Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика показателей иммунитета к эндотоксину грамотрицательных бактерий при кишечных дисбактариозах

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кочурко, Людмила Ивановна, Москва

-?—у—-г-з»-у-# з'-7 7 Г

/ /

/

российская академия медицинских наук

/

научно-исследовательский институт вакцин и сывороток

имени И.И.МЕЧНИКОВА

На правах рукописи

КОЧУРКО ЛЮДМИЛА ИВАНОВНА

ДИНАМИКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУНИТЕТА К ЭНДОТОКСИНУ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ ПРИ КИШЕЧНЫХ ДИСБАКТЕРИОЗАХ

03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор В.Г.Лиходед

Москва -1998

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В ДИССЕРТАЦИИ СОКРАЩЕНИЙ

ЛПС- липополисахарид

ПЯЛ- полиморфноядерный лейкоцит

IgA-иммуноглобулин класса А

IgG - иммуноглобулин класса G

IgM - иммуноглобулин класса М

Гр" -грамотрицательный

КДО- кетодезоксиоктулоновая кислота (кетодезоксиоктонат)

CD 14 - один из рецепторов для эндотоксина

CD 18 - один из рецепторов для эндотоксина

LBP - белок, связывающий липополисахарид (lipopolysaccharide binding protein)

РЭС - ретикулоэндотелиальная система

ЛВП - липопротеины высокой удельной плотности

ЭТ - эндотоксин

РПГА - реакция пассивной гемагглютинации

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

1. Введение 1

2. Обзор литературы 5

2.1. Нормальная микрофлора кишечника человека 6

2.2. Дисбактериозы кишечника 18

2.3. Структура и биологическая активность эндотоксина грам-отрицательных бактерий 26

2.4. Факторы клеточного и гуморального иммунитета к эндотоксину грамотрицательных бактерий 34

2.5. Состояние антиэндотоксинового иммунитета при различных патологических процессах 39

2.6. Заключение по обзору литературы 47

3. Материалы и методы исследований 48

4. Результаты исследований 58

4.1. Микробиологическая характеристика дисбактериозов кишечника 58

4.1.1. Частота выявления различных форм дисбактериоза кишеч-

ника 59

4.1.2. Частота выявления различных видов дисбактериоза кишечника при дефиците бифидо- и лактобактерий 61

4.1.3. Частота выявления различных дисбактериозов кишечника у людей, различающихся по содержанию типичных эшерихий 64

4.1.4.Плазмидный контроль продукции гемолизина у штаммов Escherichia coli, выделенных при дисбактериозах кишечника 67

4.2. Состояние иммунитета к эндотоксину грамотрицательных бактерий при дисбактериозах кишечника 72

4.2.1.Динамика показателй антиэндотоксинового иммунитетапри дисбактериозах кишечника 72

4.2.2.Изучение зависимости показателей антиэндотоксинового иммунитета от вида дисбактериоза кишечника 75

5. Обсуждение полученных результатов 87

6. Выводы 101

7. Работы, опубликованные по теме диссертации 103

8. Список литературы 104

-:-4---

1. Введение

Актуальность проблемы. В связи с ухудшением экологических и социальных условий, а также с неконтролируемым применением антибиотиков и других антибактериальных препаратов в последние годы в стране отмечается довольно широкое распространение дисбактериозов, особенно дисбактериозов кишечника. Кишечный дисбактериоз обусловливает увеличенное поступление эндотоксина грамотрицательных бактерий из кишечника в воротную вену и системный кровоток, что может приводить к снижению общей резистентности организма и утяжелению различных патологических процессов. Существенное значение в этой ситуации имеет напряженность антиэндотоксинового гуморального и клеточного иммунитета, в частности, содержание циркулирующих антиэндотоксиновых антител и лейкоцитов, способных связывать эндотоксин.

В настоящее время известно, что при многих вирусных и бактериальных инфекциях и других заболеваниях активность антиэндотоксинового иммунитета снижается [Рудик А.А., 1988; Малов В.А.и др.,1993,1996; Пермяков Н.К. и др.,1995; Дмитриева Е.В. и др.,1995; Ющук Н.Д. и др.,1996; Яковлев М.Ю.и др.,1998]. Однако состояние иммунитета к эндотоксину грамотрицательных бактерий при

дисбактериозах кишечника изучено недостаточно. Имеются лишь данные о снижении антиэндотоксинового иммунитета и развитии дисбактериоза кишечника у мышей после проникающей радиации [Яковлев М.Ю.и др.,1993; Лиходед В.Г. и др.,1994]. Это обстоятельство обусловливает необходимость изучения показателей

антиэндотоксинового иммунитета при дисбактериозах кишечника у человека.

Цель исследования - изучить динамику показателей иммунитета к эндотоксину грамотрицательных бактерий при кишечных дисбактериозах у человека.

Задачи исследования:

1) определить динамику титров антиэндотоксиновых антител (антител к Ле-гликолипиду, входящему в состав эндотоксинов различных грамотрицательных бактерий) при обнаружении кишечного дисбактериоза и после его коррекции пробиотиками и препаратами бактериофагов;

2) установить содержание полиморфноядерных лейкоцитов, связавших эндотоксин в циркулирующем кровотоке, при кишечных дисбактериозах в динамике;

3) определить наличие резервов связывания эндотоксина полиморфноядерными лейкоцитами при кишечных дисбактериозах;

4) сравнить показатели антиэндотоксинового иммунитета при различных формах кишечных дисбактериозов.

Научная новизна.

1. Установлено, что у лиц с дисбактериозами кишечника имеют место следующие изменения показателей иммунитета к эндотоксинам грамотрицательных бактерий:

а) снижение титров антител к гликолипиду хемотипа Re, нейтрализующих биологическую активность эндотоксинов различных грамотрицательных бактерий;

б) уменьшение количества полиморфноядерных лейкоцитов, связывающих эндотоксин в циркулирующем кровотоке при помощи Fc-зависимого механизма;

в) отсутствие лейкоцитов, способных к Fc-опосредованному связыванию эндотоксина in vitro, то-есть, отсутствие резервов Fc-зависимого связывания эндотоксина лейкоцитами.

2. Снижение антиэндотоксинового иммунитета не зависит от разновидности дисбактериоза кишечника.

7

3. При излечении дисбактериозов препаратами пробиотиков и бактериофагов наблюдается улучшение всех показателей антиэндотоксинового иммунитета.

4. При дисбактериозах кишечника часто обнаруживаются бактерии Escherichia coli, несущие плазмидные детерминанты синтеза гемолизина и способные к их передаче при конъюгации.

5. Повышенное содержание в кишечнике условно патогенных энтеробактерий, стафилококков, энтерококков и грибов при дисбактериозах не зависит от развития дефицита бифидо- и лактобактерий. В то же время высокое содержание в кишечнике гемолитических эшерихий при дефиците бифидо- и лактобактерий наблюдается чаще, чем при нормальном содержании этих анаэробных микроорганизмов.

Практическая ценность. Определение показателей антиэндотоксинового иммунитета может быть использовано для оценки эффективности коррекции дисбактериозов кишечника.

Работа выполнена в Научно-производственном центре Тидробиос" Федерального управления медико-биологических и экстремальных проблем при Министерстве здравоохранения Российской

и

Федерации и в бактериологической лаборатории филиала 2 ЦВКГ имени П.В.Мандрыки Министерства обороны.

2. Обзор литературы

Человек живет в огромном мире различных микроорганизмов, которые не только составляют его микроокружение, но и заселяют его кожные покровы и открытые полости тела, формируя различные микробиоценозы. Микроорганизмы, заселяющие кожные покровы и открытые полости тела здорового человека, получили название нормальной микрофлоры человека. Нормальной микрофлоре тела человека посвящено достаточно большое количество публикаций, обобщенных в ряде обзорных работ отечественных и зарубежных авторов [ Перетц Л.Г., 1955; Чахава О.В., 1972; Петровская В.Г., О.П.Марко, 1976; Блохина И.Н., В.Г.Дорофейчук, 1979; Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М., 1984 ; Шендеров Б.А., 1998; Rosebury Т., 1962; Dubos R., 1966; Gall L.S., 1970; Freter R., 1974; Wilson G., 1974; Haenel H, Bendig J., 1975; Savage D., 1989].

Необходимо отметить, что в науке о микроорганизмах в последние годы появился новый термин - микробная экология. Как научное направление микробная экология рассматривает взаимоотношения микроорганизмов между собой и с окружающей средой, в том числе с организмом хозяина. В своей последней

монографии Б.А.Шендеров [1998] подчеркивает, что в настоящее время микробная экология по количеству публикаций и достижений переживает настоящий бум. Однако в данном обзоре внимание будет уделено лишь одному из разделов микробной экологии, а именно описанию микрофлоры кишечника.

2.1. Нормальная микрофлора кишечника человека

Микрофлора кишечника привлекала и привлекает пристальное внимание многих исследователей. Тем не менее единой классификации микроорганизмов, населяющих кишечник, до сих пор нет. Чаще всего нормальную микрофлору делят на индигенную (резидентную), характерную для данного вида животного, и случайную, временную [Чахава О.В., 1972]. Применяется также деление на облигатную, постоянную микрофлору и факультативную, временную [Петровская В.Г., О.П.Марко, 1976].Кроме того, при классификации микрофлоры кишечника могут быть использованы количественные характеристики: микроорганизмы, представленные в наибольшем количестве (около 90% микробиоценоза), относят к главной микрофлоре, микроорганизмы, представленные в значительно меньшем количестве (около 10%), называют сопутствующими, а микробы, составляющие менее 1% микробиоценоза, называют остаточными [Пинегин Б.В.и др. 1984].

-t

Наконец, в зависимости от локализации кишечную микрофлору делят на мукозную (М-микрофлору), ассоциированную со слизистой оболочкой кишечника, и полостную (П-микрофлору), локализованную в просвете кишки. Ассоциация М-микрофлоры со слизистой обусловлена в значительной мере способностью микроорганизмов к адгезии, которая может зависеть от свойств ряда поверхностных структур микробной клетки [Пинегин Б.В. и соавторы, 1984].

В состав микрофлоры пищеварительного тракта входит большое разнообразие анаэробных (облигатно-анаэробных и факультативно-анаэробных) и аэробных микроорганизмов. Общие представления о составе микрофлоры кишечника дает схема 1 из книги Б.В.Пинегина и соавторов [1984].

Анаэробы кишечника представлены главным образом семействами Bacteroidaceae (роды Bacteroides, Fusobacterium и Leptotrichia), Actinomycetaceae (роды Actinomyces, Bifidobacterium, Bacterionema, Rothia) и Lactobacillaceae (род Lactobacillus). По количественным показателям бактероиды и бифидобактерии представляют собой главную микрофлору. Они составляют около 90% всех микроорганизмов кишечника. Лактобактерии, эшерихии и энтерококки составляют около 10% от общего количества микробов кишечника и относятся к так называемой сопутствующей микрофлоре. Другие микрорганизмы, представленные в схеме 1 (условно патогенные

энтеробактерии, стафилококки, клостридии, аэробные бациллы, дрожжи и др.), составляют не более 1% от общего количества всех микробов, и относятся к остаточной микрофлоре [Пинегин Б.В. и др.,1980; Haenel П, Bendig J.,1975; Savage D., 1977].

В разных отделах пищеварительного тракта представители микрофлоры распределены неравномерно. Полость рта является одним из главных путей контаминации макроорганизма микробами. В полости рта могут обнаруживаться свыше 300 видов микроорганизмолв [Sutter V., 1984]. К наиболее частым представителям микрофлоры полости рта здорового человека относятся стрептококки (так называемые "слюнные" стрептококки - S.salivarius), микрококки, стафилококки. Реже встречаются лактобактерии, бифидобактерии, коринебактерии, актиномицеты, бактероиды, вейлонеллы и другие микроорганизмы [Шендеров Б.А., 1998]. Иногда из полости рта могут быть высеяны эшерихии и другие энтеробактерии, однако отнесение этих бактерий к представителям нормальной микрофлоры полости рта является спорным [Петровская В.Г., Марко OIL, 1976].

В желудке здоровых людей обычно содержится незначительное количество микроорганизмов (менее 103 клеток/мл) ,что может быть связано с бактерицидным действием соляной кислоты и желудочного сока. Тем не ме-нее из желудка могут быть высеяны лактобактерии, стрептококки,грибы и некоторые другие микроорганизмы [Heyde Н.,

у

Henderix H.,1964; Ленцнер A.A. и ■ др.,1966; Krisk Е.,1995]. Имеются сообщения о том, что в мукозном слое желудка здоровых людей могут присутствовать бактерии Helycobacter pilori [Lee A., Hallel S.,1988].

Схема 1. Структура микрофлоры кишечника

Палочковидные

(коринебактерии,

лактобактерии)

Шарообразные (микрококки, стрептококки, стафилококки)

Бесспоровые

Дрожжи Бациллы

Палочковидные (провиденция, севдомонады,| энтеробактерии)

Спорообразующие Бесспоровые

"Грамположительные

Аэробы

Грамотрицательные

_I

Г

Микрофлора кишечника I

Анаэробы

Грамположительные I

Бесспоровые

Спорообразующие бациллы

Грамотрицательные I

Бесспоровые —

Палочковидные Шарообразные (актиномицеты, (пептококки, бифидобактерии, пептострепто-эубактерии, кокки)

лактобактерии, пропионобактерии)

Клостридии Палочко- Шарооб-

видные разные (бакте- (вейло-

роиды, неллы) фузобак-терии)

Извитые (кампило-бактер)

4U

В двенадцатиперстной, тощей и в верхнем отделе подвздошной кишки обычно содержится незначительное количество микроорганизмов (менее 104 клеток/мл). Чаще всего здесь обнаруживаются аэробные и анаэробные кокки, лактобациллы и бифидобактерии, реже бактериоды, вейлонеллы и энтеробактерии [Justesen I. и др., 1984; Finegold S.,1986], С приближением к слепой кишке количество бактерий в подвздошной кишке увеличивается,и грамположительная микрофлора сменяется грамотрицательной, причем облигатные анаэробы начинают преобладать над аэробами [Finegold S.,1986], Все перечисленные представители микробов встречаются как в М-микрофлоре, так и в П-микрофлоре тонкой кишки [Пинегин Б.В. и др.,1984].

Наиболее заселена микроорганизмами толстая кишка человека.

По расчетам, в толстой кишке человека содержится около 1,5 кг

микроорганизмов [Hill М., Drasar В.,1975]. В 1 грамме фекалий может

1

содержаться около 10 микроорганизмов. В толстой кишке обнаруживаются микроорганизмы, относящиеся к 17 различным семействам, 45 родам и более 400 видам, причем количество анаэробов в 100-1000 раз превышает количество аэробов [Boriello S.,1986; Finegold S.,1986; Savage D.,1989; Simon G., Gorbach S., 1984].

Качественный и количественный состав микрофлоры кишечника (фекальной микрофлоры) представлен в табл.1, которая взята из одного

из последних пособий, утвержденных Минздравом РФ [Коршунов В.М. и др.,1997].

Из перечисленных в табл.1 микроорганизмов к облигатным для человека относят бифидобактерии, лактобактерии, бактероиды, пептострептококки, эшерихии. Некоторые авторы [Петровская В.Г.,Марко О.П.,1976] к облиганой микрофлоре кишечника человека относят также энтерококки. Остальные микроорганизмы, перечисленные в табл.1, являются факультативными для микрофлоры кишечника человека.

Из облигатных бактерий следует выделить, прежде всего, бифидобактерии и лактобактерии. Бифидобактерии грамположительные, бесспоровые, плеоморфные, строго анаэробные микроорганизмы. Название этой группы микроорганизмов обусловлено наличием раздвоений (бифуркаций) концов клетки. Присутствуют в кишечнике на протяжении всей жизни человека. Обладают высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно патогенным микробам, что обусловлено выделением большого количества кислых продуктов, лизоцима и спиртов. Бифидобактерии синтезируют аминокислоты, белки и различные витамины. Они оказывают выраженное иммуностимулирующее действие [Коршунов В.М. и др.,1997].

Лактобактерии - грамположительные микроаэрофилы, обладающие высокой антибактериальной активностью, что приводит к подавлению гнилостных и гноеродных бактерий. Это связано с выработкой в процессе сбраживания углеводов молочной кислоты, спирта и лизоцима.

Бифидо- и лактобактерии вступают в тесный контакт со слизистой кишечника, образуя М-микрофлору, однако в мукозе находится меньше этих бактерий, чем в полости кишки [Шендеров Б.А.,1998]. Адгезия этих бактерий к слизистой предохраняет слизистую от возможного внедрения патогенных микробов, то-есть, обеспечивает так называемую колонизационную резистентность [Пинегин Б.В. и др., 1984].

Довольно многочисленными представителями кишечной микрофлоры являются бактероиды. Это грамотрицательные, неспорообразующие, полиморфные палочки, строгие анаэробы. Как и бифидо- и лактобактерии бактероиды могут ассоциироваться со слизистой кишечника, однако в отличие от бифидо- и лактобактерий некоторые представители бактероидов обладают факторами патогенности и при определенных условиях могут обусловливать развитие патологических процессов [Коршунов В.М. и др., 1997].

10

Пептострептококки - грамположительные кокки, строгие анаэробы, не образуют спор. При определенных условиях могут быть патогенными и вызывать гноеродные процессы. К строгим грамположительным анаэробам относятся и палочковидные эубактерии, представители которых также могут вызывать гноеродные процессы [Коршунов В.М. и др.,1997].

К облигатной микрофлоре кишечника относят также типичные по своим свойствам эшерихии, грамотрицательные палочки, количество которых составляет менее 1% от общего количества микроорганизмов кишечника. Различные представители эшерихий могут значительно различаться по серологическим признакам. Они также могут обладат