Характеристика химического и антигенного составов гликополимеров поверхности бактерий Herbaspirillum seropedicae Z78 и Herbaspirillum lusitanum P6-12

Величко, Наталья Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика химического и антигенного составов гликополимеров поверхности бактерий Herbaspirillum seropedicae Z78 и Herbaspirillum lusitanum P6-12
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика химического и антигенного составов гликополимеров поверхности бактерий Herbaspirillum seropedicae Z78 и Herbaspirillum lusitanum P6-12"

На правах рукописи

Величко Наталья Сергеевна

ХАРАКТЕРИСТИКА ХИМИЧЕСКОГО И АНТИГЕННОГО СОСТАВОВ ГЛИКОПОЛИМЕРОВ ПОВЕРХНОСТИ БАКТЕРИЙ НЕ ИВА 5 РІШИ УМ 5ЕЯОРЕО!СА Е Ъ1Ъ И НЕЯВАБРІШиЛМ ¿г/£/7МЛта/Р6-12

03.01.04 - биохимия 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4 КЮН 2012

Саратов-2012

005045915

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии

наук (ИБФРМ РАН)

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Игнатов Владимир Владимирович

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук

кандидат биологических наук Смолькина Ольга Николаевна Научно-производственная фирма «Винар», г. Москва

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Соколов Олег Игоревич

доктор биологических наук, профессор Щербаков Анатолий Анисимович

Федеральное государственное бюджетное образовательнс учреждение высшего профессионального образования Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «27» июня 2012 г. в 10:00 ч. на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов 13).

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ и на сайте ИБФРМ РАН: http://ibppm.ru/dissertacionnyv-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат разослан Щу> мая 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ________

доктор биологических наук, профессор В.Е. Никитина

Актуальность темы. Для большинства растений характерны симбиозы с микроорганизмами (эндофитными и ризосферными), фиксирующими азот или оптимизирующими получение других необходимых веществ из почвы. Исследования особенностей таких взаимодействий являются основой отдельного направления в прикладной микробиологии. Перспективным модельным объектом для изучения эндофитной растительно-микробной ассоциации являются бактерии рода Herbaspirillum, благодаря потенциально высокой азотфиксирующей активности, способности продуцировать фитогормоны и иные физиологически активные вещества (Baldani et al, 1986; Bastia et al, 1998; Lambrecht et al, 2000; Souza et al, 2000; Pedresa et al, 2001; Ongena et al, 2007). Об интересе к исследованию гербаспирилл свидетельствует выполненное секвенирование нуклеотидных последовательностей генома бактерий H. seropedicae Z78 (Pedrosa and Genopar, 2005).

В прикреплении бактерий к корням, проникновении и распространении по макроорганизму участвуют как неспецифическая сорбция, так и специфические взаимодействия, которые на разных этапах опосредуются поверхностно локализованными белками и полисахаридами (ПС) (Michiels et al, 1991; Baldani et al., 1993; Mora and Newton, 2008). Уже сложилось представление о важной роли гликополимеров поверхности в обеспечении выживания бактерий в почве и взаимодействии их с растением (Dell Gallo and Haegi, 1990; Gulatï et al., 2011). Анализ строения и функций различных структурных элементов клеточной поверхности эндофитных ассоциативных бактерий является ключевым направлением в изучении молекулярных механизмов формирования симбиотических отношений. В литературе отсутствуют данные, касающиеся исследований состава и функций экстраклеточных и капсульных гликополимеров гербаспирилл. Фрагментарно представлены сведения об исследовании липополисахарвдов (ЛПС) - главного компонента внешней мембраны грамотрицательных бактерий. ЛПС, специфичность которых в контактных взаимодействиях определяют полисахаридные составляющие, играют важную роль в создании внутривидовых классификационных схем грамотрицательных бактерий (Caroff and Karibian, 2003). Известны результаты иммунохимических исследований ассоциативных азотфиксаторов, фигопагогенных бактерий (Варбанец, 1994; Pier, 2003; Коннова с соавг., 2009), в та время как аналогичные аспекты изучения эндофитных диазотрофов, за исключением представителей рода RMzobium, находятся на периферии исследовательских интересов. Изучение структурных особенностей и атггигенного состава индивидуальных препаратов гликополимеров гербаспирилл является актуальным как для таксономических исследований, так и для понимания механизмов индукции и развития их биологического действия при формировании эндофитного симбиоза с растениями.

В связи с этим, целью работы было выявление особенностей структуры и антигенного состава гликополимеров поверхности бактерий Я seropedicae Z78 и Я lusitanum Р6-12.

Для реализации цели в ходе исследования решали следующие задачи:

1) выделение полисахаридов из культуральной жидкости, капсулы и внешней мембраны Я seropedicae Z78 и Я lusitanum Р6-12;

2) анализ химического состава углеводсодержащих биополимеров Я seropedicae Z78 и Я lusitanum Р6-12;

3) исследование антигенного состава полисахаридов гербаспирилл с применением кроличьих антител и фаговых мини-антител к препаратам экстраклеточных, капсульных и мембранных гликополимеров Н. seropedicae Z78;

4) выделение О-специфических полисахаридов (ОПС) из липополисахаридов и определение структуры повторяющегося звена ОПС Я seropedicae Z78.

Научная новизна полученных результатов заключается в следующем:

1. Получены приоритетные данные о составе экстраклеточных, капсульных гликополимеров и О-антигенов II. ¡егоресЧсае Z78 и Н. ¡изНапит Р6-12.

2. Впервые для типового штамма Н. яегоресИсае 278 установлен состав повторяющихся звеньев О-специфической части липополисахарида внешней мембраны, имеющих нетипичные для грамотрицательных бактерий составляющие - Л'-ацстил-О-глюкозамин и неуглеводный заместитель - глицерин. Необходимо отметить, что подобные компоненты часто встречаются в структуре тейхоевых кислот грамположительных (Наумова с соавт., 1987; УагЬапйв е/ а/., 1990; Стрешинская с соавт., 1998) бактерий и крайне редко обнаруживаются у грамотрицательных представителей.

3. С применением поликлональных кроличьих и фаговых мини-антител впервые получены сведения об антигенных свойствах гликополимеров Н. яегоресИсае 7Л& и

Н. 1шИапит Р6-12.

Научно-практическая значимость. Данные о составе и структуре мембранных, экстраклеточных и капсульных гликополимеров НегЬавртИит необходимы для понимания механизмов индукции и развития их биологического действия при формировании симбиоза с растениями. Они также могут служить основой внутривидовых классификационных схем данных бактерий.

Препараты полисахаридов НегЬюртИит, а также фаговые мини-антитела к ним применяются при проведении плановых НИР сотрудниками лаборатории биохимии и иммунохимии ИБФРМ РАН. Полученные антитела планируется использовать для дальнейшего серологического анализа коллекционных культур НегЬюртИит, а также вновь изолированных из природной среды микроорганизмов.

Результаты диссертационной работы использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами биологического факультета СГУ.

Апробация работы. Материалы исследований, изложенные в диссертации, были представлены на 4-ой Международной конференции молодых ученых «Биология - от молекулы до биосферы» (Харьков, Украина, 2009); на Всероссийском с международным участием симпозиуме «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, Россия, 2009); на 5-ой Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2010); на 1-ой Общероссийской электронной научной конференции «Актуальные вопросы современной науки и образования» (Красноярск, Россия, 2010); на 14-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - Наука XXI века» (Пущино, Россия, 2010); на Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2010); на 3-ем и 4-ом Всероссийских с международным участием конгрессах студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010, 2011» (Нижний Новгород, Воронеж, Россия, 2010, 2011); на 5-ой школе-симпозиуме «Адаптация к климатическим изменениям в регионе Балтийского моря: вклад биотехнологии растений и микроорганизмов» (Миккели, Финляндия, 2010); на 4-ой Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, Россия, 2011); на 1-ой Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, Россия, 2011); на 24-ой зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биотехнологии» (Москва, Россия, 2012).

Доклад «Химическая и иммунохимическая характеристика мембранных, капсульных и экстраклеточных гликополимеров НегЬазртИит 5егоресИсае 278», представленный на 3-

ем Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, Россия, 2010) был удостоен диплома первой степени.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 5 статей в журналах рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.

Работа выполнена в лаборатории биохимии ИБФРМ РАН в соответствии с плановыми темами: «Биополимеры и низкомолекулярные соединения во взаимодействии растений и микроорганизмов», «Структурно-функциональные особенности поверхностных гликополимеров ризобактерий» (№№ гос. per. 01200904391, 01200403358, научный руководитель - зав. лаб. засл. деятель науки РФ, д.б.н. проф. Игнатов В.В.).

Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований в 2011 - 2013 гг. «Исследование строения и свойств липополисахаридов ризобактерий в связи с существованием в различных экологических нишах» № 11-04-00533, а также грантом Президента РФ на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ НШ-3171.2008.4 в 2008 - 2009 гг.

Ряд работ выполнен совместно с сотрудниками лаборатории химии углеводов ИОХ РАН имени Н.Д. Зелинского (г. Москва).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 332 источника, в том числе - 273 зарубежных. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок и 8 таблиц.

На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:

1. Выявлен сложный многокомпонентный состав гликополимеров культуральной жидкости, капсулы и внешней мембраны бактерий Я. seropedicae Z78 и Я. lusitamim Рб-12. ЛПС внешней мембраны отличны по структуре от экстраклеточных и капсульных гликополимеров липополисахаридной природы. В капсулыюм материале Я. seropedicae Z78 дополнительно присутствует гликолипид, а в культуральной жидкости - свободный полисахарид.

2. В составе всех исследуемых гликанов Я. seropedicae Z78 обнаружены общие антигенные детерминанты, наряду с наличием индивидуальных иммунодоминантных групп в мембранных и капсульных полисахаридах. Я. seropedicae Z78 и Я. lusitanum Р6-12 являются серологически различными.

3. В О-специфической цепи ЛПС Я. seropedicae Z78 показано наличие двух типов повторяющихся звеньев: 1,3-глицерофосфата и 1,3-глицерофосфата, замещенного во втором положении Ы-ацетил-О-глюкозамином.

Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям заслуженному деятелю науки Российской Федерации, доктору биологических наук, профессору В.В. Игнатову и кандидату биологических наук О.Н. Смолькиной за неоценимую поддержку на всех ключевых этапах выполнения данной работы. Автор выражает благодарность за плодотворное сотрудничество коллегам из лаборатории биохимии - доктору биологических наук, профессору С.А. Конновой, кандидату биологических наук, доценту Ю.П. Федоненко, кандидату биологических наук И.В. Егоренковой, сотрудникам ИБФРМ РАН доктору биологических наук Л.Ю. Матора, кандидату биологических наук, доценту Г.Л. Бурыгину, кандидату химических наук O.E. Макарову, кандидату биологических наук М.П. Чернышевой, а также другим сотрудникам

ИБФРМ РАН и сотрудникам лаборатории химии углеводов ИОХ РАН им. Н.Д. Зелинского (г. Москва).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования

В работе были использованы бактерии Н. seropedicae Z78, впервые выделенные из корней сорго и любезно предоставленные в коллекцию ИБФРМ РАН доктором Дж. Доберейнер (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria, Rio de Janeiro, Бразилия), H. lusitanum P6-12, выделенные из клубеньков фасоли обыкновенной и предоставленные доктором Ж. Игуал (IRNA, Salamana, Испания).

Исследуемые микроорганизмы выращивали на синтетической среде с малатом и глюкозой (American Туре Culture Collection. Catalogue of Bacteria and Bacteriophages 18th edition, 1992, Rockville, Maryland 20852-1776. ISBN: 0-930009-44-4).

Для выделения суммарных препаратов ПС использовали методы осаждения, ультрацентрифугирования и экстракции. После процедур очистки водные растворы ПС лиофилизировали.

Количественное содержание углеводов, белков, нуклеиновых кислот, 2-кето-З-дезокси-D-октолузоновой кислоты (КДО) определяли общепринятыми спектрофотометрическими методами (Dubois et al., 1956; Скоупс, 1985; Спирин, 1958; Karkhanis et al., 1978 соответственно).

Для гель-фильтрации использовали колонки с носителями Sepharose CL-4B, Sephadex G-50 и Toyopearl TSK HW-40. В качестве элюентов применяли раствор бикарбоната аммония (0.025 М, рН 8.3), пиридин-ацетатный буфер (0.05 М, рН 5.3) и 1% уксусную кислоту. Детекцию продуктов разделения в элюате проводили с помощью дифференциального проточного рефрактометра LKB 2142 (LKB, Швеция). Дополнительно строили элюционные профили по содержанию углеводов в отдельных фракциях (Dubois et al., 1956).

Электрофорез препаратов ПС выполняли в полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия по методу Хичкок и Браун (Hitchcock and Brown, 1983), визуализацию полисахаридов осуществляли окрашиванием гелей красителем на основе азотнокислого серебра (Tsai and Frash, 1982).

Поликлональные антитела (Ат) получали иммунизацией кроликов целыми клетками бактерий, обработанными 2% глутаровым альдегидом (Матора с соавт., 1998), и осаждали из антисыворотки сульфатом аммония (Кэбот и Мейер, 1968). С использованием овечьей фаговой библиотеки Ат были получены фаговые мини-Ат (м-Ат) к JinCZ78, ЭПС1278, ЭПСП278, КПС1278 и КПСИ278 (м-Атлпс, м-АтЭПсь м-АтЭПсп, м-Аткпа и м-Аткпсп соответственно). Для селекции м-Ат использовали принцип аффинного взаимодействия между фаговой частицей и иммобилизованным на твердой фазе (полистироловом планшете или нитроцеллюлозной мембране) антигеном (Аг). Компетентными вирусами инфицировали клетки Е. coli XL-1 Blue, и после трехдневной инкубации из культуральной жидкости выделяли м-Атлпс. м-Атэпсь м-Атэпсп, м-Аткпа и м-Аткпсп- Концентрацию фаговых частиц определяли спектрофотометрическим методом.

Иммуноферментный анализ проводили в полистироловых 96-ти луночных планшетах. Тестируемые соединения иммобилизировали за счет простой адсорбции. В качестве ферментной метки использовали пероксидазу хрена, конъюгированную с козьими антикроличьими антителами (Sigma, США). В качестве субстратного реагента использовали о-фенилендиамин с перекисью водорода. Измерения оптической плотности исследуемых проб проводили на иммуноферментном анализаторе Multiskan Ascent с последующей

обработкой результатов с помощью программы Ascent Software for Multiskan Ascent (Thermo Electron, China).

Нейтральные моносахариды, аминосахариды и неуглеводные заместители идентифицировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) (Захарова и Косенко, 1982). Количественное определение нейтральных моносахаридов проводили методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) в виде ацетатов полиолов (Слонекер, 1975) на хроматографе Hewlett-Packard 5890 (США). Метилирование ПС проводили СН31 в присутствии щелочи и анализировали методом ГЖХ-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС) на газовом хромато-масс-спектрометре Finnigan Trace DSQ (США).

ОПС гербаспирилл получали рутинным методом гидролиза ЛПС 2% уксусной кислотой (Muller-Seitz ct al., 1968). Выделенные препараты очищали хроматографически.

Определение состава жирных кислот (ЖК) в виде метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) гликополимеров проводили с помощью ГЖХ на хроматографе GC-2010 (Shimadzu, Япония) с капиллярной колонкой EQUTY-1 (Supelco, Чехия). Метилирование выполняли согласно методу, описанному в работе (Mayer et al., 1985).

Спектры ЯМР снимали на спектрометре DRX-500 (Bruker, Германия), используя стандартное математическое обеспечение фирмы Bruker. Для сбора и обработки данных использовали программу XWINNMR2.1.

Результаты всех экспериментов подвергали статистической обработке (Лакин, 1980). Данные представлены в виде средних значений (как минимум трех экспериментов, каждый из которых проводился в трех повторностях) со средней квадратичной ошибкой. Доверительные интервалы определены для надежности 95%.

Результаты исследований и их обсуждение

В настоящем разделе работы представлены результаты сравнительного исследования химического состава, полисахаридной и липидной составляющих капсульных, экстраклеточных и липополисахаридов бактерий рода Я. seropedicae Z78 и Я. lusitanum Р6-12, а также данные, касающиеся характеристики антигенных детерминант данных гликополимеров.

1 Исследование химического состава капсульных и экстраклеточных полисахаридов

Интерес к исследуемым культурам связан с тем, что Я. seropedicae Z78 является типовым, ассоциированным с экономически важными сельскохозяйственными культурами, а Я. lusitanum Р6-12 - первый представитель рода гербаспирилл, обнаруженный в клубеньках бобовых. При выращивании микроорганизмов II. seropedicae Z78 и Я. lusitanum Р6-12 на жидкой синтетической среде с малатом и глюкозой в качестве источников углерода, культуры достигают окончания экспоненциальной фазы роста к 16 и 12 часам соответствешю. При данных условиях клетки образуют капсулу, наличие которой было выявлено негативным контрастированием по методу Гипса. В результате проведенного эксперимента на темно-сером фоне были хорошо видны овальные участки капсул, не воспринимающие краситель, внутри которых располагались окрашенные в розово-малиновый цвет клетки бактерий (рис. 1). В качестве примера приведен рисунок только для Я. seropedicae Z7S, так как внешний вид картины был одинаков для обоих исследуемых видов.

Из культуральной жидкости и капсульного материала бактерий Я. seropedicae Z78 и И. lusitanum Р6-12 были выделены, хроматографически очищены и охарактеризованы ЭПС278, КПС278, ЭПСР6_,2 и КПСрб-12-

Показано, что в состав препаратов, помимо углеводов, белка и фосфора, входит КДО (табл. 1). Известно, что КДО является маркером молекулы ЛПС. Однако для некоторых штаммов Е. coli (Whitfield et al., 1993), Azospirillum (Konnova et al„ 1994) было показано ее присутствие в КПС, а у бактерий рода Rhizobium КДО является компонентом повторяющихся звеньев КПС (Carlson et al., 1985).

Рис. 1. Клетки Н. яегоресИсае Z78, окруженные капсулами. Негативное контрастирование по методу Гинса. Длина масштабной линейки 25 мкм.

В липидных составляющих гликополимеров гербаспирилл выявлено присутствие предельных, непредельных алкановых и гидроксиалкановых кислот с длиной углеродной цепи от С10 до С,8.

На основании наличия КДО и гидроксикислот в ЭПС278, КГ1С278, ЭПСрб-12 и КПСР6_12 было сделано предположение, что они представлены экстраклеточными формами ЛПС или представляют собой смесь ЭЛПС и КПС и/или ЭПС. В связи с этим, была предпринята попытка выделения ЛПС из исходных препаратов ЭПС278, КПС278, ЭПСР6_12, КПСР6.12 методом ультрацентрифугирования. В результате были получены гелеобразные осадки (ЭПС1278, КПС1278, КПОрб-12), предположительно являющиеся липополисахаридами, и супернатанты, содержащие экстраклеточные и капсульные ПС (ЭПСИ278, КПСП278 и ЭПСИрб-12) Для ЭПСрб-12 прозрачного гелеобразного осадка обнаружено не было. Все образцы были хроматографически очищены. Специфическими реакциями на соответствующие компоненты в составе всех выделенных образцов ПС были найдены углеводы, КДО, фосфор и белок (табл. 1).

В составе липидной части ЭПС1278, КПС1278, КПСП278> ЭПСИР6.12, КПС1Р6.12 и КПСПР6.12 были идентифицированы насыщенные, ненасыщенные и гидроксикислоты (табл. 2), в препарате ЭПСН278 жирных кислот не обнаружено. Профили ЖК КПС1278 и КПС1[273 (за исключением С16:0) были идентичны таковым мажорных и минорных ЖК в КПСг78. Это указывает на преобладание в пуле КПС278 липидной составляющей КПС1278, что хорошо согласуется с результатами исследования выхода КПС1278, который был в четыре раза выше, чем КПСП278. Содержание гидроксикислот в КПС1278 составило 44.3%, а в КПС11278 - только 8.1% от общей массы МЭЖК. Наличие небольшого количества гидроксикислот в КПСН278 может быть связано с тем, что этот препарат, несмотря на наличие КДО, не является ЛПС, а представляет собой полисахарид, ассоциированный с липидным компонентом.

Несмотря на то, что при ультрацентрифугировании ЭПСР6_12 не произошло осаждения гелеобразного осадка ЭЛПС, как в случае с ЭПС278, наличие в ЭПСПРб.12 КДО и присутствие ~ 40% гидроксилированных ЖК, позволяет предположить, что он представляет собой ЛПС, отличный от капсульного ЛПС составом ЖК. Сумма гидроксикислот для КПС1рб-]2 и КПСНрб-12 была - 60% (табл. 2), что, наряду с достаточно

высоким содержанием углеводов и КДО (табл. 1) в образцах КПС1Р6.12 и КПС11Р6.,2, также свидетельствует об их липополисахаридной природе.

Анализ моносахаридного состава ЭПС1278> ЭПСН278, КПС1278, КПСН278, ЭПСПР6.,2, КПСІрб.,2 и КПСНрй.,2 выполняли методом ГЖХ в виде ацетатов полиолов. В составе ЭПС1278 и ЭПСП278 было выявлено небольшое содержание неидентифицированного компонента и показано преобладание маннозы (Man), глюкозы (Glc) и галактозы (Gal) в соотношении 1:4:3. На их долю приходилось до 95% от суммы пиков всех идентифицированных ацетатов полиолов.

Таблица 1

Биополимерный состав и выходы гликополимеров бактерий Я seropedicae Z78 и Я lusitamm Р6-12

Образец Содержание, % Выход, %

Углеводы Белки КДО Фосфор

KncZ78 10.8 ±0.6 1.3 ±0.1 2.9 ±0.1 5.0 + 0.8 0.7*

КПС1278 7.3 ± 0.8 1.5 ±0.1 0.7 ±0.1 1.1 ±0.2 15.6'

КПСІІ278 4.2 ± 0.4 0.2 ± 0.0 0.5 ± 0.0 4.5 ± 0.2 63'

ЭПС278 35.4+ 1.2 4.0 + 0.1 0.3 + 0.0 1.0 ±0.1 1.5*

ЭПС1г78 66.1 ±3.6 6.9 ± 1.7 0.4 ± 0.0 1.6±0.1 8.3'

ЭПСПст 47.3 ± 1.7 0.8 ±0.1 0.2 ±0.0 0.8 ±0.1 37'

КПСРб-12 48.3 ± 3.3 8.3 ±0.1 2.3 ±0.1 3.9 ±0.6 1.1*

КПСІрб.,2 22.9 ± 1.1 7.8 ±0.2 0.7 ±0.0 1.2 ±0.3 49.7'

КТІСІІР6.І2 27.2 ±3.2 6.7 ± 0.4 0.7 ± 0.0 3.3 ± 0.2 43.4'

ЭПСрб-12 41.3 ±2.6 5.6 ±0.2 0.4 ±0.0 5.8 ±0.9 8.6*

ЭПСПр6_,2 29.8 ± 0.8 4.0 ±0.3 0.3 ±0.0 4.7 ± 0.2 48.6'

Примечание: «*» - выход ПС от веса сухих микробных клеток, «'» - выход от навески исходного ПС.

В ЭГГС1278 были обнаружены следовые количества (менее 0.5%) GlcN и GalN. В составе капсульных ПС Я seropedicae Z78, кроме упомянутых выше нейтральных Сахаров, были выявлены рамноза (Rha), арабиноза (Ara), глюкозамин (GlcN) и галактозамин (GalN), а также два неидентифицированных компонента. Основными по содержанию (~ 82% от суммы площадей пиков ацетатов полиолов) были Glc, Gal, GlcN и GalN в соотношении ~ 3:3:1:1. Количество Ara, Man, Rha и каждого из неидентифицированных компонентов не превышало 3 - 5%. Определение неидентифицированных компонентов выполняли методом ГЖХ-МС в виде ацетатов полиолов.

Анализ проводили для каждого отдельного образца ПС. Результат анализа ГЖХ-МС ацетатов полиолов KnCIZ78 (рис. 2) показал, что он содержит в своем составе дезоксигексапиранозу (dHexp - Rha), по два остатка гексоз (Нех/з), один остаток пентозы (Pent - Ara), два остатка Л'-ацетилгексапираноз (HexpNAc). КПС1278 содержал в своем составе два неидентифицированных компонента, которые, исходя из данных масс-спектров, представляют собой глицерин (Gro) и 1,2,3,4-бутантетраол (рис. 2). Масс-спектры ацетатов полиолов КПСП278, ЭПС1278 и ЭПСИ278 также содержали пики соответствующие 1,2,3,4-бутантетраолу, a KI ICIIZ7S еще и пик Gro.

В составе ЭПСНрб.|2 было показано преобладание Man и Glc в соотношении 1:3. lía их долю приходилось до 70% от суммы пиков всех идентифицированных ацетатов полиолов. В ЭПСПр6.12 также было выявлено небольшое содержание Gro и GlcN (~ 5%). В составе ЭПСИрб^г, кроме упомянутых моносахаридов и неутлеводного компонента, были обнаружены Rha, Ara и Gal. Содержание Rha, Ara, Gal и Gro не превышало 4 - 7% для каждого компонента. Моносахаридный состав КПС1Р6.,2 и КПСПР6.,2 отличался от

3nCIIps-i2 отсутствием Man и был представлен Gro, 1,2,3,4-бутантетраолом, Gal, GlcN и гептозой (Hep) (обязательной структурой коровой области ЛПС) в соотношении 1:1:2:2:2.5.

Таблица 2

Состав жирных кислот гликополимеров, выделенных из капсульного материала и культуральной жидкости Н. зегоресИсае 7.1% и Н. ЫхИапит Р6-12

Компоненты Содержание МЭЖК (в % от суммы площадей всех пиков)

ЭПСЬа КПСІ7Л8 КПСІЬ, ЭПСИР6-,2 КПСІР6.12 КПСПрб.і2

2-ОН-Сюо 12.4 ■ 8.1 - - -

З-ОН-Сюо 17.3 21.1 - 14.2 17.8 17.9

Cl2:0 10.6 2.6 - 10.1 21.3 16.8

Cl4 0 6.2 29.6 - - - -

2-ОН-СІ20 - - - 13.4 17.3 19.4

3-OH-Cl20 - 23.2 - 15.4 19.1 20.8

Cl5:0 - - 9.0 - - -

І-Сі5:0 5.4 - 12.9 - - -

а-Сі5:0 6.2 - 22.3 - - -

І-СібО 4.8 - 18.1 - - -

С16 0 15.4 20.7 12.3 - 13.9 11.2

С|6:| 5.0 2.7 - - 1.9 3.1

І-Сі7:0 - - 8.0 - 2.8 3.4

а-Сі7о - - 9.3 - - -

Сі8:1 13.3 - - - 4.4 5.2

Ct8:0 3.3 - - - - -

ЖК1 - - - 14.0 - -

ЖК2 - - 16.3 - -

ЖКЗ - - - 12.6 - -

£гидроксикислот 29.7 44.3 8.1 43.0 54.2 58.1

Примечание: «-» - компоненты отсутствуют.

В составе КПСІрб-12 и КПСІІрб-іг. кроме упомянутых моносахаридов и неуглеводных компонентов, были обнаружены Шіа, Ага и С1с, содержание которых не превышало 1 - 7% для каждого компонента.

Учитывая идентичность моносахаридного состава КПС1Р6.12 и КПСПРб_і2 и состава жирных кислот, а также близкие значения содержания различных компонентов при определении биополимерного состава, можно сделать вывод о том, что эти препараты являются одним и тем же высокомолекулярным гликолипидом липополисахаридной природы. Однако они имеют некоторые отличия по составу ЖК и моносахаридов от экстраклеточного гликолипида бактерий этого штамма Наличие в составе гликополимеров ЗПСІ278, ЭПСП778, КПС1278 и КПСН^з неуглеводного компонента могло объяснить низкое содержание углеводов (табл. 1) в этих препаратах. Однако содержание бутантетраола в капсульных гликанах было в два раза выше, чем в экстраклеточных. Мы предположили, что ацетилированию подверглись не все остатки бутантетраола.

Действительно, анализ ГЖХ-МС ацетатов полиолов показал, что на долю этого полиспирта в капсульных ПС приходилось до 80% от суммы пиков всех идентифицированных мономеров, а в экстраклеточных ~ 20%, что хорошо сопоставимо с данными по содержанию углеводов в образцах.

Неху Нех/

-•гтсго-

«кдамо-

•еСОПМО ХЮАЙ-

кожоо 1отохю:

я в-

бп»

НехГЧАс

НехМАс

-- I . I I 1

Рис. 2. Спектр ГЖХ-МС ацетатов полиолов КПС1278.

Необходимо отметить, что остатки полиолов (глицерина, рибитола, маннитола) являются неотъемлемой частью тейхоевых кислот грамположительных бактерий. Однако существуют данные, указывающие на наличие остатков спиртов в структуре повторяющихся звеньев ЛПС и КПС грамотрицательных микроорганизмов, причем полиолы обнаруживаются как в виде боковых заместителей, так и в структуре главной цепи, соединяясь с остатками Сахаров через фосфодиэфирную связь (Туо\\ е1 а1, 2001).

Таким образом, в составе капсульного материала Я. ¡егоресИсаг 278 были обнаружены два вида гликополимеров. Один из них липополисахаридной природы и полисахарид, ассоциированный с липидным компонентом. Для Я. ¡шИапит Р6-12 характерно образование лишь полимера липополисахаридной природы. В культуральную жидкость Я. ¡егоресИсае Ъ1% и Я. Ызкапит Р6-12 выделяют экстраклеточные формы ЛПС, а Я. вегоресИсае Ъ1% еще и полисахарид. ЭПС Я. 1шНапит Р6-12 отличается от капсульного гликана моносахаридным составом, а также составом липидной компоненты. Капсульные и экстраклеточные ПС Я. ¡егоресИсае ТП имеют близкий моносахаридный и значительные различия в составе жирных кислот. Полисахаридные части капсульных полимеров Я. яегоресИсае ЪПЪ и Я. ¡изНапит Р6-12 содержат остатки глицерина и бутантетраола. В то время как ПС части экстраклеточных гликополимеров обоих штаммов характеризуются присутствием только глицерина. Остатки полиспиртов с большей долей вероятности соединены посредством фосфодиэфирных связей и несут на себе высокую плотность отрицательного заряда. Известно, что низкомолекулярные ЭПС ризобий могут служить супрессорами растительных защитных реакций. Возможно, по аналогии с полианионными ЭПС ризобий и различных фитопатогенов (АБ1ат е/ а!.. 2009; ЭШро е/ а1„ 2010), КПС и ЭПС гербаспирилл могут хелатировать ионы Са2+, участвуя в подавлении защитных реакций растения. Для многих микроорганизмов было показано, что ЛПС, наряду с другими микробиыми метаболитами, индуцируют защитные механизмы растительных клеток. Однако в случае симбиотических отношений, бактериальные ПС, в том числе и ЛПС, часто выступают как ее супрессоры, подавляя выделение N0, активных форм кислорода и приток ионов кальция (БШро е1 а1, 2010). КПС^, ЭПС1278, КПС1Р6.12 и КПСНР6.12> являясь экстраклеточнои формой ЛПС, также могут оказывать подобное воздействие на растение, для оптимизации условий эндофитного существования. Гетерогенность полисахаридсодержащих полимеров поверхности Я яегоресНсае 7Л% и

Я. lusitanum Рб-12, очевидно, связана с их различной ролью в процессе колонизации растения и реализации эффективного симбиоза, а также адаптации к существованию в тканях растения.

2 Исследование химического состава липополисахаридов

В настоящее время известна только одна работа, посвященная исследованию состава ЛИС Я. seropedicae (Serrato et al., 2010). Авторы получали ЛПС с поверхности клеток, не отмытых от капсулы. Нами показано, что капсульные гликополимеры исследуемых бактерий являются экстраклеточной формой ЛПС. При экстракции О-антигена они также могут попадать в состав препарата и существенно влиять на результаты дальнейших исследований. Мы осуществили параллельное выделение ЛПС из внешней мембраны Я. seropedicae Z78 и Я. lusitanum Р6-12 по модифицированной методике Галаноса (РСР-экстракция) и стандартной Вестфаля (PW-экстракция) с разделением yiIICPWw и ЛПСР\УР11) и без разделения слоев (ЛПСРХУ). В отдельных экспериментах, для исключения коэкстракции фосфолипидов из микробной массы, проводили предварительную процедуру очистки. Выход ЛПС варьировал от 1 до 6% от веса сухой микробной массы в зависимости от способа экстракции (табл. 3). Электрофоретический анализ ЛПС обоих видов показал сосредоточение большей части макромолекул в нижней части трека. Для Я. seropedicae Z78 визуализированы две узкие полосы в верхней части фореграммы, а для Я. lusitanum Р6-12 — три. Сравнительный анализ выходов и макромолскулярной организации выделенных полисахаридов позволили провести детальный анализ компонентов внешней мембраны и подобрать оптимальный метод экстракции. Результаты анализа биополимерного состава представлены в табл. 3. Показано, что на долю углеводов в образцах приходится от 9 до 23% от массы препаратов (табл. 3). Разброс в содержании углеводов, учитывая, что результаты электрофоретического анализа говорят о значительном преобладании в пуле мембранных ЛПС молекул R- и лишь незначительном присутствии S-форм, может быть объяснен возможностями методов экстракции давать при выделении более высокомолекулярные и низкомолекулярные фракции. В составе всех выделенных ЛПС была идентифицирована КДО. Во всех образцах ЛПС Я. seropedicae Z78 обнаружено небольшое (менее 1%) количество общего фосфора, в то время как в ЛПС Я. lusitanum Рб-12 его содержание было значительным (табл. 3). Разницу в содержании данного компонента в ЛПС исследуемых микроорганизмов можно объяснить различной длиной их полисахаркдной цепи. Известно, что фосфатные группы, локализованные в липиде А и во внутренней части кора, являются высокоэффективными катионсвязывающими участками в молекуле ЛПС. Степень ионизации отрицательно заряженных групп определяет силу отталкивания между ними, гидратацию полярной части и образование водородных связей, что влияет, в конечном итоге, на субмолекулярную организацию ЛПС в мембране (Mayer et al., 1985).

В составе липидной части ЛПС были идентифицированы насыщенные, ненасыщенные и гидроксикислоты с длиной углеродной цепи от Сю до С]8 (табл. 4).

Метод PW-экстракции позволил разделить весь пул мембранного ЛПС Я. seropedicae Z78 на гидрофобную и гидрофильную фракции. Преобладающими в препаратах оказались 3-гидроксидекановая (З-ОН-Сюо), 3-гидроксидодекановая (3-ОН-С12;о), тетрадекановая (С14:0), гексадекановая (С16:0) кислоты, а также октодеценовая (C1S:i) в ЛПС278Р\Ур11 и 2-гидроксидодекановая (2-ОН-С12 0) в JiriCZ7gPWw (табл. 4).

Исследование состава ЖК фосфолипидов препарата Я. seropedicae Z78 (<WIZ78), полученных экстракцией с поверхности клеток смесью хлороформа и метанола методом ГЖХ показало, что эти макромолекулы построены из изопентановой (¡-Ci5o), С16:0,

гексадеценовой (С1&1), С^ и нонадекановой (С]90) кислот (табл. 4). В связи с этим, присутствие в препарате ЛПС278Р\\'Р1, С]8:1 и следовых количеств С,6 ! и 1-С150 можно объяснить наличием примеси ФЛ278, которые, вероятно, попадают при выделении ЛПС в фенольную часть экстракта за счет своей гидрофобности.

Таблица 3

Биополимерный состав и выходы ЛПС бактерий Н. зегоресНсае 278 и Н. Шйапит Р6-12,

выделенных разными методами

Компоненты ЛПCz7sPWw ЛПСгуаРУ/рь ЛПС278РСР ЛПСрб-і2РСР ЛПСР6.|2Р%'

Углеводы 23.3±1.6 18.7±1.1 8.8±0.2 12.7±0.5 22.1±2.5

8*. Белок 1.5±0.1 2.0±0.1 0.5±0.1 0.8±0.1 2.7±0.1

£ § Р, к Фосфор 0.8±0.1 0.6±0.1 0.4±0.1 5.5±0.4 6.1±0.1

и КДО 1.6±0.0 1.9±0.1 1.9±0.2 0.6±0.1 0.4±0.1

Выход ЛПС, % от веса сухих клеток 1.0 1.5 6.0 3.0 5.4

Из обезжиренных клеток Р\¥-экстракцией выделяли ЛПСг78Р\Ул. и ЛПCZ78PWph (табл. 4). Составы и соотношения ЖК ЛПС^РХУ1,*, и ЛПС273Р\У'Г;, оказались одинаковыми. На основании этого можно констатировать, что распределение макромолекул в водную и фенольную части экстракта связано с размерами их полисахаридной составляющей. Таким образом, показано, что в состав липида А ЛПС Н. ¡егореЛсае 778 входят З-ОН-Сю о, 2-ОН-С120, З-ОН-С12 0, С14 0, 2-ОН-С|4:о и С16 0 кислоты. Сумма гидроксикислот в образцах ЛПС, полученных после обезжиривания клеток, составила ~ 63% (табл. 4), что согласуется с литературными данными о количестве гидроксикислот в липидах А (Красикова с соавт., 1989).

Анализ, проведённый методом ГЖХ после метанолиза ЛПС Н. 1и$Иапит Р6-12, выявил, ЧТО ОСНОВНЫМИ по содержашпо были С,2:0, 2-ОН-С12 0, З-ОН-С12 0, 2-ОН-С14 0 и С16:0. В ЛПС Н. ¡гиНапит Р6-12 также были обнаружены С161 и С^, но в меньшем количестве (4.9 и 4.1% соответственно). Общее содержание ЖК в образце ЛПС составило ~ 70%. Профиль ЖК ФЛ Н. \usitanum Р6-12 оказался похожим на профиль ЖК ФЛ Н. хегоресИсае 7.78, однако он отличается наличием в качестве мажорного компонента гептадекановой (С170) и полным отсутствием С19 0 кислот (табл. 4).

Из обезжиренных клеток Р\У-экстракцией без разделения слоев, выделяли ЛПСр^РХУ'. После экстракции не проводили разделения на водную и фенольную составляющие, в связи с тем, что по предварительным экспериментам и по аналогии с ЛПС278Р\У„ и ЛПС278Р\У'Р11 мы показали, что составы и соотношения ЖК во фракциях одинаковы. Полученные препараты характеризовались присутствием С1&1 и С18 ! кислот. Было отмечено снижение содержания С16 о, а также увеличение С12 0, 2-ОН-С12 0, З-ОН-С^о и 2-ОН-С140 кислот (табл. 4). Показано, что гидроксикислоты в ЛПС Н. ¡изНапит Р6-12 составляли ~ 30% от содержания МЭЖК. В исследуемом образце также были обнаружены ненасыщенные ЖК (9%).

Обнаруженные небольшие отличия в количественном соотношении отдельных жирных кислот, входящих в состав липидных компонентов ЛПС Н. зегоресИсае 278 и Н. 1изИапит Р6-12, могут оказывать существенное влияние на их биологическую активность. Также необходимо отметить наличие отличий состава ЖК мембранных ЛПС данных микроорганизмов от капсульных и экстраклеточных полисахаридов.

Проведённые эксперименты показали, что наиболее эффективным способом экстракции ЛПС из внешней мембраны Н. ¡егореЛсае Ъ1Ъ и Н. /и.чНапит Р6-12 является

метод Вестфаля из обезжиренных клеток. Данная процедура позволяет получить препараты с достаточно высокими выходами, не содержащие примесей посторонних компонентов, которые наиболее подходят для дальнейших исследований структуры и биологической функции. В связи с этим, нами для дальнейших исследований применялись препараты ЛПС, полученные по методу Вестфаля из обезжиренных клеток Н. ¡егоресИсае Ъ1% и Н. 1и$Иапит Р6-12, обозначенные далее как ЛПС278 и ЛПСР^12.

Таблица 4

Соотношение жирных кислот в препаратах липополисахаридов и фосфолипидов бактерий Н. хегоресИсае 2П9, и Н. 1шИапит Р6-12

жк Содержание МЭЖК (в % от суммы площадей всех пиков)

flnCznPWw ЛПС2ЛР\У„, ФЛг7, ЛПС27,Р\У\, ЛПСг7,Г\Ур, ЛПСИИ2Р\У ФЛрыг

Cl2:0 - - - - - 11.1 21.1

3-OH-Cioo 14.0 10.2 - 14.3 16.8 сл сл

2-OH-Ci2 о 9.1 сл 11.8 11.3 11.1 - 17.9

3-ОН-С,2о 20.2 14.2 - 28.7 25.7 9.4 - 14.2

28.0 16.4 - 27.0 28.1 сл - сл

сл сл 26.6 - - - . -

2-ОН-См» сл сл - 8.3 8.6 8.6 16.2

С iso 14.8 26.5 31.0 6.7 9.5 22 49.1 7.2

С]б:1 сл сл 14.2 - - 4.9 12.3 _

С ]7 О - - сл - - сл 15.8 -

C¡3:1 - 10.7 14.2 - - 4.1 22.7 -

- - 14.0 - - - - -

£гидрокси кислот 43.3 24.0 - 63.1 62.4 29.1 - 48.3

Примечание: «-» — компоненты отсутствуют.

3 Иммунохимическое исследование гликополимеров бактерий рода НегЬахртПит

Сотрудниками лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН были любезно предоставлены для исследований поликлональные кроличьи Ат, полученные к целым клеткам бактерий Н. зегореШсае обработанным глутаровым альдегидом (Ат278) (Матора с соавт., 1998; 2005). Хроматографически очищенные препараты ЛПС^а, ЭПС1278, ЭПСП278, а также КПС1278 и КПСН278 тестировали на способность взаимодействовать с Ат278 методом твердофазного ИФА (рис. 3). Было показано, что ЛПСг78, ЭПСП278 и КПСН278 взаимодействовали с Ат278. Максимальный ответ наблюдался для ЛПС278, тогда как ЭПС1278 и КПС1278 не преципитировались Ат278, что может свидетельствовать об антигенных различиях препаратов ЭПС1278 и КПСТ^з от ЛПС278.

Фаговые Ат отличаются более высокой специфичностью, по сравнению с поликлональными. С использованием овечьей фаговой библиотеки антител были получены м-Атдпс, м-Атэпсь м-АтЭПс1ь м-АтКПа и м-Аткпсп- Селекцию полученных специфических м-Ат проводили с использованием фагового дисплея антител, любезно предоставленного профессором У. Харрисом (Университет Абердина, Великобритания),

Результаты ИФА показали высокую эффективность использованной в данной работе процедуры увеличения специфичности м-Ат. От раунда к раунду увеличивалось число фагов, несущих специфичные вариабельные домены к соответствующим Аг (рис. 4). В качестве примера на рис. 4 приведены результаты ИФА после первого и четвертого раундов селекции м-Ат к КПСП278. м-Аткпсп после первого раунда селекции

взаимодействовали со всеми исследуемыми препаратами, а после четвертого - на одном уровне с гомологичным Аг, с ЛПС278 и с КПС1278, но не взаимодействовали с экстраклеточными полисахаридами.

Рис. 3. Твердофазный иммуноферментный анализ ЛПС278 (1), КПСН278 (2), ЭПСН278 (3).

ЭПС1278 (4), КПС1278 (5) с Ат278.

Для выявления наличия или отсутствия общих АгД гликополимеров Я. ¡егоресИсае Z78 и Я 1шИапит Р6-12 был проведён сравнительный анализ с использованием м-Ат к ЛПС278, ЭПС11278, КПСП/78, ЭГ1С1278 и КПС1278, а также поликлональных кроличьих Ат278 методами ИФА и двойной радиальной иммунодифузии.

Анализы показали, что препараты ЛПС, КПС и ЭПС Я. ¡и.чНапит Р6-12 не реагировали с поликлональными, а также со всеми м-Ат к Аг Я ¡егоресИсае 7,7%, что свидетельствует об отсутствии в составе гликополимеров исследуемых штаммов общих АгД. Степень связывания м-Атлпс с гомологичным Аг в ИФА характеризовалась достоверным отличием от контроля. Также отмечалось достоверное различие уровня взаимодействия м-Атлпс с КПС1278 и КПСИ278, причем наибольшая активность выявлялась в отношении КПСП278, что говорит о большей представленности в их составе специфичных АгД. ЭПСИг78 и ЭПС1278 характеризовались очень слабой, почти на уровне контроля, преципитацией с м-Атклсп. Для м-Аткпот реакция с ЛПС278 была слабее, а с КПС1278 сильнее, чем с гомологичным Аг (табл. 5). М-АтЭпс1 и м-АтЭпси проявляли активность со всеми выделенными препаратами Н. ¡егоресИсае 7.19,, при этом реакция с гомологичными Аг была слабее, чем с КПСП278, в случае которого достигалась максимальная оптическая плотность продуктов в реакции ИФА. Взаимодействие м-АтЭПс1 и м-АтЭпсн с ЛПС278 было более активным, чем КПС1278 (табл. 5).

М-АтКПс1 проявляли активность со всеми Аг Я ¡егоресИсае 7ЛЧ, однако наиболее высокий уровень наблюдался для ЛПС278, ЭПСН278 и КПСП278.

Результаты анализа полученных данных указывают на сложную природу полисахаридсодержащих антигенов поверхности Н. .чегоресіісае 7ЛК. Очевидно, что ЛПС278, КПСН278 и КПС1278 имеют индивидуальные АгД, которые узнаются м-АтЛПс и м-Аткпсп. а также отсутствуют в ЭПС1278 и ЭПСН278. А м-АтЭПсп позволяют обнаружить в составе ЛПС278, КПС1278 и КПС1278 АгД, присутствующие в ЭПСП278 и ЭПС1278.

030 0J25 020 015

і -«-лпсетв : -*г-кпсіг78 s-í-raicn^g

•>^*-эпспг78

6-контроль

tíOMep яункя

(а)

0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00

(б)

Рис. 4. Твердофазный иммуноферментный анализ KnCIZ78, КПСИ278, ЭПС1278, ЭПСИ278 и ЛПС278 с м-Аткисп, полученными после 1 (а) и 4 (б) раундов селекции.

Полученные результаты хорошо коррелируют с данными о моносахаридном составе исследуемых препаратов. Для ЛПС278, КПСИ278 и КПС1278 характерно наличие Rha, GlcN и GalN, которые могут входить в состав АгД этих гликанов. Это объясняет преципитацию м-Атлпс> м-Аткпст и м-Аткпсп не только с гомологичными А г, но и перекрестные реакции с ЛПС278, КПСН278 и КПС1278. Из-за отсутствия в составе ЭПСП278 и ЭПС1278 Rha и наличия GlcN и GalN лишь в следовых количествах не наблюдается реакции этих гликанов с м-Атлпс и м-Аткпсп-

Взаимодействие м-АтЭПа и м-АтЭПсп с ЛПС278, КПСИ278 и КПС1278 можно объяснить присутствием Glc и Gal в составе этих Аг. На основании всего изложенного, можно предположить, ЧТО М-АТдпс и М-Аткпсц должны проявлять большую специфичность к детерминантам, содержащим Rha, GlcN и GalN, м-АтЭпа и м-/\тэпси - к детерминатам содержащим Glc и Gal, а м-Ат^псі - и к детерминантам несуїцим и те и другие сахара в равной степени.

Методом иммунодиффузии была проведена оценка ингибирующего эффекта моносахаридов, входящих в состав ЛПС278, - коммерческих препаратов Gal, Glc, GlcN, ОПС278 и корового олигосахарида Z78 (полученных нами в результате мягкого кислотного гидролиза ЛПС278), а также, выделенный из полисахарида бактерий рода Azospirillum, по модифицированной методике препарат D-Rha. Для сравнения в качестве отрицательного

Таблица 5

Результаты сравнительного иммуноферментного анализа гликополимеров бактерий Я seropedicae Z78 и Я. lusitanum Р6-12

Аг/Ат м-Атлпс М-АТкпа м-Аткпст м-Атэпа м-Атэпси

mcZ78 1 И 1 +++ ++ +++ +++

КПС1278 ++ ++ ++++ ++ ++

кпси278 +++ +++ +++ ++++ ++++

ЭПС1278 - ++ - ++ ++

ЭПСП278 - +++ - ++4- +++

ПС штамма Р6-12 - - - - -

Примечание: «++++» - максимальное взаимодействие (М90~0.6), «+++» - сильное взаимодействие (0490-0.4), «++» - взаимодействие средней силы (¡X90-0.3), «-» - взаимодействие отсутствует (0490-0.1).

Рис. 5.

контроля была взята альтроза (Altr). Концентрацию моносахаридов 10"4М выбирали с заведомым избытком по отношению к концентрации специфических Ат. Концентрация м-Атдпс составляла 2.4x10" вирионов/мл, а липополисахарида 0.015 мг/мл.

Результаты, представленные на рис. 5, показывают, что по убыванию степени торможения иммунохимических реакций, данные ингибиторы можно расположить в следующей последовательности: коровый олигосахарид, D-Rha, ОПС275, Glc, Gal и GlcN. Altr не проявляет эффекта ингибирования. Степень взаимодействия Ат, обработанных этим моносахаридом, совпадает с контрольным образцом для необработанных Ат. Показано, что кор полностью ингибировал m-Атдпс- OnCZ78 также ингибировал м-АтЛПс, но в меньшей степени. Glc, Gal, GlcN одинаково ингибировали м-Атдпо но сильнее чем ОПС278.

На основании полученных результатов можно констатировать, что м-Атлпс проявляют большую специфичность к коровой области ЛПС278, а из моносахаридов к D-Rha (рис. 5). Эти результаты согласуются с выдвинутым нами предположением о наибольшей специфичности м-Атлпс к детерминантам несущим именно этот моносахарид.

0.6 0.5 □ .4 03 0.2 0.1 0

ОПС Gal кор ас GlcN Altr

Оценка действия ингибиторов в реакции jmCZ7S с м

D-Rha

-Атдпс методом ИФА.

Ингибирование м-Атдпс ® различной степени широким набором Сахаров, вероятно, указывает на значительную разветвлснность и гетерогенность корового олигосахарида.

4 Выделение О-специфических полисахаридов, коровых олигосахаридов //. seropedicae Z78 и Н. lusitanum Рб-12 и исследование химической структуры повторяющегося звена Н. seropedicae Z78

В связи с отсутствием в литературе данных о структуре ОПС ассоциативных диазотрофных бактерий рода Herbaspirillum, которые играют важную роль в функционировании бактериальной клетки и взаимодействии микроорганизмов с другими биологическими системами, было проведено выделение и исследование этих гликополимеров.

Для получения ОПС и коровых олигосахаридов Я. seropedicae Z78 и Я. lusitanum Р6-12 был проведен кислотный гидролиз соответствующих ЛПС. Выходы OnCz78) ОПСР6.і2, корІ278, KopIIZ78, корірв.,2 и корИрб.,2 составили 6.1, 10.6, 17.0, 23.0, 7.7 и 16.1% от навесок ЛПС соответственно. Низкие выходы ОПС и высокие олигосахаридов кора в сочетании с данными электрофореза ЛПС в ПААГ, свидетельствует о преобладании в пуле мембранного ЛПС молекул R-формы.

В препаратах ОПС278 методом ГЖХ показано наличие Rha, Man, Glc, Gal, GlcN, GalN и неидентифицированного компонента, а в OnCPS.¡2 - Rha, Gal, GlcN и также неидентифицированного компонента. Эти препараты также характеризовались значительным содержанием гептоз. Разнообразие моносахаридного состава и данные электрофореза ЛПС позволяют предположить присутствие корового олигосахарида в выделенном препарате ОПС.

Неидентифицированным компонентом, как и в случае с КПС1278 и KnCIIZ78, является глицерин. Для определения типов замещения моносахаридных остатков, полисахариды были подвергнуты метилированию в присутствии твердой щелочи, пиролизу и исследованию методом ГЖХ-масс-спектрометрии в виде частично метилированных ацетатов полиолов. Показано, что ОПС Я. seropedicae Z78 почти на 80% состоял из замещенного глицерина. Помимо этого в составе ОПС были обнаружены 3-замещенная дезоксигексапираноза (dHexp), два остатка терминальных гексоз (Hex/;), 2,3-замещенная dHex/?, остатки 4- и 6-замещенных Нехр, 3,4,7-замещенная Hep, rio два терминальных остатка N-ацетил гексапираноз (HexpNAc), 4-замещенных HexpNAc и неидентифицированных аминосахаров.

KopIZ78 характеризовался наличием Rha, Man, Glc, Gal, GlcN, GalN и Hep в соотношении 2:5:4:11:1:1, тогда как корН278 включал в свой состав Rha, Glc, Gal, GlcN и Hep в соотношении 1:4:2:6.

КорІрб.і2 и корПрб.12 имели идентичный моносахаридный состав, представленный Rha, Gal, GlcN, но показаны различия в соотношении Сахаров (1:3:2 и 3:1:1 соответственно).

Коровая область ЛПС Я. seropedicae Z78 характеризовалась полным отсутствием четырехатомного спирта и неидентифицированных аминов. Было показано, что KopIZ78 содержал два остатка терминальных Hex/?, остатки 2-, 4-, 3-, 6-замещенных Hex/), 2-замещенную Hep, терминальную и 4-замещенную HexpNAc. В составе KopIIZ78 почти полностью отсутствовали гексозы, за исключением одного остатка терминальной Исхр. В этом препарате также были обнаружены терминальная Hep, 2- и 6,7-замещенные Hep.

Анализируя данные моносахаридного состава было сделано предположение, что структура повторяющегося звена ОПС представлена глицерином и одним из аминов, в то

время как сахара, найденные в кор1278, представляют собой составляющие внешнего, а в корП^ —внутреннего коров липополисахарида.

Использование физико-химических методов не позволило нам установить структуру повторяющегося звена ОПС278. Гетерогенная природа ОПС278 явилась причиной того, что не полностью был определен состав ПС и конфигурации некоторых остатков. Для установления тонкой химической структуры исследуемого ОПС, включающей определение последовательности моносахаридов и неуглеводных заместителей, типов связей между остатками моносахаридов, а также степени разветвления повторяющихся звеньев, был проведен анализ методом 'Н- и 13С-ЯМР спектроскопии.

Р ЯМР спектр ОПС показал наличие сигнала одной монофосфатной группы при 1.43 м.д. ОПС был дефосфорилирован 48% HF. Гель-фильтрация полученной смеси на колонке с TSK HW-40 позволила выделить две низкомолекулярных фракции, которые были проанализированы ГЖХ после восстановления и ацетилирования. В их составе были идентифицированы Gro и GlcNAc в разном соотношении, что позволило нам предположить, что именно эти компоненты образуют повторяющееся звено ОПС и остаток Gro фосфоридирован.

В С ЯМР спектре (табл. 6) исследуемых фракций присутствовали сигналы одного моносахаридного остатка и глицерола, которые включали в себя сигнал аномерного углерода при 98.3 м.д., трех ОСН2-С групп (С-6 GlcNAc, С-1 и С-3 Gro) при 61.8 - 62.8 м.д., трех сигналов вторичных углеродов моносахаридного цикла при 71.4 - 73.4 и С-2 глицерола при 80.5 м.д., одного атома углерода, связанного с азотом (С-2 GlcN) при 55.2 м.д. и сигналы N-ацетильной группы при 176.1 и 23.5 м.д. В 'Н ЯМР спектре (табл. 6) присутствовал сигнал одного аномерного протона при 5.04 м.д., одной N-ацетилыюй группы при 2.04 м.д., и других сигналов в области 3.49 - 3.92 м.д. Полученные данные свидетельствуют о том, что повторяющееся звено представлено остатками глицерола и N-ацетилглюкозамина.

Одномерные 'Н- и 13С-ЯМР спектры были отнесены с помощью двумерных экспериментов COSY, TOCSY, ROESY и >Н,13С HSQC. TOCSY спектр демонстрировал корреляции Н-1 с Н-2-Н-6 для моносахаридного остатка, что подтвердило его глюко конфигурацию. Относительно низкое значение константы спин-спинового взаимодействия (КССВ) Ji 2 ~ 3 Гц указывало на то, что остаток глюкозамина присоединен а-гликозидной связью. Отсутствие сигналов в области 82 - 88 м.д., характерных для фуранозидов, свидетельствует о пираиозной форме глюкозамина. Отнесение сигналов H-l/C-1, Н-2/С-2 и Н-З/С-З глицерола было проведено на основании корреляций 'Н,13С HSQC спектра.

Двумерный ROESY эксперимент показал присутствие кросс-пиков между аномерным протоном GlcNAc и протоном при С-2 Gro 5.04/3.75 м.д., в то же время в 'Н,13С НМВС спектре была выявлена корреляция между Н-1/С-2 GlcNAc/Gro и Н-2/С-1 Gro/GlcNAc соответственно. На основании полученных данных была установлена последовательность заместителей в повторяющемся звене ОПС. Исходный ОПС был подвергнут серии экспериментов 'Н и 13С ЯМР спектроскопии, включающих 'Н,'Н COSY, TOCSY, ROESY, Н, С HSQC и НМВС. Отнесение сигналов было осуществлено по аналогии с описанным выше. Характерной особенностью ОПС было смещение химических сдвигов Н-1, Н-3 Gro в слабопольную область (табл. 6), обусловленное наличием связи с монофосфатным остатком. Помимо этого в спектрах присутствовали сигналы не связанного с GlcNAc глицерофосфата.

Таблица 6

Данные спектров 'Н-ЯМР и 13С-ЯМР ОС после дефосфорилирования ОПС и ОПС

H. seropedicae Z78

Остаток Ядра 1 (а/б) 2 3 (а/б) 4 5 6 (а/б) СНзСО

ОС после дефосфорилирования ОПС

a-D-GlcpNAc 'H 13C 5.04 98.3 3.92 55.2 3.77 72.3 3.49 71.4 3.85 73.4 3.79/3.84 61.9 2.04 23.5/176.1

->2)-Gro 'H 13c 3.67* 61.8* 3.75 80.5 3.72* 62.8*

ОПС1

a-D-GlcpNAc 'H I3C 5.10 98.1 3.95 72.3 3.82 72.3 3.49 71.3 3.97 73.3 3.80/3.90 61.8 2.09 23.4/175.9

->2,3)-Gro-l-P-(0-> 'H 13c 3.99* 65.9* 4.07 66.5 4.05* 66.5*

ОПС2

—>3)-Gro-1 -P-(0—» 'H 13c 3.91* 67.5 4.06 70.7 3.98* 67.5

Примечание: * - отнесение может быть обратным.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что изученный ОПС278 содержит в своем составе два вида повторяющихся звеньев следующего строения:

a-D-GlcpNAc і

2 (1)

->3)-Сго-1-Л{0->

->3)-Gro-l-F-(0-> (2)

Остается неясным входит ли в состав ЛПС два независимых ОПС или они являются достаточно длинными блоками внутри одной О-цепи.

Необходимо отметить, что подобные структуры являются характерными для тейхоевых кислот грамположительных (Наумова с соавт., 1987; Varbanets et al, 1990; Стрешинская с соавт., 1998) и редко встречаются у представителей грам отрицательных бактерий. В составе ОПС некоторых из них были обнаружены компоненты кислой неуглеводной природы, такие как фосфат рибита или этаноламинфосфат, находящиеся в боковой цепи полимера (Krytstyna et al., 2001). Показано, что ОПС бактерий рода Salmonella содержит 2-ацетимидоиламино-2,6-дндезокси-Ь-галактозу и фосфат рибита в основной цепи (Перепелов с соавт., 2009). ОПС малоизученного вида Budvicia aquatica построен из глицерофосфатов в основной цепи, замещенных во втором положении остатками Glc (Здоровенко с соавт., 2011). Для бактерий Е. coli 029 было показано сходство структуры ОПС со структурой тейхоевой кислоты (Perepelov et al., 2006). ОПС, содержащий глицерин в качестве повторяющегося звена, был обнаружен в составе ЛПС Proteus mirabilis 040 (Kondakova et al, 2005).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе для бактерий рода НегЪазртЦит произведен подбор оптимального метода выделения ЛПС внешней мембраны. Впервые для О-специфичеекого полисахарида бактерий Н. зегоресИсае Z78 установлена структура повторяющегося звена, в состав которого входит компонент неуглеводной природы - глицерин. Необычная для грамотрицательных бактерий структура О-специфической части липополисахарида внешней мембраны, возможно, связана с их различной ролью в процессе колонизации растения и реализации эффективного симбиоза, а также адаптации к существованию в тканях растения.

С помощью оптимизированных методов впервые для гербаспирилл выделены и охарактеризованы капсульные и экстраклеточные гликополимеры. Полисахаридные части КПС Я. зегореШсае и Я. ¡изНапит Р6-12 содержат остатки глицерина и бутантетраола. В то время как ПС части ЭПС обоих штаммов отличаются присутствием только глицерина. Возможно, присутствие данных компонентов в составе выделенных гликополимеров обусловлено эндофитным образом жизни изучаемых микроорганизмов и позволяет подавлять защитные реакции растений.

ВЫВОДЫ

1. Впервые в капсу льном материале и культуральной жидкости бактерии Я ¡егоресИсае 7.18 и Я. 1и.чИапит Р6-12 обнаружен компонент липополисахаридной природы. Для Я. яегореШсае 278 дополнительно в составе капсульного материала выявлено присутствие полисахарида, ассоциированного с липидным компонентом, и полисахарида в культуральной жидкости.

2. Капсульные и экстраклеточные полисахариды Я ¡егоресИсае 278 имеют близкий моносахаридный состав, представленный глюкозой и галактозой, в отличие от таковых Я. ¡ихИапит Р6-12, у которых в экстраклеточных гликополимерах преобладают манноза и глюкоза, а в капсульных — галактоза и глюкозамин. Кроме того, в составе капсульных и экстраклеточных гликанов обоих штаммов выявлено присутствие многоатомных спиртов {глицерина и эритрита).

3. Впервые для Я. уегоресИсае 7.1?, установлен состав двух типов повторяющихся звеньев О-специфической части липополисахарида внешней мембраны. Первый тип представлен редким для грамотрицательных бактерий компонентом - 1,3-глицерофосфатом, а второй - 1,3-глицерофосфатом, замещенным Лг-ацетил-гз-глюкозамином.

4. Преобладающими компонентами липидных составляющих гликополимеров Я. яегоресИсае Z78 и Я 1и$Иапит Р6-12 являются 3-гидроксидекановая, додекановая, 3-гидроксидодекановая, гексадекановая и октадеценовая кислоты. Гликолипид и липополисахарид из капсулы Я .четресИсаг 71И существенно отличаются составом жирных кислот между собой и от всех исследуемых гликополимеров.

5. Для бактерий Я. 5егоресИсае 718 с применением поликлональных кроличьих и высокоспецифичных фаговых мини-антител показано, что экстраклеточные полисахариды содержат общие антигенные детерминанты с мембранными и капсульными гликанами, которые характеризуются наличием дополнительных индивидуальных иммунодоминант.

6. В состав антигенных детерминант капсульных гликополимеров и липополисахарида Я яегоресЧсае 718 входят рамноза, глюкозамин и галактозамин, ответственные за перекрёстные реакции с мини-антителами (м-Атцпс, м-АтКПа и м-АтКПси)- Наибольшим эффектом ингибирования взаимодействия препаратов с гомологичными м-Ат обладали коровый олигосахарид ЛПС278 и 1>рамноза.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Работы в рецензируемых журналах и изданиях:

1. Смолькина О.Н., Шишонкова (Величко) Н.С., Юрасов H.A., Игнатов В.В. Капсульные и экстраклеточные полисахариды диазотрофных ризобактерий Herbaspirillum seropedicae Z78 // Микробиология. - 2012. - Т. 81, № 3. - С. 345 - 352.

2. Smol'kina O.N., Shishonkova (Velichko) N.S., Fedonenko Yu.P., Zdorovenko E.L., Konnova S.A., Ignatov V.V. An impoved rapid method for preparation of D-rhamnose // Carbohydr. Res. -2012. -V. 347. - P. 161-163.

3. Шишонкова (Величко) H.C., Смолькина O.H., Чернышева М.П., Игнатов B.B. Выделение и характеристика липополисахарида Herbaspirillum seropedicae Z78 II Известия Саратовского университета. Серия Химия. Биология. Экология. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2011. - Т. 11, Вып. 2. -С. 19- 85.

4. Величко Н.С., Смолькина О.Н., Староверов С.А., Дыкман Л.А., Игнатов В.В. Особенности состава и иммунохимическая характеристика мембранного липополисахарида бактерий Herbaspirillum seropedicae Z78 // Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по микробиологии, иммунологии и биотехнологии. — 2011. — Т. 4, № 1. — С. 94.

5. Шишонкова (Величко) Н.С., Смолькина О.Н., Игнатов В.В. Выделение и исследование липополисахарида ассоциативных азотфиксирующих бактерий Herbaspirillum seropedicae Z78 II Бюллетень Московского общества испытателей природы. Отдел биологический. - 2009. - Т. 114, Вып. 2. - С. 119 - 121.

Статьи в сборниках и тезисы докладов

6. Шишонкова (Величко) Н.С., Смолькина О.Н., Игнатов В.В. Выделение и исследование капсульного полисахарида бактерий Herbaspirillum seropedicae Z78 // Биология: от молекулы до биосферы: сборник тезисов / IV Международная конференция молодых ученых. Харьков, 17-21 ноября 2009. - Харьков, 2009. — С. 58-59.

7. Шишонкова (Величко) Н.С., Смолькина О.Н., Игнатов В.В. Исследование липополисахаридов бактерий Herbaspirillum seropedicae Z78 II Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов: материалы симпозиума / Всероссийский симпозиум с международным участием. Москва, 24-27 декабря 2009. -Москва, 2009. - С. 208.

8. Шишонкова (Величко) Н.С. Сравнительная характеристика мембранных и экстраклеточных гликополимеров бактерий Herbaspirillum seropedicae Z78 II Исследования молодых ученых и студентов в биологии и экологии: Сборник научных статей. — Саратов: Изд-во Сарат. Ун-та, 2010. - Вып. 8. - С. 118 - 122.

9. Шишонкова (Величко) Н.С., Смолькина О.Н., Игнатов В.В. Характеристика капсульного полисахарида бактерий Herbaspirillum seropedicae Z78 // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: сборник тезисов / V-я Межрегиональная конференция молодых ученых. Саратов, 28 сентября - 1 октября 2010. -Саратов, 2010.-С. 83.

10. Шишонкова (Величко) Н.С., Смолькина О.Н., Игнатов В.В. Состав и характеристика полисахаридсодержащих полимеров внешней мембраны бактерий Herbaspirillum seropedicae Z78. // Актуальные вопросы современной науки и образования: материалы конференции /1 Общероссийская электронная научная конференция. Красноярск, декабрь 2010. - Красноярск: Изд-во «Научно-инновационный центр», 2010. - С. 1051 - 1054.

И. Шишонкова (Величко) Н.С., Смолькина О.Н., Игнатов В.В. Экстраклеточные полисахариды бактерий Herbaspirillum seropedicae Z78 II Биология - Наука XXI века:

сборник тезисов / 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых. Пущино, 19-23 апреля 2010. - Пущино, 2010. - С. 72.

12. Шишонкова (Величко) Н.С., Смолькина О.Н., Игнатов В.В. Капсульный полисахарид бактерий Herbaspirillum seropedicae Z78 // Студент и научно-технический прогресс: сборник тезисов / XLVIII Международная научная студенческая конференция. Новосибирск, 10-14 апреля 2010. - Новосибирск, 2010. - С. 211.

13. Шишонкова (Величко) Н.С., Смолькина О.Н., Бурыгин Г.Л., Игнатов В.В. Химическая и иммунохимическая характеристика мембранных, капсульных и экстраклеточных гликополимеров Herbaspirillum seropedicae Z78 // Симбиоз-Россия 2010: сборник тезисов / III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов, Нижний Новгород, 24-29 мая 2010. - Нижний Новгород, 2010. -

С. 85.

14. Shishonkova (Velichko) N.S., Smol'kina O.N., Ignatov V.V. An extracellular and a membrane glycopolymer of the bacterium Herbaspirillum seropedicae 7Л% H 5th Postgraduate Course and Minisymposium of AB-RMS,16th Biotechnology Summer School of University of Gdansk, and 2nd Workshop of PAS and RAAS on Plant Molecular Biotechnology. - Finland, Mikkeli, July 24-31, 2010. - P. 17.

15. Шишонкова (Величко) H.C., Смолькина O.H., Бурыгин Г.Н., Игнатов В.В. Иммунохимические особенности экстраклеточных и мембранных гликополимеров // Симбиоз-Россия 2011: сборник тезисов / IV Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов. Воронеж, 24-29 мая 2011. - Воронеж, 2011. -С. 112.

16. Шишонкова (Величко) Н.С., Смолькина О.Н., Дедюкина Д.А., Бурыгин Г.Н. Игнатов В.В. Иммунохимическая характеристика мембранных и экстраклеточных полисахаридов Herbaspirillum seropedicae Z78 с использованием рекомбинантных антител scFv // Химия и биохимия углеводов: сборник тезисов / 4-й Всероссийская школа-конференция. Саратов, 14-16 сентября 2011. - Саратов, 2011. - С. 123.

17. Величко Н.С., Смолькина О.Н., Дедюкина Д.А., Игнатов В.В. Характеристика полисахаридов Herbaspirillum lusitanum Р6-12 // Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии: сборник тезисов / XXIV зимняя молодежная научная школа, Москва, 7—9 февраля 2012. - Москва, 2012. - С. 70.

Подписано в печать 23.05.12. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Объем 1 усл. печ. л. Тираж 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии «Техно-Декор» 410012 г.Саратов, Московская,! 60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Величко, Наталья Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Бактерии рода НегЬаБртИит - представители азотфиксирующих 12 диазотрофных ризобактерий

1.1.1 Физиолого-морфологические особенности гербаспирилл

1.1.2 Исследование генома НегЪазрмШит

1.1.3 Применение диазотрофных ризобактерий рода НегЬазртПит

1.2 Организация и функции наружной мембраны, капсулы и 19 межклеточного пространства грамотрицательных бактерий

1.3 Липополисахариды грамотрицательных бактерий

1.3.1 Общая характеристика липида А

1.3.2 Общая характеристика олигосахарида кора

1.3.3 Общая характеристика О-специфических полисахаридных цепей. 32 Структурное разнообразие и вариабельность

1.4 Экзополисахариды грамотрицательных бактерий

1.4.1 Капсульные полисахариды

1.4.2 Экстраклеточные полисахариды. Внеклеточные 37 липополисахариды

1.5 Функции экстаклегочных, капсульных и липополисахаридов в 41 растительно-микробных взаимодействиях

1.6 Способы получения антител для иммунохимических исследований

1.6.1 Получение поликлональных антител

1.6.2 Получение моноклональных антител с использованием 44 гибридомной технологии

1.6.3 Использование рекомбинаторной фаговой библиотеки для 45 получения мини-антител

1.7 Методы исследования иммунохимической специфичности 48 полисахаридов поверхности

1.8 Методы выделения и исследования бактериальных полисахаридов

1.8.1 Выделение и очистка экзополисахаридов

1.8.2 Экстракция и фракционирование липополисахаридов

1.8.3 Разделение липидного и углеводного компонентов 53 липополисахарида

1.8.4 Изучение строения О-специфических полисахаридов

1.8.4.1 Деструктивные химические методы с применением 55 газожидкостной хроматографии и масс-спектрометрии

1.8.4.2 Структурный анализ полисахаридов методом ядерного 58 магнитного резонанса

1.9 Липополисахариды НегЪазртИит

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Микробиологические культуры и условия выращивания

2.2 Приборы и материалы

2.3 Микробиологические методы

2.3.1 Оценка чистоты культуры

2.3.2 Выявление капсулы

2.4 Методы выделения и исследования полисахаридов бактерий рода 66 НегЬазртИит

2.4.1 Выделение полисахаридов из культуральной жидкости

2.4.2 Выделение полисахаридов из капсульного материала

2.4.3 Экстракция липополисахаридов

2.4.4 Хроматографические методы

2.4.4.1 Гель-фильтрация

2.4.4.2 Газо-жидкостная хроматография и хромато-масс 71 спектрометрия

2.4.4.2.1 Определение состава жирных кислот 71 полисахаридов и липополисахаридов

2.4.4.2.2 Определение моносахаридного состава поли- 71 сахаридов

2.4.5 Колориметрическое определение состава углеводсодержащих 72 полимеров

2.4.6 Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле

2.4.7 Получение кроличьих антител

2.4.8 Получение мини-антител

2.4.9 Твердофазный иммуноферментный анализ

2.4.10 Конкурентный иммуноанализ

2.4.11 Выделение О-полисахаридов кислотным гидролизом 75 липополисахаридов

2.4.12 ЯМР - спектроскопия 76 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Выделение и исследование химического состава капсульных и 77 экстраклеточных полисахаридов

3.2 Выделение и исследование химического состава липополисахаридов

3.3 Иммунохимическое исследование гликополимеров бактерий рода 100 Herbaspirillum

3.3.1 Сравнительный иммунохимический анализ гликополимеров 101 Н. seropedicae Z78 и Н. lusitanum Р6

3.3.2 Конкурентный иммуноанализ в оценке строения углеводных 106 эпитопов ЛПС бактерий Н. seropedicae Z

3.4 Исследование О-специфического полисахарида

3.4.1 Выделение О-специфических полисахаридов, коровых 108 олигосахаридов и определение их моносахаридного состава методом ГЖХ

3.4.2 Исследование структуры повторяющегося звена 113 О-специфического полисахарида Н. seropedicae Z

3.4.2.1 Определение характера замещения моносахаридных 113 остатков методом метилирования с последующей ГЖХ-масс-спектрометрией

3.4.2.2 'Н- и 13С-ЯМР-спектроскопия 113 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 120 ВЫВОДЫ 125 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

Аг - антиген (ы) АП - ацетаты полиолов Ат - антитело (а)

ГЖХ - газожидкостная хроматография

ГЖХ-МС - ГЖХ-масс-спектрометрия

ДМСО - диметилсульфоксид

ЖК - жирные кислоты

ИФА - иммуноферментный анализ

К-Аг - К-антигены

КДО - 2-кето-3-дезокси-0-октолузоновая кислота

КЛПС - капсульный липополисахарид

КПС - капсульный полисахарид

JIA - липид А

ЛПС - липополисахарид м-Ат - мини-антитела

МЭЖК - метиловые эфиры жирных кислот

НК - нуклеиновые кислоты

ОПС - О-специфический полисахарид

ПААГ - полиакриламидный гель

ПС - полисахарид

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ЭЛПС - экстраклеточный липополисахарид

ЭПС - экзополисахарид

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Acyl - ацил

Ara - арабиноза

COSY - Correlation Spectroscopy Gal - галактоза GalN - галактозамин Glc - глюкоза

GlcN - глюкозамин

GlcNAc - N-ацетилглюкозамин

Gro - глицерин

HSQC - Heteronuclear Single-Quantum Coherence Man - манноза ManN - маннозамин

NOESY - Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy РСР-экстракция - экстракция ЛПС по методу Галаноса PW-экстракция - экстракция ЛПС по методу Вестфаля Rha - рамноза

ROESY - Rotating-frame nuclear Overhauser Effect Spectroscopy scFv - single-chain Fragments variable TOCSY - TOtal Correlation Spectroscopy

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика химического и антигенного составов гликополимеров поверхности бактерий Herbaspirillum seropedicae Z78 и Herbaspirillum lusitanum P6-12"

Актуальность. Для большинства растений характерны симбиозы с микроорганизмами (эндофитными и ризосферными), фиксирующими азот или оптимизирующими получение других необходимых веществ из почвы. Исследования особенностей таких взаимодействий являются основой отдельного направления в прикладной микробиологии. Перспективным модельным объектом для изучения эндофитной растительно-микробной ассоциации являются бактерии рода Herbaspirillum, благодаря потенциально высокой азотфиксирующей активности, способности продуцировать. фитогормоны и иные физиологически активные вещества (Baldani et al, 1986; Bastia et al, 1998; Lambrecht et al., 2000; Souza et al., 2000; Pedrosa et al, 2001; Ongena et al, 2007). Об интересе к исследованию гербаспирилл свидетельствует выполненное секвенирование нуклеотидных последовательностей генома бактерий H. seropedicae Z78 (Pedrosa and Genopar, 2005).

Известны результаты иммунохимических исследований ассоциативных азотфиксаторов, фитопатогенных бактерий (Варбанец, 1994; Pier, 2003; Коннова с соавт., 2009), в то время как аналогичные аспекты изучения эндофитных диазотрофов, за исключением представителей рода Rhizobium, находятся на периферии исследовательских интересов. Изучение структурных особенностей и антигенного состава индивидуальных препаратов гликополимеров гербаспирилл является актуальным как для таксономических исследований, так и для понимания механизмов индукции и развития их биологического действия при формировании эндофитного симбиоза с растениями.

В связи с этим, целью работы было выявление особенностей структуры и антигенного состава гликополимеров поверхности бактерий Н. seropedicae Z78 и Н. lusitanum Р6-12.

Для реализации цели в ходе исследования решали следующие задачи:

1) выделение полисахаридов из культуральной жидкости, капсулы и внешней мембраны Н. seropedicae Z78 и Н. lusitanum Р6-12;

2) анализ химического состава углеводсодержащих биополимеров Н. seropedicae Z78 и Н. lusitanum Р6-12;

4) выделение О-специфических полисахаридов (ОПС) из липополисахаридов и определение структуры повторяющегося звена ОПС Н. seropedicae Z78.

Научная новизна работы. Получены приоритетные данные о составе экстраклеточных, капсульных гликополимеров и О-антигенов Н. seropedicae Z78 и Н. lusitanum Р6-12.

Впервые для типового штамма Н. seropedicae Z78 установлен состав повторяющихся звеньев О-специфической части липополисахарида внешней мембраны, имеющих нетипичные для грамотрицательных бактерий составляющие - ТУ-ацетил-Э-глюкозамин и неуглеводный заместитель - глицерин. Необходимо отметить, что подобные компоненты часто встречаются в структуре тейхоевых кислот грамположительных (Наумова с соавт., 1987; Varbanets et al, 1990; Стрешинская с соавт., 1998) бактерий и крайне редко обнаруживаются у грамотрицательных представителей.

С применением поликлональных кроличьих и фаговых мини-антител впервые получены сведения об антигенных свойствах гликополимеров Н. яегоресИсае Ъ1Ъ и Я ¡шНапит Р6-12.

Научно-практическая значимость. Данные о составе и структуре мембранных, экстраклеточных и капсульных гликополимеров НегЪазртИит необходимы для понимания механизмов индукции и развития их биологического действия при формировании симбиоза с растениями. Они также могут служить основой внутривидовых классификационных схем исследуемых бактерий.

Препараты полисахаридов НегЬазртИит, а также фаговые мини-антитела к ним применяются при проведении плановых НИР сотрудниками лаборатории биохимии и иммунохимии ИБФРМ РАН. Полученные антитела планируется использовать для дальнейшего сёрологического анализа коллекционных культур НегЬазртИит, а также вновь изолированных из природной среды микроорганизмов.

Доклад «Химическая и иммунохимическая характеристика мембранных, капсульных и экстраклеточных гликополимеров НегЬаяряШит яегоресИсае Z78», представленный на 3-ем Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, Россия, 2010), был удостоен диплома первой степени.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории биохимии ИБФРМ РАН.

1. Выявлен сложный многокомпонентный состав гликополимеров культуральной жидкости, капсулы и внешней мембраны бактерий

Н. зегоресНсае 278 и Н. 1жНапит Р6-12. ЛПС внешней мембраны отличны по структуре от экстраклеточных и капсульных гликополимеров липополисахаридной природы. В капсульном материале Н. зегоресИсае 2Л% дополнительно присутствует гликолипид, а в культуральной жидкости - свободный полисахарид.

2. В составе всех исследуемых гликанов Н. зегоресИсае Ъ1% обнаружены общие антигенные детерминанты, наряду с наличием индивидуальных иммунодоминантных групп в мембранных й капсульных полисахаридах.

Н. зегоресИсае и Н. I из Напит Р6-12 являются серологически различными.

3. В О-специфической цепи ЛПС Н. яегоресИсае показано наличие двух типов повторяющихся звеньев: 1,3-глицерофосфата и 1,3-глицерофосфата, замещенного во втором положении М-ацетил-о-глюкозамином.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Величко, Наталья Сергеевна

ВЫВОДЫ

1. Впервые в капсульном материале и культуральной жидкости бактерий Я. seropedicae Ъ1% и Я lusitanum Р6-12 обнаружен компонент липополисахаридной природы. Для Я seropedicae Z78 дополнительно в составе капсульного материала выявлено присутствие полисахарида, ассоциированного с липидным компонентом, и полисахарида в культуральной Жидкости. •

2. Капсульные и экстраклеточные полисахариды Я seropedicae Z78 имеют близкий моносахаридный состав, представленный глюкозой и галактозой, в отличие от таковых Я lusitanum Р6-12, у которых в экстраклеточных гликополимерах преобладают манноза и глюкоза, а в капсульных - галактоза и глюкозамин. Кроме того, в составе капсульных и экстраклеточных гликанов обоих штаммов выявлено присутствие многоатомных спиртов (глицерина и эритрита).

3. Впервые для Я seropedicae Z78 установлен состав двух типов повторяющихся звеньев О-специфической части липополисахарида внешней мембраны. Первый тип представлен редким для грамотрицательных бактерий компонентом - 1,3-глицерофосфатом, а второй - 1,3-глицерофосфатом, замещенным /У-ацетил-О-глюкозамином.

4. Преобладающими компонентами липидных составляющих гликополимеров Я. seropedicae Z78 и Я lusitanum Р6-12 являются 3-гидроксидекановая, додекановая, 3-гидроксидодекановая, гексадекановая и октадеценовая кислоты. Гликолипид и липополисахарид из капсулы Я seropedicae Z78 существенно отличаются составом жирных кислот между собой и от всех исследуемых гликополимеров.

5. Для бактерий Я seropedicae Z78 с применением поликлональных кроличьих и высокоспецифичных фаговых, мини-антител показано, что экстраклеточные полисахариды содержат общие антигенные детерминанты с мембранными и капсульными гликанами, которые характеризуются наличием дополнительных индивидуальных иммунодоминант.

6. В состав антигенных детерминант капсульных гликополимеров и липополисахарида Я. seropedicae Z78 входят рамноза, глюкозамин и галактозамин, ответственные за перекрёстные реакции с мини-антителами (м-АтЛпс> м-Аткпа и м

Аткпсп)- Наибольшим эффектом ингибирования взаимодействия препаратов с гомологичными м-Ат обладают коровый олигосахарид ЛПС278 и э-рамноза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Перспективным модельным объектом для изучения эндофитной растительно-микробной ассоциации являются бактерии рода Herbaspirillum, благодаря потенциально высокой азотфиксирующей активности, способности продуцировать фитогормоны и иные физиологически активные вещества (Baldani et al, 1986; Bastia et al., 1998; Lambrecht et'al., 2000; Souza et al, 2000; Pedrosa et al, 2001; Ongena et al, 2007). Об интересе к исследованию гербаспирилл свидетельствует выполненное секвенирование нуклеотидных последовательностей генома бактерий Я. seropedicae Z78 (Pedrosa and Genopar, 2005).

В литературе отсутствуют данные, касающиеся исследований состава и функций экстраклеточных и капсульных гликополимеров гербаспирилл. I

Фрагментарно представлены сведения об исследовании липополисахаридов. Ни для одного из штаммов не определена структура повторяющихся звеньев ОПС. В связи с этим, перед нами стояла задача о подборе оптимального метода экстракции ЛПС, изучении химической структуры их ОПС, выделении экстраклеточных и капсульных полисахаридов, выявлении химических особенностей и антигенного состава выделенных гликополимеров.

Были получены и охарактеризованы экстраклеточные и капсульные полисахариды Я seropedicae Z78 и Я. lusitanum Р6-12. В составе капсульного материала Я seropedicae Z78 были обнаружены два вида гликополимеров. Один из них липополисахаридной природы и полисахарид, ассоциированный с липидным компонентом. Для Я. lusitanum Р6-12 характерно образование лишь полимера липополисахаридной природы. В культуральную жидкость Я. seropedicae Z78 и Я lusitanum Р6-12 выделяют экстраклеточные формы ЛПС, а Я. seropedicae Z78 еще и полисахарид. ЭПС Я lusitanum P6-1Z отличается от капсульного гликана моносахаридным составом, а также составом липидной компоненты. Капсульные и экстраклеточные ПС Я seropedicae Z78 имеют близкий моносахаридный и значительные различия в составе жирных кислот. Полисахаридные части КПС Я seropedicae Z78 и Я lusitanum Р6-12 содержат остатки глицерина и бутантетраола. В то время как ПС части ЭПС обоих штаммов характеризуются присутствием только глицерина. Остатки полиспиртов с большей долей вероятности соединены посредством фосфодиэфирных связей и несут на себе высокую плотность отрицательного заряда. Известно, что низкомолекулярные ЭПС ризобий могут служить супрессорами растительных защитных реакций. Возможно, по аналогии с полианионным ЭПС ризобий и различных фитопатогенов (А81аш а1, 2009; 8Шро а1, 2010), КПС и ЭПС гербаспирилл могут хелатировать ионы Са2+, участвуя в подавлении защитных реакций 'растения. Для многих микроорганизмов было показано, что ЛПС, наряду с другими микробными метаболитами, индуцируют защитные механизмы растительных клеток. Однако в случае симбиотических отношений, бактериальные ПС, в том числе и ЛПС, часто выступают как ее супрессоры, подавляя выделение N0, активных форм кислорода и приток ионов кальция (БШро е/ а1, 2010). КПС1278, ЭПС1278, КПС1Р6.12 и КПС11р6.12, являясь экстраклеточной формой ЛПС, также могут оказывать подобное воздействие на растение, для оптимизации условий эндофитного существования. Гетерогенность полисахаридсодержащих полимеров поверхности Н. зегоресНсае и Н. 1т Напит Р6-12, очевидно, связана с их различной ролью в процессе колонизации растения и реализации эффективного симбиоза.

Показано, что наиболее эффективным способом экстракции ЛПС из внешней мембраны Н. зегоресНсае 7Л% и Н. 1ш Напит Р6-12 является метод Вестфаля из обезжиренных клеток. Данная процедура позволяет получить препараты с достаточно высокими выходами, не содержащие примесей посторонних компонентов, которые наиболее подходят для дальнейших исследований структуры и биологической функции.

В связи с отсутствием в литературе данных о структуре ОПС НегЬаэрНШит, было проведено выделение и исследование этих полимеров. Впервые для Н.

1 13 хегоресИсае с применением методов Н- и С-ЯМР спектроскопии была I установлена тонкая химическая структура исследуемого ОПС. Показано, что в состав повторяющихся звеньев входит необычный для большинства грамотрицательных бактерий компонент неуглеводной природы - глицерин. Одним из повторяющихся звеньев является 1,3-глицерофосфат, а другим - 1,3-глицерофосфат, замещенный во втором положении ТУ-ацетил-э-глюкозамином.

Необходимо отметить, что подобные структуры являются характерными для тейхоевых кислот грамположительных (Наумова с соавт., 1987; УагЬапе1з ег а1, 1990; Стрешинская с соавт., 1998) и редко встречаются у представителей грамотрицательных бактерий. В составе ОПС некоторых из них были обнаружены компоненты кислой неуглеводной природы, такие как фосфат рибита или этаноламинфосфат, находящиеся в боковой цепи полимера (Krytstyna et al., 2001). Показано, что ОПС бактерий рода Salmonella содержит 2-ацетимидоиламино-2,6-дидезокси-Ь-галактозу и фосфат рибита в основной цепи (Перепелов с соавт., 2009). ОПС малоизученного вида Budvicia aquatica построен из глицерофосфатов в основной цепи, замещенных во втором положении остатками Glc (Здоровенко с соавт., 2011). Для бактерий Е. coli 029 было показано сходство структуры ОПС со структурой тейхоевой кислоты (Perepelov et al., 2006). ОПС, содержащий глицерин в качестве повторяющегося звена, был обнаружен в составе ЛПС Proteus mirabilis 040 (Kondakova et al., 2005). Таким образом, впервые показано присутсвие глицерофосфатов в повторяющемся звене-ОПС почвенных микроорганизмов, что, возможно, обусловлено эндофитным образом жизни изучаемых бактерий и позволяет подавлять защитные реакции макропартнера.

На следующем этапе нашей работы мы провели исследования антигенного состава гликополимеров H. seropedicae Z78 и H. lusitanum Р6-12. Были получены и охарактеризованы высокоспецифичные фаговые мини-антитела ко всем выделенным препаратам биогликанов Н. seropedicae Z78.

Показано отсутствие в составе гликополимеров Н. seropedicae Z78 и Н. lusitanum Р6-12 общих антигенных детерминант, несмотря на наличие в составе полисахаридных составляющих этих гликанов одинаковых Сахаров. Подобные явления уже наблюдались для структурно близких гликоконьюгатов других бактерий, для которых были выявлены серологичекие различия, либо серологическая неидентичность. Более того такой феномен отмечали для К- и О-антигенов (имеющих близкие структуры полисахаридов) одного бактериального штамма (Kenne and Lindberg, 1983).

С использованием м-Ат к различным гликанам Н. seropedicae Z78 была выявлена сложная природа полисахаридсодержащих антигенов поверхности Н. seropedicae Z78. В составе всех исследуемых гликанов штамма Н. seropedicae Z78 обнаружены общие антигенные детерминанты. Кроме того, для мембранных и капсульных полисахаридов данного штамма показано присутствие индивидуальных иммунодоминант.

Показано, что общими для мембранного и капсульных полисахаридов бактерий Н. БегоресИсае Ъ1Ъ моносахаридами являются рамноза, глюкозамин и галактозамин, которые входят в состав антигенных детерминант этих гликополимеров и ответственны за их перекрёстные реакции с гомологичными препаратами мини-антител. Полученные мини-антитела к мемранному ЛПС проявляют большую специфичность к коровой области ЛПС278, в которой наиболее экспонированным сахаром является рамноза.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность за плодотворное сотрудничество коллегам из лаборатории биохимии - доктору биологических наук, профессору С.А. Конновой, кандидату биологических наук, доценту Ю.П. Федоненко, кандидату биологических наук И.В. Егоренковой, сотрудникам ИБФРМ РАН доктору биологических наук Л.Ю. Матора, кандидату биологических наук, доценту Г.Л. Бурыгину, кандидату химических наук, с.н.с. O.E. Макарову, кандидату биологических наук Чернышевой М.П., а также другим сотрудникам ИБФРМ РАН и сотрудникам лаборатории химии углеводов ИОХ РАН (Москва), на разных этапах проявивших интерес к теме и принимавших участие в представленном исследовании.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Величко, Наталья Сергеевна, Саратов

1. Варбанец Л.Д., Винарская Н.В. Структура, функция, биологическая активность эндотоксинов' грамотрицательных бактерий // Токсини Мпсрооргашзм1в. 2002. - С. 1-7.

2. Вестфаль О., Янн К. Методы химии углеводов // Бактериальные липополисахариды / Под. ред. Н. К. Кочеткова. М.: Мир, 1967. - С. 325 -332.

3. Гнутова Р. В. Серология и иммунохимия вирусов растений. М.: Наука, 1993.-300 с.

4. Громов Б.В. Строение бактерий. Л.: Изд-во Ленинградского ун-та, 1985. -190 с.

5. Гусев М.В. Минеева Л.А. Микробиология. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1985. -376 с.

6. Деев С., Лебеденко Е. Современые технологии создания антител для клинического применения // Acta Nature. 2009. - Т. 1.-С.32-50.

7. Дыкман Л.А., Богатырев В.А. Коллоидное золото в твердофазных методах анализа// Биохимия. 1997. - Т. 6. - С. 411 -418.

8. Блинов Н.П. Успехи микробиологии. М., 1982, Т. 17: - С. 158 - 177.

9. П.Емцев В.Т., Чумаков М.И, Брук М.Х. Об ассоциативном симбиозе

10. Clostridium с высшими растениями // Биологический азот в сельском хозяйстве / Под ред. Е.Н. Мишустина. -М.: Наука, 1988. С. 54-71.

11. Жемеричкин Д.А., Макаров О.Е., Скворцов И.М., Игнатов В.В. Выделение, фракционирование и моносахаридный состав О-специфических полисахаридов S-формы Azospirillum brasilense II Микробиология. 1989. -Т. 58, №2.-С. 236-239.

12. Завалин А.А, Чистотин М.В., Кожемяков А.П. Эффективность инокуляции зерновых культур Azotobapterium radiobacter в зависимости от азотного удобрения, почвенных и метеорологических условий // Агрохимия. 2001. -Т 1, № 2. - С. 31 -35.

13. Захарова И .Я., Косенко JI.B. Методы изучения микробных полисахаридов. -Киев: Наук. Думка, 1982. 192 с. .

14. Здоровенко Г.М. 2-0-метил-0-рамноза в составе липополисахарида Bacterium alcaligenes faecalis // Биоорг. химия. 1981. - Т. 7, № 1. - С. 103 -110.

15. Здоровенко Г.М. Внеклеточный липополисахарид грамотрицательных бактерий // Микробиол. журн. 1988. - Т. 50, № 4. - С. 98 - 107.

16. Здоровенко Г.М. ' Липополисахариды неферментирующих грамотрицательных бактерий: Дис. . д-ра биол. наук. Киев, 1990. - 384 с.

17. Здоровенко Э.Л., Варбанец Л.Д., Броварская О.С., Валуева О.Н., Шашков А.С., Книрель Ю.А. Липополисахарид Budvicia aquatica 97U124: иммунохимические свойства и строение // Микробиология. 2011. Т. 80, № 3,-С. 366-371.

18. Ирвинг Л. Вейсман, Лерой Е. Худ, Уильям Б. Вуд Введение в иммунологию. -М.: Высшая школа, 1983. 159 с.

19. КагаваЯ. Биомембраны. М.: Высшая школа, 1985. - 303 с,

20. Каратыгин И.В., Нездойминого Э.Л. История и предварительные итогиIисследования микофлоры Российской Арктики // Микология и фитопатол. -1994. Т. 28. - Вып. 3. - С. 70 - 83.

21. Кац Л.Н. Поверхностные структуры бактериальной клетки // Успехи совр. биологии. 1973. - Т. 76, № 1 - 3. - С. 395 - 414.

22. Книрель Ю.А. Липополисахариды грамотрицательных бактерий // Прогресс химии углеводов / Под. ред. И.В. Торгова. -М.:Наука, 1985. С. 54-71.

23. Книрель Ю.А., Здоровенко Г.М., Яковлева Л.М., Шашков А.С., Соляник Л.П., Захарова И .Я. Антигенные полисахариды бактерий // Биоорган. Химия. 1988.-Т. 14, №2.-С. 166-171.

24. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А (обзор) // Биохимия. 1993. - Т. 58. - С. 166 - 181.

25. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. III. Структура О-специфических полисахаридов//Биохимия1-1994.-Т. 59, № 12.-С. 1784- 1851.

26. Козулин В.В., Микеров А.Н., Макоров О.Е., Скворцов И.М., Игнатов В.В. Полисахаридные комплексы, липополисахариды и О-специфические полисахариды бактерий Xanthomonas campestris pv. campestris 8183a // Микробиология. 1997. - Т. 66, № 2. - С. 192 - 197.

27. Красикова И.Н., Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф. Новый способ выделения О-специфического полисахарида из грамотрицательных бактерий Yersinia pseudotuberculosis II Биоорг. химия. 1998. - Т. 24, № 7. - С. 549 - 553.

28. Красикова И.Н., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Структура и свойства липида А компонента эндотоксинов грамотрицательных бактерий // Химия природных соединений. - 1989. -№ 5. - С. 601 -616.

29. Крепе Е.М. Липиды клеточных мембран. Л.: Наука, 1981. -339 с.

30. Кульберг А.Я. Молекулярная иммунология. М.: Высшая школа, 1985. -287 с.

31. Кэбот Е., Мейер М. Экспериментальная иммунохимия. М.: Медицина,I1968.-684 с.

32. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. школа, 1980. -293 с.

33. Ляшенко В.А, Воробьев А.А. Молекулярные основы иммуногенности антигенов. М.: Медицина, 1982. - 272 с.

34. Матора Л.Ю., Шварцбург Б.И., Щеголев С.Ю. Иммунохимический анализ О-специфических полисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий Azospirillum. brasilense II Микробиология. 1998. - T. 67, № 6. - С. 815 - 820.

35. Мишустин E.H., Шильникова В.К. Биологическая фиксация атмосферного азота. -М.: Наука, 1968.-531 с.

36. Наумова И.Б., Садиков Б.М., Стрешинская Г.М., Полин А.Н. Тейхоевая кислота клеточной стенки' Arthrobacter crystallopoietes II Антибиот. Мед. Биотехнол. 1987. -№ 32. - С. 107-111.

37. Оводов Ю.С. Химия иммунитета. Сыктывкар: Изд-во Сыктывкарского ГУ, 1997.-203 с.

38. Оводов Ю.С. K-антигены бактерий. Строение K-антигенов бактерий // Биохимия. 2006. - Т. 71.-Вып. 9.-С. 1155- 1174.

39. Озерецковская Л.В., Васюкова Н.И., Леонтьева Т.В., Метлицкий Л.В. Биохимические механизмы специализации фитопатогенов // Успехи соврем, биологии. 1985. - Т. 100, № 2. - С. 230 - 242.

40. Онофраш Л.Ф., Якимова М.Ф., Ковальжиу А.И., Волоскова М.М. Симбиотическая азотфиксация и пути ее повышения. Кишинев: Штиница, 1992.- 146 с.

41. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985. -536 с.

42. Пименова М.Н., Гручушкина H.H., Азова Л.Г., Семенова Е.В., Мыльникова С.И. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / под ред. Н.С. Егорова. -М.: Изд-во МГУ, 1983. 220 с.

43. Проворов H.A. Растительно-микробные симбиозы как эволюционный континуум // Журнал общей биологии. 2009. - Том 70, № 1, С. 10 - 34.

44. Самуэльсон О. Ионообменные разделения в аналитической химии: Пер. с англ. -М.: Химия, 1966.-416 с.

45. Свешников П.Г., В.В. Малцйцев, И.М. Богданова, Солопова О.Н. Введение в молекулярную иммунологию и гибридомную технологию. М.: Из-во МГУ, 2006.-321 с.

46. Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Физические свойства липополисахаридов граммотрицательных бактерий // Биол. мембраны. 1992. - Т. 9, № 3. - С. 245 -258.

47. Спирин A.C. Спектрофотойетрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. 1958. - Т. 23, № 5. - С. 656 - 662.

48. Стрешинская Г.М., Тульская Е.М., Шашков A.C., Евтушенко Л.И., Таран В.В., Наумова И.Б. Тейхоевые кислоты клеточных стенок Nocardiopsis lesteri, Nocardiopsis lucenensis и Nocardiopsis tregalose II Биохимия. 1998. Т. 63, №2.-С. 230-234.

49. Тимакой В.Д., Левашов B.C., Борисов Л.Б. Микробиология. М.: Медицина, 1983.-512 с.

50. Филимонова М. В. Биологически активные вешества гриба ботри-тис (Botrytis cmerea). II Прикл. биохим. микробиол. 1985. - Т. 21. - Вып. 6. - С. 707-713.

51. Чижов О.С., Шашков A.C. Масс-спектрометрия и ЯМР-спектроскопия в установлении структуры полисахаридов // Успехи химии углеводов / Под ред. И.В. Торгова. М.: Наука, 1985. - С. 30 - 54.

52. Шаблин П.А. Теоретические и практические вопросы взаимодействия в системе макроорганизмы микроорганизмы // Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI веках: Тез. докл. Всерос. Конф., 25-28 сентября 2001 г.-СПб, 2001.-С. 80-81.

53. Шашков А.С., Чижов О.С. Спектроскопия 13С-ЯМР в химии углеводов и родственных соединений // Биоорг. химия. 1976. - Т. 2, № 4. - С. 437 - 497.

54. Эрнст Р., Боденхаузен Дж., Вокаун А. ЯМР в одном и двух измерениях: Пер. с англ. М.: Мир, 1990. - 709 с

55. Adams G.A. Extraction of lipopolysaccharides from gram-negative bacteria with dimethyl sulfoxide // Can. J. Biochem. 1967. - V. 45. - P. 422 - 426.

56. Albus U, Baier R, hoist O, Piihler A, Niehaus K. Suppression of an elicitor-induced oxidative burst reaction "in Medicago sativa cell cultures by Sinorhizobium meliloty lypopolysaccharides // New phytol. 2001. - V. 151. - P. 597 - 606.

57. Alexander C., Rietschel E.Th. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity // J. Endotox. Res. 2001. - V. 7,№3.-P. 167-202.

58. Alexander D.C., Valvano M.A. Role of the rfe gene in the biosynthesis of thei

59. Escherihia coli 07-specific lipopolysaccharide and other O-specific polysaccharides containing N-acetylglucosamine // J. Bacterid. 1994. - V. 176. -P. 7079-7084.

60. Al-Qutub M.N., Braham P.H., Karimi-Naser L.M., Liu X., Genco C.A., Darveau R.P. Hemin-Dependent Modulation of the Lipid A Structure of Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharide // Infection and Immunity. 2006. - V. 74, № 8. -p. 4474-4485.

61. Arata S., Hirayama T., Kasai N. Isolation of 9-hydroxy-d-tetradecalactone from Lipid A from Pseudomonas diminuta and Pseudomonas vesicularis II FEMS Microbiol. Lett. 1989. - V. 60, №2. - P. 219 - 222.

62. Aspinall G.O. Chemical characterization and structure determination of polysaccharides // The Polysaccharides / Ed. G.O. Aspinall. New York: Acad. Press, 1982.-V. l.-P. 135-131.

63. Atkins E.D.T., Attwool, P.T., Miles M.J., Morris V.J., O'Neill M.A. and Surtherland I.W. Effect of acetilation on the macromolecular and interactions gelling properties of a bacterial polysaccharide Internat. // J. Biol. Macromol. -1989. P. 115-117.

64. Atkins, E.D.T., Biomolecular structures of naturally occurring carbohydrate polymers // Intrernal. J. Biol. Macromol. 1986. - V. 8. - P. 323 - 329.

65. Aucklen H.M., Wilkinson S.G., Pitt T.Z. Immunochemical characterization of two new serotypes of Serratia marcescens (027 and 028) // FEMS Microbiol. Lett. -1996.-V. 138.-P. 74-82.

66. Baldani J. I., Baldani V. L. D., Sampaio M. J., and Dobereiner J. A found Azospirillum species from cereal roots // An. Acad. Bras. Cienc. 1984. - V. 56. -P. 365 -368.

67. Baldani J. I., Baldani V. L. D., Seldin L., and Dobereiner J. Characterization of Herbaspirillum seropedicae gen. nov., sp. nov., a root-associated nitrogen-fixing bacterium // Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. - V. 36. - P. 86 - 93.

68. Baldani J.I., Baldani V. L. D.„ and Dobereiner J. Genus Herbaspirillum II Bergey's manual of Syystimatic bacteriology / Ed. D.K. Boone, R.W. Kastenholz. New York: Springer, 2003. - V. 1. - P. 198 - 200.

69. Baldani J.I., Caruso L., Baldani V.L.D., Gop S.R., Dobereiner J. Recent advances in bnf with non-legume plants // Soil Biol. Biochem. 1997. - V. 29, № 5/6. - P. 911 -922.

70. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Inoculation of rice plants with the endophytic diazotrophs Herbaspirillum seropedicae and Burkholderia spp. // Biol. Fertil. Soils. 2000. - V. 30. - P. 485 - 489.

71. Bashan Y., Holguin G. Azospirillum plant relationships: environmental and physiological advances (1990 - 1996). // Can. J. Bacteriol. - 1997. - V. 43. - P. 103 -121.

72. Bastin D.A., Reeves P.R. Sequence and analysis of the O antigen gene (rfb) cluster of Escherihia coli 0111// Gene. 1995. - V. 164. - P. 17 - 23.

73. Bax A., Lerner L. Two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy // Science. 1986. - V. 232, № 4753. - P. 960 - 967.

74. Bedini E., de Castro C., Erbs G., Dow J.M., Newman M.-A., Parrilli M., Unverzagt C. Structure-dependent modulation of a pathogen response in plants by synthetic O-antigen polysaccharides // J. Am. Chem. Soc. 2005. - V. 127. - P. 2414-2416.

75. Belunis C.J., Clements T., Carty S.M., Raetz C.R. Inhibition of lipopolysaccharide biosynthesis and sell growth following inactivation of the kdtA gene in Escherihia coli II J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 27646 - 27652.

76. Berenblum I., Chain E. An improved method for the colorimetric determination of phosphate // Biochem. J. 1938. - V. 32, № 2. - P. 295 - 298.

77. Beynon L.M., Cox A.D., Taylor C.J., Wilkinson S.G., Perry M.B. Characterization of a lipopolysaccharide containing two different trisaccharide repeating units from Burkholderia cepacia sertype E (02) // Carbohydr. Res. 1995. - V. 272. - P. 231 -239.

78. Bishop D.G., Hewett M.J., Knox K.W. Occurrence of 3-hydrohytridecanoic and 3-hydroxypentadecanoic acids in the lipopolysaccharides of Veillonella II Biochim. Biophys. Acta. 1971. - V. 231, № 2. - P. 274 - 276.

79. Bock K., Pedersen C. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy of monosaccharides // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1983. - V. 41. - P. 27 -66.

80. Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Matora L.Yu., Schwartsburd B.I. The serotyping of Azospirillum spp by cell gold immunoblotting // FEMS Microbiol. Let. 1992. -V. 96. - P. 115-118.

81. Boivin A., Mesrobeanu J., Mesrobeanu L. Technique pour la preparation des polysaccharides microbiens spécifiques // Ibid. 1943. - V. 113, № 21. - P. 490 -492.

82. Boivin A., Mesrobeanu J., Mesrobeanu L. Extraction d'un complexe toxique et antigenique a partir du bacilli d'aertrycke // C. R. Soc. Boil. 1933. - V. 114, № 30.-P. 307-310.

83. Borneleit P., Blechschmidt B., Blasig R., Franke P., Gunter P., Kleber H.-P. Preparation of R-type lipopolysaccharides of Acinetobacter calcoaceticus by EDTA-salt extraction 11 Curr. Microbiol. 1989. - V. 19. - P. 77 - 81.

84. Bredford M. A rapid and sentive method for protein analysis the principe of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248 - 254.

85. Brisson J.R., Sue S.C., Wu W.G., Manus G., Nghia P.T., Uhrin D. // NMR Spectroscopy of Glycoconjugates / Eds. Jimenez-Barbero J., Peters T. Weinhem: Wiley - VCH, 2002. - P. 59 - 93.

86. Bugert P, Geider K. Molecular analysis of the ams operon required for exopolysaccharide synthesis of Erwinia amylovora II Mol Microbiol. 1995. - V. 15.-P. 917-933.

87. Bull C.T., Weller D.M., and Thomashow L.S. Relationship between root colonization and suppression of Gaeumannomyces graminis var. tritici by Pseudomonas fluuorescens strain 2-79 // Phytopathology. 1991. - V. 81. - P. 954-959.

88. Calix J.J., Nahm M.H.', Zartler E.R. Elucidation of structural and antigenic properties of Pneumococcal serotype 11 A, 11B, 11C, and 1 IF polysaccharide capsules // J Bacteriol. 2011 - V. 193, № 19. - P. 5271 - 5278.

89. Carlson R.W., Busch M., Mayer H. Distribution and phylogenetic significance of 27-hydroxyoctacosanoic acid in lipopolysaccharides from bacteria belonging to the a-2 subgroup of Proteobacteria II J. Syst. Bacteriol. 1991. - V. 41, № 2. - P. 213 - 217.

90. Caroff M., Karibian D. Structure of bacterial lipopolysaccharides // Carbohydr. Res. 2003. - V. 338. - P. 2431 - 2447.

91. Choma A. Fatty acid composition of Mesorhizobium huakuii lipopolysaccharides. Identification of 27-oxooctacosanoic acid // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - V. 177, №. 2. - P. 257 - 262.

92. Choma A., Komaniecka I. Characterization of a novel Lipid A structure isolated from Azospirillum lipoferum lipopolysaccharide // Cabohydr. Res. 2008. -V. 343.-P. 799-804.

93. Ciucanu I., Kerek F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates // Carbohydr. Res. 1984. - V. 131, № 1. - P. 209 - 217.

94. Coenye, T., and Vandamme P. Diverdity and cignificance of Burkholderia species occupying diversr ecological niches // Environ. Microbiol. 2003. - V. 5. -P. 719-729.

95. Conrad H.E. Methylation of carbohydrates with methyl iodide in dimetyl sulfoxide in the presence of methylsulfinyl-anion // Meth. Carbohydr. Chem. -1972.-V. 6.-P. 361 -364.

96. Crutchley M.J., Marsh D.G., Cameron J. Biological studies on free endotoxin and non-toxin material from culture supernatant fludies of Escherihia coli 078K80 // J Gen Microbiol. 1968. - V. 50, № 3. - P. 413 - 420.

97. Crutchley M.J., Marsh D.G., Cameron J. Free endotoxin // Nature. 1967. -V. 214, №5091.-P. 102- 103.

98. Corsaro M.M., De Castro C., Molinaro A., Parrilli M. Structure of lipopolysaccharides from phytopathogenic bacteria // Recent Res Develop Phytochem. -2001. -V. 5. P. 119-138.

99. Coulon C., Vinogradov E., Filloux A., Sadovskaya I. Chemical analysis of cellular and extracellular carbohydrates of a biofilm-forming strain Pseudomonas aeruginosa PAH // PLoS One. 2010. - V. 5, № 12. - P. 1 - 10.

100. Cuicanu I., Kerek F. A simple and rapid method for the permetylation of carbohydrates // Carbohydr. Res. 1984. - V. 131. - P. 209 - 217.

101. Cadieux J. E., Kuzio J., Milazzo F.H., Kropinski A.M. Spontaneous release of lipopolysaccharide by Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 1983. - V. 155, №2.-P. 817- 825.

102. De Boer W.R., Kruyssen F.J., Wouters J.T., Kruk C.M. The structure of teichoic acid from Bacillus subtilis var, niger WM as determined by C nuclear-magnetic-resonance spectroscopy // Eur. J. Biochem. 1976. - V. 62, № 1. - P. 1 -6.

103. Del Gallo M., Negi M., Neyra C. Calcofluor and lectin-binding exocellular polysaccharides of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum II J. Bacteriol. 1989.-V. 171.-P. 3504-3510.

104. Desaki Y, Miya A, Venkatesh B, Tsuyumu S, Yamane H, Kaku H, Minami E, Shibuya N. Bacterial lipopolysaccharides induce defense responses associated with programmed cell death in rice cells // Plant cell Physiol. 2006. - V. 47. - P. 1530- 1540.

105. Ding L., Seto B.L., Ahmed S.A., Coleman W.G. Purification and properties of the Escherihia coli K-12 NAD-dependent nucleotide diphosphosugar epimerase, ADP-L-glycero-D-mannoheptose-6-epimerase // J. Boil. Chem. -1994. V. 269. - P. 24384 - 24390.

106. Dmitriev B.A., Ehlers S., Rietschel E.T. Layer murein revisited: a fundamentally new concept of bacterial cell wall structure, biogenesis and function // Med. Microbiol. Immunol. (Berl). 1999. - V. 187. - P. 173 - 181.

107. Dobereiner J., and Baldani. V.L.D. Nitrogen fixation with non-legumes: Biological nitrogen fixation by the endophytic diazotrophs in non-leguminous crops in the tropics / Ed. K.A. Malik, J.K. Ladha. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1998.-P. 3-7.

108. Dobereiner J. History and new perspectives of diasotrophs in associations with non-leguminous plants // Symbiosis. 1992a. - V. 13.-P. 1-13.

109. Dobereiner J. Recent changes in concepts of plant bacteria interactions: Endophytic N2 fixing bacteria // Ciencia e Cultura. 19926. - V. 44. - P. 310 -313.

110. Domenico Ph., Diedrich D.L.,. Straus D.C. Extracellular polysaccharide production by Klebsiella pneumoniae and its relationship to virulence // Can. J. Microbiol. 1985. - V. 31, № 5. - P. 472 - 478.

111. Dow J.M., Newman M.-A., Roepenack E. The induction and modulation of plant defense responses by bacterial lipopolysaccharides // Annu. Rev. Phytopathol. 2000. - V. 38. - P. 241 - 261.

112. Dow M., Molinaro' A., Cooper R.M., Newman M.-A. Microbial glicobiology: structures Relevance and Applications: Microbial glycosylated components in plant disease / Ed. A. Moran, P. Brennan, O. Hoist. San Diego: Elsevier, 2009. - P. 803 - 820.

113. Dubois M., Gilles K. A., Hamilton J. K., Rebers P. A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. - V. 28, № 3. - P. 350 - 356.

114. Dykman L.A., Matora L.Yu., Bogatyrev V.A. Use of colloidal gold to obtain antibiotin antibodies // J. Microbiol. Meth. 1996. - V. 24. - P. 247 - 248.

115. Falk E.C., Johnson J.L., Baldani V.L.D., Dobereiner J., and Krieg N.R. Deoxyribonucleic and ribonucleic acid homology studies of the genera

116. Azospirillum and Conglomeromona II Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. - V 36. - P. 80-85.

117. Fedonenko Y.P., Zatonsky G.V., Konnova S.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense Sp245 // Carbohydr. Res. 2002. - V. 337. - P. 869 -872.

118. Fett W.f., Osman S.F., Fishman M.R., Siebles T.S. Alginate production by plant pathogenic Pseudomonas II Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 52, № 3. -P. 466-473.

119. Fontaine T., Stephan M.P., Debarbieux L., Previato J.O., Mendon9a-Previato L. Lipopolysaccharides from six strains of Acetobacter diazotrophicus II FEMS Microboil. Lett. 1995. - V. 132. - Issue 1 - 2. - P. 45 - 50.

120. Galanos C. Physical state and biological activity of lipopolysaccharides. Toxicity and immunogenicity of the lipid A component // Z. Immunol. Forsch. -1975.-V. 149. P. 214 - 216.

121. Galanos C., Luberitz O., Westohal O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides // Eur. J. Biochem. 1969. - V. 9, №2. - P. 245 - 249.

122. Galanos C., Lüderitz O. Electrodialysis of lipopolysaccharides and their conversion to uniform salt forms // Eur. J. Biochem. 1975. - V. 54. - P. 603 -610.

123. Gerber I.B., Zeidler D., Durner J., Dubery I.A. Early perception responses of Nicotiana tabacum cells in response to lipopolysaccharides from Burcholderia cepacia II Planta. 2004. - V. 218. - P. 647 - 656.

124. Gervig G.J., Kamerling J.P., Vliegenthart J.F.G. Determination of the D and L configuration of neutral monosaccharides by high-resolution capillary g.l.c. // Carbohydr. Res. 1978. - V. 62. - P. 349 - 357.

125. Gil J.F., Hoyos C.L., Cimino R.O., Krolewiecki A.J., López Quiroga I., Cajal S.P., Juárez M., García Bustos M.F., Mora M.C., Marco J.D., Nasser JR.B.

126. Role of three ELISA tests using promastigote homogenates of Leishmania braziliensis, L. amazonensis and L. guyanensis in the diagnosis of tegumentary leishmaniasis // Medicina (B Aires). 2011. - V. 71, № 5. - P. 420 - 428.

127. Goldman R.C., Leive L. Electroforetic separation of lipopolysaccharide monomers differing in polysaccharide length // Meth. Enzymol. 1987. - V. 138. -P. 267-275.

128. Goldstein I.J., Hay J.W., Lavis B.A., Smith F. Controlled degradation of polysaccharides by periodate oxidation, reduction, and hydrolysis // Meth. Carbohydr. Chem. 1965. - V. 5. - P. 361 - 370.

129. Gorshkova R.P., Isakov V.V., Zubrov V.A., Ovodov Y.S. Structure of the O-specific polysaccharide of lipopolysaccharide from Yersinia bercovieri 0:10 // Bioorg. Chem. 1994.-V. 20.-P. 1231 - 1235.

130. Gross M., Rudolph K. Characterization of leval, alginate and «LPS» // J. phytopathol. 1987. - V. 119, № 3.-P. 206-215.

131. Gusso CL, Rigo LU, Pedrosa FO, Yates MG, et. al. Effect of an ntrC mutation on amino acid or urea utilization and on nitrogenase switch-off in Herbaspirilium seropedicae II Can. J. Microbiol. 2008. - V. 54. - P. 235 - 239.

132. Gyaneshwar P.E.K., James P.M. Reddy B., Reinhold-Hurek, and Ladha J.K. Herbaspirillum colonization increases growth ant nitrogen accumulation in aluminium tolerant rice varieties // New Phytol. 2002. - V. 154. - P. 131-146.

133. Hakomori S.-I. A rapid permetylaion of glicolipids and polysaccharides catalyzed by methylsulfinyl carbanion in dimethylsulfoxide // J. Biochem. 1964. - V. 55.-P. 205-208.

134. Heike R.U.S., Freudenberg M., Weckesser J., Mayer H. Lipopolysaccharide of Rhodospirillum salinarum 40: structural studies on the core and lipid A region // Arch. Microbiol. 1995. - V. 164. - P. 280 - 289.

135. Heimer R., Glick D.L., Abruzzo J.L. The detection of antigens in immune complexes II Scand. J. Immunol. 1981. - V. 13, № 5. - P. 441 - 446.

136. Hitchcock P. J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stain polyacrylamide gels // J. Bacterid. 1983.-V. 154.-P. 269-277.

137. Hols O., Ulme A. J., Brade H., Fla H.-D., Rietsche E. T. Biochemistry and cell biology of bacterial endotoxins // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. -V. 16.-P. 83 - 104.

138. Hoist O., Brade H. Chemical structure of the core region of bacterial lipopolysaccharides // Bacterial Endotoxic Lipopolysaccharides / Ed. D.C. Morrison, J.I. Ryan. Boca Raton: CRC Press, 1992. - V. 1. - P. 135 - 170.

139. Iida T., Haishima Y., Tanaka A., Nishiyama K., Saito S., Tanamoto K. Chemical structure of lipid A isolated from Comamonas testosteroni lipopolysaccharide // Eur. J. Biochem. 1996. - V. 237, № 5. - P. 468 - 475.

140. Im W.-T., Bae H.-S., Yokota A., and Lee S.T. Herbaspirillum chlorophenolicum sp. nov., a 4-chlorophenol-degrading bacterium // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. - V. 54. - P. 851 - 855.

141. James E.K., Olivares F.L., Baldani J.I., Dobereiner J., Moench L. Herbaspirillum, an endophytic diazotroph colonizing vascular tissue in leaves of Sorghum bicolor II J. Experimental Botany. 1997. - V. 48. - P. 785 - 789.

142. Jann B., Jann K. Capsules of Escherichia coli II Escherichia colv. Mechanisms of Virulence / Ed. M. Sussman. Cambridge: Cambridge University Press, 2001.-P. 113-143.

143. Jann B., Jann K. Structure and biosynthesis of the capsular antigens of E. coli II Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1990. - V. 150. - P. 19 - 42.

144. Jann K., Jann B. Biochemistry and expression of bacterial capsules // Biochem. Soc. Trans. 1991,-V. 19.-P. 623 -628.

145. Jansson P.E., Kenne L., Leigren H., Lindberg B., Lonngren J. A practical guide to the methylation analysis of carbohydrates // Chem. Commun. Univ. Stockholm. 1976. - V. 8. - P. 1 - 75.

146. Jansson P.E., Kenne L., Lindbreg B. Structure of extracellular polysaccharide from Xanthomonas campestris II Carbohidr. Res. 1975. - V. 45. -P. 275-282.

147. Johnson K.G., Perry M.B., Mc Donald I.J., Russell R.R.B. Cellular and free lipopolysaccharides of some species of Neisseria II Can. J. Microbiol. 1975. - V.21, № 12.-P. 1969- 1980.

148. Johnson K.J., Mc Donald I.J., Perry M.B. Studies on the cellular and free lipopolysaccharide from Branhamella catarralis II Can. J. microbial. 1976. - V.22, №4.-P. 1969- 1980.

149. Jung S.Y., Lee M.H., Oh T.K., Yoon J.H. Herbaspirillum rhizosphaerae sp. nov., isolated from rhizosphere soil of Allium victorialis var. platyphyllum // Int J Syst. Evol. Microbiol. 2007. - V. 57, № 10. - P. 2284 - 2288.

150. Kabat E.A. Basic principles of antigen-antibody reaction // Meth. Enzymol. Immunochemical Techniques. New York: Academic Press, 1980. - V. 70. - P. 3 -49.

151. Kabat E.A. Structural concepts on immunology and immunochemistry.i

152. New York: Holt Rinehardt Winston, 1976. 547 p.

153. Kadowaki T., Inagawa H., Kohchi C., Hirashima M., Soma G. Functional characterization of lipopolysaccharide derived from symbiotic bacteria in rice as a macrophage-activating substance // Anticancer Res. 2011. - V. 31, № 7. - P. 2467-2476.

154. Kannenberg E.L., Carlson R.W. Lipid A and O-chain modifications cause Rhizobium lipopolysaccharides to become hydrophobic during bacteroid development // Mol. Microbial. 2001. - V. 39. - P. 379 - 391.

155. Karkhanis D., Zeltner Y., Jackson J., Carlo J. A new and improved microassay to determing 2-keto-3-deoxyoctnate in lipopolysaccharide of gramnegative bacteria // Anal. Biofchem. 1978. - V. 85, № 2. - P. 595 - 601.

156. Karlsson C., Jansson P.E., Wollin R. Structure of the O-polysaccharide from the LPS of a Hafnia alvei strain isolated from a patient with suspect yersinosis // Carbohydr. Res. 1997. - V. 300. - P. 191 - 197.

157. Kasai N., Nowotny A. Endotoxic glycolipid from a heptoseless mutant of Salmonella minnesota II J. Bacteriol. 1967. - V 94. - P. 1824 - 1836.

158. Kato H., Iida T., Haishima Y., Tanaka A., Tanamoto K. Chemical structure of lipid A isolated from Flavobacterium meningosepticum lipopolysaccharide // J. Bacteriol. 1998.-V. 180, № 15.-P. 3891 -3899.

159. Kauffmann F., Liideritz O., Stierlin H., Westphal O. Zur Immunchemie der O-Antigene der Enterobacteriaceen. I. Analyse der Zuckerbausteine von Salmonella-O-antigenen // Zentralbl. Bakt. I Orig. 1960. - V. 178. - S. 442 -458.

160. Keenleyside W.J., Perry M., Mac Lean L., Poppe C., Whitfield C. A plasmid-encoded rfb 0:54 g^ne cluster is required for biosynthesis of the 0:54 antigen in Salmonella enterica serovar Borreze // Mol. Microbiol. 1994. - V. 11. -P. 437-448.

161. Kenne L., Lindberg B. Bacterial polysaccharides // The polysaccharides, Vol. 2 / Ed. G.O. Aspinall. Orlando: Academic Press, 1983. - P. 287 - 363.

162. Kim Y.B., Watson D.W. Biologically active endotoxins from Salmonella mutants deficient in O- and R-polysaccharides and heptose // J. Bacteriol. 1967. -V. 94.-P. 1320- 1326.

163. Kirchhof G.B., Eckert M., Stoffels J.I., Baldani V.M., Reis A., and Hartmann A. Herbaspirillum frisingense sp. nov., a new nitrogen-fixing bacterial species that occurs in C4-fibre plants // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - V. 51. P. 157- 168.

164. Klassen G., Pedrosa F.O., Souza E.M., Funayama S., Rigo L.U. Effect of nitrogen compounds on nitrogenase activity in Herbaspirillum seropedicae strain SmRl // Can J Microbiol. 1997. - V. 43. P. 841 - 846.

165. Kloepper J.W., Beauchamp C.J. A review of issues related to measuring colonization of plant roots by bacteria // Can. J. Microbiol. 1992. - V. 38. - P. 1219 - 1232.

166. Knirel Yu.A., Vinogradov E.V., Mort A.J. Applicatoin of anhydrous hydrogen fluoride for the structural analysis of polysaccharides // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem.- 1989.-V. 47.-P. 167-202.

167. Koch A.L., Woeste S.W. The elasticity of the sacculus of Esherichia coli II J. Bacteriol. 1992,-V. 174.-P. 4811 -4819.

168. Kocharova N.A., Blaszczyk A., Zatonsky G.V., Torzewska A., Bystrovai

169. O.V., Shashkov A.S., Knirel Yu.A. Structure and cross-reactivity of the O-antigen of Providencia stuartii 018 containing 3-acetamido-3,6-dideoxy-D-glucose and Antoni Rozalskib II Carbohydr. Res. 2004. - V. 339. - P. 409 - 413.

170. Kocharova N.A., Katzenellenbogen E., Zatonsky G.V., Gamian A., Brzozowska E., Shashkov A.S., Knirel Yu.A. Structure of the O-polysaccharide of Citrobacter youngae PCM 1503 // Carbohydr Res. 2010. - V. 22; №17. - P. 2571 -2573.

171. Kondo S., Hisatsune K. Rapid preparation of samples for compositional sugar analysis of the "degraded polysaccharide" fraction of lipopolysaccharides from Vibrio cholerae II Microbiol. Immunol. 1988. - V. 32. - P. 907 - 915.

172. Krauss J.H., Seydel U., Weckesser J., Mayer H. Structural analysis of the nontoxic lipid A of Rhodobacter capsulatus 37b4 // Eur.J. Biochem. 1989. - V. 180, №3,-P. 519-526.

173. Kumada H., Haishima Y., Umemoto T., Tanamoto K. Structural study on the free lipid A isolated from the lipopolysaccharide of Porphyromonas gingivalis II J. Bacteriol. 1995. - V. 177, № 8. - P. 2098 - 2106.

174. Lacave C., Asselineau J., Serre A., Roux J., Comparison of the chemical composition a lipopolysaccharide fraction and of a polysaccharide fraction isolated from Brucella melitensis II Europ. J. Biochem. 1969. - V. 9. - P. 189 — 198.

175. Lambrecht M., Okon Y. A., Vande B., and Vanderleyden J. Indol-3-acetic acid: A signaling molecule in bacteria-plant interactions // Trends Microbiol. -2000.-V. 8.-P. 298-300.

176. Lebbar S., Haeffner-Cavaillon N„ Karibian D„ Le-Beyec Y., Caroff M. 252 Cf-plasma desorption mass spectrometry analysis of lipids A obtained by an elimination reaction under mild conditions // Rapid. Commun. Mass Spectrom. -1995.-V. 9.-P. 693-696.,

177. Lee C.-J. Bacterial capsular polysaccharides-biochemistry, immunity and vaccine // Mol. Immunol. 1987. -V. 24. - P. 1005 - 1019.

178. Leontein K., Lindberg B., Lonngren J. Assigment of absolute configuration of sugars by g.l.c. of their acetylated glycosides formed from chiral alcohols // Carbohydr. Res. 1978. - V. 62. - P. 359 - 362.

179. Lerouge I., Vaanderleyden J. O-antigen structural variations: Mechanisms and possible roles in animal/plant-microb interactions // FEMS Microbiol Rev. -2002.-V. 26.-P. 17-47.

180. Lindberg A.A., Holme T. Evaluation of some extraction methods for the preparation of bacterial lipopolysaccharides for structural analysis // Microbiol. Immunol. 1972. - V. 80. - P. 751 - 759.

181. Lipkind G.M., Shashkov A.S., Mamyan S.S., Kochetkov N.K. The nuclear Overhauser effect and structural factors determining the conformations of disaccharide glycosides // Carbohydr. Res. 1988. - V. 181. - P. 1 - 12.

182. Liideritz O., Galanos C., Risse HJ et al. Structural relationships of Salmonella O and R antigens // Ann. NY Acad Sci. 1966. - V. 133. - P. 349 -347.

183. Lugtenberg B., van Aphen L. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of E. coli and other Gram-negative bacteria // Biochem. Biphis. Acta. 1983,- V. 737.-P. 51 - 115.

184. Maitra S.K., Nachum R., Pearson F.C. Establishment of beta-hydroxy fatty acids as chemical marker molecules for bacterial endotoxin by gas chromatography-mass spectrometry // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 52. -P. 510-514.

185. Manneewannakul K., Manneewannakul S. Ippen-Ihler K. Synthesis of F pilin.//J. Bacterid. 1993.-V. 175. - P. 1384 - 1391.

186. Marsh D.G., Fett W.F., OsmanS.F., Fishman M.R., Siebles T.S. Alginate production by plant pathogenic Pseudomonas II Appl. Environ. Microbiol. 1986. -V. 52, №3,-P. 466-473.

187. Marsh D.G., Crutchley M.J., Purification and physiko-chemical analysis of fractions from the culture supernatant of Escherihia coli 078K80. Appl. Environ. Microbiol. 1988. - V. 52, № 2. - P. 566 - 573.

188. Masound H., Mayer H., Kontrohr T., Hoist O., Weckesser J. The structure of the core region of the lipopolysaccharide from rhodocyclus gelatinosus // Arch. Microbial. 1991. - V. 12. - P. 222 - 227.

189. Mayer H., Tharanathan R.N., Weckesser J. Analysis of lipopolysaccharides of Gram-negative bacteria // Meth. Microbiol. 1985. - V. 18. - P. 157 - 207.

190. Meyer A., Puhler A., Niehaus K. The lipopolysaccharides of the phytopathogen Xanthomonas campestris pv campestris induce an oxidative burst reaction in cell cultures of Nicotiana tabacum II Planta. 2001. - V. 213. P. 214 -222.

191. Mobley H.L.T, Mendz G.L., Hazell S.L., Helicobacter pylori Physiology and Genetics. Washington (DC): ASM Press, 2001. - 319 p.

192. Model P., Russel M. The bacteriophages. New York: Plenum, 1988. - P. 456.

193. Mora A. P. Structure-bioactivity relationships of bacterial endotoxins // J. Toxicol. Toxin Rev. 1994. - V. 14. P. 47 - 83.

194. Mora L., and Newton W.E. Isolation, identification and localisation of diazotrophic bacteria from C4-plant Miscanthu II New Horizons in Nitrogen fixation / Ed. B.Eckert. Dordrecht: Kluwer academic publishers, 2008. - 705 p.

195. Morgan W.T.J., Partridge S.M. Studies in immunochemistry. The use of phenol and of alkali in the degradation of antigenic material isolated from Bact. dysenteriae (Shiga) // Biochem. J. 1941. - V. 35. - P. 407 - 417.

196. Munford R.S., Hall C.L., Rick P.D. Size heterogeneity of Salmonella typhinumirium lipopolysaccharides in outer membranes and culture supernatant membrane fragments // J. Bacteriol. 1980. - 144, № 2. - P. 630 - 640.

197. Munford R.S., Varley A.W. Shield as Signal: Lipopolysaccharides and the Evolution of Immunity to Gram-Negatiye Bacteria // PLoS Pathogens. 2006. -V. 2.-Issue 6.-P. 467-471.

198. Nazarenko E.L., Crawford R.J., Ivanova E.P. The structural diversity of carbohydrate antigens of selected gram-negative marine bacteria // Mar Drugs. -2011.-V. 9,№ 10.-P. 1914- 1954.*

199. Nazir R., Warmink J. A., Boersma H. and Dirk J. V. Elsas Mechanisms that promote bacterial fitness in fungal-affected soil microhabitats // FEMS Microbiology Ecology.-2010,-V. 71. Issue 2. - P. 169- 185.

200. Newman M.-A., Dow J.M., Molinaro A., Parrilli M. Priming induction andmodulation of plant defense responses by bacteria lipopolysaccharides // J.i

201. Endotoxin Res. 2007. - V. 13. - P. 69 - 84.

202. Noindorf L., Bonatto A.C., Monteiro R.A., Souza E.M., Rigo L.U., Pedrosa F.O., Steffens M.B., Chubatsu L.S. Role of PII proteins in nitrogen fixation control of Herbaspirillum seropedicae strain SmRl // BMC Microbiol. -2011.-V. 11,№ 11.-P. 8- 12.

203. Olivares F. L., James ,E. K., Baldani J. I., and Dobereiner J. Infection of mottled stripe disease-susceptible and resistant sugar cane varieties by the endophytic diazotroph Herbaspirillum II New Phytol. 1997. - V. 135. - P. 723 -737.

204. Ollivier J.S., Towe A., Bannert B. Hai E.-M., Kastl A., Meyer M., Xia Su, Kleineidam K. and Schloter M. Nitrogen turnover in soil and global change // FEMS Microbiology Ecology. 2011. - V. 78. - Issue 1. - P. 3 - 16.

205. Orskov F., Sharma V., Orskov I. Influence of growth temperature on the development of Escherichia coli polysaccharide K antigens // J. Gen. Microbiol. -1984. V. 130. - P. 2681 - 2684.

206. Parker J.H., Smith G.A., Fredrickson H.L., Vestal J.R., White D.C. Sensitive assay, based on hydroxy fatty acids from lipopolysaccharide lipid A, for Gram-negative bacteria in sediments // Appl. Environ. Microbiol. 1982. - V. 44. -P. 1170- 1177.

207. Pedrosa F.O., Monteiro R.A., Wassem R., Cruz L.M., Ayub R.A. Genome of Herbaspirillum seropedicae strain SmRl, a Specialized Diazotrophic Endophyte of Tropical Grasses // Plos Genet. 2011. - V. 7. - Issue 5. - P. 1 - 10.

208. Pereira J.A.R., Cavalkante V.A., Baldani J.I., and Dobereiner J. Field inoculation of sorghum and rice with Azospirillum spp. and Herbaspirillum seropedicae II Plant soil. 1988. - V. 10. - P. 269 - 274.

209. Perepelov A.V., Babicka D., Shashkov A.S., Arbatsky N.P., Senchenkova S.N., Rozalsky A., Knirel Yu.A. Structure and cross-reactivity of the O-antigen of Proteus vulgaris 08 // Carbohydr. Res. 1999. - V. 318. - P. 186 — 192.

210. Pietscher K., Weckesser J., Fischer U., Mayer H. The lipopolysaccharides of Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum molischianum, and Rhodophila globiformis II Arch. Microbiol. 1990. - V. 154, № 5. - P. 433 - 437.

211. Pike R.M., Chandler C.H. The spontaneous release of somatic antigen from Vibrio cholerae II J. Gen. Microbiol. 1974. - V. 81, № 1. - P. 59 - 67.

212. Putnoky P., Petrovics G., Kreszt A., Grosskopf E., Ha D.T.C., Banfalvi Z.,i

213. Kondorosi A. Rhizobium meliloti lipopolysaccharide and exopolysaccharide can have the same function in the plant-bacterium interaction // J. Bacteriol. 1990. -V. 172.-P. 5450 -5458.

214. Quispel A. A search of signals in endophytic microorganisms // Molecular signals in plant-microbe communications / Ed. D.P.S.Verna. New York: CRC Press, 1992.-P. 471 -491.

215. Raetz C.R.H. and Whitfiel C. Lipopolysaccharide enotoxins // Annu. Rev. Biochem. 2002. - V. 71, № l.-P. 635-700.

216. Raetz C.R.H. Reynolds C.M., Trent M.S., and Bishop R.E. Lipid A modification systems in gram-negative bacteria // Annu. Rev. Biochem. 2007. -V. 76, № l.-P. 295 -329.

217. Reinhold B., Hurek T. Azoarcus sp. strain BH72 as a model for nitrogen-fixing grass endophytes // Journal of Biotechnology. 2003. - V. 106. - P. 169 -178.

218. Rietschel E.T., Brade L., Shade U. // Surface structures of microorganisms and their interactions with the mammalian hosts // Weinheim: Veriag Chemie. -1988. P. 1-41.

219. Roberto F., Kosuge T. Cytokin production by Pseudomonas savastanoi. // J. cell Biochem. 1986. - V. 10. - P. 36 - 40.

220. Rocchetta H.L., Burrows L.L., and Jam J.S., Genetics of O-antigen biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa II Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. -V. 63.-P. 523 -553.

221. Roppll J., Mayer H., Weckesser J. Identification of a 2,3-diamino-2,3-dideoxyhexose in the lipid A component of lipopolysaccharides // Carbohydr. Res. 1975.-V. 40, №1.-P. 31-40.

222. Rothballer M., Schmid M., Klein I., Gattinger A., Grundmann S., Hartmann A. Herbaspirillum hiltneri sp. nov., isolated from surface-sterilized wheat roots // Int J Syst Evol Microbiol. 2006. - V. 56, № 6. - P. 1341 - 1348.

223. Rothfield L., Pearlnman-Kothencz M. Sythesis and assembly of bacterial membrane components. A lipopolysaccharide-phospholipid-protein complex excreted by living bacteria // J. Mol. Biol. 1969. - V. 44, № 3. - P. 477 - 492.

224. Russa R., Urbanic-Sypniewska T., Lindstrom K., Mayer H. The structure of the homopolymeric O-specific chain from the phenol soluble LPS of the Rhizobium meliloti type strain NZP 2213 // Carbohydr. Polym. 1995. - V. 27. -P. 299-303.

225. Savardecker J.S, Sloneker J.H., Jeans A. Quantitative determination of monosaccharides as their alditol acetates by gas liquid chromatography // Anal. Chem. 1965. - V. 37. - P. 1602 - 1603.

226. Sachdev S. Phage Display In Biotechnology and Drug Discovery. Boca Raton London New York Singapore: Sidhu, 2005. - 308 p.

227. Saunder N. J., Pede J. F., Hoo D. W., Moxon E. R. Simple sequence repeats in the Helicobacter pylori genome // Mol. Microbiol. 1998. - V. 27. - P. 1091 -1098.

228. Schmid M., Baldani J.I., Hartman A. The Genus Herbaspirillum II Procaryotes.-2006.-V. 5. P. 141 - 150.

229. Schnaitman C.A., Klena J.D. Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria // Microbiol. Rev. 1993. - V. 57. - P. 655 - 682.

230. Seufferheld M.J., Alvares H.M., Farias M.E. Role of Polyphosphates in Microbial Adaptation to Extreme Environments // Appl. Environ. Microbiol. -2008.-V. 74.-P. 5867-587.

231. Shashkov A.S., Lipkind G.M., Knirel Yu.A., Kochetkov N.K.13

232. Stereochemical factors determining the effects of glycosylation on the C chemical shifts in carbohydrates // Magn. Reson. Chem. 1988. - V. 26. - P. 735 -747.

233. Shibaev V.N. Biosynthesis of bacterial polysaccharide chains composed of repeating units // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1986. - V. 44. - P. 277 -339.

234. Silipo A., Erbs G., Shinya T., Maxwell J. Dow, Parrilli M., Lanzetta R., Shibuya N., Newman M.-A., and Molinaro A. Glycoconjugates as elicitors or suppressors of plant innate immunity // Glycobiology. 2010. - V. 20, № 4. - P. 406-419.

235. Sletmoen M., Maurstad G., Sikorski P., Paulsen B.S., Stokke B.T. Characterisation of bacterial polysaccharides: steps towards single molecular studies // Carbohydr. Res. 2003. - V. 338. - P. 2459 - 2475.

236. Souza E.M., Pedrosa F.O., Rigo L.U., Machado H.B., Yates M.G. Expression of the nifA gene of Herbaspirillum seropedicae: role of the NtrC and NifA binding sites and of the -24/-12 promoter element // Microbiology. 2000. -V. 146, №6.-P. 1407- 1418.

237. Spaink H.P., Kondorosi A., Hooykaas P.J.J. The Rhizobiaceae. Molecular Biology of Model Plant-Associated Bacteria. Dordrecht Boston London: Kluwer Academic Publishers, 1998. 558 p.

238. Stead D.E. Grouping of plant-pathogenic and some other Pseudomonas spp. by using cellular fatty acid profiles // Int. J. Syst. Bacteriol. 1992. - V. 42, № 2. - P. 281-295.

239. Sutherland I.W. Structure-function relationships in microbial exopolysaccharides // Biotech Adv. 1994. - V. 12. - P. 393 - 448.

240. Tanamoto K., Kato H., Haishima Y., Azumi S. Biological properties of lipid A isolated from Flavobacterium meningosepticum II Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2001. - V. 8. - P. 522 - 527.

241. Taylor A., Knox K.W., Work E. Chemical and biological properties of an extracellular lipopolysaccharide from Escherihia coli grown under lysine-limiting conditions // Biochem. J. 1966. - V. 99, № 1. - P. 53 - 61.

242. Tsai C.M., Frasch C.E. A sensitive silver stain for delecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1982. - V. 119.-P. 115-119.

243. Tul'skaya E.M., Shashkov A.S., Evtushenko L.I., Taran V.V., and Naumova I.P. Novel cell-wall teichoic acid from Nocardiopsis albus subsp. albus. as a species-specific marker // Microbiology. 1995. - V. 141. - P. 1851 - 1856.

244. Tul'skaya E.M., Vylegzhanina K.S., Streshinskaya G.M., Shashkov A.S., and Naumova I.B. New cell wall glycopolymers of the representatives of the genus Kribbella II Biochim. Biophys. Acta. 1991. - V. 1074. - P. 237 - 242.

245. Unger F.M. The chemistry and biological significance of 2-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid (Kdo) // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1982. - V. 38.-P. 322-387.

246. Urbanic-Sypniewska T., Seydel U., Grecj M., Weckesser J., Mayer H. Chemical studies on the lipopolysaccharide of Rhizobium meliloty 10406 and its lipid A region // Arch. Microbiol. 1989. - V. 152, №. 4. - P. 527 - 532.

247. Van Peer R., and Schippers B. Plant growth response to bacterization with selected Pseudomonas: effect of soil organic matter content, number of rhizophere bacteria and inoculation // Soil Biol. Biochem. 1989. - V. 20. - P. 45 - 49.

248. Varbanets L.D., Shashkov A.S., Kocharova N.A. Phosphorus-containing glycopolymers of Clavibacter michiganense cell walls // Carbohydr. Res. 1990. -V. 204.-P. 157- 160.

249. Vinogradov E.V., Bock K., Hoist O., Brade H. The structure of the lipid Acore region of the lipopolysaccharides from Vibrio cholerae 01 smooth strain 569B (Inaba) and rough mutant strain 95R (Ogawa) // Eur. J. Biochem. 1995. - V. 233.-P. 152- 158.

250. Vinogradov E.V., Brade L., Brade H., Holstb O. Structural and serological characterisation of the O-antigenic polysaccharide of the lipopolysaccharide from Acinetobacter baumannii strain 24 // Carbohydr. Res. 2003a. - V. 338. - P. 2751 -2756.

251. Wang Z., Li J., Vinogradov E., Altman E. Structural studies of the core region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. 2006. - V. 341.-P. 109 - 117.

252. Webwer O.B., Cruz L. M., Baldani J. I. and Dobereiner J. Herbaspirillum-like bacteria in babana (Musa sp.) plants // Brasil. J. Microbiol. 2001. - V. 32. -P. 201 -205.

253. Weckesser J., Mayer H. Different lipid A types in lipopolysaccharides of phototrophic and related non-phototrophic bacteria // FEMS Microbiol. Rev. -1988. V. 54, № 2. - P. 143 - 154.

254. Weintraub A. Immunology of bacterial polysaccharide antigens // Carbohydr. Res. 2003. - V. 338. - P. 2539 - 2547.

255. Weintraub A., Zahringer U., Wollenweber H.W., Seydel U., Rietschel E.T. Structural characterization of the lipid A component of Bacteroides fragilis strain NCTC 9343 // Eur. J. Biochem. 1989. - V. 183. - P. 425 - 431.

256. Weller D.M. Biological control of soilborne plant pathogens in the rizophere with bacteria // Annu. Rev. Phytopathol. 1988. - V. 26. - P. 379 -407.

257. Wesphal O., Lüderitz O. Chemische Erforschung von Lipopolysacchariden Gram-negativer Bacterien // Angew Chemie. 1954. - V. 66. - P. 407 - 414.

258. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides. Extraction with phenol-water and further applications of the procedure // Meth. Carbohydr. Chem. 1965. - V. 5.-P. 83-91.

259. Westphal O., Lüderitz O., Bister F.Z. Über die Extraktion von Bakterien mit Phenol/Wasser // Z. Naturforsh: Anorg. Chem. Org. Chem. Biochem. Biophys. Biol. 1952. - Bd. 7B. - S. 148 - 155.

260. Whitfield C., Paiment A. Biosynthesis and assembly of Group 1 capsular polysaccharides in Escherichia coli and related extracellular polysaccharides in other Bacteria // Carbohydr. Res. 2003. - V. 338. - P. 2491 - 2502.

261. Whitfield C., Roberts I.S. Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli II Molecular Microbiol. 1999. - V. 31. - Issue 5. -P. 1307 - 1319.

262. Whitfield C., Valvano M.A., Biosynthesis and expression of cell-surface polysaccharides in Gram-negative bacteria // Adv. Microb. Physiol. 1993. - V. 35.-P. 135 -246.

263. Wiese A., Seydel U. Interaction of peptides and proteins with bacterial surface glycolipids: a comparison of glycosphingolipids and lipopolysaccharides // J. Ind. Microbiol. Biotech. 1999. - V. 23. - P. 414 -424.

264. Wilkinson S.G. Bacterial lipopolysaccharides themes and variation // Prog. Lipid Res. - 1996. - V. 35, № 3. - P. 283 - 343.

265. Wilkinson S.G., Caudwell P.F. Lipid composition and chemataxonomy of Pseudomonas putrefactions (Alteromonas putrefactions) // J. Gen. Microbiol. -1980. V. 118, № 2. - P. 329 - 341

266. Williams M.N.V., Hollingsworth R.I., Brzoska P.M., Singer E.R., Rhizobium meliloti chromosomal loci required for suppression of exopolysaccharide mutations, by lipopolysaccharide // J. Bacterid. 1990. - V. 172.-P. 6596-6598.

267. Wyckoff T.J., Raetz C.R., Jackman J.E. Antibacterial and antiinflammatory agents that target endotoxin // Trends. Microbiol. 1998. - V. 6. -P. 154- 159.

268. Yadomae T., Yamada H., Miyazaki T. et. Al. Characterization of an extracellular polysaccharide from a Xanthomonas species // Carbohidr. Res. -1978.-V. 60.-P.129- 139.

269. Yakovleva L.M., Zdorovenko G.M., Gvozdiak R.I., Zacharova I.Ya. Extracellular carbohydrate-containg substances of some phytopathogenic Pseudomonas II 3rd Bratislawa Symposium on saccharides. Bratislawa. -Bratislawa, 1986.-P. 38.

270. Yao X., Jericho M., Pink D., Beveridge T.J. Thickness and elasticity of gram-negative murein sacculi measured by atomic force microscopy // J. Bacteriol. 1999. - V. 182, № 22.-P."6865-6875.o ©

271. Yokota A., Rodrigues M., Yamata I. Lipopolysaccharides of chemolithotrophic bacteria Thiobacillus species containing lipid A with 2,3-diamino-2,3-didideoxyglucose // Arch. Microbiol. 1987. - V. 149, № 2. - P. 106 - 111.

272. Zakria M., Ohsako A., Saeki Yu., Yamamoto A., Akao Sh. Colonization and growth promotion characteristics of Enterobacter sp. and Herbaspirillum sp. On Brassica oleracea II Soil science and Plant Nutrition. 2008. - V.54. - P. 507 -516.

273. Zdorovenko E.L., Varbanets L.D., Zatonsky G.V., Ostapchuk A.N. Structures of two putative O-specific polysaccharides from the Rahnella aquatilis 3-95 lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. 2006. - V. 341. - P. 164 - 168.

274. Zdorovenko E.L., Valueva O.A., Varbanets L.D., Shubchinskiy V.V., Shashkov A.S., Knirel Yu.A. Structure of the O-polysaccharide of the lipopolysaccharide of Pragia fontium 97U116 // Carbohydr Res. 2010. - V. 345, № 12. -P. 1812-1815.

Информация о работе

Величко, Наталья Сергеевна
кандидата биологических наук
Саратов, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Характеристика химического и антигенного составов гликополимеров поверхности бактерий Herbaspirillum seropedicae Z78 и Herbaspirillum lusitanum P6-12 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы