Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация генетических маркеров, ассоциированных с предрасположенностью к сахарному диабету тиа 1, на хромосомах 1,2,5 и 16

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация генетических маркеров, ассоциированных с предрасположенностью к сахарному диабету тиа 1, на хромосомах 1,2,5 и 16"

\г

На правах рукописи

ЧЕРНЫШЕВА АНА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬЮ К САХАРНОМУ ДИАБЕТУ ТИПА 1, НА ХРОМОСОМАХ 1,2,5 И 16

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

»-■иоиныэа 14

Москва-2007

003066914

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика»)

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор биологических наук, профессор Носиков Валерий Вячеславович лаборатория молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии, ФГУП «ГосНИИгенетика» доктор медицинских наук, профессор Асанов Алий Юрьевич, кафедра медицинской генетики ГОУ ВПО ММА им Сеченова

кандидат физико-математических наук Казаченко Константин Юрьевич, лаборатория эукариотических систем экспрессии генов, ФГУП «ГосНИИгенетика» Институт экспериментальной кардиологии, Российский Кардиологический Научно-производственный Комплекс МЗ РФ

Защита состоится «Д5» отс/ия 200"^г в '7 часов на

заседании Диссертационного совета Д 217 013 01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика» Реферат разослан Щ1Т&Ш> 2007г

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук ^Р&^^г^С/- 3аигРаева г г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Сахарный диабет (СД) типа 1 является одним из наиболее распространенных и тяжелых наследственных заболеваний человека Как правило, при наличии генетической предрасположенности он развивается в раннем возрасте и вызывает тяжелые осложнения, такие как поражения кровеносных сосудов, почечную недостаточность, слепоту, гангрены

Лечение уже развившегося сахарного диабета типа 1 со сформировавшимся фенотипом требует огромных материальных ресурсов С другой стороны, при своевременной профилактике заболевания у пациентов с повышенным генетическим риском можно, как минимум, значительно отсрочить появление симптомов сахарного диабета и снизить опасность развития осложнений Поэтому в настоящее время одним из наиболее прогрессивных подходов является разработка стратегии ранней диагностики, прогнозирования и превентивной терапии заболевания с использованием генетических маркеров

Наследование сахарного диабета типа 1 имеет полигенный характер По-видимому, существует несколько десятков генов, продукты которых прямо или косвенно вовлечены в его патогенез В отличие от моногенных синдромов, сочетающихся с различными нарушениями углеводного обмена, при аутоиммунном сахарном диабете типа 1 причина заболевания лежит не в мутациях отдельных генов Генетическая предрасположенность к СД типа 1 связана с наследованием определенных аллелей обычных "здоровых" генов Иногда эти аллели, которые определяют предрасположенность к СД типа 1 и сцеплены с заболеванием, называют этиологическими мутациями или вариантами Часто этиологические варианты широко распространены в популяции, но при этом каждый из них сам по себе не приводит к развитию заболевания Только наличие определенной комбинации этиологических вариантов в генах, предрасполагающих к заболеванию, может приводить к физиологическим нарушениям, находящим свое выражение в развитии СД типа 1 Частоты встречаемости этих вариантов в разных этнических группах существенно различаются, соответственно различается и популяционный риск, связанный с каждым из них Поэтому первоочередной задачей

исследователей в области генетики СД типа 1 является поиск генов и полиморфных маркеров, предрасполагающих к заболеванию, в конкретных этнических группах

При реализации подхода генетического картирования, часто используемого в исследованиях полигенных, многофакторных наследственно« заболеваний, поиск генов-кандидатов начинают не с функций, а с хромосомной локализации Для этого проводится детальное картирование участков сцепления на всех хромосомах человека с использованием групп полиморфных маркеров и семей с наличием заболевания у сибсов Затем в участках, показавших максимальное сцепление с сахарным диабетом типа 1, изучают функции конкретных генов и исследуют ассоциацию с заболеванием полиморфных маркеров в этих генах

Установление ассоциации генов с заболеванием необходимо для понимания природы процессов, приводящих к сахарному диабету типа 1, и для оценки его индивидуального и популяционного генетического риска

Цель работы Целью данной работы являлся поиск полиморфных маркеров, ассоциированных с генетической предрасположенностью к сахарному диабету типа 1, на хромосомах 1ч42, 2q31-33, 2ч35, 5q31 1-33 1 и 16422-24

Для ее достижения были поставлены следующие задачи

1 Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа 1 группы полиморфных маркеров в хромосомной области 1р42 с использованием семей с наличием заболевания у сибсов

2 Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа 1 группы микросателлитных полиморфных маркеров в хромосомной области ^22-24

3 Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа 1 группы микросателлитных полиморфных маркеров в хромосомных областях 2я31-33и2д35

4 Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа 1 однонуклеотидного полиморфного маркера в гене И12В в хромосомной области 5д31 1-33 1

5 При наличии ассоциации проанализировать функции генов в областях 1ц42 и 16д22-24, определить гены, которые по своим функциям могут быть задействованы в развитии СД типа 1

Научная новизна работы В данной работе впервые была изучена ассоциация полиморфных маркеров в хромосомных областях 1я42, 2ц31-33, 2д35, 5ч31 1-331 и 16ч22-24 с сахарным диабетом типа 1 у пациентов из городских популяций России Обнаружена статистически достоверная ассоциация с СД типа 1 в областях 1ц42 и 2д35

Проводились исследования функций генов в хромосомной области 1р42 в связи с их возможным участием в развитии сахарного диабета типа 1 На роль генов-кандидатов предложены гены ТАР51, АВСВ10 и К1АА0133, связанные с предрасположенностью к СД типа 1

Практическая ценность работы Изучение ассоциации полиморфных маркеров с сахарным диабетом типа 1 позволит оценить относительный (популяционный) и абсолютный (индивидуальный) риск развития заболевания в популяциях России, прогнозировать его развитие и прогрессирование задолго до клинического проявления и, наконец, правильно формировать группы риска Эти исследования также могут способствовать наиболее эффективному проведению профилактики сахарного диабета (мониторинг лиц группы риска, использование иммуномодуляторов и/или иммуносупрессоров, превентивной инсулинотерапии и др ), а также обучению лиц, уже заболевших СД, самоконтролю уровня глюкозы в крови, проведению интенсивной инсулинотерапии и т д

Апробация работы Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого совета ФГУП "ГосНИИ генетика" от 14 февраля 2007 г Результаты настоящей работы докладывались на Третьем Российском Диабетологическом Конгрессе (2004 г), на \/-ом Съезде Российского общества медицинских генетиков (2005 г), на \/-ом Всероссийском конгрессе эндокринологов "Высокие медицинские технологии в эндокринологии" (2006 г) и 43-ем Ежегодном Конгрессе Европейской Ассоциации по изучению диабета (ЕАЭО - 2007 г )

Публикации По материалам работы опубликовано 6 печатных работ, включая 3 статьи, а также материалы докладов и сообщений на конференциях

Структура диссертации Диссертация состоит из следующих разделов введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы Материалы диссертации изложены на 122 страницах машинописного текста и содержат 24 таблицы и 9 рисунков

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Изучение сцепления и ассоциации полиморфных маркеров в хромосомной области 1q42 с сахарным диабетом (СД) типа 1

Группа пациентов была сформирована из 35 семей с конкордантными по заболеванию парами сибсов и 72 семей с дискордантными парами сибсов, представляющих городское население Москвы и Самары Семьи содержали двух родителей и как минимум двух сибсов В работе использовалась геномная ДНК, выделенная из цельной крови

Одним из значимых локусов по вкладу в семейный риск развития заболевания является 1q42, расположенный на хромосоме 1 Он был обнаружен во второй работе по полному геномному поиску (Concannon et al, 1998) Проведенные ранее другими авторами исследования позволили выделить в хромосомной области 1q42 небольшую область сцепления с СД типа 1 размером около 250 т п н (Ewens et al, 2002) В этой области по данным NCB! (www nebí nlm nih gov) к настоящему времени обнаружены три сильно сцепленных гена TAF5L, АВСВ10 и KIAA0133

В настоящем исследовании была поставлена задача исследовать сцепление и ассоциацию хромосомной области 1q42 с сахарным диабетом типа 1 в городских популяциях больных г Москвы и г Самары Нами были выбраны 6 полиморфных маркеров, суммарно перекрывающих область длиной около 4,5 м п н Из них в интервале 1,5 м п н находятся 5 маркеров, и только маркер D1S1644 удален от остальных на 3 м п н (Табл 1) Аллели и генотипы каждого из этих полиморфных маркеров были определены во всей группе из 107 семей с СД типа 1 Для идентификации аллелей использовалось разделение в полиакриламидном геле амплифицированных фрагментов ДНК, содержащих внутри себя полиморфный маркер

Таблица 1,

Характеристика полиморфных маркеров, расположенных в хромосомной

области1д42

Маркер Расстояние от 1q-ter, м.п н Тип ' полиморфизма Число аллелей Длины фрагментов, п.н.

D1S1644 222,82 STR 4-нукл. 5 265 - 281

D1S1617 226.01 STR 3-нукп 5 118-130

D1S2847 226,17 STR 2-нукл. S 156-166

D1S1668 226,99 STR 4-нукл. 4 179-191

D1S103 227,14 STR 2-нукл 5 82-90

D1S225 227,47 STR 2-нукл. 7 111-123

На рис. 1 показан пример разделения амплифицированных фрагментов ДНК для локуса 0132847. Для определения размеров фрагментов ДНК нами проводилось их сравнение с аллельными "лестницами", специально разрабатываемыми для каждого из маркеров в отдельности.

12 3 4 5 б

V>

Рисунок 1, Пример разделения амглифицированных фрагментов ДНК, соответствующих определенным аллелям полиморфного маркера 0132847 в 10% полиакриламидном геле. На дорожке 4 - аллельная "лестница", содержащая аллели 156 - 166. Генотипы по остальным дорожкам следующие: 1 - 755/166; 2 - 164/166; 3 - 162/166; 5 - 758/164, 6 - 156/156.

1 1 Сцепление полиморфных маркеров D1S1644, D1S1617, D1S2847, D1S1668, D1S103 и D1S225 с сахарным диабетом типа 1

Оценка сцепления полиморфных маркеров с СД типа 1 проводилась только на ядерных семьях с конкордантными парами сибсов Для каждого аллеля вычислялся LOD-балл, характеризующий вероятность совместного наследования или отсутствия наследования этого аллеля обоими сибсами одновременно (Risch, 1990) Эта величина отражает корреляцию между идентичными по происхождению сибсами Наличие корреляции свидетельствует о сцеплении полиморфного маркера с заболеванием Максимальный LOD-балл (MLS) вычислялся как максимум значений LOD по всем аллелям Значение MLS соответствует десятичному логарифму отношения шансов за и против сцепления полиморфного маркера с заболеванием

Результаты проведенного исследования приведены в виде кривой сцепления, на которой по оси абсцисс отложена хромосомная локализация полиморфного маркера в м п н , а по оси ординат - величина MLS (рис 2)

Рисунок 2 Кривая сцепления с СД типа 1 в области 1q42 по данным о б-ти полиморфных маркерах Приведена локализация маркеров и значения MLS

Обращает на себя внимание классический характер кривой в виде колокола Максимум находится вблизи полиморфных маркеров D1S2847 (MLS = 3,69) и D1S1617 (MLS = 3,42), что соответствует значимому сцеплению (MLS > 3,5) Предположительное сцепление (MLS > 2,2) показано и для маркеров D1S1668 (MLS = 2,70), D1S103 (MLS = 2,30) и D1S225 (MLS = 2,53) Таким образом, сразу пять маркеров в хромосомной области 1q42 сцеплены с сахарным диабетом типа 1

Расположение области максимального сцепления при исследовании в двух российских городских популяциях полностью соответствует данным для других этнических групп Действительно, наиболее часто упоминаемым в связи со сцеплением с СД типа 1 в работах по геномному поиску является полиморфный маркер D1S1617 (Concannon et al, 1998, Ewens et al, 2002), который находится на расстоянии 160 тпн от полиморфного маркера D1S2847 Таким образом, области максимального сцепления полностью перекрываются

1 2 Ассоциация полиморфных маркеров D1S1644, D1S1617, D1S2847, D1S1668, D1S103 и D1S225 с сахарным диабетом типа 1

Для оценки ассоциации с заболеванием использовался метод неравновесной передачи аллелей от родителей к больным сибсам - TDT (Spielman et al, 1993) Вычислялась величина х2. которая является мерой различий между числом сибсов, которым передается аллель, и числом сибсов, которым он не передается Модификация метода неравновесной передачи аллелей, S-TDT, основана на оценке различий передачи аллелей в сибсовых парах (Spielman et al, 1998) Здесь различия вычислялись между частотами передачи аллелей здоровым и больным сибсам Тест S-TDT в чистом виде не проводился, вместо него проводился объединенный тест, сочетающий в себе результаты как ТОТ, так и S-TDT (Spielman et al, 1998) Величина Z\ рассчитываемая в объединенном тесте, является мерой относительного риска развития заболевания в случае наличия у пробанда определенного аллеля полиморфного маркера

В исследованиях полиморфных маркеров с числом аллелей больше двух, вводилась поправка Бонферрони на число множественных сравнений

Значения достоверности р дополнительно умножались на величину (N-1), где N - это число аллелей полиморфного маркера Необходимость введения данной поправки обусловлена тем фактом, что данные для разных аллелей не являются независимыми

Для проверки приведенных результатов о наличии сцепления с сахарным диабетом типа 1 в хромосомной области "Щ42 провели альтернативное исследование неравновесной передачи аллелей от родителей к больным сибсам (ТОТ), показывающее наличие или отсутствие ассоциации с заболеванием Тест проводился на всех типах семей для каждого из 6 полиморфных маркеров В таблице 2 приведены результаты как собственно теста ТЭТ, так и объединенного теста Б-ТОТ + ТОТ только для полиморфных маркеров, показавших ассоциацию с заболеванием

Таблица 2

Передача в семьях с СД типа 1 больным сибсам аллелей полиморфных маркеров 0182847 и 0181617, а также результаты объединенного теста

ТОТ и БЛШ

Аллель TDT-тест Объединенный тест

Передается Не передается х2 Ро 71 Рс

D1S1617

118 30 38

121 15 28

124 50 57

127 47 24 7,451 0,025 2,611 0,018

130 18 15

D1S2847

156 23 45

158 12 16

160 18 27

162 59 23 15,805 0,0005 3,905 0,001

164 16 15

166 0 2

Статистически значимая ассоциация с СД типа 1 обнаружена для тех же маркеров 0131617 и 0132847, для которых было показано сцепление с заболеванием Так, аллель 127 полиморфного маркера 0181617 и аллель 762

полиморфного маркера 0232847 передаются чаще больным детям (табл 2), что свидетельствует о предрасполагающем характере данных аллелей

Для аллелей всех остальных маркеров уровень значимости рс < 0,05 не был достигнут, хотя в некоторых случаях и для них существует слабая тенденция к неравновесной передаче в семьях больных СД типа 1 Таким образом, тест на ассоциацию (ТЭТ) полностью подтвердил данные теста на сцепление о том, что расположенные друг от друга на расстоянии 160 тп н полиморфные маркеры 0181617 и 0182847 связаны с сахарным диабетом типа 1 в российских семьях

Принимая во внимание тот факт, что определенный нами интервал максимального сцепления в точности совпадает с таковым в других этнических группах, правомерно сделать предположение о том, что предрасположенность к СД типа 1 в области 1ц42 во всех этих группах вызвана полиморфным маркером в одном и том же гене

Исследования связи конкретных генов в хромосомной области с СД типа 1 проводились на группе больных Европы и Северной Америки (Ем/епэ е1 а1, 2002) Эти исследования показали ассоциацию некоторых полиморфных маркеров в генах К1АА0133, ТАР5Ь и С АРN9 В данной работе были рассмотрены гены, локализация которых в этой области была подтверждено экспериментально (рис 3)

АВСВ10

К1АА0133

"^ИИ!Г

о

0151617

50

100

150 200тпн

Р1$2847 Т

Рисунок 3 Карта хромосомной области ■\c\42 с указанием полиморфных маркеров, показавших сцепление с СД типа 1 в настоящей работе (0151617 и 0152847) и в работах других авторов Кроме того, показаны гены, существование которых подтверждено экспериментально

Ген АВСВ10 входит в большую семью генов, кодирующих интегральные белки мембран, продукты всех этих генов используют АТФ в качестве источника энергии и осуществляют перенос через мембраны ионов и различных низкомолекулярных соединений Эти белки очень консервативны и встречаются в клетках как прокариотов, так и эукариотов Белок АВСВ10 относится к подсемейству MDR/TAP, члены которого ответственны за устойчивость к лекарствам Продукт гена АВСВ10 расположен на внутренней мембране митохондрий и предполагается, что его функцией является перенос соединений, необходимых для синтеза гема (Solomon et al, 2004)

Об ассоциации генов, кодирующих белки данного семейства с СД типа 1 никаких сведений нет Однако, было установлено что рецептор сульфонил-мочевины, который является одним из двух компонентов калиевых каналов (АВСС8), участвующих в секреции инсулина из ß-клеток при СД типа 2, относится к этому же семейству белков

Продукт гена TAF5L входит в состав комплекса PCAF, состоящего из 20 полипептидов и осуществляющего ацетилирование гистонов TAF5L, также как и другие белки семейства TAF, играет важную роль в процессе транскрипции в целом Кроме того, эти белки являются коактиваторами транскрипции, участвуют как в узнавании промоторных последовательностей, так и во взаимодействии с другими факторами транскрипции, что облегчает формирование транскрипционного комплекса и инициацию транскрипции Изучение ассоциации однонуклеотидных полиморфных маркеров гена TAF5L с СД типа 1 в популяции больных Европы и Северной Америки уже проводилось и один маркер дал значимое отклонение (р = 0,0006) в популяции больных по сравнению с здоровыми индивидами (Ewens et al, 2002)

Ген KIAA0133 кодирует продукт, функции которого еще пока недостаточно изучены, но предполагается, что этот белок похож на белки, связывающие ламин, которые в свою очередь, участвуют в процессах связывания хроматина с ядерной мембраной, а также в процессах синтеза ДНК, транскрипции и апоптоза Для населения Европы и Северной Америки уже показано значимое отклонение (р = 0,04) в популяции больных СД типа 1 по сравнению со здоровыми особями для одного из однонуклеотидных полиморфных маркеров в гене KIAA0133 (Ewens et al , 2002)

На первом этапе работы были проанализированы 6 однонуклеотидных полиморфных маркеров, расположенных в данных трех генах Среди них два однонуклеотидных полиморфных маркера, T150G и A301G расположены в экзоне гена АВСВ10 и один в интроне этого же гена Маркеры A454G и G248T расположены в экзоне гена TAF5L, а маркер G778T в экзоне гена KIAA0133 Однако, два однонуклеотидных полиморфных маркера в гене АВСВ10 (в интроне и в экзоне T150G) оказались неполиморфными в популяции г Москвы и не использовались в дальнейшем исследовании

Данные обо всех полиморфных маркерах были получены из баз данных dbSNP и UmSTS Национального центра биоинформатики (NCBI, www nebí nlm nih gov) В случае каждого из этих четырех маркеров (A301G, A4S4G, G248T и G778T) были идентифицированы аллели и генотипы во всех 107 семьях больных СД типа 1

1 3 Изучение ассоциации однонуклеотидных полиморфных маркеров A301G, A454G, G248T и G778T с СД типа 1

Для идентификации аллелей однонуклеотидных полиморфных маркеров использовали метод амплификации фрагментов ДНК, содержащих внутри себя полиморфные маркеры с последующим расщеплением этих фрагментов рестриктазами, узнающими последовательность одного из аллелей Разделение образующихся фрагментов ДНК проводили в 10% полиакриламидном геле Аллели полиморфного маркера A301G определяли с помощью рестрик-тазы BstSFI, расщепляющей амплифицированный фрагмент длиной 533 п н Фрагмент, содержащий аллель G, оставался нерасщепленным, в то время как фрагмент, содержащий аллель Д расщеплялся на фрагменты длиной 203 и 330 п н (рис 4) Аналогичным образом, амплифицированный фрагмент ДНК длиной 91 пн, содержащий аллель А полиморфного маркера A454G, расщеплялся рестриктазой Hin6l на фрагменты длиной 61 и 30 п н , а в случае полиморфного маркера G248T рестриктаза BstFNI расщепляла фрагмент, содержащий аллель 6, на фрагменты длиной 201 и 110 п н Для определения аллелей полиморфного маркера G778T использовалась рестриктаза BsoMAI Фрагмент длиной 311 п н , содержащий аллель Т, она расщепляла на две части с длинами 201 и 110 п н , а фрагмент, содержащий аллель G, не расщепляла

По результатам пак теста ТОТ, так и объединенного теста, не было обнаружено никаких значимых различий в частотах передачи аллелей полиморфных маркеров АЗОЮ в гене А8СВ10. в248Т в гене ТАРЫ, и 37781 в гене К1АА0133 в семьях с СД типа 1 Таким образом, ассоциация с СД типа 1 у данных полиморфных маркеров отсутствует.

1 2345 6 789

Рисунок 4. Пример разделения в 10% полиакриламидном геле аллелей полиморфного маркера A454G после амплификации и расщепления рестриктазой Hin6i. Длины фрагментов: аллель /1-91 п.н., аллель G - 61 п.н. Генотипы по дорожкам: 1, 2, 4, 7,8 - A/G\ 3. 6 -А/А: 5 - G/G. Изображение сканировано.

Для полиморфного маркера A454G в гене TAF5L, напротив, ассоциация с СД типа 1 была обнаружена (табл. 3) Аллель А данного маркера достоверно чаще передается больным детям (75 семей против 47, х2 =3.509 р - 0,061). Объединенный тест также подтверждает наличие ассоциации (Z' = 2,034. р = 0.021),

Таблица 3.

Передача в семьях с СД типа 1 больным сибсам аллелей полиморфного маркера A4S4G, а также результаты объединенного

теста ТОТ и S-TDT

Аллели TDT Объединенный тест (TDT+S-TDT)

Передается Не передается ? Р m Р

А 67 47 3,509 0,061 2,034 0.021

G 47 67

Таким образом, аллель А полиморфного маркера A454G в гене TAF5L является фактором повышенного риска развития СД типа 1 в исследуемых нами городских популяциях России Однако этот факт не может быть безусловным свидетельством роли самого гена TAF5L в патогенезе данного заболевания Возможно, что маркер A454G находится в неравновесии по сцеплению с другим пока неизвестным полиморфным маркером, локализованном в одном из соседних генов в той же хромосомной области

2 Изучение сцепления и ассоциации полиморфных маркеров в хромосомной области 16q22-24 с СД типа 1

Область сцепления в районе 16q22-24 была обнаружена в первых работах по геномному поиску (Mein et al, 1998) Область максимального сцепления окружает полиморфный динуклеотидный маркер D16S3098 и ее размер составляет примерно 2,0 м п н Однако, все последующие исследования не смогли подтвердить тот факт, что данный локус вовлечен в формирование предрасположенности к сахарному диабету типа 1 (Concannon et al, 1998, Kristiansen et al 1999)

В настоящем исследовании была поставлена задача изучить сцепление и ассоциацию локуса 16q22-24, используя для анализа семьи русского происхождения Нами были отобраны 5 полиморфных маркеров, суммарно перекрывающих область длиной около 6,5 м п н Из них в интервале 3,0 м п н находятся 4 маркера, и только маркер D16S3118 удален от остальных на 3,0 м п н (табл 4)

Таблица 4

Характеристика полиморфных маркеров, расположенных в хромосомной области '\6q22-24

Маркер Расстояние от 16q-ter, т л н Тип полиморфизма Число аллелей Длина фрагментов, п н

D16S3118 76112 STR 2-нукл 7 109-127

D16S750 79438 STR 4-нукл 3 109-117

D16S3073 79732 STR 2-нукл 6 172-182

D16S3098 81228 STR 2-нукл 5 157-165

D16S422 82691 STR 2-нукл 13 188-212

Аллели и генотипы каждого из полиморфных маркеров были определены во всей группе из 107 семей с СД типа 1. Для идентификации аллелей попользовалось разделение в лопиакрипамидном геле амплифицираванннык фрагментов ДНК. содержащих внутри себя полиморфный маркер. На рис. 5

показан пример такого разделения для локуса 01633098 _______

12 3 + 5 6 7 К 9 10 II 12 13 1

Рисунок 5. Пример разделения амплифицированных аллелей полиморфного маркера Ш6Б750 в 10% полиакриламидном геле. На дорожках 5 и 13- маркер рВЯ!322/М5р1, с аллелями 110 и 121 п.н. Генотипы по остальным дорожкам следующие : 1 - 109/113\ 2 - 113/117; 3 - 113/117; 4 -109/113; 6- 113/113; 7- 109/113, 8, 9, 10, 11 - 113/113, 12- 109/113.

2,1. Сцепление полиморфных маркеров D16S3118, D16S750, D16S3073, D16S309S и D16S422 с сахарным диабетом типа 1.

Результаты исследования приводятся в виде кривой сцепления, на которой ло оси абсцисс отложена хромосомная локализация полиморфного маркера в ц.п.н., а по оси ординат - величина MLS (рис. б). Обращает на себя внимание классический характер кривой в виде колокола. Максимум находится вблизи полиморфного маркера D16S750 (MLS = 1,68), что не соответствует предположительному сцеплению (MLS > 2,2). Таким образом, ни один из

маркеров в хромосомной области -\6о,22-24 не сцеплен с сахарным диабетом типа 1

Рисунок 6 Кривая сцепления с СД типа 1 в области 16q22-24 по данным о 5-ти полиморфных маркерах Приведена локализация маркеров и значения MLS

2 2 Ассоциация полиморфных маркеров D16S3118, D16S750, D16S3073, D16S3098 и D16S422 с сахарным диабетом типа 1

Для проверки приведенных результатов о наличии сцепления с сахарным диабетом типа 1 в хромосомной области 16q22-24 провели альтернативное исследование неравновесной передачи аллелей от родителей к больным сибсам (TDT), показывающее наличие или отсутствие ассоциации с заболеванием Тест проводился на всех типах семей для каждого из 5 полиморфных маркеров

Статистически значимая ассоциация не была обнаружена ни для одного из исследованных полиморфных маркеров, хотя в некоторых случаях существует слабая тенденция к неравновесной передаче аллелей в семьях

больных СД типа 1 Таким образом, тест на ассоциацию (TDT) полностью подтвердил данные теста на сцепление о том, что локус 16q22-24 не связан с сахарным диабетом типа 1 в российских семьях

3 Изучение сцепления и ассоциации полиморфных маркеров в хромосомной области 2q31-33 с СД типа 1

Локус IDDM7 в хромосомной области 2q31-33 был обнаружен в первых работах по геномному поиску (Davies et al, 1994) Область сцепления окружает полиморфный динуклеотидный маркер D2S152 Результаты полученные в разных этнических группах очень гетерогенны - от сильной ассоциации данного маркера с сахарным диабетом типа 1 (Copeman et al, 1995), через слабую ассоциацию (Luo et al, 1995), до ее полного отсутствия (Buhler et al, 1997) В проведенных работах были получены данные свидетельствующие о том, что полиморфный маркер Ala45Thr в гене NeuroD/Beta2, который кодирует белок участвующий в инициации транскрипции гена инсулина, ассоциирован с сахарным диабетом типа 1 (Iwata et al, 1999), но в последующих работах было показано что ассоциация данного полиморфного маркера не может объясняться неравновесием по сцеплению с IDDM7, а, возможно, является отдельным локусом предрасположенности к сахарному диабету типа 1 (Hansen et al, 2000)

В настоящем исследовании была поставлена задача изучения сцепления и ассоциации полиморфных маркеров, расположенных в хромосомной области 2q31-33, используя для анализа семьи русского происхождения Нами были отобраны два полиморфных маркера, суммарно перекрывающие область длиной около 1,5 м п н (табл 5)

Таблица 5

Характеристика полиморфных маркеров, расположенных в хромосомной области 2q31-33

Маркер Расстояние от 16q-ter, м п н Тип полиморфизма Число аллелей Длина фрагментов, п н

D2S152 188,00 STR 2-нукл 9 269 - 285

D2S1775 189,50 STR 4-нукл 6 115-135

Аллели и генотипы каждого из полиморфных маркеров были определены во всей группе из 107 семей с СД типа 1 Для идентификации аллелей

использовалось разделение е полиакриламидном геле амплифицированных фрагментов ДНК. содержащих внутри себя полиморфный маркер. На рис. 7 показан пример такого разделения для локуса 0251775.

1 2 3 4 5 й

Рисунок 7. Пример электрофоретического разделения аллелей полиморфного микросател личного маркера D2S1775 в 10% ПААГ. На дорожке 4 - аллельная "лестница" с аллелями 115, 119, 123, 127, 131 и 135 л.н. Генотипы по остальным дорожкам следующие: 1 - 127/127; 2 -119/127: 3- 127/127; 5- 115/115: б - 123/127

3.1. Сцепление полиморфных маркеров D2S152 и D2S1775 с сахарным диабетом типа 1,

Оценка сцепления полиморфных маркеров с СД типа 1 проводилась только на ядерных семьях с конкордантными парами сибсов. Результаты исследования приводятся в таблице 6 Максимальное значение LOD-балла в данном исследовании было получено для маркера D2S152 (MLS = 2.41). что соответствует предположительному сцеплению. Для маркера D2S1775 максимальный LOD-балл был равен 1,41. что ниже порога значимого сцепления (табл. 6).

Таким образом, можно сделать вывод, что маркер D2S152. расположенный s хромосомной области 2q31-33. слабо сцеплен с сахарным диабетом типа 1 в семьях больных русского происхождения

Таблица 6

Результаты анализа сцепления маркеров 025152 и 0251775 в хромосомной области 2д31-33 в семьях больных русского происхождения

Маркер МЬЭ Ро

023152 2,41 0,064

0281775 1,14

3 2 Ассоциация полиморфных маркеров 025152 и 0251775 с сахарным диабетом типа 1

Для проверки полученных нами результатов о наличии сцепления с сахарным диабетом типа 1 в хромосомной области 2я31-33 нами было проведено альтернативное исследование неравновесной передачи аллелей от родителей к больным сибсам (ТЭТ) Тест проводился на всех типах семей для каждого из двух полиморфных маркеров

Статистически значимая ассоциация не была показана ни для одного из исследованных полиморфных маркеров, хотя в некоторых случаях существует слабая тенденция к неравновесной передаче аллелей в семьях больных СД типа 1 Таким образом, тест на ассоциацию (ТОТ) не подтвердил данные теста на сцепление о том, что локус 2р31-33 связан с сахарным диабетом типа 1 в российских семьях

4 Изучение сцепления и ассоциации полиморфных маркеров в хромосомной области 2ч35 с СД типа 1

Одним из значимых локусов по вкладу в семейный риск развития заболевания является локус ЮОМ13, расположенный в хромосомной области 2р35 В ряде исследований была обнаружена ассоциация полиморфных микросателлитных маркеров 028137 (Ри е! а!, 1998), 023157 (Евров^о е1 а1, 1998), 028164 и 0281471 (1_агзеп е1 а1, 1999), расположенных в области 2ч35 В этом районе расположен ген 1А-2, кодирующий аутоантиген, ген Л/Я/ШР7, кодирующий белок необходимый для нормальной функции макрофагов, ген белка - транспортера АВСВ12, а также гены белка, связывающего подобные инсулину факторы роста 2 и 5 - ЮРВР2 и ЮРВРб, соответственно Однако, ни для одного из этих генов не было найдено подтверждения того что они могут

быть возможными генами-кандидатами для ЮОМ13 (Евров^о е1 а1 1998, Апш1о е1 а1 2002, Owerbacn е1 а1,1997)

В настоящем исследовании была поставлена задача изучения сцепления и ассоциации полиморфных маркеров, расположенных в локусе 2д35, используя для анализа семьи русского происхождения Нами были отобраны 5 полиморфных маркеров, суммарно перекрывающих область длиной около 10 м п н Из них в интервале 4 м п н находятся 4 маркера, и только маркер 025157 удален от остальных на 6 м п н (табл 7) Аллели и генотипы каждого из полиморфных маркеров были определены во всей группе из 107 семей с СД типа 1 Для идентификации аллелей использовалось разделение в полиакриламидном геле амплифицированных фрагментов ДНК, содержащих внутри себя полиморфный маркер

Таблица 7

Характеристика полиморфных маркеров, расположенных в хромосомной

области 2q35

Маркер Расстояние от 16q-ter, м п н Тип полиморфизма Число аллелей Длина фрагментов, п н

D2S157 211,03 STR 2-нукл 10 103-122

D2S143 216,21 STR 2-нукл 7 109-121

D2S137 216,64 STR 2-нукл 9 142-158

D2S301 217,71 STR 2-нукл 6 224 - 234

D2S164 220,83 STR 2-нукл 8 265 - 279

41 Сцепление полиморфных маркеров D16S3118, D16S7S0, D16S3073, D16S3098 и D16S422 с сахарным диабетом типа 1

Оценка сцепления полиморфных маркеров с СД типа 1 проводилась только на ядерных семьях с конкордантными парами сибсов Результаты исследования приводятся на рис 8 Максимальное значение LOD-балла в данном исследовании было получено для полиморфного маркера D2S137 (MLS = 3,18), что соответствует предположительному сцеплению (MLS > 2,2) Остальные проанализированные маркеры не показали предположительного

сцепления Таким образом, один из маркеров (028137), расположенный в хромосомной области 2д35, достоверно сцеплен с сахарным диабетом типа 1

Рисунок 8 Кривая сцепления с СД типа 1 в области 2q35 по данным о 5 полиморфных маркерах Приведена локализация маркеров и значения MLS

4 2 Ассоциация полиморфных маркеров 025157, 02143, 02$137, 028301 и 028164 с сахарным диабетом типа 1

Для проверки приведенных результатов о наличии сцепления с сахарным диабетом типа 1 в хромосомной области 2ц35 нами было проведено альтернативное исследование неравновесной передачи аллелей от родителей к больным сибсам (ТОТ), показывающее наличие или отсутствие ассоциации с заболеванием Тест проводился на всех типах семей для каждого из 5 полиморфных маркеров

Статистически значимая ассоциация была обнаружена только в случае полиморфного маркера 028137, для которого ранее было показано предположительное сцепление В табл 8 приведены результаты как

собственно теста ТОТ, так и объединенного теста в-ТБТ + ТОТ только для полиморфного маркера 028137, показавшего ассоциацию с заболеванием

Таблица 8

Передача в семьях с СД типа 1 больным сибсам аллелей полиморфного маркера 028137, а также результаты объединенного теста ТОТ и в-ТРТ

Аллель ТОТ-тест Объединенный тест

Передается больным сибсам Не передается больным сибсам хг Рс г' Рс

142 6 12

144 0 0

146 16 25

148 25 19

150 31 33

152 46 19 11,215 0,0064 3,225 0,0048

154 8 6

156 10 23

158 7 9

Статистически значимая ассоциация с СД типа 1 обнаружена для того же маркера 028137, для которого было показано сцепление с заболеванием Так, аллель 152 полиморфного маркера 025137 передается чаще больным детям (табл 8), что свидетельствует о предрасполагающем характере данного аллеля

Для аллелей всех остальных маркеров уровень значимости рс < 0,05 не был достигнут, хотя в некоторых случаях и для них существует слабая тенденция к неравновесной передаче в семьях больных СД типа 1

Таким образом, тест на ассоциацию (ТОТ) полностью подтвердил данные теста на сцепление о том, что полиморфный маркер 028137 связан с сахарным диабетом типа 1 в российских семьях

5 Изучение сцепления и ассоциации полиморфных маркеров в

хромосомной области 5q31 1-33 1 с СД типа 1

Локус 1DDM18 в хромосомной области 5q31 1-331 был обнаружен сравнительно недавно, в работах с использованием мышей линии NOD (Adormí, 2001) Ген IL12B, кодирует субъединицу р40 интерлейкина 12 (IL-12), который является одним из ключевых цитокинов, необходимых для развития и созревания Th-1 клеток Подтверждение того, что полиморфный маркер С1159А действительно ассоциирован с сахарным диабетом типа 1 было получено при анализе популяций больных Австралии и Великобритании (Morahan et al, 2001) Аллель А преимущественно передавался больным сибсам Однако, эти данные в последствии не были подтверждены при изучении 795 семей с дискордантными парами сибсов из Европы и Америки и 337 семей с конкордантными парами сибсов датского происхождения (Bergholdt et al, 2004)

В настоящем исследовании была поставлена задача изучения сцепления и ассоциации полиморфных маркеров, расположенных в локусе IDDM18 в хромосомной области 5q31 1-331, используя для анализа семьи русского происхождения Нами были отобраны 2 полиморфных маркера - один в 3'-нетранслируемой области гена IL12B и один на расстоянии 540 тпн дистально от этого гена (табл 9)

Таблица 9

Характеристика полиморфных маркеров, расположенных в хромосомной области 5q31 1-33 1

Маркер Расстояние от 5q-ter, м п н Тип полиморфизма Число аллелей Длина фрагментов, п н

D5S2060 158,13 STR 2-нукл 11 108-128

С1159А 158,67 SNP 2 323

Аллели и генотипы каждого из полиморфных маркеров были определены во всей группе из 107 семей с СД типа 1 Аллели полиморфного маркера С1159А определяли после обработки рестриктазой Taql, расщепляющей амплифицированный фрагмент ДНК длиной 323 п н Фрагмент, содержащий аллель А, оставался нерасщепленным, в то время как фрагмент, содержащий аллель С, расщеплялся на фрагменты 185 и 138 п н

5 1 Сцепление полиморфных маркеров D5S2060 и С1159А с сахарным диабет ом типа 1

Оценка сцепления полиморфных маркеров с СД типа 1 проводилась только на ядерных семьях с конкордантными парами сибсов Результаты исследования приводятся в табл 10 Максимальное значение LOD-балла в данном исследовании было получено для маркера D5S2060 (MLS = 1,58), что не соответствует предположительному сцеплению (MLS > 2,2) Для маркера С1159А максимальный LOD-балл был равен 0,31 (табл 10)

Таблица 10

Результаты анализа сцепления в хромосомной области 5q31 1-33 1

Маркер MLS Рс

D5S2060 1,58 NS

С1159А 0,31 NS

Таким образом, маркеры 0582060 и С1159А в хромосомной области 5431 1-33 1 не сцеплены с сахарным диабетом типа 1 в семьях больных русского происхождения

5 2 Ассоциация полиморфных маркеров 0552060 и С1159А с сахарным диабетом типа 1

Для проверки приведенных результатов о наличии сцепления с сахарным диабетом типа 1 в хромосомной области 5431 1-33 1 провели альтернативное исследование неравновесной передачи аллелей от родителей к больным сибсам (ТОТ), показывающее наличие или отсутствие ассоциации с заболеванием Тест проводился на всех типах семей для каждого из двух полиморфных маркеров

Статистически значимая ассоциация не была показана ни для одного из исследуемых полиморфных маркеров

Таким образом, тест на ассоциацию (ТЭТ) подтвердил данные о том, что локус 5431 1-33 1 не связан с сахарным диабетом типа 1 в российских семьях

выводы

1 Изучена передача в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 1 аллелей полиморфных маркеров 0181644, 0181617, 0182847, 0181668, 018103 и 018225, расположенных в хромосомной области ~1ц42 Показано наличие высоко достоверной ассоциации с заболеванием для полиморфных маркеров 0181617 и 0182847

2 Исходя из результатов, полученных при анализе сцепления и ассоциации полиморфных маркеров, расположенных в хромосомной области 1ч42, высказано предположение о возможной роли генов ТАР5Ц АВСВ10 и К1АА0133 в патогенезе сахарного диабета типа 1 Проведен анализ сцепления и ассоциации однонуклеотидных полиморфных маркеров, расположенных в этих генах Для полиморфного маркера А454в в экзоне гена ТАР5Ц получена значимая ассоциация с заболеванием, по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов Аллель А этого маркера чаще передавался больным сибсам, что говорит о том что данный аллель или аллель который с ним находится в неравновесии по сцеплению, является фактором повышенного риска развития заболевания

3 Проанализированы сцепление и ассоциация с сахарным диабетом типа 1 пяти полиморфных микросателлитных маркеров, расположенных в области 16ц22-24, в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 1 Сцепление и ассоциация с заболеванием в хромосомной области 16р22-24 не обнаружены, по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов

4 Изучены сцепление и ассоциация с сахарным диабетом типа 1 двух полиморфных микросателлитных маркеров, расположенных в хромосомной области 2я31-33 (ЮОМ7) в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 1 Обнаружено слабое сцепление с сахарным диабетом типа 1 полиморфного микросателлитного маркера 025752 Не показано положительной ассоциации данного маркера, по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов

5 Изучены сцепление и ассоциация с сахарным диабетом типа 1 пяти полиморфных микросателлитных маркеров, расположенных в хромосомной области 2д35 (ЮОМ13) в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 1

Обнаружено сцепление с сахарным диабетом типа 1 полиморфного микросателлитного маркера D2S137 Показана положительная ассоциация аллеля 152 данного маркера с сахарным диабетом типа 1, по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов Данный аллель является фактором повышенного риска развития патологии 6 Изучены сцепление и ассоциация с сахарным диабетом типа 1 полиморфного микросателлитного маркера D5S2Q60 и однонуклеотидного маркера С1159А в З'-нетранслируемой области гена IL12B, расположенных в хромосомной области 5q31 1-33 1 (IDDM18) Сцепление и ассоциация с заболеванием в данной хромосомной области не обнаружены, по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Чернышева, А, Зильберман, Л И , Савостьянов, К В , Цитлидзе, Н М , Кураева, Т Л , Петеркова, В А, Дедов И И , Носиков, В В (2007) Ассоциация хромосомной области 5q31 1-q33 1 (IDDM18) с сахарным диабетом типа 1 среди русских, проживающих в г Москве Сахарный диабет, (2), 6-8

2 Chistiakov, D А, Chernisheva, А , Savost'anov, К V , Turakulov, R I, Kuraeva, Т L, Dedov, 11, Nosikov, V V (2005) Lack of association between genetic markers on chromosome 16q22-q24 and type 1 diabetes in Russian affected families Croat Med J, 46(4), 670-677

3 Chistiakov, D A, Chernisheva, A, Savost'anov, К V , Turakulov, R I, Kuraeva, T L , Dedov, i I, Nosikov, V V (2005) The TAF5L gene on chromosome 1q42 is associated with type 1 diabetes in Russian affected patients Autoimmunity, 28(4), 283-293

4 Носиков, В В , Кураева, Т Л , Серегин Ю А , Зильберман Л И , Савостьянов К В , Титович Е В , Чернышева А, Петеркова В А, Дедов И И Геномика сахарного диабета типа 1 Материалы Третьего Российского Диабетологического Конгресса, стр 43, г Москва, Россия (24 - 27 мая 2004 г)

5 Носиков, В В , Кураева, Т Л , Серегин, Ю А , Зильберман, Л И , Савостьянов, KB, Титович, ЕВ, Чернышева, А, Петеркова, В А, Дедов, ИИ

Геномика сахарного диабета типа 1 Материалы V Съезда Российского общества медицинских генетиков, стр 241, г Уфа, Россия (24 - 27 мая 2005) Медицинская генетика, 4(5), 241 (2005) б Носиков, В В , Кураева, Т Л , Чернышева, А, Зильберман, Л И , Савостьянов, К В , Цитлидзе, Н М , Петеркова, В А, Дедов И И Молекулярная генетика сахарного диабета типа 1 достижения и перспективы Материалы V Всероссийского конгресса эндокринологов "Высокие медицинские технологии в эндокринологии", стр 40, Москва, Россия (30 октября - 2 ноября 2006 г)

Подписано в печать 17 09 2007 г Исполнено 17 09 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 721 Тираж 120 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чернышева Ана

ВВЕДЕНИЕ Цель работы Научная новизна работы Практическая ценность работы

1. Обзор литературы

1.1 Общая характеристика СД типа

1.2 Концентрация СД типа 1 в семьях больных

1.3 Вклад генетических и негенетических факторов в развитие

СД типа

1.4 Полиморфные участки ДНК

1.4.1 Типы полиморфизма

1.4.2 Методы выявления полиморфизма ДНК

1.5 Стратегии изучения мультифакторных заболеваний 1.5.1 Тест на неравновесную передачу аллелей

1.6 Молекулярно-генетические маркеры СД типа

1.7 Молекулярные механизмы возникновения аутоиммунной реакции при СД типа

1.8 Характеристика исследуемых в работе локусов и генов

1.8.1 Локус lq42 на хромосоме 1 и ген TAF5L

1.8.2 Локус IDDM7 на хромосоме 2q31-q

1.8.3 Локус IDDM13 на хромосоме 2q34-q

1.8.4 Локус IDDM18 и ген IL-12B

1.8.5 Локус 16q22-q24 Заключение

2. Материалы и методы

2.1 Реактивы и ферменты

2.2 Буферные растворы

2.3 Формирование группы пациентов

2.4 Выделение геномной ДНК человека методом фенол/ хлороформной экстракции

2.5 Амплификация ДНК

2.6 Расщепление продуктов амплификации рестриктазами

2.7 Электрофоретическое разделение ДНК

2.8 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

2.9 Статистическая обработка результатов

2.9.1 Проверка на подчинение равновесию Харди-Вайнберга и неравновесие по сцеплению

2.9.2 Методы анализа сцепления генетического маркера с заболеванием

2.9.3 Поправка Бонферрони

3. Результаты и обсуждение

3.1 Изучение сцепления полиморфных маркеров в хромосомной области lq42 с СД типа

3.1.1 Выбор полиморфных маркеров в области lq

3.1.2 Идентификация аллелей полиморфных микросателлитных маркеров в хромосомной области lq

3.1.3 Изучение сцепления полиморфных маркеров в области lq42 с СД типа

3.1.4 Изучение ассоциации аллелей полиморфных маркеров в области lq42 с СД типа

3.1.5 Выбор гена-кандидата, продукт экспрессии которого может быть задействован в механизме развития СД типа 1 в области lq42 у русских

3.1.6 Выбор точечных полиморфных маркеров для изучения сцепления в хромосомной области lq42 с СД типа

3.1.7 Изучение сцепления аллелей нуклеотидных полиморфных маркеров в хромосомной области lq42 с СД типа 1 у русских

3.2 Изучение сцепления полиморфных маркеров в хромосомной области 16q22-q24 с СД типа

3.2.1 Выбор полиморфных маркеров в области 16q22-q

3.2.2 Идентификация аллелей полиморфных микросателлитных маркеров хромосомной области 16q22-q

3.2.3 Изучение сцепления полиморфных маркеров в области 16q22-q24 с СД типа

3.2.4 Изучение ассоциации аллелей полиморфных маркеров в области 16q22-q24 с СД типа

3.3 Изучение сцепления полиморфных маркеров в хромосомной области 2q31-q33 с СД типа

3.3.1 Выбор полиморфных маркеров в области 2q31-q

3.3.2 Идентификация аллелей полиморфных микросателлитных маркеров хромосомной области 2q31-q

3.3.3 Изучение сцепления полиморфных маркеров в области 2q31-q33 с СД типа

3.3.4 Изучение ассоциации аллелей полиморфных маркеров в области 2q31-q33 с СД типа

3.4 Изучение сцепления полиморфных маркеров в хромосомной области 2q35 с СД типа

3.4.1 Выбор полиморфных маркеров в области 2q

3.4.2 Идентификация аллелей полиморфных микросателлитных маркеров в хромосомной области 2q

3.4.3 Изучение сцепления полиморфных маркеров в области 2q35 с СД типа

3.4.4 Изучение ассоциации аллелей полиморфных маркеров в области 2q35 с СД типа

3.5 Изучение сцепления полиморфных маркеров в хромосомной области 5q31.1-q33.

3.5.1 Выбор полиморфных маркеров в области 5q31.1-q33.

3.5.2 Идентификация аллелей полиморфных микросателлитных маркеров в хромосомной области 5q31.1-q33.

3.5.3 Изучение сцепления полиморфных маркеров в области 5q31.1-q33.1 сСДтипа

3.5.4 Изучение ассоциации аллелей полиморфных маркеров в области 5q31.1-q33.1 с СД типа

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация генетических маркеров, ассоциированных с предрасположенностью к сахарному диабету тиа 1, на хромосомах 1,2,5 и 16"

Сахарный диабет (СД) типа 1 является распространенным и тяжелым наследственным заболеванием человека. Нарушение метаболизма глюкозы при СД типа 1 возникает из-за аутоиммунного разрушения бета-клеток поджелудочной железы, вследствие чего они теряют способность вырабатывать инсулин. Пути развития заболевания к настоящему времени изучены неполностью, но известно, что СД типа 1 формируется при взаимодействии нескольких генетических компонент и факторов внешней среды.

Как правило, при наличии генетической предрасположенности, СД типа 1 развивается в раннем возрасте и вызывает поражения кровеносных сосудов, почечную недостаточность, слепоту, гангрены и другие тяжелые осложнения. С помощью своевременной профилактики заболевания у пациентов с повышенным генетическим риском можно значительно отсрочить появление симптомов СД и снизить опасность развития осложнений. Поэтому в настоящее время главным является разработка стратегии ранней диагностики, прогнозирования и превентивной терапии заболевания с использованием генетических маркеров.

Полигенная природа СД типа 1 доказана последними работами по поиску локусов предрасположенности к заболеванию с использованием мультилокусного анализа сцепления. Удалось обнаружить более 20 локусов предрасположенности к СД типа 1. К сожалению, результаты оказались противоречивыми и сильно зависели от этно-территориальной принадлежности использованных выборок. Только для двух локусов существуют четкие доказательства их связи с СД типа 1. Это главный комплекс гистосовместимости (МНС) и полиморфный повтор в гене инсулина (INS). Поскольку в процесс формирования патологии вовлечены полиморфные маркеры в нескольких генах, в настоящее время проводятся крупномасштабные исследования множества генов-кандидатов и хромосомных областей с использованием выборок из различных этнических групп. Каждая из таких работ вносит свой вклад в понимание процессов, приводящих к СД типа 1.

К настоящему времени усилиями зарубежных исследовательских групп с использованием семей с сибсами, больными СД типа 1, проведено генетическое картирование и анализ сцепления этих локусов с СД типа 1 в этнических группах Европы, Северной Америки и Азии. Показано, что значимыми локусами по вкладу в семейный риск развития заболевания являются, IDDM13 (2q34-q35), IDDM18 (5q31.1-q33.1), IDDM7 (2q31-q33), а также хромосомные области 16q22-q24 и lq42. Однако для популяций России подобные исследования ранее не проводились.

Установление сцепления полиморфных маркеров с СД типа 1 поможет разработать дифференцированный подход к профилактике и лечению данной патологии.

10

Цель работы

Целью данной работы являлся поиск полиморфных маркеров, сцепленных с СД типа 1, в хромосомных областях lq42, 2q31-q33, 2q35, 5q31.1-q33.1 и 16q22-q24 .

Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа 1 группы полиморфных маркеров в хромосомной области lq42 с использованием семей с наличием заболевания у сибсов.

2. Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа 1 группы микросателлитных полиморфных маркеров в хромосомной области 16q22-24.

3. Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа 1 группы микросателлитных полиморфных маркеров в хромосомных областях 2q31-33 и 2q35.

4. Провести анализ сцепления и ассоциации с сахарным диабетом типа 1 однонуклеотидного полиморфного маркера в гене IL12B в хромосомной области 5q31.1-33.1.

5. При наличии ассоциации проанализировать функции генов в областях lq42 и 16q22-24, определить гены, которые по своим функциям могут быть задействованы в развитии СД типа 1.

Научная новизна работы

В данной работе впервые была изучена ассоциация полиморфных маркеров в хромосомных областях lq42, 2q31-33, 2q35, 5q31.1-33.1 и 16q22-24 с сахарным диабетом типа 1 у пациентов из городских популяций России. Обнаружена статистически достоверная ассоциация с СД типа 1 в областях lq42 и 2q35.

Проводились исследования функций генов в хромосомной области lq42 в связи с их возможным участием в развитии сахарного диабета типа 1. На роль генов-кандидатов предложены гены TAF5L, АВСВ10 и KIAA0133, связанные с предрасположенностью к СД типа 1.

Практическая ценность работы

Изучение ассоциации полиморфных маркеров с сахарным диабетом типа 1 позволит оценить относительный (популяционный) и абсолютный (индивидуальный) риск развития заболевания в популяциях России, прогнозировать его развитие и прогрессирование задолго до клинического проявления и, наконец, правильно формировать группы риска. Эти исследования также могут способствовать наиболее эффективному проведению профилактики сахарного диабета (мониторинг лиц группы риска, использование иммуномодуляторов и/или иммуносупрессоров, превентивной инсулинотерапии и др.), а также обучению лиц, уже заболевших СД, самоконтролю уровня глюкозы в крови, проведению интенсивной инсулинотерапии и т.д.

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Чернышева Ана

ВЫВОДЫ

1. Изучена передача в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 1 аллелей полиморфных маркеров D1S1644, D1S1617, D1S2847, D1S1668, D1S103 и D1S225, расположенных в хромосомной области lq42. Показано наличие высоко достоверной ассоциации с заболеванием для полиморфных маркеров D1S1617 и D1S2847.

2. Исходя из результатов, полученных при анализе сцепления и ассоциации полиморфных маркеров, расположенных в хромосомной области lq42, высказано предположение о возможной роли генов TAF5L, АВСВ10 и KIAA0133 в патогенезе сахарного диабета типа 1. Проведен анализ сцепления и ассоциации однонуклеотидных полиморфных маркеров, расположенных в этих генах. Для полиморфного маркера A454G в экзоне гена TAF5L, получена значимая ассоциация с заболеванием, по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов. Аллель А этого маркера чаще передавался больным сибсам, что говорит о том что данный аллель или аллель который с ним находится в неравновесии по сцеплению, является фактором повышенного риска развития заболевания.

3. Проанализированы сцепление и ассоциация с сахарным диабетом типа 1 пяти полиморфных микросателлитных маркеров, расположенных в области 16q22-24, в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 1. Сцепление и ассоциация с заболеванием в хромосомной области 16q22-24 не обнаружены, по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов.

4. Изучены сцепление и ассоциация с сахарным диабетом типа 1 двух полиморфных микросателлитных маркеров, расположенных в хромосомной области 2q31-33 (IDDM7) в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 1. Обнаружено слабое сцепление с сахарным диабетом типа 1 полиморфного микросателлитного маркера D2S152. Не показано положительной ассоциации данного маркера, по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов.

5. Изучены сцепление и ассоциация с сахарным диабетом типа 1 пяти полиморфных микросателлитных маркеров, расположенных в хромосомной области 2q35 (IDDM13) в 107 семьях больных сахарным диабетом типа 1. Обнаружено сцепление с сахарным диабетом типа 1 полиморфного микросателлитного маркера D2S137. Показана положительная ассоциация аллеля 152 данного маркера с сахарным диабетом типа 1, по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов. Данный аллель является фактором повышенного риска развития патологии.

6. Изучены сцепление и ассоциация с сахарным диабетом типа 1 полиморфного микросателлитного маркера D5S2060 и однонуклеотидного маркера С1159А в З'-нетранслируемой области гена IL12B, расположенных в хромосомной области 5q31.1-33.1 (1DDM18). Сцепление и ассоциация с заболеванием в данной хромосомной области не обнаружены, по данным о всех 107 семьях с наличием заболевания у сибсов.

Заключение.

В обзоре литературы дана характеристика СД типа 1, характера его наследования и метаболических изменений. Подробно рассмотрены аутоиммунные механизмы формирования патологии, ее основные этапы и участвующие в этом гены по данным о модельных организмах.

Во втором разделе приведены характеристики полиморфизма ДНК, типов полиморфных участков и различных методических подходов по их обнаружению и исследованию. Рассмотрены аспекты практического использования полиморфных маркеров для генетического анализа наследственных заболеваний.

Большое внимание уделялось принципам картирования локусов предрасположенности к наследственным заболеваниям.

Наконец, в последних разделах охарактеризованы использованные в работе локусы и некоторые расположенные в них или по соседству гены и полиморфные маркеры.

Несмотря на недостаток и противоречивость литературного материала о роли исследуемых в работе локусов в патогенезе СД типа 1, в обзоре литературы предпринята попытка достаточно полно описать объекты исследования, а также систематизировать и обобщить накопленные по теме исследований данные.

2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Реактивы и ферменты.

ДНК-полимераза Taq, рестриктазы TaqI, Hin6I и Xapl -производства НПО "Ферментас" (Литва). Рестриктазы BstDEI, BstFNI, BsoMAI и BstSFI - производства ООО "СибЭнзим". Синтез олигонуклеотидов выполнен НПО «Литех» (Москва).

Дрожжевая тРНК, ДСН, бромистый этидий, NaCl -производства фирмы "Serva" (Германия). dATP, dCTP, dTTP, dGTP -производства НПО "Ферментас" (Литва). Протеиназа К, сахароза, БСА, Тритон Х-100®, Твин-20, ДТТ, хлорид магния, сульфат аммония - фирмы "Sigma" (США). Легкоплавкая агароза Seakem LE, трис, ДМСО, минеральное масло, ЭДТА, акриламид, метилен-бисакриламид, TEMED, бикарбонат натрия - фирмы "Диаэм"(Москва). Уксусная кислота, азотная кислота, NaOH, НС1, фенол, хлороформ, этанол, ацетат натрия - производства фирмы "Реахим" (Россия). КС1 - производства фирмы "Merck" (Германия), а персульфат аммония - фирмы "Реонал" (Венгрия).

2.2. Буферные растворы (1х):

Буфер ТАЕ — 40 мМ Трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА.

Буфер ТВЕ — 0.089 МТрис, 0.89 М борная кислота, 0.002 М EDTA (рН=8.0).

Буферы для рестрикции (1х):

Буфер Y+ (yellow) - 33 мМ трис-ацетат (рН 7.9), 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия, 0.1мг/мл БСА

Буфер SE 2 (G) - ЮмМ трис-HCl (рН 7.6 при 25°С), ЮмМ MgCl2,50мМ NaCl, 1мМ ДТТ

Буфер SE 4 (W) - ЮмМ трис-HCl (рН 8.5 при 25°С), ЮмМ MgCl2, 150мМ NaCl, 1мМ ДТТ

Буфер SE 5 (Y) - 33 мМ трис-ацетат (рН 7.9 при 25°С), 10мМ ацетат магния, 66мМ ацетат калия, 1мМ ДТТ

Буферы для амплификации (1х): Буфер Al: 0.5М КС1,0.1М трис - НС1 (рН 9.2), 15мМ MgCl2 Буфер А2: 0.5М КС1,0.1М трис - НС1 (рН 8.3), 15мМ MgCl2 Буфер Taq: 67мМ трис - НС1 (рН 8.8), 16.6мМ сульфат аммония, 0.1% твин-20

2.3. Формирование группы пациентов.

Выборка была сформирована из 35 семей с конкордантными парами сибсов и 72 семей с дискордантными парами сибсов городского населения Москвы и Самары. Каждая семья с конкордантными парами сибсов содержала как минимум двоих сибсов с СД типа 1, каждая семья с дискордантными парами сибсов -одного больного и одного здорового. У больных детей СД был обнаружен в возрасте до 18 лет. Образцы крови были предоставлены сотрудниками Эндокринологического научного центра РАМН (г.Москва) и Самарского диабетического центра.

2.4. Выделение геномной ДНК человека методом фенол/хлороформной экстракции.

200 мкл венозной крови человека смешивали с равным объемом лизирующего буфера (10 мМ Трис-HCl (рН=8.0), 0.32 М сахароза, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 0.1%-ный тритон Х-100), добавляли ДТТ, ДСН и протеиназу К в конечной концентрации 0.2%, 40 мМ и 20 мкг/мл соответственно и инкубировали при 37°С в течение ночи. Затем последовательно обрабатывали фенолом, смесью фенол/хлороформ (1:1) и хлороформом (дважды на каждой стадии). ДНК осаждали добавлением 1 мл 96%-ного этанола в присутствии 0.3 М ацетата натрия и тРНК дрожжей (10 мкг/мл) с последующей инкубацией при -70°С. Осадок ДНК промывали 80%-ным этанолом, сушили на воздухе и растворяли в 50 мкл бидистиллированной воды. Препараты ДНК хранили при -70°С.

2.5. Амплификация ДНК.

ПЦР проводили на амплификаторе РНС-2 ('Techne", Великобритания) или "Терцик" ("ДНК- Технология", Москва) в 25 мкл реакционной смеси, содержащей буфер для амплификации, 0.2 мМ каждого dNTP, по 10 пикомолей каждого из праймеров, 100-200 нг геномной ДНК и 2.0 ед. ДНК-полимеразы Taq. Концентрацию хлорида магния варьировали в зависимости от амлифицируемого локуса. При необходимости в реакционную смесь вносили ДМСО в конечной концентрации 10%.

На начальной стадии ПЦР денатурировали ДНК при 94°С в течение 3 мин, на конечной - проводили синтез второй цепи при 72°С в течение 7 мин. В промежутке между данными стадиями осуществляли 35 циклов ПЦР по трехступенчатой программе, включающей денатурацию ДНК (94°С/45с), отжиг праймеров в течение 45с и синтез второй цепи (72°С/45с). Температуру отжига праймеров вариировали в зависимости от амлифицируемого локуса. Условия ПЦР и последовательности праймеров для амплификации исследованных локусов приведены в табл. 3 и 4.

2.6. Расщепление продуктов амплификации рестриктазами.

SNP маркеры исследовали, обрабатывая соответствующими рестриктазами продукты ПЦР, содержащие полиморфный участок. К 6 мкл амплифицированного фрагмента ДНК добавляли 1 мкл 10-кратного буфера, 2 мкл воды и 2-3 ед. фермента. Расщепление ДНК рестриктазами Hin6I и Xapl проводили в буфере Y+, Taql - в буфере для Taql, BstFNI - в буфере SE 5 (Y), BstDEI - в буфере SE 2 (G), BsoMAI- в буфере SE 4 (W) с добавлением 100мкг/мл БСА, a BstSFI в буфере SE 3 (О). Рестрикцию проводили в течение ночи при 37°С СHin6I, ХарГ), 55°С СBsoMAI), 60°С (BstDEI, BstFNI и BstSFI) или при 65°С (TaqI).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чернышева Ана, Москва

1. Бочков Н.П., Гинтер Е.К., Сергеев А.С. Генетика сахарного диабета: итоги и перспективы исследований. // Вест. АМН СССР. 1989. N5. С. 17-22.

2. Leslie R.D.G., Elliott R.B. Early environmental events as a cause of IDDM. Evidence and implications. // Diabetes. 1994. V. 43. P. 843-850.

3. Hawa M.I., Beyan H., Buckley L.R., Leslie R.D.G. Impact of Genetic and Non-Genetic Factors in Type 1 Diabetes // Amer J Med Gen (Semin. Med. Genet.). 2002. V.115. P. 8-17

4. Wagener D.K., Sacks J.M., LaPorte R.E., Macgregor J.M. The Pittsburgh study of insulin-dependent diabetes mellitus: Risk for diabetes among relatives of IDDM. // Diabetes. 1982. V. 31. P. 136-144.

5. Diabetes Epidemiology Research International Group. Geographic patterns of childhood insulin-dependent diabetes mellitus. Diabetes. 1988. V. 37. P. 1113-1119.

6. Warrant J.H., Krolewski A.S., Gottllieb M.S., Kahn C.R. Differences in risk of insulin- dependent diabetes in offspring of diabetic mothers and diabetic fathers.//N.Engl. J.Med. 1984. V. 311. N. 11. P. 657-673.

7. Vadheim СМ., Rotter J.I., Maclaren N.K., Riley W.J., Anderson C.E. Preferential transmission of diabetic alleles within the HLA gene complex. // N. Engl. J. Med. 1986. V. 315. N. 19. P. 1314-1318.

8. McCarthy М.1., Kruglyak L., Lander E.S. Sib pair collection strategies for complex diseases. // Genetic Epidemiology. 1998. V. 15. P. 317-340.

9. McCarthy B.J., Dorman J.S., Aston C.E. Investigating genomic imprinting and susceptibility to insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM): An epidemiological approach// Genetic Epidemiol. 1991. V. 8. P. 177-86.

10. Warrant J.H., Martin B.C., Krolewski A.S. Risk of IDDM in Children of diabetic mothers descreases with oncreasing maternal age at pregnancy. // Diabetes. 1991. V. 40. P. 1679-1684.

11. Кураева Т.П. Популяционно-генетические и иммуногенетические аспекты риска развития инсулинзависимого сахарного диабета. Дисс. докт. мед. наук, Москва, 1997,208 стр.

12. Chern М.М., Anderson V.E., Barbosa J. Empirical Risk for Insulin -dependent Diabetes (IDD) in Sibs. // Diabetes. 1982. V. 31. P. 11151118.

13. Eisenbarth G.S., Ziegler A.G., Colman P.A. Pathogenesis of insulin-dependent (type I) diabetes mellitus. In: Joslins Diabetes Mellitus. Edd. Kahn C.R., Weir G.C. Philadelphia, Baltimore, Hong Kong, London, Munich, Sydney, Tokyo. 1994. P. 216-239

14. Darlow J.M., Smith C.H., Duncan L.J.P. A statistical and genetical study of diabetes. III. Empiric risks to relatives. // Ann. Hum.Genet. 1973. Vol. 37. N2. P. 157-174.

15. Salvetti M., Ristori G., Bomprezzi R., Pozzilli P., Leslie R.D.G. Twins: mirrors of the immune system. // Immunol Today. 2000. V. 21. P. 342347.

16. Redondo M. U., Yu L., Hawa M., Mackenzie Т., Руке D.A., Eisenbarth G.S., Leslie R.D.G. Heterogeneity of type 1 diabetes: analysis of monozygotic twins in Great Britain and the United States. // Diabetologia. 2001. V. 44. P. 354-362.

17. Smith C. Statistical resolution of genetic heterogeneity in familial disease. // Ann. Human Genet. 1976. V. 39. N. 3. P. 281-291.

18. Мушкамбаров H.H., Кузнецов C.C. Молекулярная биология. ООО "Медицинское информационное агентство", Москва, 2003,544 с.

19. Singer М. Highly repeated sequences in mammalian genomes // Int. Rev. Cytol. 1982. V. 76. P. 67-112.

20. Jelinek W., Schmid C. Repetitive sequences in eukaryotic DNA and their expression // Ann. Rev. Biochem. 1982. V. 51. P. 813-844.

21. Warburton P.E., Willard H.F. Genomic analysis of sequence variation in tandemly repeated DNA. Evidence for localized homogenious sequence domain within arrays of alpha-satellite DNA // J.Mol.Biol. 1990. V. 216. P. 3-16.

22. Lund J.A., Bostock C., Leth-Bak A. Chromosome-specific subfamilies within human alphoid repeatitive DNA // J. Mol. Biol. 1986. V. 187. P. 185-196.

23. Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA // Nature. 1985. V. 316. P. 67-73.

24. Nakamura Y„ Leppert M., 0'Cornell P., Wolff R., Holm Т., Culver M., Martin C., Fujimoto E., HoffM., Kumlin E., White R. Variable number of tandem repeats (VNTR) markers for human genome mapping // Science. 1987. V. 235. P. 1616-1622.

25. Miesfield R., Krystal M., Arnheim N. A member of new repeated sequence family which is conserved eucaryotic evolution is found between the human delta- and beta-globin genes // Nicleic Acids Res. 1981. V. 9. P. 5931-5947.

26. Hamada H., Petrino M., Kakunaga Т., Seidman M., Stollar B. Characterization of genomic Poly(dT-dG) Poly(dC-dA) sequences: structure, organization and conformation // Mol. Cell. Biol. 1984. V. 4. P. 2610-2621.

27. Hamada H., Seidman M., Howard В., Gorman C. Enchanced gene expression by Poly(dT-dG) Poly(dC-dA) sequence // Mol. Cell. Biol. 1984. V. 4. P. 2622-2630.

28. Edwards A., Hammond H.A., Jin L., Caskey C.T., Chakraborty R. DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats // Am. J. Hum Genet. 1991. V. 49. P. 746-756.

29. Saiki R.K., ScharfS., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for sickle cell anemia // Science. 1985. V. 230. P. 1350-1354.

30. Decorte R., Cuppens H., Marinen P., Cassiman J.-J. Rapid detection of hypervariable regions by the polymerase chain reaction technique // DNA Cell Biol. 1990. V. 9. P. 461-469.

31. Li H., Gyllensten U.B., Gui X., Saiki P.K., Erlich H.A., Arncheim N. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells // Nature. 1988. V. 335. P. 414-417.

32. Jouquand S„ Cheron A., Galibert F. Microsatellite analysis using two-step procedure for fluorescent labeling of PCR products // Biotechniques. 1999. V. 26. P. 902-905.

33. Hayashi K. PCR-SSCP: a simple and sensitive method for detection of mutation in the genomic DNA // PCR Methods Appl. 1991. V. 1. P. 3438.

34. Sanger F, Nicklen S, Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc Natl Acad Sci USA. 1977. V. 74. N. 12. P. 5463-5467.

35. Vink J.M., Boomsma D.I. Gene finding strategies // Biol sychology. 2002. V. 61. P. 53-71

36. McCarthy M.I. Susceptibility gene discovery for common metabolic and endocrine traits // Journ Molec Endocrin. 2002. V. 28. P. 1-17

37. Risch N., Merikangas K. The future of genetic studies of complex human deseases// Science. 1997. V.275. P. 1516-1517.

38. Risch N., Zhang H. Extreme discordant sib pairs for mapping quantitative trait loci in humans// Science. 1995. V. 268. P. 1584-1589.

39. Risch N. Linkage strategies for genetically complex traits. II. The power of affected relative pairs. // Am. J. Hum. Genet. 1990. V. 46. P. 229-241.

40. Risch, N. Linkage strategies for genetically complex traits. III. The effect of marker polymorphism on analysis of affected relative pairs. // Am. J. Hum. Genet. 1990. V. 46. N. 242-253.

41. Risch N. Linkage strategies for genetically complex traits. I. Multilocus models. // Am J Hum Genet. 1990. V. 46. P. 222-228.

42. RojfD.A., Bentzen P. The statistical analysis of mitochondrial DNA polymorphisms: chi 2 and the problem of small samples// Mol.Biol.Evol. 1989. V.6. P. 539-45.

43. Ionnidis J.P.A., Ntzani E.E., Trikalinos T.A. Contopoulos-Ioannidis D.G. Replication validity of genetic association studies. // Nat. Genet. 2001. V. 29. P. 306-309.

44. Schulze T.G., McMahon F.J. Genetic association mapping at the crossroads: which test and why? Overview and practical guidelines. // Am. J. Hum. Genet. 2002. V. 114. N. 1. P. 1-14.

45. Spielman R.S., McGinnis R.E., Evens W.J. Transmission test for linkage disequlibrium: the insulin gene region and insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) // Am. J. Hum. Genet. 1993. V. 53. P. 506-516.

46. Spielman R.S., Evens W.J. A sibship test for linkage in the presence of association: the sib transmission/disequilibrium test // Am. J. Hum. Genet. 1998. V. 62. P. 450-558.

47. Threadgill D.W., Hunter K.W., Williams R.W. Genetic dissection of complex and quantitative traits: from fantasy to reality via a community effort // Mamrn Genome. 2002. V. 13. P. 175-178.

48. Whittemore A.S. Genome scanning for linkage: an overview. Am J Hum Genet. 1996. V. 59. P. 276-287

49. Lander E., Kruglyak L. Genetic dissection of complex traits: guidelines for interpreting and reporting linkage results. // Nat Genet 1995. V. 11. P. 241-247.

50. Lander E.S., Schork N.J. Genetic dissection of complex traits// Science. 1994. V. 265. P. 2037-48.

51. Altmuller J., Palmer L.J., Fischer G., Scherb H., Wjst M. Genomewide Scans of Complex Human Diseases: True Linkage Is Hard to Find // Am. J. Hum. Genet. 2001. V. 69. P. 936-950

52. Owerbach D., Gabbay K.H. Localization of a type 1 diabetes susceptibility locus to the variable tandem repeat region flanking the insulin gene. // Diabetes. 1993. V. 42. P. 1708-1714.

53. Xiong M., Jin L. Comparison of the Power and Accuracy of Biallelic and Microsatellite Markers in Population-Based Gene-Mapping Methods // Am. J. Hum. Genet. 1999. V. 64. P. 629-640

54. Lonjou C., Collins A., Morton N.E. Allelic association between marker loci// Proc.Natl.Acad.Sci. 1999. V. 96. P. 1621-26.

55. International SNP Map Working Group. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms// Nature. 2001. V. 409. P. 928-933.

56. Fulker D.W., Cherny S.S., Sham P.C., Hewitt J.K. Combined linkage and association sib-pair analysis for quantitative traits. // Am J Hum Genet. 1999. V. 64. P. 259-267.

57. Cardon L.R., Abecasis G.R. Some properties of a variance. Null components model for fine-mapping quantitative trait loci. II Behav Genet. 2000. V. 30. P. 235-243

58. Sun L.,Cox N.J., McPeek M.S. A Statistical Method for Identification of Polymorphisms That Explain a Linkage Result // Am. J. Hum. Genet. 2002. V. 70. P. 399-411

59. Bell G.I., Horita S., Karam J.H. A polymorphic locus near the human insulin gene is associated with insulin-dependent diabetes mellitus // Diabetes. 1984. V. 33. N. 2. P. 176-183.

60. Simpson N.E. The genetics of diabetes mellitus in man. // J. Genet, and Cytol. 1980. V. 22. N. 4. P. 497-506. predict insulin-dependent diabetes mellitus: a study of identical twins// Diabetologia. 1990. V. 33. P. 497-502.

61. Beer S.F., Heaton D.A., Alberti K.G.M.M., Руке D.A., Leslie R.D.G. Impaired glucose tolerance precedes but does not predict insulin-dependent diabetes mellitus: a study of identical twins// Diabetologia. 1990. V. 33. P. 497-502.

62. Reed P.W. Davies J.L. Copeman J.B. Chromosome specific microsatellite sets for fluorescence based, semi-automated genome mapping// Nature Genet. 1994. V. 7. P. 390-5.

63. Ott J. Analysis of Human Genetic Linkage// The Johns Hopkins University Press. Baltimore. 1999.

64. International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome// Nature. 2001. V. 409. P. 860-921.

65. European Consortium for IDDM Genome Studies. A genomewide scan for type I diabetes susceptibility in Scandinavian families: identification of new loci with evidence of interactions// Am.J.Hum.Genet. 2001. V.69. P. 1301-13.

66. Bertrams J., BaurM.P. Histocompatibility testing. New York. 1984. P. 348-358.

67. Owerbach D., Nerup J. Restriction fragment length polymorphism of the insulin gene in diabetes mellitus. // Diabetes. 1982. Vol. 31. P. 275-277

68. Postigo A.A., Dean D.C. Independent Repressor Domains in ZEB Regulate Muscle and T-Cell Differentiation // Molec Cell Biol. 1999. P. 7961-7971

69. Hayashi Т., Faustman D. NOD mice are defective in proteasome production and activation of NF-kB// Mol Cell Biol. 1999.V. 19. P. 86468659

70. Faustman D., Li X., Lin H.Y., Fu Y., Eisenbarth G., Avruch J., Guo J. Linkage of faulty major histocompatibility complex class I to autoimmune diabetes. // Science. 1991. V. 254. P. 1756-1761.

71. Aldrich C.J., Ljunggren H.G., Van Kaer L., Ashton-Rickardt P.G., Tonegawa S., Forman J. Positive selection of self- and alloreactive CD8+ T cells in TAP-1 mutant mice. // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. V. 91. P. 6525-6528

72. Glas R., Ohlen C., Hoglund P., Karre K. The CD8+ T cell repertoire in p2-microglobulindeficient mice is biased towards reactivity against self-major histocompatibility class I. //J Exp Med. 1994. V. 179. P. 661-672

73. Goldberg A.L., Rock K.L. Proteolysis, proteosomes and antigen presentation. // Nature. 1992. V. 357. P. 375-379.

74. Monaco J.J. A molecular model of MHC class I restricted antigen processing. //Immunol Today. 1992. V. 13. P. 173-179.

75. Yowdell J.W., Bennink J.R. Cell biology of antigen processing and presentation to major histocompatibility complex class I molecule restricted T lymphocytes. // Adv Immunol. 1992. V. 52. P. 1-123.

76. Owens G.P., Hahn W.E., Cohen JJ. Identification of mRNAs associated with programmed cell death in immature thymocytes// Mol.Cell Biol. 1991. V. 11(8). P. 4177-88.

77. Orlowski M. The multicatalytic proteinase complex, a major extralysosomal proteolytic system. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 1028910297.

78. Yan G., Fu Y., Faustman D.L. Reduced expression of Tapl and Lmp2 antigen processing genes in the nonobese diabetic (NOD) mouse due to a mutation in their shared bidirectional promoter. // J Immunol. 1997. V. 159. P. 3068-3080

79. Dianzani U., Chiocchetti A., Ramenghi U. Role of inherited defects decreasing Fas function in autoimmunity // Life Sciences. 2003. V.72. P.2803-2824

80. Amrani, A., Verdaguer J., Anderson В., Utsugi Т., Bou S., Santamaria P. Perforin-independent (3 cell destruction by diabetogenic CD8+ T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. // J. Clin. Invest. 1999. V. 103. P. 1201-1209.

81. Silva D.G., Petrovsky N., Socha L, Slattery R., Gatenby P., Charlton B. Mechanisms of Accelerated Immune-Mediated Diabetes Resulting from Islet p Cell Expression of a Fas Ligand Transgenel // J Immunol. 2003. V. 170. N. 10. P. 4996-5002.

82. Hayashi Т., Faustman D. Role Of Defective Apoptosis In Type 1 Diabetes And Other Autoimmune Diseases // Recent Prog Horm Res. 2003. V. 58. P. 131-53.

83. Hsu S.C., Gavrilin M.A., Lee H.H., Wu C.C., Han S.H., Lai M.Z. NF-kB-dependent Fas ligand expression // Eur J Immunol. 1999 V. 29. P. 2948-2956

84. Green JM. The B7/CD28/CTLA4 T-cell activation pathway. Implications for inflammatory lung disease. // Am J Respir Cell Mol Biol. 2000. V. 22. N. 3. P. 261-264.

85. Ewens K.G., Johnson L.N., Wapelhorst В., O'Brien K., Gutin S., Morrison V.A., Street C., Gregory S.G., Spielman R.S., Concannon P. Linkage and association with type I diabetes on chromosome lq42 // Diabetes. 2002. V. 51(11). P. 3318-25.

86. Harland L., Crombie R., Anson S., deBoer J., Ioannou P.A., Antoniou M. Transcriptional regulation of the human TATA binding protein gene// Genomics. 2002. V.79(4). P. 479-82.

87. Copeman J.B.,Cucca F., Hearne C.M., Cornall R.J., Reed P.W., Ronningen K.S., Undlien D.E., Nistico L, Buzzetti R„ Tossi R. Linkage disequilibrium mapping of T1D susceptibility gene (IDDM7) to chromosome 2q31-q33 // Nat Genet. 1995. V. 9(1). P. 80-5.

88. Luo D.F., Maclaren N.K., Huang H.S., Muir A., She J.X. Intrafamilial and case-control association analysis of D2S152 in insulin-dependent diabetes mellitus // Autoimmunity. 1995. V. 21(2). P. 143-7.

89. Dupont S., Dina C., Hani E.H., Froguel P. Absence of replication in the French population of the association between beta2/NEUROD-A45T polymorphism and type I diabetes // Diabetes Metab. 1999. V. 25(6). P. 516-7.

90. Morahan G., Huang D., Tait B.D., Colman P.G., Harrison L.C. Markers on distal chromosome 2q linked to insulin-dependent diabetes mellitus // Science. 1996. V. 272(5269). P. 1811-3.

91. Bosi E., Sarugeri E. Advances and controversies in ethiopathogenesis of type I (insulin-dependent) diabetes mellitus// J. Pediatr.Endocrinol.Metabol. 1998. V.ll(2). P. 293-305.

92. Adorini L. Interleukin 12 and autoimmune diabetes I I Nat. Genet.2001. V. 27(2). P. 131-132.

93. Seegers D., Zwiers A., Strober W., Репа A.S., Bouma G. A Taql polymorphism in the З'-UTR of the IL-12 p40 gene correlates with increased IL-12 secretion // Genes Immun. 2002. V. 3(7) P. 419-23.

94. Nistico L., Giorgi G., Giordano M., Galgani A., Petrone A., D'Alfonso S., Federici M., Di Mario U., Pozzilli P., Buzzetti R., Cascino I. IL12B polymorphism and type I diabetes in the Italian population // Diabetes.2002. V.51. P. 1649-1650.

95. Holm P., Luthman H, Kockum /. No evidence for linkage in Swedish multiplex T1D familied IL12B on chromosome 5q33-34 // Ann.N Y

96. AI o„: ЛПЛ1 Л 1 1 ЛАС г» о CI с

97. McCormack R.M., Maxwell A.P., Carson D.J., Patterson C.C., Middleton D., Savage D.A. The IL12B 3' untranslated region DNA polymorphism is not associated with early onset type I diabetes // Genes Immun. 2002. V.3.P. 433-5.

98. Davoodi-Semiromi A., Yang J. J., She J.X. IL12p40 is associated with type I diabetes in Caucasian-American families // Diabetes. 2002. V.51. P.2334-6.

99. Kristiansen O.P., Larsen Z.M., Johannesen J., Nerup J., Mandrup-Poulsen Т., Pociot F. No linkage of P187S polymorphism in NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQ01/DIA4) and type I diabetes in the Danish population // Hum. Mutat. 1999. V. 14(1). P. 67-70.