Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетический анализ эффекта положения мозаичного типа и эффекта Дубинина у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетический анализ эффекта положения мозаичного типа и эффекта Дубинина у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи УДК 576.316.352:576.316.345:575.224.3:595.773.4

РГ6 ОД

Демакова Ольга Викторовна

Цнтогенетическнй анализ эффекта положения мозаичного типа и эффекта Дубинина у ВгоБоркйа melanogaster.

Генетика-03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1998

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель:

Официальные оппонента:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук Е.С. Беляева

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук Л.В. ВысоЦдая

Новосибирский государственный университет; г. Новосибирск

кандидат биологических наук Л.В. Омельянчук Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН, г. Москва.

Защита диссертации состоится

1998 г.

на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д - 002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан_

1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А.Д. Груздев

Введение

Актуальность проблемы. В регуляции экспрессии генов эукариот большую роль играют процессы, связанные с изменениями компактизащш хроматина на высших уровнях его упаковки. У Drosophila эти процессы лежат в основе такого, например, явления, как эффект положения гена. При классическом эффекте положения мозаичного типа (ЭПМ) перенос эухроматинового гена к прицентромерному гетерохроматину вследствие хромосомной перестройки приводит к инактивации этого гена в части клеток. Инактивация обусловлена распространением плотной упаковки гетерохроматинового материала на перенесенный эухроматиновый участок хромосомы, т.е. его компактизацией.

Помимо неспецифической гетерохроматиновой инактивации генов, у дрозофилы описан и другой тип эффекта положения - трансчувствительные эффекты. В эту группу входят такие известные явления, как трансвекция, z-w взаимодействие и другие. В их основе лежит зависимость экспрессии ряда генов от соматического спаривания (конъюгации) гомологичных хромосом в интерфазном ядре. Хромосомные перестройки, нарушающие соматическое спаривание гомологов, приводят к нарушению регуляции таких генов Транс-чувстаительные эффекты проявляются только в гетерозиготных комбинациях определенных аллелей гена.

Данные последних лет показали, что эти два типа эффекта положения гена имеют общие черты. По-видимому, это обусловлено универсальностью механизмов регуляции генов на высших уровнях организации хроматина.

Особое место среди известных случаев эффекта положения занимает эффект положения гена cubitus interruptus. Ген ci локализован на эу-гетерохроматиновой границе хромосомы 4. Рецессивная мутация ci' приводит в гомозиготе к прерывистости кубитальной жилки крыла у части мух. Если в результате хромосомных перестроек (R) ген ci+ попадает в эухроматиновые районы, то часть гетерозигот R(ci+)/ci' имеет мутантный фенотип (эффект Дубинина) (Dubinin, Sidorov, 1934). Своеобразие эффекта Дубинина в том, что одни его проявляения типичны для ЭПМ, а другие - для транс-чувствительных эффектов.

Изучение ЭПМ и эффекта Дубинина находится на разных уровнях, что обусловливает и разные подходы к их исследованию на данном этапе. Природа ЭПМ во многом уже известна. Полагают; что важную роль в процессе компактизации играют белки хроматина и, в первую очередь, структурные компоненты гетерохроматина. Актуальным направлением изучения ЭПМ является анализ распределения белков хроматина на политенных хромосомах, что необходимо для обсуждения возможной роли этих белков как в норме, так и в эффекте положения. К настоящему времени антитела получены лишь на некоторые из белков, предположительно являющихся структурными компонентами гетерохроматина, в том числе на белки НР1 и Modulo. Эти белки являются продуктами супрессоров ЭПМ, генов Su(var)205 и modulo. Однако прямые подтверждения их участия в компактизации при ЭПМ до сих пор не получены.

В то же время эффект Дубинина изучен явно недостаточно для того, чтобы объяснить многие его особенности. Здесь на первый план выходит выяснение его природы. Анализ цито генетических проявлений эффекта Дубинина, на наш взгляд, мог бы оказаться продуктивным для понимания сути этого явления. Цель данной работы. Целью данной работы являлось исследование цигогенетических аспектов эффекта Дубинина, а также возможной роли гетерохроматиновых белков НР1 и Modulo как в эффекте положения мозаичного типа, так и в эффекте Дубинина.

В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Проанализировать распределение белка НР1 на политенных хромосомах слюнных желез в линии с Dp(l; 1)рп2Ь, вызывающей ЭПМ.

2. Исследовать характер распределения белка НР1 на политенных хромосомах псевдопитающих клеток.

3. Изучил, возможность зависимости распределения белка Modulo на политенных хромосомах от дозы гена modulo и типа клеток.

4. Выяснить, сопровождается ли эффект Дубинина видимыми изменениями в компактизации района 101D-102B в транслоцированном гомологе хромосомы 4.

5. Изучить жизнеспособность и фенотип гетерозигот по мутациям гена с/ и транслокациям, вызывающим эффект Дубинина.

6. Выяснить, зависит ли супрессия эффекта Дубинина в проксимальных районах аутосом от частоты соматического спаривания нормального и транслоцированного гомологов хромосомы 4 и влияет ли доза генов Su(var)205 и modulo на эту частоту.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получено прямое доказательство участия гетерохроматинового белка НР1 в ЭПМ. Установлено, что белок Modulo является общим для двух ядерных структур: ядрышка и хромосом. Супрессия ЭПМ в случае одной дозы гена modulo+ в геноме коррелирует с отсутствием белка Modulo в прицентромерном гетерохроматине. Выявлены тканеспецифические различия в распределении НР1 и Modulo на политенных хромосомах слюнных желез и псевдопитающих клеток. Предложена модель влияния ядрышка на ЭПМ, которая предполагает конкуренцию между гетерохроматином и ядрышком за связывание с общими белками (например, Modulo). Проведен анализ цитогенетических аспектов эффекта Дубинина. Установлено, что этот случай эффекта положения относится к трансчувствительным эффектам, но не ЭПМ, т.к. он

1) не связан с явными изменениями в компактизации транслоцированного гомолога хромосомы 4 ;

2) обусловлен особыми аллелоспецифическими отношениями, но не инактивацией локуса с/;

3) его супрессия в проксимальных районах аутосом коррелирует с высокой частотой восстановления соматического спаривания нормального и транслоцированного гомологов хромосомы 4. НР1 может играть роль в проявлении эффекта Дубинина, влияя на эту частоту.

Полученные в ходе работы результаты имеют теоретическое значение для дальнейшего анализа роли белков хроматина в эффекте положения гена.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 187

ссылок. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 3 таблицы.

Апробация работы. Основные результаты этой работы были представлены в докладе на Второй международной конференции по гетерохроматину Drosophila (Гонолулу, США, 1995 г.), на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (1996 г.) и в стендовом сообщении на XII Всероссийском симпозиуме по структуре и функции клеточного ядра (Санкт-Петербург, Россия, 1996 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Материалы и методы исследования

Линии мух. Использованные линии мух описаны в справочнике (Lindsley andZimm, 1992).

Антитела. В качестве первых антител были использованы мышиные моноклональные антитела С1А9 на белок НР1, любезно предоставленные проф. Элгин (США), и Mab LA9 на белок Modulo, любезно предоставленные проф. Прадедом (Франция) В качестве вторых антител использовали конъюгат иммуноглобулина G (коза против мыши) с флюорохромом изотиоцианатом (FITC) фирмы Sigma.

Приготовление цитологических препаратов. Давленые препараты слюнных желез получали, как описано в статье (Belyaeva et al., 1986), псевдопитающих клеток - как описано- в статье (Mal'ceva et al., 1993).

Непрямое иммунофлюоресиентное окрашивание политенных хромосом выполняли, как описано в статье (Zink, Paro, 1989), с некоторыми модификациями.

Комплементаиионный анализ проводили по стандартной схеме при25°С.

Статистическая обработка результатов. Доверительные интервалы долей определяли, используя критерий Фишера. Достоверность различий распределений частот встречаемости разных типов ядер или классов мух в сравниваемых выборках оценивали с помощью критерия %2.

Результаты и обсуждение 1. Иммунолокализация белков НР1 и Modulo на политенных хромосомах

Белки НР1 и Mod как компоненты конденсированного хроматина

Установлено, что белок НР1 в разных типах клеток связан с гетерохроматиновыми районами. На политенных хромосомах слюнных желез он в основном локализован в хромоценгре, хромосоме 4, а также теломерах и некоторых эухроматиновых районах (James et al., 1989). Логично было предположить, что этот белок участвует и в компактизации эухроматиновых районов при ЭПМ. Dp(l;I)pn2b переносит к прицетромерному гетерохроматину район 1А-2Е1-2 X-хромосомы, что приводит к компактизации этого района в части клеток. Мы показали, что в этих клетках НР1 присутствует в компактизованном эухромагановом районе 1С-2Е1-2. В контроле, т.е. в тех клетках, где этот район не компактизован, НР1 не выявлен. В части клеток наблюдается прерывистая компактизация, когда блоки компактизованного эухроматина разделены промежуточными участками хромосом, сохранившими нормальный дисковый рисунок. В этом случае белок связан только с блоками компактизированного эухроматина.

Таким образом, нами впервые получено прямое доказательство участия НР1 в эффекте положения гена. Следовательно, распространение инактивации генов вдоль по хромосоме при ЭПМ (spreading-эффект) действительно связано с распространением гетерохроматинового белка на эухроматиновый участок.

Ранее было показано, что ген modulo является доминантным супрессором ЭПМ, а его продукт способен связываться с ДНК. Эти данные позволили предположить, что белок Modulo играет важную роль в регуляции компактизации хроматина (Garzino et al., 1992). В отличие от HP 1, локализация белка Modulo на политенных хромосомах слюнных желез практически не изучена. Используя для иммуноокрашивания линию дикого типа Oregon-R, мы показали, что мажорное окрашивание связано с ядрышком. В меньшей степени белок присутствует в хромоцентре и подавляющем числе

дисков эухроматиновых плеч хромосом. Modulo отсутствует в районах междисков и пуфов. Связь белка с ядрышком мы подтвердили также в линии, где встройка одиночной кодирующей единицы 18S+28S рРНК приводит к формированию мини-ядрышка Таким образом, белок Modulo оказался общим для ядрышка и районов конденсированного хроматина.

Локализация Modulo почти во всех дисках не позволяет прямо проверить его значение для компактизации в хромосомной перестройке, вызывающей ЭПМ. Мы использовали другой подход. Известно, что недостаток дозы гена modulóf, кодирующего этот белок, приводит к сильной супрессии эффекта положения. Мы показали, что у гетерозигот по нуль-аллелю гена (1 доза гена) белок выявляется только в районах ядрышка. Таким образом, потеря одной копии гена приводит к почти полному отсутствию белка Modulo в гетерохроматиновых районах, что, в свою очередь, по-видимому, и вызывает супрессию ЭПМ в соответствующих перестройках. Мы полагаем, что этот белок, являясь компонентом конденсированного хроматина, возможно, выполняет какие-то общие функции в формировании и/или поддержании закрытой конформации хроматина, что и определяет его значение для ЭПМ. Гетерохроматиновые белковые комплексы

Ранее было высказано предположение о том, что белки Modulo и НР1 входят в единый комплекс и непосредственно взаимодействуют друг с другом. Предполагают, что Modulo, способный связываться с ДНК, важен для связывания НР1 с хроматином (Garzino et.al., 1992). Мы получили данные, которые не подтверждают эту гипотезу. Нам удалось показать, что у редких выживающих гомозигот по мутации гена modulo, Df(3R)A4-4 L8, белок Modulo полностью отсутствует. В то же время при окрашивании политенных хромосом таких "безмодульных" личинок антителами на НР1 наблюдается типичная картина локализации этого белка на хромосомах слюнных желез, т.е. для правильного связывания НР1 с хромосомами наличие в клетке белка Modulo, не требуется.

Тканеспецифичность распределения белков НР1 и Modulo на политенных хромосомах

Важным аспектом изучения гетерохроматиновых белков является вопрос о возможной тканеспецифичности их распределения на хромосомах. Этот вопрос мы изучили на примере политенных хромосом питающих клеток ооцитов у мутанта oíu (псевдопитагощих клеток). Известно, что в этих клетках ослаблены все типичные свойства гетерохроматина: он более декомпактизован, а ЭПМ слабее в 5-6 раз, чем в слюнных железах (Mal'ceva et al., 1997).

Картина локализации НР1 на хромосомах псевдопитагощих клеток оказалась сходной с описанной ранее для слюнных желез. Тем не менее распределение эухромашновых сайтов связывания частично различается и, пожалуй, самое яркое различие обнаружено в районе 31 2Ь-хромосомы. В слюнных железах этот район является единственным эухроматиновым сайтом мажорного окрашивания, а в псевдопитающих клетках НР1 в нем полностью отсутствует.

Полученные данные, во-первых, согласуются с представлением о том, что НР1 является структурным компонентом гетерохроматина. Во-вторых, обнаруженные псанеспецифические различия в распределении белка в эухроматиновых районах подтверждают предположение о том, что НР1 не связывается с определенными последовательностями ДНК.

Белок Modulo в псевдопитающих клетках практически весь связан с ядрышком, которое имеет в этих клетках необычно большие размеры. Слабо окрашен прицентромерный гетерохроматин и отдельные эухроматиновые сайты в части клеток. Эти особенности локализации белка не связаны с самой мутацией oíu, т.к. в контроле, в слюнных железах мутантов oíu, локализация Modulo не отличается от описанной для линии д икого типа.

Мы предлагаем следующую модель для объяснения особенностей распределения Modulo на политенных хромосомах двух типов клеток (Рис. 1). По этой модели, ядрышко и прицентромерный гетерохроматин имеют не только'специфические, но и некоторые общие белки, например, Modulo, за связывание с которыми они конкурируют. Увеличение числа последовательностей

ядрышкового организатора (например, в псевдопитающих клетках) или снижение синтеза общего белка Modulo (в случае 1 дозы гена modulo+) приводит к преимущественному связыванию белка с ядрышком. При этом значительно меньшая часть свободных молекул белка Modulo остается доступной для связывания с гетерохроматином, что вызывает ослабление эффекта положения.

Известно, что уменьшение дозы ядрышкового организатора приводит к усилению проявлений ЭПМ. Логично предположить, что делеция последовательностей ядрышкового организатора будет приводить к уменьшению размеров ядрышка, преимущественному связыванию общих белков с прицентромерным гетерохроматином и, вследствие этого, усилению ЭПМ.

Мы полагаем, что конкурируя за общие белки, ядрышко может влиять на эффект положения гена в разных типах клеток. Modulo является первым кандидатом на участие в таком механизме.

|ЯО

ЭПМ усилен

| Mod1»- ¿ffis,

ДИКИЙ ТИП ЖЙто

АЛЛ/

ЭПМ подавлен

Клетки слюнных желез

Псевдопитаюшие клетки

подавление ЭПМ

1 Специфические белки адфышка О Общ» белки шшр. Mod) ^ Специфические хромосомные 6е.ши

Рис. 1. Модель влияния ядрышка на эффект положения мозаичного типа. Пояснения в тексте.

Условные обозначения: ЯО - ядрышковый организатор.

2. Анализ цитогенетических аспектов эффекта Дубинина

За 60 лет изучения этого явления накоплено много данных о противоречивости его свойств. Ряд авторов рассматривал эффект Дубинина в терминах ЭПМ. Основанием для этого служили эу-гетерохроматиновый характер перестроек, вызывающих эффект Дубинина, и влияние количества гетерохроматина в клетке на проявление с/'-фенотипа у гетерозигот R(ct)lci' (Grell, 1959). Кроме того, перенос гена с/ в проксимальные районы аутосом практически не вызывает нарушений его экспрессии (Khvostova, 1939), а такая зависимость, как оказалось, характерна для ЭПМ некоторых других гетерохроматиновых генов.

В других работах отмечалось принципиальное отличие этого эффекта от ЭПМ: гомозиготы R^ctyR^ct) и гемизиготы R(ci+)/0 (где 0 - делеция или утрата хромосомы 4) обычно не отличимы от мух дикого типа Для объяснения этой особенности была предложена гипотеза о зависимости эффекта от соматического спаривания гомологов хромосомы 4. Проблема в том, что на основании описанных ранее свойств невозможно до конца понять природу эффекта Дубинина. Необходим дополнительный анализ его цитологических и генетических проявлений. Морфология района 101 в транслокациях T(l;4)wmJ5*-JI, T(2;4)astT и Т(3;4)А2

На первом этапе работы нашей задачей было выяснить, сопровождается ли эффект Дубинина типичной для ЭПМ компактизацией материала в транслоцированном гомологе хромосомы 4. В трех исследованных транслокациях район 101D-102F хромосомы 4 перенесён в различные эухроматиновые районы. Гетерозиготы по этим транслокациям и мутации ci1 проявляют сильный мутантный фенотип. Проведя морфологический анализ транслоцированного гомолога хромосомы 4 в разных условиях (у самцов генотипа XXY при 25° и самцов генотипа ХО при 14°), мы не обнаружили каких-либо изменений рисунка дисков на протяженном участке и образования блоков, что обычно наблюдается при ЭПМ.

Таким образом, перенос хромосомы 4 в эухроматиновое окружение не приводит к явным изменениям в ее ком пактизации. Генетический анализ мсизнеспособности и фенотипа гетерозигот по транслокациям, вызывающим эффект Дубинина, и мутаптным аллелям локуса с!

Известно, что при ЭПМ происходит инактивация гена в перестроенном гомологе, а транс-чувствительные эффекты обнаруживаются только в определенных аллельных сочетаниях. Чтобы понять, какова суть эффекта Дубинина, мы провели анализ жизнеспособности и фенотипа гетерозиготных комбинаций трех транслокаций со всеми известными аллелями гена с/ (Табл. 1). Мы показали следующее. 1) Эффект Дубинина не связан с инактивацией гена с/ в перестроенном гомологе, т.к. жизнеспособность мух во всех случаях, включая и гетерозигот по летальным аллелям гена, была нормальной. 2) В основе эффекта лежат особые аллелоспецифические отношения. Принято считать, что сг' -единственная мутация, способная вызывать эффект Дубинина (НешкоГГ, 1994). Мы же обнаружили, что все мутации группы комплементации с/; (сг', сг161, сР7е, с/") проявляют мутантный фенотип в гетерозиготе с транслокациями. Итак, данные генетического анализа свидетельствуют о принадлежности эффекта Дубинина к группе транс-чувствительных эффектов, но не ЭПМ. Зависимость эффекта Дубинина от соматического спаривания транслоцированного и нормального гомологов хромосомы 4

Причины обнаруженного В.В.Хвостовой ограничения эффекта Дубинина дистальными эухроматиновыми районами до сих пор неясны. Мы предположили, что супрессия эффекта в проксимальных районах аутосом может быть результатом восстановления соматического спаривания (конъюгации) гомологов у гетерозигот по перестройке и мутации а. Для проверки мы сравнили частоты соматической конъюгации нормального и транслоцированного гомологов хромосомы 4 в двух группах транслокаций, контрастных по свойствам (Рис. 2 и 3). В первую группу входили транслокации с дистальными эухроматиновыми разрывами, вызывающие сильный эффект Дубинина (Т(1;4)^258-2'/Ш6, Т(2;4)азГ/01а, Т(3;4)А2/Ме), во вторую - транслокации с проксимальными разрывами,

Таблица 1. Жизнеспособность и фенотип гетерозигот по транслокациям, вызывающим эффект Дубинина, и аллелям гена ci.

Транслокация Цитологическая локализация точек разрывов Аллели гена ci

ci1 ci'" ci''' ci" ciD cic' /(4)13 1(4)17

T(l;4)wm2""'/FM6 3F, 101F 141:134 184:188 207:202 180:172 114:104 92:115 119:125 109:93

ci (85.5)? d (44.2) ci (39.3) ci ci tv + +

T(2;4)ast'/Gla 21Е;101F 87:108 161:188 121:147 95:142 110:83 86:97 109:83 109:144

ci (97.2) ci (61.2) ci (78.9) ci ci Ce + +

T(3;4)A2/Me 94А;101F 168:185 173:194 112:132 132:184 162:143 79:107 202:195 98:112

ci (75.1) ci (60.0) ci (75.8) ci ci Ce + +

T(3;4)p"/TM3, Ser 8SA; 101 182:178 - - - - - - -

ci (7.9)

T(3;4)c/InP, Dfd 86С; 101 79:102 - - - - - - -

ci (2.0)

T(3;4)86D/TM3, Sb 86D; 101 121:130 - - - - - - -

ci (6.9)

1 - отношение числа мух генотипа т/В к числу мух генотипа т/Т среди потомков Fl (m - мутация гена ci, В - балансёрная хромосома, Т - транслокация).

2 - фенотип и доля мух (в %) генотипа т/Т, у которых проявляется мутантный признак.

Т(1;4)ыт253-21х а1 Т(2;4)аьРх а1 Т(3;4)А2ха1

100% т 80%

Т(3;4)р42 х с/1 Т(3;4)с х а1 Т(3;4)860 х а1

Рис 2. Частота контактов транслоцированного гомолога хромосомы 4 с приценгромерным гетерохроматином у гетерозигот К(а*)/а' при25°С.

Условные обозначения:

к - конъюгация транслоцированного и нормального гомологов хромосомы 4; 4/ГХ - контакт транслоцированного гомолога хромосомы 4 с прицентромерным гетерохроматином; нк -отсутствие конъюгации гомологов хромосомы 4.

И Т(3;4)р42 LB □ Т(3-4)р42,ТМ6

И T(3;4)p42.Su(vai)205 а Т(3;4)р42.Су

100% 80% -60% 40% 20% 0%

4/ГХ

100% 80% 60% -• 40% 20% 0%

I

гЬ

i ¿Г/1х i—

4/ГХ

И T(3;4)c,L8 D Щ4)с, ТМ6 100% j 80% -60% -40% -20% 0%

4/ГХ

И T(3;4)c,Su(vat)205 □ Т(3,4)с,Су

100% 80% 60%

rí гЬ 40% , Т., т

у/л , V/. . iñ. *>*

0%

гЬ rír

Ж -Е- ж\.

4/ГХ

нк

И T(3;4)86D,L8n T(3;4)86D,TMB

100% т 80% 60% -40% 20% 0%

И T(3;4)86D,Su(var)205 □ T(3,4)86D,Cy 100% -80% 60% 40% -20% ■ 0% -

lí]

4/ГХ

Рис. 3. Влияние модификаторов ЭПМ на частоту контактов транслоцированного гомолога хромосомы 4 с прицентромерным гетерохроматином при 25°G.' Условные обозначения см. Рис. 2.

вызывающие крайне слабое проявление эффекта (T(3:4)p42/TM3, Ser, T(3;4)c/InP, Dfd, T(3;4)86D/TM3, Sb). Из диаграмм видно (Рис. 2), что в дистальных районах в подавляющем большинстве ядер транслоцированный гомолог не коныогирует с нормальным, а также не контактирует с прицентромерным гетерохроматином. Напротив, в проксимальных районах, вблизи хромоцентра, облегчены эктопические контакты между прицентромерным гетерохроматином и гетерохроматиновым участком района 101,

который транслокации обычно "захватывают" при переносе хромосомы 4 в другие районы.

Вследствие этого транслоцированный гомолог в проксимальных районах хромосом значительно чаще контактирует с хромоцентром и коньюгирует со своим нормальным гомологом.

Супрессия эффекта в проксимальных районах хромосом скорее всего вызвана высокой частотой соматического спаривания транслоцированного и нормального гомологов хромосомы 4.

Известно, что проявление эффекта Дубинина зависит от ■количества гетерохроматина в ядре (Grell, 1959). Данные цитологического анализа позволяют с большими основаниями связывать эффект Дубинина с нарушением соматического спаривания, чем с изменениями в компактизации района 101D-102B в транслокациях. Мы предположили, что гетерохроматиновые белки влияют на способность гетерохроматина к эктопическим контактам и, как следствие, на частоту конъюгации нормального и транслоцированного гомологов хромосомы 4. Мы сравнили эту частоту у двух классов сибсов, у которых перестройка была либо в гетерозиготе с балансером (контроль), либо с мутацией, снижающей дозу гена-супрессора ЭПМ (Рис. 3). В одном случае - это ген modulo, в другом - Su(var)205.

Наличие в генотипе одной дозы Su(var)205 приводит к достоверному снижению частоты конъюгации гомологов хромосомы 4. В случае Т(3;4)р42 и Т(3;4)с общее число контактов с хромоцентром не изменяется, что предполагает влияние НР-1 непосредственно на соматическое спаривание гомологов 4 хромосомы.

Причина отсутствия влияния белка Modulo на эктопические контакты с гетерохроматином в политенных хромосомах, возможно, связана с его минорным количеством в хромоцентре. В таком случае влияние этого белка может быть более выраженным в диплоидных ядрах, где гетерохроматин реплицирован полностью.

Таким образом, основа влияния гетерохроматина на эффект Дубинина и на ЭПМ, возможно, различна. Судя по всему, влияние эктопического связывания прицентромерного гетерохроматина с гетерохроматиновым участком, встроенным в эухроматин, может

носшъ общий характер и лежать в основе ограничения эффекта

положения ряда генов дистальными районами хромосом.

Выводы

1. Получено прямое доказательство участия белка НР1 в компактизации эухроматинового участка при ЭПМ. Впервые показано, что в основе spreading-эффекта лежит распространение структурного компонента гетерохроматина на эухроматиновый район хромосомы.

2. Показано, что белок Modulo является общим компонентом ядрышка и районов конденсированного хроматина (прицентромерного гетерохроматина и дисков эухроматиновых плеч хромосом). Наличие Modulo в районах конденсированного хроматина зависит от дозы гена modulo*" в геноме.

3. Показано, что НР1 демонстрирует типичную картину локализации на политенных хромосомах слюнных желез в отсутствие гена modulo+ в геноме. Белки НР1 и Modulo, таким образом, не входят; по всей видимости, в единый комплекс.

4. Сравнительный анализ иммунолокализации НР1 и Modulo на политенных хромосомах слюнных желез и псевдопитающих клеток показал, что функциональные особенности этих двух типов клеток влияют на характер распределения обоих белков.

5. Предложена модель влияния ядрышка на ЭПМ, согласно которой ядрышко и прицентромерный гетерохроматин имеют общие белки (Modulo) и конкурируют за них.

6. Выявлены следующие цитогенетические особенности эффекта Дубинина, позволяющие рассматривать его как пример трансчувствительных эффектов, но не эффекта положения мозаичного типа:

а. эффект не связан с видимыми изменениями в компактизации хромосомы 4, перенесенной транслокацией в эухроматиновые районы,

б. эффект обусловлен не инактивацией гена с/+, а особыми аллелоспецифическими взаимодействиями,

в. супрессия эффекта Дубинина в проксимальных районах аутосом коррелирует с высокой частотой восстановления соматического спаривания нормального и транспонированного

гомологов хромосомы 4. Гетерохроматиновые белки, по крайней мере, НР1, играют роль в эффекте Дубинина, влияя на эту частоту.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Belyaeva E.S., Demakova O.V., Umbetova G.H., Zhimulev I.F. Cytogenetic and molecular aspects of position effect variegation in Drosophila melanogaster. V. Heterochromatin-associated protein HP-1 appears in euchromatic chromosome regions inactivated as a result of position effect variegation//Chromosoma. 1993. V. 102. P. 583-590.

2. Демакова O.B., Беляева E.C., Умбетова Г.Х., Жимулев И.Ф. Роль белка НР1, специфического для гетерохроматина, в процессе компактизации эухромаггиновых районов при эффекте положения мозаичного типа// ДАН. 1993. Т. 329. С. 655-657.

3. Жимулев И.Ф., Беляева Е.С., Семешин В.Ф., Похолкова Г.В., Кокоза Е.Б., Козлова Т.Ю., Демаков С.А., Мальцева Н.И., Демакова О.В., Баласов M.JI., Коряков Д.Е., Макунин И.В., Белоусова Н.В. Молекулярно-генетическая организация политенных хромосом// Известия Академии наук. Серия химическая. 1995. N9. С. 1622-1638.

4. Демакова О.В., БеляеваЕ.С., Жимулев И.Ф. Цитогенетические аспекты эффекта положения гена cubitus interruptus (эффекта Дубинина) у Drosophila melanogaster!I Цитология: 1997. Т. 39. С. 54.

5. Belyaeva E.S., Koryakov D.E., Pokholkova G.V., Demakova O.V., Zhimulev I.F. Cytological study of the brown dominant position effect// Chromosoma. 1997. 106. P. 124-132.

6. Демакова O.B., Беляева E.C., Жимулев И.Ф. Соматическое спаривание гомологов четвертой хромосомы как причина супрессии эффекта Дубинина у Drosophila melanogaster!I -Генетика. 1998. Т. 34. в печати.

7. Perrin L., Demakova O.V., Mal'ceva N.I., Fanti L., Saingeri S., Kallenbach S., Pimpinelli S., Zhimulev I.F. Pradel J. Sub-nuclear localization of the modulo gene product and regulation of position effect variegation by nucleolus in Drosophila!! in press.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Демакова, Ольга Викторовна, Новосибирск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Институт цитологии и генетики

На правах рукописи

ДЕМАКОВА Ольга Викторовна

Цитогенетический анализ эффекта положения мозаичного типа и эффекта Дубинина у Вго$орМ1а melanogaster

Генетика - 03.00.15

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н. Беляева Е.С.

Новосибирск 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................5

ГЛАВА 1.

ЭФФЕКТ ПОЛОЖЕНИЯ ГЕНА У DROSOPHILA MELANOGASTER (Обзор литературы)................................................................................................11

1.1. Цитогенетическая и молекулярная организация гетерохроматина............12

1.1.1. Основные свойства и организация гетерохроматиновых районов хромосом...........................................................................................................12

1.1.2. Гетерохроматин в политенных хромосомах..........................................13

1.1.3. Белки, входящие в состав гетерохроматина..........................................15

1.2. Эффект положения мозаичного типа..........................................................16

1.2.1. Общая характеристика свойств. Генетическая инактивация при эффекте положения мозаичного типа..............................................................16

1.2.2. Конденсация хроматина при эффекте положения мозаичного типа.... 18

1.2.3. Время установления мозаичной инактивации в онтогенезе..................19

1.2.4. Модификация эффекта положения мозаичного типа. Средовые, генетические и химические модификаторы....................................................20

1.2.5. Генетические модификаторы и их продукты........................................22

1.2.5.1. Общая характеристика генов-модификаторов мозаичного типа......22

1.2.5.2. Гапло-супрессоры, трипло-энхансеры................................................23

1.2.5.3. Гапло-супрессоры.................................................................................24

1.2.5.4. Супрессоры, не проявляющие дозовой зависимости..........................25

1.2.5.5. Гены-энхансеры эффекта положения мозаичного типа.....................25

1.2.6. Модели....................................................................................................26

1.2.6.1. Эффект положения мозаичного типа и изменение

состояния хроматина........................................................................................26

1.2.6.2. Эффект положения мозаичного типа и представленность последовательностей ДНК в политенных и диплоидных клетках................29

1.2.6.3. Эффект положения мозаичного типа и структура хроматина...........30

1.2.6.4. Эффект положения мозаичного типа и внутриядерная организация. 31

1.2.6.5. Эффект положения мозаичного типа и регуляция гомейозисных генов..........................................................................................32

1.3. Транс-чувствительные эффекты..................................................................34

1.3.1. Трансвекция............................................................................................34

1.3.2. zeste-white взаимодействие.....................................................................35

1.3.3. Транс-чувствительные эффекты и ген zeste+.........................................36

1.3.4. Ген zeste+ и гены Polycomb-Group..........................................................37

1.4. Особые случаи эффекта положения гена.....................................................39

1.4.1. Эффект положения гетерохроматиновых генов....................................39

1.4.2. Эффект положения гена brown+.............................................................41

1.4.3. Эффект положения гена cubitus interrupted..........................................42

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................47

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...............................................................49

2.1. Генетические линии дрозофил. Ведение их культур...................................49

2.2. Приготовление давленых препаратов слюнных желез...............................50

2.3. Получение личинок самцов генотипов ХО и XYY для цитологического анализа.................................................................................................................51

2.4. Гибридизация in situ на политенных препаратах слюнных желез..............51

2.4.1. Приготовление давленых препаратов слюнных желез

для гибридизации in situ...................................................................................51

2.4.2. Процедура гибридизации in situ..............................................................51

2.4.3. Мечение тритием клонов ДНК..............................................................52

2.4.4. Использованные зонды ДНК.................................................................52

2.5. Непрямое иммунофлюоресцентное окрашивание политенных хромосом.. 53

2.5.1. Приготовление растворов.......................................................................53

2.5.2. Приготовление давленых препаратов слюнных желез для иммуноокрашивания........................................................................................54

2.5.2.1. С помощью моноклонального антитела С1А9 на белок НР1............54

2.5.2.2. С помощью моноклонального антитела Mab LA9 на белок Modulo. 54

2.5.3. Приготовление давленых препаратов питающих клеток ооцитов для иммуноокрашивания........................................................................................54

2.5.4. Обезвоживание и хранение препаратов.................................................54

2.5.5. Процедура иммуноокрашивания политенных хромосом......................55

2.5.6. Использованные антитела......................................................................55

2.6. Статистическая обработка результатов......................................................56

ГЛАВА 3. ИММУНОЛОКАЛИЗАЦИЯ БЕЛКОВ НР-1 И MODULO НА ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМАХ.....................................................................57

3.1. Результаты....................................................................................................57

3.1.1. Иммунолокализация белка НР1 на политенных хромосомах..............57

3.1.1.1. Локализация белка НР1 на политенных хромосомах слюнных желез в линии, несущей дупликацию Dp(l;l)pn2b......................................57

3.1.1.2. Распределение белка НР1 на Х- хромосоме в клетках

слюнных желез.................................................................................................59

3.1.1.3. Особенности распределения белка НР1 на политенных хромосомах псевдопитающих клеток..................................................................................62

3.1.2. Цитологический анализ особенностей распределения белка

Modulo на политенных хромосомах............................................................67

3.1.2.1. Локализация белка Modulo на политенных хромосомах

слюнных желез.................................................................................................67

3.1.2.2. Анализ распределения белка Modulo на политенных хромосомах слюнных желез в зависимости от дозы гена modulo.......................................69

3.1.2.3. Окрашивание политенных хромосом слюнных желез личинок генотипа Df(3R)A4-4 L8/Df(3R)A4-4 L8антителами на белок НР1...............71

3.1.2.4. Локализация белка Modulo на политенных хромосомах псевдопитающих клеток..................................................................................72

3.2. Обсуждение...................................................................................................75

3.2.1. Белки НР1 и Modulo как компоненты конденсированного хроматина75

3.2.2. Гетерохроматиновые мультибелковые комплексы..............................76

3.2.3. Особенности распределения белков НР1 и Modulo в эухроматиновых районах хромосом.............................................................................................77

3.2.4. Модель участия ядрышка в регуляции эффекта положения мозаичного типа...................................................................................................................80

ГЛАВА 4.

АНАЛИЗ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ ЭФФЕКТА ДУБИНИНА. 84 4.1. Результаты....................................................................................................84

4.1.1. Локализация гена с/в норме и в транслокациях с помощью гибридизации in situ..........................................................................................84

4.1.2. Морфология хромосомы 4 в норме и в транслокациях Т(1;4)пт25в'21, T(2;4)as? и Т(3;4)А2..........................................................................................86

4.1.2.1. Особенности морфологии хромосомы 4 в норме.................................86

4.1.2.2. Морфология транслоцированного гомолога 4Т в транслокациях Т(3;4)А2, T(1;4)W"258-21 и T(2;4)ast...................................................................88

4.1.3. Генетический анализ жизнеспособности и фенотипа гетерозигот по транслокациям, вызывающим эффект Дубинина, и мутантным аллелям гена ci.............................................................................................91

4.1.4. Цитологический анализ частоты соматического спаривания гомологов

хромосомы 4 в ряде транслокаций, вызывающих эффект Дубинина............93

4.2. Обсуждение...................................................................................................99

4.2.1. Особенности морфологии района 101 в норме и в транслокациях.......99

4.2.2. В основе эффекта Дубинина лежат особые аллелоспецифические отношения.......................................................................................................100

4.2.3. Эффект Дубинина зависит от соматического спаривания транслоцированного и нормального гомологов хромосомы 4......................103

4.2.4. Природа эффекта Дубинина.................................................................105

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ............................................................................108

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................112

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность. Одной из важнейших особенностей регуляции экспрессии генов эукариот является сложный процесс активации и репрессии больших доменов хромосом. Механизм такой регуляции связан с изменениями в конденсации хроматина на высших уровнях его упаковки и, по-видимому, носит универсальный характер. Так, данные последних лет позволяют предполагать общность молекулярных механизмов таких генетических явлений, как "молчание" генов у дрожжей, инактивация Х-хромосомы у млекопитающих, а также регуляция гомейозисных генов, транс-чувствительные эффекты и эффект положения мозаичного типа (ЭПМ) у дрозофилы.

Эффект положения отражает зависимость экспрессии гена от его положения на хромосоме. Наибольшее число работ посвящено ЭПМ, при котором перенос эухроматинового гена к прицентромерному гетерохроматину вследствие хромосомной перестройки приводит к инактивации этого гена в части клеток. Такая инактивация обусловлена распространением плотной упаковки гетерохроматинового материала на перенесенный эухроматиновый участок хромосомы. Большое число генов-модификаторов ЭПМ кодирует белки, так или иначе влияющие на ком-пактизацию хроматина.

Необходимым направлением исследования таких белков является анализ их распределения на политенных хромосомах. Гигантские политенные хромосомы двукрылых, имеющие характерный дисковый рисунок, удобны для локализациии белков хроматина in vivo методом непрямого иммуноокрашивания хромосом, благодаря возможности достаточно точно соотносить распределение белка с определенными морфологическими структурами хромосом и ядра в целом. Такой подход позволяет судить о предполагаемых функциях белка в клетке как в норме, так и при ЭПМ.

К настоящему времени антитела получены лишь на некоторые из продуктов генов-модификаторов ЭПМ, в том числе на белки НР1 и Modulo. Эти продукты супрессоров ЭПМ, генов Su(var)205 и modulo предположительно являются струк-

турными компонентами гетерохроматина. Однако прямые подтверждения их участия в компактизации при ЭПМ до сих пор не получены.

ЭПМ значительно снижен в питающих клетках ооцитов у мутанта otu (псевдопитающих клетках), для политенных хромосом которых характерно более деконденсированное состояние гетерохроматиновых районов по сравнению с клетками слюнных желез. Логично предположить, что особенности организации гетерохроматина в двух типах клеток могут быть связаны с различиями как в наборе гетерохроматиновых белков, так и в характере их распределения на политенных хромосомах.

Помимо неспецифической гетерохроматиновой инактивации генов, у дрозофилы описан и другой тип эффекта положения, так называемые трансчувствительные эффекты. В основе этих эффектов, как полагают, лежит зависимость экспрессии ряда генов от соматического спаривания гомологичных хромосом. Интерес многих исследователей вызывает эффект положения гена cubitus in-terruptus+ (ci+), или эффект Дубинина. Несмотря на многолетнее изучение этого феномена, до сих пор неясна его природа. Своеобразие эффекта Дубинина связано с тем, что одни его проявляения типичны для ЭПМ, а другие - для трансчувствительных эффектов.

Изучение этих двух типов эффекта положения находится, таким образом, на разных уровнях, что обусловило и разные подходы к их исследованию, примененные в данной работе. Если природа ЭПМ уже во многом ясна и установлена ее связь со специфическими белками хроматина, то феномен эффекта Дубинина изучен явно недостаточно для того, чтобы объяснить многие его особенности. Анализ цитогенетических проявлений эффекта Дубинина, на наш взгляд, мог бы оказаться продуктивным для понимания как природы самого эффекта, так и основы общности свойств разных типов эффекта положения.

Цель работы. Целью данной работы является выяснение закономерностей проявления эффекта Дубинина, которые могут пролить свет на его природу, а также анализ распределения на политенных хромосомах гетерохроматиновых белков НР1 и

Modulo в связи с их возможной ролью в механизме эффекта положения мозаичного типа и эффекта Дубинина.

В связи с этим поставлены следующие конкретные задачи.

1) Проанализировать особенности локализации белка НР1 на политенных хромосомах слюнных желез в линии с Dp( 1; 1 )рп2Ь, вызывающей эффект положения мозаичного типа.

2) Исследовать характер распределения белка НР1 на политенных хромосомах псевдопитающих клеток.

3) Изучить возможность зависимости распределения белка Modulo на политенных хромосомах от дозы гена modulo и типа клеток.

4) Выяснить, сопровождается ли эффект Дубинина видимыми изменениями в ком-пактизации района 1 OID-102В в транслоцированном гомологе хромосомы 4.

5) Изучить жизнеспособность и фенотип гетерозигот по мутациям гена сг и транслокациям, вызывающим эффект Дубинина.

6) Выяснить, зависит ли супрессия эффекта Дубинина в проксимальных районах хромосом от частоты соматического спаривания нормального и транслоциро-ванного гомологов хромосомы 4 и влияет ли доза генов Su(var)205 и modulo на эту частоту.

Научная новизна. Показано наличие гетерохроматинового белка НР1 в эухромати-новых участках хромосом, компактизованных вследствие ЭПМ. Таким образом, впервые получены прямые доказательства участия структурного компонента гете-рохроматина в ЭПМ в качестве белка - компактизатора. Методом иммунолокали-зации на политенных хромосомах слюнных желез установлено, что белок Modulo является общим для двух ядерных структур: ядрышка и хромосом. Впервые проведенная иммунолокализация белков НР1 и Modulo на политенных хромосомах псевдопитающих клеток позволила выявить тканеспецифические различия в распределении этих белков. Показана зависимость локализации Modulo в районах конденсированного хроматина от дозы гена modulo в геноме. На основании полученных данных предложена модель влияния ядрышка на ЭПМ, которая предполагает, что в основе известного влияния рДНК на ЭПМ лежат конкурирующие от-

ношения между ядрышком и прицентромерным гетерохроматином за общие белки. Modulo является первым кандидатом на участие в таком механизме.

Проведен анализ цитогенетических аспектов эффекта Дубинина. Показано, что этот случай эффекта положения не связан с видимыми изменениями в компак-тизации протяженного участка хромосомы 4, несущей транслокацию. Эффект обусловлен не инактивацией локуса ci, а особыми аллелоспецифическими отношениями. Впервые установлено, что супрессия эффекта Дубинина в проксимальных районах аутосом коррелирует с высокой частотой восстановления соматического спаривания нормального и транслоцированного гомологов хромосомы 4. Показано, что гетерохроматиновые белки, по крайней мере, НР1, могут играть роль в проявлении эффекта Дубинина, влияя на эту частоту. Полученные данные свидетельствуют о том, что эффект Дубинина относится к транс-чувствительным эффектам, но не к ЭПМ.

Практическая ценность. Предложена модель влияния ядрышка на проявление ЭПМ за счет конкуренции за общие белки. Модель может иметь существенное значение для дальнейших исследований роли продуктов генов-модификаторов ЭПМ, влияющих на компактизацию хроматина.

Высокая частота контактов прицентромерного гетерохроматина и гетерохроматиновых участков, перемещенных в эухроматин, обнаруженная в проксимальных районах хромосом при эффекте Дубинина, может иметь общее значение для эффектов положения других гетерохроматиновых генов.

Благодарности. Автор благодарен Е.С. Беляевой, под руководством которой была выполнена эта работа, И.Ф. Жимулеву - за ценные советы по ходу выполнения работы, Н.И. Мальцевой, Е.С. Беляевой и Г.Х. Умбетовой за участие в работе, Е.И. Волковой и Д.Е. Корякову - за помощь в компьютерной обработке результатов, K.D. Tartof - за любезно предоставленные клоны ДНК, S.C.R. Elgin и J. Pradel - за любезно предоставленные антитела.

Автор также благодарен сотрудникам лаборатории молекулярной цитогене-тики за поддержку и обсуждение результатов.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 187 ссылок. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 3 таблицы.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Цитологический анализ иммуноокрашенных препаратов Dp(l;l)pn2b проводился совместно с Е.С. Беляевой и Г.Х. Умбетовой. Приготовление препаратов псевдопитающих клеток и их цитологический анализ проводились совместно с Н.И. Мальцевой.

Апробация работы. Основные результаты этой работы были представлены в докладе на Второй международной конференции по гетерохроматину Drosophila 1995 г. (Гонолулу, США), на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (1996) и в стендовом со