Характеристика условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза толстого кишечника

Нилова, Людмила Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза толстого кишечника
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза толстого кишечника"

На правах рукописи

НИЛОВА Людмила Юрьевна

ХАРАКТЕРИСТИКА УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ДИСБАКТЕРИОЗА ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2009

003463678

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Бойцов Алексей Геннадьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Королюк Александр Михайлович

доктор медицинских наук,

профессор Кветная Ася Степановна

Ведущее учреждение: ГОУДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования».

Защита диссертации состоится « 24 » марта 2009 г. в_час. на заседании диссертационного Совета ДМ 208.086.03 при ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., д. 47).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Росздрава» (195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., д. 47).

Автореферат разослан «_» февраля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Бойцов А.Г.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Бактериологический метод диагностики дисбактериоза толстого кишечника широко востребован врачами разного профиля и реализуется во многих лабораториях страны. Результаты исследований служат основанием для назначения препаратов, используемых для коррекции дисбактериоза. Существуют многочисленные рекомендации, описывающие технику проведения таких исследований, разработан отраслевой стандарт ОСТ 91500.11.0004-2003 «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника».

В то же время проблема дисбактериозов вызывает острые дискуссии. Это обусловлено многими причинами, среди которых ведущей является отсутствие достоверных методов его диагностики.

Так, профессор А.Н. Маянский [1999] пишет: «Фактически это дорогостоящее (тем более что тестирование рекомендуется делать в динамике), трудоемкое исследование с невысокой (если не с нулевой) отдачей. Принимая во внимание огромный опыт такого рода исследований, представляется возможным почти безошибочно ставить регламентированный инструкциями диагноз "дисбактериоз", опираясь на клинику». С ним солидарны и многие гастроэнтерологи, подчеркивающие, что препараты типа «Лактулоза», «Бифидумбактерин», «Хи-лак», а также многие другие, способствующие нормализации состава микрофлоры можно назначить и, не зная количества лактобактерий и бифидобактерий в испражнениях. В то же время, действующий ОСТ 91500.11.0004-2003 провозглашает: «Поскольку дисбактериоз кишечника в ряде случаев протекает бессимптомно, решающее значение при постановке диагноза имеют микробиологические показатели».

В ОСТ 91500.11.0004-2003 приведена информация о содержании в фекалиях здоровых людей 15 групп микроорганизмов, однако, очевидно, это лишь малая доля от числа видов, обитающих в кишечнике человека. Следует признать, что дать исчерпывающую характеристику состава нормальной микрофлоры кишечника невозможно даже в научных, а тем более в практических лабораториях.

По-видимому, надо уделять внимание только тем группам бактерий, количество которых в той или иной степени влияет на тактику коррекции дисбактериоза. Основное внимание при этом должно уделяться условно-патогенным бактериям и грибам, численность которых чрезмерна. Однако критерии оценки значимости отдельных штаммов, выделенных от пациента в генезе дисбиотических нарушений, не разработаны.

При коррекции дисбиотических нарушений кишечной микрофлоры одновременно со стимуляцией «полезной» составляющей микробиоты необходимо подавить микроорганизмы, численность которых чрезмерна. Выбор оптимальной схемы коррекции состава микрофлоры без лабораторных исследований крайне затруднен, однако оптимальный перечень подобных исследований не определён.

Существующее мнение о безвредности пробиотиков для пациента в настоящее время поколеблено [Besselink M.G.H. et al., 2008; Vleggaar F.P. et al., 2008], а литературные данные об их эффективности не однозначны [Watkinson P.J. et al., 2007]. Установлено, что про-биотические препараты могут подавлять индигенные лактобациллы пациента [Глушанова Н.А., Шендеров Б.А., 2005]. Способность к адгезии к эпителиальным клеткам хозяина - признанный тест при отборе потенциальных штаммов пробиотиков [Dunne С. et al., 2001]. Однако, адгезивная активность - сугубо индивидуальное свойство: штамм пробиотика, обладающий высокой адгезией к эпителию пациентки «А», может практически не прикрепляться к эпителию «Б» [Бойцов А.Г. и соавт., 2004].

Коррекция состава факультативно-анаэробной части микрофлоры кишечника требует назначения таких препаратов, как бактериофаги и антибиотики. Их правильный выбор не возможен без адекватного лабораторного пособия.

Таким образом, специальные лабораторные тесты могут облегчить правильность выбора пробиотиков и антимикробных препаратов. Необходимость в таких тестах ещё до конца не осознана медицинской общественностью, а техника их выполнения не стандартизирована.

Цель исследования - характеристика условно-патогенных микроорганизмов (УПМ), выделенных от больных с дисбактериозом толстого кишечника и выбор на её основе лабораторных тестов, необходимых для обеспечения правильного выбора пробиотических и антибактериальных препаратов.

Задачи исследования:

1. Оценить значимость условно-патогенных микроорганизмов в развитии дисбактериоза толстого кишечника при некоторых патологических состояниях.

2. Определение факторов колонизации (антилизоцимной активности и адгезивности) УПМ, выделенных при дисбактериозе.

3. Выбор методов определения чувствительности УПМ к антагонистической активности пробиотических микроорганизмов и В.сегеиз.

4. Определение чувствительности УПМ к антибиотикам, бактериофагам, антагонистической активности пробиотических микроорганизмов и В. сегеиз.

5. Изучение свойств пробиотических микроорганизмов, влияющих на эффективность их применения на фоне избыточной численности УПМ в кишечнике.

Научная новизна. Сопоставлены спектры условно-патогенных микроорганизмов, выделяемых при дисбактериозе толстой кишки различного генеза. Впервые изучена адгезивность УПМ, выделенных у больных с дисбактериозом толстого кишечника, по отношению к собственным эпителиальным клеткам кишечника. Получена новая информация о чувствительности УПМ указанного происхождения к антибиотикам, бактериофагам и об их антилизоцимной активности. Дана оценка значимости адгезивных и антагонистических свойств пробиотических штаммов, влияющих на эффективность коррекции дисбактериоза толстого кишечника.

Практическая значимость. Предложены схемы выбора препаратов для коррекции дисбактериоза толстого кишечника на основании данных бактериологического исследования. Показана необходимость внедрения в работу бактериологических лабораторий индивидуального подбора препаратов для коррекции дисбактериоза толстого кишечника. Показана эффективность фаготерапии при определении чувствительности к бактериофагам до начала лечения. Предложена методика определения антагонистической активности бацилл, входящих в состав эу-биотиков. Рекомендованы методы определения антагонистической активности пробиотических микроорганизмов и В. сегеиэ.

Дана оценка значимости адгезивных и антагонистических свойств пробиотических штаммов и В. сегеиэ, влияющих на эффективность коррекции дисбактериоза толстого кишечника.

Материалы работы внедрены в работу бактериологической лаборатории клиник СПбГМА им. И.И. Мечникова больницы Петра Великого, и Санкт-Петербургского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Пастера.

Получены удостоверения на рационализаторские предложения № 1804, № 1805, № 1806, принятые ГОУВПО СПбГМА им. И.И. Мечникова 05.12.2008 г. к использованию под наименованиями: «Способ определения in vitro адгезивной активности пробиотиче-ских препаратов, содержащих лакто- и бифидумбактерии, используемых для коррекции дисбиоза толстого кишечника»; «Способ индивидуального подбора in vitro пробиотических препаратов, содержащих лакто- или бифидумбактерии для коррекции дисбиоза толстого кишечника на основе антагонистической активности, адгезивной активности и биосовместимости»; «Способ индивидуального подбора in vitro пробиотических препаратов, содержащих лакто- или бифидумбактерии для элиминации условно-патогенных микроорганизмов при дисбиозе толстого кишечника на основе антагонистической активности».

Кроме того, результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУВПО СПбГМА им. И.И. Мечникова для врачей-интернов, ординаторов и слушателей факультета усовершенствования врачей.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Выбор пробиотиков, эубиотиков, антибиотиков и бактериофагов для коррекции дисбактериоза толстого кишечника должен быть индивидуальным, учитывающим особенности организма хозяина и биологических свойств микроорганизма и основываться на данных лабораторных исследований.

2. Разработана схема лабораторного тестирования для выбора препаратов пробиотиков, основанная на определении адгезивных свойств препарата к клеткам эпителия пациента, антагонистических свойств по отношению к индигенным штаммам - представителям его микрофлоры и УПМ, количество которых избыточно. Осуществлен выбор оптимальных методов тестирования.

3. Подтверждена эффективность коммерческих препаратов бактериофагов в отношении условно-патогенных микроорганизмов при условии их выбора на основании обязательного лабораторного тестирования.

4. Разработан метод определения антагонистической активности эубиотиков, который может быть использован для оптимального выбора препарата.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ. Основные положения работы доложены на отчетных научно-практических конференциях сотрудников и молодых ученых СПбГМА им. И.И. Мечникова (Санкт-Петербург, 2006, 2007), на четвертой международной конференции, посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008), а также в выступлении на 6-й международной Германо-Российской конференции Кох-Мечников «От Ильи Мечникова и Пауля Эрлиха к современным достижениям медицинской науки и практики» (Санкт-Петербург, 2008).

Личный вклад диссертанта. Личное участие автора осуществлялось на всех этапах работы и заключалось в выполнении всех микробиологических исследований, статистической обработке результатов, анализе полученных данных, в обобщении и оформлении результатов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Диссертация содержит 27 таблиц и 10 рисунков. В работе использовано 117 отечественных и 79 иностранных источников литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили условно-патогенные микроорганизмы, выделенные из фекалий больных с дисбактериозом толстого кишечника.

Для бактериологической диагностики дисбактериоза на базе кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбГМА им. И.И. Мечникова нами было проведено обследование 608 человек: группа сравнения- 25 человек, 456 больных с различными патологическими состояниями, 80 детей в возрасте до 1 года и 47 детей от 1 года до шести лет. Все обследовавшиеся взрослые пациенты, находились на лечении в клиниках гастроэнтерологии, урологии и внутренних болезней больницы Петра Великого. Дети до 1 года обследовались нами по направлениям педиатров в связи с изменением харак-

тера стула и вздутием живота. Обследование включало определение числа бифидобактерий, бактероидов, лактобактерий, кишечных палочек с типичными и атипичными свойствами, условно-патогенных и патогенных энтеробактерий, неферментирующих грамотрицательных бактерий, стафилококков, гемолитических форм микроорганизмов, энтерококков, дрожжеподобных грибов рода Candida.

Инкубация посевов на плотных средах для выделения лакто- и бифидумбактерий осуществлялась в анаэростатах АЭ-01 (ОАО «НИКИ MJIT», Санкт-Петербург) и OXOID (England)c использованием газогенерирующих пакетов «Анаэрогаз». Идентификацию анаэробных микроорганизмов осуществляли с помощью ANAEROTEST 23 (Lachema, Чешская республика). Идентификацию условно-патогенных энтеробактерий проводили с использованием общепринятых схем идентификации с использованием ПБДЭ («Диагностические системы», Нижний Новгород), ENTEROTEST 24 (Lachema, Чешская республика), НЕФЕРМтесте (Lachema, Чешская республика), а также сред Гисс. Оценка результатов проводилась в соответствии с нормативами, приведенными в Отраслевом стандарте «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» 91500.11.0004- 2003.

Адгезию УПМ осуществляли на буккальный эпителий больных, у которых были выделены данные микроорганизмы согласно методике Бойцов А.Г. и соавт., [2004]. Антилизоцимную активность определяли по стандартной методике [Бухарин О.В. и соавт., 1985]. Чувствительность к антибиотикам определяли на Мюллер-Хинтон агаре в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Определение фагорезистентно-сти проводили на 1,5 % питательном агаре по аналогии с методом фаго-дифференцировки с использованием коммерческих бактериофагов.

Для изучения свойств пробиотиков, влияющих на эффективность элиминации УПМ было использовано 10 коммерческих биопрепаратов: 5 препаратов, содержащих лактобациллы: «Лактобактерин» («Микро-ген» Пермь); «Лактобактерин» («Имбио» Нижний Новгород); «Лактобактерин» («Иммунопрепарат» Уфа); «Нормофлорин-Л» (ООО «Бифи-люкс» Москва), йогурт «Актимель» (Россия) и 5 биопрепаратов, содержащих бифидобактерии: «Бифидумбактерин сухой» («Микроген» Пермь); «Бифидумбактерин» («Экополис» Ковров); «Бификол» («Био-мед» им. И.И.Мечникова Московская область); «Нормофлорин-Б» (ООО «Бифилюкс» Москва); «Бифиформ» («Ferrosan» Дания).

Антагонистическая активность пробиотических препаратов была проверена методами отсроченного антагонизма (метод штрихов) [Постникова Е.А. и соавт., 2004], прямого совместного культивирования [Глушанова Н.А. и соавт., 2004], перевернутого агара [Арзума-нян В.Г. и соавт., 2005], двуслойного агара [Е.И.Ермоленко и соавт., 2004]. Биосовместимость определялась по аналогии с методом прямого совместного культивирования [Глушанова Н.А., и соавт., 2005].

Для определения антагонистической активности Bacillus cereus была использована специально разработанная методика с использованием питательных сред с антибиотиками.

Статистическая обработка результатов исследований проводилась в компьютерной оболочке Windows с помощью процессора электронных таблиц Microsoft Office Excel 2003 и программы Биостат [Гланц С., 1999]. Были использованы непараметрические методы сравнения - критерий F - тест, коэффициенты корреляции Пирсона (г) и Спирмена (р), однофакторный дисперсионный анализ [Руни-он Р., 1982; Гланц С., 1999].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

При обследовании взрослых, страдающих различными формами патологии пищеварительного тракта, инфарктом миокарда, больных, прошедших длительный курс антибиотикотерапии по поводу урологических заболеваний, детей разных возрастных групп с разной частотой отмечались изменения анаэробной составляющей кишечного микробиоценоза. Снижение численности индигенной анаэробной микрофлоры зарегистрировано практически во всех обследованных группах: бифидумбактерий в 472 случаях (81 %), бактероидов - в 540 случаях (92,6 %), лактобактерий - в 284 случаях (48,7 %). Однако в большинстве случаев величина отклонения от нормы была незначительна и сопоставимы с ошибкой метода.

Наиболее часто снижение численности бифидобактерий выявлено в группах с синдром раздраженного кишечника (63 случая -92,6 %), хронического гастродуоденита (28-90,3 %), неспецифического язвенного колита (42-85,7 %), и в группе с клиническими симптомами дисбактериоза (71-88,8 %).

Среди детей в возрасте до 1 года достоверно реже по сравнению с группой сравнения наблюдалось снижение численности лактобактерий: 16 случаев - (20 %) против 13 - (52 %) в группе сравнения.

Изменения численности УПМ также были выявлены практически у всех групп обследованных больных, причем как на фоне снижения численности индигенной флоры, так и без него. При этом чаще всего наблюдалось увеличение числа условно-патогенных энтеробактерий (УПЭ), которые были выделены у 344 пациентов (59 %), при этом ассоциации энтеробактерий были выделены у 130 из них (37,8 %). Общее число выделенных культур энтеробактерий составило 455. Среди них: Enterobacter spp. - 159 штаммов (35 % от общего числа находок условно-патогенных энтеробактерий), Klebsiella spp. - 113 (24,8%), Citrobacter spp. - 107 (23,5 %), Proteus spp. - 49 (10,8 %), Hafnia spp. -17 (3,7 %), Morganella spp. - 7 (1,5 %), Serratia spp. - 3 (0,7 %).

Наличие гемолитических микроорганизмов выявлено у 82 пациентов (14,1 %). Увеличение количества коагулазоотрицательных стафилококков отмечалось в 98 случаях (16,8 %), а присутствие золотистого стафилококка - в 83 (14,2 %). Дрожжеподобные грибы рода Candida обнаруживались в количествах, превышающих норму у 66 пациентов (11,3 %), клостридии - у 28 (4,8 %), неферментирующие грамотрицательные бактерии - у 22 (3,8 %).

Наибольшее количество изменений выявлено в группе детей до 1 года: у 70 детей (87,5 %) выделены УПЭ в количествах, превышающих норму, при этом у 27 (33,8 %) они выявлялись в ассоциациях. Увеличение количества коагулазоотрицательных стафилококков отмечалось в 39 случаях (48,8 %), появление S.aureus - в 35 случаях (43,8 %).

Статистически достоверной взаимосвязи между снижением количества бифидобактерий и увеличением УПМ не выявлено ни в одной из групп. Таким образом, снижение количества бифидобактерий может приводить к избыточному размножению УПМ, но может и не влиять на этот процесс и, напротив, при нормальном содержании бифидобактерий может иметь место увеличение числа УПМ.

Для оценки возможной агрессивности УПМ, выделенных при дисбиозе из фекалий в значимом количестве, было проведено определение способности их к адгезии к эпителиальным клеткам и их анти-лизоцимной активности.

Объектом для адгезии служили клетки буккального эпителия пациентов, у которых были выделены тестируемые УПМ. Интенсивность адгезии оценивали по 5 бальной системе. Была проведена оценка степени адгезии 118 штаммов УПМ, выделенных у больных с дисбиозом толстого кишечника. Адгезивные свойства проявляли все штаммы УПМ. Однако степень адгезии микроорганизмов варьировала. Так, ад-

гезивная активность у всех штаммов Candida spp. была невелика и находилась в пределах одного балла. Штаммы со степенью адгезии 5 баллов чаще встречались среди коагулазоотрицательных стафилококков (53,3% штаммов), S.aureus (20 %) и Enterobacter spp. (20 %). Адгезивная активность гемолитических штаммов E.faecalis и E.coli, P.aeruginosa и Klebsiella spp. составляли преимущественно от 1 до 3 баллов. Полученные данные не дают оснований предполагать, что определение адгезивное™ УПМ может иметь прогностическое значение.

Изучена антилизоцимная активность 178 штаммов УПМ. Большинство выделенных условно-патогенных микроорганизмов обладали ею - 123 штамма, что составляет 69,1 %. Из 87 штаммов грамот-рицательных микроорганизмов антилизоцимная активность выявлена у 64 культур (73,6 % грамотрицательных микроорганизмов), что значительно выше, чем у грамположительных микроорганизмов. Среди штаммов Candida spp. 22 оказались активны (75,9 % штаммов).

При анализе частоты встречаемости антилизоцимной активности у разных видов УПЭ максимальная выраженность данного признака выражена у гемолитических штаммов E.coli - 18 штаммов (94,7 %), Enterobacter spp. - 15 (78,9 %), Klebsiella spp. - 75,9 %. что соответствует данным литературы. Наименьшую активность проявляли штаммы Citrobacter spp. и гемолитические штаммы Enterococcus spp. - в 30 % и 40 % случаев соответственно. Полученные данные указывают на то, что УПМ обладают разным уровнем антилизоцимной активности, однако это часто встречающийся признак, он прогнозируем и не может быть рекомендован для обязательного определения при оценке степени агрессивности УПМ, выделенных при дисбактериозе.

Пробиотики часто служат основным средством для подавления УПМ и коррекции численности резидентной микрофлоры. Наиболее часто применяются препараты на основе бифидо- и лактобактерий. Они должны обладать определенным набором свойств, чтобы конкурировать с УПМ и успешно колонизировать биотоп. К их числу относят антагонистическую активность и способность к адгезии к эпителию.

Для оценки антагонистической активности пробиотических штаммов использовали различные вариации метода отсроченного антагонизма (метод штрихов, метод перевернутого агара, метод двуслойного агара) и метод прямого совместного культивирования (капельная методика). Последнюю методику использовали также с целью оценки антагонистической активности УПМ по отношению к пробиотическим штаммам. В качестве тест-культур изучали 110 штаммов УПМ: по 20 штам-

мов Enterobacter spp., Klebsiella spp., Citrobacter spp., S.aureus, «атипичной» E.coli и 10 штаммов P.aeruginosa.

При определении антагонизма пробиотических препаратов методом штрихов выявлено незначительное количество чувствительных штаммов УПМ. В отношении штаммов Klebsiella spp антагонистическая активность пробиотических препаратов варьировала от 0 до 15%, в отношении изолятов Citrobacter spp , S.aureus и «атипичной» E.coli от 0 до 10%, среди Enterobacter spp чувствительных штаммов выявлено не было.

Достоинством испытанной методики является очевидная простота. Однако такой подход не позволяет одновременно оценить антагонистическую активность обоих испытуемых микроорганизмов - про-биотика и УПМ, выделенного от данного пациента.

Метод перевернутого агара [Арзуманян В.Г. и соавт., 2005] применяли в нашей модификации: количество микроорганизмов определяли по методу Gold. Препараты бифидобактерий проявляли выраженную антагонистическую активность в отношении Klebsiella spp. (60-100%), «атипичной» E.coli и S.aureus (25-100%). В отношении штаммов Enterobacter spp. и Citrobacter spp. эффективность различных препаратов бифидобактерий была нестабильной - от 0 до 100 %. Эффективность препаратов лактобактерий независимо от группы УПМ была существенно ниже - 0—45 %.

Метод двуслойного агара [Ермоленко Е.И. и соавт., 2004] использовали в модифицированном нами варианте: на поверхность верхнего слоя приготовленного по стандартной методике агара засевали мерно тест - культуры УПМ по методике Gold. В опыте использованы 10 штаммов пробиотических препаратов лакто- и бифидобактерий. Тестировали по 20 штаммов Enterobacter spp., Klebsiella spp., Citrobacter spp., S.aureus, «атипичной» E.coli. Мощность антагонистического воздействия пробиотических штаммов оценивали по степени интенсивности подавления штаммов УПМ по сравнению с контролем в 3 степенях: 1 - подавление на 1-2 lg, 2 - на 3-4 lg, 3- на 5 и более lg.

Закономерностей в эффективности подавления различных УПМ тем или иным биопрепаратом не выявлено. Антагонистическая активность пробиотических лактобактерий в отношении штаммов Klebsiella spp. варьировала от 30 до 75 %, Enterobacter spp. от 15 до 70 %, Citrobacter spp. от 0 до 70 %, «атипичной» E.coli от 25 до 90 % и S.aureus от 20 до 45 %; Активность пробиотических бифидумбактерий была так же нестабильной и варьировала в отношении штаммов Klebsiella spp. от 25 до

100 %, Enterobacter spp. от 20 до 75 %, Citrobacter spp. от 0 до 90 %, «атипичной» E.coli от 0 до 60% и S.aureus от 0 до 100 %.

Для оценки взаимного влияния пробиотиков и УПМ использовали метод прямого совместного культивирования [Глушанова H.A. и соавт., 2004], позволяющий определить следующие варианты взаимодействия пробиотика с УПМ:

1) подавление УПМ, 2) угнетение роста пробиотика или 3) отсутствие взаимного влияния.

В подавляющем большинстве случаев (73,1 % из 550 тестов) отсутствовало взаимное влияние пробиотика и УПМ. Подавление пробиотика УПМ отмечено в 9,4 %, а подавление УПМ пробиотиком в 17,5 %. По-видимому, каждый штамм УПМ, выделенный при дисбак-териозе в значимом количестве, нуждается в проверке антагонистических свойств в отношении штаммов пробиотиков. В противном случае применение пробиотиков становится неэффективным.

Обращает на себя внимание несовпадение результатов тестирования одного и того же пробиотика в отношении одного и того же набора штаммов УПМ при использовании разных методов выявления антагонистической активности (таб. 1).

Таблица 1

Выявление антагонистической активности пробиотических лакто- и бифидумбактерий разными методами

Метод Общее количество культур Общее количество культур

или их чувствительных к пробио- чувствительных к пробио-

сочета- тическим лактобактериям тическим бифидубактери-

ние* в методе, абс. (%) ям в методе, абс. (%)

1 23 (4,6) 10(2)

2 100(18,2) Не проводили**

3 97 (19,4) 260 (52)

4 233 (46,6) 260 (52)

5 327 (65,4) 413(82,6)

Примечание:

* 1 - метод перпендикулярных штрихов, 2 - метод совместного культивирования, 3 - метод перевернутого агара, 4 - метод двуслойного агара, 5 - все методы одновременно;

** - данный метод не использовался для определения антагонизма пробиотических бифидумбактерий

По всей видимости, это связано с многообразной природой антагонизма: накопление в среде культивирования органических кислот (молочной, муравьиной, уксусной) и изменение рН, разная скорость размножения, конкуренция за пищевой субстрат, выработка лизоцима, бактериоцинов, других биологически активных веществ и др. Поэтому, применяя один метод определения антагонизма пробиотика, затруднительно судить о достоверности получаемых результатов, а отрицательный результат не означает отсутствие активности. Одновременное использование нескольких методов определения антагонистической активности повышает эффективность выбора препарата для коррекции микрофлоры кишечника. При этом в случае даже одного положительного результата можно говорить о наличии антагонистической активности пробиотика к изучаемому штамму микроорганизма.

Каждый штамм лактосодержащих пробиотиков нами оценивался четырьмя методиками, а бифидумсодержащих тремя. Антагонистическая активность пробиотиков, содержащих лактобактерии была выявлена с помощью хотя бы одного метода у «Лактобактерина», «Мик-роген», Пермь по отношению к 49 % протестированных штаммов УПМ, у «Лактобактерина», «Имбио», Нижний Новгород - 61%, «Лактобактерина», «Иммунопрепарат», Уфа -49% , «Нормофлорина-Л» -83 %, лактобактерий из йогурта «Актимель» - 80 %.

Антагонистическая активность пробиотиков, содержащих бифидо-бактерии была выявлена с помощью хотя бы одного метода у «Бифи-думбактерина», «Микроген», Пермь, и «Бифидумбактерин», «Экопо-лис», Ковров по отношению к 100 % протестированных штаммом УПМ, - «Бификола» - 65 %, «Нормофлорина-Б» - 84 %, «Бифиформа» - 66 %.

В связи с вышеизложенным, рекомендуется использовать несколько методик определения антагонизма, например, капельную методику, методику перевернутого агара и двуслойного агара, а в случае выявления даже одного положительного результата в одном из методов можно говорить о наличии антагонистической активности данного пробиотика к данному штамму микроорганизма.

Одним из важных требований к препаратам пробиотиков является их адгезивная активность [Брилис В.И. и соавт., 1982; Бершад-ская Е.Д. и соавт., 1986; всЫИи^ег и. е1 а1., 2005]. Предполагается, что эффективность адгезии и дальнейшего приживления пробиотиче-ских штаммов зависит от соответствия рецепторов штамма пробиотиков рецепторам эпителиальных клеток.

Оценивали адгезивную активность пробиотических штаммов к эпителиальным клеткам конкретных пациентов с использованием 10 коммерческих препаратов. Объектом адгезии служили клетки кишечного эпителия, забранные с помощью ректальной петли. Параллельно использовали буккальный эпителий этих же больных, чтобы сравнить степень адгезии на двух типах эпителия и оценить возможность использования буккапьного эпителия вместо кишечного в качестве тест-объекта.

При сравнительном анализе различий в результатах, полученных на сопоставляемых тест-объектах (буккальном и кишечном эпители-ях), взятых у 11 пациентов, проводили с помощью двухвыборочного Р-теста для дисперсии для каждого препарата и каждого пациента отдельно, учитывая количество адгезированных микроорганизмов на каждой из пяти клеток одного вида эпителия. В настоящем исследовании было показано, что в 94,4 % случаях (в 85 опытах) была доказана недостоверность различий между двумя выборками, степень прикрепления к разным видам эпителия одно пациента была сопоставима (Б-критерий составил от 0,004 до 6,205 при критическом Р=7,71; а=0,05 («П7 = 5, критерий односторонний). Для определения силы взаимосвязи между количеством адгезированных пробиотических микроорганизмов на буккальном и кишечном эпителиях результаты обрабатывали методами корреляционного анализа - определения коэффициента корреляции Пирсона (г) и Спирмена (р). Наблюдалась сильная достоверная корреляционная взаимосвязь между степенью адгезии к буккальному и кишечному видам эпителия: коэффициент линейной корреляции (г) колебался от 0,7 до 1, коэффициент ранговой корреляции Спирмена - от 0,6 до 1 (Р >0.05).

Таким образом, независимо от типа препарата, степень его адгезии зависит не столько от типа эпителия, сколько от соответствия рецепторам эпителия конкретного пациента, что свидетельствует о возможности использования оценки степени адгезии пробиотических штаммов лакто- и бифидобактерий к клеткам буккального эпителия для представления об их адгезивной способности по отношению к кишечному эпителию пациента.

Проверяли адгезивность пяти биопрепаратов лактобактерий и пяти бифидумбактерий к буккальному эпителию 20-ти пациентов (200 опытов). Интенсивность адгезии пробиотических микроорганизмов оценивали в баллах от 1 до 5 в зависимости от количества прикрепившихся микроорганизмов. В целом адсорбция экзогенных лакто- и бифидобактерий достаточно низка и находится в пределах 1-2 баллов.

Для оценки значимости разницы степени адгезии разных пробио-тических препаратов к эпителию больного использовали однофак-торный дисперсионный анализ. Было доказано, что каждый из про-биотических штаммов обладает индивидуальной адгезивной активностью (Р-критерий составил от 3,5 до 45; при Р критическом равном 3,48; а=0,05; сП7 = 5, критерий односторонний) (рис. 1).

л! л2 лЗ л4 л5 61 62 63 64 65 пробиотические препараты

■ больной А (исследование № 246) □ больной Б (исследование № 250)

Л1, Л2, ЛЗ, Л4, Л5 - пробиотические препараты, содержащие лакто-бактерии;

Б1, Б2, БЗ, Б4, Б5 - пробиотические препараты, содержащие бифидо-бактерии

Рис. 1. Сравнение адгезивной активности пробиотиков к буккальному эпителию разных пациентов.

Для оценки биосовместимости лактобактерий и бифидумбакте-рий, входящих в состав коммерческих пробиотических препаратов, и индигенных лакто - и бифидумбактерий, выделенных от больных с дисбиозом толстого кишечника, использовали метод совместного культивирования на плотной питательной среде [Глушанова H.A., Шендеров Б.А, 2005]. В сумме подавление индигенных лактобактерий пробиотическими штаммами было зарегистрировано в 53,8 % случаев, а бифидобактерий - в 33,1 % (таб. 2).

Таблица 2

Взаимоотношения индигенных лактобактерий и бифидумбактерий с пробиотическими штаммами при их совместном культивировании

Подавление роста индигенных штаммов «Лактобактерин» Пермь «Лактобактерин» Н.Новгород «Лактобактерин» У<Ьа «Нормофлорин-Л» 2 ч и ё к ё < н п. ь о « «Бифидумбакте-рин»Пермь ■ «Бифидумбакте-рин»Ковров «Бификол» «Нормофлорин-Б» «Бифиформ»

Лакто- 2 2 13 12 11 12 13 2 11 8

бактерий (13) (13) (81) (75) (69) (75) (81) (25) (68) (50)

абс. (%)

Бифидо-бактерий абс. (%) 3 (25) 2 (17) 7 (58) 8 (66) 5 (41) 7 (58) 8 (66) 3 (25) 5 (41) 5 (41)

Таким образом, для прогнозирования эффективности того или иного пробиотического препарата в отношении конкретного пациента рекомендуется проводить комплексное лабораторное тестирование нескольких пробиотиков по следующим направлениям:

1) определение антагонистической активности пробиотических штаммов несколькими способами в отношении условно-патогенного микроорганизма, выделенного от конкретного пациента;

2) определение адгезивной активности пробиотических штаммов с использованием буккального эпителия конкретного пациента;

3) определение биосовместимости пробиотических и индигенных лакто- и бифидумбактерий.

Для подавления избыточной численности УПМ могут применяться антибиотики и бактериофаги. Для оценки оправданности их применения проанализированы антибиотико- и фагорезистентность выделенных при дисбактериозе толстого кишечника УПМ. В результате оценки 256 штаммов показано, что антибиотикорезистентные УПМ встречаются относительно редко, но спектр антибиотикорези-стентности отдельных видов не предсказуем. Среди энтеробактерий наиболее высокие уровни резистентности зарегистрированы по отношению к ампициллину и тетрациклину (более 30 % устойчивых

штаммов), среди S.aureus - по отношению к бензилпенициллину, макролидам и тетрациклину (более 15 % устойчивых штаммов).

Для оценки целесообразности применения бактериофагов для лечения дисбактериоза определяли чувствительность УПМ к моно- и комбинированным препаратам бактериофагов, присутствующим в настоящее время на отечественном рынке. Следует обратить внимание на то, что одна и та же культура может отличаться по чувствительности к препаратам с одинаковым названием, но выпускаемыми разными производителями, поэтому назначение фагов без предварительного определения чувствительности может привести к неэффективности терапии.

Контроль эффективности фаготерапии предварительно подобранными фагами был проведен у 25 больных. При повторном исследовании, проведенном спустя 2 недели после лечения подобранными бактериофагами, элиминации удалось достигнуть у 80 % обследуемых, а у 12 %) снизился титр ранее выделенных УПМ.

Для коррекции измененного микробиоценоза кишечника нередко используют эубиотики. Наиболее часто в состав эубиотиков входят представители рода Bacillus.

Антагонистическую активность бацилл оценивали на примере штамма Bacillus cereus, входящего в состав препарата «Бактисубтил» (Франция) - одного из наиболее широко применяемого во многих странах. В качестве тест-культур изучали штаммы УПМ, изолированные от пациентов с дисбактериозом толстого кишечника - по 20 изо-лятов S.aureus, S.epidermidis, Klebsiella spp., E.coli с типичными свойствами, E.coli с измененной ферментативной активностью, Enterobacter spp., Citrobacter spp., P.aeruginosa.

При определении антагонизма бацилл методом штриха изучаемый штамм В.cereus не проявлял активности в отношении ни одной из тест-культур. Некоторые активно подвижные штаммы УПМ (P.aeruginosa и E.coli) росли на поверхности бациллярных колоний.

Считается, что метаболиты бацилл оказывают более мощное антагонистическое действие, нежели живые культуры, поэтому использовали методику отсроченного антагонизма с промежуточной убив-кой штамма-продуцента хлороформом [Блинкова Л.П., 2003]. При наличии способности продуцировать бактериоцины должна наблюдаться зона ингибиции роста тест-штамма вокруг колонии B.cereus. Антагонистическая активность бацилл не выявлена, т.к. отмечался рост тест-культур УПМ «газоном» на поверхности среды с предпола-

гаемыми бактериоцинами. Аналогичные данные были получены методом двуслойного агара с посевом бацилл газоном с последующей убивкой и наслаиванием тест-культуры УПМ.

В связи с этим нами была разработана методика определения антагонистической активности путем высева на плотную среду после совместной инкубации штамма-продуцента и тест-культуры в физиологическом растворе. Предложена плотная питательная среда для подавления эубиотического штамма B.cereus без ущерба для всхожести тест-культур.

1 мл суспензии тест-культур УПМ в физиологическом растворе в концентрации 109 клеток по ОСО мутности смешивали с 1 мл суспензии Bacillus cereus в такой же концентрации. Во избежание размножения бацилл или УПМ использование любых жидких питательных сред для совместной инкубации сочли нецелесообразным. Смесь инкубировали 48 ч при 37"С. Предполагалось, что в течение этого времени происходило отмирание УПМ под влиянием метаболитов бацилл. Проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold. Высевали на питательный агар с антибиотиками для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Для исключения других возможных факторов подавления роста УПМ и бацилл (отсутствие питательной основы) параллельно проводили контрольный высев монокультур после инкубации в аналогичных условиях.

С использованием предложенной среды с антибиотиком изучали антагонизм Bacillus cereus и 96 культур УПМ, выделенных в значимом количестве при диагностике дисбактериоза кишечника: Citrobacter spp. (16 штаммов), Klebsiella spp. (17), S.aureus (18), Enterobacter spp. (15), типичная E.coli (15), E.coli с атипичными свойствами (15). Следует отметить, снижение количества УПМ было незначительным - на 0,5-2 lg. Устойчивыми и даже способными к размножению в присутствии эубиотика оказались 79,0 % (81 изолят) испытуемых штаммов. Т.к. эубиотики не предназначены для заселения кишечного биотопа и подразумевается, что их действующим началом является способность к мощному антагонизму, выбор эубиотика, вероятно, должен быть лабораторно обоснованным и дифференцированным в зависимости от спектра его антагонистической активности.

ВЫВОДЫ:

1. Глубина дисбиотических нарушений во многом определяется условно-патогенными микроорганизмами и их ассоциациями. Наиболее часто при дисбиотических состояниях в испражнениях увеличивается численность условно-патогенных энтеробактерий (59 % случаев), в том числе Enterobacter spp. (35 % от общего числа находок условно-патогенных энтеробактерий), Klebsiella spp. (24,8 %), Citrobacter spp. (23,5 %), Proteus spp. - (10,8 %).

2. Ряд штаммов условно-патогенных бактерий выделенных от больных с дисбактериозом обладал важными факторами колонизации: адгезивными свойствами и антилизоцимной активностью. Наиболее высокая адгезивность была выявлена у стафилококков. Штаммы с антилизоцимной активностью были выделены у E.coli (94,7%), коагулазоотрицательных стафилококков (78,6%), клебсиелл (75,9%), грибов рода кандида (75,9%) и гемолитических штаммов стафилококков (60,6%).

3. Выбор пробиотических препаратов должен основываться на предварительном лабораторном тестировании, включающее определение адгезивных свойств препарата к клеткам эпителия пациента, антагонистических свойств по отношению к индигенным штаммам -представителям его микрофлоры и условно-патогенным микроорганизмам, количество которых избыточно.

4. Уровень чувствительности выделяемых при дисбактериозах условно-патогенных бактерий к антибактериальным препаратам, бактериофагам и эубиотикам является штаммовым признаком, что требует лабораторного тестирования каждого изолята перед назначением лекарственного препарата для его элиминации.

5. Назначению бактериофага обязательно должно предшествовать лабораторное тестирование выделенных штаммов на фагорези-стентность с препаратами нескольких производителей. Коммерческие препараты лечебных бактериофагов активны в отношении большинства штаммов соответствующих им условно-патогенных бактерий. Их применение позволило в 80% случаев добиться элиминации, а в 12% -снижения численности нежелательных микроорганизмов.

Практические рекомендации

1. При исследовании испражнений с целью выявления дисбио-тических изменений необходимо особое внимание уделять условно-патогенным микроорганизмам.

2. Назначению пробиотиков должно предшествовать их лабораторное тестирование:

a) Для определения адгезивной активности целесообразно использовать буккальный эпителий пациента;

b) Антагонизм пробиотика к индигенным бифидум- и лактобак-териям оптимально определять методом биосовместимости;

c) Для выявления антагонистического действия пробиотика на условно-патогенные бактерии оптимальным является параллельное использование двух или более методов: перевернутого агара, двуслойного агара и капельной методики.

3. Для коррекции дисбиотических состояний целесообразно использовать коммерческие препараты бактериофагов. При лабораторной диагностике дисбактериоза целесообразно определять чувствительность выделенных условно-патогенных энтеробактерий одновременно к нескольким коммерческим препаратам бактериофагов соответствующей специфичности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Нилова Л.Ю. Возможность использования лечебного питания для коррекции нарушений микробиоценоза кишечника больных гастроэнтерологической патологией / Н.В. Барышникова, В.В.Петренко, H.A. Орлова, Е.А. Нилова, Л.Ю. Нилова. // Врач-Провизор-Пациент 2005: материалы 3-й Санкт-Петербургской Медицинской Ассамблеи. -СПб, 2005.-С. 10-11.

2. Нилова Л.Ю. Оценка эффективности пробиотика "Ламинолакт" в лечении больных хроническим гастродуоденитом и дисбиозом кишечника / Н.В. Барышникова, H.A. Лоева, Е.А. Оришак, Л.Ю. Нилова //Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. -2006. - № 1-2. - С. М12.

3. Нилова Л.Ю. Здоровье и болезнь: клинико-микробиологические особенности микробиоценоза кишечника / Ю.П. Успенский, Н.В. Барышникова, Е.А. Оришак, Л.Ю. Нилова, Л.Н. Белоусова // Донозоло-гия - 2006. Проблемы диагностики и коррекции состояния здоровья в напряженной экологической среде обитания: материалы второй международной научной конференции, посвященной 80-летию со дня рождения академика АМН СССР (РАМН), профессора Г.И. Сидоренко, СПб, 2006. - С. 56-58.

4. Нилова Л.Ю. Бактериофаги: монография / А.Г. Бойцов, В.П.Иванов, О.Н. Ластовка, A.A. Порин, К.Г. Косякова, Л.Ю. Нилова/ под ред. В.П. Иванова. - СПб: СПбГМА им И.И. Мечникова.-2006. - 100 с.

5. Нилова Л.Ю. Фаготерапия дисбактериоза кишечника / Л.Ю. Нилова, Е.А. Оришак, С.Л. Ильинская // Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова - 2007. - №1. (приложение) - С. 152-153.

6. Нилова Л.Ю. Дисбактериоз: проблемы и возможные пути решения / А.Г. Бойцов, ЕА. Оришак, Л.Ю. Нилова. // Материалы Всероссийской научной конференции «Современные проблемы медицинской микробиологии» (ХХХХ юбилейная конференция "Хлопинские чтения"), СПб, 2007. - С.33-38.

7. Нилова Л.Ю. Оценка микробного пейзажа при дисбактериозе кишечника у взрослых и детей / Л.Ю. Нилова // Материалы Всероссийской научной конференции «Современные проблемы медицинской микробиологии» (ХХХХ юбилейная конференция "Хлопинские чтения"), СПб,

2007.-С. 235-237.

8. Нилова Л.Ю. Рекомендации по ведению преаналитического этапа микробиологических лабораторных исследований: учебно-методическое пособие / А.Г. Бойцов, Л.А. Кафтырева, О.Н. Ластовка, Ю.А. Чугунова, Л.Ю. Нилова, A.M. Пустынникова, В.Л. Эмануэль; под. ред. А.Г. Бойцо-ва.-Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2007 - 64 с.

9. Нилова Л.Ю. К вопросу о применении бактериофагов при дисбактериозе толстого кишечника / Л.Ю. Нилова, Е.А. Оришак // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - СПб, 2008. - № 2, Ч. I. (приложение) - С. 128-129.

10. Нилова Л.Ю. Дисбиотические нарушения микрофлоры толстого кишечника: проблемы диагностики и коррекции / А.Г. Бойцов, Л.Ю. Нилова, Е.А. Оришак // Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова. -

2008.-№3,-С. 120-123.

11. Нилова Л.Ю. К вопросу о применении пробиотиков для коррекции дисбактериоза толстого кишечника / Л.Ю. Нилова, А.Г. Бойцов, Е.А. Оришак // Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова. - 2008. - №3. - С. 154-157.

ЛР № 020365 Подписано в печать 29.01.2009 г. Заказ № 39 Формат бумаги 60 х 84/16. Тираж 100 экз. Усл.п.л. 1,0 Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Типография ООО «КАРО» Санкт-Петербург, Красногвардейская пл. д. 3

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Нилова, Людмила Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ ПРИ ДИСБАКТЕРИОЗЕ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА И МЕТОДЫ ИХ ЭЛИМИНАЦИИ.

1.1 Дисбактериоз толстого кишечника у детей и взрослых.

1.2. Коррекция дисбактериоза толстого кишечника.

1.2.1. Антибиотикотерапия.

1.2.2 Фаготерапия.

1.2.3. Применение пробиотиков.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Объем исследований.

2.2 Питательные среды.

2.3 Методы микробиологических исследований.

2.4 Методы статистической обработки результатов исследований.

ГЛАВА 3 УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ ПРИ

ДИСБАКТЕРИОЗЕ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА.

ГЛАВА 4 СВОЙСТВА УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ПРИ ДИСБАКТЕРИОЗЕ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ИХ КОЛОНИЗАЦИОННУЮ АКТИВНОСТЬ.

4.1 Адгезивные свойства условно-патогенных микроорганизмов.

4.2 Антилизоцимная активность условно-патогенных микроорганизмов

ГЛАВА 5 СВОЙСТВА УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ,ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГОПРИМЕНЕНИЯ ПРОБИОТИКОВ.

5.1 Антагонистические взаимодействия условно-патогенных микроорганизмов и лакто- и бифидобактерий, входящих в состав пробиотиков.

5.2. Адгезивные свойства лакто- и бифидобактерий, входящих в состав пробиотиков.

5.3. Биосовместимость микроорганизмов, входящих в состав препаратов, применяемых для коррекции дисбактериоза толстого кишечника, с микроорганизмами - представителями нормальной микрофлоры толстого кишечника.

ГЛАВА 6 СВОЙСТВА УСЛОВНО ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ТАКТИКУ ВЫБОРА ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ДИСБАКТЕРИОЗА ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА.

6.1 Антибиотикорезистентность условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза толстого кишечника.

6.2 Фагорезистентность условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза толстого кишечника.

6.3 Антагонистические свойства бацилл, входящих в состав эубиотиков, в отношении условно-патогенных микроорганизмов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза толстого кишечника"

Актуальность проблемы.

Так, профессор А.Н. Маянский [1999] пишет: «Фактически это дорогостоящее (тем более, что тестирование рекомендуется делать в динамике), трудоемкое исследование с невысокой (если не с нулевой) отдачей. Принимая во внимание огромный опыт такого рода исследований, представляется возможным почти безошибочно ставить регламентированный инструкциями диагноз "дисбактериоз", опираясь на клинику». С ним солидарны и многие гастроэнтерологи, подчеркивающие, что препараты типа «Лактулоза», «Би-фидумбактерин», «Хилак», а также многие другие, способствующие нормализации состава микрофлоры можно назначить и, не зная количества лакто-бактерий и бифидобактерий в испражнениях. В то же время, действующий ОСТ 91500.11.0004-2003 провозглашает: «Поскольку дисбактериоз кишечника в ряде случаев протекает бессимптомно, решающее значение при постановке диагноза имеют микробиологические показатели».

Существующее мнение о безвредности пробиотиков для пациента в настоящее время поколеблено [Besselink M.G.H. et al., 2008; Vleggaar F.P. et al., 2008], а литературные данные об их эффективности не однозначны [Watlcin-son P.J. et al., 2007]. Установлено, что пробиотические препараты могут подавлять индигенные лактобациллы пациента [Глушанова Н.А., Шендеров Б.А., 2005]. Способность к адгезии к эпителиальным клеткам хозяина — признанный тест при отборе потенциальных штаммов пробиотиков [Dunne С. et al., 2001]. Однако, адгезивная активность - сугубо индивидуальное свойство: штамм пробиотика, обладающий высокой адгезией к эпителию пациентки «А», может практически не прикрепляться к эпителию «Б» [Бойцов А.Г. и соавт., 2004].

Задачи исследования:

3. Выбор методов определения чувствительности УПМ к антагонистической активности пробиотических микроорганизмов и B.cereus.

4. Определение чувствительности УПМ к антибиотикам, бактериофагам, антагонистической активности пробиотических микроорганизмов и B.cereus.

Научная новизна:

Сопоставлены спектры условно-патогенных микроорганизмов, выделяемых при дисбактериозе толстой кишки различного гецеза. Впервые изучена адгезивность УПМ, выделенных у больных с дисбактериозом толстого кишечника, по отношению к собственным эпителиальным клеткам. Получена новая информация о чувствительности УПМ указанного происхождения к антибиотикам, бактериофагам и об их антилизоцимной активности. Дана оценка значимости адгезивных и антагонистических свойств пробиотических штаммов, влияющих на эффективность коррекции дисбактериоза толстого кишечника.

Практическая значимость:

Предложены схемы выбора препаратов для коррекции дисбактериоза толстого кишечника на основании данных бактериологического исследования. Показана необходимость внедрения в работу бактериологических лабораторий индивидуального подбора препаратов для коррекции дисбактериоза толстого кишечника. Показана эффективность фаготерапии при определении чувствительности к бактериофагам до начала лечения. Предложена методика определения антагонистической активности бацилл, входящих в состав эу-биотиков. Рекомендованы методы определения антагонистической активности пробиотических микроорганизмов и B.cereus.

Дана оценка значимости адгезивных и антагонистических свойств пробиотических штаммов и B.cereus, влияющих на эффективность коррекции дисбактериоза толстого кишечника.

Материалы работы внедрены в работу бактериологической лаборатории больницы Петра Великого и Санкт-Петербургского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Пастера.

Получены удостоверения на рационализаторское предложение № 1804, № 1805, № 1806, принятые ГОУВПО СПбГМА им. И.И. Мечникова 05.12.2008 г. к использованию под наименованиями: «Способ определения in vitro адгезивной активности пробиотических препаратов, содержащих лакто-и бифидумбактерии, используемых для коррекции дисбиоза толстого кишечника»; «Способ индивидуального подбора in vitro пробиотических препаратов, содержащих лакто- или бифидумбактерии для коррекции дисбиоза толстого кишечника на основе антагонистической активности, адгезивной активности и биосовместимости»; «Способ индивидуального подбора in vitro пробиотических препаратов, содержащих лакто- или бифидумбактерии для элиминации условно-патогенных микроорганизмов при дисбиозе толстого кишечника на основе антагонистической активности».

Кроме того, результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры микробиологии, иммунологии и вирусологии ГОУВПО СПбГМА им. И.И. Мечникова для врачей-интернов, ординаторов и слушателей факультета усовершенствования врачей.

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Разработана схема лабораторного тестирования для выбора препаратов пробиотиков, основанная на определении адгезивных свойств препарата к клеткам эпителия пациента, антагонистических свойств по отношению к индигенным штаммам - представителям его микрофлоры и условно-патогенным микроорганизмам, количество которых избыточно. Осуществлен выбор оптимальных методов тестирования.

Пастера и 120 летию Парижского института Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008), а также в выступлении на 6-й международной Германо-Российской конференции Кох-Мечников «От Ильи Мечникова и Пауля Эрлиха к современным достижениям медицинской науки и практики» (Санкт-Петербург, 2008).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Нилова, Людмила Юрьевна

ВЫВОДЫ:

1. Глубина дисбиотических нарушений во многом определяется условно-патогенными микроорганизмами и их ассоциациями. Наиболее часто при дисбиотических состояниях в испражнениях увеличивается численность условно-патогенных энтеробактерий (59% случаев), в том числе Enterobacter spp. (35% от общего числа находок условно-патогенных энтеробактерий), Klebsiella spp. (24,8%), Citrobacter spp. (23,5%), Proteus spp. - (10,8%).

3. Выбор пробиотических препаратов должен основываться на предварительном лабораторном тестировании, включающее определение адгезивных свойств препарата к клеткам эпителия пациента, антагонистических свойств по отношению к индигенным штаммам - представителям его микрофлоры и условно-патогенным микроорганизмам, количество которых избыточно.

5. Назначению бактериофага обязательно должно предшествовать лабораторное тестирование выделенных штаммов на фагорезистентность с препаратами нескольких производителей. Коммерческие препараты лечебных бактериофагов активны в отношении большинства штаммов соответствующих им условно-патогенных бактерий. Их применение позволило в 80% случаев добиться элиминации, а в 12% - снижения численности нежелательных микроорганизмов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. При исследовании испражнений с целью выявления дисбиотических изменений необходимо особое внимание уделять условно-патогенным микроорганизмам.

2. Назначению пробиотиков должно предшествовать их лабораторное тестирование: a. Для определения адгезивной активности целесообразно использовать буккальный эпителий пациента; b. Антагонизм пробиотика к индигенным бифидум- и лактобакте-риям оптимально определять методом биосовместимости; c. Для выявления антагонистического действия пробиотика на условно-патогенные бактерии оптимальным является параллельное использование двух или более методов: перевернутого агара, двуслойного агара и капельной методики.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Нилова, Людмила Юрьевна, Санкт-Петербург

1. Альтшуллер М.Л. Обнаружение штаммов-антагонистов у представителей родов Bacillus и Hafnia / М.Л. Альтшуллер, Л.П. Блинкова, А.П. Ба-туро // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии 1993. - № 6. - С. 22-23.

2. Ананьева Н.В. Влияние экзополисахаридов на стрессоустойчивость пробиотических культур / Н.В. Ананьева, В.И. Ганина // Клиническое питание. 2007 - № 1-2. - С. А20.

3. Количественный способ оценки отсроченного антагонизма пробиотических культур против оппортунистических дрожжей / В.Г. Арзуманян, Н.А. Михайлова, А.А. Гайдеров, И.А. Баснакьян, И.Г. Осипова // Клиническая лаб. диагностика. 2005. - №5. - С. 53-54.

4. Изучение антагонистического действия лактобацилл на Helicobacter pylori / Л.Г. Баженов, В.М. Бондаренко, Е.А. Лыкова, Д.К. Огай // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии 1997. - № 3. - С. 89-91.

5. Пат. 2182172 РФ МПК А 01 Н 63/00, А 61 К 35/66. Штамм бактерий Bacillus subtilis, обладающий широким спектром антагонистическойактивности / Ф.А. Байгузина, Т.Н. Кузнецова, С.Н. Байгузина. -№ 2001108901/13; заявл. 05.04.2001; опубл. 10.05.2002, Бюл. 14.

6. Новые возможности диагностики и лечения дисбиотических нарушений у детей / М.В. Барсукова, В.Ф. Демин, Л.И. Ильенко, А.А. Султанова, Н.Б. Таищева, И.Н. Холодова // Русский медицинский журнал -2003.-Т. 11., №20.-С. 1124-1126.

7. Бельмер С.В. Антибиотик-ассоциированный дисбактериоз кишечника / С.В. Бельмер // Русский медицинский журнал 2004. - Т 12., № 3. -С. 148-152.

8. Бельмер С.В. Микроэкология кишечника: методы неспецифической коррекции / С.В. Бельмер, А.И. Хавкин // Русский медицинский журнал 2003. - Т. 11, № 13. - С. 772-776.

9. Стандартизация реакции прямой гемагглютинации, вызываемой бактериями рода Lactobacillus / Е.Д. Бершадская, Н.Г. Фиш, П.П. Шевьев,

10. B.И. Огарков. / Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1986.-№ 8. - С. 69-71.

11. Блат С.Ф. Подходы к коррекции микроэкологических нарушений /

12. C.Ф. Блат. // Русский медицинский журнал. 2007. -Т 15, № 1. - С. 5052.

13. Бактериоцины и бактериоциноподобные вещества как биологически активные средства / Л.П. Блинкова, М.Л. Альтшулер, О.Б. Горобец, Е.С. Дорофеева // Клиническое питание. 2007. - №1-2. - С. А22.

14. Антагонистическая активность свежевыделенных штаммов бактерий рода Bacillus / Л.П. Блинкова, и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1994. - N 5. - С. 71-75.

15. Блинкова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления / Л.П Блинкова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2003. - № 3. - С. 109-113.

16. Бактериофаги: монография / Бойцов А.Г. и др.; под ред. Иванова В.П.; СПбГМА им. И.И. Мечникова. СПб., 2007. - 100 с.

17. Бойцов А.Г. Ошибка измерений при диагностике дисбиозов /

18. A.Г. Бойцов, О.Н. Ластовка, Е.А. Нилова // Клиническая лаб. диагностика-2001.-№ 10.-С. 22.

19. Адгезия лактобактерий к клеткам вагинального и буккального эпителия / А.Г. Бойцов, С.В. Рищук, Ю.Ю. Ильясов, Т.А. Гречанинова // Вестник СПбГМА им. И.И.Мечникова 2004. - № 4(5). - С. 191-193.

20. Дисбактериозы желудочно-кишечного тракта / В.М. Бондаренко, Б.В. Боев, Е.А. Лыкова, А.А. Воробьев // Российский журнал гастроэн-терол., гепатологии, колопроктологии. 1998. - №1. - С. 66-70.

21. Бондаренко В.М. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией /

22. B.М. Бондаренко, А.А. Воробьев // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2004. - № 1. - С. 84-92.

23. Адгезивные и гемагглютинирующие свойства лактобацилл / В.И. Бри-лис, Т.А. Брилене, Х.П. Ленцнер, А.А. Ленцнер // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1982. - №9. - С. 75-78.

24. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов / В.И. Бри-лис, Т.А. Брилене, Х.П. Ленцнер, А.А. Ленцнер // Лаб. дело. 1986. -№4.-С. 210-212.

25. Некоторые аспекты влияния антибиотиков на адгезивные свойства микроорганизмов и доступная модель его изучения / В.И. Брилис, Т.А. Брилене, Л.А. Левков и др. // Антибиотики и химиотерапия. -1986.-№ 5.-С. 353-357.

26. Возможности коррекции нарушений микробной колонизации у детей первого года жизни / Г.Н. Буслаева, Т.Г. Кац, Л.Я. Никандрова, Н.В. Овечкина, Г.А. Самсыгина // Русский медицинский журнал. -2005. Т13, № 18. - С. 1215-1219.

27. Бухарин О.В. / Лизоцим микроорганизмов / О.В. Бухарин, Н.В. Васильев, Б.Я. Усвяцов. Томск: Изд-во Томского университета, 1985. -214 с.

28. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов, А.П. Малышкин, Н.В. Немцева // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1984. - № 2. - С. 2728.

29. Дисбактериозы актальная проблема медицины / А.А. Воробьев, Н.А. Абрамов, В.М. Бондаренко, Б.А. Шендеров // Вестник РАМН. -1997. -№3. - С. 3-7.'

30. Популяционно-генетические аспекты микробиологического фенотипа кишечника здорового человека / А.А. Воробьев, Ю.В. Несвижский, Е.В. Буданова, Л.О. Иноземцева // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1995. - № 4. - С. 30-35.

31. Сравнительное изучение пристеночной и просветной микрофлоры толстой кишки в эксперименте на мышах / А.А. Воробьев, Ю.В. Несвижский, А.Е. Зуденков, Е.В. Буданова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2001. - № 1. - С.62-67.

32. Гланц С. Медико-биологическая статистика: пер. с англ. / С. Гланц -М.: Практика, 1999. 463 с.

33. Глушанова Н.А. Об антагонизме пробиотических лактобацилл / Н.А. Глушанова, А.И. Блинов, В.В. Бахаев // Эпидемиол. и инфекционные болезни. 2004. - № 6. - С. 37-39.

34. Глушанова Н.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro / Н.А. Глушанова, Б.А. Шендеров // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2005. - №2. - С. 56-61.

35. Бифидофлора человека, ее нормализующие и защитные функции / Г.И. Гончарова и др. // Антибиотики и медицинская биотехнология. -1987. -№3.- С. 179-183.

36. Горелов А.В. Пробиотики: механизмы действия и эффективность при инфекциях желудочно-кишечного тракта / А.В. Горелов, Д.В. Усенко // Эпидемиология и инфекционные болезни 2006. - № 4. - С. 53-57.

37. Грачева Н.М. Пробиотические препараты в терапии и профилактике дисбактериоза кишечника / Н.М. Грачева, В.М. Бондаренко // Инфекционные болезни. 2004. - №2. - С. 53-58.

38. Микрофлора кишечника у больных инфарктом миокарда. / Р.А. Гуре-вич и др. // Лабораторное дело. 1986. - № 1. - С. 44-45.

39. Мировое применение споровых пробиотиков в практике здравоохранения / Д.С. Давыдов. // Клиническое питание. 2007. - № 1-2. - С. А36.

40. Денисенко В.В. Рост молочнокислых бактерий на средах, содержащих желчь / В.В. Денисенко, И.А. Найденко // Клиническое питание. 2007. - № 1-2. - С. А37.

41. Диагностика, прогнозирование течения и лечение острых кишечных инфекций условно-патогенной и смешанной этиологии: метод, рекомендации / А.С. Кветная и др.. JL; - 1990. - 27 с.

42. Дисбактериоз кишечника у детей и микроэкологические подходы к его коррекции: учебно-методическое пособие / М.Д. Субботина и др.; -СПб.: Изд-во ПМИ; 1997. 24 с.

43. Характеристика генновидового разнообразия бифидобактерий у городского населения Иркутской области. / Ю.П. Джиоев и др. // Клиническое питание. 2007. - № 1-2. - С. A38.

44. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл / Е.И. Ермоленко и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2004. - № 5. - С. 94-98.

45. Характеристика микроорганизмов, колонизирующих кишечник человека / Б.А. Ефимов и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2002. - № 5. - С. 98-104.

46. Жихарева Н.С. Дисбактериоз кишечника у детей и пути его коррекции / Н.С. Жихарева, А.А. Коваленко // Русский медицинский журнал. -2007.- Т. 15, № 1. С. 43-48.

47. Жихарева Н.С. Использование пребиотиков в терапии синдрома раздраженного кишечника / Н.С. Жихарева, А.И. Хавкин // Русский медицинский журнал. 2006. - Т 14., № 19. - С. 1384-1386.

48. Жихарева Н.С. Коррекция дисбиотических изменений кишечника у детей на современном этапе / Н.С. Жихарева, А.И. Хавкин // Русский медицинский журнал. 2004. - Т. 12, № 16. - С. 960-964.

49. Завгородняя Е.Ф. Некоторые биологические свойства условно-патогенных бактерий в структуре кишечных микробиоценозов у детей с нарушениями кишечной микроэкологии / Е.Ф. Завгородняя, JI.A. Сташкевич // Клиническое питание. 2007. - № 1-2. - С. А42.

50. Захарова И.Н. Коррекция дисбиоза кишечника у детей / И.Н. Захарова, Н.А. Коровина // Русский медицинский журнал. 2005,- Т. 13,-№ 27. -С.1863-1869.

51. Зыкова Н.А. Новый пробиотический препарат «Трилакт» / Н.А. Зыкова Н.В. Молокеева // Клиническое питание. 2007. - № 1-2. - С. А42.

52. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо / Иванов В.П. и др.. СПб, 2002. -31 с.

53. Иванов В.П. Повышение точности лабораторной диагностики.дисбактериоза / В.П. Иванов, А.Г. Бойцов, Е.А. Нилова // Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова. 2003. - № 1. - С. 75-76.

54. Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры / Н.Ю. Каширская // Русский медицинский журнал. 2000. - Т 8, № 13-14. - С. 572-576.

55. Киселев С.А. Пробиотики: новый подход к механизму терапевтического действия при лечении дисбактериоза кишечника / С.А. Киселев, Д.С. Чичерин // Клиническое питание. 2007. - № 1-2. С. А44.

56. Козлова Е.В. Устойчивость к антибиотикам штаммов лактобацилл / Е.В. Козлова // Журнал антибиотики и химиотерапия. 1992. - Т.37, №6, С. 12-15.

57. Динамика становления микрофлоры здоровых доношенных новорожденных детей / Э.П. Козлова и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1977. - № 2. - С. 73-79.

58. Коршунов В.М. Рациональные подходы к коррекции микрофлоры кишечника / В.М. Коршунов, В.В. Смеянов, Б.А. Ефимов // Вестник РАМН. 1996. - №2. - С. 60-65.

59. Куваева И.Б. Антагонистическая активность микробных популяций защитной флоры и её связи с характеристикой микробиоценоза и факторами питания / И.Б. Куваева, Г.Г. Кузнецова // Журнал вопросы питания. 1993. - № 3. - С. 46-50.

60. Куваева И.Б. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей / И.Б. Куваева, К.С. Ладодо. М., 1991. - 270 с.

61. Кюттер Е. Фаговая терапия: бактериофаги как антибиотики / Е. Кют-тер; пер. с англ. А.В. Иванова; под ред. Н.В. Скрипченко, А.В. Иванова. -СПб, 2001.-41 с.

62. Lebenthal Е. Пробиотики: концепция лечебного применения, ожидающая своего признания / Е. Lebenthal, Y. Lebenthal // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2003. - №4. - С. 88-91.

63. Формирование микрофлоры кишечника у детей первого года жизни / Л.А. Леванова и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2001. - № 4. - С. 47 - 50.

64. Исследование лактофлоры пищеварительного тракта экипажей «Союз-13» и «Салют-4» / А.А. Ленцнер и др. // Журнал космическая биология и авиационная медицина. 1981, - Т. 15, № 4. - С. 39-43.

65. Чувствительность к антибиотикам как дополнительный признак при уточнении видовой принадлежности лактобацилл / А.А. Ленцнер и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 1980, Т. XVI, Вып. 5. -С. 724-728.

66. Исследование чувствительности к антибиотикам лактобацилл из пищеварительного тракта экипажей «Союз-13» и «Салют-4» / А.А. Ленцнер // Журнал космическая биология и авиационная медицина. 1981, -Т.15,№4.-С. 36-39.

67. Лесняк С.В. О свойствах препаратов из нормальной микрофлоры человека / Л.Н. Евтухова, Л.Ф Шимчук, Навашин С.М. // Антибиотики и микроэкология человека и животных / под. ред. Б.А. Шендерова. М., 1988. - С. 136-140.

68. Луппова Н.Е. Логика построения корригирующих медикаментозных программ нарушенного микробиоценоза кишечника у детей / Н.Е. Луппова, В.Ф. Приворотский, О.В. Шильникова // Русский медицинский журнал. 2007. - Т 15, № 1. - С. 52-57.

69. Маянский А.Н. Микробиология для врачей: очерки патогенетической микробиологии / А.Н. Маянский. Н.Новгород: изд-во НГМА, 1999. -392 с.

70. Маянский А.Н. Ответ на письмо С.М. Захаренко "Микроэкология человека непознанная реальность" / Маянский А.Н. // Клин, микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2001. - Т 3, № 1. - С. 81-83.

71. Медицинская микробиология: учебник / под ред. A.M. Королюка. В .Б. Сбойчакова. СПб, 2002. - 4.1. - 267 с.

72. Методические рекомендации по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями / С.Д. Татаринова и др.. -М.: Минздрав СССР, 1984. 143 с.

73. Методические рекомендации по микробиологической диагностике дисбактериозов кишечника в лечебно-диагностических учреждениях армии и флота / В.М. Добрынин и др.. СПб, 1999. - 36 с.

74. Методические указания по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях: приложение 1 к приказу Минздрава СССР № 535.-М.-1986.

75. Микробиологическая диагностика дисбактериозов: методические рекомендации / Знаменский В.А. и др.. Киев, 1986. - 27 с.

76. Мухина Ю.Г. Диагностика и коррекция дисбактериоза у детей / Ю.Г.Мухина // Русский медицинский журнал. 1999. - Т. 7, № 11. -С. 487-500.

77. Нилова Е.А. Возможные пути упрощения техники диагностики дисбактериоза / Е.А. Нилова // Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова. -2003. -№ 1.-С. 140.

78. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: методические указания МУК 4.2.1890-04. // Клиническая микробиологическая антимикробная химиотерапия. 2004.-Т 6, №4. - С. 306-359.

79. Споровые пробиотики / И.Г. Осипова и др. // Журн. микробиол., виру сол. и иммунологии. 2003. - № 3. - С. 113-119.

80. ОСТ 91500.11.004 2003. (приложение) Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника. Утвержден приказом Минздрава РФ от 9 июня 2003. - №231. - 82 с.

81. Петров Л.Н. Феноменологическая модель пробиотического действия бактериальных препаратов / Л.Н. Петров // Клиническое питание. -2007. № 1-2. - С. А62.

82. Бактериальные пробиотики: биотехнология, клиника, алгоритмы выбора / Л.Н. Петров, и др.. СПб.: ФГУП ГНИИ ОЧБ, 2008. - 136 с.

83. Петровская В.Г. Микрофлора человека в норме и патологии. / В.Г. Петровская, О.П. Марко. М.: Медицина, 1976. - 231 с.

84. Пинегин Б.В. Дисбактериозы кишечника / Б.В. Пинегин, В.Н. Мальцев, В.М. Коршунов. М., 1984. - 144 с.

85. Микроэкологический статус организма как важный фактор эффективности адаптивного процесса при стрессовых ситуациях / С.М. Попкова // Клиническое питание. 2007. - №1-2. - С. А63.

86. Поиск перспективных штаммов бифидобактерий и лактобацилл для разработки новых биопрепаратов / Е.А. Постникова и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунол. 2004. - № 2. - С. 64-69.

87. Изучение качественного и количественного состава микрофлоры кишечника у клинически здоровых детей в раннем возрасте / Постникова Е.А. и др. И Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2004. - №1. - С. 62-67.

88. Рунион Р. Справочник по непараметрической статистике: Современный подход / Р. Рунион; пер. с англ. Е.З. Демиденко. М.: Финансы и статистика, 1982.-198с.

89. Рыбальченко О.В, Особенности ультратонкого строения защитных структур в биопленках лактобацилл и условно-патогенных бактерий нормофлоры кишечника / О.В. Рыбальченко, В.М. Бондаренко, Н.Б. Вербицкая // Клиническое питание. 2007. - №1-2. - С. А65.

90. Рыбальченко О.В. Атлас ультраструктуры микробиоты кишечника человека / О.В. Рыбальченко, В.М. Бондаренко, В.П. Добрица. СПб.: ИИЦВМА, 2008. - 112 с.

91. Салливан А. Место пробиотиков в терапии инфекций желудочно-кишечного тракта у человека / А. Салливан, К. Норд // Клиническая микробиология и антимикробная терапия. 2003.- Т. 5, №4. - С. 299 -398.

92. Сереброва С.Ю. Ятрогенный дисбиоз кишечника у гастроэнтерологических больных / С.Ю. Сереброва // Русский медицинский журнал. -2006.-Т 14, №29.-С. 2110-2116.

93. Современные аспекты дисбактериоза кишечника и его бактериологическая диагностика / Смолянская А.З. и др. // Лабораторное дело. -1984. -№3. С. 167-170.

94. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов / И.Б. Сорокулова // Антибиотики и химиотерапия. 1998. - №2. - С. 20-23.

95. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М.О. Биргера М.: Медицина, 1982. -464 с.

96. Суворов А.Н. Теоретические аспекты клинического использования пробиотиков / А.Н. Суворов // Клиническое питание. 2007. - № 12. С. А68.

97. Тарабрина Н.П. Взаимодействие лактобацилл со слизистой оболочкой кишечника / Н.П. Тарабрина// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1980. - №2. - С. 89-93.

98. Исследование "острой" и "хронической" токсичности необходимый элемент доклинического изучения пробиотиков / Терешкина Н.В. и др. // Клиническое питание. - 2007. - № 1-2. -С. А246.

99. Эрадикационная терапия, включающая пробиотики: консенсус эффективности и безопасности / Е.И. Ткаченко и др. // Клиническое питание. 2005. - № 1. - С. 14-20.

100. Клинические возможности пробиотической терапии в коррекции нарушений липидного обмена у больных ишемической болезнью сердца / Ткаченко Е.И. и др. // Клин, питание. 2006. - № 1-2. - С. 10-17.

101. Тюрин М.В. Устойчивость к антибиотикам лактобацилл, выделенных из кишечника здоровых людей / М.В. Тюрин // Журнал антибиотики и химиотерапия. 1989. - Т.34, №9. - С. 716-718.

102. К механизму антагонистической активности лактобацилл / М.В. Тюрин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1989. - №2.-С. 3-8.

103. Уразбаева Д.Ч. Микрофлора урогенитального тракта, ее биологические свойства в генезе пиелонефритов: автореф. Дис. Д-ра мед. наук: 03.00.07 / Д.Ч. Уразбаева; Казахский национальный медицинский университет им. С.Д. Асфендияроваг. Алматы., 2007 - 34с.

104. Урсова Н.И. Микробиоценоз открытых биологических систем организма в процессе адаптации к окружающей среде / Н.И. Урсова // Русский медицинский журнал. 2004. -Т 12, № 16. - С. 957-960.

105. Ушакова Н.А. Влияние температурного шока на биологическую эффективность пробиотика Bacillus subtilis 8130 / Н.А. Ушакова, Б.А. Чернуха // Клиническое питание. 2007. - №1-2. - С. А70.

106. Хавкин А.И. Микробиоценоз кишечника и иммунитет / А.И. Хавкин // Русский медицинский журнал. 2003. - Т 11, № 3. - С. 122-126.

107. Микроэкология кишечника у детей и её нарушения / П.Л. Щербаков и др. // Фарматека. 2007. - № 14 (148), С. 28-34.

108. Использование комбинации молекулярно-генетических методов для изучения доминантных штаммов бифидобактерий, колонизирующих кишечник здоровых детей / Шкопоров А.Н. и др. // Клиническое питание. 2007.- № 1-2. - С. А76-77.

109. Энтеробактерии: Руководство для врачей / Голубева И.В. и др.; Под ред. В.И. Покровского. М.: Медицина, 1985. - 321 с.

110. Abo-Amer А.Е. Chromosomal-gene-mediated inhibition of intestinal and foodborne pathogens by Lactobacillus acidophilus AA1 / A.E. Abo-Amer // Rev. Latinoam Microbiol. 2006. - № 48(1). - P. 24-30.

111. Antagonistic Activity of Lactobacillus plantarum СИ: Two New Two-Peptide Bacteriocins, Plantaricins EF and JK, and the Induction Factor Plantaricin A / E.L Anderssen et al. // Appl. Environ Microbiol. 1998. -Vol. 64, № 6. - P. 2269-2272.

112. Barefoot S.F. Detection and activity of lactacin B, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus / S.F. Barefoot, T.R. Klaenhammer // Appl. Environ Microbiol. 1983. - № 45 (6). - P. 1808-1815.

113. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial / M. Besselink et al. // The Lancet. 2008. - Vol. 5. №.13. - P. 651-659.

114. Safety of probiotics that contain lactobacilli or bifidobacteria / S.P. Borriell et al. // Clinical Infectious Diseases. 2003. - Vol. 36. - P. 775-780.

115. Protein-mediated adhesion of Lactobacillus acidophilus BG2F04 on human enterocyte and mucus-secreting cell lines in culture / M.H. Coconnier et al. // Appl. Environ Microbiol. 1992. - № 58(6). - P2034-2039.

116. Collins M.D. Probiotics, prebiotics and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut / M.D. Collins, G.R. Gibson // American Journal of Clinical Nutrition. 1999. - Vol. 69. №. 5. - P. 1052 -1057.

117. Conway P. L. Selection criteria for probiotic microorganisms / P.L. Conway // Asia Pacific Journal Clin. Nutr. 1996. - № 5. - P. 10-14.

118. Cummings J.H. Probiotics, prebiotics and antibiotics in inflammatory bowel disease / J.H. Cummings, S.C.Kong // Novartis Foundation symposium. 2004. - Vol. 263. - P. 99-111.

119. Cummins A.G. Postanatal Changes in mucosal immune response: A physiological perspective of breast feeding and weaning / A.G. Cummins, F. Thompson // Immunol, and Cell Biology. 1997. - № 75. - P. 419-429.

120. Delgado S. Antibiotic susceptibility of Lactobacillus and Bifidobacterium species from the human gastrointestinal tract / S. Delgado, A.B. Florez, B. Mayo // Curr. Microbiol. 2005. - № 50(4). - P. 202-207.

121. Donohue D.C. Safety of probiotics / D.C. Donohue // Asia Рас Journal Clin. Nutr. 2006. - № 15(4). - P. 563-569.

122. Colum D. In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings / D.Colum // American Journal of Clinical Nutrition. 2001. - Vol. 73, № 2. - P. 386-392.

123. American Society for Microbiology. Comparative Studies of Class II a Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria / V.G.H. Eijsink et al. // Appl. and Environmental Microbiology. 1998. - Vol. 64, № 9. - P. 3275-3281.

124. Fedorak R.N. Probiotics and prebiotics in gastrointestinal disorders / R.N. Fedorak, K.L. Madsen // Current Opinion in Gastroenterology. 2004. -Vol. 20.-P. 146-155.

125. Farrell R. J. Microbial factors in inflammatory bowel disease / R. J. Farrell // Gastroenterol. Clin. North. Am. 2002. - Vol. 31, № 1. - P. 41-62.

126. Fuller R. Probiotics in man andanimals / R. Fuller // Journal Appl. Bacteriol. 1989. - Vol. 66. - P. 365-378.

127. Fuller R. Probiotics and prebiotics: microflora management for improved gut health / R. Fuller, G.R. Gibson // Clin. Microbiol. Infect. 1998 -№ 4. - P. 477-480.

128. Gibson G.R. Concept of balanced colonic microbiota, prebiotics and synbiotics / G.R. Gibson, M.D. Collins // In: Probiotics, Other Nutritional Factors and Intestinal Microflora. Nestle Nutrition Workshop Series. 1999. -Vol. 42. P. 139-153.

129. Gibson G.R. Regulatory effects of bifidobacteria on the growth of other colonic bacteria / G.R. Gibson, J.X. Wang // Appl. Bacteriol. 1994. -№77.-P. 412-420.

130. Greene J.D. Factors involved in adherence of lactobacilli to human Caco-2 cells / J.D. Greene, T. R. Klaenhammer // Appl. Environ Microbiol. 1994 - № 60(12). - P. 4487-4494.

131. Gueimonde M. Presence of specific antibiotic resistance genes in infant faecal microbiota / M. Gueimonde, S. Salminen, E. Isolauri // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2006. -№ 48. - P. 21-25.

132. Hanlon G. Bacteriophage therapy a once and future solution / G. Hanlon // The biochemical scientist (BMSO). 2005. - P. 1058-1052.

133. Henriksson A. Characteristics of the adhesive determinants of Lactobacillus fermentum 104 / A. Henriksson, R. Szewzyk, P. L. Conway // Appl. Environ Microbiol. 1991. - № 57 (2). - P. 499-502.

134. Characterisation of Bacillus species used for oral bacteriotherapy and bacterioprofilaxis of gastrointestinal disorders / Ngo Thi Hoa et al. // Applied and environmental microbiology. 2000. - P. 5241-5247.

135. Efficacy of probiotic use in acute diarrhea in children: a meta-analysis / J.S. Huang et al. // Digestive Diseases Sciences. 2002. - Vol. 47, №11. - P. 2625-2634.

136. Huys G. Genetic Basis of Tetracycline and Minocycline Resistance in Potentially Probiotic Lactobacillus plantarum Strain CCUG 43738 / G. Huys, K. D'Haene, J. Swings // Antimicrob. Agents Chemother. 2006. -№50(4).-P. 1550-1551.

137. Jack R.W. Bacteriocins of gram-positive bacteria / R.W. Jack, J.R. Tagg, B. Ray// Microbiol. Rev., 1995. - Vol. 59, №. 2. - P. 171-200.

138. Kailasapathy К. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp / K. Kailasapathy, J. Chin // Immunol. Cell. Biol. 2000. - Vol. 78, № 1. -P. 80-88.

139. In Vitro Adhesion and Platelet Aggregation Properties of Bacteremia-Associated Lactobacilli / P.V. Kirjavainen et al. // Infection and Immunity. 1999. - Vol. 67, № 5.- P.2653-2655.

140. Klaenhammer T.R. Probiotic Bacteria: Today and Tomorrow / T.R. Klaenhammer // Journal of Nutrition. 2000. - № 130. - P. 415-416.

141. Latella G. Metabolism of large bowel mucosa in health and disease / G. Latella, R.Caprilli // International Journal of Colorectal Disease. 1991. -Vol. 6, №2. -P. 127-132.

142. Lehto E.M. Adhesion of twelve different Lactobacillus strains to Caco-2 cell cultures / E.M. Lehto, S.J. Salminen // Nutr. Today. 1996. -№31. -P. 49-50.

143. Long-time persistence of superantigen-producing. Staphylococcus aureus strains in the intestinal Microflora of Healthy Infants / E. Lindberg et al. // Pediatr. Res. 2000. - № 48(6). - P. 741-747.

144. High Rate of Transfer of Staphylococcus aureus from Parental Skin to Infant Gut Flora / E. Lindberg et al. // Journal Clin. Microbiol. 2004. -Vol. 42, № 2. - P. 530-534.

145. Chorioamnionitis and possible neonatal infection associated with Lactobacillus species / R.P. Lorenz et al. // Journal Clin. Microbiol. 1982. -Vol. 16, №3.-P. 558-561.

146. Lundequist B. The composition of faecal microflora in breastfed and bottlefed infants from birth, to 8 weeks / B. Lundequist, C.E. Nord,

147. J. Winberg // Act Paediatr. Scand. 1985. - № 74. - P. 54-58.

148. Lactic acid bacteria in the treatment of acute rotavirus gastroenteritis /

149. H. Majamaa et al. // Journal Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 1995. - Vol. 20, №3,-P. 333-338.

150. Antimicrobial susceptibility of Bifidobacterium strains from humans, animals and probiotic products / L. Masco et al. // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2006. - Vol. 58, № 1. - P. 85-94.

151. Chemotaxonomic analysis of bacterial populations colonizing the rectal mucosa in patients with ulcerative colitis / S. Macfarlane et al. // Clinical Infectious Diseases. 2004. - Vol. 38(12), № 6. - P. 1690-1699.

152. Macfarlane S. Bacterial diversity in the human gut / S. Macfarlane, G.T. Macfarlane // Adv. Appl. Microbiol. 2004. - № 54. - P. 261-289.

153. Antimicrobial susceptibility of bifidobacteria / C. Moubareclc et al. // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2005. - Vol. 55, № 1. - P. 38-44.

154. Muriana P.M. Conjugal Transfer of Plasmid-Encoded Determinants for Bacteriocin Production and Immunity in Lactobacillus acidophilus 88 / P.M. Muriana, T.R. Klaenhammer // Appl. Environ. Microbiol. 1987. -Vol. 53, №3.-P. 553-560.

155. Parker R.B. Probiotics, the other half of the antibiotic story / R.B. Parker // Anim. Nutr Health. 1974.- № 29. - P. 4-8.

156. Peri V. N. Basic aspects of pre-, pro- and synbiotics / V.N. Peri,

157. Medi // Arch. Gastroenterohepatol. 2003. - Vol. 22, № 3.4. p. 65-72.

158. In vitro anti-helicobacter pylori activity of the probiotic strain bacillus subtilis 3 is due to secretion of antibiotics / I.V. Pinchuk et al. // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001. - Vol. 45, № 11. -P. 3156-3161.

159. Absence of host specificity for in vitro adhesion of probiotic lactic acid bacteria to intestinal mucus / M. Rinkinen et al. // Veterinary-Microbiology.-2003.-Vol. 97, № 1-2.-P. 55-61.

160. Roediger W. E. W. The starved colon Diminished mucosal nutrition, diminished absorption, and colitis / W.E.W. Roediger // Diseases of the Colon & Rectum. - 1990. - Vol. 33, № 10. - P. 858-862.

161. Safety Aspects of Lactobacillus and Bifidobacterium Species Originating from Human Oro-gastrointestinal Tract or from Probiotic Products / M. Saarela et al. // Microbial Ecology in Health and Disease. 2002. -Vol. 14, №4.-P. 234-241.

162. Sullivan A. Effect of antimicrobial agents on the ecological balance of human microflora / A. Sullivan, C. Edlund, C.E. Nord // Lancet Infect. Dis. -2001.-Vol. 1, № 2. P.101-114.

163. Salminen S. Gut flora in normal and disordered states / S. Salminen, E. Isolauri, T. Onnela // Chemotherapy. 1995, Vol 41, №1.- P. 5-15.

164. Lactobacillus Bacteremia, Species Identification, and Antimicrobial Susceptibility of 85 Blood Isolates / M.K. Salminen et al. // Clinical Infectious Diseases. 2006. - Vol. 42. - P. e35-e44.

165. PCR Detection of Clostridium difficile Triose Phosphate Isomerase (tpi), Toxin A (tcdA), Toxin В (tcdB), Binary Toxin (cdtA, cdtB), and tcdC

166. Genes in Vhembe District, South Africa / A. Samie et al. // Am Journal Trop. Med. Hyg. 2008. - Vol. 78, № 4. - P. 577 - 585.

167. Sanders M.E. Probiotics: considerations for human health / M.E. Sanders // Nutr. Rev. 2003. - Vol. 61, № 3. - P. 9-19.

168. Twenty-ninth edition The Sanford Guid to antimicrobial therapy / J.P. Sanford et al.. 1999. - 141 p.

169. Savage D.C. Associations and physiological interactions of indigenous microorganisms and gastrointestinal epithelia / D.C. Savage // Am Journal Clin. Nutr. 1972. - Vol. 25, № 12. - P. 1372-1379.

170. Savage D.C. Microorganisms associated with epithelial surfaces and stability of the indigenous gastrointestinal microflora / D.C. Savage // Nah-rung.- 1987. -Vol. 31, №5-6. -P. 383-95.

171. Scanlan P.D. Human methanogen diversity and incidence in healthy and diseased colonic groups using mcrA gene analysis / P.D. Scanlan, F. Shanahan, J.R. Marchesi // BMC Microbiology. 2008. - Vol. 8. - P. 79.

172. Schillinger U. In vitro adherence and other properties of lactobacilli used in probiotic yoghurt-like products / U. Schillinge, C. Guigas, W. H. Heinrich // International Dairy Journal 2005. - Vol. 15, № 12. - P. 1289-1297.

173. Sepp E. Development of intestinal microflora during the first month of life in Estonian and Swedish infants / E. Sepp // Microbial Ecology in Health and Disease. -2000. Vol. 12, № 1. - P. 22-26.

174. Intestinal microflora of Estonian and Swedish infants / E. Sepp et al. // Act. Paediatr. 1997. - Vol. 86. - P. 956-961.

175. Shalev E. Ingestion of probiotics, optional treatment of bacterial vaginosis in pregnancy / E. Shalev // Isr Med. Assoc Journal. 2002. - Vol.4, № 5.-P. 357-360.

176. Sulakvelidze A. Bacteriophage Therapy / A. Sulakvelidze, Z. Alavidze, J.G. Morris // Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2001. -Vol. 45, №3.-P. 649-659.

177. Bacilysocin, a novel phospholipid antibiotic produced by Bacillus subtilis 168 / N. Tamehiro et al. // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2002. - Vol. 46, № 2. - P. 315-320.

178. Potential of lactic acid bacteria isolated from specific natural niches in food production and preservation / L. Topisirovic et al. // Int. Journal Food Microbiol. 2006. Vol 112(3). - 230-235.

179. Tuomola E. M. Adhesion of some probiotic and dairy Lactobacillus strains to Caco-2 cell cultures / E.M. Tuomola, S.J. Salminen // Int. Journal Food. Microbiol. -5, 1998. Vol. 41, №1. - P. 45-51.

180. Umo G. Probiotics and acute pancreatitis: there is still a long way to go / G.Umo // Journal of the Pancreas (Online). 2008. - Vol. 9, № 3. -P. 362-364.

181. Quigley E. Small Intestinal Bacterial Overgrowth: Roles of Antibiotics, Prebiotics, and Probiotics / E. Quigley, R. Quera // Journal Gastroenterology. 2006. - Vol. 130, Issue 2. - P. 78-90.

182. Vanderhoof J. A. The role of probiotics in the treatment of intestinal infections and inflammation / J. A. Vanderhoof, R. J. Young // Current Opinion in Gastroenterology. 2001. Vol. 17:1. - P. 58-62

183. Vescovo M. Drug resistance plasmids in Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus reuteri / M. Vescovo, L. Morelli, V. Bottazzi // Appl. Environ Microbiol. 1982. - Vol. 43, № 1. - P. 50-56.

184. Vleggaar F.P. Probiotics in primary sclerosing cholangitis: a randomized placebo-controlled crossover pilot study / F.P. Vleggaar, F.J. Monkelbaan, K.J. Erpecum // European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 2008. - Vol. 20, № 7. - P. 688-92.

185. The use of pre- pro- and synbiotics in adult intensive care unit patients: Systematic review / P. J. Watkinson et al. // Clinical Nutrition. -2007. Vol. 26, № 2. - P. 182-192.

186. Antibiotic susceptibility profiles of new probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains / J.S. Zhou // International Journal of food microbiology. 2005. - Vol. 98, № 2. - P. 211-217.

Информация о работе

Нилова, Людмила Юрьевна
кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Характеристика условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза толстого кишечника - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы