Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химические свойства клеточной поверхности бактерий рода Azospirillum: цитохимический и электрооптический анализ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические свойства клеточной поверхности бактерий рода Azospirillum: цитохимический и электрооптический анализ"

РГ 5 ОД

На правах рукописи

БОГАТЫРЕВ Владимир Александрович

Физико-химические свойства клеточной поверхности бактерий рода АгозрпгШит: цитохимический и электрооптический анализ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов, 1995

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорг низмов Российской Академии Наук (ИБФРМ РАН).

Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ, доктор биологичесю наук, профессор Игнатов В.В., кандидат физико-математических наук, ведуии научный сотрудник Хлебков Н.Г.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, старший научный с трудник Дятлов И.А., доктор биологических наук, заведующий лаборатори Панасенко В.И.

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (г. Оболенск).

Защита состоится 16 ноября 1995г. в 9 час. 30 мин. на заседании Диссертацж ного совета Д074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумн институте "Микроб" (410071, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РНИПЧИ "Микроб".

Автореферат разослан 14 октября 1995г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, пр фессор Корнеев Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы отмечается растущий интерес к сво-бодноживущим почвенным микроорганизмам, ассоциированным с корневой системой растений, в частности, к бактериям рода Azospiriflum. Наряду с представителями некоторых иных родов (цианобактериями, азотобактером, клостридиями, псевдомонадами и др.) эти микробы способны осуществлять ассоциативную (несимбиотическую) фиксацию атмосферного азота и снабжать растения важными для них метаболитами (например, фитогормонамн). Однако при этом не образуется выраженных морфологических атрибутов типа растительных клубеньков, характерных для бобово-ризобиального симбиоза. Поэтому особое значение приобретает поиск информативных физиолого-биохимических тестов и соответствующих методов их реализации, позволяющих характеризовать способность бактерий к установлению ассоциативных взаимодействий с растениями.

Очевидно, что на ключевых этапах контактных взаимодействий ассоциативных микроорганизмов с растениями большое значение имеет структура клеточной поверхности обоих партнеров. В цело;.! рял« pauoi, посушенных ризобиальному симбиозу и агробактериальному патогенезу, была показана существенна« роль бактериальных липополисахаридов, экзополисахаридов, белков-адгезинов и фибрилл на этапах узнавания и инфицирования микроорганизмами растения-хозяина (Matthysse et al., 1978, Leigt et al., 1985, Smit et al., 1989). Однако для азоспирилл, в отличие от ризобий и патогенных агробактерий, объем фактических данных о структуре, физико-химических и биохимических свойствах клеточной поверхности, а также о биологической роли различных ее компонентов весьма ограничен. Это, как мы полагаем, обусловлено, в частности, недостаточной проработанностью оптимальных методов исследования в их приложении к изучению тонких структурных особенностей внешней мембраны клеток азоспирилл. К числу таких методов мы относим методы цитохимического (Bullock, Petrusz, 1983, 1985) и электрооптического (Толстой и др., 1967, Стоилов и др., 1977, Мирошников и др., 1986) анализа клеток.

Маркеры для цитохимического анализа представляют собой конъюгаты биоспецифических макромолекул (зондов) с различными метками: ферментной, радиоизотопной, флуоресцентной . . . Очевидно, что универсальной метки для всего многообразия вариантов цитохимического анализа не существует. Поэтому, наряду с широко известными методиками, например, с применением иммунофермент-ного и радиоизотопного анализа, представляют интерес новые подходы, основанные, в частности, на использовании в качестве меток частиц коллоидного золота (КЗ).

Известные из литературы преимущества КЗ по сравнению с отмеченными выше метками сводятся к: а) возможности использования как в микроскопии, так и в твердофазном био- и иммуноанализе, б) более простой методике применения, в) высокой чувствительности, сопоставимой с чувствительностью радиоизотопной метки. Однако до начала исследований, представленных в данной диссертации, был недостаточно разработан ряд принципиальных вопросов, связанных с получением биоспецифических маркеров - конъюгатов КЗ с заданными свойствами, контролем качества получаемых препаратов и их практическим использованием в твердофазном био- и иммуноанализе бактериальных клеток.

Основой метода электрооптического анализа коллоидных систем является зависимость их оптических свойств от ориентации частиц под действием электрического поля. Анализ современной литературы показывает хорошие потенциальные возможности данного метода в его приложении к исследованию биологических

систем, В том числе это касается высокой чувствительности электрооптических характеристик суспензий клеток к изменениям электрофизических свойств клеточной поверхности, связанных с особенностями клеточного метаболизма (Фомченков, 1982), специфических и неспецифических взаимодействий клеточной поверхности с разнообразными высоко- и низкомолекулярными веществами (Сирота, 1979, Khlebtsov et al„ 1991) и т.д.

Однако оптические модели, использовавшиеся до недавнего времени для интерпретации результатов электрооптических измерений, не соответствовали реальным бактериальным и дрожжевым взвесям. Развитая в последние годы теория ориентационных оптических эффектов (Хлебцов, 1988, Khlebtsov et al., 1991) применительно к бактериальным суспензиям требовала экспериментальной проверки. Кроме того, дискуссионным оставался вопрос о природе механизмов ориентации клеток в инфранизкочастотных электрических полях. Экспериментальные исследования указанных двух проблем вошли в круг задач данной диссертации. При этом была также апробирована методика определения геометрических, оптических и электрофизических параметров клеток по данным спектральных, релаксационных и полевых измерений.

Цель работы. Основной целью данной работы было развитие методологии иммуноцитохимического и электрооптического анализа клеточных популяций в их приложении к оценке ряда молекулярно-генетических и биофизических характеристик почвенных ассоциативных бактерий рода Azospirillum. При этом решались следующие конкретные задачи:

1. Разработать эффективные методы синтеза коллоидного золота и его конъюгации с различными зондами - антителами, протеином А, лектинами, целлюла-зой и др., обеспечивающие получение биомаркеров с заданным размером частиц золота в интервале 1-50 нм.

2. Провести сравнение экспериментальных спектров ослабления золей золота и суспензий биомархеров с результатами численных расчетов с применением современных оптических теорий.

3. Изучить возможность применения метода твердофазного иммуноанализа с биоспецифическими маркерами - конъюгатами коллоидного золота для изучения интактных бактериальных клеток.

4. Методом дот-блот анализа оценить эффективность взаимодействия интактных клеток азоспирилл с антителами, специфичными к О-антигенам различных штаммов бактерий данного рода.

5. Оценить влияние R - S диссоциации A. brasilense Sp 7 на характеристики поверхностных структур бактерий, определяемые методами иммуноцитохимического анализа.

6. Провести экспериментальное исследование электрооптических характеристик бактериальных суспензий в их сопоставлении с результатами усовершенствованной теории.

7. Провести изучение электрофизических свойств клеточной поверхности бактерий рода Azospirillum.

Научная новизна работы заключается в том, что в ней предложен новый способ синтеза КЗ восстановлением золотохлористоводородной кислоты (ЗХВК) (патент РФ N2013374), обеспечивающий получение стабильных маркеров в области относительно малых диаметров частиц КЗ (1-5нм). Впервые проведено сравнение экспериментальных спектров ослабления света золями золота и суспензиями конъюгатов с результатами расчетов, выполненных по современным версиям тео-

рии поглощения и рассеяния света малыми частицами с учетом их реальных геометрических и оптических особенностей.

Предложена оригинальная процедура твердофазного иммуноанализа целых клеток с использованием их прямого и непрямого мечения иммуноцитохимиче-скими маркерами, содержащими частицы КЗ (названная нами cell-gold im-munoblotting). С ее использованием впервые для азоспирилл показано, что при R -S диссоциации штамма A. brasilense Sp 7, связанной с элиминацией плазмиды 115 МДа, происходят изменения свойств клеточной поверхности, которые могут свидетельствовать об утрате целлюлозоподобных структур на поверхности клеток-диссоциантов.

Впервые проведено сравнение электрооптических свойств клеточных популяций (ориентационный турбндиметрический эффект и дихроизм), полученных экспериментально, с результатами соответствующих теоретических расчетов. Экспериментально показана возможность решения задачи одновременного определения геометрических оптических и электрофизических параметров клеток по их ориен-тационным спек 1 рил! ослабления caaia. Получены новые данные по дискуссионному вопросу о природе дипольного момента микробных хлгтк. саидстслт.ст-вующие об отсутствии их полной переориентации даже в поле инфранизкочастот-ных электрических импульсов. Обнаружена корреляция между рН-зависимым изменением низкочастотного электрооптического эффекта и изоэлектрической точкой клеток.

Практическая значимость работы. Разработанный оригинальный способ синтеза золей золота позволил оптимизировать технологию получения конъюга-тов золотой метки с биоспецифическими зондами (иммуноглобулинами, лектина-ми, ферментами и т.п.) при любом заданном диаметре частиц из интервала 1-50нм. Получены калибровочные кривые для оперативного слектрофотометрического контроля процесса синтеза КЗ маркеров. На основе этих разработок создан Лабораторный технологический регламент для получения биомаркеров. Наработаны их опытные образцы и проведены лабораторные испытания в тест-системах с использованием иммуноглобулиновых, лектиновых и ферментных зондов. Составлен каталог препаратов, включающий 121 наименование биомаркеров, используемых в нескольких лабораториях ИБФРМ РАН. Часть образцов передана другим организациям по их заказам (включая представителей ближнего зарубежья) для проведения работ, связанных с решением широкого круга научных и прикладных задач в области физико-химической биологии, биотехнологии и медицины.

Результаты экспериментальной проверки теории ориентационных оптических эффектов включены в разработку специализированного прибора - электрооптического спектротурбидиметра, выполняемую в рамках международного научно-технического проекта "ЕОСТ" (совместно с Институтом физической химии Болгарской академии наук), финансируемого Министерством науки РФ.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Усовершенствование технологии синтеза золей золота и его конъюгации с биомакромолекулами, а также методики контроля морфометрических и биоспецифических свойств получаемых препаратов.

2. Разработка и апробация на примере почвенных микроорганизмов методики твердофазного иммуноанализа целых клеток с использованием их прямого и непрямого мечения иммуноцитохимическими маркерами, содержащими частицы КЗ (cell-gold immunoblotting).

3. Установление взаимосвязи изменений некоторых физико-химических свойств клеточной поверхности бактерий A. brasilense Sp 7 в процессе R-S диссоциации, сопровождаемой элиминацией плазмиды 115 МДа, с возможной утратой наружных целлюлозоподобных глюкановых структур клеток.

4. Результаты экспериментального изучения: 1) концентрационной, спектральной и полевой зависимостей электрооптического эффекта бактериальных и дрожжевых суспензий; 2) типов движения бактериальных клеток в полях инфра-низких частот; 3) зависимости фазы и амплитуды динамической модуляции от электроповерхностных свойств клеток (изоэлектрическая точка, поверхностная поляризуемость) и физико-химических условий опытов (pH, ионная сила).

Работа выполнена в лаборатории физической химии клеточных структур (ЛФХКС) ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках следующих тем: "Изучение молекулярно-генетических механизмов узнавания, контакта и обмена метаболитами азоспирилл и культурных злаков" (научный руководитель д.б.н., профессор Игнатов В.В., № гос. регистрации 01860024516); "Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений" (научный руководитель к.ф.-м.н., зав. лаб. Щеголев С.Ю., № гос. регистрации 01890017743); "Разработать методологию и измерительные устройства на основе спектротурби-диметрии и электрооптики для исследований в области иммунологии, микробиологии и биотехнологии" (научный руководитель к.ф.-м.н., вед.н.с. Хлебцов Н.Г., № гос. регистрации 01860027453).

Частично данная работа получила финансовую поддержку от Министерства науки и технической политики РФ в рамках программы "Средства обеспечения исследований по физико-химической биологии и биотехнологии" (Распоряжения № 1508ф от 11,05.93г. и последующие), Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 94-03-09286) и Международного научного фонда (фонда Сороса) (номер гранта RNR000).

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на: Всесоюзной конференции "Биофизика микробных популяций" - Красноярск, 1987; Всесоюзной школе "Электронная микроскопия в молекулярной биологии" - Звенигород, 1990; I~°Ä всесоюзной конференции "Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем" - Велигож, 1990; XX Meeting of the FEBS - Budapest (Hungary), 1990; V International Symposium on Nitrogen fixation with non-legumes - Florense (Italy), 1990; XII International Lectin Conference - Devis (USA), 1990; VI International Symposium "Colloid and Molecular Electrooptics" - Vama (Bulgaria), 1991; VIII Eastern European Symposium on Biological Nitrogen fixation - Saratov (Russia), 1992; International Symposium on Biomedical Optics EUROPE'93 - Budapest (Hungary), 1993; I European Nitrogen Fixation Conference - Szeged (Hungary), 1994; I International Conference on Polysaccharide Engineering - Trondheim (Norway), 1994; NATO Advanced Research Workshop on Azos-pirillum and Related Microorganisms - Sarvar (Hungary), 1994; International Workshop on Associative Interactions of Nitrogen-Fixing Bacteria with Plants - Saratov (Russia), 1995; а также на отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 печатных работ (включая одно изобретение) в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав (включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждение), заключения, списка исполь-

юванных литературных источников и приложения. Работа изложена на 201 стра-1ице, иллюстрирована 40 рисунками и включает 6 таблиц. Список использовании литературных источников включает 168 наименований.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературный обзор представлен в первой главе, где дана характеристика рода Azospirilîum, рассмотрены основные типы поверхностных структур клеток и обсу-кдена их роль в бактериально-растительных взаимодействиях. Приведены известные примеры применения коллоидного золота в иммунохимическом и иммуноци-гохимическом анализе клеточных структур, а также методов спектротурбидимет-эии и электрооптики в их приложении к анализу клеточных популяций. Кроме гого, дополнительные обсуждения литературных данных, посвященных конкретным методологическим и теоретическим аспектам технологии применения КЗ и злектроошичсгкого анализа клеток, имеются в третьей и пятой главах диссертации.

Сведения об использованных материалах п рутинных методах исследования 1редставлены отдельно во второй главе. Оригинальные разработки по метел" моги и иммуноцитохимического и электрооптического анализа клеток представлены, :оответственно, в третьей и пятой главах диссертации.

В работе использованы культуры: Azospirilîum brasilense Sp 7, Sp 107, Sp 245, JM 125 A2, S 27, KR 77, UQ 1794, Sp Br 14; Azospirilîum lipo/erum Sp 59b, RG 20a; Her-bospirillum seropedicae Z-78; Escherichia coli J-62; Bacillus polimyxa B-3015, Candida 'ambica ВНБ-579. Штаммы были получены от различных источников (авторов) и хранились в группе геносистематики ИБФРМ РАН. Мутанты штамма A. brasilense 5р 245 и S-диссоциант штамма A. brasilense Sp 7 были получены и любезно предоставлены сотрудниками лаборатории генетики ИБФРМ РАН. Культуры клеток азоспирилл, как правило, выращивали на жидкой синтетической малатной среде (Bulow, Dobereiner, 1975) при 28°С до поздней логарифмической фазы роста.

Для получении антител, специфичных к углеводным компонентам клеточной поверхности бактерий, использовали специальную методику иммунизации кроликов целыми клетками, включающую их предварительную обработку глутаровым альдегидом (Матора, 1992).

Морфометрический контроль параметров маркеров на основе КЗ проводили по результатам электронно-микроскопического анализа. Биоспецифические свой-:тва этих препаратов определяли методом дот-блот анализа.

Для определения относительной гидрофобности использовали следующие методы: гидрофобную хроматографию, высаливание сульфатом аммония, скрининг культур по их прилипанию к полистиролу (Dilon et al., 1986), разделение в двухфазных системах (Сингуров, 1984).

Калькофлюорный тест проводили согласно Matthysse et al. (1981), выращивая культуры на чашках с плотной средой LB, содержащей 0,02% калькофлюора. Агглютинацию суспензии клеток моркови проводили по методу тех же авторов, используя прямую и светомикроскопическую визуализацию. Электрофорез липопо-яисахаридов проводили по Hitchcock, Brown (1983).

Спектрофотомстрические и турбидиметрические измерения проводили на при-5оре "Specord М-40" (Германия) с приставкой для турбидиметрических измерений, разработанной в ЛФХКС ИБФРМ РАН (Хлебцов, Мельников, 1987). Электронно-микроскопические исследования выполняли на приборе BS-500 "Tesla" (ЧССР), светомикроскопические - на микроскопе "ЛЮМАМ И-2" (ЛОМО, Россия) с применением фазового контраста. Основные электрооптические измерения проводили

на оригинальной установке (Сирота, 1979, Хлебцов и др., 1989). В качестве электрооптической ячейки использовали фотометрические кюветы с установленными в них никелевыми (золочеными) или графитовыми электродами.

Полученные результаты и их обсуждение

1. Усовершенствование методики синтеза золей золота и его конъюгации с биомакромолекулами

Рассмотрим поэтапно технологию получения биоспецифических коньюгатов КЗ: 1) синтез золей золота с заданным размером частиц; 2) конъюгирование золей с биоспецифическими зондами; 3) контроль качества полученных золей и коньюгатов.

1) Качество золотосодержащего маркера существенно зависит от степени монодисперсности исходных золей золота. Оптимальный диапазон средних диаметров (с0 частиц КЗ, пригодных в качестве метки в многоцелевом анализе поверхностных структур клеток, охватывает интервал от I -5нм (электронная микроскопия) до 30-50нм (твердофазный био- и иммуноанализ). Однако получение практически монодисперсных золей в диапазоне (I порядка 1 -5нм оставалось сложной задачей, которая не была решена в известных нам способах синтеза КЗ. Подробный анализ их ограничений и недостатков приведен в третьей главе диссертации.

Предложенный нами способ, признанный изобретением, осуществляется следующим образом. К 50мл 0.01% водного раствора ЗХВК (в реакционную смесь может быть добавлен 0.2М раствор карбоната калия для достижения рН, оптимального для дальнейшей конъюгации) при интенсивном перемешивании без нагревания сначала добавляли ЭДТА-Ыа: (3-3.5x10^ М), а затем 0.5мл 0.1% раствора борогидрида натрия. При этом образовывался золь оранжево-красного цвета. Средний размер частиц золота и степень полидисперсности образцов определяли либо с помощью электронной микроскопии, либо спектрофотометрически.

Для получения золей с размерами частиц от 15 до 50 нм использовали цитрат-ный метод Фрэнса (ИгепЕ, 1973), а для диапазона размеров 8-10 нм - модификацию этого метода (Бе Меу, Моегетат, 1986). Отметим, что установленные нами концентрации восстановителя, необходимые для получения частиц заданного размера, несколько отличались от предложенных Фрэнсом. Таким образом, комбинация описанного оригинального способа с известным цитратным методом и его модификацией позволила получать достаточно монодисперсные золи с размером частиц в диапазоне 1-50 нм.

2) Конъюгация КЗ с биоспецифическим зондом происходит благодаря суммарному эффекту относительно слабых нековалентных взаимодействий (электростатических и гидрофобных), что позволяет с большой вероятностью сохранить нативность биомакромолекул, а, следовательно, активность и специфичность их взаимодействия с лигандом.

Для получения устойчивого маркера рН золотого золя доводили до значения на 0,5 ед. выше изоэлектрической точки белка. Конъюгацию проводили смешиванием золя золота и зонда, взятого в количестве на 20% превосходящем так называемое "золотое число". Последнее определяется минимальным защитным количеством биополимера (зонда), необходимым для стабилизации золя золота. Затем вносили вторичный стабилизатор (полиэтиленгликоль) до концентрации 0.02%. Концентрирование маркера осуществляли либо центрифугированием, либо диализом против полиэтиленгликоля. Фракционирование препарата проводили центрифугированием в градиенте концентрации глицерина или с помощью гель-

фильтрации. Отобранные фракции подвергали спектрофотометрическому контролю, доводили до оптической плотности Dsv> = 5 (в расчете на 1-см кювету) и разливали по аликвотам для последующего хранения и использования.

3) Контроль за качеством маркеров требует, прежде всего, оперативного определения среднего размера частиц КЗ. Очевидно, что в силу сложности аппаратурной и препаративной реализации традиционный метод электронной микроскопии мало пригоден для этой цели. По этим причинам мы решили использовать спектрофотометрический метод, основанный на известной зависимости максимума поглощения золен от размера частиц (Борен, Хафмен, 1986). Оптическим свойствам золотых золей посвящена обширная литература, однако мы не нашли детальных количественных теоретических и экспериментальных исследований зависимости величины и спектрального положения максимума экстинкции золей и их конъюгатов от размера частиц в диапазоне 1 -50 нм с учетом реальной полидисперсности л полиморфности частиц, а также с учетом зависимости оптических констанг от размера чаешц нзномггровод; дпагтяэоня.

Чтобы восполнить данный пробел и получить надежную калибровку для определения размера частиц КЗ мы синтезировали золи золота со значениями d в диапазоне 4-40нм и на их основе получили биоспецифический маркер - конъюгат КЗ с овомукоидом. Эти препараты были нами использованы для сравнения экспериментально определенных спектров ослабления света для золей и конъюгата с результатами соответствующих теоретических расчетов, учитывающих перечисленные выше геометрические и оптические особенности частиц. Эти расчеты были выполнены с использованием классической и современной версий теории рассеяния и поглощения света малыми частицами: теории Ми (Mie, 1908) и метода Т-матриц (Борен, Хафмен, 1986). Был использован ряд экспериментальных наборов спектральной зависимости оптических констант объемного золота, модифицированных нами с учетом размерных эффектов. Кроме того, учитывались полидисперсность по размерам и форме частиц КЗ, смоделированные на основе данных электронно-микроскопического анализа.

По результатам сравнения теоретических и экспериментальных зависимостей величины и положения максимума экстинкции от среднего размера частиц КЗ была выбрана оптическая модель, позволяющая наиболее точно описать экспериментальные спектры в диапазоне длины волны света 300-800 нм. На основе электронно-микроскопических и спектральных измерений были получены калибровочные кривые (рис. 1), которые предлагаются нами к использованию для оперативного спектрофотометрического контроля размера золотых частиц и для расчета количества восстановителя, необходимого для получения частиц КЗ заданного размера. Как видно из рис. I, сдвиг положения максимума с увеличением размера частиц достаточно мал, поэтому в наших экспериментах обеспечивалась точность определения величины и положения максимума экстинкции не хуже ±0.002 и ±0.5 нм соответственно. Важно отметить, что калибровки на рис. ! являются не просто эмпирически установленными зависимостями, а вполне обоснованы в рамках точных оптических теорий, справедливых для малых металлических частиц.

40

20

2 4

V, МП

Рис. I. Калибровочные кривые для определения среднего диаметра d частиц золя по величине >.тах (а) и для определения объема 1% цитрата натрия (на 100 мл золя), необходимого для получения частиц заданного размера (б). 1 - экспериментальные данные, 2 -наилучшие полиномиальная (а) и степенная (б) аппроксимации.

Для конъюгатов коллоидного золота с овомукоидом были проведены спектральные измерения и определены стабилизирующие концентрации зонда по методике солевой дестабилизации. Эти исследования показали, что уже простейшая двухслойная, сферическая модель конъюгата позволяет адекватно объяснить основные изменения в спектрах золя после его конъюгирования со специфическими биомакромолекулами и сделать определенные выводы о структуре адсорбированного биополимерного слоя. В частноти, о толщине слоя и объемной доле биополимера в нем.

2. Твердофазный иммуноанализ интактных бактериальных клеток (cell-gold immunoblotting): экспериментальное обоснование и апробация на примере серологического и биоспецифического анализа штаммов и мутантов азоспирилл

Метод твердофазного иммуноанализа основан на переносе частиц исследуемого вещества на твердый носитель (сорбент) с последующим специфическим выявлением исследуемых компонентов с помощью иммунохимической реакции. Этот метод имеет высокую чувствительность и точность анализа, а также быстр, надежен и прост в исполнении. В работах Liang, Emerich (1987), Meier-Dieter et al. (1989) сообщалось об использовании в твердофазном анализе с пероксидазной меткой целых бактериальных клеток (что было названо авторами "colony immunoblotting"), выращенных на нитроцеллюлозных мембранах, либо перенесенных на них из накопительной среды. Нас весьма заинтересовала возможность использования аналогичной техники с коллоидно-золотой меткой, поскольку, как показывают результаты сравнительных исследований, например, в области клинической гистохимической диагностики (Edwards, Wilson, 1987), иммунно-золотой метод превосходит пероксидазный, по крайней мере, по трем показателям: оперативности, чувствительности и себестоимости анализов.

Схема проведения твердофазного иммуноанализа включает выполнение следующих операций: нанесение исследуемого материала на сорбент, блокирование

Л™,- эОО.нм

фона, иммунохимическое выявление антигенов с помощью зондов, меченных коллоидным золотом. В качестве сорбента мы использовали нитроцеллюлозные фильтры, выпускаемые фирмами "Millipore" (США; диаметр пор 0.22мкм) и "Synpor" (ЧССР; диаметр пор 1.5мкм). Отметим, что при работе с целыми клетками предпочтение следует отдавать более крупнопористым мембранам (1.5мкм), поскольку мелкие поры легко "забиваются" клетками бактерий, которые препятствуют проникновению маркера вглубь мембраны. При этом пятна с меньшим количеством корпускулярного антигена могут даже выявляться ярче.

Для иммунохимического выявления антигенов, находящихся на поверхности целых клеток, применяли методики их прямого и непрямого мечения. При прямом мечении для визуализации продуктов иммунохимических реакций используют непосредственно конъюгаты КЗ с иммуноглобулинами. При непрямом мечении места связывания антигенов с антителами выявляются с использованием третьего бноспецифического компонента (меченного КЗ), способного специфически связываться с иммуноглобулинами. Зю может бып. либо протеин A (G), либо антитела против иммуноглобулинов. Использование непрямого меч^чив позьоллгг обойтись без стадий получения конъюгатов КЗ с антителами к каждому из исследуемых, штаммов бактерий и весьма целесообразно при проведении серий экспериментов с большим числом штаммов (или мутантов) микроорганизмов.

На рис. 2 приведены результаты дот-блот анализа целых клеток для двух видов азоспирилл с использованием гомологичных антител, специфичных преимущественно к полисахаридным (О-специфическим) компонентам клеточной поверхности каждого из исследуемых штаммов. При этом для выявления связавшихся с клетками антител использовали их непрямое мечение посредством конъюгата протеин А + КЗ. Эти результаты показывают, что полученные антитела обладают выраженной видовой и штаммовой специфичностью. При этом четкие перекрестные реакции, сравнимые с прямыми реакциями

по интенсивности окрашивания мест связывания антител с бактериальными поверхностными антигенами, имеют место только для штаммов А. Ьга$Иете Бр 107 и Бр 245. Данные штаммы были выделены из корней пшеницы и отличаются тем, что один (Эр 245) был получен в полевых, а другой (Бр 107) -в лабораторных условиях (ВаШаш е[ а1„ 1987). Не исключено, что дополнительные исследования могут привести к заключению об идентичности данных штаммов по целому ряду фенотипиче-ских признаков.

Следует отметить практически полную воспроизводимость результатов дот-блот определений типа приведенных на рис. 2 при использовании клеток, подвергнутых предварительной термообработке при 100°С в течение 60 мин. Термостабильность антигенных детерминант, выявляемых в подобных сравнительных опытах,

В

д

0

X

> -Г

> г

5

6

* f

Рис. 2. Дот-блот определние целых клеток (а- с) гомологичными антителами (1-6), выявленными коныогатом протеин А+КЗ, для штаммов: А. Иро/егит 5р59Ь (а,1), А. ЬгазИегие Эр 107 (6,2), А. ЬпиНегие Ш125А2 (в,3), А. ЬгазИеюе Бр7 (8-форма - г,4), А. ЬгазИепхе Бр7 (Я-форма -д,5), А.ЬгазНеюе Бр245 (е,6).

может служить дополнительным подтверждением сделанного ранее вывода о преимущественном иммунном ответе на углеводные антигены клеточной поверхности бактерий, обеспечиваемом при использованном нами способе иммунизации животных (Матора, 1992).

Кроме того, метод cell-gold immunoblotting был использован для оценки взаимодействий клеточной поверхности 65 мутантов A. brasilense Sp 245 с антителами к родительскому штамму (прямое мечение), специфичными к его углеводным антигенам. Одновременно были проведены аналогичные опыты по оценке способности клеточной поверхности мутантов связывать пектиновый конъюгат (WGA+K3). Для вызывающих сомнение штаммов была повторно проверена их способность связывать конъюгаты КЗ с антителами и WGA при стандартной концентрации

клеток N « Ю10 кл/мл. В итоге был выявлен один мутант, утративший способность к синтезу компонентов внешней мембраны клеток со структурой, гомологичной углевод-связывающим центрам WGA (Н-ацетил-й-глкжозамин) и антиген-связывающим центрам антител против О-специфических полисахаридов клеточной поверхности исходного штамма.

Таким образом, мы полагаем, что предложенная процедура твердофазного им-муноанализа целых клеток с использованием их прямого и непрямого мечения иммуноцитохимическими маркерами, содержащими частицы КЗ (cell-gold immunoblotting) отличается простотой и целесообразна, например, при серологических исследованиях большого числа штаммов и мутантов микроорганизмов.

3. Оценка изменений поверхностных свойств бактерий Л. brasilense Sp 7 при их R-S диссоциации Для сравнения структур клеточной поверхности R- и S-форм A. brasilense Sp 7 были проведены опыты по оценке связывания ими целлюлазы, антител и различных лектинов, меченных КЗ. По результатам опубликованных исследований бактерий рода Rhizobium известно, что на первых этапах их взаимодействий с бобовыми (в процессе колонизации корня и образования клубенька) у этих клеток образуются целлюлозные фибриллы. Следовательно, наличие целлюлозы (или ее предшественников типа P-D-глюканов) у бактерий рода Azospirillum могло бы свидетельствовать о схожести механизмов взаимодействия с корнями высших растений для азоспирилл и ризобий.

Прежде всего, нами были выявлены различия в свечении колоний для R- и S- клонов A. brasilense Sp 7 , выращенных на среде, содержащей калькофлюор, что обусловлено различным накоплением этого красителя на поверхности клеток. При этом были хорошо заметны морфологические отличия в характере поверхности колоний.

Результаты дот-блот анализа (рис. 3), проведенного с применением набора молекулярных зондов, специфичных к различным типам углеводных соединений, достаточно убеди-

Щ

а Ш д & 0 ш $ •

q г с ^ rl

Рис. 3. Дот-блот анализ целых клеток Я- (верхний ряд) и Б-форм (нижний ряд) А.ЬгазПете Бр7 с использованием антител к Б-форме (а), иЕА1 (б), Соп А (в), целлюлазы (г) меченных КЗ.

тельно свидетельствуют о наличии глкжанов в составе экзополисахарида (ЭПС) Л-формы А. ЬгазПегие Бр 7, Об этом, в частности, свидетельствуют четко выявляемые взаимодействия с клетками Соп А (специфичного к маннозе и глюкозе) и цел-люлазы (выявляющей гликозидные связи глкжанов), зарегистрированные только для Я-формы данного штамма азоспирилл. Опыты с использованием клеток, предварительно обработанных на доте немеченой целлюлазой, показали специфичность их реакций с данным зондом, меченным КЗ, поскольку такая предобработка создавала эффект ингибирования этих реакций.

Отсутствие взаимодействий Соп А и целлюлазы с клетками Б-формы, по-видимому, говорит о том, что соответствующие им лиганды не входят в состав поверхностных полисахаридов Б-варианта А. Ьгазйете Бр7. Эти соображения согласуются с результатами независимых исследований моносахаридного состава ЭПС бактерий данного штамма, согласно которым в ЭПС из природной Я-формы штамма Бр 7 была обнаружены глюкоза, галактоза, фукоза и рамноза (Бе ТгосЬ й а1„ !')"')), тегдч кик для З-форыы с поверхностных полисахаридах глюкоза не найдена (Коннова и др., ¡990).

Антитела, полученные против Б-формы штамма Бр 7, одинаково эффективно взаимодействовали с обеими формами данного микроорганизма. Аналогичные результаты были получены и в экспериментах с антителами против Я-формы. Как было отмечено выше, использованные нами антитела обладают преимущественно О-антигенной специфичностью. Таким образом можно допустить, что 11-Б диссоциация для бактерий данного штамма не связана с изменением липополисахарид-ной части их внешней мембраны. Об этом свидетельствует также идентичность полученных нами электрофоретических спектров липополисахаридов Я- и Б-форм.

Не выявили различий между Я- и Б-клонами также и лектины \\ЮА (специфичный к М-ацетил-ё-глюкозамину) и РЫА (специфичный к галактозе и галактозамину). Однако лектин иЕА1 уже гораздо лучше взаимодействовал с Я-формой бактерий по сравнению с их Б-вариантом. Что неудивительно, если учесть его специфичность к фукозе и (хотя и в меньшей степени) к глюкозе.

Фенотипическим проявлением выявленных структурных различий клеточной поверхности К- и Б-вариантов азоспирилл штамма Бр 7 может служить неодинаковое влияние бактерий этих форм на суспензию клеток моркови. Это иллюстрируют результаты экспериментов, согласно которым бактерии исходной И.-формы агрегировали клетки данной модельной растительной системы. В то же время для дис-социантов (Б-формы) эффекта агглютинации не наблюдалось.

Наконец, различия в структуре клеточной поверхности Л- и Б-клонов должны, вероятно, сказываться и на таком интегральном показателе клеток, как их относительная гидрофобность, что и показали ее измерения с помощью метода гидрофобной хроматографии. Достоверность результатов была подтверждена еще тремя способами: адгезией на полистироле, высаливанием сульфатом аммония и разделением клеточной суспензии в двухфазных системах. Интересно, что довольно высокий индекс гидрофобности для клеток Б-формы согласуется с присутствием на их поверхности полисахарид-липидного комплекса, богатого липидами (Коннова и др., 1990). Однако для более определенного суждения о вкладе тех или иных поверхностных структур клеток азоспирил в показатели их гидрофобности требуется проведение специальных исследований.

Суммируя изложенные выше результаты проведенных нами экспериментов, можно предположить, что в составе клеточной поверхности природной И.- формы А. ЬгаэИепзе Бр 7 содержатся целлюлозные фибриллы (или их глюкановые предшественники), исчезающие при спонтанной мутации с образованием устойчивой Б-

формы бактерий данного штамма. Специальные генетические исследования показали (Матвеев и др., 1987), что это может быть связано с элиминацией плазмиды 115МДа.

4. Результаты экспериментального изучения электрооптического эффекта для бактериальных и дрожжевых суспензий в полях инфранизкой частоты Основными измеряемыми величинами в наших экспериментах были: 1) ориен-тационный турбидиметрический эффект AD = (Du - Dx) I Dx, где Du - оптическая плотность ориентированной системы для неполяризованного (unpolarized) света, Dx - то же для хаотической ориентации; 2) ориентационный дихроизм

д = (Ai ар~ jpjj) / Dx, где Z>nap, Z)n ерП - оптические плотности для света поляризованного вдоль и поперек ориентирующего поля и распространяющегося перпендикулярно полю. Если указанные выше параметры измеряли для состояния полной или насыщеной (saturation) ориентации, то они дополнительно помечались индексом s: например AD3 или Д^ и т.д.

Нами были проведены измерения параметра ADs и соответствующего изменения пропускания ATS в неполяризованном поперечном по отношению к полю

свете суспензий клеток A. brasilense Sp 245 и С. lambica ВНБ-578 в поле прямоугольных импульсов с частотой 40Гц и напряженностью 140 В/см в зависимости от концентрации суспензий. Цель этих экспериментов - проверка вывода теории, согласно которому указанные концентрационные зависимости изменения пропускания Д 7"j имеют вид универсальных кривых с экстремумом при оптической плотности Dx = 0.434 независимо от размера частиц. Результаты измерений абсолютных величин ADs (не зависящих от концентрации клеток) и концентрационных зависимостей изменения пропускания оказались в отличном согласии с расчетом по теории, основанной на приближении оптически мягких частиц.

Разработанная в ЛФХКС ИБФРМ РАН теория позволяет предсказать зависимость ориентационного изменения прозрачности от длины волны света при заданных размере, форме и степени упорядоченности клеток. Наиболее просто такая зависимость рассчитывается для случая полной ориентации. Количественной характеристикой эффекта является спектральная зависимость параметра ДDs(k) (к - длина световой волны). Полученные нами экспериментальные спектры ориентационного турбидиметрического эффекта для клеток С. lambica ВНБ-578 и В. polimyxa В-3015 , хорошо согласуются с результатами теоретических расчетов (Хлебцов, 1988) и являются однозначной экспериментальной демонстрацией того факта, что не только величина, но даже и знак электрооптического эффекта зависит от отношения размера клеток к длине волны зондирующего излучения. Это обстоятельство имеет важное значение для оптимизации методик электрооптического анализа бактериальных взвесей.

Для измерения оптического дихроизма была разработана оригинальная четы-рехэлектродная методика, в которой изменение поляризации света по отношению к плоскости ориентации клеток достигается не оптически (поворот поляризатора), а электрическим поворотом клеток. Измерения абсолютных величин дихроизма полностью ориентированных клеток Е. coli J-62 и его спектральная зависимость

оказались в хорошем согласии с результатами теоретических расчетов. Этот результат имел решающее значение для проверки теории, поскольку дихроизм ориентированной бактериальной взвеси является гораздо более тонким (и более слабым) эффектом, чем индуцированное полем изменение пропускания.

Зависимость ориентационных эффектов от напряженности электрического поля (так называемая полевая зависимость) используется для определения анизотропии электрический поляризуемости клеток, которая наряду с электрокинетическим потенциалом является их основным электрофизическим параметром. Однако результаты, получаемые разными методами (дихроизм, двойное лучепреломление, светорассеяние), часто не согласуются между собой (Стоилов и др., 1977). По нашему мнению, одна из причин подобных расхождений заключается в некритичном использовании выводов теорий, разработанных для малых релеевских частиц. В данной работе мы впервые, насколько нам известно, попытались сопоставить теоретические и экспериментальные полевые зависимости абсолютных значений ориентационных эффектов, а не нормированных на максимальное значение в насыщении (прием, использовавшийся многими авторами), поскольку такая нормировка в значшельноЯ мере обесценивает резулы дт проверки (Хлебпов. 1988). Из сопоставления этих зависимостей в слабых полях были определены значения апп

зотропии электрической поляризуемости клеток Ду =4Ы(Г28Ф-м2 (Е. соИ 1-62) и Ду =40 10_27Ф-м2(В. роИтуха В-3015), которые находятся в согласии с литературными данными (Мирошников и др., 1988). Эти значения Ду и экспериментальные морфометрические параметры клеток приводят также к согласию полных абсолютных теоретических полевых характеристик с результатами наших измерений.

Таким образом, наши экспериментальные измерения показали адекватность разработанной теории (Хлебцов, 1988) в описании ориентационных оптических эффектов в бактериальных взвесях.

В работе представлены также результаты первой экспериментальной проверки схемы решения обратной задачи спектротурбидиметрии ориентированных систем в комбинации с данными измерений релаксации электрооптического эффекта после снятия поля. Проведя соответствующие измерения для клеток Е. сой .1-62 и В. роИтуха В-3015 и решив обратную задачу ориентационной спектротурбидиметрии, мы получили из одного эксперимента следующий набор данных: средние наибольший и наименьший размеры клеток, их усредненный показатель преломления, число клеток в единице объема, удельную поверхность, концентрацию биомассы и анизотропию поверхностной поляризуемости Ду (по измерениям полевой зависимости).

В пятой главе диссертации представлены также результаты исследования типов движения клеток в импульсных полях инфранизких частот. Этот вопрос тесно связан с природой дипольного момента клеток и дискуссией, ведущейся в литературе по этому вопросу (Толстой и др., 1972, Стоилов и др., 1977, БЫтепоуа е1 а!., 1991). Еще в начале 50-х годов было показано (Толстой, 1955), что для очень широкого круга синтетических и биологических суспензий в поле инфранизких частот регистрируется динамическое изменение прозрачности, синхронизированное с переключением знака поля, которое интерпретировалось как полная периориента-ция частиц вследствие наличия у них собственного жесткого (постоянного) диполя в полярных средах. Однако при регистрации только переменной части электрооптического сигнала вне поля зрения исследователей оставалась усредненная упоря-

Рис. 4. Основной электрооптический опыт в П-лоле: осциллограммы изменения прозрачности дисперсий клеток А. Ьта^Иепзе (а) и Е. соИ (б) под действием пачки импульсов поперечного поля ЮОВ.см с частотами 2.5(1), 7(2), 14(3), 25(4) Гц.

доченность клеток, которая на более высоких частотах является основным эффектом.

Основная идея наших экспериментов заключалась в регистрации и количественном исследовании полного электрооптического отклика бактериальной взвеси на пачку прямоугольных знакопеременных импульсов (рис.4), включая нарастание сигнала до некоторого стационарного уровня, переменную модуляцию около этого уровня и релаксацию после выключения поля. Сопоставление величин стационарного и переменного электрооптического эффектов показывает, что динамическая модуляция составляет небольшую часть общего сигнала, в особенности на более высоких частотах. Мы провели серию экспериментов, которые включали: 1) количественное измерение стационарного и динамического эффектов при разных частотах и напряженностях поля и при разных концентрациях клеток; 2) прямую фоторегистрацию клеток в ячейке для микроэлектрофореза, на которую подавались теже самые импульсы знакопеременного поля, а фоторегистрация осуществлялась с заданным временным сдвигом по отношению к моменту переключения направления поля. В результате мы пришли к выводу, что клетки в поле переменных прямоугольных импульсов совершают малые колебания около состояния полной ориентации, достигаемого в промежуточные моменты после переключения полярности поля. В работе обсуждается возможный механизм такого движения, связанный с инерционностью перестройки диффузной ионной атмосферы на ин-франизких частотах (Стоилов и др., 1977).

В заключительной части работы представлены результаты исследования зависимости фазы и амплитуды динамической модуляции от электроповерхностных свойств клеток (изоэлектрическая точка, поверхностная поляризуемость) и физико-химических условий измерений (рН, ионной силы). Основной результат наших исследований состоит в обнаружении изменения типа модуляции динамического эффекта в кислой области рН. При этом стационарный сигнал на низких частотах практически равен нулю, а на высоких частотах крутизна его нарастания очень мала. Эти эффекты, как мы убедились, не связаны с увеличением электропроводности. Нам представляется, что точка нулевого стационарного эффекта и изменения типа низкочастотной модуляции соответствует изоэлектрической точке клеток (или хотя бы коррелирует с ней). Во всяком случае, мы получали автоагглютинацию при значениях рН нулевых электрооптических эффектов. Здесь очевидна аналогия с корреляцией между стабильностью, нулевой анизотропией поляризуемости и электрокинетическим потенциалом, обнаруженная в экспериментах по светорассеянию (Стоилов и др., 1977, БЮтепоуа е1 а1„ 1991).

17

ВЫВОДЫ

1. Показана эффективность оригинальных методологических подходов, развитых на основе иммуноцитохимического и электрооптического анализа микроорганизмов, в исследовании структуры и физико-химических свойств клеточной поверхности почвенных азотфиксирующих ассоциативных бактерий рода Azospirillum.

2. С использованием запатентованного способа синтеза коллоидного золота разработана оптимальная технология получения его конъюгатов с различными биоспецифическими зондами - антителами, протеином А, лектинами, целлю-лазой и др., обеспечивающая получение биомаркеров с заданным диаметром частиц золота в широком интервале (1-50нм), охватывающем область размеров меток, пригодных к использованию как в электронной и световой микроскопии, так и в твердофазном био- и иммуноанализе.

3. Предложены и обоснованы сравнением с данными теоретических расчетов по современным вариантам оптических теорий оперативные спектрофотометри-ческис метод;.! "подменил срезного размера частиц золота и контроля качества препаратов - конъюгатов коллоидного 'опо га.

4. Предложена и апробирована на почвенных микроорганизмах рода A-ospirJiw" оригинальная процедура твердофазного иммуноанализа целых клеток с использованием их прямого и непрямого мечения иммуноцитохимическими маркерами, содержащими частицы коллоидного золота (cell-gold immunoblot-ting).

5. По результатам дот-блот анализа интактных клеток азоспирилл с антителами, специфичными к О-антигенам различных штаммов бактерий данного рода, составлена серологическая характеристика десяти штаммов. Зарегистрировано иммунологическое подобие для штаммов A. brasilense Sp 245 и Sp 107. Из 65 мутантов штамма A. brasilense Sp 245 был выявлен штамм, утративший способность взаимодействовать с гомологичными антителами и агглютинином зародышей пшеницы.

6. Установлено, что в процессе R - S диссоциации штамма A. brasilense Sp 7, сопровождающимся утратой плазмиды 115 МДа, клетки разных форм неодинаково связывают калькофлюор, отличаются по связыванию глюкозоспецифич-ных лектинов и целлюлазы, меченных коллоидным золотом, обладают различной степенью гидрофобности и по-разному агглютинируют суспензию морковных клеток. При этом не выявлено различий во взаимодействии клеток диссоциантов с гомологичными антителами. Сделано предположение, что установленные различия могут быть связаны с наличием у R-формы бактерий целлюлозных фибрилл (или их глюкановых предшественников), исчезающих у S-формы в связи с элиминацией плазмиды 115МДа.

7. Показано, что в полях инфранизкой частоты динамическая модуляция прозрачности суспензий обусловлена малыми колебаниями клеток относительно направления преимущественной ориентации. Фаза и амплитуда динамической модуляции зависят от электроповерхностных свойств клеток и физико-химических условий измерений.

8. Измерены спектральные и полевые зависимости ориентационных оптических эффектов для нескольких бактериальных и дрожжевых суспензий и показано хорошее согласие с результатами теоретических расчетов. Экспериментально апробирована методика определения поверхностной поляризуемости клеток с учетом оптических факторов и показана возможная корреляция между харак-

теристиками динамического электрооптического эффекта и изоэлектрической точкой бактерий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Сирота А.И. Электрооптический эффект в низкочастотных полях и проблема дипольного момента бактериальных клеток // "Биофизика микробных популяций", Тез. Всесоюз. конф. Красноярск, 1987. -С. 155.

2. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г., Богатырев В.А., Сирота А.И. Оптические эффекты в ориентированных биологических дисперсных системах H Там же, -С. 156.

3. Позднякова Л.И., Каневская C.B., Леванова Г.Ф., Барышева H.H., Пилипенко Т.Ю., Богатырев В.А., Федорова Л.С. Таксономическое изучение азоспирилл, выделенных из злаков Саратовской области // Микробиология. -1988. -Т.27. -С.275-278.

4. Sokolov O.I., Bogatyrev V.A., Khlebtsov N.G. Spectroturbidimetric studies of myosin solution // "Molecular Organization of Biological Structures", Abs. Book II, June 19-24,1989, Moskow. -P. 193.

5. Хлебцов Н.Г., Богатырев B.A., Мельников А.Г., Сирота А.И. Оптические эффекты в ориентированных дисперсных системах. Экспериментальное исследование электрического дихроизма в биологических дисперсиях // Оптика и спектроскопия. - 1990. -Т.68. - С.238. Анн. деп. статьи, Деп. ВИНИТИ,1989.

6. Bogatyrev V.A., Ivanova L.Yu„ Schwartsburd B.I., Khlebtsov N.G. Use of colloidal gold in immunodot technique // 19th FEBS Meeting, Rome, July 2-7, 1989.

7. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г., Богатырев B.A., Сирота А.И. Дихроизм ориентированных дисперсий в приближении физической оптики // Журнал прикладной спектроскопии. - 1989. -Т.51. -С.99-105.

8. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Мельников А.Г., Сирота А.И. Оптические эффекты в ориентированных дисперсных системах. 3. Экспериментальное исследование электрического дихроизма в биологических дисперсиях // Оптика и спектроскопия. -1990. -Т.68. - С.238. Анн. деп. статьи, Деп. ВИНИТИ, 1989.

9. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Мельников А.Г., Сирота А.И. О дипольном моменте бактериальных клеток // Биофизика. - 1990. - Т.35. - С. 173. Анн. деп. статьи, Деп. ВИНИТИ, 1989.

10. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Мельников А.Г., Сирота А.И. Дихроизм бактериальных суспензий в электрическом поле // Журнал прикладной спектроскопии. - 1990. - Т.52. - С.978-983.

11. Karpunina L.V., Trikhacheva U.Yu., Nikitina V.E., Bogatyrev V.A. Investigation of interaction of Bacillus polimyxa lectins with wheat root fraction // Book of abstr. 12 Int. Lectin Conf., USA, Calif, 9-14 Sept., 1990. - P.66.

12. Italianskaya J.V., Nikitina V.E., Ponomariova E.G., Bogatyrev V.A. Azospirillum lectins in the integration of bacteria-plants interaction II Lectin: Biol., Boichem. and Clin. Biochem. V.8. Sigma Chem. Comp. S.-Luis 1990.

13. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г., Богатырев B.A., Боровский Д.А., Сирота А.И. Стационарные и переходные оптические эффекты в ориентированных дисперсных системах //1 Всесоюзная конференция 'Теория и практика элеюрооп-тических исследований коллоидных систем", 1-4 окт., 1990, Велигож. Тез. докл. Оболенск, 1990. - С.8.

14. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г., Богатырев В.А., Боровский Д.А. Оптические эффекты в дисперсных системах, индуцированные внешним полем: Светорассеяние, линейный дихроизм, двойное лучепреломление // "Оптика моря и атмосферы",4.1/ под ред. Сидько Ф.Я. -Красноярск, ин-т физики СО АН СССР, Красноярск, 1990. - С. 168.

15. Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Pozdnyakova L.I., Schwartsburd B.I. Relative surface hydrophobicity of N2-fixing bacteria of the Azospirillum genus // 5 Int. Symp. N2-fixation with non-legumes, Sept. 10-14, 1990. Florense, Italy, abstr. B-16. -P.106.

16. Bogatyrev V.A., Matora L.Yu., Dykman L.A., Katzy E.I., Schwartsburd B.I. Effect of plasmid content on ceil-surface antigens of Azospirillum brasilense Sp 245 // Ibid., abstr. B-7. - P.97.

17. Khlebtsov N.G., Melnikov A.G., Bogatyrev V.A., Sirota A.I. The orientational optic effects in colloidal systems approximate and exact approaches II Abs. of VI International Symposium "Colloid and Molecular Electrooptics", Sept. 19-26, ¡991, Varna, Bulgaria. - P. 12-13.

18. Богатырез В А., Дыкман Л.А., Мгтора Л Ю.. Шварцбурд Б.И. Твердофазный иммуноанализ с использованием коллоидного золота « о.еротшшрсвапп;т азоспирилл // Микробиология. -1991. - Т.60. - С.524-529.

19. Khlebtsov N.G., Melnikov A.G., Bogatyrev V.A. The linear dichroism and birefringence of colloidal dispersions: approximate and exact approaches // Journal of Colloid and Interface Sci. -1991. - V. 146. - P.463-478.

20. Petrov R.V., Schwartsburd B.I., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Shchogolev S.Yu., Sidorovich I.L., Nikolaeva I.A., Pavlikov S.P., Shevalier A.F., Mikhailov M.V., Khaitov R.M., Ignatov V.V. Solid-fase immunoassay with colloidal gold conjugates for diagnosis of HIV-infection // 15-th Int. Congr. of Biochem., Yerusalem, Israel, Aug. 4-8, 1991.

21. Khlebtsov N.G., Melnikov A.G., Bogatyrev V.A., Sirota A.I. The orientational optic effects in colloidal systems: approximate and exact approaches // "Colloid and Molecular Electro-Optics", ЮР Publishing, Bristol, 1992. - P. 13-20.

22. Bogatyrev V.A., Matveev V.Yu., Dykman L.A., Matora L.Yu., Schwartsburd B.I. Changes of physico-chemical properties of Azospirillum brasilense Sp 7 cell surface in consequense of R-S dissotiation // 8th Eastern Europe Symp. on Biological N2-fixation, Saratov, Russia, Sept. 22- 26, 1992, abstr. P48. - P.75.

23. Bogatyrev VA., Dykman L.A. The methodology development and practice of colloidal gold conjugates application to studying of biospecific interactions // Ibid., abstr. P47. -P. 74.

24. Schwartsburd B.I., Matora L.Yu., Bogatyrev VA., Dykman L.A., Shchyogolev S.Yu. Structure of the cell surface carbohydrate determinants and its dependence on the plasmid content in bacteria of the genus Azospirillum II Ibid., abstr. L32. - P. 43.

25. Матвеев В.Ю., Богатырев B.A., Дыкман Л.А., Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И. Физико-химические свойства клеточной поверхности R- и S-вариантов штамма A zospirillum brasilense II Микробиология. - 1992. - Т.61. - С.645-651.

26. Bogatyrev VA., Dykman L.A., Matora L.Yu., Schwartsburd B.I. The serotypingof Azospirillum Spp by cell gold immunoblotting II FEMS Microbiol. Lett. - 1992. -V.96.-P.115-118.

27. Khlebtsov N.G., Melnikov A.G., Bogatyrev V.A., Sirota A.I. The orientational optic effects in colloidal systems: approximate and exact approaches // In: Colloid and Molecular Electro-Optics, Bristol: IOP Publishing, 1992.'- P.I3-20.

28. Shchyogotev S.Yu., Khlebtsov N.G., Bunin V.D., Sirota A.I., Bogatyrev V.A. Ir verse problems of spectroturbidimetry of biological disperse systems with randoi and ordered orientation // Ibid., - P.58.

29. Khlebtsov N.G., Melnikov A.G., Shchyogolev S.Yu., Bogatyrev V.A., Sirota A. Anisotropic and spectral properties of biological scattering objects with the ordere particle orientation // In: Quantification and Localisation using Diffused Photon i a Highly Scattering Media / Ed. B.Chance, Bellingham: Proc. SPIE, - 1994. V.2082. - P.33-42.

30. Shchyogolev S.Yu., Khlebtsov N.G., Bunin V.D., Sirota A.I., Bogatyrev V.A. Ir verse problems of spectroturbidimetry of biological disperse systems with randor and ordered orientation // Ibid., - P. 167-176.

31. Dykman L., Bogatyrev V., Shchyogolev S., Ignatov V. Estimation of cell surfac hydrophobicity of soil bacteria using cation probes labelled with colloidal gold , The First Eur. Nitrogen Fixation Conf., Szeged, Hungary, Aug. 28 - Sept. 2, 1994. P.93.

32. Khlebtsov N.G., Shchyogolev S.Yu., Bogatyrev V.A., Sirota A.I., Bunin V.E Combination of the spectroturbidimetric and electrooptic methods for multipurpos analysis of cells // Ibid., - P.327

33. Solovova G., Veliko'v V., Bogatyrev V., Dykman L., Shelud'ko A., Chumakov M The evidence , involving of surface polysaccharides of Agrobacterium radiobacte 5D-1 in attachment process to wheat roots // The First Int. Conf. on Polysaccharid Engineering. Trondheim, Norway, June 6-8, 1994, Book of abstr. - P.8.

34. Solovova G., Matora L., Dykman L., Bogatyrev V., Shchyogolev S., Chumakov M Short-term localization and attachment of bacteria of the family Rhizobiaceae am of the genus Azospirillum to plant roots // NATO Adv. Res. Workshop on Azospirit lum and Related Microorganisms. Sarvar, Hungary, Sept. 4-6, 1994, Book of absti РИ-5.

35. Хлебцов Н.Г., Богатырев B.A., Дыкман Л.А., Мельников А.Г. Оптически свойства коллоидного золота и его конъюгатов с биоспецифическими макрс молекулами // Коллоидный журнал -1995. -Т.57. - С.412-423.

36. Карпунина Л.В., Вишневецкая О.А., Богатырев В.А., Никитина В.Е., И таль янская Ю.В. Определение локализации лектинов, агглютининов почвенны азотфиксирующих бактерий// Микробиология. - 1995. - Т.64. - С.453-457.

37. Dykman L.A., Matora L.Yu., Bogatyrev V.A. Use of colloidal gold for obtainm antibiotin antibodies // J. Microbiol. Meth. - 1995 (in press).

38. Хлебцов Н.Г., Богатырев B.A., Дыкман Л.А., Мельников А.Г. Спектральны свойства коллоидного золота // Опт. и спектр. - 1995 (в печати).

I. Патент РФ N 2013374, МКИ С 01 G 7/00, В 01 J 13/00. Способ получения бис специфических маркеров-конъюгатов коллоидного золота / Богатырев В.А Дыкман Л.А., Щеголев С.Ю. (Россия). - 6 с.

Подписано к печати 4.10.95. Объем 1 п.п. Тираж 100. Заказ № 3. Отпечатано в ИБФРМ РАН Саратов, пр. Энтузиастов 13.