится возможным изучение роли отдельных генов и их пептидных продуктов в механизмах реализации сложных функций нервной системы. Образно говоря, современные методы физиологии позволяют построить мостик между генами и поведением.

Наиболее хорошо изученным механизмом, по которому гены влияют на фенотип, является классический путь с образованием полипептидных продуктов путём транскрипции ДНК и последующей трансляции РНК клеточным аппаратом. Белки и пептиды влияют на функции нервной системы непосредственно, являясь нейромедиаторами (инсулин), нейромодуляторами (FMRF-амид), а также рецепторами к ним; будучи включёнными в каскады передачи сигналов (протеинкиназы) или метаболизма классических медиаторов и других нейроспецифичных веществ (ацетилхолинэстераза). Кроме этих, очевидных, путей известны также полипептиды, действующие в нервной системе через другие механизмы, например регуляторы экспрессии генов (CREB, Notch), белки цитоскелета (тубулин) или транспортные белки.

В последнее десятилетие огромное число исследований посвящено изучению локализации и функции эндогенных биоактивных веществ различной природы в ЦНС беспозвоночных животных: моллюсков, нематод, кольчатых червей, насекомых, ракообразных (недавние обзоры: Nusbaum etal., 2001; Homberg, 2002; Nassel, 2002; Skiebe, 2003; Hummon et al., 2005). Значительное место в. этих работах занимает изучение паттернов распределения и механизмов действия нейропептидов.

Вещества этого класса широко распространены в нервных системах различных животных, начиная с диффузной нервной сети таких примитивных организмов, как кишечнополостные (Bosch and Fujisawa, 2001; Anderson etal., 2004) и заканчивая ЦНС человека (Storm and Tecott, 2005). При этом разнообразие нейропептидов позволяет им выполнять широкий диапазон функций в нервной системе. В основном, нейропептиды выбрасываются в синаптическую щель вместе с основным медиатором и играют модулирующую роль — меняют временные или амплитудные параметры постсинаптического ответа, влияют на выброс медиатора из пресинаптической терминали. Кроме того, нейропептиды могут распространяться далеко от места секреции, в таком случае их обычно называют нейрогормонами.

Действуя как модуляторы синаптических связей и нейрогормоны, пептиды участвуют в сложнейших функциях нервной системы и организма в целом. Для примера можно привести пептид NPY, участвующий в организации пищевого поведения у человека (Ramos et al., 2005) или пирокинины, без которых не может пройти развитие насекомых с полным превращением (Ewer, 2005). Нейропептиды могут иметь одинаковую или близкую структуру у беспозвоночных и млекопитающих. Необходимость исследования нейропептидов подчёркивается также тем, что нарушение их нормальной функции лежит в основе некоторых заболеваний нервной системы человека, таких как болезнь Альцгеймера, эпилепсия или симптом гипералгезии (Carro and Torres-Aleman, 2004; Baraban andTallent, 2004; King et al., 2005).

Одной из недавно открытых групп нейропептидов является семейство CNP (Command Neuron Peptides), предсказанное по нуклеотидной последовательности гена HCS2 и после обнаруженное иммунохимическими методами в ЦНС виноградной улитки Helix lucorum L. (Bogdanov et al., 1998; Balaban et al., 2001). Эти пептиды локализованы в нейронах сети оборонительного поведения улитки (ген HCS2 был выделен из командных нейронов этой сети); также недавно было исследовано распределение пептидов CNP в • ЦНС другого моллюска, Aplysia californica (Ierusalimsky etal., 2003). Изучение функций пептидов CNP только началось, однако уже показана их функция в модуляции оборонительной моторной программы, а также нейроростовые свойства (Коршунова и др., 2005). На данный момент неизвестно, ограничивается ли распространение семейства нейропептидов CNP нервной системой моллюсков или они свойственны также нервной системе других беспозвоночных животных.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы является поиск и исследование представителей нового семейства нейропептидов CNP в разных группах беспозвоночных животных. В соответствии с такой, поисковой, целью, в первую очередь необходимо было:

1. Выяснить, являются ли пептиды CNP уникальными для ЦНС улитки, или же гомологичные им пептиды присутствуют также в нервной системе других беспозвоночных животных.

Когда результаты иммуноблотгинга подтвердили предположение о широкой распространённости пептидов семейства CNP, нами были поставлены следующие задачи:

2. Выяснить, какие клетки нервной системы содержат гомологичные CNP пептиды — являются ли эти пептиды неспецифическими маркёрами всех клеток нервной ткани, локализованы в определённых клеточных типах (например, в глии или мотонейронах) или образуют ещё более специфичный паттерн распределения.

3. Провести сравнительный анализ паттерна CNP-иммунореактивных клеток с картами идентифицированных клеток, известными для некоторых беспозвоночных.

4. Охарактеризовать и по возможности идентифицировать CNP-иммунореактивные клетки, которые не обозначены на таких картах.

5. Так как, исходя из структуры, CNP являются секретируемыми пептидами, то возникает задача проверить эффекты аппликации синтетических пептидов CNP на нервную систему в физиологических концентрациях.

Научная новизна работы.

Нами впервые показано широкое распространение пептидов, гомологичных пептидам CNP улитки, в нервной системе беспозвоночных, не принадлежащих к типу Mollusca. Применённая модификация метода иммуноблотгинга с поликлональными антителами к пептидам CNP2 и CNP4 выявила присутствие гомологичных полипептидов в центральных ганглиях Lymnaea stagnalis, Lumbricus terrestris, Drosophila melanogaster и позволила определить их молекулярную массу.

С использованием иммуногистохимической техники окрашивания клеток, в ганглиях центральной и периферической нервной системы медицинской пиявки, Hirudo medicinalis, были впервые обнаружены CNP-иммунореактивные нейроны; на основе анализа большого количества препаратов нами была построена суммарная схема распространения таких нейронов в нервной системе пиявки. В нервной системе пиявки — так же, как и в ЦНС виноградной улитки — паттерн локализации CNP-иммунореактивных нейронов высокоспецифичен: пептиды выявляются в строго определённых кластерах с небольшим количеством идентифицируемых нейронов.

Благодаря правильно выбранному объекту исследования (медицинская пиявка является классической нейробиологической моделью) удалось продолжить исследование CNP-иммунореактивных нейронов и на уровне клеточной физиологии. В работе впервые предпринята попытка выяснить функции CNP-иммунореактивных нейронов и определить мишени биологического действия гомологичных CNP пептидов в организме представителя типа Annelida, пиявки Hirudo medicinalis. Электрофизиологическими методами мы идентифицировали часть нервной сети CNP-иммунореактивных интернейронов 254. В нашем исследовании не было обнаружено влияния пептида CNP4 на фасилитацию двух известных моносинаптических связей. Были показаны тормозные модулирующие эффекты на сердце и возбуждающие его мотонейроны. Существование физиологических эффектов подтверждает выдвинутую нами гипотезу о широком распространении пептидов семейства CNP в нервной системе беспозвоночных животных.

Положения, выносимые на защиту.

3. Синтетический пептид CNP4 оказывает модулирующее тормозное влияние на деятельность сердца пиявки.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Предваряя литературный обзор, хочется предупредить негодование академической читательской аудитории, уже замечающей на этой странице эпиграф, а возможно уже прочитавшей его, забегая вперёд. Дело в том, что мы рискнули параллельно обзору научной литературы по теме диссертации провести обзор художественной литературы, также не обходящей стороной актуальные проблемы биологической науки. Из этого второго литературного обзора были взяты короткие эпиграфы, релевантные подразделам научного обзора. Как нам кажется, редкое вкрапление кусков художественного текста не только не мешает восприятию научного текста, но и наоборот, должно облегчить чтение сухого изложения фактов. Всё же, на всякий случай, для эпиграфов мы старались брать достаточно авторитетные художественные источники, прошедшие испытание временем. Эпиграф на этой странице особенно интересен тем, что здесь в художественной литературе используются научные факты задолго до того, как они получили широкое признание в науке (открытие синаптической химической передачи А. Ф. Самойловым в 1925 году не было воспринято научной общественностью, признавшей существование химических синапсов только после экспериментов Дэйла, опубликованных в 1936 году (Dale etal., 1936)).

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Асеев, Николай Александрович

выводы.

3. Известные по литературе командные нейроны локомоции пиявки Trl, Тг2 и R3bl не являются CNP-иммунореактивными.

5. Синтетический пептид CNP4 не оказывает модулирующего действия на фасилитацию двух известных моносинаптических связей N-AE hN-CV.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Стоя на большом железном мосту, я бросил в реку двухкопеечную деньгу, сказав: «Нужно заботиться о науке будущего». Кто тот учёный рекокоп, кто найдёт жертву реке?

Вел. Хл., «Ка», 1915.

Полученные в настоящей работе результаты гармонично дополняют имеющиеся литературные данные о распространении в животном мире, локализации в нервной системе и физиологических функциях нейропептидов семейства CNP. Необходимо отметить, что изучение пептидов CNP имеет своей целью не одно только расширение знаний об этом конкретном семействе пептидов; как и любое фундаментальное исследование, оно вносит вклад в решение общих задач биологии.

Другим интересным фактом, позволяющим обобщение, является показанное нами кластерное, повторяющееся от препарата к препарату, распределение пептидов CNP в нервной системе пиявки. Многие нейроспецифичные вещества распределены по такому же принципу, притом в некоторых случаях даже понятно функциональное значение такого распределения (например, дофаминергические клетки в ядрах ствола мозга позвоночных — substantia nigra). Мы считаем, что данные о строгом распределении биологически активных веществ аргументируют концепцию идентифицируемых нейронов (в современном её прочтении). Первоначальный вариант нейронной концепции был сформулирован Рамон-и-Кахалем, в противовес ретикулярной теории, предложенной Камилло Гольджи. С точки зрения ретикулярной теории, отдельные нервные клетки равноправны и дают ничтожный вклад в функционирование целой нервной сети. Напротив, само название концепции идентифицируемых нейронов подразумевает возможность идентифицировать, описать нейрон по свойствам, которыми обладает только он.

Крайним вариантом применения концепции идентифицируемых нейронов, наверное, являются «клетки моей бабушки» — нейроны способные кодировать сложные стимулы, целые образы — такие, например, как образ хищника для грызунов и птиц. Роль и сама идея существования гностических нейронов вызвала бурные обсуждения в конце 60-х годов XX века (Конорский, Барлоу, Леттвин и другие). Однако наибольшее распространение концепция идентифицируемых нейронов получила в нейробиологических работах 70-х, когда стало ясно, что для реализации многих видов поведения беспозвоночных животных достаточно активировать всего одну клетку (командный нейрон этого вида поведения). Термин «командный нейрон» введён в обиход нейробиологов Вирсмой, а его критерии и классическое определение концепции теперь она называлась концепцией командного нейрона) были даны Купферманном и Вейссом в 1978 году. На современном этапе развития науки спор о распределении функций между элементами нервной системы, начатый Гольджи и Кахалем, продолжается на новом уровне, между сторонниками теории клеточных ансамблей (Miguel A. Nicolelis, Gyorgy Buzsaki и другие) и теории оркестрирования (основатель Graham Hoyle, сторонники теории: С. J. Н. Elliott, Hans J. Pflueger, Eve Marder и другие). Хотя теория оркестрирования рассматривает вопрос управления в нервных сетях с иных позиций, чем концепция командного нейрона, в последнее время наметилась тенденция к объединению этих двух теорий в одну (Kupfermann and Weiss, 2001)

В более широком аспекте, применительно ко всем типам нейронов, соотношение химической специфичности и функциональной специализации было проанализировано Д. А. Сахаровым (Сахаров, 1974). Противопоставляя функциональную и генетическую гипотезы происхождения нейронов, Д. А. Сахаров приходит к выводу, что нейроны, использующие определённый медиатор, могут иметь совершенно разные функции. В первую очередь это связано с эволюцией постсинаптического механизма— рецепторных белков и других элементов каскада передачи сигнала. Однако, в ряду гомологичных нейронов, таких например, как гигантские метацеребральные клетки моллюсков, наблюдается единство функций. Гомология этих нейронов прослежена в представителях разных надотрядов моллюсков и везде их активирующее действие связано с медиатором серотонином. Интересно, что у других типов :, животных аналогичная функция также связана с моноаминами: у насекомых с октопамином, а у позвоночных с дофамином.

Известную путаницу в картину медиаторной специфичности вносит множественность медиаторов. Довольно давно известно, что каждое синаптическое окончание содержит множество физиологически активных веществ, выбрасывающихся локально в синаптическую щель или распространяющихся в организме более широко. При этом окончательный физиологический эффект зависит как от рецепторов-мишеней, так и от комбинации медиаторов, среди которых важную роль играют вещества пептидной природы. Учитывая большое разнообразие нейропептидов, становится очевидной необходимость их изучения для решения вопроса о соотношении функции нейрона и его химической специфичности.

Пожалуй, не будет преувеличением сказать, что до полного понимания вклада медиаторной специфичности в функциональную специализацию нейрона ещё очень далеко. В то же время ясно, что это ключевой вопрос концепции идентифицируемых нейронов на данных момент. Практически все нейробиологи сейчас так или иначе пытаются понять, каким образом в нервной системе сочетаются химическое кодирование сигнала и система связей между нейронами. Пока оптимального баланса, логично объясняющего всё наблюдаемое разнообразие паттернов физиологически активных веществ и распределение функций в нервной системе не найдено.

Подведём общий итог. Одной из глобальных задач нейробиологии является изучение физиологических механизмов, связывающих гены и поведение. В настоящей работе, усилия были сконцентрированы на исследовании функций нейронов с определённой химической специфичностью — содержащих нейропептиды семейства CNP. Было продемонстрировано, что пептиды этого семейства распределены сходным образом в нервных системах животных, принадлежащих к разным таксономическим типам и что по крайней мере какая-то часть функций нейропептидов семейства CNP может быть общей у разных животных. В основе работы лежит концепция идентифицируемых нейронов и её более поздние надстройки; мы полагаем, что полученные результаты поддерживают и развивают эти теоретические построения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Асеев, Николай Александрович, Москва

1. Ашмарин и др. Нейрохимия: Учебник для биологических и медицинских

2. ВУЗов. /Под ред. акад. РАМН И. П. Ашмарина и проф. П. В. Стукалова. — Москва: Изд-во Института биомедицинской химии РАМН, 1996. — 470 с.

3. Балабан П. М. Сенситизация и привыкание в командных нейронахоборонительного рефлекса виноградной улитки //Журнал Высшей Нервной Деятельности 1978. - Т. 28, № 2. - С. 356-363.

4. Догель В. А. Зоология беспозвоночных: Учебник для университетов.

5. Под ред. проф. Полянского Ю. И. — 7-е изд. — М: Высш. школа, 1981. 606 с.

6. Коршунова Т. А., Малышев А. Ю., Захаров И. С., Иерусалимский В. Н.,

7. Балабан П. М. Функции пептида CNP4, кодируемого геном HSC2, в нервной системе Helix lucorum //Журнал высшей нервной деятельности 2005. - Т. 55, № 1. - С. 91-99.

8. Кэндел Э. Клеточные основы поведения. — М.: Мир, 1980.

9. Максимова О. А., Балабан П. М. Нейронные механизмы пластичностиповедения. — Москва: Наука, 1983.

10. Ноздрачев А. Д., Поляков Е. Л., Лапицкий В. П. Анатомиябеспозвоночных: пиявка, прудовик, дрозофила, таракан, рак. (Лабораторные животные). — Москва: Лань, 1999.

11. Сахаров Д. А. Генеалогия нейронов. — Москва: Наука, 1974.

12. Anderson P. A., Thompson L. F., Moneypenny С. G. Evidence for a commonpattern of peptidergic innervation of cnidocytes //Biol Bull 2004. -Vol. 207 (2).-Pp. 141-146.

13. Angstadt J. D., Friesen W. O. Modulation of swimming behaviorin the medicinal leech. II. Ionic conductances underlying serotonergic modulation of swim-gating cell 204 //J Comp Physiol A. 1993a. -Vol. 172 (2).-Pp. 235-248.

14. Angstadt J. D., Friesen W. O. Modulation of swimming behaviorin the medicinal leech. I. Effects of serotonin on the electrical properties of swim-gating cell 204 //J Comp Physiol A. 1993b. - Vol. 172 (2). -Pp. 223-234.

15. Balaban P. M. Sensitization and habituation in command neuronsof the defensive reflex in Helix lucorum //Neurosci. Behav. Physiol. 1980. Vol. 10 (4).-Pp. 340-345.

16. Balaban P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail

17. Neurosci Biobehav Rev 2002. - Vol. 26 (5). - Pp. 597-630.

18. Balaban P. M., Poteryaev D. A., Zakharov I. S., Uvarov P., Malyshev A.,

19. Belyavsky A. V. Up- and down-regulation of Helix command-specific 2 (HCS2) gene expression in the nervous system of terrestrial snail Helix lucorum //Neuroscience 2001. - Vol. 103 (2). - Pp. 551-559.

20. Baraban S. C., Tallent M. K. Interneuron Diversity series: Interneuronalneuropeptides — endogenous regulators of neuronal excitability //Trends Neurosci 2004. - Vol. 27 (3). - Pp. 135-142.

21. Benjamin P. R., Rose R. M. Central generation of bursting in the feedingsystem of the snail, Lymnaea stagnalis //J. Exp. Biol. 1979. - Vol. 80. -Pp. 93-118.

22. Bi G. Q., Rubin J. Timing in synaptic plasticity: from detection to integration

23. Trends Neurosci 2005. - Vol. 28 (5). - Pp. 222-228.

24. Bogdanov Y. D., Balaban P. M., Poteryaev D. A., Zakharov I. S., Belyavsky A.

25. V. Putative neuropeptides and an EF-hand motif region are encoded by a novel gene expressed in the four giant interneurons of the terrestrial snail //Neuroscience 1998. - Vol. 85 (2). - Pp. 637-647.

26. Boguski M. S., Jones A. R. Neurogenomics: at the intersection of neurobiologyand genome sciences //Nat Neurosci 2004. - Vol. 7 (5). - Pp. 429-433.

27. Bosch Т. C., Fujisawa T. Polyps, peptides and patterning //Bioessays 2001.1. Vol. 23 (5).-Pp. 420-427.

28. Briggman К. L., Abarbanel H. D. I., Kristan W. В., Jr. Optical imaging ofneuronal populations during decision-making //Science 2005. -Vol. 307.-Pp. 896-901.

29. Brodfuehrer P. D., Debski E. A., O'Gara B. A., Friesen W. O. Neuronal controlof leech swimming //J Neurobiol 1995. - Vol. 27 (3). - Pp. 403-418.

30. Brodfuehrer P. D., Friesen W. O. From stimulation to undulation: a neuronalpathway for the control of swimming in the leech //Science 1986a. -Vol. 234.-Pp. 1002-1004.

31. Brodfuehrer P. D., Friesen W. O. Initiation of swimming activity by triggerneurons in the leech subesophageal ganglion. III. Sensory inputs to Trl and Tr2 //J Comp Physiol A. 1986b. - Vol. 159 (4). - Pp. 511-519.

32. Brodfuehrer P. D., Friesen W. O. Initiation of swimming activity by triggerneurons in the leech subesophageal ganglion. II. Role of segmental swim-initiating interneurons //J Comp Physiol A. 1986c. - Vol. 159 (4). -Pp. 503-510.

33. Brodfuehrer P. D., Friesen W. O. Initiation of swimming activity by triggerneurons in the leech subesophageal ganglion. I. Output connections of Trl and Tr2 //J Comp Physiol A. 1986d. - Vol. 159 (4). - Pp. 489-502.

34. Brusca R. C., Brusca G. J. Invertebrates. — 2nd ed. — Sunderland, MA, USA:1. Sinauer Press, 2002.

35. Cacciatore T. W., Brodfuehrer P. D., Gonzalez J. E., Jiang Т., Adams S. R.,

36. Tsien R. Y., Kristan W. В., Jr., Kleinfeld D. Identification of neural circuits by imaging coherent electrical activity with FRET-based dyes //Neuron 1999. - Vol. 23 (3). - Pp. 449-459.

37. Calabrese R. L. The roles of endogenous membrane properties and synapticinteraction in generating the heartbeat rhythm of the leech, Hirudo medicinalis //J Exp Biol 1979. - Vol. 82. - Pp. 163-176.

38. Calabrese R. L., Nadim F., Olsen О. H. Heartbeat control in the medicinalleech: a model system for understanding the origin, coordination, and modulation of rhytmic motor patterns //J Neurobiol 1995. - Vol. 27. -Pp. 390-402.

39. Cang J., Friesen W. O. Sensory modification of leech swimming: rhythmicactivity of ventral stretch receptors can change intersegmental phase relationships //J Neurosci 2000. - Vol. 20 (20). - Pp. 7822-7829.

40. Cang J., Friesen W. O. Model for intersegmental coordination of leechswimming: central and sensory mechanisms //J Neurophysiol 2002. -Vol. 87 (6). - Pp. 2760-2769.

41. Cang J., Yu X., Friesen W. O. Sensory modification of leech swimming:interactions between ventral stretch receptors and swim-related neurons //J Comp Physiol A. 2001. - Vol. 187.(7). - Pp. 569-579.

42. Carro E., Torres-Aleman I. The role of insulin and insulin-like growth factor Iin the molecular and cellular mechanisms underlying the pathology of Alzheimer's disease //Eur J Pharmacol 2004. - Vol. 490 (1-3). -Pp. 127-133.

43. Chen M. L., Muneoka Y., Walker R. J. Actions of a small cardioactive peptidefrom Mytilus, APNFLAYPRLamide, on central neurones of Helix aspersa //Gen Pharmacol 1995. - Vol. 26 (2). - Pp. 273-283.

44. Clancy В., Cauller L. J. Reduction of background autofluorescence in brainsections following immersion in sodium borohydride //J Neurosci Methods -1998.-Vol. 83 (2).-Pp. 97-102.

45. Conlon J. M., Larhammar D. The evolution of neuroendocrine peptides

46. Gen Comp Endocrinol 2005. - Vol. 142 (1-2). - Pp. 53-59.

47. Cottrell G. A., Davies N. W. Multiple receptor sites for a molluscan peptide

48. FMRFamide) and related peptides of Helix //J Physiol 1987. - Vol. 382. -Pp. 51-68.

49. Cowan W. M. The Emergence of Modern Neuroanatomy and Developmental

50. Neurobiology //Neuron 1998. - Vol. 20. - Pp. 413-426.

51. Crisp К. M., Klukas K. A., Gilchrist L. S., Nartey A. J., Mesce K. A.

52. Distribution and development of dopamine- and octopamine-synthesizing neurons in the medicinal leech //J Comp Neurol 2002. - Vol. 442 (2). -Pp. 115-129.

53. Crisp K. M., Mesce K. A. To swim or not to swim: regional effects ofserotonin, octopamine and amine mixtures in the medicinal leech //J Comp

54. Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol 2003. - Vol. 189 (6). -Pp. 461-470.

55. Crisp К. M., Mesce K. A. A cephalic projection neuron involved in locomotionis dye coupled to the dopaminergic neural network in the medicinal leech //J Exp Biol 2004. - Vol. 207 (Pt 26). - Pp. 4535-4542.

56. Cropper E. C., Lloyd P. E., Reed W., Tenenbaum R., Kupfermann I., Weiss K.

57. R. Multiple neuropeptides in cholinergic motor neurons of Aplysia: evidence for modulation intrinsic to the motor circuit //Proc Natl Acad Sci U S A -1987a. Vol. 84 (10). - Pp. 3486-3490.

58. Cropper E. C., Tenenbaum R., Kolks M. A., Kupfermann I., Weiss K. R.

59. Myomodulin: a bioactive neuropeptide present in an identified cholinergic buccal motor neuron of Aplysia //Proc Natl Acad Sci U S A 1987b. -Vol. 84 (15). - Pp. 5483-5486.

60. Dale B. Blood pressure and its hydraulic function in Helix pomatia L

61. J Exp Biol 1973. - Vol. 59 (2). - Pp. 477-490.

62. Dale B. Extrusion, retraction and respiratory movements in Helix pomatia inrelation to distribution and circulation of the blood //J Zool 1974. -Vol. 173 (3).-Pp. 427-439.

63. Dale H., Feldberg W., Fogt M. Release of aceticholine at voluntary motornerve endings //J Physiol (Lond.) 1936. - Vol. 86. - Pp. 353-380.

64. De la Lande I. S., Waterson J. G. Modification of autofluorescence in theformaldehyde-treated rabbit ear artery by Evans blue //J Histochem Cytochem- 1968.-Vol. 16 (4).-Pp. 281-282.

65. Dockray G. J., Vaillant C., Williams R. G., Gayton R. J., Osborne N. N.

66. Vertebrate brain-gut peptides related to FMRFamide and Met-enkephalin Arg6Phe7 //Peptides 1981. - Vol. 2 Suppl 2. - Pp. 25-30.

67. Duan Y., Panoff J., Burrell B. D., Sahley C. L., Muller K. J. Repair and

68. Regeneration of Functional Synaptic Connections: Cellular and Molecular Interactions in the Leech //Cellular and Molecular Neurobiology 2005. -Vol. 25 (2).-Pp. 441-450.

69. Esch Т., Mesce K. A., Kristan W. B. Evidence for sequential decision makingin the medicinal leech //J Neurosci 2002. - Vol. 22 (24). -Pp. 11045-11054.

70. Evans В. D., Pohl J., Kartsonis N. A., Calabrese R. L. Identification of

71. RFamide neuropeptides in the medicinal leech //Peptides 1991. -Vol. 12 (5).-Pp. 897-908.

72. Ewer J. Behavioral actions of neuropeptides in invertebrates: insights from

73. Drosophila IIHorm Behav 2005. - Vol. 48 (4). - Pp. 418-429.

74. Fan R. J., Marin-Burgin A., French K. A., Otto Friesen W. A dye mixture

75. Neurobiotin and Alexa 488) reveals extensive dye-coupling among neurons in leeches; physiology confirms the connections //J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol 2005. - Pp. 1-15.

76. Friesen W. O., Pearce R. A. Mechanisms of intersegmental coordination inleech locomotion //The Neurosciences 1993. - Vol. 5. - Pp. 41-47.

77. Fujisawa Y., Kubota I., Nomoto K., Minakata H., Yasuda-Kamatani Y., Ikeda

78. Т., Muneoka Y. A Mytilus peptide related to the small cardioactive peptides (SCPs): structure determination and pharmacological characterization //Comp Biochem Physiol С 1993a. - Vol. 104 (3). - Pp. 469-475.

79. Fujisawa Y., Ikeda Т., Takahashi Т., Furukawa Y., Muneoka Y., Matsumoto

80. S., Kuniyoshi H., Suzuki A. Effects of several peptides with Pro-Arg-Leu-NH2 C-terminal sequence on invertebrate muscles //Comp Biochem Physiol С 1993b. - Vol. 105 (3). - Pp. 471-477.

81. Gillis M. A., Anctil M. Monoamine release by neurons of a primitive nervoussystem: an amperometric study Hi Neurochem 2001. - Vol. 76 (6). -Pp. 1774-1784.

82. Gisselmann G., Plonka J., Pusch H., Hatt H. Drosophila melanogaster GRDand LCCH3 subunits form heteromultimeric GABA-gated cation channels //Br J Pharmacol 2004. - Vol. 142 (3). - Pp. 409-413.

83. Greenberg M. J., Price D. A. Relationships among the FMRFamide-likepeptides //Prog Brain Res 1992. - Vol. 92. - Pp. 25-37.

84. Grimmelikhuijzen C. J., Westfall J. A. The nervous systems of cnidarians. In:

85. The nervous system of invertebrates: an evolutionary and comparative approach. /О. Breidbach and W. Kutsch — Basel: Birkhauser, 1995. — Pp. 7-24.

86. Gustafsson M. К., Halton D. W., Kreshchenko N. D., Movsessian S. O.,

87. Raikova О. I., Reuter M., Terenina N. B. Neuropeptides in flatworms //Peptides 2002. - Vol. 23 (11). - Pp. 2053-2061.

88. Holmgren S., Jensen J. Evolution of vertebrate neuropeptides //Brain Res Bull 2001. - Vol. 55 (6). - Pp. 723-735.

89. Homberg U. Neurotransmitters and neuropeptides in the brain of the locust

90. Microsc Res Tech 2002. - Vol. 56 (3). - Pp. 189-209.

91. Hoyle С. H. Neuropeptide families and their receptors: evolutionaryperspectives //Brain Res 1999. - Vol. 848 (1-2). - Pp. 1-25.

92. Hummon А. В., Amare A., Sweedler J. V. Discovering new invertebrateneuropeptides using mass spectrometry //Mass Spectrom Rev — 2005. -in press.

93. Ierusalimsky V. N., Boguslavsky D. V., Belyavsky A. V., Balaban P. M. Helixpeptide immunoreactivity pattern in the nervous system of juvenile Aplysia //Brain Res Mol Brain Res 2003. - Vol. 120 (1). - Pp. 84-89.

94. Kandel E. R., Tauc L. Heterosynaptic facilitation in neurones of the abdominalganglion of Aplysia depilans Hi Physiol 1965. - Vol. 181 (1). - Pp. 1-27.

95. Keating H. H., Sahley C. L. Localization of the myomodulin-likeimmunoreactivity in the leech CNS //J Neurobiol 1996. - Vol. 30 (3). -Pp. 374-384.

96. King Т., Gardell L. R., Wang R., Vardanyan A., Ossipov M. H., Malan T. P.,

97. Jr., Vanderah T. W., Hunt S. P., Hruby V. J., Lai J., Porreca F. Role of NK-1 neurotransmission in opioid-induced hyperalgesia //Pain 2005. -Vol. 116(3).-Pp. 276-288.

98. Kristan W. В., Jr., Calabrese R. L. Rhythmic swimming activity in neurones ofthe isolated nerve cord of the leech //J Exp Biol 1976. - Vol. 65 (3). -Pp. 643-668.

99. Kristan W. В., Jr., Calabrese R. L., Friesen W. O. Neuronal control of leechbehavior //Prog Neurobiol 2005. - in press.

100. Kristan W. В., Skalak R., Wilson R. J. A., Skierczynski B. A., Murray J. A.,

101. Eisenhart F. J., Cacciatore T. W. Biomechanics of hydroskeletons, lessonslearned from studies of crawling in the medicinal leech. — New York: Springer-Verlag, 2000.

102. Kuffler S. W., Potter D. D. Glia in the Leech Central Nervous System:

103. Physiological Properties and Neuron-Glia Relationship //J Neurophysiol 1964. - Vol. 27. - Pp. 290-320.

104. Kuhlman J. R., Li C., Calabrese R. L. FMRF-amide-like substances in theleech. I. Immunocytochemical localization //J Neurosci 1985. - Vol. 5 (9). -Pp. 2301-2309.

105. Kupfermann I., Weiss K. R. The command neuron concept //Behav. Brain Sci.- 1978.-Vol.1.-Pp. 3-39.

106. Li C., Calabrese R. L. FMRFamide-like substances in the leech. III.

107. Biochemical characterization and physiological effects //J Neurosci 1987. Vol. 7 (2).-Pp. 595-603.

108. Marder E., Richards K. S. Development of the peptidergic modulation of arhythmic pattern generating network //Brain Res 1999. - Vol. 848 (1-2). -Pp. 35-44.

109. Masino M. A., Calabrese R. L. Period differences between segmentaloscillators produce intersegmental phase differences in the leech heartbeat timing network //J Neurophysiol 2002. - Vol. 87 (3). - Pp. 1603-1615.

110. Morishita F., Minakata HTakeshige K., Furukawa Y., Takata Т., Matsushima

111. O., Mukai S. Т., Saleuddin A. S., Horiguchi T. Novel excitatory neuropeptides isolated from a prosobranch gastropod, Thais clavigera: The molluscan counterpart of the annelidan GGNG peptides //Peptides 2005. -in press.

112. Muller K. J., Nicholls J. G. Different properties of synapses between a singlesensory neurone and two different motor cells in the leech C.N.S /ЯPhysiol 1974.-Vol. 238 (2).-Pp. 357-369.

113. Neurobiology of the leech /Edited by Muller K. J., Nicholls J. G., Stent G. S.

114. NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1981.

115. Muneoka Y., Morishita F., Furukawa Y., Matsushima O., Kobayashi M.,

116. Ohtani M., Takahashi Т., Iwakoshi E., Fujisawa Y., Minakata H. Comparative aspects of invertebrate neuropeptides //Acta Biol Hung 2000. Vol.51 (2-4).-Pp. 111-132.

117. Nadim F., Calabrese R. L. A slow outward current activated by FMRFamide inheart interneurons of the medicinal leech //J Neurosci 1997. - Vol. 17 (11). -Pp. 4461-4472.

118. Nassel D. R. Neuropeptides in the nervous system of Drosophila and otherinsects: multiple roles as neuromodulators and neurohormones //Prog Neurobiol 2002. - Vol. 68 (1). - Pp. 1-84.

119. Nicholls J., Wallace B. G. Modulation of transmission at an inhibitory synapsein the central nervous system of the leech //J Physiol 1978. - Vol. 281. — Pp. 157-170.

120. Nicholls J. G., Baylor D. A. Specific modalities and receptive fields of sensoryneurons in CNS of the leech //J Neurophysiol 1968. - Vol. 31 (5). -Pp. 740-756.

121. Nicholls J. G., Purves D. Monosynaptic chemical and electrical connexionsbetween sensory and motor cells in the central nervous system of the leech //J Physiol. 1970. - Vol. 209 (3). - Pp. 647-667.

122. Nicholls J. G., Purves D. A comparison of chemical and electrical synaptictransmission between single sensory cells and a motoneurone in the central nervous system of the leech //J Physiol. 1972. - Vol. 225 (3). -Pp. 637-656.

123. Nusbaum M. P., Blitz D. M., Swensen A. M., Wood D., Marder E. The roles ofco-transmission in neural network modulation //Trends Neurosci 2001. -Vol. 24 (3).-Pp. 146-154.

124. Nusbaum M. P., Kristan W. В., Jr. Swim initiation in the leech by serotonincontaining interneurones, cells 21 and 61 //J Exp Biol 1986. - Vol. 122. -Pp. 277-302.

125. O'Gara B. A., Chae H., Latham L. В., Friesen W. O. Modification of leechbehavior patterns by reserpine-induced amine depletion //J Neurosci 1991. Vol. 11(1).-Pp. 96-110.

126. O'Gara B. A., Friesen W. O. Termination of leech swimming activity by apreviously identified swim trigger neuron //J Comp Physiol A. 1995. -Vol. 177 (5).-Pp. 627-636.

127. Olsen О. H., Calabrese R. L. Activation of intrinsic and synaptic currents inleech heart interneurons by realistic waveforms //J Neurosci 1996. -Vol. 16 (16). - Pp. 4958-4970.

128. Opdyke C. A., Calabrese R. L. Outward currents in heart motor neurons of themedicinal leech //J Neurophysiol 1995. - Vol. 74 (6). - Pp. 2524-2537.

129. Ort C. A., Kristan W. В., Jr., Stent G. S. Neuronal control swimming in theleech. II. Identification and connection of the motor neurons //J. Comp. Physiol. 1974. - Vol. 94. - Pp. 121-154.

130. Pearce R. A., Friesen W. O. A model for intersegmental coordination in theleech nerve cord //Biol Cybern 1988. - Vol. 58 (5). - Pp. 301-311.

131. Price D. A., Greenberg M. J. Structure of a molluscan cardioexcitatoryneuropeptide //Science 1977. - Vol. 197 (4304). - Pp. 670-671.

132. Prosser C. L., Zimmerman G. L. Effects of drugs on the hearts of Arenicolaand Lumbricus. //Physiol. Zool. 1934. - Vol. 16. - Pp. 77-83.

133. Raffa R. B. The actions of FMRF-NH2 and FMRF-NH2 related peptides onmammals //NIDA Res Monogr- 1991. Vol. 105. - Pp. 243-249.

134. Ramos E. J., Meguid M. M., Campos A. C., Coelho J. C. Neuropeptide Y,alpha-melanocyte-stimulating hormone, and monoamines in food intake regulation //Nutrition 2005. - Vol. 21 (2). - Pp. 269-279.

135. Retzius M. G. Biologische Untersuchungen Neue Folge II. — Stockholm:1. Sampson and Wallin, 1891.

136. Roeder T. Octopamine in invertebrates //Prog Neurobiol 1999. -Vol. 59 (5).-Pp. 533-561.

137. Samarova E. I., Bravarenko N. I., Korshunova T. A., Gulyaeva N. V., Palotas

138. A., Balaban P. M. Effect of beta-amyloid peptide on behavior and synaptic plasticity in terrestrial snail //Brain Res Bull 2005. - Vol. 67 (1-2). -Pp. 40-45.

139. Schmidt J., Calabrese R. L. Evidence that acetylcholine is an inhibitory transmitter of heart interneurons in the leech //J Exp Biol 1992. -Vol. 171.-Pp. 329-347.

140. Schmidt J., Gramoll S., Calabrese R. L. Segment-specific effects of FMRFamide on membrane properties of heart interneurons in the leech //J Neurophysiol 1995. - Vol. 74 (4). - Pp. 1485-1497.

141. Shafer M. R., Calabrese R. L. Similarities and differences in the structure ofsegmentally homologous neurons that control the hearts of the leech, Hirudo medicinalis //Cell Tissue Res 1981. - Vol. 214 (1). - Pp. 137-153.

142. Shaw В. K., Kristan W. В., Jr. The whole-body shortening reflex of the medicinal leech: motor pattern, sensory basis, and interneuronal pathways //J Comp Physiol A. 1995. - Vol. 177 (6). - Pp. 667-681.

143. Shaw В. K., Kristan W. В., Jr. The neuronal basis of the behavioral choicebetween swimming and shortening in the leech: control is not selectively exercised at higher circuit levels //J Neurosci 1997. - Vol. 17 (2). -Pp. 786-795.

144. Simon T. W., Opdyke C. A., Calabrese R. L. Modulatory effects of FMRF

145. NH2 on outward currents and oscillatory activity in heart interneurons of the medicinal leech //J Neurosci 1992. - Vol. 12 (2). - Pp. 525-537.

146. Simon T. W., Schmidt J., Calabrese R. L. Modulation of high-threshold transmission between heart interneurons of the medicinal leech by FMRF-NH2 //J Neurophysiol 1994. - Vol. 71 (2). - Pp. 454-466.

147. Skiebe P. Neuropeptides in the crayfish stomatogastric nervous system //Microsc Res Tech 2003. - Vol. 60 (3). - Pp. 302-312.

148. Sommerville B. A. The circulatory physiology of Helix pomatia. I. Observations on the mechanism by which Helix emerges from its shell and on the effects of body movement on cardiac function //J Exp Biol 1973. -Vol. 59 (2). - Pp. 275-282.

149. Stent G. S., Kristan W. В., Jr., Torrence S. A., French K. A., Weisblat D. A.

150. Development of the leech nervous system //Int Rev Neurobiol 1992. -Vol. 33.-Pp. 109-193.

151. Stent G. S., Thompson W. J., Calabrese R. L. Neural control of heartbeat inthe leech and in some other invertebrates //Physiol Rev 1979. -Vol. 59(1).-Pp. 101-136.

152. Storm E. E., Tecott L. H. Social circuits: peptidergic regulation of mammaliansocial behavior //Neuron 2005. - Vol. 47 (4). - Pp. 483-486.

153. Stuart A. E. Excitatory and inhibitory motoneurons in the central nervous system of the leech //Science 1969. - Vol. 165 (895). - Pp. 817-819.

154. Stuart A. E. Physiological and morphological properties of motoneurones inthe central nervous system of the leech //J Physiol 1970. - Vol. 209 (3). -Pp. 627-646.

155. Stuart A. E., Hudspeth A. J., Hall Z. W. Vital staining of specific monoaminecontaining cells in the leech nervous system //Cell Tissue Res 1974. -Vol. 153(1).-Pp. 55-61.

156. Taghert P. H., O'Brien M. A., Schneider L. E., Roberts M. S. Moleculargenetic analysis of the FMRFamide-related neuropeptides m. Drosophila //Prog Brain Res 1992. - Vol. 92. - Pp. 163-174.

157. Taylor A. L., Cottrell G. W., Kleinfeld D., Kristan W. В., Jr. Imaging revealssynaptic targets of a swim-terminating neuron in the leech CNS //J Neurosci 2003. - Vol. 23 (36). - Pp. 11402-11410.

158. Tobin A. E., Calabrese R. L. Myomodulin increases ih and inhibits the na/kpump to modulate bursting in leech heart interneurons //J Neurophysiol -2005. Vol. 94 (6). - Pp. 3938-3950.

159. Waller A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations produced thereby in the structure of the primitive fibres. //J, Anat. Lond. 1850. -Vol. 87 - Pp. 387—406.

160. Wang W. Z., Ernes R. D., Christoffers K., Verrall J., Blackshaw S. E. Hirudomedicinalis: a platform for investigating genes in neural repair //Cell Mol Neurobiol 2005. - Vol. 25 (2). - Pp. 427-440.

161. Wang Y., Price D. A., Sahley C. L. Identification and characterization of amyomodulin-like peptide in the leech //Peptides 1998. - Vol. 19 (3). -Pp. 487-493.

162. Wang Y., Strong J. A., Sahley C. L. Modulatory effects of myomodulin onthe excitability and membrane currents in Retzius cells of the leech //J Neurophysiol 1999. - Vol. 82 (1). - Pp. 216-225.

163. Weatherill D., Chase R. Modulation of heart activity during withdrawal reflexes in the snail Helix aspersa //J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol 2005. - Vol. 191 (4). - Pp. 355-362.

164. Wenning A., Cymbalyuk G. S., Calabrese R. L. Heartbeat control in leeches.

165. Constriction pattern and neural modulation of blood pressure in intact animals //J Neurophysiol 2004a. - Vol. 91 (1). - Pp. 382-396.

166. Wenning A., Hill A. A., Calabrese R. L. Heartbeat control in leeches. II.

167. Fictive motor pattern //J Neurophysiol 2004b. - Vol. 91 (1). -Pp. 397-409.

168. Wiersma C., Ikeda K. Interneurons commanding swimmeret movements inthe crayfish Procambarus clarkii (Girard) //Comp Biochem Physiol 1964. Vol. 12.-Pp. 509-525.

169. Wilson R. J., Kristan W. В., Jr., Kleinhaus A. L. An increase in activity ofserotonergic Retzius neurones may not be necessary for the consummatory phase of feeding in the leech Hirudo medicinalis Hi Exp Biol — 1996. -Vol. 199 (6).-Pp. 1405-1414.

170. Wrenn С. C., Marriott L. K., Kinney J. W., Holmes A., Wenk G. L., Crawley

171. J. N. Galanin peptide levels in hippocampus and cortex of galanin-overexpressing transgenic mice evaluated for cognitive performance //Neuropeptides 2002. - Vol. 36 (6). - Pp. 413-426.

172. Yau K. W. Physiological properties and receptive fields of mechanosensoryneurones in the head ganglion of the leech: comparison with homologous cells in segmental ganglia //J Physiol 1976a. - Vol. 263 (3). - Pp. 489-512.

173. Yau K. W. Receptive fields, geometry and conduction block of sensory neurones in the central nervous system of the leech //J Physiol 1976b. -Vol. 263 (3). -Pp. 513-538.

174. Zhang J., Campbell R. E., Ting A. Y., Tsien R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology //Mol Cell Biol 2002. - Vol. 3. - Pp. 906-918.1. БЛАГОДАРНОСТИ.

175. Я хочу поблагодарить к. б. н. Наталью Пасикову, учившую меня работать на микротоме. Я благодарен к. б. н. Дмитрию Воронцову, чей живой интерес к работе способствовал бесконечным переработкам и улучшениям текста.

Информация о работе

Асеев, Николай Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.13

Диссертация

Обнаружение и функциональное исследование нейропептидов, гомологичных пептидам CNP улитки Helix lucorum L., в нервной системе других беспозвоночных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы