Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация генетических маркеров, ассоциированных с предрасположенностью к сахарному диабету типа 1, на хромосомах 6 и 10

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация генетических маркеров, ассоциированных с предрасположенностью к сахарному диабету типа 1, на хромосомах 6 и 10"

На правах рукописи

СЕРЕГИН ЮРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬЮ К САХАРНОМУ ДИАБЕТУ ТИПА 1, НА ХРОМОСОМАХ 6 И 10

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика»).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Валерий Вячеславович Носиков

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Иткес Александр Вениаминович кандидат биологических наук Судомоина Марина Анатольевна

Ведущая организация: Медико-генетический научный центр РАМН

Защита состоится «_»_2004г. в_часов на

заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд,!

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика».

Реферат разослан «_»

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

2004 г.

В. И. Щербакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сахарный диабет (СД) типа 1 является одним из наиболее распространенных и тяжелых наследственных заболеваний человека. Как правило, при наличии генетической предрасположенности он развивается в раннем возрасте и вызывает тяжелые осложнения, такие как поражения кровеносных сосудов, почечную недостаточность, слепоту, гангрены.

Лечение уже развившегося сахарного диабета типа 1 со сформировавшимся фенотипом требует огромных материальных ресурсов. С другой стороны, при своевременной профилактике заболевания у пациентов с повышенным генетическим риском можно как минимум значительно отсрочить появление симптомов сахарного диабета и снизить опасность развития осложнений. Поэтому в настоящее время одним из наиболее прогрессивных подходов является разработка стратегии ранней диагностики, прогнозирования и превентивной терапии заболевания с использованием генетических маркеров.

Наследование сахарного диабета типа 1 имеет полигенный характер. По-видимому, существует несколько десятков генов, продукты которых прямо или косвенно вовлечены в его патогенез. Причем в отличие от моногенных синдромов, развитие сахарного диабета типа 1 связано не с мутациями отдельных генов, а с определенными комбинациями их "здоровых" аллелей, называемых этиологическими вариантами. Распространенность каждого из вариантов сильно варьирует в разных этнических группах, соответственно различается и популяционный риск каждого из них. Поэтому первоочередной задачей является поиск генов и полиморфных маркеров, предрасполагающих к заболеванию, в конкретных этнических группах.

При реализации подхода генетического картирования, часто используемого в исследованиях полигенных, многофакторных наследственных заболеваний, поиск генов-кандидатов начинают не с функций, а с хромосомной локализации. Для этого проводится детальное картирование участков сцепления на всех хромосомах человека с использованием групп полиморфных маркеров и семей с наличием

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

»

заболевания у сибсов. Затем в участках, показавших максимальное сцепление с сахарным диабетом типа 1, изучают функции конкретных генов и исследуют ассоциацию с заболеванием полиморфных маркеров в этих генах.

Установление ассоциации генов с заболеванием необходимо для понимания природы процессов, приводящих к сахарному диабету типа 1, и для оценки его индивидуального и популяционного генетического риска.

Цель работы. Целью данной работы являлся поиск полиморфных маркеров, ассоциированных с генетической предрасположенностью к сахарному диабету типа 1, на хромосомах 6q27 и 10р 11.

Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ ассоциации с сахарным диабетом типа 1 группы полиморфных маркеров в хромосомной области 6q27 с использованием семей с наличием заболевания у сибсов. Определить гаплотипы повышенного риска по всем маркерам.

2. Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа 1 группы микросателлитных полиморфных маркеров в хромосомной области 10р11.

3. При наличии ассоциации проанализировать функции генов в областях 6q27 и 10р 11, определить гены, которые по своим функциям могут быть задействованы в развитии СД типа 1. Изучить ассоциацию с СД типа 1 полиморфных маркеров внутри этих генов.

Научная новизна работы В данной работе впервые была изучена ассоциация полиморфных маркеров в хромосомных областях 6q27 и 10р11 с сахарным диабетом типа 1 у пациентов из городских популяций России. Обнаружена статистически достоверная ассоциация с СД типа 1 в обеих областях.

Впервые в мире проводились исследования функций генов в хромосомных областях 6q27 и 10р11 в связи с их возможным участием в развитии сахарного диабета типа 1. На роль генов-кандидатов предложены гены Рй0й2 и Т0Р8, связанные с предрасположенностью к СД типа 1.

Также впервые в мире проведено исследование полиморфных маркеров в генах Рй0й2 и Т0Р8. Два участка гена Рй0й2 секвенированы для определения не обнаруженных ранее полиморфных маркеров.

Практическая ценность работы. Изучение ассоциации полиморфных маркеров с сахарным диабетом типа 1 позволит оценить относительный (популяционный) и абсолютный (индивидуальный) риск развития заболевания в популяциях России, прогнозировать его развитие и прогрессирование задолго до клинического проявления и, наконец, правильно формировать группы риска. Эти исследования также могут способствовать наиболее эффективному проведению профилактики сахарного диабета (мониторинг лиц группы риска, использование иммуномодуляторов и/или иммуносупрессоров, превентивной инсулинотерапии и др.), а также обучению лиц, уже заболевших СД, самоконтролю уровня глюкозы в крови, проведению интенсивной инсулинотерапии и т.д.

Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого совета ФГУП "ГосНИИ генетика" от 26 марта 2004 г. Результаты настоящей работы докладывались на ежегодных конференциях Государственной подпрограммы "Геном человека" (2000,2001 гг.), на конгрессах международной организации по изучению генома человека - HUGO (2001, 2002 гг.), Европейской ассоциации по изучению диабета - EASD (2001 г.) и Международной федерации диабета - IDF (2003 г.).

Публикации. По материалам работы опубликовано 9 печатных работ, включая 2 статьи, а также тезисы докладов и сообщений на международных конференциях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 103 страницах машинописного текста и содержат 14 таблиц и 10 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Изучение ассоциации полиморфных маркеров в хромосомной области 6q27 с сахарным диабетом (СД) типа 1.

Группа пациентов была сформирована из 35 семей с конкордантными по заболеванию парами сибсов и 72 семей с дискордантными парами сибсов, представляющих городское население Москвы и Самары. Семьи содержали

двух родителей и как минимум двух сибсов. В работе использовалась геномная ДНК, выделенная из цельной крови.

Одним из наиболее значимых локусов по вкладу в семейный риск развития заболевания является IDDM8, расположенный в хромосомной области 6q27. Он был обнаружен уже в первой работе по геномному поиску (Davies et al, 1994). В работах Луо и соавт. (1995,1996) для полиморфного маркера D6S281 показано значимое сцепление с СД типа 1 (MLS = 3,6) на объединенной группе семей европеоидного происхождения.

Проведенные ранее другими авторами исследования позволили выделить в хромосомной области 6q27 вблизи теломеры небольшую область сцепления с СД типа 1 размером около 225 т.п.н (Owerbach et al, 2000). В этой области по данным NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) к настоящему времени обнаружены три сильно сцепленных гена. Это ген субъединицы протеосомы PSMB1, связывающего ТАТА-бокс белка ТВР и активатора программируемой гибели клетокPDCD2.

На первом этапе работы были проанализированы 4 полиморфных маркера, расположенных в данной области хромосомы 6 (Рис.1). Среди них три однонуклеотидных полиморфных маркера, Т(-99)С в промоторе гена ТВР, G(-276)Тв промоторе гена PDCD2 и С1038Тв З'-нетранслируемой области гена PDCD2, и полиморфный микросателлит (CAG)n в экзоне 2 гена ТВР. Кроме того, были исследованы еще 3 возможных однонуклеотидных полиморфизма в кодирующих частях гена PSMB1, но ни один из них в исследуемой группе не оказался полиморфным.

Рисунок 1. Взаимное положение полиморфных маркеров и генов в хромосомной области 6q27.

Все полиморфные маркеры были получены из баз данных dbSNP и UniSTS Национального центра биоинформатики (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov). Для каждого из четырех маркеров Т(-99)С, С1038Т, 0(-276)Г и (CAG)n идентифицированы аллели и генотипы во всех 107 семьях больных СД типа 1.

Для оценки ассоциации с заболеванием использовался метод неравновесной передачи аллелей от родителей к больным сибсам - TDT (Spielman et al, 1993). Вычислялась величина х2. которая является мерой различий между числом сибсов, которым передается аллель, и числом сибсов, которым он не передается. Модификация метода неравновесной передачи аллелей, S-TDT, основана на оценке различий передачи аллелей в сибсовых парах (Spielman et al, 1998). Здесь различия вычислялись между частотами передачи аллелей здоровым и больным сибсам. Тест S-TDT в чистом виде не проводился, вместо него проводился объединенный тест, сочетающий в себе результаты как TDT, так и S-TDT (Spielman et al, 1998). Величина z', рассчитываемая в объединенном тесте, является мерой относительного риска развития заболевания в случае наличия у пробанда определенного аплеля полиморфного маркера.

В исследованиях полиморфных маркеров с числом аллелей больше двух, одним из которых является маркер (CAG)n, вводилась поправка Бонферрони на число множественных сравнений. Значения достоверности Р дополнительно умножались на величину (N-1), где N - это число аллелей полиморфного маркера. Необходимость введения данной поправки обусловлена тем фактом, что данные для разных аллелей не являются независимыми.

1.1. Изучение ассоциации полиморфного маркера (CAG)n с СД типа 1.

Аллели микросателлитного маркера (CAG)n идентифицировали с помощью разделения в 10% полиакриламидном геле амплифицированных фрагментов ДНК, содержащих внутри себя полиморфный участок (Рис. 2). Было обнаружено 6 аллелей, содержащих от 25 до 32 повторов CAG с длиной от 130 до 151 п.н. Нумерация аллелей осуществлялась по числу повторов. На геле проводилось сравнение с аллельной "лестницей", содержащей все варианты обнаруженных в выборке аллелей (аллели 25,28-32).

Рисунок 2. Пример разделения амллифицированных аллелей полиморфного маркера (CAG)n в 10% полиакриламидном геле. На дорожке 4 - аллельная "лестница", содержащая аллели 25 и 28-32. Генотипы по остальным дорожкам следующие : 1,2,3 - 31/31; 5 -29/31; 6 - 30/32; 7,8 - 25/29; 9 - 29/32; 10 - 25/32. Изображение сканировано.

В результате проведенных тестов на неравновесную передачу аллелей ассоциация полиморфного маркера (CAG)n с СД типа 1 не была обнаружена.

Ассоциация полиморфного маркера (CAG)n с СД типа 1 не была обнаружена и в единственном аналогичном исследовании, проведенном на группе европейских семей (Owerbach et al, 2000). С другой стороны, ранее была показана ассоциация данного полиморфного маркера с некоторыми неврологическими заболеваниями (Koide et al, 1999; Wu et al, 2004). По-видимому, экспансия тринуклеотидных повторов, имевшая место у неврологических больных, никак не связана с сахарным диабетом типа 1.

1.2. Изучение ассоциации однонуклеотидных полиморфных маркеров Т(-99)С, С1038Ти в(-276) Тс СДтипа 1.

Для идентификации аллелей однонуклеотидных полиморфных маркеров использовался метод ПЦР-ПДРФ. На первом этапе амплифицировали фрагмент ДНК, содержащий внутри себя полиморфный маркер. Затем проводили инкубацию с рестриктазой, расщепляющей данный фрагмент в случае наличия в нем определенного аллеля. Разделение образующихся фрагментов ДНК проводили в 10% полиакриламидном геле.

Аллели полиморфного маркера Т(-99)С определялись с помощью рестриктазы М!в!, расщепляющей амплифицированный фрагмент длиной 102

п.н. Фрагмент, содержащий аллель С, оставался нерасщепленным, в то время как фрагмент, содержащий аллель Т, расщеплялся на фрагменты 81 и 21 п.н. (Рис. 3). Аналогично в случае аллеля Г полиморфного маркера С1038Т амплифицированный фрагмент длиной 179 п.н. расщеплялся рестриктазой Alul на фрагменты с длинами 150 и 29 п.н. Для определения аллелей полиморфного маркера G(-276)T использовалась рестриктаза Paul. Фрагмент длиной 248 п.н., содержащий аллель Г, она расщепляла на две части с длинами 80 и 168 п.н., а фрагмент, содержащий аллель G, на три части с длинами 80,128 и 40 п.н.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рисунок 3. Пример разделения в 10% полиакриламидном геле аллелей полиморфного маркера Т('99)С после амплификации и расщепления рестриктазой М1в\. Длины фрагментов: аллель С - 102 п.н., аллель Т- 81 п.н. Генотипы по дорожкам: 1,3,6,9 - С/С; 2,4,5,7, 10,11 - С/Т; 8 - Т/Т. Изображение сканировано.

По результатам как теста TDT, так и объединенного теста не было обнаружено никаких значимых различий в частотах передачи аллелей полиморфных маркеров Т(-99)С и й(-276)Т в семьях с СД типа 1. Таким образом, ассоциация с СД типа 1 данных полиморфных маркеров отсутствует.

Для полиморфного маркера С1038Т в том же гене РйСй2, напротив, ассоциация с СД типа 1 была обнаружена (Табл. 1). Аллель С данного маркера достоверно чаще передается больным детям (75 семей против 47, х2 = 6,43, Р = 0,011). Объединенный тест также подтверждает наличие ассоциации = 2,18, Р= 0,015).

Таблица 1. Передача в семьях с СД типа 1 больным сибсам аллелей полиморфного маркера С1038Т, а также результаты объединенного теста ТОТ и S-TDT.

Аллель TDT Объединенный тест (TDT+S-TDT)

Передается больным сибсам Не передается больным сибсам х2 Р Z' Р

С 75 47 6,43 0,011 1,76 0,015

т 47 75

Таким образом, аллель С полиморфного маркера С1038Т в гене PDCD2 является фактором повышенного риска развития СД типа 1 в исследуемых нами городских популяциях России. Однако этот факт не может быть безусловным свидетельством роли самого гена PDCD2 в патогенезе данного заболевания. Возможно, что маркер С1038Т находится в неравновесии по сцеплению с другим пока неизвестным полиморфным маркером, локализованном в одном из соседних генов в той же хромосомной области.

1.3. Ассоциация гаплотипов полиморфных маркеров Т(-99)С, С1038Т и G(-276)N c СД типа 1.

Обнаруженная с использованием отдельных однонуклеотидных полиморфных маркеров ассоциация была проверена с помощью более информативного теста, которым является анализ ассоциации гаплотипов, содержащих аллели сразу нескольких сильно сцепленных между собой маркеров (Xiong, 1999). При достаточно большом числе маркеров гаплотипы гораздо лучше, чем аллели, характеризуют реально существующие в популяции хромосомы. Исследования гаплотипов наиболее информативны при наличии сцепления между всеми полиморфными маркерами.

Оценка неравновесия по сцеплению между тремя исследуемыми нами однонуклеотидными полиморфными маркерами проводилась с использованием перестановочного теста (Roff and Bentzen, 1989). Показано наличие сильного неравновесия (Р < 0.01 для каждой пары маркеров), что подтверждает полученные ранее результаты о принадлежности этих маркеров к одной группе сцепления (Owerbach et al, 2000).

Гаплотипы были сформированы из аллелей трех однонуклеотидных полиморфных маркеров Т(-99)С, С1038Т и й(-276)Т. После коррекции Бонферрони на общее число гаплотипов ^ = 7) обнаружена выраженная ассоциация с СД типа 1 гаплотипа О-О-й (Табл. 5). В исследуемой выборке он передавался больным детям в 27 случаях и не передавался в 10 (х2 = 7,81; Рс = 0,036). Объединенный тест также свидетельствует об ассоциации гаплотипа С-О-й с СД типа 1 = 2,59; Рс- 0,029).

Таким образом, гаплотип О-О-й, как и аллель С полиморфного маркера С1038Т, является фактором риска развития СД типа 1. По-видимому, у носителей данного гаплотипа существует пока не обнаруженный предрасполагающий к заболеванию полиморфный маркер в одном из генов внутри области сцепления на хромосоме 6q27. Определенный аплельный вариант этого маркера изменяет уровень экспрессии гена или структуру соответствующего белка, что приводит к метаболическим нарушениям и формированию фенотипа заболевания.

Таблица 5. Передача в семьях с СД типа 1 больным сибсам гаплотипов, содержащих аллели полиморфных маркеров Т(-99)С, С1038Ти0(-276)Т.

Гаплотип TDT Объединенный тест (TDT+S-TDT)

Передается больным сибсам Не передается больным сибсам х2 Рс z' Рс

C-T-G 31 38

C-C-G 27 10 7,81 0,036 2,59 0,029

T-C-G 6 5

T-T-G 51 38

С-Т-Т 17 24

С-С-Т 28 33

Т-Т-Т 5 7

1.3. Поиск полиморфных маркеров в гене PDCD2 у больных СД типа 1.

Ранее было неоднократно показано, как для человека, так и для модельных организмов (мышей линии NOD), что основную роль в развитии сахарного диабета типа 1 играют гены, продукты которых участвуют в

регуляции иммунного ответа, что легко объяснимо, учитывая аутоиммунный характер данной патологии. У человека, например, в число генов-кандидатов, предрасполагающих к СД типа 1, входят гены главного локуса гистосовместимости (Davies et al, 1994), поверхностных рецепторов Т-лимфоцитов CD4 (Ghabanbasani et al, 1994) и CTLA4 (Nistico et al, 1996), интерлейкина 12 (Morahan et al, 1996). У мышей показана связь с СД типа 1 многих генов, продукты которых регулируют последовательные стадии лимфопоэза, способствуют узнаванию антигенов Т-лимфоцитами, отвечают за формирование иммунного ответа, межклеточные взаимодействия и т.д. (Aldrich et al, 1994; Yan et al, 1997; Durant et al, 2003). Нарушения на каждой из этих стадий способны привести к аутоиммунной реакции, в данном случае, против (S-клеток поджелудочной железы, то есть к СД типа 1.

Основываясь на этих данных, был проведен анализ функций каждого из трех генов внутри области 6q27, на основании которого было сделано предположение о роли в развитии СД типа 1 активатора программируемой гибели клеток PDCD2, который, по-видимому, участвует в процессах дифференцировки лимфоидных клеток в тимусе на ранних стадиях развития (Baron et al, 2002). Путем пока неизвестных регуляторных механизмов он вызывает апоптоз у незрелых Т-лимфоцитов. Поскольку именно в тимусе происходит "выбраковка" аутореактивных клонов Т-лимфоцитов, нарушение этого процесса может приводить к возникновению аутоиммунной реакции.

Проведенное исследование первого экзона гена PDCD2 и его фланкирующих областей показало, что наиболее значимые для экспрессии участки содержатся в интервале от -350 до +200. В них обнаружена высокая плотность участков узнавания основных транскрипционных факторов, а также области островков CpG, метилирование которых может резко менять экспрессию гена. В дальнейшем у 20 неродственных больных было проведено секвенирование этой регуляторной области вместе с первым экзоном, а также второго экзона, который кодирует основной репрессорный домен белка PDCD2, содержащий структуру типа "цинковый палец". Длины секвенированных последовательностей: первый участок (промотор и первый экзон) - 683 п.н., второй участок (второй экзон) - 436 п.н. Из 20 исследованных пробандов 10 являлись носителями гаплотипа повышенного риска C-C-G.

Рисунок 4. Пример хроматограмм, полученных при автоматическом секвениро-вании промоторной области гена PDCD2. Показаны два образца , с различными генотипами полиморфного маркера G(-276)T.

Поиск новых полиморфных маркеров в гене PDCD2 не дал положительных результатов. Замена G(-276)T однозначно фиксируется на хроматограммах (рис. 4), но другие маркеры в промоторной области, первом и втором экзонах отсутствуют.

Этот факт вовсе не свидетельствует об отсутствии связи между геном PDCD2 и сахарным диабетом типа 1. Нарушение экспрессии или функций гена может быть вызвано изменениями других нуклеотидных последовательностей, например, экзонов 3, 4, 5, б, участков сплайсинга в интронах, участков узнавания транскрипционных факторов в энхансерах и т.д. В рамках настоящего исследования были проверены лишь наиболее значимые области гена. Отсутствие в них неизвестных ранее полиморфных маркеров является важной информацией, необходимой для дальнейшего изучения связи гена PDCD2 и других генов в хромосомной области 6q27 с сахарным диабетом типа 1.

2. Изучение сцепления и ассоциации полиморфных маркеров в хромосомной области 10р11 с СД типа 1.

Обнаруженный в первой работе по геномному поиску (Davies et al, 1994) локус IDDM10 на хромосоме 10р11 вносит большой вклад в генетическую предрасположенность к СД типа 1, достигающий 14% (Mein et al, 1998). Таким

образом, он является вторым по этому показателю после главного комплекса гистосовместимости (МНС).

Предыдущие исследования локуса IDDM10 (Davies et al, 1994; Reed et al, 1997 и др.) позволили примерно определить область максимального сцепления с СД типа 1 в некоторых популяциях Европы и Северной Америки. Она окружает полиморфный динуклеотидный маркер D10S208, и ее размер составляет примерно 2 м.п.н.

В настоящем исследовании была поставлена задача уточнить положение области максимального сцепления, используя в анализе семьи русского происхождения.

Таблица 6. Полиморфные маркеры в хромосомной области 10р11.

Маркер Расстояние от 10p-ter, т.п.н. Тип полиморфизм а Число аллелей Длины фрагментов Номера аллелей

D10S1426 27679 STR 4-нукл. 7 152-180 9-16

D10S2326 28431 STR 4-нукл. 12 108-128, 156-180 10-15, 10i-15i*

D10S1169 28632 STR 4-нукл. 6 122-142 9-14

D10S1243 29440 STR 2-нукл. 15 181-229 8-30

D10S675 31660 STR 4-нукл. 7 100-120 13-18

D10S507 37320 STR 4-нукл. 6 148-168 10-15

* - Аллели, обозначенные буквой i, отличаются вставкой 48 п.н.

Были выбраны 6 полиморфных маркеров, суммарно перекрывающих область длиной 10 м.п.н. Из них в интервале 4 м.п.н. находятся 5 маркеров, и только маркер 010Б507удален от остальных на 6 м.п.н. (Табл. 6).

Аллели и генотипы каждого из полиморфных маркеров были определены во всей группе из 107 семей с СД типа 1. Для идентификации аллелей использовалось разделение в полиакриламидном геле амплифицированнных фрагментов ДНК, содержащих внутри себя полиморфный маркер. На рисунке 5 показан пример такого разделения для локуса 010Б507. Проводилось сравнение с аллельными "лестницами", специально разрабатываемыми для каждого из маркеров в отдельности.

1 23456789

Рисунок 5. Пример разделения амплифицированных аллелей полиморфного маркера D10S507в 1 0% полиакриламидном геле. На дорожке 5 - аллельная "лестница", содержащая аллели 10-15. Генотипы по остальным дорожкам следующие: 1 -13/13; 2 -11/15; 3 - 14/15; 4 -13/15; 6 -11/14; 7 - 10/10; 8,9 -10/13.

2.1. Сцепление полиморфных маркеров D10S1426, D10S2326, D10S1169, D10S1243, D10S675 и D10S507 с сахарным диабетом типа 1.

Оценка сцепления полиморфных маркеров с СД типа 1 проводилась только на ядерных семьях с конкордантными парами сибсов. Для каждого аллеля вычислялся LOD-балл, характеризующий вероятность совместного наследования или отсутствия наследования этого аллеля обоими сибсами одновременно (Risch, 1990). Эта величина отражает корреляцию между идентичными по происхождению сибсами. Наличие корреляции свидетельствует о сцеплении полиморфного маркера с заболеванием. Максимальный LOD-балл (MLS) вычислялся как максимум значений LOD по всем аллелям. Значение MLS равно десятичному логарифму отношения шансов за и против сцепления полиморфного маркера с заболеванием.

Результаты исследования приводятся в виде кривой сцепления, на которой по оси абсцисс отложена хромосомная локализация полиморфного маркера в м.п.н., а по оси ординат - величина MLS (Рис. 3). Обращает на себя внимание классический характер кривой в виде колокола. Максимум находится вблизи полиморфного маркера D10S1243 (MLS = 3,20), что соответствует предположительному сцеплению (MLS > 2,2) и несколько ниже порога

значимого сцепления (MLS > 3,5) Предположительное сцепление показано и для маркера D10S1169 (MLS = 2,48). Таким образом, сразу два маркера в хромосомной области 10р11.2 сцеплены с сахарным диабетом типа 1.

Рисунок 3. Кривая сцепления с СД типа 1 в области 10р11 по данным о 6 полиморфных маркерах. Приведена локализация маркеров и значения MLS.

Расположение области максимального сцепления при исследовании в двух российских городских популяциях полностью соответствует данным для других этнических групп Действительно, наиболее часто упоминаемый в связи со сцеплением с СД типа 1 в работах по геномному поиску полиморфный маркер D10S208 (Mein et at, 1998, Сох et al, 2001) находится между маркерами D10S1169 и D10S1243 на расстоянии менее 1 м п н от каждого из них. Таким образом, области максимального сцепления полностью перекрываются.

2.2. Ассоциация полиморфных маркеров 01031426, 01032326, 01 й3 1169, й1 йв 1243,0103675 и 0103507с сахарным диабетом типа 1.

Для проверки приведенных результатов о наличии сцепления с сахарным диабетом типа 1 в хромосомной области 10р11 провели альтернативное исследование неравновесной передачи аллелей от родителей к больным сибсам (ТОТ), показывающее наличие или отсутствие ассоциации с заболеванием. Тест проводился на всех типах семей для каждого из 6 полиморфных маркеров. В таблице 4 приведены результаты как собственно теста TDT, так и объединенного теста S-TDT + TDT только для полиморфных маркеров, показавших ассоциацию с заболеванием.

Таблица 4. Передача в семьях с СД типа 1 больным сибсам аллелей полиморфных маркеров 01031169 и 01031243, а также результаты объединенного теста TDT и S-TDT.

ТОТ-тест Объединенный тест

Аллель Передается больным сибсам Не передается больным сибсам х2 Рс * Рс

- >- - • * > 4 ' —

9 24 29

10 28 31

11 41 20 7,230 0,029 2,391 0,017

12 35 38

13 4 13

,1— 1 ^ , * . .г' • - - - .

10 2 4

12 19 22

14 16 22

15 2 0

16 27 5 15,125 0,001 3,830 0,001

18 14 19

19 1 6

20 11 10

21 5 7

22 17 17

23 7 8

24 4 5

30 7 5

Статистически значимая ассоциация с СД типа 1 обнаружена для тех же маркеров D10S1169 и D10S1243, для которых было показано сцепление с заболеванием. Так, аллель 17 полиморфного маркера D10S1169 передается чаще больным детям (41 против 20, х2 = 7,230, Рс - 0,029), что свидетельствует о предрасполагающем характере данного аллеля.

Аналогично аллель 16 полиморфного маркера D10S1243 передается больным сибсам в 27 случаях, а не передается всего в 5 (х2 = 15,125, Рс = 0,001). Для аллелей всех остальных маркеров уровень значимости Рс < 0,05 не был достигнут, хотя в некоторых случаях и для них существует слабая тенденция к неравновесной передаче в семьях больных СД типа 1.

Таким образом, тест на ассоциацию (ТОТ) полностью подтвердил данные теста на сцепление о том, что расположенные друг от друга на расстоянии 800 т.п.н. полиморфные маркеры D10S1169 и D10S1243 связаны с сахарным диабетом типа 1 в российских семьях.

В проведенных ранее работах по генетическому картированию (Mein et al, 1998; Сох et al, 2001 и др.) также была показана ассоциация с СД типа 1 полиморфных маркеров D10S208 и D10S193, расположенных вблизи маркеров D10S1169UD10S1243.

Принимая во внимание тот факт, что определенный нами интервал максимального сцепления в точности совпадает с таковым в других этнических группах, правомерно сделать предположение о том, что предрасположенность к СД типа 1 в области 10р11.2 во всех этих группах вызвана полиморфным маркером в одном и том же гене.

Исследования связи конкретных генов в хромосомной области 10р11.2 с СД типа 1 до сих пор не проводились. Поэтому в работе были рассмотрены гены, локализованные к настоящему времени в этой области, и существование которых было подтверждено экспериментально (Рис. 4).

Ген ARHGAP12 кодирует белок, активирующий ро-ГТФазу (регулятор формирования цитоскелета) (Zhang et al, 2002), KIF5B - предположительно один из белков семейства кинезинов (факторов, задействованных при движении клеточных органелл). Кроме них в область исследования вошли два гена с плохо изученными функциями: L0C143110 и L0C220929. Исходя из гомологии, первый из них, возможно, кодирует аналог мембранного белка супервилина, связанного с актинами цитоскелета (Ting et al, 2002).

_J t_ t

D10S1169 D10S208 D10S1243

| или.

I ifl

Рисунок 4. Карта хромосомной области 10р11.2 с указанием полиморфных маркеров, показавших сцепление с СД типа 1 в настоящей работе {D10S1169 и D10S1243) и в работах других авторов {D10S208). Кроме того, показаны гены, существование которых подтверждено экспериментально.

Наконец, наибольший интерес в исследованиях сахарного диабета типа 1 представляет ген TCF8, кодирующий репрессор транскрипции ZEB. N-концевой домен белка ZEB принимает самое непосредственное участие в процессах дифференцировки лимфоидных клеток, поскольку напрямую влияет на экспрессию генов многих важнейших факторов клеточного цикла, таких как интерлейкин 2 (Yasui et al, 1998), ядерный фактор NF-kB, рецептор CD4 (Postigo et al, 1999), а4-интегрин (Lobb et al, 1994), транскрипционный фактор GATA3 (Gregoire et al, 1999). Очевидно, что в отличие от генов структурных белков ARHGAP12, KIF5B и LOC143110, ген TCF8 имеет гораздо больше шансов на ассоциацию с аутоиммунными заболеваниями, в частности, с сахарным диабетом типа 1.

Основываясь на предположительной роли гена TCF8 в патогенезе СД типа 1, было проведено исследование 4 известных полиморфных маркеров в этом гене. Их локализация была получена из базы данных dbSNP. Для идентификации аллелей использовался метод ПЦР-ПДРФ, с помощью которого было проанализированы аллели каждого из полиморфных маркеров у 50 неродственных индивидов. Полиморфизм был обнаружен только в случае маркера G(-781)C, для всех остальных в исследуемой выборке встречался только один аллель.

Таблица 4. Полиморфные маркеры в гене ТСР8.

В дальнейшем для полиморфного маркера G(-781)C было проведено генотипирование всех 107 семей с сахарным диабетом типа 1.

Для исследования ассоциации полиморфного маркера G(-781)C с СД типа 1 использовались тесты TDT и TDT+S-TDT. Значимых отклонений в частотах передачи аллелей в семьях не обнаружено, что может быть связано с низкой частотой встречаемости аллеля С (6,4%), и, соответственно, с малым числом анализируемых семей.

Таким образом, известные полиморфные маркеры внутри гена TCF8 оказались непригодны для анализа его ассоциации с сахарным диабетом типа 1. Однако данный ген находится в центре области максимального сцепления и является пока единственным геном из этой области, функции которого позволяют предположить роль в развитии заболевания. Поэтому сделано предположение, что именно ген TCF8 определяет предрасположенность к СД типа 1 в хромосомной области 10р11 2.

ВЫВОДЫ

1. Изучена передача в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 1 аллелей полиморфных маркеров Т(-99)С, (CAG)n, C1038T и G(~276)T, расположенных в хромосомной области 6q27. Показано наличие высоко достоверной ассоциации с заболеванием для полиморфного маркера С1038Т в гене PDCD2. Аллель С этого маркера чаще передавался больным сибсам, что говорит о том, что данный аллель является фактором повышенного риска развития заболевания.

2. Показано, что гаплотип C-C-G, содержащий аллели полиморфных маркеров Т(-99)С, С1031Ти G(-276)T, положительно ассоциирован с риском развития сахарного диабета типа 1.

Маркер Локализация 1 Аминокислотная замена Полиморфизм

в(-927)А промотор - -

Т(-911)в промотор - -

в(-781)С промотор - +

1804Т экзон 7 Ие->ТГ>г -

3. Исходя из функций генов, расположенных в хромосомной области 6д27, высказано предположение о роли гена РООО2 в патогенезе сахарного диабета типа 1. Проведен компьютерный анализ регуляторных последовательностей гена РООО2. Определено положение его основных регуляторных элементов.

4. Определены нуклеотидные последовательности промотора, первого и второго экзонов гена Р0О02 у 20 больных сахарным диабетом типа 1. Новые полиморфные маркеры не обнаружены.

5. Проанализировано сцепление с сахарным диабетом типа 1 шести полиморфных микросателлитных маркеров, расположенных в хромосомной области 10р11.2, в 35 семьях с конкордантными по заболеванию парами сибсов. Показано сцепление полиморфных маркеров 01031169 и 01081243.

6. Показана положительная ассоциация аллеля 11 полиморфного маркера 01081169 и аллеля 16 полиморфного маркера 01081243 с сахарным диабетом типа 1 по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов. Данные аллели являются факторами повышенного риска развития патологии.

7. Исходя из функций генов в хромосомной области 10р11.2 высказано предположение о роли гена ТОГ8 в патогенезе сахарного диабета типа 1. Проанализированы все 4 известных ранее полиморфных маркера в данном гене. Только для маркера в(-781)О показан полиморфизм в исследуемой выборке. Ассоциация маркера в(-781)О с сахарным диабетом типа 1 не была обнаружена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Носиков В.В., Серегин Ю.А., Титович Е.В., Савостьянов К.В., Зильберман Л.И., Чистяков Д.А, Кураева Т.Л., Дедов И.И. Идентификация генетических маркеров, сцепленных с сахарным диабетом типа 1 // Проблемы эндокринологии. 2002. Т.48. №4. С.10 -13.

2. Носиков В.В., Серегин Ю.А., Титович Е.В., Савостьянов К.В., Зильберман Л.И., Чистяков Д. А, Кураева Т.Л., Дедов И.И. Генетический анализ семей с сибсами, больными сахарным диабетом типа 1 // Сахарный диабет. 2002. Т.1. С.34-37.

3. Серегин Ю.А., Савостьянов К.В., Титович Е.В., Чистяков ДА, Кураева Т.П., Дедов И.И., Носиков В.В. Идентификация генетических маркеров, сцепленных с сахарным диабетом типа 1. // Сборник отчетов за 2000 год подпрограммы Теном человека". 2001. С. 125-126.

4. Носиков В.В., Серегин Ю.А., Титович Е.В., Савостьянов К.В., Зильберман Л.И., Чистяков ДА, Кураева Т.Л., Дедов И.И. Идентификация генетических маркеров, сцепленных с сахарным диабетом типа 1 // Материалы IV Всероссийского конгресса эндокринологов "Актуальные проблемы современной эндокринологии". С. 157. Санкт-Петербург, Россия (1-5 июня 2001 г.).

5. Серегин Ю.А, Зильберман Л.И., Савостьянов К.В., Титович Е.В., Чистяков ДА, Кураева Т.Л., Дедов И.И., Носиков В.В. Генетический анализ семей с сибсами, больными сахарным диабетом типа 1 // Сборник отчетов за 2001 год подпрограммы Теном человека". С.137-138.

6. Nosikov V.V., Chistyakov DA, Kuraeva T.L., Savost'anov K.V., Titovich E.V., Seryogin Yu.A, Zilberman L.I., Peterkova V.A, Dedov I.I. Sibpair mapping of susceptibility loci to type 1 diabetes in Russian families. Abstracts of the 37th AnnualMeeting of European Association forthe StudyofDiabetes, p.A80 (Abstract N 303), Glasgow, United Kingdom (September 9-13, 2001). Diabetologia. V.44. [Suppl.1], P.A80.

7. Nosikov V.V., Chistyakov D.A, Kuraeva T.L., Savost'anov K.V., Titovich E.V., Seryogin Yu.A, Zilberman L.I., Peterkova V.A, Dedov I.I. Genetic mapping of suspectibility loci for type 1 diabetes mellitus in Russian families // Abstracts of Human Genome Meeting HGM2002. P. 166 (Abstract 333). Shanghai, China (April 14-17,2002).

8. Nosikov V.V., Seryogin Yu.A, Savost'anov K.V., Kuraeva T.L, Titovich E.V., Chistyakov D.A, Zilberman L.I., Peterkova V.A, Dedov I.I. Polymorphic markers of human genome and identification of loci implicated to susceptibility to type 1 diabetes // Abstracts of International Conference "Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine". P.17 (Abstract GP1_5). StPetersburg - Moscow, Russia (June 22 - 30,2002).

9. Seryogin Yu.A, Savost'anov K.V., Kuraeva T.L, Kochetkova M. E., Zilberman L.I., Titovich E.V., Peterkova V.A, Dedov 1.1., Nosikov V.V. Genetic analysis of putative loci located in regions 6q27 (IDDM8) and 11p13 in Russian families with

Type 1 diabetes // Abstracts of the 18th Congress of the International Diabetes Federation. P. A107-108 (Abstract 299). Paris, France (August 23 - 29, 2003). Diabetologia, V. 46 [Suppl.2], P. A107-108.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 26.04.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 494. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

»13227

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Серегин, Юрий Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

Цель работы.

Научная новизна работы.

Практическая ценность работы.

1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика сахарного диабета типа 1.

1.2. Концентрация сахарного диабета в семьях больных.

1.3. Вклад генетических и негенетических факторов в развитие сахарного диабета типа 1.

1.4. Полиморфные участки ДНК.

1.4.1. Типы полиморфизма.

1.4.2. Методы детекции полиморфизма ДНК.

1.5. Стратегии изучения мультифакторных заболеваний.

1.5.1. Тест на неравновесную передачу аллелей (TDT).

1.6. Молекулярно — генетические маркеры сахарного диабета типа 1.

1.7. Молекулярные механизмы возникновения аутоиммунной реакции при сахарном диабете типа 1.

1.8. Структура регуляторных участков гена. Транскрипционные факторы.

1.9. Характеристика исследуемых в работе локусов и генов.

1.9.1. Локус IDDM8 на хромосоме 6q27.

1.9.2. Локус IDDM10 на хромосоме 10pl 1.

1.9.3. Ген транскрипционного фактора ZEB (TCF8).

1.9.4. Ген активатора программируемой клеточной гибели PDCD2 .49 Заключение.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Реактивы и ферменты.

2.2. Буферные растворы:.

2.3. Формирование группы пациентов.

2.4.Выделение геномной ДНК человека методом фенол/хлороформной экстракции.

2.5.Амплификация ДНК.

2.6. Расщепление продуктов амплификации рестриктазами.

2.7. Электрофоретическое разделение ДНК.

2.8. Секвенирование гена PDCD2.

2.9. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.

2.10. Статистическая обработка результатов.

2.10.1. Анализ сцепления.

2.10.2. Анализ ассоциации.

2.10.3. Неравновесие по сцеплению.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Изучение полиморфных маркеров на хромосоме 6q27.

3.1.1.Выбор полиморфных маркеров.

3.1.2. Идентификация аллелей полиморфного маркера (CAG)n.

3.1.3. Идентификация аллелей однонуклеотидных полиморфных маркеров Pro 11 Ala, Phel07Asn, Glyll7Val, C1038T, T(-99)C,G(-276)T.

3.1.3. Неравновесие по сцеплению между полиморфными маркерами в хромосомной области 6q27.

3.1.4. Ассоциация аллелей полиморфных маркеров (CAG)n, Т(-99)С, С1038Ти G(-276)Tc СД типа 1.

3.1.5. Ассоциация гаплотипов с СД типа 1.

3.1.6. Поиск полиморфных маркеров в гене PDCD2.

3.2. Изучение ассоциации полиморфных маркеров в хромосомной области 10pl 1 с СД типа 1.

3.2.1. Выбор полиморфных маркеров в области 10pl 1.

3.2.2. Идентификация аллелей полиморфных микросателлитных маркеров в хромосомной области 10pl 1.

3.2.3. Сцепление полиморфных маркеров в области 10pl 1 с сахарным диабетом типа 1.

3.2.4. Ассоциация аллелей полиморфных маркеров в области 1 Op 11 с

СД типа 1.

3.2.5. Возможная роль продукта гена TCF8 в развитии сахарного диабета типа 1.

3.2.6 Исследование полиморфных маркеров в гене TCF8.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация генетических маркеров, ассоциированных с предрасположенностью к сахарному диабету типа 1, на хромосомах 6 и 10"

Сахарный диабет (СД) типа 1 является одним из наиболее распространенных и тяжелых наследственных заболеваний человека. Показано, что имеющее место нарушение метаболизма глюкозы возникает из-за аутоиммунного разрушения бета-клеток поджелудочной железы, после чего они теряют способность вырабатывать инсулин. Пути развития заболевания к настоящему времени недостаточно изучены. Однако известно, что сахарный диабет первого типа формируется при взаимодействии нескольких генетических компонент и факторов внешней среды.

Как правило, при наличии генетической предрасположенности СД типа 1 развивается в раннем возрасте и вызывает тяжелые осложнения, такие как поражения кровеносных сосудов, почечную недостаточность, слепоту, гангрены. С помощью своевременной профилактики заболевания у пациентов с повышенным генетическим риском можно как минимум значительно отсрочить появление симптомов сахарного диабета и снизить опасность развития осложнений. Поэтому в настоящее время одним из наиболее прогрессивных подходов является разработка стратегии ранней диагностики, прогнозирования и превентивной терапии заболевания с использованием генетических маркеров.

Полигенная природа СД типа 1 доказана последними работами по поиску локусов предрасположенности к заболеванию с использованием мультилокусного анализа сцепления. Удалось обнаружить более 20 локусов предрасположенности к СД типа 1. К сожалению, результаты оказались противоречивыми и сильно зависели от этно-территориальной принадлежности использованных выборок. Только для двух локусов существуют четкие доказательства их связи с СД типа 1. Это главный комплекс гистосовместимости (МНС) и полиморфный повтор в гене инсулина INS. Поскольку в процесс формирования патологии, повидимому, вовлечены полиморфные маркеры в нескольких генах, в настоящее время проводятся крупномасштабные исследования множества генов-кандидатов и хромосомных областей с привлечением выборок из различных этнических групп мира. Каждая из таких работ вносит свой вклад в понимание процессов, приводящих к СД типа 1.

Одними из наиболее значимых локусов по вкладу в семейный риск развития заболевания являются IDDM8 и IDDM10, расположенные соответственно в хромосомных областях 6q27 и lOpll. К настоящему времени усилиями зарубежных исследовательских групп с использованием семей с сибсами, больными СД типа 1, проведено генетическое картирование хромосомных областей 6q27 и Юр 11 в этнических группах Европы и Северной Америки. Оно позволило в той или иной степени определить положения локусов IDDM8 и IDDM10. Однако для популяций России подобные исследования ранее не проводились. Кроме того, ранее нигде в мире не изучались конкретные гены в данных областях и полиморфные маркеры внутри этих генов. В настоящем исследовании мы постарались восполнить эти пробелы.

Установление ассоциации полиморфных маркеров с сахарным диабетом типа 1 поможет разработать дифференцированный подход к профилактике и лечению данной патологии в зависимости от наследственной предрасположенности конкретного пациента.

Цель работы.

Целью данной работы являлся поиск полиморфных маркеров, ассоциированных с генетической предрасположенностью к сахарному диабету типа 1, на хромосомах 6q27 и 1 Ор 11.

Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ ассоциации с сахарным диабетом типа 1 группы полиморфных маркеров в хромосомной области 6q27 с использованием семей с наличием заболевания у сибсов. Определить гаплотипы повышенного риска по всем маркерам.

2. Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа 1 группы микросателлитных полиморфных маркеров в хромосомной области lOpll.

3. При наличии ассоциации проанализировать функции генов в областях 6q27 и lOpll, определить гены, которые по своим функциям могут быть задействованы в развитии СД типа 1. Изучить ассоциацию с СД типа 1 полиморфных маркеров внутри этих генов.

Научная новизна работы

В данной работе впервые была изучена ассоциация полиморфных маркеров в хромосомных областях 6q27 и 10pl 1 с сахарным диабетом типа 1 у пациентов из городских популяций России. Обнаружена статистически достоверная ассоциация с СД типа 1 в обеих областях.

Впервые в мире проводились исследования функций генов в хромосомных областях 6q27 и Юр 11 в связи с их возможным участием в развитии сахарного диабета типа 1. Предложены гены PDCD2 и TCF8 на роль генов-кандидатов, связанных с предрасположенностью к СД типа 1.

Также впервые в мире проведено исследование полиморфных маркеров в генах PDCD2 и TCF8. Два участка гена PDCD2 секвенированы для определения не обнаруженных ранее полиморфных маркеров.

Практическая ценность работы

Изучение ассоциации полиморфных маркеров с сахарным диабетом типа 1 позволит оценить относительный (популяционный) и абсолютный (индивидуальный) риск развития заболевания в популяциях России, прогнозировать его развитие и прогрессирование задолго до клинического проявления и, наконец, правильно формировать группы риска. Эти исследования также могут способствовать наиболее эффективному проведению профилактики сахарного диабета (мониторинг лиц группы риска, использование иммуномодуляторов и/или иммуносупрессоров, превентивной инсулинотерапии и др.), а также обучению лиц, уже заболевших СД, самоконтролю уровня глюкозы в крови, проведению интенсивной инсулинотерапии и т.д.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Серегин, Юрий Александрович

выводы

1. Изучена передача в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 1 аллелей полиморфных маркеров Т(-99)С, (CAG)n, С1038Т и G(-276)T, расположенных в хромосомной области 6q27. Показано наличие высоко достоверной ассоциации с заболеванием для полиморфного маркера С1038Т в гене PDCD2. Аллель С этого маркера чаще передавался больным сибсам, что говорит о том, что данный аллель является фактором повышенного риска развития заболевания.

2. Показано, что гаплотип C-C-G, содержащий аллели полиморфных маркеров Т(-99)С, С1038Т и G(-276)T, положительно ассоциирован с риском развития сахарного диабета типа 1.

3. Исходя из функций генов, расположенных в хромосомной области 6q27, высказано предположение о роли гена PDCD2 в патогенезе сахарного диабета типа 1. Проведен компьютерный анализ регуляторных последовательностей гена PDCD2. Определено положение его основных регуляторных элементов.

4. Определены нуклеотидные последовательности промотора, первого и второго экзонов гена PDCD2 у 20 больных сахарным диабетом типа 1. Новые полиморфные маркеры не обнаружены.

5. Проанализировано сцепление с сахарным диабетом типа 1 шести полиморфных микросателлитных маркеров, расположенных в хромосомной области Юр 11.2, в 35 семьях с конкордантными по заболеванию парами сибсов. Показано сцепление полиморфных маркеров D10S1169 и D1 OS1243.

6. Показана положительная ассоциация аллеля 11 полиморфного маркера D1 OS 1169 и аллеля 16 полиморфного маркера D1 OS1243 с сахарным диабетом типа 1 по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов. Данные аллели являются факторами повышенного риска развития патологии.

7. Исходя из функций генов в хромосомной области Юр 11.2 высказано предположение о роли гена TCF8 в патогенезе сахарного диабета типа 1. Проанализированы все 4 известных ранее полиморфных маркера в данном гене. Только для маркера G(-781)C показан полиморфизм в исследуемой выборке. Ассоциация маркера G(-781)C с сахарным диабетом типа 1 не была обнаружена.

Заключение.

В обзоре литературы дана характеристика сахарного диабета типа 1, характера его наследования и метаболических изменений. Подробно рассмотрены аутоиммунные механизмы формирования патологии, ее основные этапы и участвующие в этом гены по данным о модельных организмах.

В другом разделе приведены характеристики полиморфизма ДНК, типов полиморфных участков и различных методических подходов по их обнаружению и исследованию. Рассмотрены аспекты практического использования полиморфных маркеров для генетического анализа наследственных заболеваний.

Большое внимание уделялось принципам картирования локусов предрасположенности к наследственным заболеваниям.

Наконец, в последних разделах охарактеризованы использованные в работе локусы и некоторые расположенные в них или по соседству гены и полиморфные маркеры. К сожалению, конкретные гены в интересующих нас областях ранее не изучались на предмет связи с СД типа 1. Поэтому для них были рассмотрены только структура и функции.

Несмотря на недостаток и противоречивость литературного материала о роли исследуемых в работе локусов в патогенезе СД типа 1, в обзоре литературы предпринята попытка достаточно полно описать объекты исследования, а также систематизировать и обобщить накопленные по теме исследований данные.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Реактивы и ферменты.

ДНК-полимераза Taq, рестриктазы Alu\, BsplA, EcoRl, Mls\ -производства НПО "Ферментас" (Литва). Рестриктазы BamWl, BsuJU, Fau\, Rsa\ - производства ООО "СибЭнзим" (Новосибирск). Синтез олигонуклеотидов выполнен НПО «Синтол» (Москва).

Дрожжевая тРНК, ДСН, бромистый этидий, - фирмы "Serva" (Германия). dATP, dCTP, dTTP, dGTP - производства НПО "Ферментас" (Литва). Протеиназа К, сахароза, агароза (Type II), БСА, Тритон Х-100®, Твин-20, ДТТ- фирмы "Sigma" (США). Легкоплавкая агароза Seakem LE. Трис, ДМСО, минеральное масло, ЭДТА, акриламид, метилен-бисакриламид, TEMED - фирмы "Диаэм"(Москва). Уксусная кислота, азотная кислота, NaOH, НС1, фенол, хлороформ, этанол - отечественного производства ("Реахим").

Соли: хлорид магния, сульфат аммония — фирмы "Sigma" (США), КС1 - производства фирмы "Merck" (Германия), NaCl - фирмы "Serva" (Германия), персульфат аммония - фирмы "Реонал" (Венгрия), ацетат натрия - отечественного производства ("Реахим"), натрий бикарбонат -фирмы "Диаэм"(Москва).

2.2. Буферные растворы:

Буфер ТАЕ (1х) — 40 мМ Трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА.

Буфер ТВЕ (1х) — 0.089 МТрис, 0.89 М борная кислота, 0.002 М EDTA (рН=8.0).

Буферы для рестрикции (1х):

Буфер Y+ (yellow) - 33 мМ Трис-ацетат (рН 7,9), 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия, 0.1mg/ml БСА

Буфер R+ (red) - 10 мМТрис-HCl (рН 8,5), 10 мМ хлорид магния, 100 мМ КС1, 0.1mg/ml БСА

Буфер G+ (green) - 10mM Tris-HCl (pH 7,5), lOmM MgC12, 50mM NaCl, O.lmg/ml БСА

Буфер B+ (blue) - lOmM Tris-HCl (pH 7,5), lOmM MgCl2, O.lmg/ml БСА Буфер EcoRI+ - 50mM Tris-HCl (pH 7.5), lOmM MgCl2, lOOmM NaCl, 0.02% Triton X-100, O.lmg/ml БСА

2.3. Формирование группы пациентов.

Выборка была сформирована из 35 "ядерных" и 72 "простых" семей городского населения из Москвы и Самары. Каждая "ядерная" семья содержала как минимум двух сибсов с сахарным диабетом типа 1, каждая "простая" семья — как минимум одного больного и одного здорового. Образцы крови были любезно предоставлены сотрудниками Эндокринологического научного центра РАМН (г.Москва) и Самарского центра диабета. В дальнейшем для простоты выборка называется "русской".

2.4. Выделение геномной ДНК человека методом фенол/хлороформной экстракции.

200 мкл венозной крови человека смешивали с равным объемом лизирующего буфера (10 мМ Трис-HCl (рН=8.0), 0.32 М сахароза, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 0.1%-ный тритон Х-100), добавляли ДТТ, ДСН и протеиназу К в конечной концентрации 0.2%, 40 мМ и 20 мкг/мл соответственно и инкубировали либо при 37°С в течение ночи, либо 2 ч при 60°С. Затем последовательно обрабатывали фенолом, смесью фенол/хлороформ (1:1) и хлороформом (дважды на каждой стадии). ДНК осаждали добавлением 1 мл 96%-ного этанола в присутствии 0.3 М ацетата натрия и тРНК дрожжей (10 мкг/мл) с последующей инкубацией при -70°С. Осадок ДНК промывали 80%-ным этанолом, сушили на воздухе и растворяли в 30 мкл бидистиллированной воды. Препараты ДНК хранили при -ЖС.

2.5. Амплификация ДНК.

ПЦР проводили на амплификаторе РНС-2 ("Techne", Великобритания) или "Терцик" ("ДНК- Технология", Москва) в 25 мкл реакционной смеси, содержащей буфер 1 или 2, 0.2 мМ каждого dNTP, по 10 пикомолей каждого из праймеров, 100-200 нг геномной ДНК и 2.0 ед. ДНК-полимеразы Taq. Буфер 1 включал 67 мМ Трис-HCl (рН=8.8), 16.6 шМ сульфат аммония и 0.1%-ный твин-20. Концентрацию хлорида магния варьировали в зависимости от амлифицируемого локуса. Буфер 2 содержал 100 мМ Трис-HCl (рН 8.8), 500 мМ КС1 и 25 мМ MgCl2. При необходимости в реакционную смесь вносили ДМСО в конечной концентрации 10%.

На начальной стадии ПЦР денатурировали ДНК при 94°С в течение 4 мин, на конечной - проводили синтез второй цепи при 72°С в течение 7 мин. В промежутке между данными стадиями осуществляли 30-35 циклов ПЦР в зависимости от локуса и количества исходной ДНК по трехступенчатой программе, включающей денатурацию ДНК (94°С/50с), отжиг праймеров в течение 30с и синтез второй цепи (72°С/30с). Температуру отжига праймеров варьировали в зависимости от амлифицируемого локуса. Условия ПЦР и последовательности праймеров для амплификации исследованных локусов приведены в таблицах 3,4, 5.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Серегин, Юрий Александрович, Москва

1. Бочков Н.П., Гинтер Е.К., Сергеев А.С. Генетика сахарного диабета: итоги и перспективы исследований. // Вест. АМН СССР. 1989. N 5. С. 17-22.

2. Кураева Т.Н. Популяционно-генетические и иммуногенетические аспекты риска развития инсулинзависимого сахарного диабета. Дисс. докт. мед. наук, Москва, 1997, 208 стр.

3. Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.С. Молекулярная биология. ООО "Медицинское информационное агентство", Москва, 2003, 544 с.

4. Aldrich C.J., Ljunggren H.G., Van Kaer L., Ashton-Rickardt P.G., Tonegawa S., Forman J. Positive selection of self- and alloreactive CD8+ T cells in TAP-1 mutant mice. // Proc NatlAcad Sci USA. 1994. V. 91. P. 6525-6528

5. Altmuller J., Palmer L.J., Fischer G., Scherb H., Wjst M. Genomewide Scans of Complex Human Diseases: True Linkage Is Hard to Find // Am. J. Hum. Genet. 2001. V. 69. P. 936-950

6. Amrani, A., Verdaguer J., Anderson В., Utsugi Т., Bou S., Santamaria P. Perforin-independent P cell destruction by diabetogenic CD8+ Tlymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. // J. Clin. Invest. 1999. V. 103. P. 1201-1209.

7. Beer S.F., Heaton D.A., Alberti K.G.M.M., Руке D.A., Leslie R.D.G. Impaired glucose tolerance precedes but does not predict insulindependent diabetes mellitus: a study ofidentical twins. // Diabetologia. 1990. V. 33. P. 497-502.

8. Bell G.I., Horita S., Karam J.H. A polymorphic locus near the human insulin gene is associated with insulin-dependent diabetes mellitus // Diabetes. 1984. V. 33. N. 2. P. 176-183.

9. Bertrams J., Baur M.P. Histocompatibility testing. New York. 1984. P. 348-358.

10. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. // Genes Dev. 2002. V. 16. P. 6-21.

11. Cardon L.R., Abecasis G.R. Some properties of a variance. Null components model for fine-mapping quantitative trait loci. // Behav Genet. 2000. V. 30. P. 235-243

12. Chern M.M., Anderson V.E., Barbosa J. Empirical Risk for Insulin -dependent Diabetes (IDD) in Sibs. // Diabetes. 1982. V. 31. P. 11151118.

13. Darlow J.M., Smith C.H., Duncan L.J.P. A statistical and genetical study of diabetes. III. Empiric risks to relatives. // Ann. Hum.Genet. 1973. Vol. 37. N2. P. 157-174.

14. Davies J.L., Cucca F., Goy J.V., Atta Z.A., Merriman M.E., Wilson A., Barnett A.H., Bain S.C., Todd J.A. Saturation multipoint linkage mapping of chromosome 6q in type 1 diabetes // Hum Mol Genet. 1996. V.5. N.7. P.1071-1074.

15. Decorte R., Cuppens H., Marinen P., Cassiman J.-J. Rapid detection of hypervariable regions by the polymerase chain reaction technique // DNA Cell Biol. 1990. V. 9. P. 461-469.

16. Diabetes Epidemiology Research International Group. Geographic patterns of childhood insulin-dependent diabetes mellitus. Diabetes. 1988. V. 37. P. 1113-1119.

17. Dianzani U., Chiocchetti A., Ramenghi U. Role of inherited defects decreasing Fas function in autoimmunity // Life Sciences. 2003. V.72. P.2803-2824

18. Economou E., Bergen A., Warren A., Antonarakis S. The polyadenylate tract of Alu-repetitive elements is polymorphic in the human genome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 2951-2954.

19. Edwards A., Hammond H.A., Jin L., Caskey C.T., Chakraborty R. DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats // Am. J. Hum Genet. 1991. V. 49. P. 746-756.

20. Eisenbarth G.S., Ziegler A.G., Colman P.A. Pathogenesis of insulin-dependent (type I) diabetes mellitus. In: Joslins Diabetes Mellitus. Edd. Kahn C.R., Weir G.C. Philadelphia, Baltimore, Hong Kong, London, Munich, Sydney, Tokyo. 1994. P. 216-239

21. European Consortium for IDDM Genome Studies. A Genomewide Scan for Type 1 — Diabetes Susceptibility in Scandinavian Families: Identification of New Loci with Evidence of Interactions // Am. J. Hum. Genet. 2001. V. 69. P. 1301-1313.

22. Faustman D., Li X., Lin H.Y., Fu Y., Eisenbarth G., Avruch J., Guo J. Linkage of faulty major histocompatibility complex class I to autoimmune diabetes. // Science. 1991. V. 254. P. 1756-1761.

23. Fontemaggi G., Gurtner A., Strano S., Higashi Y., Sacchi A., Piaggio G., Blandino G. The Transcriptional Repressor ZEB Regulates p73

24. Expression at the Crossroad between Proliferation and Differentiation // Molec Cell Biol. 2001. V. 21. N. 24 P. 8461-8470.

25. Fulker D.W., Cherny S.S., Sham P.C., Hewitt J. K. Combined linkage and association sib-pair analysis for quantitative traits. // Am J Hum Genet. 1999. V. 64. P. 259-267.

26. Genetta Т., Ruezinsky D., Kadesch T. Displacement of an E box-binding repressor by basic helix-loop-helix proteins: implications for B-cell specificity of the immunoglobulin heavy-chain enhancer. // Mol. Cell. Biol. 1994. V. 14. P. 6153-6163.

27. Glas R., Ohlen C., Hoglund P., Karre K. The CD8+ T cell repertoire in P2-microglobulindeficient mice is biased towards reactivity against self-major histocompatibility class I. // J Exp Med. 1994. V. 179. P. 661-672

28. Goldberg A.L., Rock K.L. Proteolysis, proteosomes and antigen presentation. //Nature. 1992. V. 357. P. 375-379.

29. Green JM. The B7/CD28/CTLA4 T-cell activation pathway. Implications for inflammatory lung disease. // Am J Respir Cell Mol Biol. 2000. V. 22. N. 3. P. 261-264.

30. Gregoire, J.M., Romeo P.H. T-cell expression of the human GATA-3 gene is regulated by a non-lineage-specific silencer. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 6567-6578.

31. Hamada H., Petrino M, Kakunaga Т., Seidman M, Stollar B. Characterization of genomic Poly(dT-dG) Poly(dC-dA) sequences: structure, organization and conformation I I Mol. Cell. Biol. 1984. V. 4. P. 2610-2621.

32. Hamada H., Seidman M, Howard В., Gorman C. Enchanced gene expression by Poly(dT-dG) Poly(dC-dA) sequence // Mol. Cell. Biol. 1984. V. 4. P. 2622-2630.

33. Harland L., Crombie R., Anson S., deBoerJ., Ioannou P. A, Antoniou M. Transcriptional Regulation of the Human TATA Binding Protein Gene // Genomics. 2002. V. 79. N. 4. P. 479-482.

34. Hartling S.G., Lindgren F., Dahlqvist G., Persson В., Binder C. Elevated proinsulin in healthy sibs of IDDM patients independent of HLA identity. Diabetes. 1987. V. 38. P. 1271-1274.

35. Hawa M.I., Beyan H., Buckley L.R., Leslie R.D.G. Impact of Genetic and Non-Genetic Factors in Type 1 Diabetes // Amer J Med Gen (Semin. Med. Genet.). 2002. V.l 15. P. 8-17

36. Hayashi K. PCR-SSCP: a simple and sensitive method for detection of mutation in the genomic DNA // PCR Methods Appl. 1991. V. 1. P. 34-38.

37. Hayashi Т., Faustman D. 1999 NOD mice are defective in proteasome production and activation of NF-kB. Mol Cell Biol 19:8646-8659

38. Hayashi Т., Faustman D. Role Of Defective Apoptosis In Type 1 Diabetes And Other Autoimmune Diseases // Recent Prog Horm Res. 2003. V. 58. P. 131-53.

39. Higashi Y., Moribe H., Takagi Т., Sekido R., Kawakami K., Kikutani H., Kondoh H. Impairment of T cell development in deltaEFl mutant mice. // J. Exp. Med. 1997. V. 185. P. 1467-1479.

40. Hsu S.C., Gavrilin M.A., Lee H.H., Wu C.C., Han S.H., Lai M.Z. NF-kB-dependent Fas ligand expression // Eur J Immunol. 1999 V. 29. P. 29482956

41. Imbert G., Trottier Y., Beckmann J., Mandel J.L. The gene for the TATA binding protein (TBP) that contains a highly polymorphic protein coding CAG repeat maps to 6q27. // Genomics. 1994. V. 2. P. 667-668.

42. International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. //Nature. 2001. V. 409. P. 860-921.

43. International Snp Map Working GroupA map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. //Nature 2001. V. 409. P. 928-933.

44. Ionnidis J.P.A., Ntzani E.E., Trikalinos T.A. Contopoulos-Ioannidis D.G. Replication validity of genetic association studies. // Nat. Genet. 2001. V. 29. P. 306-309.

45. Irwin M., Marin M.C., Philip A.C., Seelan R.S., Smith D.I., Liu W., Flores E.R., Tsai K.Y., Jacks Т., Vousden K.H., Kaelin W.G. Role for the p53 homologue p73 in E2F-1-induced apoptosis. // Nature. 2000. V. 407. P. 645-648.

46. Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA // Nature. 1985. V. 316. P. 67-73.

47. Jelinek W, Schmid C. Repetitive sequences in eukaryotic DNA and their expression // Ann. Rev. Biochem. 1982. V. 51. P. 813-844.

48. JouquandS., Cheron A., Galibert F. Microsatellite analysis using two-step procedure for fluorescent labeling of PCR products // Biotechniques. 1999. V. 26. P. 902-905.

49. La Spada A.R., Wilson E.M., Fischbeck K.H. Meiotic stability and genotype-phenotype correlation of the expanded trinucleotide repeat sequence in X-linked spinal and bulbular muscular atrophy // Nature Genet. 1992. V. 2. P. 301-304.

50. Lander E., Kruglyak L. Genetic dissection of complex traits: guidelines for interpreting and reporting linkage results. // Nat Genet 1995. V. 11. P. 241-247

51. Lander E.S., Schork N.J. Genetic dissection of complex traits. // Science. 1994. V. 265. P. 2037-2048.

52. Leal S.M., Ott J. Effects of stratification in the analysis of affected-sib-pair data: benefits and costs. // Am J Hum Genet. 2000. V. 66. P. 567575.

53. Leslie R.D.G., Elliott R.B. Early environmental events as a cause of IDDM. Evidence and implications. // Diabetes. 1994. V. 43. P. 843-850.

54. Li H., Gyllensten U.B., Gui X., Saiki P.K, Erlich H.A., Arncheim N. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells//Nature. 1988. V. 335. P. 414-417.

55. Lobb R.R., Hemler M.E. The pathophysiologic role of alpha 4 integrins in vivo. //J. Clin. Investig. 1994. V. 94. P. 1722-1728.

56. Lonjou С., Collins A., Morton N.E. Allelic association between marker loci. // Proc Natl Acad Sci. 1999. V. 96. P. 1621-1626.

57. Lund J.A., Bostock C., Leth-Bak A. Chromosome-specific subfamilies within human alphoid repeatitive DNA // J. Mol. Biol. 1986. V. 187. P. 185-196.

58. Luo D.-F., Bui M.M., Maclaren N.K., Thomson G., SheJ.-X. Affected-sib-pair mapped of a novel suspectibility gene to insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM8) on chromosome 6q25-q27. // Am. J. Hum. Genet. 1995. V. 57. P. 911-919.

59. Mandel J.-L. Questions of expansion // Nature Genet. 1994. V. 4. P. 8-9.

60. McCarthy B.J., Dorman J.S., Aston C.E. Investigating genomic imprinting and susceptibility to insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM): An epidemiologic approach. // Genetic Epidemiol. 1991. V. 8. P. 177-186.

61. McCarthy M.I. Susceptibility gene discovery for common metabolic and endocrine traits // Journ Molec Endocrin. 2002. V. 28. P. 1-17

62. McCarthy M.I., Kruglyak L., Lander E.S. Sib pair collection strategies for complex diseases. // Genetic Epidemiology. 1998. V. 15. P. 317-340.

63. Metcalfe K.A., Hitman G.A., Rowe R., Hawa M., Huang X, Stewart Т., Leslie RDG. .Concordance for type 1 diabetes in identical twins is affected by insulin genotype. // Diabetes Care. 2001. V. 24. N. 838-842.

64. Miesfield R., Krystal M., Arnheim N. A member of new repeated sequence family which is conserved eucaryotic evolution is found between the human delta- and beta-globin genes // Nicleic Acids Res. 1981. V. 9. P. 5931-5947.

65. Monaco J.J. A molecular model of MHC class I restricted antigen processing. // Immunol Today. 1992. V. 13. P. 173-179.

66. Nakamura Y., Leppert M., O'Connell P., Wolff R., Holm Т., Culver M., Martin C., Fujimoto E., Hoff M., Kumlin E., White R. Variable number of tandem repeats (VNTR) markers for human genome mapping II Science. 1987. V. 235. P. 1616-1622.

67. Ni X.,Guo J., Xia J., Li L. Investigation on VNTR in intron 40 of vWF gene in Chinese Han population // I Chuan Hsueh Pao. 1996. V. 23. P. 110.

68. Orlowski M. The multicatalytic proteinase complex, a major extralysosomal proteolytic system. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 10289-10297.

69. Ott J. Analysis of Human Genetic Linkage. The Johns Hopkins University Press. Baltimore. 1999.

70. Owens G.P., Hahn W.E., Cohen J.J. Identification of mRNAs associated with programmed cell death in immature thymocytes. // Mol Cell Biol. 1991. V. 11. N. 8. P. 4177-4188.

71. Owerbach D. Physical and genetic mapping of IDDM8 on chromosome 6q27. // Diabetes. 2000. V. 49. N. 3. P. 508-512.

72. Owerbach D., Gabbay K.H. Localization of a type 1 diabetes susceptibility locus to the variable tandem repeat region flanking the insulin gene. // Diabetes. 1993. V. 42. P. 1708-1714.

73. Owerbach D., Gunn S., Gubbey K.H. Multigenic basis for type 1 diabetes: association of HRAS1 polymorphism with HLA-DR3, DQw2/DR4, DQw8. // Diabetes. 1990. V. 39. P. 1504-1509.

74. Owerbach D., Nerup J. Restriction fragment length polymorphism of the insulin gene in diabetes mellitus. // Diabetes. 1982. Vol. 31. P. 275-277.

75. Polyak K., Xia Y., Zweler J. L., Kinzler K.W., Vogelstein B. A model for p53-induced apoptosis // Nature. 1997. V. 389. P. 300-305.

76. Postigo A.A., Dean D.C. Independent Repressor Domains in ZEB Regulate Muscle and T-Cell Differentiation // Molec Cell Biol. 1999. P. 7961-7971

77. Prokhortchouk E., Hendrich B. Methyl-CpG binding proteins and cancer: are MeCpGs more important than MBDs? // Oncogene. 2002. V. 21. P. 5394-5399.

78. Reddy P.H., Williams M., Tagle D.A. Recent advances and understanding the pathogenesis of Huntington's disease // Trends Neurosci. 1999. V. 22. P. 248-255.

79. Redondo M.U., Yu L., Hawa M., Mackenzie Т., Руке D.A., Eisenbarth G.S., Leslie R.D.G. Heterogeneity of type 1 diabetes: analysis of monozygotic twins in Great Britain and the United States. // Diabetologia. 2001. V. 44. P. 354-362.

80. Reed P.W., Davies J.L., Copeman J.B. Chromosome-specific microsatellite sets for fluorescence based, semi-automated genome mapping //Nature Genet. 1994. V. 7. P. 390-395.

81. Risch N. Linkage strategies for genetically complex traits. II. The power of affected relative pairs. // Am. J. Hum. Genet. 1990. V. 46. P. 229-241.

82. Ш. Risch, N. Linkage strategies for genetically complex traits. III. The effect of marker polymorphism on analysis of affected relative pairs. // Am. J. Hum. Genet. 1990. V. 46. N. 242-253.

83. Risch N., Merikangas K. The future of genetic studies of complex human diseases. // Science. 1997. V. 275. P. 1516-1517.

84. Risch N., Zhang H. Extreme discordant sib pairs for mapping quantitative trait loci in humans. // Science. 1995. V. 268. P. 1584-1589.

85. Roff D.A., Bentzen P. The statistical analysis of mitochondrial DNA polymorphisms: chi 2 and the problem of small samples. // Mol. Biol. Evol. 1989. V. 6. P. 539-545.

86. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Amheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for sickle cell anemia // Science. 1985. V. 230. P. 1350-1354.

87. Saito F., Yamamoto Т., Horikoshi M., Ikeuchi T. Direct mapping of the human TATA box-binding protein (TBP) gene to 6q27 by fluorescence in situ hybridization. // Jpn. J. Hum. Genet. 1994. V. 39. P. 421-425

88. Salvetti M., Ristori G., Bomprezzi R., Pozzilli P., Leslie R.D.G. Twins: mirrors of the immune system. // Immunol Today. 2000. V. 21. P. 342347.

89. Sanger F, Nicklen S, Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc Natl Acad Sci USA. 1977. V. 74. N. 12. P. 5463-5467.

90. Scarr R.B, Sharp P.A. PDCD2 is a negative regulator of HCF-1 (CI) // Oncogene. 2002. V. 21. P. 5245 5254

91. Wl.Schulze T.G., McMahon F.J. Genetic association mapping at the crossroads: which test and why? Overview and practical guidelines. // Am. J. Hum. Genet. 2002. V. 114. N. 1. P. 1-14.

92. Sekido R., Takagi Т., Okanami M, Moribe H., Yamamura M., Higashi Y., Kondoh H. Organization of the gene encoding transcriptional repressor dEFl and cross-species conservation of its domains. // Gene. 1996. V. 173. N. 2. P. 227-32.

93. Simpson N.E. The genetics of diabetes mellitus in man. // J. Genet, and Cytol. 1980. V. 22. N. 4. P. 497-506.

94. Singer M. Highly repeated sequences in mammalian genomes // Int. Rev. Cytol. 1982. V. 76. P. 67-112.

95. Spielman R.S., McGinnis R.E., Evens W.J. Transmission test for linkage disequlibrium: the insulin gene region and insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) // Am. J. Hum. Genet. 1993. V. 53. P. 506-516.

96. Spielman R.S., Evens W.J. A sibship test for linkage in the presence of association: the sib transmission/disequilibrium test // Am. J. Hum. Genet. 1998. V. 62. P. 450-558.

97. Sun L.,Cox N.J., McPeek M.S. A Statistical Method for Identification of Polymorphisms That Explain a Linkage Result // Am. J. Hum. Genet. 2002. V. 70. P. 399-411

98. Threadgill D.W., Hunter K.W., Williams R.W. Genetic dissection of complex and quantitative traits: from fantasy to reality via a community effort//Mamm Genome. 2002. V. 13. P. 175-178.

99. Ting H.J., Yeh S., Nishimura K., Chang C. Supervillin associates with androgen receptor and modulates its transcriptional activity. // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. V. 99. N. 2. P. 661-666.

100. Trachtulec Z, Hamvas R.M.J., Forejt J., Lehrach H.R., Vincek V., Klein J. Linkage of TATA-binding protein and proteasome subunit C5 genes in mice and humans reveals synteny conserved between mammals and invertebrates. // Genomics. 1997. V. 44. P. 1-7

101. Vadheim C.M., Rotter J.I., Maclaren N.K., Riley W.J., Anderson C.E. Preferential transmission of diabetic alleles within the HLA gene complex. //N. Engl. J. Med. 1986. V. 315. N. 19. P. 1314-1318.

102. VinkJ.M., Boomsma D.I. Gene finding strategies // Biol sychology. 2002. V.61.P. 53-71

103. Wagener D.K., Sacfc J.M., LaPorte R.E., Macgregor J.M. The Pittsburgh study of insulin-dependent diabetes mellitus: Risk for diabetes among relatives of IDDM. // Diabetes. 1982. V. 31. P. 136-144.

104. Warburton P.E., Willard H.F. Genomic analysis of sequence variation in tandemly repeated DNA. Evidence for localized homogenious sequence domain within arrays of alpha-satellite DNA // J. Mol. Biol. 1990. V. 216. P. 3-16.

105. Warram J.H., Krolewski A.S., Gottllieb M.S., Kahn C.R. Differences in risk of insulin- dependent diabetes in offspring of diabetic mothers and diabetic fathers. // N. Engl. J. Med. 1984. V. 311. N. 11. P. 657- 673.

106. Warram J.H., Martin B.C., Krolewski A.S. Risk of IDDM in Children of diabetic mothers descreases with oncreasing maternal age at pregnancy. // Diabetes. 1991. V. 40. P. 1679-1684.

107. Wharton K, Yedvobnick В., Finnerty V., Atravanis-Tsakonas S. Opa: a novel family of transcribed repeats shared by the Notch locus and other developmentally regulated loci in D. melanogaster // Cell. 1985. V. 40. P. 55-62.

108. Whittemore A.S. Genome scanning for linkage: an overview. Am J Hum Genet. 1996. V. 59. P. 276-287

109. Wright J.M. Mutation at VNTRs: are minisatellites the evolutionary progeny of microsatellites // Genome. 1994. V. 37. P. 345-347.

110. Xiong M., Jin L. Comparison of the Power and Accuracy of Biallelic and Microsatellite Markers in Population-Based Gene-Mapping Methods // Am. J. Hum. Genet. 1999. V. 64. P. 629-640

111. Yan G., Fu Y., Fanstman D.L. Reduced expression of Tapl and Lmp2 antigen processing genes in the nonobese diabetic (NOD) mouse due to a mutation in their shared bidirectional promoter. // J Immunol. 1997. V. 159. P. 3068-3080

112. Yasui D.H., Genetta Т., Kadesch Т., Williams Т. M., Swain S. L., Tsui L. V., Huber В. T. Transcriptional Repression of the IL-2 Gene in Th Cells by ZEB1 // J Immunol. 1998. V. 160. P. 4433^440.

113. Yowdell J.W., Bennink J.R. Cell biology of antigen processing and presentation to major histocompatibility complex class I molecule restricted T lymphocytes. // Adv Immunol. 1992. V. 52. P. 1-123.

114. Zhang Z, Wu C., Wang S., Huang W., Zhou Z, Ying K., Xie Y., Mao Y. Cloning and characterization of ARHGAP12, a novel human rhoGAP gene. // Int J Biochem Cell Biol. 2002. V. 34. N. 4. P. 325-331.