Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика расщепления in vitro tatPHK ВИЧ-1 рибозимом модели "головка молотка"

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика расщепления in vitro tatPHK ВИЧ-1 рибозимом модели "головка молотка""

г r

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНССїІаТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

На правах рукопису УДК 577.214.3 - 577.113.4

БУР’ЯНОВСЬКИЙ Леонід Миколайович

ХАРАКТЕРИСТИКА РОЗЩЕПЛЕННЯ IN VITRO tatPHK ВІЛ-1 РИБОЗИМОМ МОДЕЛІ “ГОЛОВКА МОЛОТКА”

03.00.03 - молекулярна біологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ-

19 97

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі структури і функції нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології і генетики НАН України

Науковий керівник: кандидат біологічних наук А.Д.Швед.

Офіційні опоненти: член-кореспондент НАНУ і АМНУ,

Провідна установа: Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії

Захист дисертації відбудеться 20 травня 1997 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої ради Д 01.86.01 з захисту докторських дисертацій в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 252143, м.Київ-143, вул.Академіка Заболотного, 1Б0.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Автореферат розіслано 4 . 1997 року.

доктор біологічних наук,професор В.А.Кордюм,

кандидат біологічних наук О.М.Живолуп.

НАН України

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Л.Л.Лукаш

АКТУАЛЬНІСТЬ ПРОБЛЕМ Відкриття каталітичних властивостей у полірибонуклеотидів належить до найбільш значних подій у молекулярній біології і біохімії останнього десятиріччя. Це відкриття, що було відзначено Нобелеєською премією за 1989 рік, призвело до перегляду уявлень про роль РНК у клітині й, у більш широкому контексті, про можливу роль каталітичних РНК у виникненні життя і у процесах еволюційної адаптації.

Рибозими типу "головка молотка" були першими штучно синтезованими рибозимами, здатними не тільки до природної цис-активності, але й до транс-активності, тобто здатними розщеплювати інші ланцюги РНК. Невеликі розміри та спроможність до транс-активності зумовили привабливість використання рибозимів саме цього типу для розщеплення та інактивації специфічних РНК, в тому числі і в якості противірусного агента. На сьогодні вже накопичено багато повідомлень про успішне використання рибозимів типу "головка молотка" для блокування експресії клітинних та вірусних генів у різних модельних системах in vitro та in vivo. Але достатньо широкого розповсюдження рибозимна методологія ще не набула, що пов’язано як з певними труднощами на етапах експресії і локалізації рибозимів у клітині, так і з недостатністю вивчення механізмів каталізу розщеплення рибозимом субстрату (РНК-мішені). Дійсно, хоча кінетику реакції розщеплення субстрату рибозимом типу "головка молотка" детально вивчено, але такий аналіз проведено лише для кількох олігорибонуклео-тидних субстратів. Відсутність грунтовної теорії зумовлює суттєві труднощі в разі екстраполяції цих результатів на величезну різноманітність послідовностей і набагато більші

розміри природних РНК-мішеней та пов’язану з цим відповідну варіабельність частини нуклеотидної послідовності рибозиму, відповідальної за зв’язування РНК-субстрату. Отже, дослідження умов розщеплення кожного нового субстрату відповідним рибозимом розширює і поглиблює розуміння механізмів РНК-опосєредкованого каталізу і, таким чином, додає нові факти для створення завершальної теорії. _

МЕТА ТА ЗАВДАННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ. Метою роботи було вивчення і сптимізація умов розщеплення tatPHK ВІЛ-1 рибозимом типу "головка молотка" в системі in vitro та дослідження впливу моновалентних катіонів лужних металів і іону амонію, а також іонної сили на ефективність реакції розщеплення. Відповідно до мети було поставлено такі завдання:

1. Клонувати фрагмент гену tat і хімічно синтезовану дезоксирибонуклеотидну послідовність рибозиму у складі транскрипційних векторів.

2. Одержати у препаративних кількостях субстратну tatPHK і рибозимну РНК у реакціях транскрипції in vitro .

3. Створити систему in vitro розщеплення tatРНК за допомогою рибозиму.

4. Вивчити і оптимізувати умови розщеплення tatPHK створеним рибозимом (такі, як залежність від концентрації іонів Mg24\ температури, pH та тривалості інкубації).

5. Дослідити вплие катіонів лужних металів і амонію та іонної сили на ефективність реакції розщеплення tatPHK рибозимом.

НАУКОВА НОВИЗНА РОБОТИ. В даній роботі вперше створено рибозим типу "головка молотка", специфічний до сайту розщеплення між 5375 і 5376 нуклеотидами геному ВІЛ-1 ізоляту

- з -

ВН10, тобто локалізованого в екзоні 2 гену tat. Проведено якісний аналіз умов розщеплення транскрипту іаіРНК створеним рибозимом, а саме: залежність ефективності реакції від концентрації іонів Mg2+, від pH, температури та тривалості інкубації. Використання подовженого субстрату, близько 400 нуклєотидів завдовжки, в структурному аспекті є певним наближенням до умов взаємодії рибозиму з природною РНК у клітині. Вперше показано абсолютну залежність каталітичної активності рибозиму типу "головка молотка" від наявності спермідину у реакційному середовищі. Вперше виявлено різке зниження ефективності реакції у слабколужному середовищі. Вперше показано різний за рівнем стимулюючий вплив фізіологічних концентрацій катіонів лужних металів на ефективність розщеплення транскрипту iatPHK рибозимом типу "головка молотка". Вперше показано інгибуючу дію іонів амонію і підвищених концентрацій (>0.2 М) солей лужних металів на ефективність реакції розщеплення.

ПРАКТИЧНА ЦІННІСТЬ РОБОТИ. Рибозами типу "головка молотка" є цікавим об’єктом не тільки з точки зору дослідження фундаментальних механізмів функціонування РНК, але можуть також мати велике практичне значення, у першу чергу, як інструмент зворотньої генетики у генній терапії. Інший аспект практичного застосування рибозимів зумовлений їх висо-коспецифічною ендорибонуклеазною активністю, що може бути використано у фундаментальних дослідженнях просторових кон-формацій молекул РНК.

ОСОБИСТИЙ ВНЕСОК АВТОРА полягає у виконанні всього обсягу експериментальної частини дисертації, пошуку та обробці даних літератури, аналізі та інтерпретації отриманих резуль-

. - 4 -

татів.

ПОЛОЖЕННЯ, ЩО ВИНОСИТЬСЯ НА ЗАХИСТ: можливість регу-

ляції каталітичної активності рибозиму типу "головка молотка" за рахунок іонних взаємодій з елементами реакційного середовища.

АПРОБАЦІЯ РОБОТИ. Матеріали роботи апрбувалися на спільному науковому семінарі відділу структури та функції нуклеінових кислот і відділу регуляторних механізмів клітини ІМБіГ НАНУ 24 березня 1997 року. За матеріалами дисертації опубліковано 3 статті.

СТРУКТУРА ТА ОБСЯГ ДИСЕРТАЦІЇ. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини, що складається з методів та результатів дослідження і їх обговорення, і висновків. Роботу викладено на fûOciov. машинописного тексту, ілюстровано 17 малюнками і 1 таблицею. Список цитованої літератури містить 140 джерел.

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ. РНК-полімеразу фагу Т7 виділяли з штаму-суперпродуценту HMS174/pAR1219 (Davanloo е.а.,1984). Фрагмент гену tat ВІЛ-1 ізоляту ВН10 розміром 384 н.п. (мал.ІА), отриманий рестрикцією плазміди рВН 10 ендонуклеа-зами EcoRI і Есо47.І (останній затуплювали фрагментом Кленова ДНК-полімерази І), клонували у векторі pGEM-3Z (Promega) по сайтах EcoRI і Smal під промотором Т7 РНК-полімерази. Два дезоксиолігонуклеотиди, відповідні нуклеотидній послідовності рибозиму типу "головка молотка", було синтезовано на ДНК-синтезаторі DNA Assembler Special (Pharmacia). Після очистки в 15^-му денатуруючому поліакриламідному гелі і гібридизації дуплекс клонували у транскрипційному векторі

А

5 ’ - БББСБААЦисибСМСААСивОивиииАиССАШииСАБААииБВБивиСв АСАиАБСАБААиАБбСВииАСиСБАСАЄАЗВАБАБСААБАААиЄБАЄССАбиАв АиССиАБАСиАБАвСССиЗБАА&ЗАиССАВВААБиСАБССиААААСиВСииБиА ССМиУБОиАииБиАААААБиБииБСиииСАиивОСААБиииБиииСАиААСАА ААБСтиАББСАисиССиАиББСАББААВААБСББАБАСАЄСБАСБААбАССиС СиСААББСАтСМВАСиСАиСААбииисиСиАиСАААВСАБиААБиАБЦАСАи БиААиБСААССиАиАСАААиАБОААиАБиАбСАииАБиАБиАБСААиААиииА БСААиАБЦизиЕиЗБиССББЗ-3'

Сайт розщеплення ІаіРНК ,

| 5376 ¡ІіигНІВ 2

5'-.. .сисмассАсис" іелсисдис..З'

^СШССЄиСА исиСАСІ^ ,СС І ,Сич с

4 1

Рпбозш Аи О

С^рр-5;

Мад.І. А. Нукдеотіщна послідовність іаіРІЇК-транскришу. Ділянки зв'язування рибозиму підкреслено, розщеплюваний зв'-язок відмічено а. Б. Фрагмент іаІРНК довкола сайту розщеплення і модель вторинної структури рибозиму.

PGEM-4Z. Послідовність клонованих фрагментів перевіряли сек-венуванням дідезоксиметодом за F.Sanger,1977. Препаративну транскрипцію лінеарізованих плазмідних ДНК-матриць проводили у 0.1 мл реакційної суміші такого складу: 40 МіМ трис-НСІ, pH 8.0, 6 мМ MgCl2l 0.5 М кожного рибонуклеотидтрифосфату, 50 мкКі 32Р-альфа-АТР, 10 мМ дітіотреітол, 10 мМ NaCl, 8 мкг ДНК-матриці і 5 мкг Т7 РНК-полімерази. Суміш інкубували протягом 2 годин при 34°С. Реакцію зупиняли додаванням рівного об'єму фенолу. РНК-транскрипти з водної фази осаджували додаванням 2 М оцтовокислого амонію і 2.5 об'ємів етилового спирту, з послідушим переосадженням з розчину 0.14 М NaCl.

На мал.ІВ наведено фрагмент tatPtiК біля сайту розщеплення і передбачену послідовність рибозиму.

Перевірку каталітичної активності рибозиму проводили у 10 мкл реакційної суміші: 40 мМ трис-НСІ, pH 7.4 (при 20°С), 10 мМ MgCl2, 2 мМ спермідин, 0.5 мкМ РНК-субстрат, 5-20 мкМ рибозим. Інші компоненти, температуру та тривалість реакції

- як зазначено у підписах до малюнків. Реакцію зупиняли додаванням 5 мкл суміші 90%-го формам іду, ЗО мМ EDTA, 0.02%-го ксиленцианолу. Продукти реакції аналізували електрофорезом у 6%-му денатуруючому поліакриламідному гелі з послідуючою ав-торадіографією. Активність рибозиму визначали або вимірюючи черенковське випромінення вирізаних з гелю продуктів реакції (у Z від похідного субстрату), або денситометрією на лазерному денситометрі UltroScan XL (LKB) відповідних 5'-продуктам смуг на радіоавтографі. В останньому випадку накопичення 5'-продукту виражалось через площу піку смуги 5'-продукту,

о.п.х мм (одиниць поглинання х мм). Фон визначався за зразком ЬаfcPHK, що інкубували у відсутності рибозиму.

- 7 -

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Синтез і характеризація РНК-субстрату і рибозшу.

В оптимальних умовах реакції транскрипції вихід повно-розмірного продукту - tatPHK розміром 396 нуклеотидів -складав не менше 90-95% за результатами електрофоретичного аналізу у денатуруючому ПААГ.

ta¿РНК'Транскрипти характеризувались аномальною електрофоретичною рухомістю і у всіх експериментах мігрували в денатуруючому поліакриламідному гелі в зоні, що відповідала розмірам денатурованого ДНК-маркеру близько 450 - 470 нуклеотидів. Оскільки послідовність ДНК-матриці перевірялась після клонування, можливість "подовшання'* її виключається. Крім того, продукти розщеплення tatPHK рибозимом мігрували у повній відповідності з положеннями маркеру (показано далі). Можливо, аномальна рухомість tatPHK-транскрипту пов’язана з міцними, щоб не бути зруйнованими в денатуруючих умовах під час електрофорезу, елементами вторинної структури.

Вихід повнорозшрного РНК-транскрипту рибозиму довжиною 54 нуклеотиди в оптимальних умовах складав не менше 95% аа результатами електрофоретичного аналізу в денатуруючому ПААГ, де рибозимна РНК мігрувала однією смугою у відповідній з положеннями маркерів зоні. Але на авторадіограмах в експериментах з вивчення каталітичних властивостей рибозим виявлявся двома, або навіть трьома смугами, що розмішувалися послідовно на незначній відстані. Здатність до агрегації молекул РНК добре відома, і схильність до утворення асоціатів (ди-мерів і мультимерів) і агрегатів деякими рибозимами типу "головка молотка” (Heus е.а., 1990; Fedor, Uhlenbeck, 1990), а також типу "шпилька" (Hegg, Fedor, 1995) було показано. Не

- 8 - . виключено, що поява додаткових смуг (асоціатів) на електро-фореграмах була пов'язана не стільки з підвищеними концентраціями рибозиму в реакціях розщеплення, скільки з присутністю спермідину в реакційному середовищі, що й зумовлювало комплексоутворення.

Характеризація каталітичної активності рибозиму. При еквімолярних концентраціях субстрату і рибозиму, так само як

і при значному надлишку субстрагної РНК, - тобто в умовах, відповідних багатообертовому типу кінетики реакції, - каталітичної активності спочатку не було виявлено. Лише при 10-40 -кратному надлишку рибозиму над субстратною РНК і у присутності 2 мМ спермідину в реакційному середовищі було можливим розщеплення tatPHK (кал.2, дар.1-3). Ефективність реакції складала 10-15%. Додавання 100 мМ КС1 у реакційну суміш не призводило до появи продуктів реакції у відсутності спермідину, але сумісне додавання 2 мМ спермідину з 100 мМ КС1 подвоювало ефективність реакції порівняно з реакцією в присутності лише спермідину (мал.2, дор.4 і 5).

Таким чином, вперше показано активуючу дію спермідину на рибозим типу "головка молотка" у реакції розщеплення подовженого РНК-субстрату.

Ефективність реакції розщеплення транскрипту tatPHK (390 н.) створеним рибозимом у присутності 2 мМ спермідину і

0.1 М КС1 складала близько 25 - 30% за 180 хв. при 28°С (мал.2, дор.5). Молярне співвідношення субстрат/рибозим становило 1/40. Цей результат цілком узгоджується з даними літератури як щодо ефективності реакції розщеплення довгих субстратів, що звичайно коливається у межах 5 - 50% за декілька годин, так і стосовно стехіометрії субстрат/рибо-

Мал. 2 Електрофоретичний аналіз продуктів реакції розщеплення tatPHK рибозимам in vitro:

1 - tatPHK без добавлення рибозиму;

2 - tatPHK+рибозим, трис-НСІ,рН 7.4, 10 мМ М§СІ2ї

3 - ге саме, що 2, плюс 2 мМ спермідин;

4 - те саме, що 2, плюс 100 мМ КСІ;

5 - те саме, що З, плюс 100 мМ КСІ.

Реакція тривала З год. при 28°С; співвідношення субстрат/рибозим приблизно дорівнювало 1/40.

зим, необхідної для таких реакцій, цо звичайно складає у межах 1/3 - 1/100.

Залежність ефективності розщеплення tatPHK від концентрації іонів магнію. Необхідність додавання спермідину в реакційну суміш могла свідчити про ге, що іони магнію в реакційному середовищі були в субоптимальній концентрації (Bratty е.а.,1993). Залежність ефективності розщеплення tatPHK рибозимом від концентрації MgCl2 наведено на мад.З. Як видно з малюнка, оптимальна концентрація іонів магнію становила 5 мМ. При збільшенні концентрації MgC3.2 в реакційному середовищі більше 10 мМ ефективність реакції зменшувалась. Враховуючи, що реакція йшла досить ефективно навіть при концентраціях іонів магнію 1-3 мМ (дані не наводяться), можна зробити висновок, що якась кількість іонів магнію містилась у препаратах РНК. Тож, хоча максимальна ефективність реакції розщеплення tatPHK спостерігалась при 5 мМ MgCis, але, щоб зменшити можливий вплив "ендогенного" Wg2+ в препаратах РНК, реакцію розщеплення проводили у присутності 10 мМ MgCl2.

Залежність ефективності розщеплення tatPHK від температури. інкубації. Результати дослідження впливу температури інкубації на ефективність розщеплення tatPHK рибозимом in vitro наведено на мал.4. Як видно з малюнка, створений рибо-зим виявляв каталітичну активність у широкому діапазоні температур - від 15° до 45° С, з оптимумом близько 30° С. При додаванні у реакційну суміш 20 % (кінцева концентрація) фор-маміду ефективність реакції при 15° С підвищувалась вдвічі порівняно з відповідним значенням у відсутності формаміду. Це цілком узгоджується з вихідним припущенням про те, що

Накопичення 5'-продукту, (о.п.) х мм

0.71

0.5“

0.6”

0.4“

/

0 10 20 ЗО 40 мМ MgCl2

Мал.З. Залежність ефективності розщеплення іаіРНК рибозимом від концентрації іонів М^++. Інкубація протягом 60 хв. при 35° С. Співвідношення субстрат/рибозим = 1/20.

Мал. 4. Залежність ефективності розщепленя tatPHK рибозимом від температури. Інкубація протягом 120 хв.

1 - реакційна суміш з 2 мМ спермідину, 100 мМ КС-1,

трИС-HCl, pH 7.4 (при 20° С); ■

2 - те зк, що 1, але з добавленням 20 % формаміду;

3 - те та, що 2, але з добавленням 100 мМ LiCl. •

Ефективність розщеплення, % 20-

5-

15 25 35

С

формамід повинен сприяти деструктуризації РНК-субстрату і, тим самим, більшій досяжності сайту розщеплення для рибозиму

і, по-друге, знижуючи температуру плавлення дуплексів, формамід повинен підвищувати швидкість дисоціації комплексу ри-бозим-продукт, що є досить суттєвим при знижених температурах. Збільшення іонної сили реакційного середовища додаванням 100 Ш LiCl практично цілком усувало активуючу дію формаміду при знижених температурах (мал.4),що можна інтерпретувати як усунення дезінтегруючого впливу формаміду на РНК-субстрат підвищенням концентрації моновалентних катіонів.

Залежність ефективності розщеплення tatPHK in vitro від тривалості інкубації. Необхідість додавання великого надлишку рибозиму відносно субстрату - їх співвідношення в реакційній суміші звичайно складало 10/1 або 40/1 - зумовлювало, як раніше відзначалось, однообертовий тип кінетики реакції. Це саме по собі свідчило про те, що швидкість реакції має бути меншою, ніж швидкість реакції при багатообертовому механізмі кінетики. Вивчення залежності ефективності розщеплення tatPHK in vitro від тривалості інкубації показало, що, дійсно, реакція відбувається досить повільно (мал.5). Крива залежності складається з двох ділянок: протягом першої години її нахил є найбільш стрімким, тобто швидкість реакції на цьому відрізку часу була максимальною, а далі іде похилий прямолінійний відрізок. В цілому, близько 20% субстрату переходило у фракцію продукту за 5 годин реакції при 25° С. Збільшення тривалості інкубації до 14 годин подвоювало ефективність реакції порівняно з 5-ма годинами, але при цьому відмічався вже досить значний рівень неспецифічної дегра-

Ефективність розщеплення, %

60 120 180 240 300 , ХВИЛИН

Мал. 5. Залежність ефективності розщеплення tat-PHK рибозимом від тривалості інкубації.

Інкубація при 25°С. Молярне співвідношення субстрат/рибозим дорівнює 1/20.

А - електрофореграма розділення продуктів реакції, де доріжки 1-3 відображають тривалість реакції відповідно О, 10, 20, 40, 60, 120, 180, 240, 330 хв; доріжка 10 - маркер (плазміда pBR 322, рестрикована Hinf І і денатурована 5 хв. при 100° С);

Б - кількісна графічна інтерпретація.

- 14 -

дації РНК-субстрагу (дані не наводяться).

pH-залежність реакції розщеплення tatPHK рибозииом. Концентрація іонів водню виявляє суттєвий вплив на каталітичну активність багатьох ферментів. А оскільки структурні основи будови білкових ферментів і нуклеїнових кислот, до яких належать рибозими, надзвичайно відрізняються, викликало інтерес визначити характер pH-залежності ефективності реакції розщеплення tatPHK рибозимом типу "головка молотка". Графік залежності ефективності реакції розщеплення від pH реакційного середовища наведено на мал.6. Як видно з малюнка, максимальна ефективність реакції спостерігалась при нейтральних значеннях pH 6.9 - 7.2. При зростанні значення pH на одну одиницю ефективність реакції зменшувалась вдвічі. Подальше підвищення pH до значення 9.0 призводило до ще значнішого падіння ефективності реакції і, крім того, субстратна РНК ставала більш уразливою до неспецифічного гідролізу. Зниження pH нижче нейтрального рівня не так різко видбивалося на ефективності реакції. При pH 5.0 ефективність реакції зменшувалась вдвічі порівняно з рівнем ефективності при pH 7.0 (мал.6). Якщо к прийняти до уваги досить значні хелатугочі властивості використаного у даному випадку цитрат-ного буферу і пов’язане з цим неминуче зниження концентрації Mg2+, яке ніяк не було компенсовано, то можна припустити, що реальна каталітична активність при pH 5.0 була дещо вищою за визначений рівень.

Вплив моновалентних катіонів на ефективність розщеплення tatPHK рибозимом In vitro. Вплив різних іонів двовалентних і перехідних металів на каталітичну активність рибозимів типу "головка молотка" добре вивчено (Dahm,Uhlenbeck,l991).

Накопичення 5’-продукту, (о.п.) х мм

0,51

0,3-

0,1-

9 pH

Man. 6. Залежність від pH ефективності розщеплення tafcPHK рибозимом in vitro.

1 - 33 мМ Na-цитрзтний буфер, pH 5.0;

2 - 50 мМ імідазол-НСІ, pH 6.6;

3 - 50 мМ К-фосфатний буфер, pH 7.0 або 7.4;

4 - 50 мМ трис-НСІ, pH 7.4, 8.0 або 8.5. •

Реакція тривала 100 хв. при 34° С. -

Навпаки, дія іонів лужних металів зовсім не вивчалась, хоча моновалентні катіони металів теоретично можуть приймати участь якщо не безпосередньо у каталізі, то принаймні у стабілізації вторинної і третинної структур рибозиму.

Як видно з малюнка 7, найбільший . стимулюючий ефект

спостерігався при додаванні в реакційну суміш солей КС1 1 L1C1 в концентраціях 0.1 М. При цьому накопичення 5’-продук-ту збільшувалось удвічи порівняно s реакцією, що проводилась у відсутності солі. Але при концентраціях, більших ВІД 0.12

- 0.15 М відмічалось зниження ефективності реакції. При концентрації 0.4 М КС1 зменшував ефективність розщеплення на ЗО 7,, a L1C1 - на 50 % порівняно з ефективністю у відсутності солі. Стимулюючий вплив іонів Li+ повністю усувався, якшр в якості аніону виступав перхлорат-іон, СЮ4- (мал. 7, крива 3). Відомо, що перхлорат-іони мають хаотропну дію і порушують структуру води. Тому цей результат може свідчити про важливість впливу саме структури води на каталітичну активність рибовиму.

Іони Ма+ виявляли менший вплив на розщеплення рибозимом fcatPHK порівняно з іонами К+ і Li+ (дані не наводяться). Тож, за здатністю підвищувати ефективність розщеплення tatPHK рибозимом іони лужних металів можуть бути розташовані в черзі: K+>Ll+>Na+.

Іони амонію виявляли інгибуючий вплив, в усякому випадку, в концентраціях, вищих за 0.1 М (мал.7,крива 4). Це в деякій мірі несподіваний результат, оскільки відомо (Wang е.а.,1993) , що іони амонію, як і іони калію, специфічно приймають участь у створенні 1 підтримці одного з елементів третинної структури у складі рРНК, який за розмірами 1 вторинною структурою практично повністю відтворює структуру "головки молотка" за винятком консервативних нуклеотидів . І оскільки іони калію в концентрації 0.1 Ы підвищували ефективність розщеплення tatPHK, очікувалось отримати аналогічний ефект також і у випадку іонів амонію. З іншого боку,

Накопичення 5'-продукту,

(o.nj X MM

Мал.7. Залежність ефективності розщеплення tatPHK рибозимом від концентрації солей

1 - КС1 ;

2 - LÍC1 ;

3 - LÍGIO4;

4 - NH4C2H3O2; •

5 - КС1 у присутності 25 % формачіду. Реакцію проводили протягом 120 хв. при 25° С.

отриманий результат підтверджує результати щодо інгибуючої дїї неоміцину на каталітичну активність рибозйму типу "головка молотка" (Cluet-d'Orval е.а.,1995).

В цілому, збільшення іонної сили вище 0.1-0.2 М супроводжувалось зниженням ефективності реакції розщеплення tatPHK рибозимом, і при концентрації солі понад 0.6 - 0.8 М реакція практично повністю блокувалась (мал.7).

ВИСНОВКИ

1. Синтезовано та клоновано рибозим типу "головка молотка", специфічний до tatPHK ВІЛ-1 Ізоляту ВН10.

2. Розроблено систему in vitro розщеплення транскрипту tatPHK створеним рибозимом. В даній системі рибозим виявляв абсолютну залежність від присутності як іонів Mg2+, так і полікатіону спермідину.

3. pH-залежність розщеплення tatPHK рибозимом характеризується різким падінням ефективне?і реакції у слабколузкно-му середовищі.

4. Іони лужних металів у фізіологічних концентраціях (0.1 М) мають різний стимулюючий вплив на ефективність реакції. За рівнем дії вони можуть бути розташовані у черговості: K+>Li+>Na+.

5. Виявлено інгибуючий вплив іонів амонію на ефективність розщеплення tatPHK рибозимом.

6. Збільшення іонної сили понад 0.2 М пригнічує, а понад 0.8 М - цілком блокує розщеплення tatPHK рибозимом.

7. Отримані' дані свідчать про важливість для каталітичної активності рибозиму іонних взаємодій, за рахунок яких може здійснюватись її регуляція.

- 19 -

ПЕРЕПІК ПРАЦЬ, НАДРУКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Л. Н. Бурьяновский, А. Д. Швед. Специфическая деструкция tat-РНК ВИЧ-1 in vitro с помощью каталитически активного полирибонуклеотида (рибозима). // Биополимеры и клетка. -1996. - т.12, N2. -С. 20-23.

2. Л. Н. Бурьяновский, А. Д. Швед. Характеристика каталитической активности in vitro рибозима, специфического к tat-PHK вируса иммунодефицита человека типа I // Биополимеры и клетка. -1996, -т. 12, N 6. -С. 69-73.

3. Л. Н. Бурьяновский. Влияние pH, ионной силы и ионного состава реакционной среды на еффективность расщепления in vitro tatPHK ВИЧ-1 рибозимом модели "головка молотка". // Биополимеры и клетка, -1997, -т. 13, N 1. -С. 30-35.

АНОТАЦІЇ

Бурьяновский Л.Н. Характеристика расщепления in vitro tatPHK ВИЧ-1 рибозимом модели "головка молотка". Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1997 г. Защищаются 3 печатные работы, посвященные изучению расщепления в системе in vitro транскрипта (400 н.) tatPHK ВИЧ-1 рибозимом модели "головка молотка". Показана абсолютная зависимость каталитической активности рибозима не только от наличия Mg2+, но и от наличия спермидина в реакционной среде. Выявлено различное по степени воздействия (K+>Li+>Na+) стимулирующее влияние физиологических концентраций катионов щелочных металлов на эффективность расщепления. Ионы аммония ингибировали реакцию при всех исследованых концентрациях. Повышение pH выше значений 7.5 или концентрации соли выше

0.2 tl сникало эффективность расщепления tatPHK. Эти данные свидетельствуют о важности ионных взаимодействий для каталитической активности рибозима типа "головка млотка".

Buryanovsky L.N. Characterization of in vitro cleavage of the HIV-1 tatRNA by using the hammerhead ribozyme. Dissertation thesis for Candidate of Science Degree on speciality 03.00.03 - molecular biology. Institute of Molecular Biology and Genetics, NASU, Kiyv, 1997. The three printed papers are defended, in which data on in vitro cleavage of 400 nt transcript of the HIV-1 tatRNA by' using hammerhead ribozyme have been presented. Ribozyme catalytic activity shown strong dependence on both Mg2* and spermidine presence. The alkaline metal ions at physiological concentrations (0.1 M) had different stimulatory effect on tatRNA cleavage and may be ranged in the row: K+>Li+>Na+.

NH4+ ions decreased cleavage at all concentrations tested. Raising pH above 7.5 or salt concentrations above 0.2 M reduced efficiency of tatRNA cleavage. These data suggest importance of ionic interaction for catalytic activity of the hamierhead ribozyme.

Ключові слова: РНК, рибозим.