Характеристика белок-белкового взаимодействия с учетом групповой принадлежности крови

Шахнович, Елена Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика белок-белкового взаимодействия с учетом групповой принадлежности крови
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика белок-белкового взаимодействия с учетом групповой принадлежности крови"

На правах рукописи

Шахнович Елена Александровна

ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛОК-БЕЛКОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С УЧЕТОМ ГРУППОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ

03.01.04- Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 4 ОКТ 2013

005535663

Челябинск 2013

005535663

Работа выполнена на кафедре фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной

диагностикой Государственного бюджетного образовательпого учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научпый руководитель:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой

ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России Гильмиярова Фрида Насыровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биологии

доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского ФГОУ ВПО «Московский государственный университет

им. М.В. Ломоносова» Муронец Владимир Израилевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования . «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится —2013 г. в_часов на заседании диссертационного

совета Д. 208.117.02 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

ГБОУ ВПО ЮУГМУ

Минздрава России

Колесников Олег Леонидович

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медиципских наук,

профессор кафедры нормальной физиологии

ГБОУ ВПО ЮУГМУ

Минздрава России

Н.В. Тишевская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

В настоящее время существует потребность в фундаментальных исследованиях, раскрывающих молекулярные механизмы основных процессов жизнедеятельности, ключевыми из которых являются межмолекулярные взаимодействия. Они представлены на всех уровнях структурной и регуляторной иерархии в организме, определяющей специфику, направленность анаболизма и катаболизма, информационное взаимодействие молекул, клеток, органов и систем, устойчивость и динамичность биохимических и физиологических процессов (Лим В.И. и соавт. Кинетические, энергетические и стереохимические факторы, определяющие молекулярное узнавание белков и нуклеиновых кислот. Молекулярная биология. 2006, Т. 40, № 4. С. 572 - 579; Яковлев A.A. Кросс-линкеры и их использование для исследования межмолекулярных взаимодействий Нейрохимия. 2009, Т. 26, № 2. - С. 149 - 155; Василевская В.В. и соавт. Компьютерное моделирование макромолекулярных систем с амфифильными мономерными звеньями. Биометрические модели. Высокомолекулярные соединения. 2011, Т.53, № 9. С. 1603 - 1626; Иванов A.C. Исследование межмолекулярных взаимодействий с помощью оптических биосенсоров, работающих на эффекте поверхностного плазменного резонанса. Современные технологии в медицине. 2012, № 4, С. 142 - 153; Мао L. et al. Multiple intermolecular interaction modes of positively charged residues with adenine in ATP-binding proteins. J Am Chem Soc. 2003, Vol. 26, № 125(47). P.14216 - 14217; Kamei N. et al. Importance of intermolecular interaction on the improvement of intestinal therapeutic peptide/protein absorption using cell-penetrating peptides. J Control Release. 2009,Vol. 19, № 136(3). P.179 - 186).

Благодаря успехам протеомики, внедрению высокотехнологичных методов раскрыты определенные закономерности структурной организации белков, получены достаточные доказательства того, что ключевыми звеньями в реализации функций организма являются белок-белковые взаимодействия, нарушение которых может привести к развитию патологических состояний (Шатаева JI.K. и соавт. Пептидная саморегуляция живых систем (факты и гипотезы) Спб.: «Наука», 2003. 222 е.; Березов Т.Т. и соавт. Альцгеймеровские амилоидные бляшки в механизмах нарушения синаптической пластичности нейронов. Вестник РАМН. 2005, № 10. С. 3 - 7; Пятницкий М.А. и соавт. Предсказание взаимосвязанных белков методами сравнительной геномики in silico. Биомедицинская химия. 2009, Т. 55, № 3. С. 230 - 246.; Терентьев A.A. и соавт. Динамическая протеомика в моделировании живой клетки. Белок-белковые взаимодействия. Успехи биологической химии. 2009, Т.49, С. 429 -480; Иванов A.C. и соавт. Технологии белковой интерактомики. Биоорганическая химия. 2011, Т.37, № 1. С. 8 — 31; 326. Shaitàn' K.V. In: stochastic dynamics of reacting biomolecules. World scientific. 2003, P. 283 - 308;

Zaretsky J.Z. et al. Protein multifunctionality: principles and mechanisms. Translate Oncogenomics. 2008, № 3, P.99 - 136).

В литературе представлены разрозненные, несистематизированные сведения о предрасположенности к определенным соматическим и инфекционным заболеваниям лиц с различной АВО-групповой принадлежностью крови (Гребенщиков Л.В. Значение групповой принадлежности крови в диагностике наиболее распространенных JIOP-заболеваний: автореф. дис. ... канд. мед. наук. СПб., 2001, 23 е.; Афонин А.А. Генетика групп крови. М., 2006, 52 е.; Гильямиярова Ф.Н. и соавт. Группы крови: биологическая вариабельность клеточного состава и метаболизма в норме и патологии. М.: «Известия», 2007, 490 е.; Кучерюк П.Н. Эритроцитарные антигены системы АВО и сердечно-сосудистый риск. Пермский медицинский журнал. 2009, Т. 26, № 4. С. 90 - 94; Fry А.Е. et al. Common variation in the ABO glycosyltransferase is associated with susceptibility to severe Plasmodium falciparum malaria. Human Molecular Genetics. 2008, Vol. 17, № 4; Reid M.E. From DNA to blood groups. Immunohematology. 2008, № 24(4). P. 166-169).Молекулярная сущность этих явлений недостаточно аргументирована, в связи с этим создание теоретической базы данных о функциональной специфике антигенов системы АВО будет основой для выяснения причин индивидуальной реакции на экзогенные и эндогенные факторы обладателей различных групп крови, что имеет важное значение для развития превентивной медицины.

Немногочисленны сведения о структурной организации и функциях антигенов АВО системы. Известно, что детерминантной группой антигенов являются N-ацетилгалактозамин у антигена А и галактоза у антигена В (Yamamoto F. АВО blood group system-ABH oligosaccharide antigens, anti-A and anti-B, A and В glycosyltransferases, and ABO genes. Immunohematology. 2004, № 20. P. 3-22; Blumenfeld O.O. The ABO gene-more variation! Blood. 2003, № 102. P. 2715; Seltsam A. et al. The nature of diversity and diversification at the ABO locus. Blood. 2003, Vol. 102, № 8. P. 3035-3042). Генный локус системы H, предшественника антигенов АВО, расположен на 19 хромосоме в позиции 19ql3.3 и кодирует синтез каталитического белка а1,2-фукозилтрансферазы, переносящей остатки фукозы на терминальную галактозу (Оловникова Н.И. и соавт. Антигены эритроцитов человека. Гематология и трансфузиология. 2001, № 5. С. 37-45; Schenkel-Brunner Н., 2000; Cooling L.W. et al. Determinants of ABH expression on human blood platelets. Blood. 2005, № 105. P. 3356-3364). Гены белков, отвечающих за образование АВО системы антигенов, располагаются на 9 хромосоме в позиции 9q34.1 - 9q34.2 (Yamamoto F. et al. Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system. Nature. 1990, Vol. 345. P. 229-233). Кодируемые ими белки обладают гликозилтрансферазной активностью, обеспечивая доставку УДФ-№ацетилгалактозамина, формируя гликопротеин А, или галактозы к терминальной фукозе, формируя гликопротеин В (Льюис С.М. и соавт. Практическая и лабораторная гематология. М.: «ГЭОТАР - Медиа», 2009. 672 е.; Yamamoto М. et al.

Molecular genetic basis of porcine histo-blood group AO system. Blood. 2001, № 97. P. 3308-3310; Blumenfeld O.O. et al. Allelic genes of blood group antigens: a source of human mutations and cSNPs documented in the blood group antigen gene mutation database. Hum. Mutat. 2004, № 23. P. 8; Anstee D.J. Red cell genotyping and the future of pretransfusion testing . Blood. 2009, № 114. P. 248-256; Sindhuwinata N. et al. Binding of an acceptor substrate analog enhances the enzymatic activity of human blood group В galactosyltransferase. Glycobiology. 2010, № 20. P. 718-723). Тем самым формируются фенотипы А и В (Hosoi Е. Biological and clinical aspects of ABO blood group system.The Journal of medical investigation. 2008, Vol. 55. P. 174-182). Отсутствуют данные о поведении антигенов ABO системы как биомолекул, интеграция этих структур в каскад метаболических и физиологических процессов в организме.

Настоящее исследование выполнено в рамках Федеральной программы:

«Взаимодействие биологически активных веществ растительного и животного происхождения с системами жизнеобеспечения организма с учетом биологической вариабельности метаболизма, ассоциированной с групповой принадлежностью крови» (номер гос. регистрации 0120.0809698).

Цель исследования: выяснить молекулярную основу белок-белкового взаимодействия на модели гликопротеинов А и В и их лигандов, особенности ответа системы на воздействие биологически активных веществ.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать показатели белкового обмена практически здоровых лиц 0(1) - AB(IV) групп крови, выявить ассоциированность направленности метаболизма с определенной группой крови.

2. Исследовать группоспецифические особенности поведения белков сыворотки крови в электрическом поле, используя капиллярный электрофорез, оценить влияние силистронга на физико-химические характеристики белков.

3. Изучить действие силистронга на антиген-антительную модельную систему в условиях in vitro, используя в качестве объектов гликопротеины А и В и моноклональные антитела, охарактеризовать скорость наступления и степень агглютинации.

4. Оценить эффект силистронга на естественные анти-А и анти-В антитела по характеру межмолекулярного узнавания между модифицированными антителами и стандартными эритроцитами, содержащими антигены АВО системы.

5. Дать качественную и количественную оценку белок-лигандных комплексов с помощью методов конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и проточной цитофлуориметрии, выявив влияние силистронга на межмолекулярные процессы.

Методология и методы исследования

Работа включала несколько этапов:

1. Определение показателей белкового обмена у 1300 лиц практически здоровых лиц в возрасте 19,6±1,5 лет, проживающих на территории Самарской области с 0(1) -AB(IV) группами крови.

2. Оценка влияния силистронга на физико-химические свойства белков сыворотки крови здоровых лиц со А(П) (п=100) и В(1П) (п=100) группами крови методом капиллярного электрофореза.

3. Изучение реакции системы антиген-антитело в различных условиях эксперимента, используя в качестве объектов гликопротеины А (п=60) и В(п=60), моноклональные антитела (п=60), естественные антитела (п=60).

4. Визуализация антиген-антительных комплексов методом проточной цитофлуориметрии, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (п=200).

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и рекомендаций базируется на достаточном числе наблюдений и использовании современных методов исследования и статистической обработки материалов с помощью пакета компьютерных программ SPSS 12.0, «ANOVA».

Результаты исследований были представлены на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии», посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица (Челябинск, 2009); ХШ Международной научной конференции «Здоровье семьи в 21 веке» (Хургада, 2009); научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 2009); II международной научно-практической конференции «Посттеномпые методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, 2011); Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине «Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (Омск, 2011); научно-практической конференции «Обеспечение доступности современных клинических лабораторных исследований: аналитические возможности, клинические потребности, организационно-экономические условия» (Москва, 2011); Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые - медицине» (Самара, 2011, 2012); Международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2011, 2012); научно-практической конференции «Реальные клинико-диагностические лабораторные услуги: степень соответствия стандартам лабораторной медицины, качество, себестоимость и цена» (Москва, 2012); XVI международной научной конференции «Здоровье семьи в XXI веке» (Будапешт, 2012); I Всероссийской конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012); совместном заседании Самарского отделения Всероссийского биохимического общества, кафедры фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой и кафедры общей, бионеорганической и биоорганической химии ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Самара, 2013).

Личное участие автора в получении научных результатов, изложенных в диссертации, состояло в проведении научно-информационного поиска, анализа и обобщения данных литературы по профилю диссертационного исследования, формулировке цели и задач; проведении определения показателей белкового обмена, групповой принадлежности крови у 1300 клинически здоровых лиц, экспериментов in vitro по оценке влияния препарата силистронг на физико-химические свойства белков, серии модельных экспериментов по изучению белок-белкового взаимодействия in vitro, визуализации антиген-антительных комплексов методами проточной цитофлуориметрии, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Автором лично получены все первичные данные, самостоятельно произведена статистическая обработка материала^ сформулированы положения, выносимые на защиту, выводы и выводы и практические рекомендации, написан текст диссертации.

Положения, выносимые на защиту

1. Направленность белкового обмена, ассоциированная с АВО-групповой принадлежностью крови. Для носителей антигена А - низкое содержание альбумина при высоком уровне у-глобулинов, Ig G, свидетельствующем о напряжении специфического иммунитета. Для носителей антигена В - высокое содержание альбумина при низком уровне Ig G, Ig М и конечных продуктов азотистого обмена.

2. Для изучения белок-белкового взаимодействия разработана новая модельная система, представленная антигенами А, В и анти-А-, анти-В- антителами. В различных условиях экспериментов in vitro методом молекулярного зондирования препаратом силистронг выявлены характерные особенности глико-протеина А и гликопротеина В.

3. Различия в конформационно-реакционных свойствах гликопротеина А и гликопротеина В, проявившихся в результате действия силистронга. Визуализация комплексов антиген-антитело методами проточной цитофлуориметрии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Научная новизна

Получены новые данные, которые служат основанием для индивидуализации параметров азотистого обмена, спектра белков плазмы крови по групповой принадлежности. Разница выявленных показателей, их ассоциированность с группой крови, позволила дифференцировать протеом, характерный для лиц типа А и В, содержащих соответственно гликопротеин А А(П) группы крови и В - B(III) группы крови на эритроцитарной мембране.

Характерно, что в группе обследованных типа А самое низкое содержание ' альбумина, что свидетельствует о слабом уровне неспецифической защиты. Выявленный низкий уровень Ig А служит показателем незащищенности слизистых, доступности для организма различных бактериальных агентов. Подтверждением множественных контактов организма с патогенами является самое значительное содержание Ig G.

В противоположность этому тип В, т.е. носители В(Ш) группы крови, характеризуются самым низким уровнем Ig М, Ig G, что свидетельствует об

отсутствии иммунологической памяти о контакте с патогенами. Чистоту эндэкологии в группе лиц В типа характеризует низкое содержание С-реактивного белка.

В качестве модели для изучения белок-белкового взаимодействия, оценки динамики этого процесса в интактных условиях и под влиянием биологически активных веществ нами впервые использована антиген-антительная система группы крови ABO, а флаволигнансодержащий препарат силистронг в качестве фактора биозондирования. Установлено, что преимущественной мишенью для силистронга является гликопротеин А. Препарат замедляет узнавание и взаимодействие антигена с антителом, удлиняет время наступления агглютинации. Для гликопротеина В этот эффект не характерен. Моноклональные анти-А и анти-В антитела модифицируются силистронгом, что. увеличивает время белок-белкового взаимодействия с соответствующими антигенами. Установлены группоспецифические отличия реакции системы А(П) группы крови на воздействие силистронга: удлинение времени наступления агглютинации с гликопротеином А(П) группы крови и снижение степени агглютинации естественных анти-В антител, инертность системы В(Ш) группы крови - гликопротеина В и анти-А антител.

Получены новые данные, свидетельствующие о том, что белки плазмы крови у лиц 0(1) - AB(IV) групп крови отличаются по физико-химическим свойствам, о чем свидетельствуют результаты проведения капиллярного электрофореза. Выявлены отличия белкового спектра у обладателей А(П) группы крови: установлено наиболее высокое содержание фракции у-глобулинов, а у лиц с B(III) группой крови более низкий уровень al-, |3-глобулинов, у-глобулинов, что подтверждено нами результатами исследований биохимических показателей. Силистронг также по-разному меняет электрофоретическую подвижность белков плазмы крови лиц 0(1) - AB(IV) групп крови, выявлено изменение распределения белков плазмы крови по фракциям: перераспределение фракции р-, у-гЛобулинов, «слияние» фракций (51- и р2-глобулинов. Установлены группоспецифические особенности влияния силистронга на белки плазмы крови - у людей А типа происходит перераспределение фракции al-и (¡¿-глобулинов.

Нами впервые использовано два высокотехнологичных метода исследования - проточная цитофлуориметрия и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия для качественной и количественной оценки антиген-антительных комплексов. Наибольшее влияние силистронг оказал на взаимодействие гликопротеина А с моноклональными анти-А антителами, мечеными флуоресцеинизотиоционатом, тогда как количество антиген-антительных комплексов, образованных гликопротеином В и моноклональными анти-В антителами, мечеными флуоресцеинизотиоционатом, осталось неизменным.

Блок полученных результатов является новым фактическим материалом, характеризующим особенности белок-белкового взаимодействия у лиц А и В типов, раскрывающим молекулярные механизмы, лежащие в основе

способности лиц типа А активно взаимодействовать с ксенобиотиками и патогенами.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты, полученные в работе, имеют теоретическое и практическое значение. Выявленные группоспецифические особенности состава белков плазмы крови, продуктов катаболизма азотсодержащих соединений, специфика изменений белковых фракций сыворотки под влиянием силистронга особенности межмолекулярного взаимодействия гликопротеина А, В с анти-В и анти-А антителами, модифицированных силистронгом, что является фактическим материалом для обоснования генетически детерминированной ассоциированности группоспецифических антигенов с характером белкового спекла крови, метаболомными признаками, формирующими биологический тип А и В в соответствии с презентированным антигеном А и В.

Данные о характере белок-белковых взаимодействий антигенов и антител лиц А типа с флаволигнансодержащим препаратом силистронг в различных вариантах модельных экспериментов существенно отличаются от реакции системы, определяющей принадлежность к В типу, что раскрывает молекулярные предпосылки взаимодействия с различными патогенами экотоксикантами, приводящими к высокой заболеваемости лиц А(И) группы крови по сравнению с носителями B(III) 1рУппы крови. Эти данные позволяют проводить скрининг населения по групповой принадлежности, акцентируя внимание на лицах А(И) группы крови, формировать группы повышенного риска для проведения превентивных, персонализированных мер профилактики

Такой подход предполагает целесообразность составления индивидуального группоспецифического «паспорта здоровья» лиц А и В типа для повышения информативности диагностических процедур на доклинической стадии развития патологии и при мониторинге эффективности лечения.

Разработанная нами модель с визуализируемой качественной и количественной оценкой динамики межбелкового взаимодействия является продуктивным объектом для изучения межмолекулярного взаимодействия тестирования индивидуального ответа на действие биологически активных' веществ, лекарственных- препаратов, различных ксенобиотиков -экотоксикантов.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты диссертационного исследования используются в работе клинико-диагностической лаборатории ГБУЗ СО «Самарская городская поликлиника № 3»; в учебном процессе кафедры фундаментальной и клиническом биохимии с лабораторной диагностикой ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; кафедры биологической химии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; кафедры биологической химии с курсом медицинской фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО «Красноярский

государственный медицинский университет имени профессора В.Ф.Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Получены патенты:

•Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2010611397 от 2010 г.

• Патент на изобретение № 2484480 «Способ оценки действия биологически активных веществ на антиген-антительное взаимодействие» от 10 июня 2013 г.

Конкурсная поддержка исследования

Данная работа выполнена при поддержке гранта «У.М.Н.И.К.», проект № 8/14261 «Разработка группоспецифического метаболического,

иммунологического паспорта в прогнозировании и диагностике заболеваний»; губернского гранта в области науки и техники за II полугодие 2012 г. «Способ визуализации антиген-антительного взаимодействия методом конфокальной микроскопии»; гранта РФФИ, проект 13-04-9712 «Модель визуализации белок-белкового взаимодействия».

Публикации

Соискатель имеет 20 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 20 научных работ общим объёмом 44 печатных листа, в том числе 5 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций. Соискателю выдан 1 патент, 1 свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ. 12 работ опубликовано в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 165 страницах машинописного текста, иллюстрированы 33 таблицами и 40 рисунками, состоят из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав собственных данных, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 368 источников, из них 169 - отечественных и 199 -зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследования проводились на кафедре фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России, клинико-диагностической лаборатории Клиник СамГМУ.

Под наблюдением находилось 1300 практически здоровых лиц в возрасте 19,6±1,5 лет, их клиническое состояние здоровья подтверждалось отсутствием обострения хронических соматических заболеваний, а также латентных

вирусных инфекций путем тестирования образцов крови на вирусные гепатиты В и С, ВИЧ-инфекцию. Распределение групп крови по системе АВО в группе обследуемых было следующим: с 0(1) группой крови - 390 человек (30,0%), А(И) группой крови - 445 человек (34,2%), В(Ш) - 327 человек (25,2%), AB(IV) группой крови -138 человек (10,6%).

В крови обследуемых определяли содержание показателей белкового обмена: общего белка, альбумина, мочевины, креатинина, мочевой кислоты, иммуноглобулинов A, G и М, активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы на биохимическом анализаторе «Hitachi - 902», «Интегра 400» («Roche-Diagnostics», Япония). Электрофорез белков сыворотки и оценку влияния силистронга на физико-химические свойства белков проводили с помощью автоматической системы капиллярного электрофореза «MINICAP» («Sebia», Франция).

Моделью для изучения белок-белкового взаимодействия служила антиген-антительная система АВО. В качестве внешнего стимула был выбран силистронг - средство метаболической коррекции, разработанный коллективом кафедры фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России (Патент РФ № 2112020; ФСП 42-0211-070301), внесен в реестр лекарственных средств РФ (регистрационное удостоверение Р № 000605/01 от 23.08.2001).

Были проведены три серии экспериментов: преинкубация силистронга с гликопротеинами А и В эритроцитов; моноклональными антителами («Эритротест», Россия); изогемагглютининами плазмы на автоматическом анализаторе «Хемос СП II» («BIO-Rad», США) с использованием стандартных эритроцитов («ReversCell», США). О степени влияния силистронга на антиген-антительное взаимодействие судили по двум параметрам: изменению степени и скорости наступления агглютинации.

Визуализацию антиген-антительного взаимодействия осуществляли на проточном цитофлуориметре «FACSCalibur» («BecktonDickinson», США) с использованием моноклональных анти-А и анти-В антител, меченых флуоресцеинизотиоционатом (FITC) («SantaCruzBiotechnology» США); с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, реализованной при помощи экспериментального стенда, состоящего из конфокального микроскопа Olympus IX 71 («Olympus», Япония), сканирующего блока и лазерного комбайна («ANDOR», Япония). Анализ данных интенсивности флуоресценции (FITC) осуществляли с помощью компьютерной программы Europe Medical Biological Image (2011).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью статистической программы SPSS 12.0, «ANOVA». Определяли среднее арифметическое (М), стандартную ошибку средней арифметической (m), медиану (Me), 95% доверительный интервал. Для оценки достоверности использовался t-критерий Стьюдента. Для сравнения здоровых лиц по группам крови применяли однофакторный дисперсионный анализ. Показатели со

скошенной формой распределения (С-реактивный белок, аспартатаминотрансфераза) предварительно логарифмировали для симметризации закона распределения. Апостериорные сравнения групп (попарные тесты) проводили методом Тьюки (Гланц С., 1999; Платонов А.Е., 2000; Мидлтон М.Р., 2005; Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., 2006). В случае если получаемые распределения значений изучаемых показателей отличались от классического Гауссовского распределения, для сравнения статистик двух выборочных распределений применяли непараметрические методы сравнения: критерий Колмогорова-Смирнова с поправкой Лилиефорса и Шапиро-Уилки. Критическое значение уровня значимости принимали равным 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Были изучены показатели белкового обмена в крови лиц 0(1)-АВ(1У) групп крови, определены тенденции, характеризующие их биологическую вариабельность, выделены параметры, ассоциированные с групповой принадлежностью крови (таблица 1). Установлены следующие особенности метаболического профиля.

У лиц с 0(1) группой крови обнаружено более высокое содержание общего белка, а- и Р- глобулинов по сравнению с генеральной совокупностью. По-видимому, эти данные отражают напряжение неспецифических защитных механизмов, системы антипротеазных ингибиторов, опсонинов, участвующих в формировании острофазного ответа. Интенсивный обмен азотсодержащих соединений характеризует преобладание мочевины.

В крови обладателей А(П) группы крови выявлено наибольшее содержание фракции у-глобулинов, в этой фракции белков преобладает - ^ С, что свидетельствует о большем напряжении иммунной системы.

Для представителей В(Ш) группы крови характерен более низкий уровень общего белка, а1-, р- глобулинов, повышенный уровень альбумина по сравнению с генеральной совокупностью. В крови лиц с В(Ш) группой крови установлен самый низкий уровень 1ц в и ^ М, что свидетельствует о низком уровне иммунологической памяти (Ройт А. и соавт. Иммунология. М.: «Мир», 2000. 592 е.; Бурместер Г.-Р. и соавт. Наглядная иммунология. М. : «Бином», 2009. 320 е.).

У лиц с АВ(1У) группой крови выявлено более низкое содержание а2-, р-и у-глобулинов, что, вероятно, указывает на меньшую антипротеиназную активность белков плазмы крови.

Выявлена ассоциированность направленности белкового обмена у мужчин и женщин с 0(1) - АВ(1У) группами крови. У лиц со А(П) группой крови наиболее резко выражены тендерные отличия. Для обладателей В(Ш) группы крови как у мужчин, так и у женщин, характерно однонаправленное распределение показателей белкового обмена (рисунок 1).

У лиц с гликопротеином А более низкое содержание альбумина, мочевины, активность аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы. Преобладание мочевой кислоты служит показателем повышенного катаболизма Таблица 1 - Показатели белкового обмена в сыворотке крови клинически здоровых лиц 0(1) - АВ(1У) групп крови

Показатели Группы крови Генераль пая совокупное ТЬ

о® А(П) В(П1) АВ(1У)

Общий белок, г/л М±т 74,4±1,64 74,2± 1,3 7 72,8±1,51 73,7±1,19 73,8±0,76

Ме 72,2 73,1 71,6 75,3 73,1

95% 71,1-77,8 71,4-77,0 69,7-75,8 71,2-76,2 72,3 - 75,3

Альбу мины, % М±т 50,0± 1,03 51,8±0,72 54,6±0,92 Рн„=0,008 54,4±1,34 Р1_1У=0,031 52,4±0,51

Ме 50,8 52,7 54,3 53,6 52,8

95% 50,3- 53,3 52,6- 56,5 51,4- 57,6 51,4- 53,5 51,4-53,5

а1-глобули ны,% М±т 3,9±0,13 з,б±одз 3,5±0,13 3,7±0,24 3,6±0,07

Ме 3,93 3,56 3,45 3,68 3,58

95% 3,33 - 3,87 3,19 - 3,73 3,14 - 4,23 3,49 - 3,78 3,49 - 3,78

а2-глобули ны,% М±т 10,7±0,45 9,2±0,35 Рш =0,028 8,9±0,31 Рыи=0,01 8,6±0,4 3 Рыу =0,009 9,4±0,21

Ме 10,89 8,95 8,85 7,85 9,06

95% 9,76-11,70 8,51-9,98 8,24 - 9,56 7,57 - 9,53 8,98 - 9,84

Р- глобули ны,% М±т 16,3±1,03 16,0±0,59 15,0±0,66 15,1±0,85 15,7±0,38

Ме 16,16 15,02 14,85 14,93 15,09

95% 14,06-18,47 14,81-17,26 13,61- 16,43 13,08- 17,02 14,93-16,46

г- глобули ны,% М±т 19,1 ±0,91 19,4±0,55 18,0±0,55 18,2±0,74 18,8±0,34

Ме 19,07 19,59 18,77 17,30 18,79

95% 17,15-21,08 18,21-20,51 16,87-19,24 16,50- 19,90 18,12-19,50

г/л М±т 4,02±0,40 3,03±0,17 3,01±0,28 3,83±0,39 3,36±0,15

Ме 3,60 2,94 2,76 3,64 3,13

95% 3,19- 4,85 2,69- 3,38 2,45- 3,58 2,98-4,67 3,07- 3,66

18 0, г/л М±т 11,45±0,33 11,62±0,35 10,78±0,27 11,21±0,37 11,28±0,17

Ме 11,55 11,56 11,01 11,50 11,44

95% 10,75- 12,15 10,91-12,34 10,23-11,32 10,40- 12,01 10,94-11,62

г/л М±т 1,09±0,12 1,17±0,09 0,96±0,08 1,24±0,12 1,10±0,05

Ме 0,88 0,99 0,84 1,16 0,95

95% 0,84 - 1,34 0,99 -1,34 0,79-1,13 0,97-1,51 1,00-1,20

Мочев ина, ммоль/л М±т 5,28±0,22 4,66±0,22 4,72±0,25 4,54±0,27 4,81±0,12

Ме 5,3 4,6 4,5 4,1 4,8

95% 4,82 - 5,73 4,20-5,11 4,21 - 5,22 3,96-5,12 4,57 - 5,06

пуриновых пуклеотидов. О напряженности иммунной системы свидетельствует более высокий уровень а1, у - глобулинов, ^А, 1% О и М, что является молекулярной основой предрасположенности лиц со второй группы крови к развитию соматических и инфекционных заболеваний (Гребенщиков Л.В.

Значение групповой принадлежности крови в диагностике наиболее распространенных ЛОР-заболсваний: авгорсф. дис. ... канд. мед. наук. СПб., 2001, 23 е.; Гильямиярона Ф.Н. и соавт. Группы крови: биологическая вариабельность клеточного состава и метаболизма в норме и патологии. М.: «Известия», 2007, 490 е.; Кучеркж TI.H. Эритроцитарные антигены системы ЛВО и сердечно-сосудистый риск. Пермский медицинский журнал. 2009, Т. 26, № 4. С. 90 - 94; Fry А.Е. et al. Common variation in the ЛВО glycosyltransferase is associated with susceptibility to severe Plasmodium falciparum malaria. Human Molecular Genctics. 2008, Vol. 17, № 4; Reid M.E. From DNA to blood groups, lmmunohematology. 2008, № 24(4). P. 166-169).

ЛлЛТ

AMI

В(1П) AB(IV)

Рисунок 1 - Отклонения от генеральной совокупности показателей белкового обмена у мужчин и женщин с различными группами крови (100% - генеральная совокупность)

При оценке протсинограмм лиц с 0(1) - AB(IV) группами крови установлено, что картина белкового спектра очень близка у представителей различных групп крови, однако обращает внимание, что у обладателей Л(И) группы крови наиболее высокое содержание фракции у-глобулииов, а у ли« с В(Ш) группой крови более низкий уровень al-, Щ у-глобулинов, что подтверждено нами результатами исследований биохимических показателей.

-Мужчины

Крмтмммм

-Жомщмны ¡tj^

Важными являются данные о влиянии силнстроига на физико-химические характеристики белков сыворотки кров« (рисунок 2). Методом капиллярного электрофореза установлено перераспределение фракций белков за счет изменения их физико-химических свойств. Общей закономерностью является уменьшение процентного содержания фракции р-глобулинов (р=0,04), увеличение содержания у-глобулинов (р=0,01), «слияние» фракций р1- и Р2-глобулинов. У лиц с гликопротенном А происходит перераспределение фракции а1- и а2-глобулинов. По-видимому, силиетронг переориентируя заряд молекулы, вызывает изменение изоэлектрической точки белков.

А(И)

ч..

} ^ /V /х __/ V».

В(1П)

Рисунок 2 - Электрофореграмма белков плазмы у лиц А(11) и В(Ш) фуппы крови а - исходное значение; б - под влия тем силнстроига

Следующим этапом нашего исследования стало детальное »пучение взаимодействия гликопротеннов А и В с моноклональнымн и естественными антителами на модели белок-белкового узнавания. Оценку влияния силистронга на антигеп-антительные комплексы проводили с учетом изменения степени и скорости наступления агглютинации. 11а» более подвержен воздействию силистронга гликопротеин А - время наступления агглютинации увеличилось на 75%. Гликопротеин В менее подвержен воздействию внешнего стимула (рисунок 3).

■ Глииопротеин А * Глмколротеии б

Кремч

До Поем

воздействия ютдейстоип

силистромгом силистронгом

Лр-0,01

Рисунок 3 - Влияние силистронга на гликоиротеины Л и В

Прсинкубання силистронга с моноклональнымн антителами выбывает увеличение времени наступления агглютинации и снижение ее степени в равном количестве у антн-А и анти-В антител (рисунок 4). Несколько другой эффект вызывает введение силистронга в систему естественных антител (рисунок 5). Под влиянием препарата анти-В антитела, циркулирующие в крови лиц с А(И) группой крови, снизили свою агглютинирующую способность на 75%, тогда как степень агглютинации анти-А антител, имеющихся у лиц с В(Ш) группой крови, снизилась на 16% по сравнению с исходным значением. Таким образом, снлистронг оказывает различное влияние на естественные и моноклональные антитела, что обусловлено их строением (Перехрсстенко П.М. с соавт., 2000; Рагнмова А.А. и соавт. Основы трансоузионной иммунологии. М. :МИА, 2004. 280 е.; Обухова, П.С. Специфичносп естественных анти-углеводных а1ггитсл человека в норме, авторсф. дне.... канд. хим. наук. М., 2011. 24 е.).

Степей» агтлютм* ацни

До В09 действия Пос»

силистронгом потдейстпия силистронгом

■ лиги-А антитела • анти-В антитела

Время агтлюти

До поздовстямя Поел* сипмстротом воздействия силистронгом

Степень агглютииа ции

До

■01ДСЙСТМЯ силистронгом

После »»действия силистронгом

Рисуиок 4 - Влияние силистронга на моноклональные антитела

В целом, введение снлистронга в систему антиген-антитело вызывает увеличение времени наступления агглютинации гликопротеина А с соответствующим антителом, и снижение ее степени у естественных анти-В-антнтел. По-видимому, выявленные отличия во взаимодействии гликопротеина А с антителами обусловлены особенностями их строения.

'•р=0,03

Рисунок 5 - Влияние силистронга на изогемагглютинины плазмы

Впервые с целью оценки белок-белковых взаимодействий гликопротеинов А и В со специфичными моноклональными коньюгированными антителами мечеными флуорссцсинизотиоционатом, применены современные высокотехнологичные способы визуализации: метол проточной цитофлуориметрии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

После инкубации гликопротеина А с силистронгом количество образующихся антиген-антительных комплексов увеличилось на 12%, что, вероятно, обусловлено улучшением взаимоузнавания антигена и антитела. В аналогичных условиях постановки эксперимента количество образующихся антигсн-антитсльных комплексов с гликопротеином В осталось неизмененным по сравнению с контролем (рисунок 6).

При анализе данных, полученных с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, установлено увеличение размеров и количества антиген-антительных комплексов у лиц с гликопротеинами А и В после действия силистронга. Размеры образованных иммунных комплексов А(Н) группы крови больше размеров комплексов В(Ш), как в исходном состоянии, так и после инкубации с силистронгом (рисунок 7, рисунок 8).

Далее нами была произведена оценка интенсивности флуоресценции комплексов антиген-антитело помощью компьютерной программы Europe Mcdical Biological Image. Установлено, что количество антиген-антительных комплексов, образованных гликопротеином А, возросло на 13% под влиянием силистронга. тогда как количество комплексов, образованных гликопротеином В, возросло на 3%. Полученные данные совпадают с результатами проточной цитофлуориметрии.

До воздействия силистронгом

После воздействия силистронгом

Я Анти-А антитела Анти-В антитела

л А'

Рисунок 6 - Визуализация антиген-антительного взаимодействия методом

проточной цитофлуориметрии

А - комплекс гликопротеина А с антителом (исходное);

А* - комплекс гликопротеина А с антителом, после действия силистронга;

В - комплекс гликопротеина В с антителом (исходное);

В' - комплекс гликопротеина В с антителом, после действия силистронга

Таким образом, совокупность данных, полученных с помощью методов визуализации с использованием экспериментальной модели белок-белкового взаимодействия демонстрирует различное восприятие гликопротеинами А и В внешних стимулов.

Рисунок 7 - Визуализация антигсн-антительных комплексов методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии:

А - гликопротеин А + антитело, меченое Р1ТС (исходное);

В - гликопротеин В + а1ггитело, меченое Р1ТС (исходное);

А' - гликопротеин А, инкубированный с силистронгом + антитело, меченое Р1ТС;

В' - гликопротеин В, инкубированный с силистронгом + антитело, меченое Р1ТС

Увеличение времени наступления агглютинации, снижение ее степени, полноты взаимодействия с антителом, а при более длительном воздействии силистронгом увеличение количества образующихся антиген-антительных комплексов глнкопротеина А и снижение степени агглютинации естественных анти-В антител обуславливают высокую чувствительность А(И) группы крови к внешним стимулам, что, по-видимому, является молекулярной предпосылкой к частому возникновению инфекционных заболеваний у данной группы лиц.

Рисунок 8 - Диаграммы пространственного распределения интенсивности флуоресценции (Р1ТС):

Л - гликопротеин А + антитело (исходное);

А' - гликопротеин А, инкубированный с снлистронгом + антитело;

В - гликопротеин В + антитело (исходное);

В' - гликопротеин В, инкубированный с снлистронгом + антитело

Гликопротеин В и соответствующие анти- А антитела менее восприимчивы к влиянию сипистронга, что проявляется менее значительным снижением времени наступления агглютинации, незначительным изменением степени агглютинации, а при более длительном воздействии знешнего стимула -практически константным количеством образующихся антиген-антительных комплексов. Полученные результаты раскрывают молекулярный механизм стабильности В(Ш) группы крови в восприятии экзогенных чужеродных веществ и объясняют высокую устойчивость лиц данной группы крови к вирусам и инфекционным агентам.

Выявленная нами ассоциированность группы крови с особенностями белкового обмена, ответной реакции на внешние стимулы раскрывает перспективы для развития нового направления индивидуализированной, предиктивной медицины. При этом группу крови человека можно рассматривать фактически как предиктор для донозологической диагностики ряда заболеваний и разрабатывать алгоритмы профилактических мер для сохранения здоровья населения.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены особенности белкового обмена, ассоциированные с АВО-групповой принадлежностью крови по показателям у клинически здоровых лиц с 0(1) - AB(IV) группами крови:

- 0(1) - более низкое содержание альбумина при высоком содержании а2-глобулинов и С-реактивного белка.

- А(Н) - более низкий уровень альбумина при более высоком у-глобулинов, Ig G.

- В (III) - более высокое содержание альбумина, более низкое содержание С-реактивного белка, al- и р-глобулинов, Ig G и Ig М, креатинина, мочевой кислоты.

- AB(IV) - низкое содержание а2-глобулинов, р- и у-глобулинов, при высоком содержании альбумина, креатинина, мочевой кислоты.

2. Под влиянием силистронга отмечено перераспределение фракций белков за счет изменения их физико-химических свойств. Общей закономерностью является уменьшение процентного содержания Р-глобулинов и увеличение у-глобулинов. Особенность реакции белков на силистронг заключается в увеличении фракции al- и а2-глобулинов у обладателей А(П) группы крови.

3. Разработана модельная система, представленная антигенами А и В, анти-А и анти-В антителами, для изучения белок-белкового взаимодействия. Выявлено адресное влияние силистронга на гликопротеин А, изменяющее межмолекулярное узнавание, что регистрируется удлинением времени агглютинации на 75% при снижении ее степени. На гликопротеин В силистронг существенного влияния не оказал.

4. В условиях эксперимента с естественными антителами выявлено снижение способности к агглютинации анти-В антител на 70%, что свидетельствует о высокой чувствительности антиген-антительной системы у обладателей А(П) группы крови. Агглютинирующая способность анти-А-антител снизилась на 16%, что свидетельствует о меньшей реакции на внешние стимулы антиген-антительной системы у носителей B(III) группы крови.

5. При визуализации антиген-антительных комплексов методами проточной цитофлуориметрии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с использованием моноклональных антител, меченных флуоресцеинизо-тиоционатом, выявлены отличия у носителей А и В антигенов. Под влиянием силистронга отмечено увеличение количества антиген-антительных комплексов, образованных гликопротеином А и моноклональными анти-А антителами, неизменное количество антиген-антительных комплексов с гликопротеином В.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендовать учитывать АВО-групповую принадлежность крови при проведении диагностических процедур и мониторинге эффективности лечения.

2. Разработанная нами молекулярная модель антиген-антительного взаимодействия может быть использована для тестирования широкого спектра веществ, обладающих биологической и фармакологической активностью.

3. Разработанная «Программа для импорта данных, полученных с биохимического анализатора COBAS INTEGRA 400 Plus» (Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2010611397 от 17 февраля 2012 г.) может быть использована в работе клинико-диагностических лабораторий при проведения биохимических исследований.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации

1. Гильмиярова, Ф.Н. Фундаментальные исследования молекулярных

признаков АВО-принадлежности, реализованных в показателях метаболизма и клеточного состава крови в норме и патологии/ Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, O.A. Гусякова, И.А. Зубова, A.B. Бабичев, Н.И. Гергель, JI.B. Виноградова, O.A. Кузнецова, ЮЛ. Мякишева, O.A. Кизирова, Е.А. Гамзова и др. //.Материалы Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии», посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица. - Челябинск. -2009.-С. 27-29.

2. Карслян, Л.С. Особенности скрининга донорской крови на ВИЧ-инфекцию/

Л.С. Карслян, И.А. Зубова, И.Ф. Сидорова, О.М. Родькина, O.A. Кизирова, Е.А. Гамзова и др.// Материалы ХП1 Международной научной конференции «Здоровье семьи в 21веке» - Хургада - Пермь. - 2009. - С. 187-191.

3. Карслян, Л.С. Повышение эффективности скрининга инфицированности

доноров вирусом гепатита С/ Л.С. Карслян, И.А. Зубова, О.М. Родышна, O.A. Кизирова, Ю.Д. Чинкова, A.A. Мингачева и др.// Труды научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете концепции развития здравоохранения России до 2020 года» - Москва. - 2009. - С. 229 -230.

4 . Гильмиярова, Ф.Н.Влияние малых молекул на процессы межмолекулярного взаимодействия, лежащие в оспове лигандных технологий лабораторной диагностики / Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, O.A. Гусякова, И.Ф. Сидорова, И.А. Зубова, Е.А. Рыськина, O.A. Кизирова, Т.Ю. Евсеева, Е.Е. Воронкова, С.И. Мурский, А.И. Габрильчак, О.М. Родькина, A.A. Мингачева, Ю.Д. Чинкова, Е.А. Гамзова, С.Г. Дзугкоев // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010, № 7.-С. 14-18.

5. Гильмиярова, Ф.Н. Метаболическое зондирование и компьютерное моделирование в изучении структурно-функциональных особенностей антигенов Н, А, В / Ф.Н. Гильмиярова, Е.А. Рыскина, В.М. Радомская, H.A. Бортникова, Е.А. Гамзова, A.A. Епифанова, Ю.В. Мякишева // Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований: материалы Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине. - Омск: Изд-во ОмГМА. - 2011. - с. 74-75

6. Гильмиярова, Ф.Н. Отличительные признаки антигенов системы ABO —

основа индивидуального ответа на различные стимулы / Ф.Н.

Гильмиярова, В.М. Радомская, Е.А. Рыскина, H.A. Бортникова, Е.А. Гамзова, A.A. Епифанова // Клиническая лабораторная диагностика. — №10, 20U.-C.3

7. Шахнович, Е.А. Влияние силистронга на процессы белок-лигандного

взаимодействия/ Е.А. Шахнович// Материалы докладов Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые - медицине», 2011. Самара. - с. 222 - 223

8. Гильмиярова, Ф.Н. Прогнозируемая биологическая активность антигенных

детерминант ABO системы крови / Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, H.A. Колотьева, Е.А. Шахнович, Н.С. Нефедова, Е.А. Рыскина, A.A. Епифанова, A.B. Бабичев И Альманах «Жизнь плюс наука». Интернализация и инновации. - Вып. 7. Самара: ООО «Книга». - 2011. - с. 24-28.

9. Колотьева, H.A. Модифицирующее влияние малых молекул на белок-

лигандное взаимодействие / H.A. Колотьева, Е.А. Шахнович, Н.С. Нефедова, Е.А. Рыскина, A.A. Епифанова, К.И. Колесова, O.A. Долгова // Тезисы II международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика». - Новосибирск. -2011.-c.211

10. Колотьева, H.A. Роль малых молекул в реализации белок-белковых взаимодействий / H.A. Колотьева, Е.А. Шахнович, Н.С. Нефедова, Е.И. Кобозева, Е.Д. Волков, Е.А. Рыскина // Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии: сборник трудов II Международной Интернет-конференции. - Казань: изд-во «Казанский университет». - 2012. - с.152-153

11. Шахнович, Е.А. Группоспецифические особенности лигандного взаимодействия под влиянием силистронга / Е.А. Шахнович, H.A. Колотьева, Н.С. Нефедова, Е.А. Рыскина, A.A. Епифанова, О.И. Мелешкина, O.A. Долгова, Е.И. Кобзева // Здоровье и образование в XXI веке. Инновационные технологии, модернизация, качество, доступность и безопасность лекарственных средств в системе здравоохранения современной России. Школа формирования принципов здорового образа жизни. - Москва.: РУДН. - 2011. - с. 510-511

12. Гильмиярова, Ф.Н. Метаболический профиль 0(1) - AB(IV) групп крови / Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, Е.А. Шахнович, Н.С. Нефедова, H.A. Колотьева, Е.А. Рыскина, A.A. Епифанова II Медицинский альманах.--2012. - № 1 (20) - с.174 -178.

13. Гильмиярова, Ф.Н. Оценка иммуногенетических особенностей донорской крови / Ф.Н. Гильмиярова, Е.А. Шахнович, H.A. Колотьева, Н.С. Нефедова, И.Ф. Сидорова, A.A. Епифанова, H.H. Гергель// Клиническая лабораторная диагностика. - 2012. - №9. - С. 42.

14. Гильмиярова, Ф.Н. Оценка полиморфизма ABO- и резус- систем крови доноров / Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, O.A. Гусякова, A.A.

Епифанова, Е.А. Рыскина, И.Ф. Сидорова, Е.А. Шахнович, H.A. Колотьева, Н.С. Нефедова, O.A. Николаева, A.A. Чудинова, Е.И. Кобозева // XVI Международная научная конференция «Здоровье семьи в XXI веке» Будапешт (Венгрия). -2012.-е. 70-72 15. Шахнович, Е.А. Оценка антиген-антительного взаимодействия с использованием флюорохромов/ Е.А. Шахнович //Материалы докладов Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые — медицине». - Самара, 2012. — с. 165 -166.

1 б. Чудинова, A.A. Может ли силистронг защищать глицеральдегид-3-

фосфатдегидрогеназу /A.A. Чудинова, Е.А. Шахнович, Е.Д. Волков, Е.И. Кобозева // Сборник трудов Ш международной Интернет-конференции. -Казань, 2013.-с. 321-323.

17 . Шахнович, Е.А. Визуализация лигандных свойств минорных компонентов

метаболизма при взаимодействии с каталитическими и рецепторными белками / Е.А. Шахнович, Н.С. Нефедова, A.A. Чудинова// Материалы I Всероссийской конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века». - Москва, 2012. - С. 205 - 206.

18 . Гильмиярова, Ф.Н. Минорпые компоненты метаболизма в регуляции белок-белковых взаимодействий / Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, Е.А. Рыскина, O.A. Гусякова, Н.А.Колотьева, Е.А. Шахнович, Н.С. Нефедова, A.A. Чудинова // Медицинский альманах. - 2013, № 2(26). - С. 181-184.

19. Мурский, С.И. Программа для импорта данных, полученных с биохимического анализатора COBAS INTEGRA 400 Plus / С.И. Мурский, O.A. Гусякова, И.А. Зубова, Е.Е. Воронкова, H.A. Бортникова, Е.С. Липатова, Е.А. Рыскина, Е.А. Гамзова и др. // Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2010611397 от 17 февраля 2012 г.

2 0. Гильмиярова, Ф.Н. Способ оценки действия биологически активных ве-

ществ на антиген-антительное взаимодействие / Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, Е.А. Шахнович, H.A. Колотьева, Н.С. Нефедова, A.A. Чудинова // Патент на изобретение № 2484480 от 10 июня 2013 г.

На правах рукописи

Шахнович Елена Александровна

ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛОК-БЕЛКОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С УЧЕТОМ ГРУППОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ

03.01.04-Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2013

Подписано в печать 24.05.2013 Формат бумаги 60x84/16. Объем издапия 1,0 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Заказ 987 Отпечатано в типографии ООО «Полиграф-Мастер» г. Челябинск, ул. Академика Королева, 26 тел./факс: (351) 281-01-64,281-01-65,281-01-66

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Шахнович, Елена Александровна, Челябинск

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

04201365255 На правах рукописи

ШАХНОВИЧ ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛОК-БЕЛКОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С УЧЕТОМ ГРУППОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ

03.01.04 — Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Ф.Н. Гильмиярова

Самара 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Антигены ABO системы крови: строение, особенности белкового и олигосахаридного компонентов

1.2 Биологические свойства флавоноидов

1.3 Рецепторы: классификация, особенности строения и взаимодействия с лигандом

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Общая характеристика объектов исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1 Биохимические методы исследования

2.2.2 Определение группы крови по системе ABO

2.2.3 Антиген-антительная система ABO -модель изучения белок-белкового взаимодействия

2.2.4 Методы визуализации антиген-антительного взаимодействия

2.2.4.1 Проточная цитофлуориметрия

2.2.4.2 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

2.2.5. Статистическая обработка результатов исследований

Глава 3 ПОКАЗАТЕЛИ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА, СООТНЕСЕННЫЕ СРАЗЛИЧНЫМ ГРУППАМ КРОВИ

Глава 4 ВЛИЯНИЕ СИЛИСТРОНГА И ЕГО КОМПОНЕНТОВ НА ГЛИКОПРОТЕИНЫ АИВ

Глава5 ВИЗУАЛИЗАЦИЯ АНТИГЕН-АНТИТЕЛЬНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

Стр. 4

24 30

39 42

46 50

5.1. Визуализация антиген-антительного 87 взаимодействия методом проточнойцитофлуориметрии

5.2. Визуализация антиген-антительного 94 взаимодействия методом

конфокальной микроскопии

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 104

ВЫВОДЫ 116

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 118

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 119

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.

В литературе представлены разрозненные, несистематизированные сведения о предрасположенности к определенным соматическим и инфекционным заболеваниям лиц с различной АВО-групповой принадлежностью крови [26, 7, 143, 29, 35, 104, 23, 51, 68, 28, 246, 215, 315]. Молекулярная сущность этих явлений недостаточно аргументирована, в связи с этим создание теоретической базы данных о функциональной специфике антигенов системы ABO будет основой для выяснения причин индивидуальной реакции на экзогенные и эндогенные факторы обладателей различных групп крови, что имеет важное значение для развития превентивной медицины.

Немногочисленны сведения о структурной организации и функциях антигенов ABO системы. Известно, что детерминантной группой антигенов являются N-ацетилгалактозамин у антигена А и галактоза у антигена В [364. 360, 204, 348, 302]. Генный локус системы Н, предшественника антигенов

ABO, расположен на 19 хромосоме в позиции 19ql3.3 и кодирует синтез каталитического белка а1,2-фукозилтрансферазы, переносящей остатки фу козы на терминальную галактозу [101, 319, 224, 315, 289]. Гены белков, отвечающих за образование ABO системы антигенов, располагаются на 9 хромосоме в позиции 9q34.1 - 9q34.2 [126, 157, 20, 352, 221]. Кодируемые ими белки обладают гликозилтрансферазной активностью, обеспечивая доставку УДФ-N-ацетилгалактозамина, формируя гликопротеин А, или галактозы к терминальной фукозе, формируя гликопротеин В [74, 38, 364, 179, 203, 225, 186, 278, 200, 274]. Тем самым формируются фенотипы А и В [246]. Отсутствуют данные о поведении антигенов ABO системы как биомолекул, интеграция этих структур в каскад метаболических и физиологических процессов в организме.

Настоящее исследование выполнено в рамках Федеральной программы:

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать показатели белкового обмена практически здоровых лиц O(I) - AB(IV) групп крови, выявить ассоциированность направленности метаболизма с определенной группой крови.

3. Изучить действие силистронга на антиген-антительную модельную систему в условиях in vitro, используя в качестве объектов гликопротеи-

ны А и В и моноклональные антитела, охарактеризовать скорость наступления и степень агглютинации.

Методология и методы исследования.

Работа включала несколько этапов:

1. Определение показателей белкового обмена у 1300 лиц практически здоровых лиц в возрасте 19,6±1,5 лет, проживающих на территории Самарской области с O(I) -AB(IV) группами крови.

2. Оценка влияния силистронга на физико-химические свойства белков сыворотки крови здоровых лиц со А(И) (п=100) и В(Ш) (п=100) группами крови методом капиллярного электрофореза.

3. Изучение реакции системы антиген-антитело в различных условиях эксперимента, используя в качестве объектов гликопротеины А (п=60) и В(п=60), моноклональные антитела (п—60), естественные антитела (п=60).

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора.

обработки материалов с помощью пакета компьютерных программ SPSS 12.0, «ANOVA».

Результаты исследований были представлены на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии», посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица (Челябинск, 2009); XIII Международной научной конференции «Здоровье семьи в 21 веке» (Хургада, 2009); научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 2009); II международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, 2011); Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине «Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (Омск, 2011); научно-практической конференции «Обеспечение доступности современных клинических лабораторных исследований: аналитические возможности, клинические потребности, организационно-экономические условия» (Москва, 2011);Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые - медицине» (Самара, 2011, 2012); Международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2011, 2012); научно-практической конференции «Реальные клинико-диагностические лабораторные услуги: степень соответствия стандартам лабораторной медицины, качество, себестоимость и цена» (Москва, 2012); XVI международной научной конференции «Здоровье семьи в XXI веке» (Будапешт, 2012); I Всероссийской конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012); совместном заседании Самарского отделения Всероссийского биохимического общества, кафедры фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой и

кафедры общей, бионеорганической и биоорганической химии ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Самара, 2013).

Личное участие автора в получении научных результатов, изложенных в диссертации, состояло в проведении научно-информационного поиска, анализа и обобщения данных литературы по профилю диссертационного исследования, формулировке цели и задач; проведении определения показателей белкового обмена, групповой принадлежности крови у 1300 клинически здоровых лиц, экспериментов in vitro по оценке влияния препарата силистронг на физико-химические свойства белков, серии модельных экспериментов по изучению белок-белкового взаимодействия in vitro, визуализации антиген-антительных комплексов методами проточной цитофлуориметрии, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Автором лично получены все первичные данные, самостоятельно произведена статистическая обработка материала, сформулированы положения, выносимые на защиту, выводы и выводы и практические рекомендации, написан текст диссертации.

Положения, выносимые на защиту:

1. Направленность белкового обмена, ассоциированная с АВ0-групповой принадлежностью крови. Для носителей антигена А - низкое содержание альбумина при высоком уровне у-глобулинов, Ig G, свидетельствующем о напряжении специфического иммунитета. Для носителей антигена В - высокое содержание альбумина при низком уровне Ig G, Ig М и конечных продуктов азотистого обмена.

2. Для изучения белок-белкового взаимодействия разработана новая модельная система, представленная антигенами А, В и анти-А-, анти-В- антителами. В различных условиях экспериментов in vitro методом молекулярного зондирования препаратом силистронг выявлены характерные особенности гликопротеина А и гликопротеина В.

3. Различия в конформационно-реакционных свойствах гликопротеина А и гликопротеина В, проявившихся в результате действия силистронга. Визуализация комплексов антиген-антитело методами проточной цитофлуори-метрии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Научная новизна. Получены новые данные, которые служат основанием для индивидуализации параметров азотистого обмена, спектра белков плазмы крови по групповой принадлежности. Разница выявленных показателей, их ассоциированность с группой крови, позволила дифференцировать протеом, характерный для лиц типа А и В, содержащих соответственно гли-копротеин А А(П) группы крови и В - В(Ш) группы крови на эритроцитар-ной мембране.

Характерно, что в группе обследованных типа А самое низкое содержание альбумина, что свидетельствует о слабом уровне неспецифической защиты. Выявленный низкий уровень Ig А служит показателем незащищенности слизистых, доступности для организма различных бактериальных агентов. Подтверждением множественных контактов организма с патогенами является самое значительное содержание Ig G.

В противоположность этому тип В, т.е. носители В(Ш) группы крови характеризуются самым низким уровнем Ig М, Ig G, что свидетельствует об отсутствии иммунологической памяти о контакте с патогенами. Чистоту эндэк-ологии в группе лиц В типа характеризует низкое содержание С-реактивного белка.

ния агглютинации. Для гликопротеина В этот эффект не характерен. Мо-ноклональные анти-А и анти-В антитела модифицируются силистронгом, что увеличивает время белок-белкового взаимодействия с соответствующими антигенами. Установлены группоспецифические отличия реакции системы А(П) группы крови на воздействие силистронга: удлинение времени наступления агглютинации с гликопротеином А(П) группы крови и снижение степени агглютинации естественных анти-В антител, инертность системы В(Ш) группы крови гликопротеина В и анти-А антител.

Получены новые данные, свидетельствующие о том, что белки плазмы крови у лиц 0(1) - АВ(1У) групп крови отличаются по физико-химическим свойствам, о чем свидетельствуют результаты проведения капиллярного электрофореза. Выявлены отличия белкового спектра у обладателей А(И) группы крови: установлено наиболее высокое содержание фракции у-глобулинов, а у лиц с В(Ш) группой крови более низкий уровень а1-, (3- глобулинов, у-глобулинов, что подтверждено нами результатами исследований биохимических показателей. Силистронг также по-разному меняет электро-форетическую подвижность белков плазмы крови лиц 0(1) - АВ(1У) групп крови, выявлено изменение распределения белков плазмы крови по фракциям: перераспределение фракции (3-, у-глобулинов, «слияние» фракций (31- и (32-глобулинов. Установлены группоспецифические особенности влияния силистронга на белки плазмы крови - у людей А типа происходит перераспределение фракции а1- и а2-глобулинов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты, полученные в работе, имеют теоретическое и практическое значение. Выявленные группоспецифические особенности состава белков плазмы крови, продуктов катаболизма азотсодержащих соединений, специфика изменений белковых фракций сыворотки под влиянием силистронга, особенности межмолекулярного взаимодействия гликопротеина А, В с анти-В и анти-А антителами, модифицированных силистронгом, что является фактическим материалом для обоснования генетически детерминированной ассоциированности группоспецифических антигенов с характером белкового спектра крови, ме-таболомными признаками, формирующими биологический тип А и В в соответствии с презентированным антигеном А и В.

Результаты о характере белок-белковых взаимодействий антигенов и антител лиц А типа с флаволигнансодержащим препаратом силистронг в различных вариантах модельных экспериментов существенно отличаются от реакции системы, определяющей принадлежность к В типу, что раскрывает молекулярные предпосылки взаимодействия с различными патогенами, эко-токсикантами, приводящими к высокой заболеваемости лиц А(П) группы крови по сравнению с носителями В(Ш) группы крови. Эти данные позволяют проводить скрининг населения по групповой принадлежности, акцентируя внимание на лицах А(П) группы крови, формировать группы повышенного риска для проведения превентивных, персонализированных мер профилактики.

Такой подход предполагает целесообразность составления индивидуального группоспецифи�

Информация о работе

Шахнович, Елена Александровна
кандидата медицинских наук
Челябинск, 2013
ВАК 03.01.04

Диссертация

Характеристика белок-белкового взаимодействия с учетом групповой принадлежности крови - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы