Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация и характеристика биологических свойств белков суперсемейства иммуноглобулинов животных

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и характеристика биологических свойств белков суперсемейства иммуноглобулинов животных"

На правах рукописи

ЕЗДАКОВА ИРИНА ЮРЬЕВНА

Идентификация и характеристика биологических свойств белков суперсемейства иммуноглобулинов

животных

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2010

- 2 ПРЧ 7П10

004615632

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии)

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Верховский Олег Анатольевич.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Поляков Виктор Филиппович

доктор медицинских наук, профессор Булычева Татьяна Ивановна;

доктор биологических наук Власова Наталья Никифоровна.

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии»

Защита диссертации состоится ч. /^/ у> 20/Уг. в

часов на заседании диссертационного совета Д" 006.033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии по адресу: 109428, Москва, Рязанский проспект,24,к.1,ВИЭВ, тел. (495) 970-03-69.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Россельхозакадемии

Автореферат разослан « /¿? » /клсь-^л^ 2010 г.

ГНУ ВИЭВ

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор ветеринарных наук, профессор

айманов А.Х.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В основе научного прогресса лежит эволюция методических приемов, используемых для решения современных задач иммунологии. Внедрение новой методологии, совершенствование методов исследования - главный фактор повышения уровня знаний в области молекулярной биологии иммунного ответа, где ключевую роль играют антитела, рецепторы иммунокомпетентных клеток, межклеточные взаимодействия.

Механизмы врожденного и адаптивного иммунитета основаны на межклеточной кооперации трех основных популяций лейкоцитов: макрофагов, Т- и B-лимфоцитов, которые на разных этапах онто- и иммуногенеза включаются в иммунные реакции, причем доля их участия зависит от вида инфекции (Цинкернагель Р., 2008). Иммунокомпетентные клетки несут на своей поверхности специфические рецепторы, с помощью которых их можно идентифицировать. Принципы классификации рецепторов - антигенных маркеров лейкоцитов человека, выявляемых моноклональными антителами (МкА), были сформулированы на 1-м Международном совещании в Париже в 1982 г. Эти маркеры обозначили как cluster of differentiation - символом CD и соответствующими номерами. К настоящему времени создана единая номенклатура системы CD, состоящая из более 300 дифференцировочных молекул клеток человека и животных. 30% CD-антигенов относится к суперсемейству иммуноглобулинов (IgSF), при участии которых происходит распознавание антигенов. Они содержат общие структурные элементы, характеризуются определенной пространственной доменной организацией и статистически значимой гомологией аминокислотных последовательностей (Ройт А. и др., 2000; Рабсон А. и др., 2006; Бурместер Г.-Р. И др., 2007 и др.). IgSF, как одни из важнейших молекул иммунной системы, обеспечивают защиту от микроорганизмов, поврежденных и генетически измененных клеток (Ярилин A.A., 1999; Давтян Т.К. и др.,2005; Сидорова Е.Б., 2006 и др.).

3

Наиболее иммунологически значимыми белками IgSF являются:

- иммуноглобулины (Ig), существующие в двух формах: растворимые белки (секретируемые антитела) и мембраносвязанные (slg), являющиеся поверхностными рецепторами В-лимфоцитов;

- иммуноглобулиноподобные молекулы (ILT), представляющие собой мембранные рецепторы иммунокомпетентных клеток.

Среди мембраносвязанных белков IgSF большой интерес представляют рецепторы, находящиеся на поверхности Т-клеток (CD2, CD4, CD8 и др.), макрофагов (Fe- рецепторы) и B-лимфоцитов (BCR - антигенный рецептор B-клетки). Функциональная и количественная характеристика данных белков является чувствительным маркером оценки состояния иммунной системы (Кирюхин A.B. и др., 2003; Добротина H.A. и др., 2005; Артюхов В.Г и др., 2006 и др.).

Вместе с тем, следует отметить, что закономерности формирования иммунного ответа на молекулярном уровне у животных, в частности, механизмы перекрестного связывания антигена с рецепторами B-клеток, роль адгезивных молекул Т-лимфоцитов и макрофагов в транедукции сигнала при иммунизации, изучены недостаточно. Разработка методов исследования IgSF, характеристика их биологических свойств, а именно функциональных и рецепторных, в процессах онто- и иммуногенеза является перспективным направлением для определения иммунологической эффективности биологических препаратов, создания новых безопасных вакцин - основы специфической профилактики болезней животных.

В настоящее время для оценки состояния иммунной системы разработан комплекс лабораторных методов, позволяющий выявлять изменения на молекулярно-клеточном уровне. Прежде всего, это иммуноцитохимический анализ мембранных и цитоплазматических структур иммуноцитов (Haines D.M. и West К.Н., 2005; Саидов М.З. и др., 2006; Высочин И.В. и др., 2006 и др.). Этот и другие способы определения и характеристики IgSF послужили методологической основой наших исследований.

Цель работы - разработка современной методологии идентификации белков суперсемейства иммуноглобулинов и характеристика их биологических свойств в процессе фило-., онто- и иммуногенеза.

Для достижения указанной цели в работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать способы получения иммуноглобулинов изотопов О, М, А (1§С, 1§М, IgA) рогатого скота.

2. Получить моноспецифические антисыворотки для количественной оценки иммуноглобулинов изотипов в, А в биологических жидкостях организма рогатого скота и провести сравнительный анализ с моноклональными антителами к

3. Усовершенствовать методы изучения и оценки растворимых и мембранных форм белков суперсемейства иммуноглобулинов

4. Разработать методы исследования В-клеток крупного рогатого скота с использованием моноклональных антител к 1§М.

5. Изучить протективные свойства белков суперсемейства иммуноглобулинов у мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза.

6. Дать характеристику секретируемым и мембранным (в^) формам ^ крупного рогатого скота и овец в различные периоды онтогенеза.

7. Провести оценку количественных изменений клеток, несущих рецепторные белки ^БР у различных видов животных.

Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР ВИЭВ задание 01.01.05 М МП «Разработать и освоить производство моноспецифических антисывороток и моноклональных антител для количественного определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных», этап Н.02.2 «Провести комплексные исследования по оценке функционального состояния гуморальных и клеточных факторов иммунной системы у мышей в процессе иммуногенеза»; задание 01.01.09 М МП «Разработать и освоить производство набора компонентов для оценки иммунного статуса организма

животных»; задание 02.02.11 РНТП «Изучить механизмы формирования иммунного ответа у животных в процессе онто- и иммуногенеза, разработать и усовершенствовать методы иммунологического мониторинга».

Научная новизна. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена концепция комплексного подхода к оценке состояния иммунной системы в процессе онто- и иммуногенеза на основе функционально-рецепторной характеристики белков суперсемейства иммуноглобулинов.

Установлено, что рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток определяет их функциональную активность в реакциях различного генеза.

На основании результатов проведенных исследований:

- получен штамм гибридных культивируемых клеток животных Миз.тивсЫиз, используемый для получения моноклональных антител к 1§М рогатого скота (Авторское свидетельство № 1560549 от 3.01.90 г. в соавторстве);

разработан способ выделения иммуноглобулина А из молозива крупного рогатого скота (патент на изобретение № 2277421 от 5 апреля 2005 г. в соавторстве);

- разработан способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости крупного рогатого скота (патент на изобретение № 2288008 от 27 ноября 2006 г. в соавторстве);

- разработан метод иммунопероксидазного окрашивания клеток для количественной оценки В-лимфоцитов крупного рогатого скота на основе моноклональных антител к иммуноглобулину М (патент на изобретение № 2293330 от 10 февраля 2007 г.).

Впервые определены формы локализации поверхностных иммуноглобулинов В-клеток у крупного рогатого скота и проведен корреляционный анализ содержания растворимого и мембраносвязанного

в периферической крови животных данного вида.

Впервые изучена динамика содержания в^М-клеток у коров в период плодоношения.

Практическая значимость. Систематизированы экспериментальные данные о функционально-рецепторной характеристике содержащие выводы по методическому подходу к изучению иммунной системы животных, а также даны конкретные рекомендации, которые позволяют интенсифицировать исследования в области ветеринарной иммунологии.

Разработаны в соавторстве и утверждены в установленном порядке: «Набор компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии», утвержденным Министерством Сельского хозяйства и продовольствия РФ, ТУ № 9388-0039-00008064-96, 1996 г.;

- временное наставление по применению набора компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии № 13-7-2/617, утвержденное Департаментом Ветеринарии МСХиП РФ от 27.05.96 г.;

- методические рекомендации «Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных» (Сибирское отделение РАСХН, Новосибирск, 2003 г.);

- технологический регламент по изготовлению, контролю и применению набора реагентов для количественного определения иммуноглобулина в в биологических жидкостях рогатого скота (секция «Инфекционные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 30.09.2010 г. протокол № 3);

- технологический регламент по изготовлению, контролю и применению набора реагентов для количественного определения иммуноглобулина А в биологических жидкостях рогатого скота (секция «Инфекционные болезни

животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 30.09.2010 г. протокол № 3).

Рассмотрены и утверждены в установленном порядке Отделением ветеринарной медицины РАСХН:

- методические рекомендации по количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток животных (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 20 мая 2005 г., протокол № 1) (авторы: Ю.Н.Федоров и И.Ю.Ездакова);

- методические рекомендации по определению В-клеток (иммунопероксидазное окрашивание) (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г., протокол № 2) (автор: И.Ю.Ездакова);

- методические рекомендации «Определение поверхностных структур иммунокомпетентных клеток методом иммунофлуоресценции» (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г., протокол № 2) (автор: И.Ю.Ездакова);

- методические наставления по использованию моноклональных антител для оценки уровня иммуноглобулинов классов М и А в биологических жидкостях крупного рогатого скота и овец (секция «Инфекционные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.04.2010 г. протокол № 2) (авторы: И.Ю.Ездакова и Т.А.Чеботарева).

Получены: серебряная медаль на 8-ой Российской агропромышленной выставке «Золотая осень» «За Способ получения секреторного иммуноглобулина А крупного рогатого скота» (2006 г.); золотая медаль на 10-й «За способ определения антител в иммуноцитохимическом анализе» (2008 г.); медали «Лауреат ВВЦ» в 1998 г. и в 2008 г. за разработку препаратов для оценки состояния иммунной системы животных; «Звезда И.И.Мечникова» за инновационное развитие и продвижение научного наследия И.И.Мечникова в 2010 г.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены: - на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИиТИБП «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2000); Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2001); Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМиБ им. К.И.Скрябина (Москва, 2004); научной конференции «30 лет развития современных направлений клеточной биотехнологии» (Москва, 2005); секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2005, 2008); Международной научной конференции «Современные проблемы клеточной биотехнологии и сохранение генетических ресурсов» (Москва, 2006); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р.Коваленко (Москва, 2006); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях», посвященной 60-летию Краснодарского научно-исследовательского ветеринарного института (2006); 20- 21- и 22-ой Международных ежегодных конференциях Европейского сообщества по изучению китообразных (ECS) (Гдыня, 2006; Сан-Себастьян, 2007; Эгмонд,

2008); Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2Ó08); Ученом Совете, Методической комиссии ВИЭВ (1995-2008); VII съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург,

2009), «Московские Мечниковские чтения» (Москва, 2010). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 44 научные

работы, в том числе 15 работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ, монография «Рецепторы иммунного узнавания у животных», 1 авторское свидетельство и 3 патента на изобретение.

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях.

Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи д.б.н., профессору Л.П.Дьяконову д.в.н., профессору М.А.Сидорову, д.б.н., профессору О.А.Верховскому, к.б.н. Т.А Чеботаревой.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 334 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения.

Материалы диссертации иллюстрированы 31 таблицей и 53 рисунками. Список литературы включает 421 источник, из них 209 зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

получение препаратов для изучения и характеристики иммуноглобулинов крупного рогатого скота;

- совершенствование иммунологических методов исследования Т-лимфоцитов, В- лимфоцитов и макрофагов;

- оценка содержания секретируемой и мембранной форм ^ крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза;

- функциональные и рецепторные свойства ^БР иммунокомпетентных клеток млекопитающих, птиц и рыб в реакциях различного генеза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования выполнены в лаборатории иммунологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко в период 1985-2010 гг. Общая схема исследований представлена на рис. 1. В качестве объектов исследования использованы различные виды животных - мыши линии ВАЬВ/с, гибриды (ВАЬВ/с х ОВА/2) и беспородные мыши, кролики, крупный рогатый скот, овцы, куры, норки, серебряные караси.

Материалом для исследований служили первичные (тимус, костный мозг) и вторичные (селезенка, лимфатические узлы, пейеровы бляшки) лимфоидные органы, кровь, а также перитонеальные макрофаги

лабораторных мышей. Исследования иммунного статуса проводили у рыб, доставленных из рыбхозов «Гжелка» и «Биссеровский» Московской области. Отбор проб крови крупного и мелкого рогатого скота для иммунологических исследований проводили в ЗАО «Кузнецовский» Наро-Фоминского района Московской области и на опытной базе ВИЭВ оЛисий. Образцы крови норок и кур получены в ходе совместных исследований с сотрудниками МГАВМиБ им. К.И.Скрябина и лаб. по изучению болезней птиц ВИЭВ.

Рис.1. Общая схема исследований

Для определения уровня иммуноглобулинов, исследований по количественной характеристике и функциональной активности иммунокомпетентных клеток использовано более 5000 проб сыворотки и цельной крови мышей, крупного рогатого скота, птиц и рыб.

При изучении поверхностных структур иммунокомпетентных клеток применяли производственную вакцину против рожи свиней из штамма ВР-2 (Щелковская биофабрика), ассоциированную вакцину против трансмиссивного гастроэнтерита («ТМК») и ротавирусной инфекции («К») свиней (опытная серия, ВИЭВ) и производственную вакцину против парвовирусного энтерита собак (АО «Ветзвероцентр»).

IgG и IgA из биологических жидкостей крупного рогатого скота и мышей выделяли методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Наличие и степень чистоты полученных препаратов определяли методом иммуноэлектрофореза с использованием антисыворотки к белкам крови крупного рогатого скота и мышей и методом электрофореза в полиакриламидном геле в буферной системе Laemmli U.K. (1970). Иммуноблотгинг проводили в буферной системе H.Towbin et al (1979).

Иммунизацию кроликов породы «Советская шиншилла» с массой 2,53,0 кг, проводили по методу, разработанному М.А.Мисниковой и А.Ю.Самострельским в нашей модификации.

Моноклональные антитела к IgM (Федоров Ю.Н., Сологуб В.К. и др., 1988) и IgA (Феоктистова Т.А. и др., 2003) рогатого скота получали по разработанной схеме на основе методики P.S. Paul et al. (1985).

Реакцию двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони (РДП) использовали для определения чистоты, рабочего разведения антисывороток и изотипирования антител (Фримель Х.,1979).

Уровень иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных определяли методом простой радиальной иммунодиффузии - РИД (Manchini G. et al, 1965). Количественную динамику розеткообразующих клеток определяли в реакции розеткообразования (Е-РО) (Кондрахин И.П. и др., 1985), теофиллиновом тесте (Караулов А.В.,2002), антигенном розеткообразовании (А-РО) (Лебедев К.А. и др.,1981).

Фагоцитарную активность исследовали с помощью клеток дрожжей, тест-культуры Staphylococcus aureus (АТСС 29213), частиц зимозана и

латекса по стандартным методикам. Исследование механизмов

межклеточных взаимодействий и адгезивной активности иммунокомпетентных клеток проводили в реакции контактного взаимодействия макрофагов и тимоцитов (РКВ) (Горбачева Л.Д. и др., 1981).

Тест-системы с использованием моноклональных антител основаны на «сэндвич»-варианте твердофазного иммуноферментного анализа. В качестве конъюгатов использовали МкА 6В8 к IgA рогатого скота, меченные пероксидазой хрена (Sigma). Изотипы Ig мышей определяли с помощью биотин-антииммуноглобулинового и авидин-пероксидазного конъюгатов, согласно инструкции фирмы производителя (Sigma Immunochemicals). Результаты оценивали с помощью фотометра «Multiskan МСС/340» по коэффициенту оптического поглощения (ОП 492).

Для определения поверхностных иммуноглобулинов использовали цитотоксический тест - ЦТТ (Хаитов Р.М., 1995), иммунопероксидазное окрашивание клеток - ИПО (Дергачева Т.И. и др., 2000), реакцию иммунофлуоресценции - РИФ (Новикова М.С.,1990).

Для идентификации поверхностных антигенов лимфоцитов мышей использовали МкА к CD2, МкА к CD 19, конъюгированные с флуорохромом (DakoCytomation) и МкА к IgM рогатого скота (лаб. иммунологии ВИЭВ).

Статистическая обработка результатов исследований проводилась общепринятыми методами с использованием программы Excel для Windows. Значение критерия достоверности оценивали по таблице вероятностей Стьюдента-Фишера в зависимости от объема анализируемого материала. Вероятность различий считалась существенной при Р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Одними из самых распространенных белков иммунной системы являются гликопротеины IgSF, участвующие в гуморальном и клеточном иммунном ответе. При этом гуморальные механизмы иммунной системы обеспечивают растворимые формы иммуноглобулинов, а клеточные -

мембраносвязанные 1ЬТ- рецепторы иммунокомпетентных клеток. Задачей первого этапа нашей работы была разработка и оптимизация методов количественной оценки ^О, 1дА и лейкоцитов с 1Ы-рецепторами.

Выделение из сыворотки крови и молозива крупного рогатого

скота

Учитывая, что основным иммуноглобулином сыворотки крови и молозива крупного рогатого скота является 1§0, для его получения использовали данные биологические жидкости. В результате гель-фильтрации у-глобулинов сыворотки крови и молозива на 8ерЬасгу1 Б-ЗОО и ЗерЬагоБе 6В были получены препараты с примесями.

В связи с этим, для выделения иммуноглобулинов Б использована ионообменная хроматография, основанная на различиях в соотношении и распределении заряженных групп на поверхности белка. Для десорбции иммуноглобулинов использовали повышение ионной силы элюирующего раствора с применением градиента концентрации №С1 от 0,1 М до 0,4 М.

Осажденные у-глобулины из сыворотки крови и молозива наносили на колонки с БЕАЕ БерЬагозе 6В. В качестве элюирующего раствора использовали 0,02 М Тпз-НС1, рН 7,2 с 0,1М, 0,15М,0,25М и 0,4М ЫаС1.

Методом иммуноэлектрофореза установлено, что элюировался в первом белковом пике при 0,1 М ЫаС1, во втором при 0,15 М ЫаС1, а IgM в третьем при 0,25 М 1МаС1. Элюаты концентрировали в ПЭГ 40000. Степень чистоты полученных препаратов иммуноглобулинов проверяли методом электрофореза в ПААГ-ДСН.

Образцы подвергали термоденатурации в присутствии 2-меркаптоэтанола, в объеме 2 мкл наносили на пластины с полиакриламидным гелем. Предварительно в образцах определяли концентрацию белка по методу Лоури. Из 2 мл у-глобулинов крупного рогатого скота, нанесенных на колонку с ОЕАЕ БерИагоБе 6В, получали 1,0 мл ^О с содержанием белка 10-15 мг/мл.

Разработка способа получения IgA из носовых секретов и молозива крупного рогатого скота

Иммуноглобулины А в биологических жидкостях находятся в нескольких полимерных формах. В сыворотке крови IgA встречается как в виде мономера с молекулярной массой 160 kDa, так и в полимерной форме, в основном, как димер. Присутствие различных полимерных форм IgA и незначительная его концентрация затрудняют его выделение из сыворотки крови крупного рогатого скота. Поэтому, для получения IgA использованы носовые секреты и молозиво, концентрация IgA, в которых является максимальной (Пат. 2277421,2006; Пат. 2288008,2006).

Для выделения S-JgA сыворотку молозива животных обрабатывали 0,1 М раствором сернокислого цинка и этилендиаминтетрауксусной кислотой, а затем проводили разделение глобулинов на колонке с Sephacryl S-400 (в качестве элюанта использовали 0,1 М Трис-HCi буфер pH 8,0 с 1,0 М NaCl). Для выделения S-IgA из носовых секретов крупного рогатого скота, данную биологическую жидкость в количестве 5,0-6,0 мл центрифугировали при 1000 об/мин в течение 15 мин. и диализовали против 0,02 М Tris-HCl буфера pH 8,0 два часа. Затем диализат фракционировали на колонке с Sephacryl S-300-HR. Иммунохимическую чистоту S-IgA подтверждали иммуноэлектрофоретическим анализом белковых фракций.

Анализ проведенных исследований показал, что лучшим источником для выделения S-IgA являются носовые секреты, поскольку концентрация данного изотипа в них достаточно велика (2,81 мг/мл) по сравнению с IgM (0,04 мг/мл) и IgG (1,56 мг/мл) (Butler, 1986).

Иммунохимические свойства моноклональных антител к IgM и slgA рогатого скота

В результате проведенной работы по гибридизации клеток лимфоцитов иммунных мыщей BALB/c с клетками миеломы Sp 2/0 получены

гибридомы-продуценты МкА к иммуноглобулинам классов М и А крупного рогатого скота. В процессе экспериментов получено и протестировано более 10000 первичных гибридных клеточных клонов. Получен набор асцитических препаратов, с помощью иммуноблоттинга и различных серологических тестов определена иммунохимическая характеристика МкА. Проведены исследования и показана возможность использования полученных МкА для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных методами «сэндвич»-ИФА и РИД (Ездакова И.Ю. и др. // Сельскохозяйственная биология, 2002)

В результате проведенных исследований установлено, что моноклональные антитела С 2, С4, G9,Cn, В3 взаимодействуют только с IgM, не реагируя IgG и IgA (Ездакова И.Ю., 1994), а МкА 4Gn, 1F3, 7Е7, 6В8 только с IgA (Феоктистова Т.А., 2003; Борзенко Е.В., 2005). По результатам иммуноблоттинга, МкА клонов С2, С, и G9 реагируют только с нативной молекулой IgM, что свидетельствует о конформационном характере антигенных детерминант на молекуле IgM, распознаваемыми полученными антителами.

Таблица 1

Иммунохимическая характеристика моноклоналъпых антител к IgM и IgA крупного рогатого скота и овец.

МкА IgG IgA IgM Тип эпитопа

Дим ер Цепи Пента мер Цепи

а I L И L

с2 - • - + - - конформационный

с4 - - - + - - конформационный

G, - - - + - конформационный

С„ - - - + + линейный

В3 - - - + + линейный

40„ - + - - - конформационный

lFg - + + - - линейный

7Е 7 - + + - - линейный

6В8 - + - - - - конформационный

Моноклональные антитела клонов Сц и В3 взаимодействуют не только с нативной молекулой, но и с ц- цепью ^М, что свидетельствует о линейном характере эпитопов, которые распознают МкА (табл.1).

В результате проведенных исследований были отобраны клоны С2 и продуцирующие МкА, которые взаимодействуют с нативной молекулой 1§М и сохраняют титр в реакции диффузионной преципитации (1:32) после лиофилизации.

Использование моноклональных антител в РИД предполагает наличие преципитирующих свойств МкА к 1§М клонов С2 и С9 обладали такими свойствами, в то время как МкА к ^А только при сочетании нескольких МкА различных клонов, направленных к разным эпитопам. Анализ иммунохимических свойств МкА показал, что наиболее эффективными для использования в РИД являются моноклональные антитела, распознающие антигенную детерминанту конформационного типа.

Для определения минимальных концентраций ^ в биологических жидкостях крупного рогатого скота (молоко, моча) оптимизированы условия постановки "сэндвич"-ИФА с использованием МкА. Испытаны сочетания МкА, где одни из них использовали в качестве иммобшшзирующих антител, а другие, конъюгированные с пероксидазой, для определения связанного антигена. В результате проведенных экспериментов подобран вариант, позволяющий идентифицировать и количественно определять уровень как мономерного сывороточного 1§А, так и э^А в различных секретах (слезы, слюна, молозиво, молоко, носовые секреты).

На основе полученных МкА к 1§М и IgA рогатого скота приготовлены реагенты для количественного определения уровня иммуноглобулинов классов М и А в РИД и ИФА.

Разработка метода идентификации ^-рецепторов В-лимфоцитов

К важнейшим рецепторам В-клеток относят поверхностные иммуноглобулины, специфичные к одному определенному антигену.

Известно, что на поверхности В-лимфоцита экспрессируется мембранный IgM (slgM), являющийся неотъемлемой частью рецепторного комплекса В-клетки для антигена. Изучение форм локализации slg на поверхности В-клеток крупного рогатого скота, плотности распределения мембранных иммуноглобулинов лимфоцитов крови у молодых и взрослых животных является перспективным направлением исследований механизмов клеточной активации и анергии в процессах онто- и иммуногенеза. С использованием поли- и моноклональных антител к иммуноглобулинам, возможно изучение локализации slg клетки и определение количества В-лимфоцитов.

Несмотря на очевидный интерес к данной теме (Murakami К. et al ,2004; Usui Т., 2006 и др.), в доступной отечественной литературе очень мало данных по исследованию поверхностных иммуноглобулинов лимфоцитов у крупного рогатого скота. Поверхность является своеобразным «паспортом» клетки, по которому можно идентифицировать тип и функции лимфоцита. Основные мембранные молекулы, участвующие в распознавании антигенов, принадлежат к IgSF. Мембранные Ig и антитела образуют своеобразную систему иммунного контроля за клеточной мембраной лимфоцитов, являясь сигнальными молекулами, с помощью которых осуществляются основные адаптивные иммунные реакции организма. Следует отметить, что многие механизмы экспрессии s-Ig лимфоцитов, влияния внешних и внутренних факторов на формирование рецепторного профиля клетки мало изучены и до сих пор неизвестны. В связи с этим следующим этапом работы был поиск адекватного метода для изучения Ig-рецепторов клетки.

Известно, что иммуноглобулины в организме могут быть в мембранной (slg), цитоплазматической (clg) и секретируемой (Ig) формах, которые являются также и показателем уровня дифференцировки В-лимфоцитов.

Для определения соотношения первых двух форм иммуноглобулинов В-клеток лимфоидных органов у интактных мышей использовали иммунопероксидазный метод.

Относительное содержание ^-клеток в костном мозге распределялось следующим образом: 22,3% - 27,5% - ДО и 20,5% - в

цитоплазматической форме, что подтверждает важную роль этого органа в синтезе антител. Зафиксировано 10,3% лимфоцитов с 51{>М. В тимусе обнаружено 18,2% тимоцитов с 1,0% мононуклеарных клеток с 2,1% лимфоцитов с В селезенке зарегистрировано 7,5% лимфоцитов с 7,1% - Б^й и 6,3% - с1|>А. Как вторичный лимфоидный орган селезенка является главным источником циркулирующих В-лимфоцитов. По-видимому, лимфоциты, на мембране которых выявлены ^С, являются В-клетками памяти. В лимфатических узлах наблюдалось 25,2% клеток с б^М и 40,5% - с Мембранный ДО распределялся в клетках лимфатических узлов следующим образом 5,0% - равномерное распределение окраски по периметру клетки, 20,3% - неравномерное распределение окраски, 5,2% -образование скопления окраски на одном из полюсов клетки и 10,0% -неравномерное распределение окраски с поглощением скоплений окраски внутрь клетки. Разнообразие форм ^-рецепторов свидетельствует об интенсивных процессах секреции антител в лимфатических узлах. Установлено, что большинство антител лимфатических узлов относятся к ^С-изотипу. В лимфоидной ткани кишечника зафиксировано 8,3% клеток с sIgM; 2,6% с вДО и 3,8% с цитоплазматической формой

На основе этой реакции был разработан иммуноцитохимический метод определения поверхностных иммуноглобулинов В-клеток крупного рогатого скота с использованием МкА к IgM (Пат. 2293330, 2007) и поликлональных антител к ДО, крупного рогатого скота, полученные нами на первых этапах работы. Большая плотность экзогенных иммуноглобулинов на поверхности клетки обусловлена способностью молекул ^ к образованию поперечных сшивок. При обработке клеток 1%-ной лимонной кислотой, количество иммуноглобулинов на поверхности клетки значительно уменьшается. РсуЯИ-рецептор В-лимфоцитов связывает только и с довольно низким сродством (<107М"'). В кислой среде

нековалентные взаимодействия между Рс-рецептором клетки и Рс-фрагментом антитела ослабевают, и экзогенные ^О диссоциируют с поверхности лимфоцита. Мембранные IgM ориентированы РаЬ-областью по направлению к внешней среде, тогда как Рс-фрагмент находится в контакте с клеточной поверхностью. содержит на С-концах тяжелых цепей

домены, образованные гидрофобными аминокислотами, которые удерживают молекулу ^ на наружной поверхности мембраны.

Таким образом, в иммунопероксидазной реакции с использованием моноклональных антител, полученных к молекуле определяли в1§М-клетки, а при обработке поликлональными антисыворотками - лимфоциты, несущие на своей поверхности иммуноглобулины различных изотипов. Используемые в данном исследовании антисыворотки к и Б-^А крупного рогатого скота, представляют собой набор антител ко всем антигенным детерминантам в том числе, и к эпитопам легких цепей, которые у всех изотипов иммуноглобулинов являются идентичными. Поэтому при добавлении к лимфоцитам данных антител, происходит их взаимодействие со всеми изотопами находящимися на поверхности клетки. С другой стороны, моноклональные антитела к IgM крупного рогатого скота, полученные к одной антигенной детерминанте на молекуле ^М, соответственно, взаимодействуют только с ней.

В результате проведенных исследований установлено, что количество Б^М-клеток в крови телят в возрасте одного месяца составляет 16,6%, у коров в возрасте 5-7 лет - 22,8%. Уровень клеток с мембранноассоциированными молекулами 1§С и ^А в крови коров находится в пределах 10,7%.-12,9%

Представленные данные свидетельствуют о том, что все изотипы иммуноглобулинов (1§М, 1§А) экспрессируются на поверхности клеток периферической крови крупного рогатого скота.

Таким образом, в результате проведенных исследований был оптимизирован иммунопероксидазный метод для его дальнейшего

использования при определении поверхностных структур лимфоцитов крупного рогатого скота.

Изменения 1ЬТ-рецепторного профиля иммунокомпетентных клеток после вакцинации

В процессе иммунного ответа осуществляется множество межклеточных взаимодействий, среди которых наиболее важным является распознавание чужеродного антигена Т-клетками, основанное на специфичности связывания пептидов молекулами МНС, расположенными на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК). Для характеристики функционально-рецепторных свойств мембраносвязанных в процессе поствакцинального иммунного ответа определяли рецепторную активность Т-клеток и антигенпрезентирующих клеток (перитонеальные макрофаги ПМ). Т-лимфоциты дифференцировали на высокоаффинные -многорецепторные (МРОК) - и неполные - малорецепторные (мРОК). В качестве модельных антигенов использовали живые вакцины бактериальной (производственная вакцина против рожи свиней из штамма ВР-2) и вирусной (ассоциированная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита («ТМК») и ротавирусной инфекции («К») свиней - опытная серия, ВИЭВ) этиологии.

Повышение адгезивной активности перитонеальных макрофагов зарегистрировано на 2-е, 10-е и 14-е сутки иммунного ответа на бактериальную вакцину и только на 3-й сутки после введения вирус-вакцины (табл.2), что обусловлено различными путями презентации эндогенных и экзогенных антигенов макрофагами.

Неактивированные макрофаги содержат незначительное количество молекул МНС. Их экспрессия начинается только после захвата антигена и образования фагосом или протеасом. Как следует из приведенных материалов, в первый день после вакцинации адгезивная активность макрофагов не отличалась от контроля.

Таблица 2

Показатели реакции контактного взаимодействия в процессе поствакцинального иммунного ответа

Группы Сутки иммунного ответа

животных 0 1 2 3 7 10 14 21

1 (Т/ПМ) 26,0 52,0 70,3 200,7 21,0 40,1 21,0 20,0

±0,5 ±0,7 ±1,0 ±12,0 ±0,3 ±0,4 ±0,8 ±0,7

2 (Т/ПМ) 30,5 34,8 212,3 70,7 56,1 260,3 125,5 26,2

±0,9 ±0,32 ±30,4 ±0,91 ±0,3 ±35,9 ±15,8 ±0,4

Примечание: р< 0,05, п=100, Т/ПМ - число адгезированных тимоцитов на поверхности 100 макрофагов. 1 группа - животные, иммунизированные ассоциированной вакциной против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней, 2 группа -животные, иммунизированные производственной вакциной против рожи свиней из штамма ВР-2

Если макрофаги, находящиеся в непосредственной близости от места внедрения антигена, не справляются с его уничтожением, то антиген распространяется по всему организму, в том числе, в перитонеальную полость. На 2-е сутки иммунного ответа на бактериальный антиген наблюдалось резкое увеличение числа тимоцитов, контактирующих с макрофагами, что связано с возросшей функциональной активностью макрофагов, которая сопровождалась морфологическими и биохимическими изменениями клеток.

В первые сутки после введения вакцины ВР-2 установлено значительное повышение количества высокоаффинных Т-клеток в костном мозге (75%, контроль - 15%), число которых на 2-е сутки снижается вдвое (рис.2). На 7-е сутки поствакцинального иммунного ответа, их уровень возрастает в лимфатических узлах (50,2%, контроль - 11%) и тимусе (60,0%, контроль -27,0%), что характеризует активизацию клеточных реакций, как в первичных, так и во вторичных лимфоидных органах. Усиление экспрессии адгезивных С02-молекул улучшает межклеточный контакт для обеспечения эффекторных функций иммуноцитов. В тимусе высокий уровень экспрессии С02-рецепторов сохраняется до 14-ти суток поствакцинального иммунного ответа (71,0%).

%

□ Костный мозг

ШТимус

1 Лимфатические узлы

О иш , Ш1|, I» , III, 1.4-,-,

1 2 7 10 14

Рис. 2. Динамика содержания высокоаффинных Т-клеток (МРОК) в лимфоидных органах мышей после иммунизации вакциной против рожи

свиней

В отличие от формирования иммунного ответа на бактериальную вакцину, иммуногенез на вирус-вакцину сопровождается увеличением экспрессии СБ2-рецепторов на Т-клетках только в костном мозге на 14-е сутки после вакцинации. Это подтверждает различие в механизмах формирования иммунного ответа на вирусные и бактериальные антигены (Жаданов А.И. и др. // Ветеринария.-2000; Ездакова И.Ю. и др.// Цитология,-2001).

Таким образом, на изменение адгезивной активности макрофагов вследствие введения вакцины против рожи свиней, Т-клетки реагируют повышением уровня экспрессии С02-рецепторов, играющих важную роль не только в адгезии клеток при распознавании антигена, но и в передаче антигенного сигнала Т-лимфоциту.

Возрастание числа С02-белков вначале на Т-клетках костного мозга, затем в тимусе и лимфатических узлах обуславливает достаточно высокую аффинность связывания комплексов молекулы МНС класса II и линейного пептида бактериальной клетки.

Анализ полученных результатов показал, что при увеличении числа тимоцитов на 1-е и 7-е сутки иммунного ответа, адгезивная активность макрофагов была на уровне контроля.

Таблица 3

Коэффициенты корреляции показателей реакции розеткообразованш в процессе иммунного ответа (г)

Источники клеток Тимус Костный мозг Лимфатические узлы Селезенка Кровь Макрофаги

Тимус - 0,07 0,63 0,4 0,62 -0,32

Костный мозг 0,07 - 0,65 -0,61 -0,04 -0,44

Лимфатические узлы 0,63 0,65 -0,03 0,36 -0,64

Селезенка 0,4 -0,61 -0,03 - 0,39 0,45

Кровь 0,62 -0,04 0,36 0,39 - 0,37

Макрофаги -0,32 -0,44 -0,64 0,45 0,37 -

И наоборот, повышение числа тимоцитов, прикрепленных к поверхности макрофагов на 2-е сутки при введении бактериальной вакцины и на 3-й -вирусной, сопровождалось только незначительным повышением уровня Т-лимфоцитов. Обратно пропорциональная связь между уровнями тимоцитов и макрофагов в определенные периоды иммуногенеза, по нашему мнению, обусловлена компенсаторными механизмами иммунной системы.

В процессе иммуногенеза установлена прямая корреляционная взаимосвязь (табл.3) между показателями Т-клеток в тимусе и крови (г=0,62), тимуса и лимфатических узлов (г=0,63) и костного мозга и лимфатических узлов (г=0,65). Сопряженность между данными параметрами объясняется развитием иммуногенеза, а именно введение антигена служит началом цепных иммунных реакций, где главную роль играет рецепторная активность С02-рецепторов Т-клеток костного мозга, тимуса и лимфатических узлов.

Значительное повышение уровня многорецепторных клеток в костном мозге в первые сутки свидетельствует об усилении адгезивной активности Т-кдеток, направленной на контакт с В-клетками, а возможно, и для

24

генерирования дополнительного активационного сигнала. Корреляция между показателями в костном мозге и лимфатических узлах (г=0,65) свидетельствует о прямой зависимости рецепторной активности лимфоцитов первичных и вторичных лимфоидных органов в процессе иммунного ответа. Отсутствие корреляционных взаимосвязей между уровнем экспрессии С02-рецепторов на клетках костного мозга и лимфоцитах крови косвенно подтверждает теорию отрицательной селекции антигеннеспецифичных лимфоцитов, которые погибают в результате апоптоза и не попадают в циркуляцию. Корреляционный анализ иммунологических данных показал прямую зависимость рецепторной активности С02-антигена от функций активированных Т-клеток на разных этапах иммунного ответа.

Оценка функциональной активности В-клеток в процессе поствакцинального иммунного ответа

Наряду с методами ИПО и РИФ, для идентификации поверхностных 15-рецепторов клеток использовали лимфоцитотоксический тест. Подопытной группе мышей вводили подкожно вакцину против рожи свиней (штамм ВР-2) в дозе 0,2 мл, ревакцинировали через 30 дней по аналогичной схеме.

1 3 7 14 1 7 14 20

время после иммунизации, сут.

| - ревакцинация, I- опыт; П-контроль.

Рис.3. Динамика содержания В-лимфоцитое селезенки в процессе поствакцинального иммуногенеза.

Контрольным животным вводили 0,2 мл физиологического раствора. Процент погибших клеток (В-лимфоциты) определяли на 1-е, 7-е и 14-е сутки первичного и вторичного иммунного ответа.

При первичном иммунном ответе увеличение В-лимфоцитов наблюдалось в первые сутки после введения вакцины (23,0%, контроль -12,0%), и на 1-е и 14-е сутки после повторной инъекции, что свидетельствует также и о повышении экспрессии на клетках (рис.3). Помимо количественного определения В- лимфоцитов, методом РИД в надосадочной жидкости МНК селезенки мышей определяли концентрацию (рис.4).

В результате проведенных исследований установлено, что в первые сутки после инъекции вакцины в селезенке достоверно повышается количество В-клеток и уровень тогда как количество Т-клеток

увеличивается только на 7-е сутки иммуногенеза.

В процессе иммунного ответа первичные фолликулы селезенки превращаются во вторичные фолликулы с зародышевым центром. В первые сутки иммунного ответа увеличивается число фолликулярных В-клеток, затем эти клетки превращаются в первичные В-бласты и центробласты, которые являются ^-негативными.

Рис.4. Уровень ^а в надосадочной жидкости МНК селезенки в процессе поствакцинального иммуногенеза.

1 -ревакцинация

время после иммунизации, сут.

На следующей стадии активации В-клеток и образования центроцитов, экспрессия иммуноглобулинов возобновляется. Реакция в зародышевом

центре селезенки продолжается около 20 суток. Полученные нами результаты подтвердили цикличность активации В-клеток селезенки и зависимость в^-рецепторной активности от стадии дифференцировки лимфоцита в процессе иммуногенеза.

Корреляция уровней иммуноглобулинов в сыворотке крови крупного рогатого скота

Антитела к различным антигенным детерминантам являются растворимыми формами мембранных иммуноглобулинов. Таким образом, антитела в разной степени - гомологи антигенсвязывающих участков клеточного рецептора В-лимфоцита.

Уровень иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма имеет важное прогностическое значение при вакцинации стельных коров, так у животных с низкими показателями возможен неадекватный иммунный ответ, проявляющийся в отсутствии формирования специфических протективных антител, которые обеспечивают защиту новорожденных телят

В оценке функциональных возможностей иммунной системы играют важную роль корреляционные взаимосвязи. (Михайленко А.А. и др.,2000). Положительная корреляция уровней ранних (1§М) и поздних (^в) иммуноглобулинов, служит критерием нормального функционирования иммунной системы и ее адаптивных возможностей как в норме, так и при различных физиологических состояниях, в том числе при плодоношении.

Как видно из данных таблицы 4, корреляционные взаимосвязи между различными изотипами иммуноглобулинов в сыворотке крови нестельных коров являются слабо положительными (г=0,24-0,35).

Отсутствие корреляции (г=0,07) между показателями 1£0 и 1§А косвенно подтверждает данные об относительной независимости системного и местного иммунитета у нестельных коров.

Таблица 4

Коэффициенты корреляции уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови стельных и нестельных коров

Показатели Нестельные Стельные

коровы (п=15) коровы (п=15)

0,24 0,49

IgMЛgA 0,35 0,51

ДОЛбА 0,07 0,76

В соответствии с представленными результатами, следует отметить, что принцип мозаичности функционирования органов и систем организма, подтверждается деятельностью иммунной системы: многочисленные структурные компоненты, которой при каком-либо воздействии на нее функционируют не одновременно. С повышением специфической нагрузки -возрастает количество компонентов, участвующих в реализации ее функций; при снижении - число активно функционирующих элементов иммунной системы сокращается (Там же). Указанный принцип реализован в наших экспериментах. Динамика коэффициентов корреляции /1дМ с 0,24 до 0,49 и ^А /^М с 0,35 до 0,51 показывает тенденцию к усилению взаимосвязи иммунологических показателей с увеличением срока стельности. Корреляция между показателями циркулирующего и местно секретируемого ^А (г=0,76) характеризует высокую степень сопряженности этих классов иммуноглобулинов у стельных коров.

Анализ взаимосвязи основных изотипов иммуноглобулинов в крови овец в онтогенезе

Для оценки состояния иммунной системы (И С) определяют количественные и функциональные показатели ее структурных компонентов. Но значения этих показателей, ввиду индивидуальной вариабельности, не всегда отражают нормальное состояние иммунной системы. Так уровень иммуноглобулинов у животных подвержен

значительным колебаниям, обусловленным возрастом, полом, генетическими особенностями, внешними факторами, различными периодами онтогенеза, например, периодом плодоношения и лактации. Вместе с тем, различные компоненты И С могут компенсировать функции друг друга, изменяя тем самым значения показателей, соответствующих статистическому определению нормального состояния иммунной системы.

В связи с этим, появляется проблема определения статистической нормы для показателей иммунного статуса. Измерять ли средние величины и возможные отклонения для каждого возраста, породы животного, периода онтогенеза, места обитания шш охарактеризовать в динамике взаимосвязи основных иммунологических показателей, необходимых для нормального функционирования иммунной системы.

По нашему мнению, для адекватной оценки иммунного статуса животных, а также механизма формирования поствакцинального иммунного ответа, необходимо использовать как традиционное определение нормы, так и корреляционный анализ взаимосвязей между показателями уровня Одной из основных характеристик состояния иммунной системы является уровень иммуноглобулинов в крови. Положительная корреляция уровней сывороточных иммуноглобулинов виМв периферической крови человека, служит критерием нормального функционирования иммунной системы и ее адаптивных возможностей при различных физиологических состояниях организма.

На примере определения коэффициента корреляции между количественными показателями иммуноглобулинов обосновывается диагностический критерий для оценки нормального состояния иммунной системы у овец. В эксперименте использовали образцы крови и носовых секретов овец. При проведении эксперимента животные были разделены на две группы. Первая группа состояла из овец (№1-5) романовской породы в возрасте 5 лет. Вторая группа (№6-10) из овец того же возраста в период 4-5 мес. суягности и последующей лактации. В третью группу (п=5) вошли

ягнята, родившиеся от овец второй группы. Образцы крови и носовых секретов брали однократно в середине месяца в течение 10 месяцев у овец и 6 месяцев у ягнят. У животных определяли количество иммуноглобулинов М, в, А в сыворотке крови и концентрацию IgA в носовом секрете методом радиальной иммунодиффузии.

В результате проведенных исследований в первой группе животных отмечалась положительная корреляционная связь между показателями концентрации иммуноглобулинов изотипов б иМ (г=0,29), М и А (г=0,1) слабой силы, а между и 10А - средней силы (г=0,5). Слабая связь также наблюдалась между уровнями в сыворотке крови и секреторного ^А в носовом секрете. Слабая отрицательная корреляция установлена между количеством сывороточных и 1£А, и уровнем з1§А.

Изучение спектра основных изотипов сывороточных иммуноглобулинов в первой группе овец подтверждает их взаимосвязь в процессе функционирования. Отсутствие корреляции между уровнями IgA в сыворотке крови и носовом секрете, как в первой, так и во второй группе животных, показывает относительную независимость системного и местного иммунитета.

Вторая группа животных представлена овцами в период поздней суягности и лактации. Как видно из данных таблицы 5, корреляция между показателями сывороточных иммуноглобулинов не отличаются от коэффициентов корреляции у овец первой группы. Таким образом, зависимость между количественными показателями циркулирующих 1§ изотипов й, М и А у клинически здоровых животных, в том числе в период суягности и лактации, является конституционной и выражается положительным значением коэффициента корреляции.

Однако, коррелятивная связь между сывороточными ^ и секреторными ^А отсутствует у животных первой группы, а у овец второй группы коэффициент корреляции между 1дМ и б^А (г=0,49±0,02) свидетельствует о средней степени сопряженности этих показателей.

Таблица 5

Коэффициенты корреляции между количественными показателями имл(уноглобулинов в крови и носовых секретах у овец (п=!0) (Ездакова И.Ю., Степнова С.Н. //Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук, 2010)

№ ДОЛвМ ДОЛйА ^МЛ^А ДОМйА 1ВА/51ЙА

1 0,33 0,48 0,09 0,2 0,24 -0,29

2 0,35 0,42 -0,17 -0,09 0,37 -0,5

3 0,28 0,4 -0,03 -0,16 0,5 0,15

4 0,32 0,69 0,31 -0,46 0,12 -0,05

5 0,18 0,53 0,3 -0,42 -0,25 -0,36

М±ш 0,29*±0,02 0,5*±0,05 ОД -0,186 0,196 -0,21

6 0,65 0,59 0,32 0,35 0,5 0,07

7 0,14 0,15 -0,08 0,17 0,37 -0,03

0,33 0,47 -0,32 0,07 0,46 0,06

9 0,54 0,53 0,14 -0,15 0,54 -0,007

10 0,3 0,55 0,23 -0,12 0,59 -0,13

М±т 0,39'±0,16 0,4б'±0,12 0,06 0,06 0,49*±0,02 -0,0074

Примечание. * - р<0,05

Появление коррелятивной связи данных показателей перед родами и в течение лактации, свидетельствует о большем функциональном напряжении иммунной системы в этот период за счет необходимости включения большего количества ее структурных компонентов. В лактационный период данные передаются с молозивом и молоком новорожденному ягненку и являются первым иммунным барьером на пути проникновения антигена в его организм. Б^А и б^М присутствуют на поверхности слизистых оболочек, блокируя первую фазу прилипания энтеропатогенных бактерий к энтероцитам, маскируя поверхностные рецепторы этих клеток. Данные иммуноглобулины являются протективными изотипами иммунной системы слизистых оболочек. Механизм иммунного исключения является основным при защите слизистых оболочек от внешних антигенов.

Также колостральные, абсорбированные и IgM поступают в системную циркуляцию новорожденных, способствуют нейтрализации бактериальных энтеротоксинов и энтеротропных вирусов и оказывают

агглютинирующее действие на большое количество энтеропатогенных микроорганизмов.

По нашему мнению, средняя степень сопряженности показателей 1§М в сыворотке крови и в носовом секрете у овец в период лактации подтверждает их важную роль в защите молодого организма от широко распространенных патогенов в первые 6 месяцев жизни.

Таблица 6

Коэффициенты корреляции между количественными показателями иммуноглобулинов в крови и носовых секретах у ягнят (Там оке).

№ ДОЛЕМ ДОЛеА ^МЛЕА [яАЛ^А

1 0,56 0,25 -0,1 -0,5 -0,29 -0,6

2 0,74 -0,06 0,7 -0,4 0,87 0,5

3 0,72 0,04 0,41 -0,5 0,2 -0,48

4 0,83 0,8 0,9 -0,29 0,3 -0,5

5 0,5 0,8 0,9 -0,5 -0,8 -0,4

М±т 0,67*±0,1 0,37 0,56 -0,44 "±0,09 0,06 -0,3

Примечание. * - р<0,05

В таблице 6 представлены данные о корреляции уровней основных изотилов иммуноглобулинов у ягнят в первые 6 месяцев жизни, полученных от овец второй группы.

Установлена положительная корреляция между уровнями ДО! и 1|>М (г=0,67), что подтверждает теорию корреляционных констант, являющиеся обязательным условием адекватного функционирования иммунной системы. Отсутствие данной корреляции или смена ее Направленности показывает неустойчивое состояние ИС и возможность ее функционального срыва.

Различные по направленности и величине коэффициенты корреляции между уровнями ДО и 1(>А, и Г^А, 1§М и б^А, 1§А и

свидетельствуют о нестабильности иммунной системы у молодых животных в данный период. Это может быть связано с механизмами индивидуального процесса развития и формирования иммунореактивности организма. Отрицательная корреляция между концентрациями в сыворотке крови и

секреторного IgA показывает относительную независимость системного иммунитета и иммунной системы слизистых оболочек.

На основании корреляционного анализа уровней основных изотипов иммуноглобулинов у клинически здоровых животных на различных этапах онтогенеза показана устойчивая корреляция между иммуноглобулинами G и М у всех исследуемых групп животных. Этот показатель может служить диагностическим критерием для оценки здоровья животного и качества иммунопрофилактики, так как изменение направленности корреляции между IgM-антителами первичного и IgG-антителами вторичного иммунного ответа является признаком нарушения иммунореактивности организма.

Представленные данные позволяют наметить перспективные пути в направлении поиска новых устойчивых корреляционных взаимосвязей между иммунологическими показателями с целью понимания механизмов, регулирующих работу иммунной системы животных.

Формы локализации Ig-рецепторов В-лимфоцитов в крови коров и

овец

В онтогенезе дифференцировка в зрелые Т- и В-клетки сопровождается изменением фенотипа поверхности лимфоцита, определяемого с помощью моно- и поликлональных антител методами иммуноцитохимии. Так экспрессия clgM на поверхность клетки играет решающую роль в В-клеточном онтогенезб. Модуляция количества slg или блокировка их антителами приводит к изменению характера иммунных реакций, поскольку именно slg связывают антиген на поверхности В-лимфоцита для дальнейшего его процессирования в эндосомах и представления Т-клеткам. В рамках исследования механизмов клеточной активации в процессе онтогенеза изучены формы локализации slg на поверхности В-клеток в крови у телят и коров. В опытах использовали кровь крупного рогатого скота черно-пестрой породы в возрасте 4-5 лет.

Иммунопероксидазное окрашивание клеток позволяет определить количество 81§-клеток, изучить модуляцию рецепторного аппарата в процессе дифференцировки В-лимфоцита в плазматическую клетку.

Исследование форм локализации представляет теоретический и практический интерес (Новиков В.В.,2007). Анализ литературных данных по изучению поверхностных рецепторов клеток показал, что под влиянием различных факторов, в том числе патогенных микроорганизмов, изменяется локализация рецепторов на поверхности клетки. По перераспределению рецепторов на мембране клетки можно судить о способности связывать антигены, т.е. характеризовать функциональную активность лимфоцита. (Артюхов В.Г.и др.,2006). Изменение локализации рецепторов, их перераспределение в мембране, определяет роль В-лимфоцита, как антигенпредставляющей клетки в иммунном ответе. Поверхностные ^ взаимодействуя с антигеном, посредством эвдоцитоза включают его в цитоплазматический компартмент, где он подвергается деградации.

В результате проведенных исследований нами установлено, что В-клетки в крови коров с окрашенной мембраной в форме «петч»/эндоцитоз составляют 68,9±3,9%, «петч» (неравномерное распределение по периметру клетки)- 15,0±3,3%, «ринг» (равномерное распределение по периметру клетки) - 10,5±3,3%, «кэп» - 5,6±1,9%. («кэппинг»- эффект-скопление на одном из полюсов клетки) (рис.5).

Следовательно, можно сделать вывод, что петч-эндоцитоз, а именно, перераспределение ^ -рецепторов в мембране с их погружением в цитоплазму клетки, является основным механизмом контроля поверхности В-лимфоцитов, т.е. таким образом, происходит считывание информации о микроокружении клетки.

На фотографиях (рис.6) показаны формы распределения в В-лимфоцитах крови у овец методом прямого иммунопероксидазного окрашивания с использованием антител к В опытах использовали

кровь овец (п=6) романовской породы в возрасте 1 года.

\

V

с ■

□

¿а

V /

Рис.5. Различные формы распределения поверхностных иммуноглобулинов по периферии В-лимфоцитов крупного рогатого скота:, а,б - «кэп», эндоцитоз, в - «петч», г - «шеддинг»

□

У

□

*

о

Рис.6. Иммунопероксидазное окрашивание В-лимфоцитов крови овец, хЮОО. а - локализация Ig-peцenmopoв в форме «пэтч»; б - локализация /,§■-рецепторов в форме «кэп», в - цитоплазматическая форма (с-1%).

Также при иммуноцитохимическом анализе в крови обнаружены В-клетки с цитоплазматическими ^ (рис.б-в).

Эти клетки не окрашиваются по периметру клетки, т.е. мембранные иммуноглобулины отсутствуют. Вероятно, что с^-клетки являются плазматическими клетками, секретирующими

Таким образом, установлено, что в крови овец в возрасте одного года присутствуют В-клетки на разных стадиях дифференцировки.

В результате проведенных исследований показана возможность использования иммунопероксидазного метода для определения форм локализации ^-рецепторов и количества В-лимфоцитов крупного рогатого скота и овец.

в^М-клетки и ^М-антитела в развитии иммунной системы у телят

Важной задачей наших исследований являлась разработка специфичного метода для количественного определения В-лимфоцитов крупного рогатого скота и изучения механизма дифференцировки лимфоцитов из общей лимфоидной клетки-предшественницы, поскольку первыми ДОР, появляющимися в цитоплазме В-клетки, являются тяжелые цепи 1§М (ц-цепи). Распределение 1§М в В-лимфоцитах крови у телят в возрасте 1 мес. определяли методом иммунопероксидазного окрашивания с использованием в качестве первых антител МкА к ^М крупного рогатого скота. Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли методом простой радиальной иммунодиффузии, используя для определения и ^А

моноспецифические антисыворотки, а для ^М - моноклональные антитела.

Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови телят в возрасте 1 месяца составляет: - 12,3 мг/мл, ^М - 0,93 мг/мл, ^А - 0,44 мг/мл. Этот период в жизни телят является критическим, так как материнские иммуноглобулины отсутствуют, синтез собственных - не достигает нормального уровня. В связи с чем, возникает предрасположение к

воздействию патогенных микроорганизмов и неблагоприятных факторов внешней среды.

Количественные показатели В-системы на фоне нормальной фагоцитарной активности (42,4%) свидетельствуют о том, что иммунная система телят в возрасте одного месяца окончательно не сформирована и поэтому внешнее воздействие на организм в этот период может вызвать ее функциональный дисбаланс, что особенно негативно может проявиться у телят с пониженным содержанием иммуноглобулинов в.

При микроскопическом исследовании препаратов установлено, что клетки крови телят, экспрессирующие бГлМ, составляют 19,2%. Кроме того, в крови обнаружены с1£М- клетки. Такие клетки могут быть пре-В-клетками с цитоплазматическими ц-цепями или плазматическими клетками, секретирующими В результате проведенных исследований показано, что в крови телят в возрасте одного месяца присутствуют В-клетки на разных стадиях дифференцировки.

Динамика ^ и 1ЬТ-рецепторных клеток у стельных коров

Несмотря на достижения в области иммунологии репродукции, многие аспекты этой важной проблемы изучены не в полной мере, например, каким образом иммунная система перестраивается, предотвращая иммунологический конфликт при беременности. Известно, что нормальная беременность характеризуется угнетением материнского клеточного иммунного ответа против эмбриона при наличии гуморального ответа на определенные антигены плода. Оценка показателей иммунного статуса стельных коров имеет важное значение в своевременной коррекции естественной резистентности организма, в связи с определенной иммуносупрессией иммунной системы. У коров с низкими показателями иммунного статуса в этот период возрастает риск рождения нежизнеспособных телят. На этом основании изучение количественной динамики параметров иммунной системы стельных коров представляет

значительный интерес для характеристики взаимодействия между плацентой и иммунной системой, разработки практических приемов коррекции воспроизводительной функции животных.

Для оценки числа В-клеток использованы МкА к рогатого скота в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). Количество 1§ определяли в РИД. В результате проведенных экспериментов нами установлено, что у коров в период от 3-4 мес. до 5-6 мес. стельности повышается как относительное (от 24,8% до 34,6%), так и абсолютное количество (от 0,9x10% до 1,7х109/л) розеткообразующих клеток в крови. Данная тенденция наблюдается также в контрольной группе, но является менее выраженной (табл.7).

Таблица 7

Динамика иммунологических показателей у стельных коров

Показатели Группы животных

1 2 Контроль -1 Контроль - 2

Т-клетки % абс.(х109/л) 32,6±1,1 1,7±0,1 42,8±2,5 2,8±0,3 28,6±2,1 1,8±0,09 31,0±3,2 1,6±0,05

В-лимфоциты % абс..(х10®/л) 26,8±4,5 1,0±0,2 29,2±1,9 1,5±0,3 25,3±2,6 0,97±0,5 26,2±2,0 1,0±0,7

мг/мл 2,3±0,4 3,5±0,5 2,3±0,1 3,1±0,4

¡Яймг/ил 21,6±1,0 26,0±1,6 19,7±2,2 20,7±3,3

1^>Амг/мл 0,75±0,3 0,8±0,2 1,0±0,5 1,3±0,6

Примечание. р< 0,05. 1 - группа коров со сроком стельности 3-4 мес., 2 - группа коров со сроком стельности 5-6 мес. Контроль 1 и 2 - средние показатели нестельных коров с интервалом 2 мес.

Известно, что молекула СИ2 экспрессируется не только на Т-клетках, но и на НК-клетках. Супрессия специфического иммунного ответа матери компенсируется усилением естественного, врожденного иммунитета, в частности увеличивается количество натуральных киллеров. Следовательно,

повышение в крови стельных коров розеткообразующих клеток в указанный период объяснится увеличением числа НК-клеток.

Одновременно в результате исследований зарегистрировано незначительное повышение относительного и абсолютного содержания В-лимфоцитов (от 26,8% до 29,2%), по-видимому, связанное с увеличением иммуноглобулинов в крови стельных коров.

Как видно из данных таблицы 7, в крови коров в период с 3-4 мес. до 5-6 мес. стельности увеличивается уровень иммуноглобулинов Б с 21,6 мг/мл до 26,0 мг/мл, которые путем транссудации поступают в молочную железу и постнатально с молозивом передаются теленку.

Иммунная толерантность при беременности обусловлена продукцией блокирующих антител, вызывающих модуляцию иммунного ответа. Клеточные рецепторы для ^С - РсуЯ, экспрессируют макрофаги, НК-клетки, некоторые Т-клетки и нейтрофилы. Мономерный 1§б связываясь с Рс-рецепторами иммунокомпетентных клеток может изменять их биологическую активность. Возможно, увеличение в крови стельных коров уровня обусловлено выполнением им функции антител, участвующих в супрессии иммунного ответа на антигены плода.

Корреляционные взаимосвязи между различными изотопами иммуноглобулинов в сыворотках крови не стельных коров являются слабо положительными (г=0,3-0,5). Низкая степень сопряженности между показателями и косвенно подтверждает относительную

независимость системного и местного иммунитета.

При исследовании в динамике смена слабой корреляционной взаимосвязи на сильную свидетельствует о возрастании функциональной активности иммунокомпетентных клеток (г=0,64 —* г=0,84) и, соответственно, уровня иммуноглобулинов (г=0,27 —► г=0,73).

Таблица 8

Корреляция иммунологических показателей в сыворотке крови стельных

коров

Показатели Стельность 3-4 мес. Стельность 5-6 мес. Контроль

Т-клетки/В-клеткя 0,64 0,84 0,5

ДОЛ^ 0,27 0,73 0,3

0,25 0,56 0,4

0,3 0,71 0,47

Примечание. р<0,01 при сравнении показателей стельных коров

Повышение степени сопряженности между показателями иммунной системы в 5-6 мес. стельности подтверждает большое функциональное напряжение иммунной системы у стельных коров по сравнению с контрольной группой (табл.8). Смена слабых корреляционных взаимосвязей между иммунологическими параметрами на сильные свидетельствует об активизации клеточных и гуморальных звеньев иммунной системы в период плодоношения.

Таким образом, методом иммунофлуоресцентного анализа установлено, что в крови коров лимфоциты, несущие на своей поверхности 1{>М составляют 25,3%-26,2%, а в период 5-6 мес. стельности количество их возрастает до 29,2%. Параллельно показано увеличение количества Т-клеток и уровня 1§С в сыворотке крови коров второй половины стельности по сравнению с уровнем у коров со сроком стельности 3-4 месяца.

Изучение мембранных и свободных форм иммуноглобулина М и других представителей суперсемейства ^ представляет значительный интерес для понимания эволюционного становления иммунной системы. Молекулы 1§М появляются первыми в фило-,онто- и иммуногенезе и являются матрицей по которой строятся другие изотипы иммуноглобулинов по мере развития иммунной системы.

Функциональные свойства иммунокомпетентных 1ЬТ-рецепторных клеток у различных видов животных

Эволюционное развитие ^БР-рецепторов началось с возникновения шаперонов бактериальных клеток, имеющих (складчатое) строение,

ТИу-1 и Р0 - молекул прокариот и одноклеточных эукариот. Многие из этих белков представляют собой различные полимеры, в которых гомологичные ^-структуры разных цепей взаимодействуют между собой. Каждая такая структура кодируется отдельным экзоном. По-видимому, данное семейство генов ведет свое происхождение от гена, кодирующего одну гомологичную структуру, похожую на ТЪу-1 или р2-микроглобулин. Новые члены семейства возникали путем дупликаций экзонов, генов и генных сегментов, кодирующих иммуноглобулиновые молекулы. Эти молекулы обеспечивали межклеточную адгезию посредством гомофильного взаимодействия. В процессе эволюции многоклеточных произошел переход от гомофильного межклеточного взаимодействия к более совершенному гетерофильному взаимодействию для распознавания чужеродных агентов (Галактионов В.Г.,2004).

Контактное взаимодействие иммунокомпетентных клеток посредством рецепторов является первым этапом в осуществлении антигенспецифических реакций. Кооперация клеток друг с другом определяется «адгезивным кодом», то есть определенным для каждой клетки набором мембранных белков. Определение этих белков для каждого клона лейкоцитов позволит понять механизмы ранней дифференцировки, филогенетической связи макрофагов, Т- и В-клеток в процессе становления иммунной системы. Поверхностные ^-молекулы клеток являются чувствительной системой, реагирующей на изменения в макро- и микроокружении организма. В результате изучения и осмысления механизмов их многообразия и модуляции, возможно создание эффективных и безопасных препаратов против постоянно изменяющих свои поверхностные антигены патогенных микроорганизмов.

Заключительным этапом исследований было определение ILT-рецепторных клеток у различных видов животных. Изучая феномен розеткообразования у животных, находящихся на различных ступенях эволюционной лестницы - костистые рыбы, птицы, млекопитающие, было показано, что их лимфоциты обладают рецепторами к эритроцитам барана. Несмотря на то, что у этих видов животных структура иммунной системы различна, основные клеточные и молекулярные компоненты врожденного иммунитета достаточно консервативны. Количественные соотношения клеток с иммуноглобулиноподобными рецепторами, такими как CD2 (Т-клетки), CD 19 (В-клетки), CD4, CD8, у данных видов животных одинаковы: Т-клеток > В-клеток; Т-хелперов больше, чем цитотоксических лимфоцитов. Это доказывает функционально-рецепторный консерватизм Ig-подобных рецепторов лимфоцитов. Анализ способности к розеткообразованию у исследуемых видов животных показывает различие рецепторной активности В-клеток. Это обусловлено тем, что В-система иммунитета в процессе эволюции развивалась позже Т-системы. У млекопитающих, птиц и рыб есть тимус - центральный орган иммунной системы, место дифференцировки Т-клеток до зрелых форм. Увеличение иммунорегуляторного индекса (соотношение CD4 Т-хелперов к цитотоксическим CD8 Т-клеткам) от 1,3 у рыб и 1,2 у птиц до 1,7 у норок показывает различие в процессах дифференцировки Т-лимфоцитов, основанное на структурных особенностях тимуса.

Возможно, что С02-рецепторы, как адгезивные молекулы, появляются одними из первых в процессе филогенеза иммунокомпетентных клеток позвоночных животных. Еще П.Эрлих впервые указал на отсутствие видовой специфичности рецепторов у животных различных видов. А, по мнению В.Г.Галактионова филогенез клеток иммунной системы строится на рецепторной и функциональной общности клеток, участвующих в эволюционном процессе, в котором на пути от НК-клеток к Т-лимфоцитам

сохранилось несколько общих рецепторов, указывающих на филогенетическую связь между этими клетками, в частности СБ2.

В настоящее время не вызывает сомнений определяющее значение белков суперсемейства иммуноглобулинов в развитии адаптивного иммунитета, основанного на врожденных механизмах защиты от инфекций. Иммунная система, как система специфического распознавания чужеродных структур, на ранних этапах эволюции начала свое становление с появлением иммуноглобулиноподобных доменов, стабилизированных дисульфидными связями. Именно из этой молекулярной, конформационной структуры, свойственной только членам суперсемейства иммуноглобулинов, построены клеточные рецепторы, ответственные за распознавание антигена, а межклеточная кооперация с участием 1§8Р является ведущим фактором в развитии иммунных реакций, обуславливающих функционирование иммунной системы, распознавание и деструкцию структур, зондирующих защитные возможности организма. Проведенные исследования показали, что функциональная активность иммунокомпетентных клеток находится в тесной взаимосвязи с мембранными и растворимыми формами молекул иммуноглобулинов. Определив модуляцию ^БР в онто- и иммуногенезе и консерватизм в филогенезе была показана возможность оценки физиологических и молекулярных аспектов функционирования иммунной системы. В результате проведенных исследований было установлено, что 1ЬТ-рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток определяет их функциональную активность и роль в иммунных реакциях различного генеза.

ВЫВОДЫ

1. Получены диагностические препараты и усовершенствованы иммунологические методы для количественного определения и характеристики растворимых и мембранных форм белков суперсемейства иммуноглобулинов животных.

2. Разработаны способы получения иммуноглобулинов А (Б-^А) крупного рогатого скота из молозива и носовых секретов животных и

унифицирована технология получения и контроля моноспецифических реагентов к иммуноглобулинам крупного рогатого скота. Экспериментально установлена возможность использования полученных поли- и моноклональных антител в иммуноцитохимических реакциях для количественной оценки IgSF-содержащих клеток.

3. С использованием реакции непрямой иммунофлуоресценции на основе моноклональных антител установлено, что число sIgM-клеток в крови крупного рогатого скота составляет от 0,97±0,5 х109/л до 1,0±0,7 х109/л. При этом количество sIgM-клеток у стельных коров значительно выше и достигает значения 1,5±0,3 х109/л .

4. Методом иммунопероксидазного окрашивания определено количество sIgM-клеток в крови телят 30-дневного возраста, находящееся в пределах 16,6±4,5% - 19,2±0,8%. Установлено, что в крови телят (возраст 1 мес.) и овец (возраст 1 год) присутствуют В-клетки с цигтоплазматической формой иммуноглобулина класса М.

5. Разработан способ идентификации В-лимфоцитов крупного рогатого скота с применением иммунопероксидазного окрашивания клеток на основе моно- и поликлональных антител. Установлено, что мембранные иммуноглобулины В-клеток крови коров распределяются по периметру лимфоцита в форме «петч»/эндоцитоз на 68,9±3,9% клеток, «петч» (неоднородные скопления рецепторов) - 15,0±3,3%, «ринг» (равномерное распределение рецепторов по периметру клетки) - 10,5±3,3%, «кзп» (скопление рецепторов на одном из полюсов клетки) - 5,6±1,9%.

6. Показано, что наиболее эффективными для использования в РИД являются моноклональные антитела, распознающие антигенную детерминанту конформационного типа.

7. Установлено, что воздействие in vitro вакцины против рожи свиней на интактные лимфоциты мышей не оказывает значительного влияния на число СЩ-молекул и рецепторов к С3-компоненту комплемента на поверхности клеток. Аналогичное воздействие на лимфоциты вакцинированных

животных, приводит к повышению уровня экспрессии Ig-подобных рецепторов иммуноцитов, при этом индекс стимуляции равен 2,5-3,3 (в контроле 1,0). Двойной антигенный сигнал (in vivo и in vitro) усиливает экспрессию иммуноглобулиноподобных рецепторов в первые 14 суток иммунного ответа, когда в организме сохраняется достаточное количество активированных лимфоцитов.

8. Определено, что иммунизация мышей вакциной против рожи свиней приводит к образованию многорецепторных Т-клеток в первые сутки в костном мозге, а в последующие - в тимусе; при использовании вирус-вакцины аналогичные лимфоциты обнаружены в костном мозге на 14-е сутки. Показана ведущая роль костного мозга в индукции С02-рецепторной активности Т-клеток в поствакцинальном иммунном ответе.

9. Установлено продолжительное влияние антигенов бактериальной этиологии на процесс активации макрофагов. Так количество тимоцитов, взаимодействующих с перитонеальными макрофагами мышей на 2-10-14 сутки после введения вакцины против рожи свиней составило 212,3±30,4, 260,3±35,9 и 125,5 ±15,8 клеток/100 макрофагов соответственно (в контроле -2б,0±0,5).

10. Показано, что вторичный иммунный ответ на введение Т-независимого антигена 2 типа (ТН-2) характеризуется увеличением количества В-клеток костного мозга и селезенки. Установлено увеличение количества IgGl в селезенке, что подтверждает участие Т-клеточных факторов в TH-2-иммуногенезе.

11. Предложен диагностический алгоритм для изучения эффективности иммунотропных препаратов на модели лабораторных мышей, включающий следующие показатели: положительная корреляция (> 0,7) между розеткообразующей активностью клеток крови и лимфатических узлов; положительная корреляция между относительным содержанием лимфоцитов и розеткообразующих тимоцитов; отрицательная корреляция (> - 0,7) между нейтрофилами и Т-клетками тимуса. Разработанная схема позволяет

45

определять уровень корреляционной связи по трем соотношениям, характеризующим сбалансированность иммунной системы.

12. Показано, что иммунный статус коров в период 3-6 мес. стельности характеризуется значительным повышением концентрации IgG, который затем переходит в молозиво, где является основным изотипом иммуноглобулинов и доминирующим фактором колострального иммунитета. Концентрация в сыворотке крови составляет IgG - 29,2± 5,9 мг/мл, IgM - 2,6 ±0,6 мг/мл, IgA -1,0± 0,3 мг/мл.

13. Установлена филогенетически детерминированная рецепторная и функциональная общность С02-рецепторных клеток у животных, находящихся на различных ступенях эволюционной лестницы и отличающихся строением иммунной системы. Показано, что основным фактором иммунитета у костистых рыб является фагоцитоз, т.е. врожденная система защиты организма, у кур - клеточные реакции, у млекопитающих -клеточно-гуморальные взаимодействия.

14. Показано, что белки суперсемейства иммуноглобулинов в мембраносвязанной и секретируемой формах (CD2, CD4, CD8, CD19, slg, Ig, антитела) определяют функциональную активность лейкоцитов и играют ведущую роль в адаптивном иммунитете.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработан комплексный методический подход к оценке Т- и В-клеточных звеньев иммунной системы крупного рогатого скота и лабораторных животных на основе определения биологических свойств белков суперсемейства иммуноглобулинов, который может быть использован для определения эффективности иммунотропных препаратов, используемых в ветеринарной практике.

Предложена технология изготовления и контроля препаратов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях рогатого скота.

Для количественного определения иммуноглобулинов класса А методом радиальной иммунодиффузии, следует использовать стандарт из гомологичной биологической жидкости в связи с полиморфизмом данного изотипа.

Для количественного определения B-лимфоцитов крупного рогатого скота рекомендуем реакцию непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител к IgM.

Метод иммунопероксидазного окрашивания с поли- и моноклональными антителами к Ig может быть использован для определения форм распределения Ig-рецепторов на мембране клетки, что дает возможность изучения молекулярных аспектов иммуногенеза у животных.

Для оценки состояния здоровья животных рекомендуем использовать индексные показатели и корреляционный анализ, которые более адекватно отражают состояние иммунной системы, чем отдельные его параметры, и что в значительной мере повысит диагностическую эффективность иммунологического мониторинга.

Разработанные методы могут быть использованы для оценки иммунного статуса животных, в том числе морских млекопитающих, в рамках программ по оценке здоровья популяций животных, обитающих в естественных условиях.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ Монографии, патенты РФ, методические рекомендации

1. Ездакова И.Ю. Рецепторы иммунного узнавания у животных /И.Ю.Ездакова. - М.:Компания Спутник+, 2008.- 88 е.: ил.; Библиогр.:с.72-73.-500 экз.- ISBN 978-5-364-01149-7.

2. A.c. 1560549 СССР. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus, используемый для получения моноклональных антител к IgM рогатого скота / Ю.Н.Федоров, В.К.Сологуб, Т.А. Феоктистова,.И.Ю. Ездакова и др.- №4229427; заявл.15.04.87; опубл. 3.01.90.

3. Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных: методические рекомендации /ГШ.Смирнов, М.И.Гулюкин, Ю.Н.Федоров,... И.Ю. Ездакова... и др.- Россельхозакадемия, Сиб. отд-ние, ГНУ ИЭВС и ДВ, ГНУ ВИЭВ, ФГОУ НРИПК АПК МСХ РФ, НГАУ. -Новосибирск, 2003 .-32 с.

4. Пат. 2277421 Российская Федерация, МПК А61К 35/12, А61К 35/20. Способ получения секреторного иммуноглобулина А из молозива рогатого скота / КШ.Федоров, И.Ю. Ездакова, Т.А.Чеботарева; заявитель и патентообладатель ГНУ ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко.- №2005109539/15; заявл.05.04.05; опубл. 10.06.06, Бюл.№16.-5с.

5. Пат. 2288008 Российская Федерация, МПК А61К 39/395, А61К 35/12. Способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости животных / Ю.Н.Федоров, И.Ю.Ездакова, Т.А.Чеботарева; заявитель и патентообладатель ГНУ ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко.-№2005109538/15; заявл.05.04.05; опубл. 27.11.06, Бюл.№33.-4с.

6. Федоров Ю.Н. Методические рекомендации по количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток животных / Ю.Н.Федоров, И.Ю. Ездакова //Сборник «Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины».-2008.-4.- С. 144-158

7. Пат. 2293330 Российская Федерация, МПК G01N 33/53. Способ определения антител/ И.Ю.Ездакова; заявитель и патентообладатель ГНУ ВИЭВ им. Я .Р.Коваленко.- №2005120538/15; заявл.04.07.05; опубл. 10.02.07, Бюл.№4.-5с.

Статьи в периодических научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук

8. Определение специфичности моноклональных антител к отдельным классам иммуноглобулинов крупного рогатого скота и свиньи методом «вестерн-блоттинга»/ О.А.Верховский, КШ.Федоров, Т. А .Феоктистова, И,Ю.Ездакова и др. // Сельскохозяйственная биология. - 1993.- № 6.- С. 135141.

9. Использование моноклональных антител для оценки антигенных свойств иммуноглобулинов животных / О.А. Верховекий, Ю.Н.Федоров,

В.К.Сологуб, Т.А.Феоктистова, И.П. Федорова, И.Ю.Ездакова // Сельскохозяйственная биология,- 1995.-№ 4.-С. 94-99.

10. Изотипспецифические антителосекретирующие клетки у мышей в процессе иммуногенеза. /А.И. Жаданов, И.Ю. Ездакова, О.А. Верховский, Ю.Н. Федоров // Ветеринария.-2000.- №11.- С.22-26.

11. Кинетика синтеза различных типов антителосекретирующих клеток костного мозга мышей в процессе иммуногенеза / Ю.Н. Федоров, О.А.Верховский, А.И.Жаданов, И.Ю.Ездакова // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук.- 2000.-№ 5.-С. 42-44.

12. Ездакова И.Ю. Динамика количества Т-клеток и их взаимодействие с антигенпредставляющими клетками в процессе иммунного ответа / И.Ю .Ездакова, Ю.Н.Федоров, А.И. Жаданов // Цитология.- 2001.- Т. 43.- № 9-.С. 858.

13. Количественное определение иммуноглобулинов А-класса в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммуноферментного анализа и радиальной иммунодиффузии / И.Ю. Ездакова, Е.В.Борзенко, Т.А.Феоктистова, Ю.Н. Федоров// Сельскохозяйственная биология.- 2002.-№ 2.-С. 118-122.

14. Ездакова И.Ю. Влияние Trypanosoma sp. на иммунокомпетентные клетки серебряного карася /И.Ю.Ездакова, М.Н. Борисова, Л.П. Дьяконов //Ветеринария.-2005.-№ 12.-С. 28-31.

15. Ездакова И.Ю. Влияние зимозана на клетки крови серебряного карася (Carassius auratus gibelio)/ И.Ю.Ездакова, М.Н. Борисова // Ветеринарная патология.-2007.-№ 2,- С. 205-207.

16. Ездакова И.Ю. Динамика иммунологических показателей стельных коров/ И.Ю.Ездакова //Ветеринарная патология.- 2007.-№ 2.-С. 148-151.

17. Ездакова И.Ю. Изучение морских млекопитающих - новое направление экологической иммунологии / И.Ю.Ездакова, О.В.Соколова// Веткорм.-2008.-№ 4.- С. 14-15.

18. Ездакова И.Ю. Динамика розеткообразующих клеток кур в онтогенезе / И.Ю. Ездакова, О.М.Чуйко, Е.О. Чадина //Ветеринарная патология.-2008.-№ 2.-С. 62-64.

19. Ездакова И.Ю. Локализация IgM в В-клетках периферической крови крупного рогатого скота/ И.Ю.Ездакова// Аллергология и иммунология.-2008,- Т. 9.- № З.-С. 274.

20. Бздакова И.Ю. Корреляционный анализ иммунологических показателей при введении иммунотропных препаратов / И.Ю.Ездакова// Веткорм.-2009.-№2.-С. 18-19.

21. Ездакова И.Ю. Динамика sIgM-клеток и IgM-антител в периферической крови коров в период плодоношения / И.Ю.Ездакова// Аллергология и иммунология,- 2009.- Т. 10,- № 2.-С. 295.

22. Ездакова Й.Ю. Взаимосвязи между основными изотопами иммуноглобулинов у овец/ И.Ю.Ездакова, С.Н.Степнова //Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук.-2010.-№5.-С.44-47 (Russian agricultural science.-2010.- Vol.36.-№5).

Статьи в других периодических изданиях, в материалах конференций и сборниках научных трудов

23. Иммуноферментный метод количественного определения IgA-изотипа в биологических жидкостях крупного рогатого скота / Т.А.Феоктистова, И.Ю.Ездакова, КХН.Федоров, Е.В.Борзенко // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Сб. науч. тр. -Щелково: ВНИиТИБП.- 2000. - С. 279-281.

24. Разработка и совершенствование методов оценки В-системы иммунитета у животных / О.А.Верховский, Т. А .Феоктистова, Ю.Н.Федоров, И.Ю.Ездакова и др. // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Сб. науч.тр. - Щелково:ВНИиТИБП.- 2000. - С. 273-275.

25. Quantitation of total IgG-, IgM-, and IgA-secreting cells in mice immunized with live erysipelas vaccine and challenged with the virulent strain of Erysipelothrix rhusiopathiae/ Yu.N.Fedorov, A.I.Zhadanov, O.A.Verkhovsky., I.Yu.Ezdakova. //Sixth International Veterinary Immunology Symposium: Abstracts book.-2001.- 206.- P.174.

26. Количественная характеристика иммуноглобулинов А-класса в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммунохимического анализа /Е.В.Борзенко, И.Ю.Ездакова, Ю.Н.Федоров, Т.А.Феоктистова // Труды ВИЭВ.- 2003.- Т. 73.- С. 217-221.

27. Ездакова И.Ю. Оценка иммуномодулирующей активности вакцины против рожи свиней (ВР-2) в процессе иммуногенеза / И.Ю.Ездакова, Ю.Н.Федоров, ИЛ.Третьякова // Труды ВИЭВ.- 2003.- Т.73,- С. 200-204.

28. Моноклональные антитела к иммуноглобулинам класса А рогатого скота: получение, характеристика, применение / Т.А.Феоктистова, Ю.Н.Федоров, И.Ю.Ездакова, В.К.Сологуб// Труды ВИЭВ.-2003.- Т. 73,- С. 197-200.

29. Ездакова И.Ю. Динамика показателей клеточного иммунитета при введении препаратов с иммунотропной активностью / И.Ю.Ездакова, И.В.Третьякова// Материалы Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМ и Б им.К.И.Скрябина.- М: МГАВМиБ.-2004.-С. 190-194.

30. Влияние иммунотропных препаратов на иммуногенез при вакцинации. /И.Ю.Ездакова, Ю.Н.Федоров, А.Ю.Ханис, Г.И.Боряев // «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее»: Сб.науч.тр.-Щелково.-ВНИиТИБП .-2004.- С. 47-52.

31. Sokolova O.V.Adaptive changes of the serum immunoglobulins level in the black sea bottlenose dolphin (Tursiops truncates)/ Sokolova O.V., T.E.Denisenko, I.Yu. Ezdakova // Marine Mammals and man in coastal ecosystem: Can they co-exist? : Abstracts book.-Gdynia:ECS.- 2006.- P. 180.

32. Ездакова И.Ю. Динамика мембранных s-Ig лимфоцитов мышей в процессе иммуногенеза /И.Ю.Ездакова// «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ.-2006.- С. 472-474.

33. Ездакова И.Ю. Фагоцитарная активность иммунокомпетентных клеток серебряного карася / И.Ю.Ездакова // «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ.-2006,- С. 475-477.

34. Ездакова И.Ю. Выявление иммуноглобулинов на мононуклеарных клетках лимфоидных органов мышей / И.Ю.Ездакова // «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях»: Сб. науч. тр.-Краснодар.-2006.- С. 400-403.

35. Ездакова И.Ю. Определение уровня адгезивной активности лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота / И.Ю.Ездакова // «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»: Сб. науч.тр,-Щелково: ВНИиТИБП.-2006.- С. 157-160.

36. Ездакова И.Ю. Изучение иммунного статуса лабораторных мышей под влиянием пробиотиков / И.Ю.Ездакова, В.В.Субботин// «Научные

основы производства ветеринарных биологических препаратов»: Сб. науч.тр. -Щелково: ВНИиТИБП.-2006.- С. 182-187.

37. Ездакова И.Ю. Динамика иммунокомпетентных клеток в процессе иммунного ответа на Т-независимые и Т-зависимые антигены / И.Ю.Ездакова //Ветеринарнаямедицина.-2007.-№ 1.-С. 11-12.

38. Ездакова И.Ю. Определение показателей В-системы иммунитета телят/ ИЛО.Ездакова // Ветеринарная медицина.- 2007.-№ 4.-С. 10-11.

39. Ездакова И.Ю. Поверхностные иммуноглобулины В-клеток крови крупного рогатого скота / И.КХЕздакова // Ветеринарная медицина.- 2007.-№ 4.-С. 11-13.

40. The cross-reactivity of the blood serum albumens from Steller sea lion pups (eumetopiasjubatus) / I.Yu.Ezdakova., О. V. Sokolova, Т. E. Denisenko, V. N. Burkanov // Marine mammals in time: past, present and future: Abstract book.-Egmond aan Zee:ECS- 2008.- P. 191-192.

41. The Ladoga ringed seal (Pusa hispida ladogensis) as a species - indicator of the influence of global warming on the wild population of the marine mammals/ O.V.Sokolova., T. Yu. Lisitsina, I.Yu. Ezdakova,, Т. E. Denisenko // Marine mammals in time: past, present and future: Abstract book.- Egmond aan Zee:ECS.-2008.- P. 151-152.

42 Ездакова И.Ю. Иммуноцитохимический метод определения В-лимфоцитов / И.Ю.Ездакова //«Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел»: Сб. науч. тр.-М:ВИЗВ.- 2008.- С. 329-332.

43. Ездакова И.Ю. Динамика адгезивной активности перитонеальных макрофагов мышей при вакцинации/ И.Ю.Ездакова// Труды ВИЭВ.- 2009.Т. 75 .-С. 235-238

44. Ездакова И.Ю Фагоцитарная активность клеток крови рыб семейства карповых /И.Ю. Ездакова, Л.П. Дьяконов // Труды ВИЭВ.- 2009.- Т. 75,- С. 239-241

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 слг 25.09.2000 г. Подписано в печать 19.10.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,0 Печать авторефератов (495)730-47-74,778-45-60

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Eздакова, Ирина Юрьевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Молекулярное единство иммунной системы.

2.2. Белки суперсемейства иммуноглобулинов - молекулы иммунного распознавания.

2.3. Фенотипическое и функциональное разнообразие ГЬТ-иммуно-компетентных клеток.

2.4. Методология исследования иммунной системы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3 .МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Разработка и оптимизация методов количественной оценки иммуноглобулинов и клеток с иммуноглобулиноподобными рецепторами.

4.1.1. Разработка методов получения препаратов для количественного определения иммуноглобулинов.

4.1.1.1. Выделение IgG из сыворотки крови и молозива крупного рогатого скота.

4.1.1.2. Разработка способа получения IgA из носовых секретов и молозива крупного рогатого скота.

4.1.1.3. Способ получения иммуноглобулинов j Gi из сыворотки крови мышей (Mus. Musculus).

4.1.1.4. Получение и контроль антисывороток к иммуноглобулинам.

4.1.1.5. Иммунохимические свойства моноклональных антител к IgM и slgA рогатого скота.

4.1.2. Разработка методов изучения и оценки растворимых и мембранных форм белков суперсемейства иммуноглобулинов.

4.1.2.1. Использование поли-и моноклональных антител к Ig в реакции'простой радиальной иммунодиффузии.

4.1.2.2. Сравнительная оценка РИД и ИФА для количественного определения иммуноглобулинов А.

4.1.2.3. Оптимизация различных вариантов реакции» розеткообразования для определения функциональной активности IgSF иммуноцитов.

4.1.2.4. Метод исследования адгезивной активности лимфоцитов крупного рогатого скота.

4.1.2.5. Определение лимфоцитов с поверхностными иммуноглобулинами лимфоцитотоксическим методом.139'

4.1.216. Разработка метода идентификации Ig-рецепторов В-лимфоцитов.

4.2. Характеристика протективных свойств IgSF мышей» в процессе поствакцинального иммуногенеза.

4.2.1. Динамика адгезивной активности лимфоцитов в процессе иммуногенеза (in vivo и in vitro).

4.2.2. Изменения ILT-рецепторного профиля иммунокомпетентных клеток после вакцинации.

4.2.3. Оценка функциональной активности В-клеток в процессе поствакцинального иммунного ответа.

4.2.4. Корреляционный анализ показателей иммунокомпетентных клеток при введении иммунотропных препаратов.

4.2.5. Сравнительный анализ функционально-рецепторной активности лимфоцитов в процессе иммунного ответа на Т-зависимый и Т-независимый антигены.

4.2.6. Взаимосвязи белков IgSF при пероральном и подкожном способе введения антигена.

4.3. Взаимосвязи различных форм Ig крупного рогатого скота и овец в различные периоды онтогенеза.

4.3.1. Корреляция уровней иммуноглобулинов в сыворотке крови крупного рогатого скота.

4.3.2. Анализ взаимосвязи основных изотипов иммуноглобулинов в крови овец в онтогенезе.

4.3.3. Формы локализации ^-рецепторов В-лимфоцитов в периферической крови коров и овец.

4.3.4. sIgM-клeтки и

§Д4-антитела в развитии иммунной системы у телят.

4.3.5. Динамика и ШГ-рецепторных клеток у стельных коров.

4.4. Функциональные свойства иммунокомпетентных 1ЬТ-рецепторных клеток у различных видов животных.

4.4.1. Динамика розеткообразующих кле'трк у кур в процессе онтогенеза

4.4.2. Модуляция иммунокомпетентных клеток серебряного карася.

4.4.3. Определение 1ЬТ-рецепторных клеток у различных видов животных.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация и характеристика биологических свойств белков суперсемейства иммуноглобулинов животных"

В основе научного прогресса лежит эволюция методических приемов, используемых для решения современных задач иммунологии. Внедрение новой методологии, совершенствование методов исследования — главный фактор повышения уровня знаний в области; молекулярной биологии иммунного ответа; где ключевую роль играют антитела, рецепторы иммунокомпетентных клеток, межклеточные взаимодействия.

Механизмы врожденного и адаптивного иммунитета основаны на межклеточной-кооперации Tjtex основных популяций лейкоцитов: макрофагов, Т- и B-лимфоцитов, которые на разных этапах онто- и иммуногенеза включаются? Bt иммунные реакции, причем доля их участия зависит от вида инфекции (Цинкернагель Р., 2008). Иммунокомпетентные клетки несут на своей поверхности специфические рецепторы, с помощью которых их можно идентифицировать. Принципы классификации рецепторов - антигенных маркеров лейкоцитов человека, выявляемых моноклональными антителами (МкА), были сформулированы на 1-м Международном совещании в Париже в 1982 г. Эти маркеры обозначили как cluster of differentiation - символом CD и соответствующими номерами. К настоящему времени создана единая номенклатура системы CD, состоящая из более 300 дифференцировочных молекул клеток человека и животных. 30% CD-антигенов относится к суперсемейству иммуноглобулинов (IgSF), при участии которых происходит распознавание антигенов. Они содержат общие структурные элементы, характеризуются определенной пространственной доменной организацией и статистически значимой гомологией аминокислотных последовательностей (Ройт А. и др., 2000; Рабсон А. и др., 2006; Бурместер F.-P. И др., 2007 и др.). IgSF, как одни из важнейших молекул иммунной системы, обеспечивают защиту от микроорганизмов, поврежденных и генетически измененных клеток (Ярилин A.A., 1999; Давтян Т.К. и др.,2005; Сидорова EJE., 2006 и др.).

Наиболее иммунологически значимыми белками IgSF являются:

- иммуноглобулины- (Ig), существующие в двух формах: растворимые белки (секретируемые антитела) и мембраносвязанные (slg), являющиеся поверхностными рецепторами В-лимфоцитов;

- иммуноглобулиноподобные молекулы (ILT), представляющие собой мембранные рецепторы иммунокомпетентных клеток.

Среди мембраносвязанных белков IgSF большой интерес представляют рецепторы, находящиеся на поверхности Т-клеток (CD2, CD4, CD8 и др.), макрофагов^ (Fe- рецепторы) и B-лимфоцитов (BCR — антигенный рецептор В-клетки). Функциональная и количественная характеристика данных белков является чувствительным маркером оценки состояния иммунной системы (Кирюхин A.B. и др., 2003; Добротина H.A. и др., 2005; Артюхов ВТ и др., 2006 и др.).

Вместе с тем, следует отметить, что закономерности формирования иммунного ответа на- молекулярном уровне у животных, в частности, механизмы перекрестного связывания антигена с рецепторами B-клеток, роль адгезивных молекул Т-лимфоцитов и макрофагов в транедукции сигнала при иммунизации, изучены недостаточно. Разработка методов исследования IgSF, характеристика их биологических свойств, а именно функциональных и рецепторных, в процессах онто- и иммуногенеза является перспективным направлением для определения иммунологической эффективности биологических препаратов, создания новых безопасных вакцин — основы специфической профилактики болезней животных.

В настоящее время для оценки состояния иммунной системы разработан комплекс лабораторных методов, позволяющий выявлять изменения на молекулярно-клеточном уровне. Прежде всего, это иммуноцитохимический анализ мембранных и цитоплазматических структур иммуноцитов (Haines D.M. и West К.Н., 2005; Саидов М.З. и др., 2006; Высочин И.В. и др., 2006 и др.). Этот и другие способы определения и характеристики IgSF послужили методологической основой наших исследований.

Цель- работы - разработка современной методологии идентификации белков суперсемейства иммуноглобулинов и характеристика их биологических свойств в процессе фило-., онто- и иммуногенеза.

Для достижения указанной цели в работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать способы получения иммуноглобулинов изотипов G, M, А (IgG, IgM, IgA) рогатого скота.

2. Получить моноспецифические антисыворотки для количественной оценки иммуноглобулинов изотипов G, А в биологических жидкостях организма рогатого скота и провести сравнительный анализ с моноклональными антителами к Ig.

3. Усовершенствовать методы изучения и оценки растворимых и „ мембранных форм белков суперсемейства иммуноглобулинов

4. Разработать методы исследования В-клеток крупного рогатого скота с использованием моноклональных антител к IgM.

5. Изучить протективные свойства белков суперсемейства иммуноглобулинов у мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза.

6. Дать характеристику секретируемым и мембранным (slg) формам Ig крупного рогатого скота и овец в различные периоды онтогенеза.

7. Провести оценку количественных изменений клеток, несущих рецепторные белки IgSF у различных видов животных.

Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР ВИЭВ задание 01.01.05 M МП «Разработать и освоить производство моноспецифических антисывороток и моноклональных антител для количественного определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных», этап Н.02.2 «Провести комплексные исследования по оценке функционального состояния гуморальных и клеточных факторов иммунной системы у мышей в процессе иммуногенеза»; задание 01.01.09 M МП «Разработать и освоить производство набора компонентов для оценки иммунного статуса организма животных»; задание 02102.11 РИГИ! «Изучить механизмы формирования» иммунного ответа у животных в процессе онто- и иммуногенеза, разработать ^усовершенствовать методы иммунологическогомониторинга».

Научная» новизна. Теоретически обоснована и: экспериментально подтверждена' концепция« комплексного подхода к оценке состояния иммунной системы в процессе онто- и иммуногенеза на основе функционально-рецепторной характеристики белков суперсемейства1 иммуноглобулинов:

Установлено, что рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток определяет их функциональную активность в реакциях различного генеза.

На основании результатов проведенных исследований:

- получен штамм гибридных культивируемых клеток животных Мш.тизайш, используемый? для получениямоноклональных антител к; ^М рогатого скота (Авторское свидетельство, № 1560549 от 3.01.90 г. в соавторстве);

- разработан способ выделения иммуноглобулина А из молозива крупного рогатого скота (патент на изобретение № 2277421 от 5 апреля 2005 г. в соавторстве);

- разработан способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости крупного рогатого скота (патент на изобретение № 2288008 от 27 ноября 2006 г. в соавторстве);

- разработан метод иммунопероксидазного окрашивания клеток для количественной оценки В-лимфоцитов крупного рогатого скота на основе моноклональных антител к иммуноглобулину М (патент на изобретение № 2293330 от 10 февраля 2007 г.).

Впервые определены формы, локализации поверхностных иммуноглобулинов В-клеток у крупного рогатого скота . и проведен корреляционный анализ содержания растворимого-и мембраносвязанного IgM в периферической; крови животных данного вида.

Впервые изучена динамика содержания я^М-клеток у коров в период плодоношения.

Практическая значимость. Систематизированы экспериментальные данные о функционально-рецепторной характеристике содержащие выводы по методическому подходу к изучению, иммунной системы животных, а также даны конкретные рекомендации, которые позволяют интенсифицировать исследования в области ветеринарной иммунологии.

Разработаны в соавторстве и утверждены в установленном порядке:

Набор компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной^ иммунодиффузии», утвержденным Министерством Сельского хозяйства и продовольствия РФ, ТУ № 9388-0039-00008064-96, 1996 г.;

- временное наставление по применению набора компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии № 13-7-2/617, утвержденное Департаментом Ветеринарии МСХиП РФ от 27.05.96 г.;

- методические рекомендации «Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных» (Сибирское отделение РАСХН, Новосибирск, 2003 г.);

- технологический регламент по изготовлению, контролю и применению набора реагентов для количественного определения иммуноглобулина в в биологических жидкостях рогатого скота (секция «Инфекционные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 30.09.2010 г. протокол № 3);

- технологический регламент, по изготовлению, контролю и применению набора реагентов для количественного определения иммуноглобулина А в биологических жидкостях рогатого скота (секция- «Инфекционные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 30.09.2010 г. протокол № 3).

Рассмотрены и утверждены в установленном порядке Отделением ветеринарной медицины РАСХН:

- методические рекомендации по количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток животных (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 20 мая 2005 г., протокол № 1) (авторы: Ю.Н.Федоров и И.Ю.Ездакова); методические рекомендации по определению В-клеток иммунопероксидазное окрашивание) (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г., протокол № 2) (автор: И.Ю.Ездакова);

- методические рекомендации «Определение поверхностных структур иммунокомпетентных клеток методом иммунофлуоресценции» (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г., протокол № 2) (автор: И.Ю.Ездакова);

- методические наставления по использованию моноклональных антител для оценки уровня иммуноглобулинов классов М и А в биологических жидкостях крупного рогатого скота и овец (секция «Инфекционные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.04.2010 г. протокол № 2) (авторы: И.Ю.Ездакова и Т.А.Чеботарева).

Получены: серебряная медаль на 8-ой Российской агропромышленной выставке «Золотая осень» «За Способ получения секреторного иммуноглобулина А крупного рогатого скота» (2006 г.); золотая медаль на 10-й «За способ определения антител в иммуноцитохимическом анализе» (2008 г.); медали «Лауреат ВВЦ» в 1998 г. и в 2008 г. за разработку препаратов для оценки состояния иммунной системы животных; «Звезда И.И.Мечникова» за инновационное развитие и продвижение научного наследия И.И.Мечникова в 2010 г.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены:

- на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИиТИБП «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2000); Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2001); Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМиБ им. К.КСкрябина (Москва, 2004); научной конференции «30 лет развития современных направлений клеточной биотехнологии» (Москва, 2005); секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2005, 2008); Международной- научной конференции «Современные проблемы клеточной биотехнологии и сохранение генетических ресурсов» (Москва, 2006); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р.Коваленко (Москва, 2006); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы-ветеринарии в современных условиях», посвященной 60-летию Краснодарского научно-исследовательского ветеринарного института (2006); 20- 21- и 22-ой Международных ежегодных конференциях Европейского сообщества по изучению китообразных (ECS) (Гдыня, 2006; Сан-Себастьян, 2007; Эгмонд,

2008); Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2008); Ученом Совете, Методической комиссии ВИЭВ (1995-2008); УП съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург,

2009), «Московские Мечниковские чтения» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 44 научные работы, в том числе 15 работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ, монография «Рецепторы иммунного узнавания, у животных», 1 авторское свидетельство и 3 патента на изобретение.

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных, научных статьях. Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи д.б.н., профессору ЛП.Дьяконову, д.в.н., профессору М.А.Сидорову, д.б.н., профессору О.А.Верховскому, к.б.н. Т.А Чеботаревой.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на •332 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Eздакова, Ирина Юрьевна

6. выводы

1. Получены диагностические препараты и усовершенствованы иммунологические методы для характеристики растворимых и мембранных форм белков суперсемейства иммуноглобулинов животных в процессе онто-, иммуно- и филогенеза.

2.- Разработаны способы получения иммуноглобулинов A (S-IgA) крупного рогатого скота из молозива и носовых секретов животных и унифицирована технология получения и контроля моноспецифических реагентов к иммуноглобулинам крупного рогатого скота. Экспериментально установлена возможность использования полученных поли- и моноклональных антител в иммуноцитохимических реакциях для количественной оценки IgSF-содержащих клеток.

3. С использованием реакции непрямой иммунофлуоресценции на основе моноклональных антител установлено, что число sIgM-клеток в крови крупного рогатого скота составляет от 0,97±0,5 х109/л до 1,0±0,7 х109/л. При этом количество sIgM-клеток у стельных коров значительно выше и достигает значения 1,5±0,3 х109/л .

4. Методом иммунопероксидазного окрашивания определено количество sIgM-клеток в крови телят 30-дневного возраста, находящееся в пределах 16,6±4,5% - 19,2±0,8%. Установлено, что в крови телят (возраст 1 мес.) и овец (возраст 1 год) присутствуют В-клетки с цитоплазматической формой иммуноглобулина класса М.

5. Разработан способ идентификации В-лимфоцитов крупного рогатого скота с применением иммунопероксидазного окрашивания клеток на основе моно- и поликлональных антител. Установлено, что мембранные иммуноглобулины В-клеток крови коров распределяются по периметру лимфоцита в форме «петч»/эндоцитоз на 68,9±3,9% клеток, «петч» (неоднородные скопления рецепторов) - 15,0±3,3%, «ринг» (равномерное распределение рецепторов по периметру клетки)1 - 10,5±3,3%, «кэп» (скопление рецепторов на одном из полюсов клетки) - 5,6±1,9%.

6. Показано, что наиболее эффективными для* использования в РИД* являются моноклональные антитела, распознающие антигенную детерминанту конформационного типа:

7. Установлено, что воздействие in vitro вакцины против рожи свиней на интактные лимфоциты мышей не оказывает значительного? влияния на число С02-молекул и рецепторов к Сз-компоненту комплемента на поверхности клеток. Аналогичное воздействие на лимфоциты вакцинированных животных, приводит к повышению уровня экспрессии Ig-подобных рецепторов иммуноцитов, при этом индекс стимуляции равен 2,5-3,3 (в контроле 1,0). Двойной антигенный сигнал (in vivo и in vitro) усиливает экспрессию иммуноглобулиноподобных рецепторов в первые 14 суток иммунного ответа, когда в организме сохраняется достаточное количество активированных лимфоцитов.

8. Определено, что иммунизация мышей вакциной против рожи свиней приводит к образованию многорецепторных Т-клеток в первые сутки в костном мозге, а в последующие - в тимусе; при использовании вирус-вакцины аналогичные лимфоциты обнаружены в костном мозге на 14-е сутки. Показана ведущая роль костного мозга в индукции СБ2-рецепторной активности Т-клеток в поствакцинальном иммунном ответе.

9. Установлено продолжительное влияние антигенов бактериальной этиологии на процесс активации макрофагов. Так количество тимоцитов, взаимодействующих с перитонеальными макрофагами мышей на 2-10-14 сутки после введения вакцины против рожи свиней составило 212,3±30,4, 260,3±35,9 и 125,5 ±15,8 клеток/100 макрофагов соответственно (в контроле — 26,0±0,5).

10. Показано, что вторичный иммунный ответ на введение Т-независимого антигена- 2 типа (ТН-2) характеризуется увеличением количества В-клеток костного мозга и селезенки. Установлено увеличение количества IgGl в селезенке, что подтверждает участие Т-клеточных факторов в TH-2-иммуногенезе.

11. Предложен диагностический алгоритм для изучения эффективности иммунотропных препаратов на модели , лабораторных мышей; включающий следующие показатели: положительная' корреляция (> 0,7) между розеткообразующей активностью клеток крови и лимфатических, узлов; положительная корреляция между относительным содержанием лимфоцитов, и розеткообразующих тимоцитов; отрицательная корреляция (> - 0,7) между нейтрофилами и Т-клетками тимуса. Разработанная схема; позволяет определять уровень корреляционной связи по трем соотношениям, характеризующим'сбалансированность иммунной системы:

12. Показано; что иммунный статус коров ¡в период 3-6; мес. стельности характеризуется значительным повышением концентрации который затем переходит в. молозиво, где является* основным изотипом иммуноглобулинов да доминирующим фактором колострального иммунитета. Концентрация в сыворотке крови составляет 1§0 - 29,2± 5,9 мг/мл, - 2,6 ±0,6 мг/мл, 1§А - 1,0± 0,3 мг/мл.

13. Установлена филогенетически детерминированная? рецепторная и функциональная общность С02-рецепторных клеток у животных, находящихся на различных ступенях эволюционной лестницы и отличающихся строением иммунной системы. Показано, что основным фактором иммунитета у костистых рыб является фагоцитоз, т.е. врожденная система защиты организма, у кур - клеточные реакции, у млекопитающих — клеточно-гуморальные взаимодействия.

141 Показано, что белки суперсемейства иммуноглобулинов в мембраносвязанной и секретируемой формах (СЭ2, СБ4; (Ш8, (Ш19, антитела)^ определяют функциональную активность лейкоцитов и играют ведущую,роль в адаптивном иммунитете. .

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Предложен комплексный методический подход к оценке Т- и В-клеточных звеньев иммунной системы крупного рогатого скота и лабораторных животных на основе- определения биологических свойств белков суперсемейства иммуноглобулинов, который может быть использован для определения эффективности иммунотропных препаратов, используемых в ветеринарной практике.

Для научно-исследовательских учреждений предложена технология получения препаратов для оценки уровня» иммуноглобулинов О и А в биологических жидкостях "рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии.

С целью повышения специфичности реакции, для количественного определения иммуноглобулинов класса А методом радиальной иммунодиффузии по методу Манчини (РИД), следует использовать стандарт из гомологичного субстрата в связи с полиморфизмом данного изотипа.

Для количественного определения В-лимфоцитов крупного рогатого скота рекомендуем реакцию непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител к

Метод иммунопероксидазного окрашивания с поли- и моноклоиальными антителами к ^ может быть использован для определения форм распределения ^-рецепторов на мембране клетки, что дает возможность изучения молекулярных аспектов иммуногенеза у животных.

Для оценки. состояния здоровья крупного рогато скота на с/х предприятиях рекомендуем использовать индексные показатели и корреляционный анализ, которые более адекватно» отражают состояние иммунной системы, чем отдельные его параметры, и что в значительной мере повысит диагностическую эффективность иммунологического мониторинга.

Разработанные методы могут быть использованы для оценки иммунного статуса животных, в том числе морских млекопитающих, в рамках программ по оценке здоровья популяций животных, обитающих в естественных условиях.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Eздакова, Ирина Юрьевна, Москва

1. Адо А.Д. О некоторых свойствах и взаимодействии рецепторов мембранлимфоцитов / А.Д.Адо //Иммунология.-1993.-№6.-С.12-17.

2. Акимочкин А.И. Применение пробиотика Биод-5 для профилактики и лечения коров при послеродовых эндометритах / А.И.Акимочкин, Т.Н.Грязнева //Ветеринарная медицина.-2005.-№1 .-С.2-3.

3. Алешкин В.А. Состояние местного иммунитета при воспалительных заболеваниях женских половых органов и влияние на него иммуномодулятора кипферона/ В.А.Алешкин, О.В.Макаров, К.А.Шайков //Иммунология.-2000.-№5.-С.41-44.

4. Азизов Г.А. Особенности иммунного статуса в центральном и региональном кровотоке у больных с заболеваниями вен нижних конечностей/ Г.А.Азизов, Э.С.Джумбаев, Н.Х.Кадыров.// Иммунология.-2003.-24.-№1.-С.50-51.

5. Артюхов В.Г. Изменения локализации CR 1-рецепторов на поверхности нейтрофильных лейкоцитов, индуцированные УФ-светом/ В.Г.Артюхов, В.В.Гисинская, Е.А.Михилева // Иммунология.- 2006.-№1.-С.6-9.

6. Атауллаханов Р.И. Усиление образования антител под влиянием иммуномодулятора гепона / Р.И.Атауллаханов, А.В.Катлинский, Р.Д.Холмс //Иммунология.-2003.-24.-№ 1 .-С.9-11.

7. Ахмедова Ш.У. Состояние показателей клеточного иммунитета у детей в дебюте сахарного диабета типа 1 и на фоне инсулинотерапии/ Ш.У.Ахмедова, Г.Н.Рахимова, Д.А.Рахимова // Иммунология.-2003.-24.-№1.-С.51-53.

8. Борзенко Е.В. Количественная характеристика иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммунохимического анализа. Дис.канд.вет.наук/ Е.В.Борзенко; ВИЭВ.-Москва, 2005.- с.60

9. Борисова Т.К. Роль цитокинов в иммунном ответе на Т-независимые антигены 2-го типа/ Т.К.Борисова //ЖМЭИ.-2006.-№1 .-С.44-47.

10. Боряев Г.И. Биохимический и иммунологический статус молодняка сельскохозяйственных животных и птицы и его коррекция препаратами селена: Дис. д-ра.биол.наук/Г.И. Боряев; ВИЭВ.- Москва, 2000.-215с.

11. Баковецкая О.В. Т- и В-лимфоцитарные системы крови коров в период эструса / О.В .Баковецкая //Ветеринария.-2005.-№8.- С.37-38.

12. Бурместер Г.-Р. Наглядная иммунология / Г.-Р.Бурместер, А.Пецутто.-М.:Бином, 2007.-320с.

13. Вавилова В.П. Применение отечественного иммуномодулятора полиоксидония в практике лечения детей с патологией лимфоглоточного кольца / В.П.Вавилова /А4ммунология.-2003.-24.-№1-С.43-46.

14. Васильева Г.И. Апоптоз Т-лимфоцитов, индуцированный «мышиным» токсином чумного микроба/ Г.И.Васильева, В.Н.Козловский и др.// Иммунология,- 2003.-24.-№ 1 .-С.6-9.

15. Васильева Г.И. Кооперативное взаимодействие моно- и полинуклеарных фагоцитов, опосредованное моно- и нейтрофилокинами / Г.И.Васильева, И.А.Иванова, С.Ю.Тюкавкина //Иммунология,- 2000.-№ 5,-С.11-16.

16. Верховский O.A. Поли- и моноклональные антитела в анализе гуморального иммунного ответа, структуре и функциональных свойств иммуноглобулинов животных: Дис.д-ра.биол.наук/ О^А.Верховский; ВИЭВ.-Москва, 1998.- 258 с.

17. Виха Г.В. Секреторный иммуноглобулин А — маркер стресса и неблагоприятных факторов внешней среды./ Г.В.Виха // Международный экологический форум "Инвестиции в экологию — шаг в будущее": Сб. науч.ст. -М., 2001.-С. 138-140.

18. Влияние иммунотропных препаратов на иммуногенез при вакцинации. /И.Ю.Ездакова, Ю.Н.Федоров, А.Ю.Ханис, Г.И.Боряев // «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее»: Сб.науч.тр.- Щелково:ВНИиТИБП .2004.- С. 47-52.

19. Выявление технологических и прогностических факторов, определяющих качество образцов стволовых клеток пуповинной крови / И.В.Высочин, А.А.Исаев, М.А.Лагарькова и др. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия,- 2006.-№1.- С.60-62.

20. ГалактионовВ.Г. Очерки эволюционной иммунологии / ГалактионовВ.Г.-М.:Наука,1995.-256с.

21. Галактионов В.Г. Основные направления исследований в эволюционной иммунологии/ В.Г.Галактионов //Известия РАН.Серия биологическая.-2004.-№6.- С.645-658.

22. Галактионов В.Г. Эволюционное развитие суперсемейства иммуноглобулинов / В.Г.Галактионов // Известия РАН.Серия биологическая.-2004.-№2.-С. 133-145

23. Гильмутдинов Р.Я. Сравнительная гематология животных/ Р.Я. Гильмутдинов, Р.Г. Ильязов, A.B. Иванов.- Казань,2005.- 288с.

24. Горбачева Л.Д. Взаимодействие макрофаг-лимфоцит in vitro. Взаимодействие интактных макрофагов с сингенными и аллогенными лимфоцитами различного происхождения/ Л.Д.Горбачева, В.Г.Галактионов, И.П. Дишкант //Иммунология.-1981 .-№ 1 .-С.3 6-3 8.

25. Горина Л.Г. Моноклональные антитела к антигенам Mycoplasma pneumoniae./ Л.Г.Горина, Э.И^робышевская //ЖМЭИ.-1999.-№2.-С.81-84.

26. Горленко A.B. Анализ иммунологических показателей у беременных с ВИЧ-инфекцией / А.В.Горленко, О.А.Белых //Иммунология.-2005.-№3.-С. 167170.

27. Давтян Т.К. Эволюция интегративной функции иммунной системы: 2. Молекулярная эволюция антиген-распознающих рецепторов/ Т.К.Давтян, Г.А.Геворкян, Д.А.Погосян //Успехи совр.биологии.-2005.-№2-С.151-156.

28. Давтян Т.К. Эволюция интегративной функции иммунной системы. 1.Эволюционное развитие иммунной системы/ Т.К.Давтян, Г.А.Геворкян, Д.А.Погосян //Успехи совр.биологии.-2005.-№1.-С.34-40.

29. Дамбаева C.B. Влияние некоторых иммуномодуляторов на функциональную активность фагоцитарных клеток периферической крови доноров/ С.В.Дамбаева, Д.В.Мазуров, Н.М.Голубева //Иммунология.- 2000.-№6.-С. 15-20.

30. Дегтярев В.П. Коррекция репродуктивной функции коров при различном состоянии естественной резистентности / В.П.Дегтярев, К.В.Леонов, А.К.Тулянский // ДокладыРАСХН.-2006.-№3.-С.52-53.

31. Добротина H.A. Влияние полиоксидония и нативных иммуномодуляторов на иммунологические реакции in vitro/ Н.А.Добротина, М.В.Прохорова, Ж.А.Казацкая // Иммунология.-2005.-26.-№3.-С.152-156.

32. Долгушин И.И. Клинико-иммунологические аспекты цервицитов хламидийной этиологии/ И.И.Долгушин, И.В.Курносенко, В.Ф.Долгушина // ЖМЭИ.-2004.-№3.-С.48-52.

33. Донник И.М. Возрастная динамика ммунологических показателей крупного рогатого скота при техногенных воздействиях/ И.М.Донник, Н.А.Верещак, И.А.Шкуратова Научно-метод. рекомендации.-Екатеринбург,2005.- 20с.

34. Дюговская JI. А. Роль вилочковой железы в образовании мастолимфоцитарных розеток/ Л.А.Дюговская, Т.В.Сидоренко, Г.П.Кравчук,

35. B.Н.Писанко //Иммунология.-2000.-№4.-С.32-34.

36. Евстропова И.В. В-1-лимфоциты: физиология, функции,популяционная гетерогенность/ И.В.Евстропова //Иммунология.-2004.-№1.1. C.46-56.

37. Ездакова И.Ю. Динамика количества Т-клеток и их взаимодействие с антигенпредставляющими клетками в процессе иммунного ответа/. И.Ю .Ездакова, Ю.Н.Федоров, А.И.Жаданов // Цитология.- 2001.- том 43.- № 9. С.858

38. Ездакова И.Ю. Оценка иммуномодулирующей активности вакцины против рожи свиней (ВР-2) в процессе иммуногенеза / И.Ю.Ездакова, Ю.Н.Федоров, И.В.Третьякова // Труды ВИЭВ.- 2003.- Т.73.- С. 200-204.

39. Ездакова И.Ю. Влияние Trypanosoma sp. на иммунокомпетентныеклетки серебряного карася / И.Ю.Ездакова, М.Н.Борисова, Л.П.Дьяконов.//Ветеринария.-2005.-№12.-С.28-31.

40. Ездакова И.Ю. Динамика мембранных s-Ig лимфоцитов мышей в процессе иммуногенеза /И.Ю.Ездакова// «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ.-2006.- С. 472474.

41. Ездакова И.Ю. Фагоцитарная активность иммунокомпетентных клеток серебряного карася / И.Ю.Ездакова // «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ.-2006.- С. 475477.

42. Ездакова И.Ю. Выявление иммуноглобулинов на мононуклеарных клетках лимфоидных органов мышей / И.Ю.Ездакова // «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях»: Сб. науч. тр.-Краснодар.- 2006.- С. 400403.

43. Ездакова И.Ю. Определение уровня адгезивной активности лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота / И.Ю.Ездакова // «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»: Сб. науч.тр. Щелково: ВНИиТИБП.-2006.- С. 157-160.

44. Ездакова И.Ю: Изучение иммунного статуса лабораторных мышей под влиянием пробиотиков / И.Ю.Ездакова, В.В.Субботин// «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»: Сб. науч.тр. -Щелково: ВНИиТИБП.-2006.- С. 182-187.

45. Ездакова И.Ю. Динамика иммунокомпетентных клеток в процессе иммунного ответа на Т-независимые и Т-зависимые антигены / И.Ю.Ездакова // Ветеринарная медицина.- 2007.-№ 1.-С. 11-12.

46. Ездакова И.Ю. Определение показателей"В-системы иммунитета телят/ И.Ю.Ездакова // Ветеринарная медицина.- 2007.-№ 4.-С. 10-11.

47. Ездакова И.Ю. Поверхностные иммуноглобулины В-клеток крови крупного рогатого скота / И.Ю.Ездакова // Ветеринарная медицина.- 2007.-№ 4.-С. 11-13.

48. Ездакова И.Ю. Иммуноцитохимический метод определения В-лимфоцитов / И.Ю.Ездакова //«Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ.- 2008.- С. 329-332.

49. Ездакова И.Ю. Определение поверхностных структуриммунокомпетентных клеток методом иммунофлуоресценции/И.Ю.Ездакова -Метод.рекомендации.-М:ВИЭВ.-2008.-12с.

50. Ездакова И.Ю. Динамика адгезивной активности перитонеальных макрофагов мышей при вакцинации/ И.Ю.Ездакова// Труды ВИЭВ.- 2009.- Т. 75.- С. 235-238

51. Ездакова И.Ю Фагоцитарная активность клеток крови рыб семейства карповых /И.Ю. Ездакова, Л.П. Дьяконов // Труды ВИЭВ.- 2009.- Т. 75.- С. 239241

52. Ездакова И.Ю. Влияние зимозана на клетки крови серебряного карася (СагазБшэ аигаШэ §1Ье11о)/ И.Ю.Ездакова, М.Н.Борисова. // Ветеринарная-, патология.-2007.-№2.- С.205-207.

53. Ездакова И.Ю. Динамика иммунологических показателей стельных коров/ И.Ю.Ездакова//Ветеринарная патология.- 2007.-№2.-С. 148-151.

54. Ездакова И.Ю. Изучение морских млекопитающих новое направление экологической иммунологии / И.Ю.Ездакова, О.В.Соколова// Веткорм.-2008.-№ 4.- С. 14-15.

55. Ездакова И.Ю. Динамика розеткообразующих клеток кур вонтогенезе/ И.Ю.Ездакова, О.М.Чуйко, Е.О.Чадина //Ветеринарная патология.-2008.-№2.-С.62-64

56. Ездакова И.Ю. Локализация IgM в В-клетках периферической крови крупного рогатого скота/ И.Ю.Ездакова// Аллергология и иммунология.- 2008.Т. 9.- № З.-С. 274.

57. Ездакова И.Ю. Корреляционный анализ иммунологических показателей при введении иммунотропных препаратов / И.Ю.Ездакова// Веткорм.-2009.-№2.-С.18-19.

58. Ездакова И.Ю. Динамика sIgM-клеток и IgM-антител в периферической крови коров в период плодоношения / И.Ю.Ездакова// Аллергология и иммунология.- 2009.- Т. 10.- № 2.-С. 295.

59. Ездакова И.Ю. Взаимосвязи между основными изотипамииммуноглобулинов у овец/ И.Ю.Ездакова, С.Н.Степнова //Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук.-2010.-№5.-С.44-47 (Russian agricultural science.-2010.- Vol.36.-№5).

60. Elizarova N.L. Effect of tactivin on correlational action of immunocompetent cells / N.L.Elizarova, Ya.Arion, O.B.Sysoyeva // Russ. J. Immunol.-2003.-№8.- C. 178-189.

61. Ермилова И.Ю. Тимические пептиды в регуляции апоптоза лимфоцитов крыс в раннем онтогенезе/ И.Ю.Ермилова // Сб.науч.ст. — Пущино, 2003.-С. 21-22.

62. Железникова Г.Ф. Иммуномодулирующее действие вакцин: новые аспекты известной проблемы/ Г.Ф.Железникова // Иммунология.-2000.-№4.-С.20-24.

63. Железникова Г.Ф. Иммуноглобулин Е: биологическая роль при инфекционных заболеваниях/ Г.Ф.Железникова // Мед. Иммунол.-2002.-№4.-С. 515-534.

64. Зубова С.Г. Роль молекул адгезии в процессе распознавания чужеродных и трнсформированных клеток макрофагами млекопитающих/ С.Г.Зубова, В.Б.Окулов // Успехи современной биологии.- 2001.-121.-№1.-С.59-66.

65. Иванова Н.Т. Атлас клеток крови рыб / Н.Т.Иванова. М.: 1983.-С.4546.

66. Игнатов П.Е. Иммунитет и инфекция/ П.Е.Игнатов // М.: «Время», 2002.- 352 с.

67. Изотипспецифические антителосекретирующие клетки у мышей в процессе иммуногенеза. /А.И. Жаданов, И.Ю. Ездакова, O.A. Верховский, Ю.Н. Федоров II Ветеринария.-2000.- №11.- С.22-26.

68. Иммунология / Е.С.Воронин, А.М.Петров, М.М.Серых, Д.А.Девришов М.:Колос-Пресс,2002. - 408с.

69. Иммунологический статус у новорожденных телят и способ его коррекции/ Р.Е.Ким, Е.П.Сисягина, Г.Р.Реджепова и др. // Ветеринарная патология.-2005 .-№4.-С. 119-122.

70. Использование моноклональных антител для оценки антигенных свойств иммуноглобулинов животных / O.A. Верховский, Ю.Н.Федоров, В.К.Сологуб, Т.А.Феоктистова, И.П. Федорова, И.Ю.Ездакова // Сельскохозяйственная биология.- 1995.-№ 4.-С. 94-99.

71. Илек Я.Ю. Эффективность полиоксидония при тяжелом течениипневмонии у детей раннего возраста/ Я.Ю.Илек, А.В.Галанина, Г.А.Зайцева // Иммунология.- 2003.- 24.-№3.-С.180-182.

72. Каблучеева Т.И. Показатели естественной резистенции птицы на птицефабрике «Родина» Кореновского района/ Т.И.Каблучеева, Е.А.Стинский, Е.И.Рябов // «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях»: Сб.науч.ст./Краснодар,2006.-С.403-406.

73. Кадыров С.О. Иммуноглобулины свиньи: IgG, IgM, IgA, slgA (выделение, очистка, идентификация, содержание): Автореф.дис.канд.биол.наук / С.О.Кадыров; ВИЭВ,- М., 1986.- 23 с.

74. Клиническая иммунология и аллергология/ Под ред. A.B.Караулова A.B.- М: МИА, 2002.- 651 с.

75. Kapp Я. Макрофаги/ Ян Kapp.- М.: Мед., 1978.-189 с.

76. Кетлинский С.А. Роль Т-хелперов типов .1 и 2 в регуляции клеточного и гуморального иммунитета/ С.А.Кетлинский //Иммунолгия.-2002.-№2,- С.77-79.

77. Кинетика синтеза различных типов антителосекретирующих клеток костного мозга мышей в процессе иммуногенеза / Ю.Н. Федоров, О.А.Верховский, А.И.Жаданов, И.Ю.Ездакова // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук.- 2000.-№ 5.-С. 42-44.

78. Кирюхин A.B. Оптимизация лечения часто и длительно болеющих детей: иммунокоррекция ликопидом / А.В.Кирюхин, Н.А.Парфенова, Т.А.Максимова //Иммунология.-2003.-24.-№1 .-С.47-50.85 .Клаус Дж. Лимфоциты.Методы/ Дж.Клаус.- М.: «Мир»,1990.-395с.

79. Клебанов Г.И. Клеточные механизмы прайминга и активации < фагоцитов / Г.И.Клебанов, Ю.А.Владимиров // Успехи современной биологии.-1999.-119.-№5 .-С.462-475.

80. Коваленко Я.Р. Факторы, влияющие на формирование поствакцинального иммунитета. Проблемы иммунитета сельскохозяйственных животных/ Я.Р.Коваленко.- М.:Колос,1966.-С.209-221.

81. Коджаева М.Х. Определение содержания иммуноглобулинов в цельной крови/ М.Х.Коджаева, Н.М.Подзолкова, А.В.Кулаков//Иммунолгия.-2005.-26.-№3.-С. 189-191.

82. Козлов И.Г. Рецепторы контактного взаимодействия/ И.Г.Козлов, Н.К.Горлина, А.Н.Чередеев // Иммунология.-1995.-№4.-С. 14-24.

83. Количественная характеристика иммуноглобулинов А-класса в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммунохимического анализа /Е.В.Борзенко, И.Ю.Ездакова, Ю.Н.Федоров, Т.А.Феоктистова// Труды ВИЭВ.- 2003.- Т. 73.- С. 217-221.

84. Коляков Я. Е. Ветеринарная иммунология / Я.Е.Коляков.

85. М.:Агропромиздат, 1986.-272 с.

86. Кольман Я. Наглядная биохимия/ Я.Кольман, К.-Г.Рем. М.: Мир, 2000.- 292 с.

87. Кондратьева И.А. Функционирование и регуляция иммунной системы рыб / И.А.Кондратьева, А.А.Киташова // Иммунология.-2002.-№2.- С.97-101.

88. Костинов М.П. Мукозальный иммунитет у детей с ВИЧ-инфекцией и возможность его коррекции/ М.П.Костинов, С.В.Сулоева, А.А.Тарасова //ЖМЭИ.- 2006.-№2.-С.75-77.

89. Крапивина Е.В. Влияние уровня кормовой добавки «мидиум» на защитные механизмы организма у свиней в условиях различной плотности загрязнения почвы радиоцезием / Е.В.Крапивина, Т.Л.Талызина, Ю.Н.Федоров //Ветеринарная медицина.-2005.-№1.- С.11-13.

90. Крапивина Е.В. Иммунный статус ремонтных бычков при включении в рацион экофена/ Е.В-.Крапивина, Е.В.Мартынова, Ю.Н.Федоров //Сельскохозяйственная биология.-2006.- №4.- С. 91-93.

91. Кунгуров Н.В. Иммуномодулятор полиоксидоний в терапии больных псориатической болезнью / Н.В.Кунгуров, Н.Н.Филимонкова, И.А.Тузанкина // Иммунология.-2003 .-№ l .-С.З 8-42.

92. Кулаков A.B. Особенности гуморального антибактериального иммунитета у больных эхинококкозом / А.В.Кулаков, М.И.Карсонова, А.Д.Черноусов // Иммунология.-2000.-№5.-С.62-64.

93. Кудаева О.Т. Определение содержания иммуноглобулинов в цельной крови/ О.Т.Кудаева, Е.В.Ненашева, В.А.Козлов //Иммунология.-2005.-№-3.-С.189-191.

94. Кулаков A.B. Антитела к различным компонентам клеточной стенки бактерий в сыворотке крови человека / А.В.Кулаков, А.Д.Черноусов, О.Т.Ешанов //Иммунология,-1995.- №5.- С.26-28.

95. Кульберг А.Я. Изменение метаболизма клеточных рецепторов при остром эмоциональном напряжении/ А.Я.Кульберг, Е.В.Орестова, В.В.Ветрова // Иммунология.- 1989.№-4.-С.60-65.

96. Купер Э. Сравнительная иммунология/Э.Купер.-М.:Мир,1980.-422с.

97. Лебедев К.А. Изменение спонтанного розеткообразования под влиянием короткой инкубации лимфоцитов с антигеном/ К.А.Лебедев, Д.Р.Каулен, Н.А.Ноева // Иммунология.-1981.- №2.- С.5-8.

98. Липатов A.M. Резистентность организма телят и ее коррекция биологически активными веществами/ А.М.Липатов //Ветеринария сельскохозяйственных животных.-2007.-№1 .-С.63-64.

99. Лисяный Н.И. Коррекция аутоиммунного демиелинизируещего процесса у крыс клетками аллогенного головного мозга новорожденных животных/ Н.И.Лисяный, О.В.Маркова//Иммунология.-2003.-24.№-1.-С.15-19.

100. Лященко В.А. Молекулярные основы иммуногенности антигенов/ В.А.Лященко, A.A. Воробьев.- М.:Медицина, 1982.-272с.

101. Макарков А.И. Механизмы регуляции экспрессии поверхностных структур дифференцированного лимфоцита/ А.И.Макарков, Г.В.Порядин, Ж.М.Салмаси // Иммунология.-1997.-№3.-С.4-8.

102. Марков A.B. Системы различения «своего» и «чужого» и формирование репродуктивной изоляции (гипотеза иммунологического тестирования брачных партнеров)/ А.В.Марков, А.М.Куликов //Успехи совр.биологии.-2006.-126.-№ 1 .-С. 10-25.

103. Марков А.Н. Влияние левамизола на иммунные показатели телок/ А.Н.Марков, М.А.Староселов, Н.Ю.Басова //«Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях:Сб.науч.тр.- Краснодар,2006.-С.411-414

104. Менделенко М.М. Динамика и взаимосвязь иммунологических показателей у здоровых детей 1-6 лет/ М.М.Менделенко, М.Л.Лившиц, Г.Н.Горбунова // Иммунология.-1989.-№5.-С.41-45.

105. Механизмы влияния ацетилхолина на интенсивность гуморального иммунного ответа / И.А.Гонтова, В.В.Абрамов, Н.Ю.Громыхина и др. // Иммунология.-1989.-№4.-С.52-55.

106. Милованов О.В. Экспериментальное исследование влияния излучения гелий-неонового и арсенидгаллиевого лазеров на розеткообразующую функцию лимфоцитов периферической крови/ О.В.Милованов, А.Р.Евстигнеев //Иммунология.- 1988.-№4.- С.88-89.

107. Мисникова М.А. Усовершенствование методики получения моноспецифических антисывороток к растворимым антигенам/ М.А.Мисникова, А.Ю.Самострельский // Труды Ленинрад. НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Пастера.- 1976.-44.-С.34-37.

108. Михайленко A.A. Роль корреляционных взаимосвязей в оценке функциональных возможностей иммунной системы/ А.А.Михайленко, Т.А.Федотова //Иммунология.- 2000.-№6.-С.59-61.

109. Михеева Е.А. Влияние радиоактивных излучений на состояние иммунной системы / Е.А.Михеева // Межд. н-пр. конф, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиолог. пром.России: Сб.науч.ст.- Курск, 2006.-С.169-172.

110. Моноклональные антитела к иммуноглобулинам класса А рогатого скота: получение, характеристика, применение / Т.А.Феоктистова,

111. Ю.Н.Федоров, И.Ю.Ездакова, В.К.Сологуб// Труды ВИЭВ.-2003.- Т. 73.- С. 197200.

112. Москаленко Е.П. Влияние ультразвука на клеточные и гуморальные факторы иммунитета / Е.П.Москаленко, Л.П.Сизякина, Е.Н.Сологуб //Бюлл. экспериментальной биологии и медицины.-1983.-№5.-С.75-78.

113. Молекулярная биология клетки. В 2 т./ Б.Альберте, Д.Брей, Дж.Льюис и др.-М.:Мир, 1994.-539с.

114. Мягкова М.А. Естественные антитела к физиологически активным соединениям/ М.А.Мягкова, Ж.Н.Трубачева, О.Н.Панченко //Иммунология.-2000.-№6.-С.6-10.

115. Неугодова Г.Л. Выявление поверхностных иммуноглобулинов на лимфоцитах периферической крови у больных инфекционно-аллергической бронхиальной астмой / Г.Л.Неугодова, П.В.Глан //ЖМЭИ.-1985.-№7.-С.99-103

116. Николаева А.И. Почему молчат «молчащие» антителообразующие клетки / А.И.Николаева //Иммунология.-1989.-№5.- С.90-94.

117. Новикова Е.М. Оценка форсифицирующего влияния различных иммуностимулирующих препаратов на иммуногенность вакцины АКДС при различных иммунодефицитных состояниях/ Е.М.Новикова, С.В.Скопцова //Аллергия, астма и клин.иммунология.- 2003.- №9.-С.92-97.

118. Новиков В.В. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы / В.В.Новиков // Иммунология.-2007.-№4.-С.249.

119. Обухова О.О. Сравнение эффективности различных схем иммунокоррекции при инфекционно-воспалительных заболеваниях/ О.О.Обухова, А.П.Шваюк , О.М.Горбенко //Иммунология.-2004.-25.-№1.-С.44-46.

120. Пат. 4925587 Российская Федерация. Способ исследования процессасборки иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцитов/ Т.В.Виноградова, Д.В:Стефании; Московский НИИ педиатрии и детской хирургии.-№4925587/14; заявл.09.04.91; опубл. 27.02.95, Бюл.№6.-8с.

121. Пат. 2073525 Российская Федерация. Способ получения иммуноглобулинового препарата/ В.А.Алешкин, И.В.Борисова, Л.И.Новикова; Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского.- № 93032578/14; заявл. 22.0б.93;опубл. 20.02.97, Бюл.№5.-8с.

122. Пат. 2189833 Российская Федерация. Способ полученияиммуноглобулинового препарата/ А.В.Зорик, В.А.Алешкин, А.Г.Лютов и др; МНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского.-№2000126310/14; заявл. 19.10.00;опубл.27.09.02, Бюл.№27.-12с.

123. Пат. 2158137 Российская Федерация. Способ получения иммуноглобулинового препарата/ В.В.Анастасиев, Ю.К.Пискарева, Т.А.Крайнова и др.; «Имбио»,- №.99126696/14; заявл. 17.12.99; опубл.27.10.00 ,Бюл.№30.-6с.

124. Пат. 1695931 Российская Федерация. Способ выделения иммуноглобулина О из сыворотки крови кур/ Э.Д.Джавадов, Е.Н.Горбачев, И.М.Джавадова; ВНИ ветеринарный институт птицеводства.-№4705742/13; заявл. 18.04.89; опубл. 07.12.91, Бюл.№45.-6с.

125. Пат. 2293330 Российская Федерация, МПК вОШ 33/53. Способ определения антител/ И.Ю.Ездакова; заявитель и патентообладатель ГНУ ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко.- №2005120538/15; заявл.04.07.05; опубл. 10.02.07, Бюл.№4.-5с.

126. Першин Б.Б. Длительное исследование уровней иммуноглобулинов в секретах слюнных желез у профессиональных лыжниц / Б.Б.Першин, А.Б.Гелиев, Г.Г.Чуракова//Иммунология.-2003.-№2.- С.111-117.

127. Петров А.М. Формирование колострального иммунитета у животных/ А.М.Петров //Ветеринария.-2006.-№8.-С.35-41.

128. Пищальников А.Ю. Врожденные эффекты гуморального звена иммунитета по данным регионального регистра первичных иммунодефицитов / А.Ю.Пищальников //Иммунология.- 2000.-№4.-С.58-60.

129. Понякина И.Д. Метод розеткообразования для выявления Т- и В-иммунокомпетентных клеток. Возможности и ограничения/ И.Д.Понякина, К.А.Лебедев //Иммунология.-1983.-№4.-С. 10-20.I301

130. Применение сорбентов в условиях экологического неблагополучия/ И.М.Донник, И.А.Шкуратова, Л.Н.Аристархова и др.- Научно-метод. рекомендации. Екатеринбург,2005.- 30с.

131. Пробиотическая активность синтетического иммуномодулятора полиоксидония при лечении больных с синдромом хронической обстипации /

132. B.П.Крылов, И.В.Нестерова, Е.А.Алексеева и др. //Иммунология, 2003.-№1.1. C.34-37.

133. Проблема колострального иммуниета у новорожденных телят/ В.В.Лисицин, А.В.Мищенко, А.В.Кононов и др. // Ветеринарная патология.-2006.-№4.-С.161-165.

134. Проточная цитометрия и доказательная диагностика иммунных нарушений в хирургии / К.А.Бунятян, Е.В.Инвияева, В.В.Никода и др. // Клин.лаб.диагностика.-2004.-№9.-С.23-25.

135. Рабсон А. Основы медицинской иммунологии/ А.Рабсон, А.Ройт, П.Делвз М.:Мир, 2006.-320с.

136. Реджепова Г.Р. Иммунодефициты при респираторных блезнях телят/ Г.Р.Реджепова, П.Н.Сисягин, С.В.Втюрин //Ветеринарная патология.- 2005.-№4.-С.122-125.

137. Ройт А. Иммунология / А.Ройт, Дж.Бростофф, Д.Мейл.- М.:Мир, 2000.- .592 с.

138. Самойлова Р.С. Иммунофейотипирование в диагностике хронических лимфопролиферативных заболеваний/ Р.С.Самойлова, Т.И.Булычева // Клин.лаб.диагностика.-2003 .-№ 11 .-С.З 5-39.

139. Свистунова А.С. Клиническая и иммунологическая эффективность иммуномодулятора ликопида при туберкулезе легких / А.С.Свистунова, С.С.Аршинова, С.В.Климова //Иммунология.-2000.-№5.-С.59-61.

140. Сидоров М.А. Иммунный статус и инфекционные болезни новорожденных телят и поросят/ М.А.Сидоров, Ю.Н.Федоров, О.М.Савич // Ветеринария.- 2006.- №11.- С. 3-5.

141. Сидорова Е.В. Роль В-клеток в функциональной активности Т-лимфоцитов/ Е.В.Сидорова //Успехи совр.биол.-2005.-125.-№4.-С.411-418

142. Сидорова Е.В. Что нам известно сегодня о В-клетках //Успехи совр.биол.-2006.- 126.-№3 .-С.227-241.

143. Сизякина Л.П. Эффекты миелопептида-1 на функциональную активность полинуклеаров больных ВИЧ-инфекцией/ Л.П.Сизякина, Е.А.Чумакова //Иммунология.-2003.-24.-№1.-С.4-6.

144. Симбирцев А.С. Толл-белки: специфические белки наспецифического иммунитета / А.С.Симбирцев //Иммунология.-2005.-№6.-С.368-377.

145. Скрытые натуральные антитела вызывают апоптоз лимфоцитов/ И.В.Леках, И.А.Замулаева, А.С.Саенко, И.М.Поверенный // Иммунология.-2000.-№4.-С.38-41.

146. Содержание растворимой формы антигена CD38 в сыворотке крови больных вирусным гепатитом В / Ю.С.Птицина, И.А.Отмахова, Г.А.Кравченко и др.//Иммунология.-2003 .-№3 .-С. 162-164.

147. Соколова О.В. Иммунный статус черноморской афалины, (Tursiops truncates ponticus barabash,1940) в период адаптации к условиям жизни в неволе: Автореф.дис. канд.биол.наук./О.В.Соколова; ИПЭЭ им.А.Н.Северцова.-М., 2006.-24с.

148. Солодовников^ В.П. Иммунохимическая оценка Т- и В-систем иммунитета . у животных в норме,, при инфекции и вакцинации: Дис.канд.биол.наук/.В:П.Солодовников; ВИЭВ.-М.Д983.- 130с.

149. Состояние/ клеточного иммунитета и- фагоцитоза у беременных, больных вирусным гепатитом В./ Р.А.Рашидова, И.К.Мусабаев, М.Д.Ахмедова и др: // ЖМЭИ-ШЗ.-№5:-С.87-93;

150. Старикова Э.А. Гетерогенность мононуклеарных фагоцитов: субпопуляции или проявления пластичности/ Э.А.Старикова, К.П.Кисилева, И.С.Фрейдлин //Успехи совр.биол.-2005.- 125.-№5.-С.466-477.

151. Судаков К.В. .Иммунные механизмы системной деятельности организма: факты и гипотезы/ К.В.Судаков //Иммунология.^-2003.^-№6.-С.372-381.

152. В.И.Тамошюнас, Н.П.Дикинене, В.В.Милюкене, Б.А.Бражюнене// Иммунология.-1983.-№5.-С.37-40.

153. Тельнюк Я.И. Особенности иммунной системы больных хроническим рецидивирующим фурункулезом и влияние на нее иммунотропной терапии / Я.И.Тельнюк, Н.Х.Сетдикова, М'.И.Карсонова //Иммунология.-2003 .-24.-№ 1 .-С.20-23.

154. Терехов О.П. Иммунная система эндогенная система питания многоклеточных организмов / О.П.Терехов //Иммунология,.- 2005.-№1.-С.59-62.

155. Технология получения моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам^ животных/ Ю.Н.Федоров, С,О. Кадыров, И.Ю.Ездакова и др. // Труды ВИЭВ.-1988.-Т.66.-С.41-46

156. Технологический регламент по изготовлению, контролю и применению набора реагентов для количественного определения иммуноглобулина G в биологических жидкостях рогатого скота/ И.Ю.Ездакова, Т.А.Чеботарева, Д.В.Рукавицын.-М:ВИЭВ.-2010.-17с.

157. Технологический регламент по изготовлению, контролю и применению набора реагентов для количественного определения иммуноглобулина А в биологических жидкостях рогатого скота/ И.Ю.Ездакова, Т.А.Чеботарева, Д.В.Рукавицын.-М:ВИЭВ.-2010.-17с.

158. Третьякова И.Е. Сравнительная характеристика секреторных продуктов нейтрофилов, полученных разными способами активации клеток/ И.Е.Третьякова, И.И.Долгушин, Э.Н.Коробейникова и др.// Мед. иммунол.-2003.-5.-1-2.-С. 117-120.

159. Тутельян A.B. Прайминг фагоцитов и егр применение в системе оценки специфической активности иммунорегуляторных соединений/ A.B.Тутельян, Г.И.Клебанов //Иммунология.-2004.-25.-№1.-С.14-16.

160. Уханова О.П. Влияние топических глюкокортикостероидов на апоптоз Т-лимфоцитов назального секрета у пациентов с аллергическимринитом / О.П.Уханова, Л.П.Сизякина, В.Д.Пасечников // Иммунология.-2004.-25.-№1.-С.28-32.

161. Федоров Ю.Н. Иммунный статус поросят в хозяйствах промышленного типа / Ю.Н.Федоров, О.А.Верховский, Б.Г.Орлянкин и др. //Ветеринария.-2006.-№6.-С. 18-21.

162. Фримель X. Иммунологические методы.- М.:Мир, 1979.-518с.

163. Фролов В.М. Иммуномодулирующий эффект нуклеината натрия и спЛенина у больных вирусными и токсическими гепатитами / В.М.Фролов, Н.А.Пересадин, Ю.А.Ененко и др. //Иммунология,-1994.-№ 6.-С.65.

164. Функциональный статус моноцитов периферической крови у больных иксодовым клещевым боррелиозом на фоне описторхозной инвазии/ Л.В.Лукашова, М.Р.Карпова, Н.П.Пирогова и др. //ЖМЭИ.-2006.-№2.-С.81-83.

165. Хаит О.В. Методические подходы к оценке показателей иммунного гомеостаза у женщин репродуктивного возраста/ О.В.Хаит // Иммунология.-1989.-№4.-С.65-70.

166. Хаитов P.M. Взаимодействие клеток иммунной системы: физиологические и медицинские аспекты иммунитета./ Р.М.Хаитов // Аллергия и клин, иммунология.-1999.- №1.- С.6-20.

167. Хаитов P.M. Иммунология./, Г.А.Игнатьева, И.Г.Сидорович.-М. ¡Медицина,2000.-432с.

168. Хаитов P.M. Особенности функционирования иммунной системы желудочно-кишечного тракта в норме и при патологии. / Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин // Аллергия, астма и клиническая иммунология. -1998.-№4.-С. 1-7.

169. Хаитов P.M. Современные иммуномодуляторы: основные принципы их применения / Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин //Иммунология.- 2000.-№5.-С.4-7.

170. Хаитов P.M. Оценка иммунного статуса человека в норме и при патологии / Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин //Иммунология.-2001.-№4.-С.4-6.

171. Хаитов P.M. Протеомный анализ иммунокомпетентных. клеток человека / Р.М.Хаитов, .О.В.Тихонова, В.Г.Згода//Иммунология.-200Э.- №5.-С.276-281. .

172. Хаитов P.M. Экологическая иммунология/ Р.М.Хаитов, Б.ВШинегин, Х.И:Истамов.- М::ВНИРО, 1995.- с.122-124. .

173. Хаитов P.M. Внутриклеточные сигнальные пути, активирующие или ингибирующие функции клеток иммунной системы. 4. Внутриклеточные сигнальные, пути при апоптозе / Р.М.Хаитов,,В.М.Манько, А.А.Ярилин://Успехи совр.биол.-2006.-12б;-№1.-С.З-9;

174. Хмелевская И.Г. Анализ иммунотропной активности антибиотиков и протеолитических ферментов на различных экспериментальных моделях индукции иммунодефицитного состояния / И.Г.Ххмелевская, Л.В.Ковальчук //Иммунология.-2000.-№4.-С.42145 i

175. Цинкернагель Р: Основы иммунологии/ Р.Цинкернагель М.: Мир, 2008.- 135с.

176. Чахирева Н.Е. Полиоксидоний в комплексной терапии паразитарных инфекций / Н.Е.Чахирева, А.Луканов //Иммунология.- 2003.-№1.-С. 46-47.

177. Чернохвостова Е.В. Иммунохимическая диагностика гаммапатий: Метод.рек. / Е.В.Чернохвостова, Г.П.Гермен -1984 .- 50с.

178. Шахов В.П. Оценка биосовместимости кальциофосфатных материалов методом розеткообразования с мононуклеарами периферической крови человека/ В.П.Шахов, А.В.Карлов, С.С.Шахова // Иммунология.-2003.-№6.-С.345-346.

179. Шахов А.Г. Примнение иммуномодуляторов при вакцинациигживотных против сальмонеллеза/ Шахов А.Г., Масьянов Ю.Н., Бригадиров Ю.Н. //Ветеринария.-2006.-№6.- С.21-26.

180. Ширшев C.B. Характеристика иммуномодулирующих эффектов полиоксидония у детей, страдающих рецидивирующими обструктивными бронхитами / С.В.Ширшев, В.А.Лопатина, И.П.Корюкина, А.С.Иванова //Иммунология.-2000.-№5.~С.53-55

181. Ширяев Н.В. Эволюционное прошлое IgG млекопитающих в свете современных знаний о структуре и функционировании данной белковой молекулы / Н.В.Ширяев // Иммунология.- 2006.-№1.- С.58-60.

182. Шмелева С.П. О гетерогенности лимфоцитов печени плода человека / С.П.Шмелева, З.С.Хлыстова, О.П.Рябчиков // Иммунология.-1989.-№5.-С.З9-41.

183. Шульга Н.Н. Динамика иммуноглобулинов в, сыворотках крови и молозива коров/ Н.Н.Шульга //Ветеринария.-2006.-№1.-С.45-47.

184. Щеголева JI.C. Результаты исследования иммунного статуса у человека в условиях Севера / Л.С.Щеголева, Л.К.Добродеева // Иммунология.-2003 .-24.-№3 .-С. 177-180.

185. Ющук Н.Д. Иммунный статус у больных брюшным тифом./ Н.Д.Ющук, Д.Р.Ахмедов, В.М.Фролов // ЖМЭИ.- 1994.-№4.-С.92-95.

186. Ярилин А.А. Межклеточная кооперация при иммунном ответе. Выбор клеткой формы ответа / А.А.Ярилин //Иммунология.- 1999.-№1.- С.17-24.

187. Ярилин А.А. Симбиотические взаимоотношения клеток иммунной системы / А.А.Ярилин //Иммунология.-2001.-№4.-С. 16-20.

188. Abe N. Reduction of Runxl Transcription Factor Activity Up-Regulates Fas and Bim Expression and Enhances the Apoptotic Sensitivity of Double Positive Thymocytes/ N.Abe, K.Kohu, H.Ohmori et al. // The Journal of Immunology.-2005.-Vol.175.-P. 4475-4482.

189. Ackermann, M. R. Bovine ileal dome lymphoepithelial cells: endocytosis and transport of Brucella abortus strain 19 / M.R.Ackermann, N.F.Cheville, B.L.Deyoe // Vet. Pathol.-1988.-№ 25.-P. 28-35.

190. Aliahmad P. Cell surface immunoglobulin regulated checkpoints in chicken Bl cell development / P.Aliahmad, K.A.Pike and M.Ratcliffe //Veterinary Immunology and Immunopathology.-2005.-108.-P.3-9.

191. Ambagala A.P.N. Viral interference with MHC class I antigen presentation pathway: The battle continues / A.P.N.Ambagala, J.C.Solheim and S.Srikumaran //Veterinary Immunology and Immunopathology.-2005-.107.-P.l-15.

192. Augello A. Bone marrow mesenchymal progenitor cells inhibit lymphocyte proliferation by activation of the programmed death 1 pathway / A.Augello, R.Tasso, S.M.Negrini // EurJ Immunol.-2005.-№35.-P. 1482-1490.

193. Bach J.F. Summary of round table discussontion on the technical aspects of the rosette test/ J.F.Bach, G.Biozzi, M.F.Greaves//Transplant. Proc.- 1972.-№4.-P.335-337.

194. Bachmann Martin F. Functional Properties and Lineage Relationship of CD8+ T Cell Subsets Identified by Expression of IL-7 Receptor aand CD62L/

195. F.Bachmann Martin, P.Wolint, K.Schwarz //The Journal of Immunology.-2005.- Vol . 175.-P. 4686-4696.

196. Bailey M. The influence of environment on development of the mucosal immune system/ M.Bailey, M.Haverson, C.Inman // Veterinary Immunology and Immunopathology.-2005.-Vol. 108.-P. 189-198.

197. Braley-Mullen H. Requirement for B-cell-derived immunoglobulin for Th activation by type 2 antigen polyvinylpirrolidone / H.Braley-Mullen,

198. G.H.Milligan, A.M.Van Buskirk // Int. Immunology.- 1994.- №6.-P.805-815.

199. Baldwin T.A.The Fourth Way? Harnessing Aggressive Tendencies in thes

200. Thymus / T.A.Baldwin, K.A.Hogquis and S.C.Jameson // The Journal of Immunology.- 2004.-Vol.l73.-P.6515-6520 .

201. Bazzocchi C. Expression and function of Toll-like receptor 2 in canine blood phagocytes / C.Bazzocchi, M.Mortarino, S.Comazzi // Veterinary Immunology and Immunopathology.-2005 .-Vol. 104.-P. 15-19.

202. Beard P.M. Modulation of yô T cells and CD1 in Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection/ S.M. Rhind , M. C. Sinclair M.C. // Veterinary Immunology and Immunopathology.-2000.- Vol.77.-P.311-319.

203. Bemdt A. Gamma/delta T cell response of chickens after oral administration of attenuated and non-attenuated Salmonella typhimurium strains/ A.Berndt and U.Methner // Veterinary Immunology and Immunopathology.-2001.-78.-P. 143-161.

204. Bergen J. Phenotypic and Functional Characterization of CD4 T Cells Expressing Killer Ig-Like Receptors / J.Bergen, A.Thompson, A.Slik//The Journal of Immunology.-2004,-Vol. 173 .-P.6719-6726.

205. Bjersing J.L. Loss of ileal IgA+ plasma cells and of CD4+ lymphocytes in ileal Peyer's patches of vitamin A deficient rats/ J.L.Bjersing, E.Telemo, U.Dahlgren, L.A.Hanson // Clin, and Exp. Immunol.-2002.- Vol.130.- 3.-P. 404-408.

206. Blackstock W.P. Trends in automation and mass spectrometry for proteomics / W.P.Blackstock // Proteomics:A Trends Guide.- 2000.-July.-P. 12-17.

207. Bienestock J. Mucosal immunology/ J.Bienestock, A.D.Befus // Immunology.-1980.-VoU 41.- P.249-255.

208. Brandzaeg P. Basic mechanism of mucosa immunity- a major adaptive defense system./ PiBrandzaeg //The Immunologist.- 1995.-№3.-P. 89-96.

209. Briken V. Diversification of CD1 proteins: sampling the lipid content of different cellular compartments / V.Briken, D.B.Moody, S.A.Porcelli // J .Immunol.-2000.-Vol.l2.-№6.-P. 517-525.

210. Briken V. Human CDlb and CDlc isoforms survey different intracellular compartments for the presentation of microbial lipid antigens / V.Briken, R.M.Jackman, G.F.Watts// J Exp Med.-2000.- №7.-P. 192-201.

211. Brossay L. Structural requirements for galactosylceramide recognition by CD 1-restricted NK T cells/ L.Brossay, O.Naidenko; N.Burdin // J . Immunol .- 1998 .-Vol.161.-P.4-8.

212. Buddie B. Identification of immune response correlates for protection against bovine tuberculosis / B.Buddie, D.Wedlock, M.Denis and M.Skinner // Veterinary Immunology and Immunopathology.-2005.-Vol. 108.-P. 45-51.

213. Butler J.E. Bovine immunoglobulins: An augmented review/ J.E.Butler // Veterinary Immunology and Immunopathology. -1983.- №4.- P. 152-172.

214. Cantrell D. T cell antigen receptor signal transduction pathways/ D.Cantrell //Ann. Rev. Immunol.-1996.-№12.-P. 259-274.

215. Castiglioni P. CDS T cell priming by B lymphocytes is CD4 help dependent/ P.Castiglioni, M.Gerloni, X.Cortez-Gonzalez, M.Zanetti // EurJ Immunol.- 2005.- Vol.35.-P. 1360-1370.

216. Cherkinsky C. The mucosal immune system and prospect, for anti-infectious and antiinflammatory vaccines / C.Cherkinsky, J.Holmgren // The Immunologist.-1995.-№3.-P. 97- 103.

217. Chirmule N. Th2-Dependent B cell Responses in the Absence of CD40-CD40 Ligand Interaction / N.Chirmule, J.Taselaar, J.M.Wilson // J Immunol.-2000.-Vol.164.-P. 248-255.

218. Chirdo F.G. Immunomodulatory dendritic cells in intestinal lamina propria/ F.G.Chirdo, O.R.Millington, H.Beacock-Sharp // Eur.J Immunol.- 2005.-Vol.35.-P. 1831-1840.

219. Clevers, H. Identification of a bovine surface antigen uniquely expressed on CD4-CD8 T cell receptor gamma/delta + T lymphocytes/ H.Clevers, N.D.MacHugh, A.Bensaid// Eur. J. Immunol.-I990.-Vol. 20.-P.809-817.

220. Conley M.E. Intravascular and mucosal immunoglobulin A: Two separate but related systems of immune defence? / M.E.Conley, D.L.Delacroix // Ann. Intern. Med.-1987.-Vol.106.-P. 982-89.

221. Coste A.L. Notch signaling: Distinct ligands induce specific signals during lymphocyte development and maturation / A.L.Coste and A.A.Freitas // Immunology Letters.-2006.-Vol. 102.-P. 1 -9.

222. Crawley A.M. Genetic selection for high and low immune response in pigs: Effects on immunoglobulin isotype expression/ A.M.Crawley, B.Mallard and B.N.Wilkie //Veterinary Immunology and Immunopathology.-2005.-Vol. 108.-P.71-76.

223. Cuesta A. Total serum immunoglobulin M levels are affected by immunomodulators in seabream (Sparus aurata L.)/ A.Cuesta, J.Meseguer and M.A.Esteban // Veterinary Immunology and Immunopathology.-2004.-Vol. 101.-P. 203-210.

224. Cupedo T. Cellular Interactions in Lymph Node Development/ T.Cupedo and R.E.Mebius //The Journal of Immunology .-2005.- Vol.174.-P. 21-25.

225. Dallanegra A. Effect of hypertonicity and monensin on CD3/TCR surface expression in human T cells / A.Dallanegra, L.Schaffar , J-Ph.Breittmayer //Immunology Letters .- 1988.-Vol. 19.-№ 2.-P. 115-120.

226. Decot V. Heterogeneity of Expression of IgA Receptors by Human, Mouse, and Rat Eosinophils / V.Decot, G.Woerly, M.Loyens et al // The JournalofImmunology.-2005.-Vol.l74.-P.628-635.

227. DeftosM.L. Notchl Signaling Promotes the Maturation of CD4 and CD8 SP Thymocytes/ M.L.Deftos, E.Huang, E.W.Ojala //Immunology Letters.-2000.-Vol.l3.-P.73-84.

228. Deng M. Regulation of apoptotic pathways in bovine y/5 T cells/ M.Deng, J.Liu, C.N.Pelak //Veterinary Immunology and Immunopathology.- 2005.-Vol.105.-P. 15-23.

229. Denis M. Iron modulates the replication of virulent Mycobacterium bovis in resting and activated bovine and possum macrophages / M.Denis and B.M.Buddie //Veterinary Immunology and Immunopathology.-2005.-Vol.107.-P. 189-199.

230. Deenick E.K. Decision criteria for resolving isotype switching conflicts by B cells// E.K.Deenick, J.Hasbold, P.D.Hodgkin / Eur.J Immunol.- 2005.-Vol.34.-P.2949-2955.

231. Doleschall M. Isolation of the gene encoding the bovine neonatal Fc receptor / M.Doleschall, Y.Zhao, B.Mayer //Veterinary Immunology and Immunopathology.-2005.- Vol.l08.-P.145-150.

232. Dowd J.E. Inhibition of antigen-specific T cell activation by staphylococcal enterotoxins/ J.E.Dowd, R.Jenkins and D.R.Karp. //J. Immunol .-1995.-Vol. 154.-P. 1024-1031.

233. Dhanji S. The Low Affinity Fc Receptor for IgG Functions as an Effective Cytolytic Receptor for Self-Specific CD8 T Cells/ S.Dhanji, K.Tse and T.Hung-Sia // The Journal of Immunology .-2005.-Vol.l74.-P.1253-1258.

234. Duffus W.P. The kinetics and morphology of the resetting-forming cell response in the popliteal lymph nodes of rats/ W.P .Duffus, D.Allan // Immunology.-I971.-Vol.20.-P.345-361.

235. Duncker S.C. Effect of orally administered probiotic E. coli strain Nissle 1917 on intestinal mucosal immune cells of healthy young pigs/ S.C.Duncker, A.Lorentz, B.Schroeder// Veterinary Immunology and Immunopathology.-2006.-Vol. 111.-P.239-250.

236. Duthoit C.T. Uncoupling of IL-2 Signaling from Cell Cycle Progression in Naive CD4+ T Cells by Regulatory CD4+CD25+ T Lymphocytes / C.T.Duthoit, D.J.Mekala, R.S.Alli //The Journal of Immunology.- 2005.- Vol.174.-P. 155-163.

237. Durandy A. Phenotypic and functional characteristics of human newborns' B lymphocytes/A.Durandy, L.Thuillier, M.Forveille // J .Immunol.- 1990.- Vol. 144.-P. 60-65.

238. Eickhoff S. Measurement of phagocytosis and oxidative burst of canine neutrophils: high variation in healthy dogs/ S.Eickhoff, L.Mironowa, R.Carlson// Veterinary Immunology and Immunopathology.-2004.-Vol.101 .-P.109-121.

239. Eicher S. D. Toll-like receptors 2 and 4, and acute phase cytokine gene expression in dexamethasone and growth hormone treated dairy calves / S.D.Eicher, K.A.McMunn, H.M.Hammon //Veterinary Immunology and Immunopathology.-2004.-Vol. 98.-P. 115-125.

240. Ellis S.The cattle major histocompatibility complex: is it unique?/ S.Ellis // Veterinary Immunology and Immunopathology.- 2004.-Vol. 101.-P. 1-8.

241. Enk A.H. Dendritic cells in tolerance induction/ A.H.Enk // Immunology Letters.- 2005.-Vol.99.-P. 8-11.

242. Erlandsson L. Both the pre-BCR and the IL-7Ra are essential for expansion at the pre-BII cell stage in vivo/L.Erlandsson, S .Licence, F.Gaspal, P.Lane et.al.//Eur.J.Immunol.-2005.-Vol.35.-P.1969-1976.

243. Fortner Karen A. The Death Receptor Fas (CD95/APO-1) Mediates the Deletion of T Lymphocytes Undergoing Homeostatic Proliferation / K.A.Fortner and R.C.Budd // The Journal of Immunology.-2005.-Vol. 175.-P. 4374-4382.

244. Fields Michele L. CD4+CD25+ Regulatory T Cells Inhibit the Maturation but Not the Initiation of an Autoantibody Response / M.L.Fields, B.D.Hondowic, M.H.Metzgar // The Journal of Immunology.- 2005.- Vol.175.- P.4255-4264.

245. Fenyo D. Identifying the proteome: software tools/ D.Fenyo //Curr.Opin.Biotechnol.-2000.-№l 1.-P.391-395.

246. Feuillet V. Multiple survival signals are delivered by dendritic cells to naive CD4+ T cells/ V.Feuillet, B.Lucas, J.Di Santo // Eur. J. of Immunology.-2005.-Vol.35.-P. 2563-2572.

247. Findlay V.L. The immunomodulatory effects of levamisole on the nonspecific immune system of Atlantic salmon, Salmo salar L./ V.L.Findlay and B.L.Munday // Journal of Fish Diseases.-2000.-№23.-P.369-378.

248. Fikri Y. Purification and characterization of bovine WC1+ y8 T lymphocytes from peripheral blood/ Y.Fikri, J.Nyabenda, M.Denis, P-P.Pastoret // Vet. Research.-2000.-Vol.31 .-P.229-239.

249. Fuentes-Panana E. Iga/IgP Complexes Generate Signals for B Cell Development Independent of Selective Plasma Membrane Compartmentalization/ E.M.Fuentes-Panana, G.Bannish, D.van der Voort // The Journal of Immunology.-2005.-Vol.174.-P. 1245-1252.

250. Gondek D.C. Contact-Mediated Suppression by CD4+CD25+ Regulatory Cells Involves a Granzyme B-Dependent, Perforin-Independent Mechanism /

251. D.C.Gondek, L-F.Lu , S.A.Quezada, S.Sakaguchi // The Journal of Immunology.-2005.-Vol. 174.-P. 1783-1786.

252. George A.J.T. Thymic involution with aging/ A.J.T.George, M.A.Ritter.// Immunol.Today.-1996.-17.-P. 267-271.

253. Gardby E. Strong Differential Regulation of Serum and Mucosal IgA Responses as Revealed in CD28-Deficient Mice Using Cholera Toxin Adjuvant/

254. E.Gardby, J.Wrammert , K.Schon //The Journal of Immunology.-2003 .-Vol. 170.-P.55-63.

255. Griebel P.J. Bovine toll-like receptor 9: A comparative analysis* of molecular structure, function and expression/ P.J.Griebel, R.Brownlie, A.Manuja //Veterinary Immunology and Immunopathology.-2005.-Vol.l08.-P.l 1-16.

256. Guiducci C. CD40/CD40L interaction regulates CD4+CD25+ T reg homeostasis through dendritic cell-produced IL-2/ C.Guiducci, B.Valzasina, H.Dislich // Eur.J Immunol.-2005.- Vol.35.-P. 557-567.

257. Harms G. In vito* complement-dependent binding and in vivo kinetics of pneumococcal polysaccharide TI-2 antigens in the rat spleen marginal zone and follicule/ G.Harms, M.J.Hardonk, W.Timens // Ibid.-1996.- Vol.64.-P. 4220-4225

258. Harp J.A. Expression of adhesion molecules on milk and blood lymphocytes from periparturient dairy cattle with Johne's disease / J.A.Harp, J.R.Stabel, B.A.Pesch and J.P.Goff //Veterinary Immunology and Immunopathology.-2004.-Vol.98.-P.69-76.

259. Harp A,J. Lymphocyte subsets and adhesion molecule expression in milk and blood of periparturient dairy cattle/ J.A.Harp, T.E.Waters and J.P.Goff //Veterinary Immunology and Immunopathology.-2004.- Vol.102.-P.9-17.

260. Habur F. Receptors for interlukin-l,in the central nervous and neuroendocrine systems: Role in infection and stress / F.Habur, C.Marquefite, E.Ban etal.//Ann. Endocrinol.(Paris).-1995.- 56.-№3.-P.173-179.

261. Harari A. Functional Heterogeneity of Memory CD4 T Cell Responses in Different Conditions of Antigen Exposure and Persistence / A.Harari, F.Vallelian, P.Meylan and G.Pantaleo // The Journal of Immunology.- 2005.- Vol.174.-P. 10371045.

262. Haines D.M. Immunohistochemistry: Forging the links between immunology and pathology/ D.M.Haines and K.H.West //Veterinary Immunology andlmmunopathology .-2005 .-Vol. 10 8 .-P. 151 -156.

263. Hagiwara K. Detection of cytokines in bovine colostrums / K.Hagiwara,

264. S.Kataoka, H.Yamanaka» // Veterinary Immunology and Immunopathology.-2000.-Vol.76.-P. 183-190. :

265. Howard С J. Dendritic cells in cattle: phenotype and; function/ C.J.Howard, G.P.Brooke, D.Werling// Veterinary Immunology and Immuriopathology.-1999.-Vol.72.-P. 119-124.

266. Hoffmann J.A. Phylogenetic perspective in innate immunity / J.A.Hoffmann, F.C.Kafatos, Ch.A.Janeway // Science. -1999. Vol.284. -P. 13131317.

267. Hoffmann J.A. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective / J.A.Hoffmann, J.-M.Reichhart //Nature immunol. -2002.-№3:-P. 121-126.

268. Harnett M.M. Differential signalling during B-cell maturation./ M.M.Harnett, E.Katz and C.A.Ford // Immunology Letters.-2005.-Vol.98.-P.33-44.

269. Ignacio G. Toll-like receptor expression in feline lymphoid tissues / G.Ignacio, S.Nordone, K.Howard and G.Dean //Veterinary Immunology and Immunopathology.-2005.- Vol.l06.-P.229-237.

270. Ishiguro. N. Molecular structures of cattle T-cell receptor gamma and delta chains predominantly expressed on peripheral blood lymphocytes/ N.Ishiguro, Y.Aida, T.Shinagawa, M.Shinagawa. // Immunogenetic^.-1993.- Vol.38.-P. 437443.

271. Itohara, S. T cell delta gene mutant mice: independent generation of alpha beta T cells and programmed rearrangement of gamma delta TCR genes./ S.Itohara, P:Mombaerts, J.Lafaille^ et al //Cell.- 1993.-Vol.72:-P. 337.

272. Jiang S. Activated CD Id-restricted natural killer T cells secrete IL-2: innate help for CD4+CD25rf regulatory T cells? / S.Jiang, D.S.Game, D.Davies // Eur.J Immunol.- 2005.-Vol.35-P. 1193-1200.

273. Kammer G.M. Capping of human T cell specific determinants: kinetics of capping and receptor re-expression and regulation by the cytoskeleton/

274. G.M.Kammer, J.A.Smith, and R.Mitchell //J Immunol .-1983.-Vol.130.-P. 38-44.

275. KawakamiT. Mast Cell Survival and Activation by IgE in the Absence of Antigen: A Consideration of the Biologic Mechanisms and Relevance/ T.Kawakami and J.Kitaura. //The Journal of Immunology.- 2005.-Vol.175.-P. 4167-4173.

276. Kanayama N. Analysis of Marginal Zone B Cell Development in the Mouse with Limited B Cell Diversity: Role of the Antigen Receptor Signals in the Recruitment of B Cells to the Marginal Zone/ N.Kanayama, M.Cascalho and

277. H.Ohmori // The Journal of Immunology.-2005.-174.-P. 1438-1445.

278. Kassiotis G. Anatomical Heterogeneity of Memory CD4+ T Cells Due to Reversible Adaptation to the Microenvironment/ G.Kassiotis and B.Stockinger// The Journal of Immunology.- 2004.- Vol.173.- P.7292-7298.

279. Kacskovics I. Fc receptors in livestock species / I.Kacskovics // Veterinary Immunology and Immunopathology.- 2004.-Vol.102.-P. 351-362.

280. Kendall M.D. Functional anatomy of the thymus/ M.D.Kendall // J.Anat.-1991 .-Vol. 177.-P. 1 -29.

281. Kirschnek S. Phagocytosis-Induced Apoptosis in Macrophages Is Mediated by Up-Regulation and Activation of the Bcl-2 Homology Domain 3-Only Protein Bim / S.Kirschnek, S.Ying, S.F.Fischer // The Journal of Immunology.-2005.- Vol.174.-P. 671-679.

282. Kilian M. Functional of mucosal immunoglobulins. In Ogra P.L., Mestecky J., Lamm M.E., Strober W., McGhee J.R., Bienenstock J. (Eds)./ M.Kilian, M.W.Russel II Handbook of mucosal immunology. Orlando. -Florida. - Academic. - 1994. - P.127-137.

283. Kobrynski L.J. Cutting Edge: Anti body Production to Pneumococcal Polysaccharides Requires CD1 Molecules and CD8+T Cell / L.J.Kobrynski,

284. A.O.Sousa, A.J.Nahmias // The Journal of Immunology.- 2005.-Vol.174.-P.1787-1790

285. Koganei S. B-la cell origin of the murine B lymphoma line BCLi characterized by surface markers and bacterial reactivity of its surface IgM/ S.Koganei, M.Ito, K.Yamamoto and N.Matsumoto //Immunology Letters.-2005.-Vol.98.-P.232-244

286. Kollner B. Evaluation of immune functions of rainbow trout {Oncorhynchus mykiss)—how can environmental influences be detected?/ B.Kollner,

287. B.Wasserrab, G.Kotterba, U.Fischer //Toxicology Letters.-2002.-Vol. 131.-P. 83-95

288. Kremyanskaya M. Ig-Independent IgP Expression on the Surface of B Lymphocytes after B Cell Receptor Aggregation / M.Kremyanskaya, J.G.Monroe // The Journal of Immunology.- 2005.-174.-P. 1501-1506.

289. Liebler-Tenorio E.M. Uptake of colostral leukocytes in the intestinal tract of newborn calves/ E.M.Liebler-Tenorio, G.Riedel-Caspari and J.F.Pohlenz // Veterinary Immunology and Immunopathology.-2002.- Vol.85.-P. 33-40.

290. Lafarge X. Expression of MHC class I receptors confers functional intraclonal heterogeneity to a reactive expansion of Y5T cells/ X.Lafarge, V.Pitard, S.Ravet et al. // Eur.J Immunol.- 2005.- Vol.35.-P. 1896-1905.

291. Lacombe M.-H. IL-7 Receptor Expression Levels Do Not Identify CD8+ Memory T Lymphocyte Precursors following Peptide Immunization/ M.-H.Lacombe, M.-P.Hardy, J.Rooney and N.Labrecque //The Journal of Immunology- 2005.-Vol.175.-P. 4400-4407.t

292. Lippolis J.D. Proteomic survey of bovine neutrophils/ J.D.Lippolis and T.A.Reinhardt 11 Veterinary Immunology and Immunopathology.- 2005.-Vol.103.-P. 53-65.

293. Lim Hyung W. Cutting Edge: Direct Suppression of B Cells by CD4+CD25+ Regulatory T Cells / H.W.Lim, P.Hillsamer, A.H.Banham. and H.K.Chang//The Journal of Immunology.- 2005.- 175.-P. 4180-4183.

294. Lin T-J. Activation of Macrophage CD8: Pharmacological Studies of TNF and IL-1B Production / T-J.Lin, N.Hirji, G.R.Stenton //The Journal of Immunology .-2000.-164.-P. 1783-1792.

295. Liu W. Cloning and comparison of bighorn sheep CD 18 with that of domestic sheep, goats, cattle, humans and mice / W.Liu, K.Brayton, JtLagerquist // Veterinary Immunology and Immunopathology.- 2006.- 110.-P.11-16.

296. Mack M. Identification of Antigen-Capturing Cells as Basophils / M.Mack, M.A Schneider, C.Moll // The Journal of Immunology.- 2005,- 174.-P. 735-741.

297. Martin L.H. Isolation of CD1 genes a family of major histocompatibility complex-related differentiation antigens / L.H.Martin, F.Galabi, C.Milstein // Proc Natl Acad Sci USA.-1986.- 83.-P. 9154-9158.

298. Mathy N.L. Pathological and immunological changes after challenge infection with Pasteurella multocida in naive and immunized calves/ N.L.Mathy, J.-P.D.Mathy, R.P.Lee // Veterinary Immunology and Immunopathology.- 2002.- 85.-P.179-188.

299. Mayer B. The neonatal Fc receptor (FcRn) is expressed in the bovine lung/ B.Mayer, Z.Kis, G.Kaján //Veterinary Immunology and Immunopathology.-2004.- 98.-P. 85-89.

300. Michie Alison M. Clonal Characterization of a Bipotent T Cell and NK Cell Progenitor in the Mouse Fetal Thymus/ A.M.Michie, J.R.Carlyle, T.M.Schmitt //The Journal of Immunology. -2000.- 164. P.1730-1733.

301. Miller R.H. Relationship between immunoglobulin concentration in milk and phagocytosis by bovine neutrophils/ R.H.Miller, A.J.Guidry, M.J.Paape //Am.J.Vet.Res.- 1988.-49.-P.42-45.

302. Millet I. Up-regulation of receptors for IgA on activated human B lymphocytes/ I.Millet, F.Brière, J.de Vries and J-P.Revillard. // Immunology Letters.-1988.- 19.-P. 153-157.

303. Mond J.J. T cell-independent antigens type 2./ J.J.Mond, A.Lees, C.M.Snapper // Annu.Rev. Immunol.-1995.- 13.-P.655-692.

304. Morrison W .1. Phenotypic and functional characterization of bovine lymphocytes./ W.I.Morrison, C.L.Baldwin, N.D.MacHugh // In Progress in Veterinary Microbiology and Immunology.- Switzerland, Basel.- 1988.-P. 134-164.

305. Mombaerts P. Mutations in theT-cell antigen receptor alpha and beta block thymocyte development at different stages/ P.Mombaerts, M.A.Rudnicki, J.Lacomint. //Nature. -1992.- 360.-P.225-230.

306. Morton H.C. IgA Fc receptors in cattle and horses / H.C.Morton //Veterinary Immunology and Immunopathology.-2005.- 108.-P. 139-143.

307. Nakaya M. IgM production of lymphocytes from C57BL/6N mice was stimulated by estrogen treated splenic adherent cells/ M.Nakaya, M:Yamasaki, H.Tachibana and K.Yamada //Immunology Letters.-2005.-98.-P.225-231.

308. Nakanishi T. Specific cell-mediated* immunity in fish / T.Nakanishi, K.Aoyagi, C.Xia, J.M.Dijkstra and M.Ototake. // Veterinary Immunology and Immunopathology.-1999.-72.-P. 101 -109.

309. Nishimura T. Expression of potential lymphocyte trafficking mediator molecules in the mammary gland / T.Nishimura //Vet.Res.-2003.-34.-P.3-10.

310. Nishimura H. A Novel Role of CD30/CD30 Ligand Signaling in the Generation of Long-Lived Memory CD8+ T Cells / H.Nishimura, T.Yajima, H.Muta //The Journal of Immunology.-2005.- 175.-P. 4627-4634.

311. Nicholson L.B. T cell recognition of self and altered self antigens / L.B.Nicholson, V.K.Kichroo //Crit. Rev. Immunol.-1997.- 17.-P. 449-462.

312. Nonaka S. Intestinal T5T Cells Develop in Mice Lacking Thymus, All Lymph Nodes, Peyer's Patches, and Isolated Lymphoid Follicles / S.Nonaka, T.Naito, H.Chen et al. //The Journal of Immunology.-2005.- 174.-P. 1906-1912.

313. Okamura M. Differential responses of macrophages to Salmonella enterica serovars Enteritidis and Typhimurium/ M.Okamura, H.S.Lillehoj, R.B.Raybourne //Veterinary Immunology and Immunopathology.-2005.-107.-P.327-335.

314. Oriss T.B. Dynamics of Dendritic Cell Phenotype and Interactions with CD4+ T Cells in Airway Inflammation and Tolerance / T.B.Oriss, M.Ostroukhova, C.Seguin-Devaux//The Journal Immunology.- 2005.- 174.-P.854-863.

315. Quartier P. Predominant role of IgM-dependent activation of the classical pathway in the clearance of dying cells by murine bone marrow-derived macrophagesin vitro/ P.Quartier, P.K.Potter, M.R.Ehrenstein et al. //Eur.J.Immunol.-2005.-35.-P.252-260.

316. Paape M.J. The bovine neutrophil: Structure and function in blood and milk/ M.J.Paape, D.D.Bannerman, X.Zhao and J-W.Lee //Vet.Res.-2003.- 34,-P.597-627.

317. Parbhakar O.P. Immunophenotypic characterization and depletion of pulmonary intravascular macrophages of horses / O.P.Parbhakar, T.Duke, H.G.G.Townsendand B.Singh// Vet. Res.-2004.- 35.-P. 39-51.

318. Pastoret P.P. Handbook of vertebrate immunology/ P.P.Pastoret, P.Griebel, H.Bazin, A.Govaerts.- 1998 by Academic Press.- 661 p.

319. Petrie H.T. CD4+8- and CD4-8+ mature thymocytes require different post-selection processing for final development/ H.T.Petrie, A.Strasser, A.W.Harris, P.Hugo and K.Shortman // The Journal of Immunology.- 1993,- 151.- 3.-P.1273-1279.

320. Pettersen E.F. Effect of seawater temperature on leucocyte populations in Atlantic salmon post-smolts/ E.F.Pettersen, I.Bjorlow, T.J.Hagland and H.I.Wergeland //Veterinary Immunology and Immunopathology.- 2005.-106.-P. 6576.

321. Pérez J. Pathological and immunohistochemical study of the abomasum and abomasal * lymph nodes in goats experimentally infected with Haemonchus contortns/ J.Pérez, P.M.Garcia, S.Hernández//Vet. Res. -2001.- 32.-P.463-473.

322. Poggi A. Regulation of YST cell survival by soluble HLA-I: Involvement of CD8 and activating killer Ig-like receptors/ A.Poggi, P:Contini, S.Catellani // Eur.J Immunol.- 2005.- 35.-P.2670-2678.

323. Porcelli S.A. The CD1 family: a third lineage of antigen-presenting molecules/ S.A.Porcelli // Adv. Immunol.- 1995.- 59.-P. 1-98.

324. Prieto G.,Mc. IgG response against infective larvae of Dirofilaria immitis in experimentally infected cats/ G.Mc. Prieto', J.W Call, Luigi Venco // Vet. Res.-2001.-3.-P. 93-96.

325. Prunesco P. Natural and experimental phagocytosis by erythrocytes in amphibian / P.Prunesco //Nature, New biol.-1971.-231.-P. 143-144.

326. Puthier D. A General Survey of Thymocyte Differentiation by Transcriptional Analysis of Knockout Mouse Models / D.Puthier, F.Joly, M.Irla //TheJ.of-Immunology .-2004.-173 .-P.6109-6118.

327. Ramanathan B. Characterization of bovine cDNA encoding triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1)/ B.Ramanathan, J.E.Minton, C.R.Ross and F.Blecha // Veterinary Immunology and Immunopathology.-2004.-102.- 1-2.-P.85-89.

328. Ramakrishna C. Differential Regulation of Primary and Secondary CD8+ T Cells in the Central Nervous System / C.Ramakrishna, S.A.Stohlman , R.A.AtkinsonThe Journal of Immunology.-2004.-173.-P. 6265-6273.

329. Rast J.P. Towards understanding the evolutionary origins and early diversification of rearranging antigen receptor/ J.P.Rast, G.W.Litman // Immunol. Rev.-1998.- 166.-P.79-86.

330. Ravindran R. Expression of T-bet by CD4 T Cells Is Essential for Resistance to Salmonella Infection / R.Ravindran, J.Foley, T.Stoklasek// The J. of Immunology.-2005.-175.-P.4603-4610.

331. Regner M. Granzymes in cytolytic lymphocytes —to kill a killer? / M.Regner and A.Miillbacher Z'Immunology and Cell Biology.-2004.- 82.-P. 161.

332. Revell P. Granzyme B and the Downstream Granzymes C and/or F Are Important for Cytotoxic Lymphocyte Functions/ P.Revell, W.J.Grossman, D.A.Thomas //The J.of Immunology. -2005. -174.-P.2124-2131.

333. Rogers A.N. Function of ruminant yô T cells is defined by WCl.lor WC1.2 isoform expression/ A.N.Rogers, D.G.VanBuren, E.Hedblom // Veterinaiy Immunology and Immunopathology.- 2005.-108.-P. 211-217.

334. Reynolds J. D. The evolution and involution of Peyer's patches in fetal and postnatal sheep. / J.D.Reynolds, B.D.Morris // Eur. J. Immunol.- 1983.- 13.-P. 627-635.

335. Rodriguez-Pinto D. B cells can prime naive CD4+ T cells in vivo in the absence of other professional antigen-presenting cells in a CD154-CD40-dependent manner / D.Rodriguez-Pinto, J.Moreno // Eur.J Immunol.-2005.-35.-P. 1097-1105.

336. Rowley A. Application of protein mass spectrometry in cell biology/ A.Rowley, J.S.Choudhary, M.Marzioch //Methods.- 2000.- 20.- 4.-P.383-397.

337. Rubtsov A.V. TLR Agonists Promote Marginal Zone B Cell Activation and Facilitate T-dependent IgM Responses/ A.V.Rubtsov, C.Swanson, S.Troy // The Journal of Immunology.- 2008.- 180.-P.3882-3888.

338. Roux K.H. Structual analysis of the nurse shark (new) antigen receptor (NAR) / K.H.Roux, A.S.Greenberg, L.Greene // Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-l 998.-95.-P. 11804-11809.

339. Salinas I. Effect of heat-inactivated fish and non-fish derived probiotics on the innate immune parameters of a teleost fish (Spams aurata L.)/ I.Salinas, P.Diaz-Rosales, A.Cuesta//Veterinary Immunology and Immunopathology.-2006.-lll.-P. 279-286.

340. Salmon H. The mammary gland and neonate mucosal immunity/ Salmon H. // Veterinary Immunology and Immunopathology.-1999.-72.-P. 143-155.

341. Schaible U.E. CD1 molecules and CDl-dependet T cells in bacterial infections: a link from innate to acquired immunity/ U.E.Schaible, H.E.Kaufmann // J. Immunol .-2000.- 12-6.-P.27-35.

342. Schartz N.C. IL-2 production by dendritic cells is not critical for the activation of cognate and innate effectors in draining lymph nodes/ N.C.Schartz, N.Chaput,J.Taieb//Eur.J.Immunol.-2005.-34.-P.2840-2850.

343. Sehrawat S. Anti-erythrocyte natural antibody activity in the unconventional 'heavy chain' immunoglobulins of Indian desert camel (Camelus dromedarius)! S.Sehrawat, A.Singh // Veterinary Immunology and Immunopathology.-2006.- 111.- P.139-147.

344. Shimosato T. Toll-like receptor 9 is expressed on follicle-associated epithelia containing M cells in swine Peyer's patches/ T.Shimosato, M.Tohno, H.Kitazawa//Immunology Letters.-2005.- 98.-P. 83-89.

345. SinkoraM. Lymphocyte development in fetal piglets: Facts and surprises/ M.Sinkora, J.E.Butler, W.Holtmeier //Veterinary Immunology and Immunopathology.- 2005.-108.-P. 177-184.

346. SobotaA. Binding of IgG-Opsonized Particles to FcYR Is an Active Stage of Phagocytosis That Involves Receptor Clustering and'Phosphorylation / A.Sobota,

347. A.Strzelecka-Kiliszek, E.Giadkowska//The Journal of Immunology.- 2005.-175.-P. 4450-4457.

348. Sorensen K.K. Isolation, cultivation and characterization of head kidney macrophages from Atlantic cod, Gadus morhua L/ K.K.Sorensen,

349. B.Sveinbjomsson, R.A.Dalmo// J. of Fish Diseases .-1997.- 20.-P. 93-107.

350. Springer T.A. Adhesion receptors of the immune system / T.A.Springer // Nature.-1990.- 346.-P.425-434.

351. Steinbach F. Molecular cloning and characterization of markers and cytokines for equid myeloid cells/ F.Steinbach, R.Stark, S.Ibrahim // Veterinary Immunology and Immunopathology.-2000.-108.-P. 227-236.

352. Stein V.M. Characterization of canine microglial cells isolated-ex vivo/ V.M.Stein, M.Czub, R.Hansen//Veterinary Immunology and Immunopathology.-2004.- 99.-P.73-85.

353. Stoel M. Restricted IgA Repertoire in Both B-l and B-2 Cell-Derived Gut Plasmablasts ' M.Stoel, H-O.Jiang , C.C.van Diemen // The Journal of Immunology.- 2005.- 174.-P. 1046-1054.

354. Tafalla C. In vivo and in vitro effect of oxytetracycline treatment on the immune response of turbot, Scophthalmus maximus (L.) / C.Tafalla, B.Novoa, J.M.Alvares and A.Figueras // Journal of Fish Diseases.- 1999.-22.-P.271-276.

355. Terawak K. Absence of Leukotriene B4 Receptor 1 Confers Resistance to Airway Hyperresponsiveness and Th2-Type Immune Responses / K.Terawak, T.Yokomizo, T.Nagase // The Journal of Immunology.- 2005.- 175.-P .4217-4225.

356. Tizard I.R. Veterinary Immunology: an Introduction /Ian R. Tizard.-2000.-6th ed.-482p.

357. Thornton A.M. CD4+CD25+ Immunoregulatory T Cells Suppress Polyclonal T Cell Activation In Vitro by Inhibiting Interleukin 2 Production/ A.M.Thornton and E.M.Shevach //J. Exp. Med.-1998.-188.- 2.-P. 287-296.

358. Thornton A.M. Suppressor Effector Function of CD4+CD25+ Immunoregulatory T Cells Is Antigen Nonspecific/ A.M.Thornton and E.M.Shevach //The Journal of Immunology.-2000,- 164.-P. 183-190.

359. Thuvander A. Monoclonal antibodies to salmonid immunoglobulin: characterization and applicability in immunoassays/ A.Thuvander, C.Fossum, N.Lorenzen.// Dev. C. Immunol.-1990.- 14.-P. 415-423.

360. Tutter A. Structure, map position and evolution of two newly diverged mouse Ig VH gene families / A.Tutter, P.Brodeur, M.Shlomchik, R.Riblet //Immunol. -1991.- 147.-P. 3215-3223.

361. Uren T.K. Vaccine-induced protection against gastrointestinal bacterial infections in the absence of secretory antibodies/ T.K.Uren, O.Wijburg, C.Simmons //Eur.J.Immunol.-2005.-35.-P.180-188.

362. Usui T. Expression of tumor necrosis factor-a in IglvT B-cells from bovine leukemia virus-infected lymphocytotic sheep/ T.Usui S.Konnai, K.Ohashi and M.Onuma // Veterinary Immunology and Immunopathology.-2006.-112.- 3-4.-P.296-301.

363. Vahlenkamp T.W. The role of CD4+CD25+ regulatory T cells in viral infections/ T.W.Vahlenkamp, M.B.Tompkins and W.Tompkins // Veterinary Immunology and Immunopathology.-2005.-108.-P. 219-225.

364. Van der Heijden. Production, characterisation and applicability of monoclonal antibodies to European eel immunoglobulin/ Van der Heijden, M.H.T.Rooijakkers, J.B.M.A.Booms// Veterinary Immunology and Immunopathology.-1995 .-45 .-P. 151 -164.

365. Van Bergen J. Phenotypic and Functional Characterization of CD4 T Cells Expressing Killer Ig-Like Receptors/ J.Van Bergen, A.Thompson, A.Van der Slik // The Journal of Immunology.- 2004;- 173.-P. 6719-6726.

366. Van Mierlo G.J.D. TNFR-Shedding by CD4+CD25+ Regulatory T cells Inhibits the Induction > of Inflammatory Mediators/ G.J.D.Van; Mierlo, 11.V.Seherer, M.Hameetman// The Journal of Immunology.-2008.- 180.-P. 2747-2751.

367. Vankayalapati R. Role of NK Cell-Activating Receptors and Their Ligands in the Lysis of Mononuclear Phagocytes Infected with an Intracellular Bacterium/R.Vankayalapati, A.Garg, A.Porgador// The Journal of Immunology.-2005.-175.-P.4611-4617. .

368. Vremec Dl CD4 and CD8 Expression by Dendritic Cell Subtypes in Mouse Thymus and . Spleen / D. Vremec, J.Pooley, H.I-Ioohrein // The Journal5 of Immunology.- 2000.- 164.-P. 2978-2986.

369. Wang H. Multi-dimensional liquid phase based separations in proteomics/

370. H.Wang, S.Hanash // J.Chromatogr. B: Analyt. Technol.Biomed. Life Sci.-2003.-787.1.-P.11-18.

371. Wetzel S.A. Peptide-Specific Intercellular Transfer of MHC Class II to CD4+ T Cells Directly from the Immunological Synapse upon Cellular Dissociation / S.A.Wetzel, T.W.McKeitha and D.C.Parker // The Journal of Immunology.- 2005.-174.-P. 80-89.

372. Wilson S.M. B-l and B-2 B-cells in the pig cannot be differentiated by expression of CD5 / S;M.Wilson and B.N. Wilkie //Veterinary Immunology and Immunopathology.-2007.- 115.-P.205-215.

373. Wortis H.H; Cutting Edge Commentary: Origins of B-l Cell / H.H.Wortis and R.Berland // The Journal of Immuriology.-2001.-166.-P.2163-2166.

374. Zamisch M. Ontogeny and Regulation of IL-7-Expressing Thymic Epithelial Cells/ M.Zamisch, B.Moore-Scott, D-M.Su // The Journal of Immunology.-2005.-174.-P. 60-67.

375. Zuckermann F.A. Extrathymic CD4/CD8 double positive T cells / F.A. Zuckermann // Veterinary Immunology and Immunopathology.-1999.-72.-P.55-66.

376. Zuniga-Pflucker J.C. Unraveling the origin of lymphocyte progenitors/ J.C.Zuniga-Pflucker, T.M.Schmitt//Eur.J.Immunology.-2005.-35.-P.2016-2018.