Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика ДНК в зоне ЭУ-гетерохроматинового перехода при эффекте положения у дрозофилы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Характеристика ДНК в зоне ЭУ-гетерохроматинового перехода при эффекте положения у дрозофилы"

на правах рукописи УДК 575.1:595,773.4

ИАКУНИН ИГОРЬ ВАСИЛЬЕВИЧ

ХАРАКТЕРИСТИКА ДНК В ЗОНЕ ЗУ-ГЕТЕРОХРОМАТИНОВОГО ПЕРЕХОДА ПРИ ЭФФЕКТЕ ПОЛОЖЕНИЯ У ДРОЗОФИЛЫ

Генетика - оз.оо.15

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1995

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Научный руководитель - доктор биологических наук

И.Ф.Кимулев

Институт цитологии и генетики со РАН, г.Новосибирск

Официальные оппоненты:-доктор биологических наук

Л.В.Высоцкая

Новосибирский государственный университет, г.Новосибирск

Кандидат биологических наук Л'.В.Омельянчук

Институт цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск Ведущее учереждение: - Институт биологии развития

им. Н.К.Кольцова РАН, г.Москва

Защита диссертации состоится "2.0'.¿¿ч!1996г. на цлСк.г/И-^-'* заседании диссертационного совета Д-002.11.01 по Защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан " С " 1995

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

А.Д.Груздев

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В геноме ^укариотических организмов выделяют два типа организации хроматина: зухроматин, в котором расположена.. основная часть генов, и гетерсхроштин, который представлен б виде компактных сильно окрашивающихся блоков на протяжении всего клеточного цикла. Гетерохроматин составляет значительную часть генома эукариот и, хотя и отличается относительной генетической инертностью, выполняет важные функции в клетке. Детальный анализ организации гетерохроматина осложнен присутствием большого количества различных повторов. Одним из возможных путей изучения строения определенных гетерохроматиновых районов является анализ перестроек с участие:» гетерохроматина и "/хроматина, для которых выполняются следующие условия: 1) место разрыва в эухроматине клонировано и 2) место разрыва в гетерохроматине картировано на уровне метафазных хромосом. Используя плодовую мушку ОговорЫ1а твТаподазЪвг в качестве объекта наших исследований, мы изучали молекулярную структуру гетерохроматина, прилежащего к месту разрыва перестроек, в которых проявлялся эффект положения мозаичного типа (ЭП). Данный Феномен заключается в мозаичной инактивации эухроматиновых генов, перенесенных к гетерохроматину.

Ранее была описана перестройка Т( 1 ;2)с/огу"г7, в которой дистальный конец Х-хромосомы присоединился к прицентромерному гетерохооматину 2-ой хромосомы, что привело к ЭП по генам, расположенным в 1А-2В Фрагменте (ггнтиТеу вЪ а!., 1986). Точка разрыва Т( 1;2)с/ог*аг 7 в эухроматине была клонирована (Рго1.оро-роу ег а!, 1991), что позволяло изучить прицентромерный гетерохроматин, присоединенный в результате перестройки к известной эухроматиновой последовательности. Наличие линий ревертан-тов, полученных из линии т( 1 ;2)с1оггвг7, в которых проявление ЭП было ослаблено, давало возможность оценить инактивирующую роль гетерохроматиновых последовательностей, прилежащих к разрыву.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью данной работы является характеристика последовательностей ДНК в зоне эу-гетерохромати-нового перехода в хромосомах с перестройками, проявляющими эффект положения мозаичного типа, а также изучение роли ближайшего гетерохроматинового соседа при ЭП. В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи: 1. проанализировать молекулярную структуру гетерохроматина, присоединенного к району 2В в транслокации т(1;2)дог"лг7;

2. проклонировать зону эу-гетерохроматинового соединения между 1А-2В фрагментом Х-хромосомы и гетерохроматином правого плеча 2-оЯ хромосомы в транолокации Т(1;2)dor"*r7;

3. определить нуклеотидные последовательности из зоны эу-гетерохроматинового соединения, а также провести их анализ;

4. провести сравнительный анализ гетерохроматиновых последовательностей в линиях ревертантов, полученных из линии Т( 1;2)dory*r7, в которых эффект положения был ослаблен или вообще отсутствовал, а также оценить роль прилежащих гетерохроматиновых последовательностей в индукции инактивации генов. НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Выделена, определена и локализована на цитологической карте последовательность нового простого сателлита D, melanogaster, специфичного для правого плеча 2-оя хромосомы. Проведен анализ строения гетерохроматина, прилежащего к месту разрыва T(1;2)dorvtr1 и показано, что разрыв произошел в кластере сатДНК, который ограничен более сложными последовательностями. Определена последовательность, имеющая 90% гомологии с ретротранспозоном stalker. Показано, что последовательности сателлитной ДНК, прилежащей к месту разрыва, являются, вероятно, проводниками эффекта положения, но не способны индуцировать его самостоятельно.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Предложен новый подход к изучению последовательностей из конкретных гетерохроматиновых районов, что имеет существенное значение для дальнейшего детального изучения структуры гетерохроматина. Он заключается в сравнительном анализе гетерохроматина, присоединенного к определенному эухроматиновому району в различных линиях, что позволяет одновременно изучать структуру и функцию отдельных гетерохроматиновых районов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты этой работы докладывались на VIII Критской конференции по молекулярной генетике дрозофилы (Греция, 1992), 2-ой конференции "Гетерохроматин у дрозофилы" (Гонолулу, США, 1995). ПУБЛИКАЦИИ. Приведенные в диссертации результаты опубликованы в пяти научных статьях. Основные результаты получены автором самостоятельно. Гибридизация in situ проводилась совместно с Г.В. Похолковой, определение нуклеотиднях последовательностей - совместно с Н.Г. Холодиловым, модель компактизации при ЭП разработывалась совместно с М.Л. Баласовым.

Автор искренне благодарен М.Л.Баласову, Г.В. Похолковой,

H.Г.Холодилову за помощь в работе и обсуждение результатов. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора-литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 162 ссылки. Работа изложена на т31 странице машинописного текста, содержит 14 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ЛИНИИ МУХ. Использованные линии мух описаны в статье Pokhol-kova et al., (1993) и справочнике (Lindsley, Zimm, 1992). КЛОНЫ ДНК. Клон 1501, перекрывавший место разрыва Т(1 ;2)dory*г7 в районе 2В (Protopopov et al., 1991), а также его Фрагменты, клонированные в pTZieR, любезно предоставлены И.В.Третьяковой.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ. Выделение, рестрикцию, клонирование, печение, гибридизацию ДНК, создание и скрининг библиотеки выполняли в основном по методикам, изложенным в книгах Маниатис и др. (1984); Мазин и др. (1990). Гибридизацию in situ на поли-теиных и метаФазных хромосомах проводили, как описано в статье Pokholkova et al. (1993). Определение первичной нуклеотвдяой последовательности проводили по методу Сэнгера с изменениями в соответствии с инструкцией к набору НПО "Фермент". Последовательности клона pDm3.0 и 2,1 тпн Hindin Фрагмента депонированы в базе данных нуклеотидных последовательностей EMBL под номерами Х86075 и Х8600? соответственно. Поиск гомологии в базах данных (Protein Data Bank (April, 1994), GenBank (releas 85.0, October, 1994), EMBL (re 1eas.40.0, September 1994)) проводили с помощью программы BLAST (Altschul et al., 1990). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Характеристика эу-гетерохроматинового соединения в линии

Т(1 ;2)dorA,^rl .

Транслокзция т( 1 ; 2Idor'1 (далее var7) представляет собой сложную перестройку, затрагивающую последовательности ДНК 2-ой и X хромосом (рис.1а). В результате перестройки последовательности ДНК' из района 2В7-8 оказались присоединенными к гетерохроматину правого плеча 2-ой хромосомы. При этом для генов, расположенных в 1А-2В районе, проявлялся ЭП.

Мы постарались охарактеризовать гетерохроматин, непосредственно прилежащий к эухроматину в линии var7, для чего определили в нем расположение сайтов для рестриктаз EcoRi, Hindili, Psti и Sali методом Саузерн-блот гибридизации. По

-з-

I

I

I

нашим данным, на протяжении ближайших ю тпн по обе стороны от разрыва в гетерохроматине для всех использованных эндонуклеаз сайты рестрикции отсутствуют. Это указывает на то, что (а) разрыв, вероятно, произошел в кластере сатДНН, не содержащем сайтов рестрикции, и (б) сатДНК окружена более сложными последовательностями, в которых такие сайты присутствуют. Аналогичное строение имеет гетерохроматин в мини-хромосоме Dpi1в7, только протяженность кластеров сатДНК больше - около 50 тпн до ближайшего "острова" сложных последовательностей и 90 тпн - следующий блок (Karpen, Spradling, 1992).

Разрыв var7 был картирован в h4l-h42 районах 2Rh. Исходя из того, что известные последовательности сателлитов не были обнаружены в этих районах (рис.з), а также принимая во внимание тот факт, что очень мало известно о "сложных" последовательностях ДНК в прицентромерном гетерохроматине, мы решили клонировать зону эу-гетерохроматинового соединения в линии var7. Выявленные в гибридизации по Саузерну два EcoR1 Фрагмента размером около 20 тпн позволяли использовать для этой цели вектор EMBL4.

2. Создание и скрининг библиотеки

Мы приготовили библиотеку из ДНК самцов линии var7 и провели скрининг, используя в качестве зонда Sal 1 Фрагмент размером 8,0 тпн (рис.16). В результате мы выделили несколько клонов, один из которых, Dm21/8, содержал все фрагменты дисталь-нее разрыва до сайта EcoRl, а также дополнительный HindiII Фрагмент размером 3,0 тпн (рис.1д). Длина вставки составила около 12 тпн, что на 8 тпн меньше ожидаемого. Мы предположили, что укорочение вставки произошло в результате делеции сател-литной ДНК (см. ниже данные секвенирования), последовательности которой нестабильны при клонировании (Lohe, Brutlag, 1986, Abad et al-, 1992). Hindin Фрагмент размером 3,0 тпн из клона Dm21/8 гибридизовался с 2,1 тпн Фрагментом из точки разрыва. Следовательно, клон Dm21/8 содержит ДНК из зоны соединения Фрагмента 1А-2В Х-хромосомы с последовательностью из районов h41-h42 2Rh. Мы клонировали 3,0 тпн фрагмент в плаэмиде рис19 (в дальнейшем клон pDm3.0).

3. Характеристика клона рОтЗ.О

Результаты определения копийности методом дот-гибридизации (Kafatos et al., 1979) показали, что рОтЗ.О содержит мно-

2Rh 2Lh

2Rh

^тшш a

358-4SR e—2ß 7R-68C-------45Я-3®------21Я

-IIVÜ501

Ft HS S P P H H _HP S H

' \»w,d-' ' "-rl-L-

-Г-УГ7РТ7Г.

330

—I—

320

310

2Rh

8.0 тпн Sail

2,1 тпн HindiII

RP

HP S H _u_I_L-

2В-7Я

г 1Й-2В

HS S P P H H

—U_I_L-l—l_L_

5-LTR HRStalk«r p

2fih

HS S

H H _l_1_

HR

dl Dn2i/8

1.9 1,2

рЗкЭ.В

R

8

R

Рис.1. Схема перестройки T(1;2)dorv*r7.

a - схема 2-ой хромосомы. Сверху обозначен гётерохсюматин правого (2Rh) и левого (2Lh) плеч, снизу - места разрывов в эухроматине и-теломерные районы, б - молекулярная карта места разрыва в районе 2В7-8. Цифры - расстояние в тпн; сайты рест-риктаз R - EcoR1, Н - Hindlll, S - Sail, Р - Pst1 (сайты Pst1

- только для 8,0 тпн sail Фрагмента); треугольник - место разрыва; 1,7 тпн Sail Фрагмент, в котором расположен неизвестный повтор, заштрихован. Над картой показано положение клона DmlSOi, снизу - положение 8,0 тпн San и 2,1 тпн Hindlll Фрагментов. в - зона соединения блока 2Rh, отошедшего от центро-мерного района, и районов 2В-7А. г - зона соединения 1А-2В с 2Rh. Тонкая линия соответствует эухроматину, толстая - сатДНК из гетерохроматина, двойная - ретротранспозону Stalker-, 5-LTR

- длинный концевой повтор, д - карта клона Dm2i/8; ломаная линия соответствует ДНК, делетировавшейся при клонировании; ниже обозначен 3,0 тпн Hindlll фрагмент (клон pDm3.0), в нем показано положение сайта sial.

гократно повторенные последовательности. Мы определили общее количество повторов, гомологичных pDm3.0 в гаплоидном геноме D. meJanogaster в пределах 550-1600 тпн (в среднем около 1000 тпн). Результаты определения копийности для различных фрагментов клона pDm3.0 показали его неоднородность. Копийность -1,9 тпн HindIIl/Sla1 Фрагмента (рис 1д) практически не отличается от представленности pDm3.0 в геноме, тогда как 1,2 тпн Sla1/ H indiII Фрагмент представлен в геноме примерно 30 копиями.

Результаты Саузерн-гибридизацйи также подтвердили неоднородность рОтЗ.0. При использовании в качестве зонда 1,9 тпн HlndIII/Slal Фрагмента выявляется Фрагменты большого молекулярного веса даже при использовании рестриктазы Msp1, которая "узнает" всего четыре нуклеотида. При Саузерн-гибридизации с 1,2 тпн siai/HindiII Фрагментом Фрагменты большого молекулярного веса (свыше 20 тпн) практически отсутствовали. На фильтре виден набор полос различной интенсивности и размеров на дорожках с геномной ДНК, гидролизованной EcoRi, HindIII и Pst1, а при использовании Mspl виден интенсивный сигнал, соответствующий фрагменту размером 1,9 тпн. Следовательно, 1,2 тпн sial/ HindIII Фрагмент клона pDm3.0 входит в состав Mspl повтора размером 1,9 тпн, диспергированно расположенному в геноме. Вероятно, этот Фрагмент содержит край мобильного элемента. 4. Характеристика последовательности ДНК клона pDm3.0

Мы определили первичную последовательность Фрагмента 2,1 тпн и клона pDтЗ.О. В результате сравнения этих двух последовательностей были установлены место разрыва в эухроматине и последовательность из гетерохроматина, присоединенная к Фрагменту 1А-2В X-хромосомы в результате перестройки.

Клон pDm3.0 содержит 3057 нуклеотидов : 1210 из 2,1 тнп Фрагмента из района 2В, 39 копий последовательности TTGTG и 1652 нуклеотида среднеповторенной последовательности. Последовательность TTGTG является новым представителем простых сателлитов D.melanogaster, отличаясь от известных ранее последовательностей всего лишь на один нуклеотид (Lohe, Brütlag, 1986). В дальнейшем мы будем употреблять более традиционную комплементарную форму записи ААСАС. Наличие тандемных повторов в клоне позволило объяснить результаты определения копийности и Саузерн-блот гибридизации присутствием в геноме большого числа ААСАС повторов, организованных в протяженные кластеры. Мы полагаем, что результаты определения копийности клона pDm3.0 в

основном отражают количество аасас сателлита в геноме. Однако эга оценка может быть завышенной, так как 1) рОтЗ.О имеет Фо-новут>'гибг^г!г1заци» с "днк äagac сателлита (клон предоставлен а. Lohe); Z) в состав зонда входит среянеповторенная последовательность, а в эухроматиновой части присутствуют короткие повтори (см. пункт 6).

Поиск по базам данных для среднеповторенной части выявил несколько родственных последовательностей (рис.2). Часть последовательности рОтЗ.О, прилежащая к сатДНК, гомологична длинным концевым повторам ретротранспозона Stalker (Georgiev et al.. 1990), Клок содержат C-i.TR а последовательность,

нрилетащую к нему■ После выравнивания гомология между последовательностями составила 97,90%. Основное число замен расположено ближе к 3' концу LTR. Сравнение последовательности из 5' зоны Stalker (представлена Д.В.Герасимовым, Т.И.Герасимовой, V.G.Coreos) с pDm3.0 выявило значительную гомологию - около 90Я> - между ними на всем протяжении (рис.2). Итак, в клонированном нами фрагменте ДНК из района разрыва T(1 ;2)dorv*rf в 2Rh последовательность ААСАС сатДНК соединена с ретротранспо-зоком Stalker.

Мы нашли также' гомологию с тремя последовательностями сайтов-мишеней (STS) космид, определенными в результате реализации Европейского проекта по картированию уосмид (Kaduer.o et al,, 1995) (рис.2). DM29G4T гомологичен LTR (98,30«), Dm25B2S - внутренней части stalker (94-,18%). Вероятно, концевые последовательности stalker более консервативны, чем лежащие в середине. Оба клона локализованы в beta-гвтерохроматике и повторены примерно 70 и 30 раз. DM25B2S содержит короткие (до 25 нуклеотидов) участки, гомологичные LTR, Имеется так яе гомология между последовательностями stalkerи mdg1 (не показано).

Последовательность staIker была определена для активной копии, выделенной из локуса yellow (Georgiev et al., 1990). Сравнение этих двух последовательностей выявило многочисленные замены, особенно в средней части, где расположены два участка (2265-2310) и (2617-2813), различающихся коренным образом (рис.2). Отметим, что STS Dm25B2S более близка нашей последовательности. Возможно, что для staIker существуют гетерохрома-тинсяецифические варианты, как и для mdg1 (Nurminsky, 1993).

1111 Uli 11(1

i етшшкксшммда^ммшмтдотш

1201 > 1(11 (—

i mTccccicttitjtt|t|ttjHtt]tjUjts (ttjtiiio и^цицаддщцтшишиишитсспАИААНС

г ...............■..................

J .A.AGG1CAGA...G...............................R..

4 CAAAAAAAITITÍCCTTICTAAACACAAIATIAATATIGAGAACTCAATGACTACATATATTACGICAAT.CMAAAAAGG.A.G..................................

1441 1411 1521

1 AAIAGAïGATTGGGTAlAACATAGCGTCGATAGAÏïGTGACACHTGICAIAATAMTATAAAlATACAAATAIAtAAAAAGACCACCAAAAACTACGIAASCACTCCAGCGCCCCAGIA

I ............................A...........................................................................................

1 ............................A...........................................................................................

« ............................A.....................................................C.

Ш1 Ifîl 1»!

1 AlAGGAIClAACGCIIAIACAlAAGCCGAICGCGGAGCGIGGGAAIGCIGAGCAIGCACnTGCAGCICAAGIGGICAAIGCGnciGCAlACAIAIGIAIAieUlAAAIGIAAGIAAG

г ...........................................................................................g............................

1 ...........................................................................................G............................

5 .................A.......Il.....GCTACA.ATA,..T..GCH.GCC...............CT.

If!! IUI Hfl

I AATACATAGATATAAGCAAiGTATGÎGCGGGnAGCTGAACCCAACTTCAGCACACTTTGATCATICGAAIAAACAGAÏICAAACAGAGCAGAGGÎTCIGAACICGGAAACGAUÎCTAI

г ..............................-...........................................G..........................G........5.........

3 ..............................-...........................................G..........................С........G.........

S t......Tï........S..A.........................A.........A...CG.....A...I..G.AIC....TT........A.C...1C1...CI1IIAA.ÏÏAAC.A

1101 —) —> 1141 SU I IUI

1 lACATCIATACCTGTTACAnTTTAAAACAATIACAT-GGCGACCGTGACTCGGTctC-lljICTGKICIIIGIIGI&rGIGÍCCGrGrAIGIGCGAGGGÍCrnAAACGGrGCIAACr

2 ------------------------------------1....................A.............................................................

5 CIA..I.C.1WIAC..IAACAAII.11.CAG.T.AIT..Al.GAAAH.AIT..AGI. 11A1G.AACAÎCA.CGC.C.CGC.A..CCC 1)21 1361 2011

f trGCieCAAGCGirGriCGCeCrG-CCrîCrGCAIHICfAArAAAArGtSnreAJTAAAACAAGAMACierCCACeAAACCAGAIIGIGIGGCAIGCCACGIGIAGCAACrGAIGAC

2 ........................С...............................G......................................................G........

2141 2011 2121

1 CAGACAGCAAAACGATCAGCAAGCACCAAACGCACAAAAACACACAGACACAAGCGGCAAlTuArGGCAGACGAGCCACAAUGACCGAGGCGCAACCCGAGGrACAGAGGGACCAGCCA

! ........................................................................................................................

2161 2201 Kspl 2241

1 ACGTIGGGAGAAGCACIGGAAIIAAACCCeCCCGAIGGACCGC-lICCCACKACAAIAGCIGAGIA-CCJjGCACGICAGGAGAAGCGCCAACCCAGGAAACAIA-AACeClCIGGACGI

2 ..........................-................GT.....................A.........................1.....1......C..ATG.....CA..

22! I 2)21 2161

1 AGAGTGAAATTACTACAACAACGCCGACTGGTCAAGGCAATGACCCAGÏÏGGCCAAGGAGGAATCATCCCGACAACGC1ACAAAGAGCG1CTTGAGGACATCGAMGCAAGATTTCGCAA

! T...ATGT.AACÍAG..IA1.ATAGCG..A.......A..................................................................................

2401 2441 2411

1 GGTGCGAAACAACGCAAACGGGCIGCAlAAAIAAAIGCCAAIGCCCCAATTICCCITAAmiAATïïCIAAACCCAAGCCGAiGCGG-GAAACCGCIGCUGAAAAACACTAAIAtCIG

2 ......................................................1...G............CC..A.G..........С.......-......G....IC....A.....

2521 2561 2601

1 TIAGGC-inTlACTAACAAIGCGGlTGGACAATTninnAT-AnGTAAACAAATATGTGAGCCAACCACATîUTlAACAACTAAlATTTCCACGÎCTCCGCTACIGAGIATAÎAT

2 ......Ï....C..........1.......S.............I.........G.C..................A.......C.l..........CÀA.GAAAAAAG1..ÏÏAI.T.GA

2641 2611 2121

1 ATICAGCTGCAAAAAnTTTiTTAAÏGACAGATAIAACAAlîCTIAICIÏCATTAAAGCTAAACAÎinTIH-AITnTGATITTCTAGAAGAAIAAATTAATAICAUAiAAIGAGAA

2 C.MlATAAA.G...A.A..AA.nAriirraArmCAA5AAGAAAAr...ïïKr.CCinAAGC.CCAA..ASAAI..C..A.IJmiran..n-----------------

6 ...........A....CG..............1...........................................A..

2161 2101 2141

1 AAAACICAIAAATAGAAAAAAAAAA-CGTTICATlGAAAATAAACAGAUftAAAAÍGGGATGGTlTAGCGATTCTAGTGAGGCAAAGGACAAÍACrGCCAACGrAGrrAArAACGrAAAA

2 -------------------...G.1C............T...G.T..........................................--...............-...............

f ..--...С......A..........A....................A..Í..I...I............................С...........

2111 2921 2161

1 AITATAGATCACACAGACGATATAAATGCGITGIGGAICTTATTGCTGATCATTACAATAGIACTACTTCIACAATTTCTGCIIACAAIHAIGITAAGCATAACAAGATCAÎCAAAAGA

2 ........................................................................................................................

1001 1041 1011

1 CGÎTATAÎAAAIAGGGCAAATCG111AGACCAGATTTAAAAAAAA—TAATATKGATTAHAAGAAAGCIT

2 ........•.....................................AAA......G.....G........A.AATAAAAACFrmmrrACGACAAGAAiGGAArCGAGCGAAArAGCG

Рис.2. Анализ последовательности клона pDm3.0.

Сравнение последовательности рогпз.о (1) с последовательностью------ --------

- Сталкера 'Г) , i.TR Sta lker (EMBL Х78Э21 ) (3), STS Z32050/ DM23G4T (4), Z32008/DM25B2S (5), Z3183S/DM138H3S (6). ТОЧКИ -одинаковые нуклеотиды, делисн - делецли. N - любоа нуклеотид, R - А или G. Начало нумерации с первого нуклеотида в сайте Hindin в эухроматинэзой части рОтЗ.О. Строчными буквами выделены AC/GT повторы, GTGTT сателлит к сайты для рестрнктаз siai и Msd1. Звездочка в положении 1210 соответствует месту соединения последовательности из района 2В7-8 с сателлитом из 2Rh. Стр^.якя псяазгзаот ..олоüörine коротких ютертирозаята!? повторов , ^лалкпру^щих длинные концевые повторы ретротранспозона Stalker.

Некоторым противоречием значительному полиморфизму в первичной последовательности ДНК, в том числе и по длине, являются результаты Саузерн-гибридизации. Отсутствие полиморфизма длины внутреннего Mspl Фрагмента при использовании в Саузерн-гибридизации 1,2 тпн Slal/Hindlll фрагмента клона pDm3.0 можно объяснить яеоякз: вп-первнх, основное количество инсерций (несовпадений по длине между двумя последовательностями Stalker) не попадает зо внутренний Mspl Срагчент (рис.2); во-вторых, нолсно предположить, что а геноме дрозофилы содержатся з основном последовательности одного типа. 3 пользу второго предположения свилетельстиует присутствие нескольких дополнительных .голос на дорожке с ДНН, гидролизевакной Mspl, с более слабыми гябоидизационными сигналами.

5. Локализация клопа pDm3.О методом in situ на нолитенных и метафазннх хромосомах

Локализация pDm3.0 на политенных хромосомах была проведена с использованием диких линий Batuni L и Oregon R. На каждой из них было обнаружено сильное мечение хромоцентра и ряда эу-хроматиновых районов. В линии Batumi L метились районы 6А, 17А, 19А на Х-хромосоме и 85D район на 3R хромосоме. В линии Oregon на Х-хромосоме был обнаружен один сайт - 6А, на 2L хромосоме - 32АЕ и 39Е, на 2R хромосоме - 54А и один сайт 87Е был найден на 3R хромосоме. Сильное мечение хромоцентра обуславливается как сатДНК, так и последовательностью хгобкльного элемента stalker, в то время как межлинейные различия в эухрома-тиновой части генома обеспечиваются, вероятно, только последо-

35 <56

. n ii' t ggc

21R

N NN NN

35 36 37 33 39 40 42Й 4gB43 46

-^иг^о-г-е^г^^ш ш mm

A ft CA С ш gTffvP3^ ca км ^вавезивя

ЙЙ«СЙС »» «ижкнне

AATAG ■

flATAACATAG Rsp «ACftC

ftftCAC шип t«tll«lllltftltltuutumiilliuu

Рис.3 Карта гетерохроматина 2-ой хромосомы (Lohe st al., 1993).

Сверху приведена схема 2-ой хромосомы, ниже - схема гетерохро-матина. Гетерохроматиновые районы пронумерованы; районы., имеющие Ы*-окраску, обозначены N. Черные прямоугольники соответствуют ярко Флюоресцирующим районам при обработке Ho©chst33258, заштрихованные пересекающимися линиями - среднему уровню свечения, косыми линиями - очень слабой Флюоресценции, незакрашенные области соответствуют нефлюоресцирующим. районам. Снизу толстыми линиями показана локализация последовательностей сатДНК. Черные квадраты указывают на присутствие ААСАС сателлита в районах h41-h42, где картирована точка разрыва T(1;2)dorvtr7, тонкие вертикальные линии отражают результаты локализации клона pDm3.0 при гибридизации in situ на метафазных хромосомах линий var7, rev4S, ге\'110.

вательностью stalker. Небольшое количество сайтов в эухромати-новых районах диких линий Batumi L и Oregon R согласуется с литературными данными (Georgiev et al., 1990).

В гибридизации in situ клона pDm3.0 на метафазные хромосомы линий var7, rev45, revUO (схема хромосом линий приведена на рис. 4) было показано, что он специфически локализуется в гетерохроматине правого плеча 2-ой хромосомы в районах h40-h46 (рис.3). Мы полагаем, что результаты гибридизации pDm3.0 на метафазных хромосомах отражают локализацию ААСАС сателлита. 6. Характеристика последовательности ДНК из района разрыва Т(1;2)dorvtr7 в районе 2В

Длина последовательности 2,1 тпн фрагмента составила 2020 пн. Содержание AT пар составило 49, зхпричем распределение

-Ю-

at/gc пар относительно равномерное по всей длчяе Фрагмента. Поиск сэ jiaoaH данных_нуклеиновых кислот не вня»!«л- пос ледова-тельноетея, родственных 2,1 тан фрагменту, за исключением со-держада: ac/gt повторы. 3 2,1 тпя зрагкенге присутствуют два таких порторз. Изеостно, что последовательности АС-повтора часто кластеризованы в геноме дрозофилы, присутствуя а расположенных рядом рестрикционных фрагментах (В^яаяядзв п др., lS83a>. Разрнз т( 1)dorv*" * з районе 2D произошел лезду этими повторами ип расстоянии so к ¡53 пи соответственно. Известно, что последовательности AC/GT минисателдита, равно как и пругт»«» iiyüiiH/iiMpHMHnifBonH» гогтгг", ;о;»оизо.<«грД!Зой И, кото-

рая, как известно, способна индуцировать образованно хромосомных перестроек (spitzner et al., 1990).

На расстоянии примерно 660 пн от точки разрыва присутствует вырояденныя повтор (CTGTT)io. Эта последовательность лишь на один нуклеотид отличается от последовательности GTGTT сателлита из 2Rh,-K которому в результате перестройки присоединился 1А-2В фрагмент Х-хромосомы. Известны случаи, когда недалеко от точек разрыва перестроек с участием готсрохроматкна и зухроматина присутствуют последовательности сатДКК (Tartof et a'l . , 1984}.

Клон Dmll, выделенный при скрининге мини-библиотеки, в мягких условиях гибридиэовалск с 2,1 тлн фрагментом нз точкя разрыва, а также с 1,7 тпи Sali фрагментом, расположенным дистальней (рис.1). При отмывке Фильтров после гибридизации при 60° сигналы не выявлялись. Между собой эти Фрагменты нэ гибридизовались. Мы предполагаем, что они содержат различные короткие повторы. Таким образом, точку разрыва var7 окружают различило повторы, хотя непосредственно в рекомбинацию они не вовлечены.

7. Характеристика гетерохроматинз в линиях ревертаятов

Очень мало известно о той роли, которую играют гетерохроматиновые последовательности, непосредственно прилежащие к эухроматиновым районам, в возникновении ЗП. До недавнего времени была детально изучена лишь перестройка у4, из которой были получены ревертанты по ЗП. Однако полученные результаты были противоречивы. По данным Tartof с соавторами (1984), ЭП в линиях ревертантов не проявлялся при сохранении как минимум 3 тпн ДНК из гетерохроматина, а по расчетам Reuter с соавторами (1985) для индукции ЭП достаточно присутствия 5

тпн ДНК из гетерохроматина. Отметим, что в этой перестройке эухроматин присоединился к среднеповторенной ДНК (Tartof et al., 1984).

В лаборатории после облучения самцов линии var7 было выделено 9 линий, в которых ЭП для генов, расположенных в 1А-2В Фрагменте, не наблюдался или был ослаблен, т.е. произошла реверсия к норме. Это позволило нам оценить роль прилежащих гетерохроматиновых последовательностей в возникновении ЭП. По результатам генетического анализа в линиях rev27, rev226, rev4S, revi 10 ЭП для генов dor и BR-С не проявлялся даже при действии усилителей ЭП (развитие при 14° или при 16°, уменьшение гетерохроматина в геноме, использование генетических эн-хансеров), а в линиях rev3, rev40, rev60, rev167, rev175 ЭП для генов dor и BR-C наблюдался только при низкой температуре, уменьшении количества гетерохроматина и под влиянием E-var(3) 201. В линии rev4S ЭП не проявлялся для генов, расположенных в 1А-2В фрагменте, но в ней наблюдалась компактизация в районе 2В-7А, причем компактизация доходила до района 50. В этой линии проявление ЭП было реципрокным по отношению к исходной линии var7.

По результатам цитологического картирования линии rev3, rev27, rev40, rev60, rev167, revl75, rev226 представляют собой свободные дупликации, причем в линиях rev27, rev226 1А-2В Фрагмент Х-хромосомы совместно с прилежащим 2R гетерохромати-ном присоединился к 19А-20 району, в линии reveo соединение произошло к району 20АЗ-20ВС, а в линиях rev3, rev40, rev167, revi 75 — к гетерохроматину Х-хромосомы. В линиях rev4S, revi 10 возникли дополнительные инверсии в гетерохроматине. Результаты цитологического картирования ревертантов суммированы на рис.4. Тем не менее, было не ясно, какое количество 2Rh осталось соединенным с 1А-2В фрагментом в этих линиях. Сравнение данных по ЭП в линиях var7 и rev4S с результатами цитологического картирования перестроек в этих линиях позволило нам предположить, что гетерохроматиновый центр инициации компактизации, находившийся в линии var7 вблизи 1А-2В фрагмента, в результате дополнительных инверсий переместился к 2В-7А Фрагменту, что и привело к ЭП в этом районе. Однако оставалось неясным, на каком расстоянии от точки разрыва находится этот центр компактизации и что он из себя представляет.

Л £î 3 _ ------- rpu?7; rm>??6 -------------------- гл^Ч r?v3¡ ге<ЛЕ7| revl75

QîSh si><n Xh íS) 2»i su* Л Xh (?) ?Rh Kh

T<l|2>dorv-7

1Я 2Bi*-jîD 2B L~J 45R-35B ^^-^^ВТЯ-еЗС; 45Н-Э53 21fl I I I

I I I

I-1 rev45

@4i 40 фЗЭ e 35 42 46

lfl 28 49F 60С-7Й 28 ьи*1«*^^ 3=5-49) 21Я

Рис.4. Схема хромосом линяя ревертанюя.

Показана схема 2-ой хромосомы з перестройке Т( 1 ;2)dor°">r7 (г) я ее пгаяаводнке, полученные в результате облучения (Pokholv kova et al. , 1 993). Е свободных дупликациях (а-в) п$юиэошел перенос iA-28-2Rh фрагмента на Х-уромосому. в линиях revZ7 к rev226 присоединение произошло к 19 району (а), в reveo - к X-гетерсхронаткну дистлльней su(f) (0). а в линиях rev3, revJO, revW7, rev 175 - проксимальней su(f) (в.) В линии revi 10 (д) произошла инверсия между 2Rh и 5D районом (показана квадратной скобочкой, пунктиры показывают положение разрывов на хромосоме линии var7). 3 линии rev45 произошли две инверсии - первая между двумя блоками 2Rh, вторая - между 2Rh и 49F районом (е). Тонкие линии соответствуют эухроматиновым районам, толстые -гетерохроматину 2-ой хромосомы, гетерохроматин X-хромосомы заштрихован и подписан xh. 3 нем указано положение локуса su(f). Гетерохроматиновые районы в точках раэрыза пронумерованы сверху, эухромятиневке - снизу, с - центромера 2-ой хромосомы, + - проявление ЭП, - - отсутствие ЭП.

Мы проанализировали гетерохроматиновые последовательности, непосредственно соединенные с последовательностю ДНК из района 2В в исходной линии т(1;2)dorv*r7 и во всех линиях ре-вертантов, методом гибридизации по Саузерну. По нашим данным, ДНК из гетерохроматина, соединенная с 1А-2В фрагментом (рис.1) сохраняется во всех ревертантах на протяжении минимум 17 тпн, а соединенная с 2B-5D (линии rev4S, revlio) - минимум ю тпн. Таким образом, мощный центр инициации компактизации находится в прицентромерном районе 2-ой хромосомы на расстоянии свыше 10 тпн от зоны эу-гетерохроматинового соединения в линии rev45. В линиях rev27, rev226, rev45, revi 10 ЭП для генов dor и BR-C не проявлялся даже при использовании модификаторов ЭП. В этих четырех линиях блок 2Rh совместно с 1А-2В фрагментом присоединился к эухроматиновому району (рис.4). При встраивании этого блока в Х-гетерохроматин в случае rev3, rev40, rev60, rev 167, revi75 ЭП проявлялся. На основании этих данных можно сделать следующие выводы: 1) не всякий гетерохроматин способен индуцировать ЭП; 2) центр инактивации компактизации может находиться на расстоянии свыше 17 тпн от места эу-гетерохроматинового соединения. Мы полагаем, что для инициации ЭП важно не столько количество гетерохроматина, как качество входящих в него последовательностей. СатДНК, прилежащая к району 2В7-8 в перестройке т(1;2)dorv*r7, служит скорее проводником ЭП, нежели является его индуктором.

8. Роль различных последовательностей в компактизации при ЭП.

Анализ полученных нами данных, а также известных из литературы случаев необычного проявления эффекта положения позволил нам сформулировать модель инактивации хроматина при ЭП (Баласов, Макунин 1993). Она включает следующие положения:

1. центры инициации компактизации располагаются как в эу-, так и в гетерохроматине, но с различной плотностью (под центром инициации компактизации мы подразумеваем участок ДНК, могущий предпочтительно связывать белки-компактизаторы);

2. молекулы белков-компактизаторов (БК) взаимодействуют как с ДНК, так и друг с другом, проявляя при этом кооперативный эффект;

гетерохроматин формируется (идентифицируется) при достижении определенной концентрации белков в данном районе. Мы предполагаем, что ДНК ААСАС сателлита в районе разрыва var7 с тносительно слабо связывается с БК и в следствие этого не

способна вызывать ЭП самостоятельно. При этом концентрация БК в районе сатДНК близка к необходимой для Формирования гетеро-— хроматина - и при приближении этого района к центру инициации компактизации происходит его гетерохроматизация в результате кооперативного эффекта при взаимодействии БК. В эухроматиновых районах БК могут взаимодействовать с повторами, аналогичными обнаруженным нами в 2,1 тпн Фрагменте (АС-повторы, вырожденный тандемный повтор (стбТТЬо, а так же ряд других). В следствие различной плотности распределения сайтов связывания с БК эу-хроматиновые районы могут обладать разной способностью к компактизации при ЭП, как в случае прерывистой компактизации при ЭП (Ве1уаеуа, гМтиТеУ, 1991).

ВЫВОДЫ

1. Охарактеризована новая система для изучения эффекта положения мозаичного типа у Оговор/?7 7а твТаподавЬвг: серия линий, различающихся по силе ЭП и содержащих одну и ту же эухромати-новую последовательность и разные блоки соседствующего с ней

гетерохроматина.

2. Сравнение ближайших к эухроматину гетерохроматиновых последовательностей методом Саузерн-блот гибридизации в перестройках с различным проявлением эффекта положения показало сохранение минимум 17 тпн ДНИ из гетерохроматина во всех линиях. Это означает, что а) данная гетерохроматиновая последовательность, непосредственно прилежащая к эухроматиновому району, не способна индуцировать эффект положения самостоятельно; б) предполагаемый центр инициации компактизации находится на расстоянии свыше 17 тпн от места разрыва Т( 1; 2)<1ог'<*г7.

3. Проклонирована и определена последовательность из зоны эугетерохроматинового соединения в Т( 1 ;2)с!ог",г7 (3057 пн) и из места разрыва этой перестройки в районе 2В7-8 (2020 пн).

4. Показано, что разрыв Т(1 ;2)е1огу*г7 в районах И41-И42 гетерохроматина правого плеча 2-ой хромосомы произошел в последовательности нового ранее не описанного для о. теТаподавЬег простого сателлита ТТйТб/ААСАС, который является специфичным для гетерохроматина правого плеча 2-ой хромосомы, что позволяет использовать его в качестве молекулярного маркера. Общее количество этого сателлита оценено в 1 ООО тпн на гаплоидный геном.

5. Гетерохроматин в районе разрыва т(1;2)dorVHrT имеет блочный тип строения : кластер сателлитной ДНК окружен сложными последовательностями ДНК. Определена последовательность длиной 1652 пн, имеющая 90% гомологии с ретротранспозоном Stalker. Показано, что этот мобильный элемент непосредственно встроился в последовательность сателлитной ДНК.

6. Предложена модель инактивации хроматина при эффекте положения мозаичного типа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Похолкова Г.В., Макунин И.В., Беляева Е.С., Жимулев И.Ф. Молекулярно-цитогенетический анализ фрагментов гетерохроматина, индуцирующих инактивацию генов при эффекте положения мозаичного типа у дрозофилы// Докл. Акад. Наук.-1993.- Т.329.- С.369-371

2. Pokholkova G.V., Makunin I.V., Belyaova E.S., Zhimulev I.F. Observations on the induction of position effect variegation of euchromàtic genes in Drosophila me lanogaster//Genetics. - 1993. - Vol.133. - P.231-242.

3. Баласов M.Л., Макунин И.В. Модель компактизации хроматина при мозаичном эффекте положения гена// Генетика.-. 1994.-Т.30.- С.869-873.

4. Макунин И.В., Похолкова Г.В., Захаркин С.О., Холодилов Н.Г., Жимулев И.Ф. Получение и характеристика повторенных последовательностей ДНК из прицентромерного гетерохроматина второй хромосомы Drosophila me lanogaster// Докл. Акад. Наук.-1995.- Т.344.- N 2.- С.266-269.

5. Жимулев И.Ф., Беляева Е.С., Семешин В.Ф., Похолкова Г.В., Кокоза Е.Б., Козлова Т.Ю., Демаков С.А., Мальцева Н.И., Демакова О.В., Баласов М.Л., Коряков Д.Е., Макунин И.В., Белоусова Н.В. Молекулярно-генетическая организация политенных хромосом// Изв. Академии Наук (сер. химич.).- 1995.- N 9.-С. 1622-1638.