Грибы рода Alternaria Nees на злаках: видовой состав и внутривидовое разнообразие

Ганнибал, Филипп Борисович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Грибы рода Alternaria Nees на злаках: видовой состав и внутривидовое разнообразие
ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Грибы рода Alternaria Nees на злаках: видовой состав и внутривидовое разнообразие"

На правах рукописи

ГАННИБАЛ Филипп Борисович

ГРИБЫ РОДА Alternaría Nees НА ЗЛАКАХ: ВИДОВОЙ СОСТАВ И ВНУТРИВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ

Специальность: 03.00.24 - микология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Сан кт-Петербург 2006

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте зашиты растений

Научный руководитель:

академик РАСХН, доктор биологических наук, профессор Левитин Марк Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Черепанова Нина Петровна

кандидат биологических наук Мироненко Нина Васильевна

Ведущее учреждение:

Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 9 февраля 2006 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 006.015.01

при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений по адресу: 196608, Санкт-Петербург - Пушкин, шоссе Подбельского, д. 3. Факс:(812)470 51 10 e-mail: vizrspb@mail333.com

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений

Автореферат разослан 28 декабря 2005 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Г. А. Наседкина

/юеба

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Род Alternaría представляет собой большую и разнообразную по биологическим характеристикам группу микромицетов, многие из которых распространены очень широко. Среди представителей этого рода известны виды с разной степенью паразитизма (от сапротрофов до био-трофов), уровнем специализации и своеобразными взаимоотношениями с растениями-хозяевами и другими организмами. Виды рода Alternaría часто обнаруживаются на злаках и считаются возбудителями чёрного зародыша и листовой пятнистости зерновых культур во многих странах мира Они способны «загрязнять» зерно своими метаболитами, токсичными не только для растений, но и для человека и животных (Тутельян, Кравченко, 1985) Однако слабая изученность и запутанность таксономии рода служит серьёзным препятствием для его изучения.

За последние 20 лет, благодаря работам американского миколога Э. Симмонса (Simmons, 1986, 1990, 1992, 1993, 2002), систематика рода Alternaría значительно продвинулась вперёд. Тем не менее, до сих пор распространены ошибки при идентификации видов, что отражается на представлении об их ареалах, субстратной приуроченности и других экологических характеристиках (Лёвкина, 2003). Поэтому крайне актуальным в настоящее время является уточнение видовой принадлежности представителей рода Alternaria, в частности приуроченных к злакам. Решение этой задачи облетают современные молекулярно-генетические методы исследований, успешно применяемые в систематике и популяционной биологии грибов (Taylor et al., 1999; Мироненко, 2004).

Цель исследований. Провести инвентаризацию видового состава грибов рода Alternaría, распространённых на растениях семейства злаковых (Роасеае) в разных регионах России, установить их таксономическое положение, филогенетические связи и внутривидовое разнообразие.

Задачи исследований. 1. Оценить распространение грибов рода Alternaría на зерновых культурах в различных регионах России.

2. Создать коллекцию чистых культур видов рода Alternaría.

3. Иденiифицировать виды с использованием традиционных и современных молекулярно-генетических методов.

4. Уточнить таксономический статус выявленных видов и их филогенетические связи с другими представителями рода, основываясь на морфологических, культуральных и молекулярно-генетических признаках.

5. Выявить доминирующие на злаках виды рода Alternaría и определить их ареалы.

6. Изучить полиморфизм доминирующих видов по патогенности, токсигенности и молекулярно-генетическим маркерам.

7. Провести анализ генетических различий ттространственно отдален-

Рос. НАЦИОНАЛЬНАЯ 1

ных популяции доминирующих ВИДОВ БИБЛИОТЕКА i

09 щь MWV J

Научная новизна работы. Впервые в России целенаправленно исследованы распространённые на злаках виды рода Alternaría и виды других фео-диктиоспоровых гифомицетов Проведена идентификация видов, основанная на современных работах по систематике этой группы грибов Из девяти обнаруженных нами таксонов (8 видов и один комплекс видов) идентифицированы два новых для России вида- A photistica Е. G. Simmons и Embellisia chla-mydospora [Hoes et al,] E G. Simmons. Для доминирующих видов впервые установлены границы ареалов в пределах России.

При инвентаризации видового состава грибов рода Alternaría, консор-тивно связанных со злаками, впервые использованы молекулярно-генетические методы, что позволило уточнить таксономический статус видов и их филогению.

Впервые исследована и охарактеризована структура популяций А tenuissima [Fries] Wiltshire. Определены генетические дистанции между тремя географически разобщенными популяциями этого вида, установлена степень изоляции, генное и генотипическое разнообразие.

Практическая значимость. Впервые сконструированы праймеры для идентификации комплекса видов A infectoria с использованием полимераз-ной цепной реакции (ПЦР), установлена специфичность некоторых существующих праймеров. Усовершенствованные методы идентификации позволят эффективнее проводить мониторинг видового состава грибов и оценивать степень заражённости семян зерновых культур видами рода Alternaría.

Апробация работы Результаты исследований обсуждались на заседаниях Лаборатории микологии и фитопатологии ВИЗР и группы биотехнологии Центра защиты растений Норвежского института исследования сельскохозяйственных культур (Norwegian Crop Research Institute), а также были представлены на 9-и съездах, конференциях и семинарах: Первом съезде микологов России (Москва, 2002); Международном микологическом конгрессе (Осло, 2002); Первом всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2003); Всероссийском координационном совещании «Разработка биотически управляемых, устойчиво развивающихся агроэкосистем на основе защиты сельскохозяйственных культур» (Санкт-Петербург, 2003); Конференции молодых учёных «Микология и альгология - 2004» (Москва, 2004); Международном семинаре «New emerging mycotoxins and toxigenic fiingi in Northern Europe» (Санкт-Петербург, 2004); Международной конференции, посвящённой столетию с начала работы профессора А С Бондарцева в Ботаническом институте им. В. Л. Комарова РАН (Санкт Петербург, 2005); Конференции по защите растений «Вопросы менеджмента в защите растений и устойчивом земледелии: исследования, развитие и информационные системы» (Санкт-Петербург, 2005); Втором всероссийском съезде по защите растений (Санкт-Петербург, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Объём и структура диссертации Диссертация изложена на 158 страницах и состоит из введения, 5 глав, выводов, списка использованной литературы, включающего 248 работ (69 - на русском языке, 179 - на иностранных языках) и приложения. Текст дополняют 19 таблиц и 31 рисунок.

Место проведения исследований. Большая часть исследований проведена в Лаборатории микологии и фитопатологии Всероссийского НИИ зашиты растений. Некоторые разделы экспериментальных исследований были выполнены в Лаборатории физиологии растений и молекулярной биологии Университета г. Турку (Финляндия) и в группе биотехнологии Центра зашиты растений Норвежского института исследования сельскохозяйственных культур.

Работа выполнена при поддержке Российской академии сельскохозяйственных наук, Министерства науки Норвегии (персональный грант № Rus03/04-89), Финского научного фонда CIMO (персональный фант № ТМ-04-2097) и международного научного фонда NordForsk (Nordic) (гранты №№ FIN 11 и 040291).

Автор выражает свою искреннюю благодарность доктору Е. G. Simmons за предоставленные штаммы, доценту Т. Yli-Mattila и доктору S. Klems-dal за помощь, оказанную при проведении молекулярно-генетических исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава I. Обзор литературы

Обсуждается современное состояние исследований по таксономии и филогении рода Alternaría, рассмотрены существующие подходы и методы изучения таксономии и идентификации видов. Приведён аннотированный список видов Alternaría, когда-либо обнаруженных на злаках. Сделано заключение, что лишь 14 из 34 видовых эпитетов, встречающихся в литературе, являются легитимными и соответствуют видам приуроченным к злакам.

Приводятся данные по распространению отдельных видов Alternaría, их патогенности, токсигенности и внутривидовому разнообразию. Детально проанализирована информация, касающаяся альтернариозов зерновых культур.

Гпава 2. Материалы и методы

2.1. Сбор материала и изоляция грибов в чистую культуру. На наличие грибов рода Alternaría нами были проанализированы образцы более 50 видов растений различных семейств, собранные автором и присланные коллегами из 34 регионов России и некоторых других стран Евразии. Основная часть изученного материала - семена зерновых культур. Для определения заражён-

ности семян видами Alternaría было проанализировано по 100 семян из 76 образцов 11 видов злаков. Изоляцию грибов в чистую культуру осуществляли после стерилизации поверхности изучаемого материала Всего было получено и идентифицировано около 2500 изолятов. Экспериментальному изучению подверглись 178 моноконидиальных изолятов, выделенных нами, а также 16 репрезентативных штаммов из коллекций Э. Симмонса (Е. G. Simmons), ВНИИСХМ и CABI.

2.2. Идентификация видов. Для анализа микроморфологии изоляты культивировали на картофельно-морковном агаре (КМА) под люминесцентными лампами. Конидиальный аппарат просматривали под микроскопом (100х) непосредственно в чашках Петри. Для описания культуральных свойств изоляты выращивали в темноте на богатой питательной среде с дрожжевым экстрактом и сахарозой (YES). Идентификацию проводили, основываясь на публикациях Э. Симмонса (Simmons, 1971 ... 2002).

2.3. Молекулярно-генетические методы Для получения мицелия изоляты культивировали на картофельно-декстрозном агаре. Экстракцию ДНК из мицелия проводили смесью хлороформа с октанолом (Bulat et al., 1998) или с помощью набора реактивов Puregene DNA isolation kít D-600A (Gentra Systems, США).

Уточнение таксономии и идентификацию изолятов, выделенных из зерновых культур, проводили методами RAPD-ПЦР (полимеразная цепная реакция со случайными праймерами; Williams et al., 1990), УП-ПЦР (полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами; Булат и др., 1992, 1995) и AFLP (полиморфизм длин амплифицированных фрагментов; Vos et al., 1995). В каждом эксперименте использовали rio 30—50 изолятов разных видов Alternaría, включая репрезентативные штаммы Для проведения RAPD подобрали 3 праймера, для УП-ПЦР - 2, а для AFLP - 4 комбинации прайме-ров.

Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. Результаты анализа спектров ДНК записывали в виде бинарных (0/1 присутствие/отсутствие продукта ПЦР) матриц. Все эксперименты проводили в двух повторностях и для дальнейшего анализа использовали только воспроизводимые результаты.

Для анализа структуры популяций A tenuissima методом AFLP было взято 77 изолятов, выделенных из пшеницы и представляющих 3 географически отдалённых региона России: Ленинградскую область, Краснодарский и Приморский края. Для проверки субстратной специализации A tenuissima в опыт были включены ещё 24 изолята, выделенные из разных субстратов и регионов.

Специфичные к комплексу видов A infectoria праймеры были сконструированы нами на основе нуклеотидной последовательности участка ДНК, являющегося УП-ПЦР маркером. Дизайн праймеров осуществляли вручную, опираясь на соответствующие рекомендации (Sambrook, Russell, 2001; Singh,

Kumar, 2001), или с использованием online программы Primer3 (Rozen, Skaletsky, 1998). Состав реакционной смеси и регламенты ПЦР, подбирали, руководствуясь общепринятыми принципами (Innis, Gelfand, 1990)

Для анализа полиморфизма нуклеотидных последовательностей ITS (internal transcribed spacer) областей рибосомальной ДНК (рДНК) нами было секвенировано 29 изолятов и ещё 50 последовательностей взяты из Генбанка (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html).

2.4. Исследование физиологических свойств видов Alternaria. Для получения инокулюма изоляты выращивали на среде V-4 (Михайлова и др., 2002) под эритемными лампами. Для заражения пшеницы (Саратовская 29 и Ленинградка) и ячменя (Турингия) использовали метод отрезков листьев, сохраняемых в 0,004% водном растворе бензимидазола (Михайлова, Квитко, 1970). На листьях делали иглой по три прокола. Каждый набор листьев опры-

скивали суспензией, содержащей 1*10 конидий/мл, затем инкубировали во влажной камере при температуре 20°С. Первые сутки листья выдерживали в темноте, после - под люминесцентными лампами. Оценку результатов заражения проводили через 7 суток после инокуляции.

При исследовании фитотоксических свойств изолятов пользовались общими рекомендациями О. А. Берестецкого (1982). Изоляты выращивали в пробирках на поверхности 5 мл жидкой глюкозо-аспарагиновой среды в течение 7 суток. Тестирование фитотоксичности культурапьной жидкости (КЖ) 154 изолятов проводили на семенах пшеницы. Десять изолятов, показавших на семенах высокую токсигенность, были протестированы на листьях пшеницы и растений других семейств.

2.5. Обработка и анализ данных. Для дисперсионного анализа была использована компьютерная программа Statistica 6.1 (StatSoft Inc., 2004). Степень различий между популяциями A tenuissima из разных регионов оценивали с помощью индекса фиксации Райта (Fst) и генетической дистанции (D), используя компьютерные программы Arlequin 2.000 (Schneider et al., 2000) и Popgene 1.32 (Yeh et al., 1999), соответственно. Кластерный анализ проводили методом невзвешенного попарного арифметического среднего (UPGMA -unweighted pair group method with arithmetic means). Для построения дендро- и филограмм использовали программу Тгеесоп 3ЛЬ (Van de Peer, De Wächter, 1994). Координатный анализ (principle coordinate analysis, PCA) различий между популяциями был выполнен в программе GenAlEx 5.1 (Peakall, Smouse, 2001). Для оценки типа репродукции A tenuissima был подсчитан индекс ассоциации (1а), используя программу MultiLocus 1.2.2 (Agapow, Burt, 2001).

Для анализа нуклеотидных последовательностей использовали пакет компьютерных программ Lasergene 5.03 (DNASTAR, США). Для выравнивания последовательностей воспользовались алгоритмом Clustal W.

Глава 3. Видовой состав грибов рода Alternaría на злаках

3 1. Идентификация видов Подавляющее большинство изолятов Alternaría было отнесено к видам A alternata [Fries] Keissler, A tenuísima и комплексу видов A infectoria. Один изолят был идентифицирован как A photis-tica Е G Simmons, став, тем самым, первой находкой этого вида в России (рис. 1) Несколько изолятов представляли роды Embellisia, Stemphylmm и Ulocladium.

Под комплексом видов (видовой группой) у Alternaría понимают группу видов, имеющих сходные паттерны формирования цепочек конидий (Simmons, личное сообщение). Из-за сильной вариабельности признаков, идентификация изолятов, относящихся к комплексу A. infectoria, до вида зачастую не представляется возможной. Среди всех изолятов комплекса нам удалось выделить группу штаммов, стабильно формирующих короткие цепочки по 3-7 конидий или одиночные конидии; в дальнейшем их именовали «короткоцепочечными».

Разнообразие габитусов колоний изолятов р. Alternaría, выросших на среде YES было разделено на четыре базовых культурально-морфологических типа (КМТ): тип I (изоляты A. tenuissima) - колонии с хорошо развитым воздушным мицелием чаще серо-зелёных или зеленовато-жёлтых тонов, тип II (A. tenuissima) - колонии с густым высоким воздушным мицелием, в центре коричневые, по периферии - бесцветные, тип III (A alternata и A tenuissima) - тёмно-оливковые или тёмно-зелёные бархатистые колонии со слаборазвитым воздушным мицелием; тип IV (комплекса видов А infectoria) - колонии с обильным бесцветным или слабоокрашенным мицелием (розовый, жёлтый, серый или иных оттенков). Последний тип колоний мы разделили на три подтипа. Колонии одного из них отличались тёмным реверсом и выделением пигмента и были характерны для большинства «коротко-цепочечных» изолятов.

При проведении ПЦР с праймерами AAF2/AAR3, сконструированными для идентификации вида A. alternata (Konstantinova et al., 2002), образование продуктов происходило в случае амплификации ДНК изолятов видов A alternata, A. tenuissima и A arborescens и не происходило у изолятов вида A pho-tistica и комплекса видов A. infectoria.

Обе пары сконструированных нами праймеров (AinlF/Ain2R и Ain3F/Aín4R) оказались специфичны ко всем изолятам комплекса А infectoria Праймеры не амплифицировали ДНК штаммов других видов грибов. Более эффективной оказалась пара Ain3F/Ain4R, обеспечивавшая наибольший выход продуктов ПЦР.

Рис 1 Alternaríaphotistica• конидии (вверху) и габитус споруляции (внизу)

3 2. Уточнение таксономического положения видов и их филогении. Кластерный анализ, как данных RAPD, так и УП-ПЦР поделил все штаммы на две основные группы. Первый хорошо обособленный кластер включал всех представителей комплекса A infectoria. Второй кластер состоял из штаммов, идентифицированных нами как A. alternata и A. tenuissima. На ден-дрограмме, визуализирующей UPGMA-анализ данных RAPD, разница между видами A alternata и A. tenuissima не являлась очевидной. Дендрограмма, основанная на данных УП-ПЦР, показала более чёткие различия между всеми тремя группами штаммов. Кластеризация комбинированных данных RAPD и УП-ПЦР также распределила все штаммы по двум группам (генетическая дистанция 0,40). Штаммы A, alternata и A. tenuissima, делящие один кластер, оказались разделёнными на две чёткие подгруппы (дистанция 0,26).

Кластерный анализ полиморфизма штаммов по AFLP-профилям также выделил три группы (рис. 2). Только штамм A photistica кластеризовался отдельно от всех остальных. Виды A. alternata и A tenuissima образовали чёткие кластеры с дистанцией 0,47 и содержали соответствующие репрезентативные штаммы. Третья группа, включающая все штаммы комплекса A. infectoria, была отделена от остальных на уровне генетической дистанции 0,82. Внутри этого кластера каких-либо чётко обособленных групп выделить не удалось. Все штаммы довольно сильно отличались друг от друга - генетическая дистанция 0,28-0,62. Зачастую дистанция между разными штаммами комплекса A infectoria была выше, чем между кластерами «A alternata» и «А.

¡епи^ипа». Все три, включённых в анализ «короткоцепочечных» штамма, оказались объединены в единый субкластер.

В целом, приведённые выше результаты, полученные благодаря использованию молекулярно-генетических методов, совпали с результатами морфологической идентификации, подтвердив их корректность. Данные, полученные методами ЯАРЭ и УП-ПЦР, показали невысокую степень генетических различий между штаммами А гепишта и А акегпШа, поставив тем самым под сомнение целесообразность выделения этих таксонов в отдельные виды. Однако результаты АРЬР-анализа выявили значительную генетическую дистанцию между А 1ети$$[та и А аИегпШа, подтвердив необходимость разделения их на два самостоятельных вида. Учитывая, что при проведении АИЛ5, было проанализировано ббльшее количество маркеров (203), результаты этого эксперимента вполне достоверны.

363-0"И 161 211 363 III 355 ою FGS 14 016 45-> 041 157 120 452 041 107 01 I 507 140 50* 0<0 011-010 009 011 452-050 348-010 bGS 34-015 3-.6-О20 356-030 4S0-0II 414-011 457 071 •«— FCiS 17-ЦЫ 148 040 405 071 ЬОЬ 4К-092 153-010 266-041 457-0^0 161 01s 428-011 363 091 F.GS 27 193 K.S 41-050 EOS 41 1о2 EGS 38-132 146-060 3914)71 FGS 49-14' 455-031 DjS 29 ¡94 EGS 91-136

0 а

4 IB

3 S

й '8 »-i i S

Генетическая дистанция

Рис 2 Генетические дистанции между штаммами видов рода Alternaría, выведенные на основе данных AFLP Дерево получено методом UPGMA Числа над узлами ветвления означают процент случаев появления идентичных кластеров в 1000 повторно-стей. указаны только величины превышающие 50%

При помощи УП-ПЦР были получены спектры ДНК для 52-х штаммов комплекса A infectoria Из 92-х фрагментов, пригодных для учёта, полиморфным оказался 91 фрагмент (99%). Генетическая дистанция между некоторыми субкластерами внутри комплекса A infectoria, также как и при AFLP-анализе, была высокой (до 0,61). Не было обнаружено ни одной пары штаммов, имеющих идентичные гаплотипы (спектры ДНК). Опираясь на уровень генетической дистанции 0,30, считаемый обычно достаточным для отнесения изолятов к разным видам, 52 проанализированных методом УП-ПЦР штамма можно было бы разделить на 40 видов. Однако отсутствие каких-либо графически чётко обособленных кластеров препятствует, осуществлению объективной таксономической процедуры, основанной на полученных данных.

Анализ морфологических признаков (размер «кустиков» конидий, густота ветвления цепочек спор, длина вторичных конидиеносцев и культураль-ные признаки) тоже не позволил определить хиатус, разделяющий виды. Единственной более или менее обособленной группой, как и при анализе данных AFLP, оказались «короткоцепочечные» штаммы.

Характер графического отображения сходств штаммов друг с другом у комплекса A infectaría в целом соответствует виду (видам), испытывающему сильное влияние рекомбинации. Лишь часть дерева, состоящая из «коротко-цепочечных» штаммов, напоминала вид со смешанным (клонально-рекомбинационным) репродуктивным типом.

Расшифрованные нуклеотидные последовательности рДНК (около 500 п.н.) у штаммов A alternata, A. arborescens и A. tenuissima оказались почти идентичными и отличались только по 1-2 нуклеотидам, что подтверждает мнение (Serdani et al., 2002) о бесполезности секвенирования рДНК в целях изучения таксономии и филогении этой группы видов.

Большинство штаммов комплекса A infectoria также имели одинаковые или очень близкие последовательности рДНК, не позволяющие провести разработку подробной таксономической системы этой группы видов. Штаммы комплекса A. infectoria представляли собой отдельную от других видовых групп ветвь, внутри которой мы выделили три подгруппы (рис. 3). Первая и вторая генетически ближе друг к другу. Анализ морфологии штаммов, попавших в эти группы не выявил между ними чётких и стабильных различий. В третьей группе оказались все шесть секвенированных «короткоцепочеч-ных» штаммов. Нуклеотидные последовательности рДНК пяти из них, были абсолютно одинаковыми.

На дендрограмме, построенной по результатам анализа последовательностей ITS-областей, все четыре штамма, относящиеся к A photistica и Lewia avenicola (телеоморфа Alternaría sp.), образовали отдельную группу, заметно отстоящую от кластера «A infectoria». Три штамма из этой группы имели идентичные последовательности, а четвёртый отличался от остальных заменой все лишь одного нуклеотида Несмотря на упоминание вида A photistica в качестве члена комплекса A infectoria (Simmons, 1986), морфологически он

1 замена на 10 сайтов юо

100

A arborescens AF347033 A alternata AY751456 A tenuissima AY751455 U atrum AF229486 A radicina AF229473 jL aven/cola CABI 387429

73,

г;

100|

EGS 35-174 A photistica A dauciAF229468

Í "S

о 5

ьг о

99j 432-010 Alternaría sp '467-031 Alternaría Sp

100

9 e|

EGS 29-194 A oregonensis A trítierna AY154695 L. ethzedia AY278833

EGS 27-193 í. mfectoria

ч «o

s С m £ o o ф

a> hü

£ s

i-5 y

S. solani AY329214

Рис 3 Филогенетические отношения видов комплекса Alternaría mfectoria и других видов, выведенные на основе данных полиморфизма рДНК" Дерево получено методом neighbour-joining Числа над узлами ветвления означают процент случаев появления монофилетической группы в 1000 повторностей: приведены только величины, превышающие 50% I (ифрьг. указанные до названия вида, - номера штамма, после - учётные номера Генбанка

заметно отличается от прочих видов комплекса (более крупные конидии, часто образующие боковые вторичные конидиеносцы; формирование псевдоте-циев в условиях чистой культуры). Данные секвенирования участка генома подтверждают своеобразие этого вида.

Двадцать шесть штаммов комплекса A infectoria были сгруппированы на основе данных четырёх независимых исследований (культуральные свойства, УП-ПЦР, AFLP и секвенирования рДНК). После этого результаты группирования по разным признакам сравнили между собой и с морфологией изо-лятов. Все «короткоцепочечные» штаммы всегда попадали в отдельную группу и достаточно чётко отличались от прочих штаммов комплекса A infectoria Поэтому они могут быть описаны как отдельный таксон (вид9). Наибольшим сходством с нашими штаммами обладает только вид A eureka Е. G. Simmons (= Embellisia eureka Е. G. Simmons), хотя, вероятнее всего, «короткоцепочечные» штаммы относятся к новому для науки виду.

Результаты группирования остальных штаммов, основанные на разных признаках, были менее согласованными. Такое независимое комбинирование признаков у большинства штаммов комплекса A infectoria говорит о возможном наличии рекомбинационных процессов внутри этой группы

Филогенетические отношения видов Alternaría, выведенные на основании данных полиморфизма рДНК (рис. 3), согласовывались с результатами, полученными с помощью других ДНК-маркеров.

Абсолютное сходство нуклеотидных последовательностей рДНК в фуппе, включающей виды A alternata, A tenuissima и A arborescens, может свидетельствовать о небогатом эволюционном прошлом этих таксонов как самостоятельных видов. Вероятно, их дивергенция произошла относительно недавно.

Напротив, полиморфизм рДНК, наблюдаемый у комплекса видов A in-fectoria, вполне возможно, является отражением более солидного эволюционного возраста этого таксона. Кроме того, некоторые виды комплекса А infectoria сохранили способность к формированию половой стадии, в то время как большинство других видовых групп Alternaría её утратили Этот факт также показывает, что комплекс видов A infectoria является обладателем наиболее архаичных признаков среди Alternaría. Длинные вторичные кони-диеносцы, на наш взгляд, являются плезиоморфиями. Короткие апикальные и боковые вторичные конидиеносцы, способствующие быстрому формированию больших компактных групп спор, - апоморфии, а носители этого состояния признака A alternata и A tenuissima - эволюционно более молодые виды.

Глава 4. Распространение видов Alternaría на территории России, их агрессивность и токсигенность

4.1 Распространение видов. Большая часть изолятов была представлена видом A. tenuissima. Данный вид обнаруживался с высокой частотой на злаках и растениях из других семейств во всех исследованных регионах (табл. 1) Вид A alternata также был выявлен в различных регионах России, однако везде встречался спорадически.

Представители комплекса видов A infectoria чаще других мелкоспоровых видов встречались в самой западной части России - Калининградской области и государствах Европы (более 70% изолятов Alternaría), что согласуется с данными литературы (Andersen et al, 1996; Kosiak et al., 2004) Изоляты комплекса A infectoria (включая «короткоцепочечные») в значительном количестве были обнаружены в различных частях Европейской части России и Западной Сибири. Но из 454 дальневосточных изолятов (Приморский край и северо-восточная часть Китая) ни один не относился к комплексу A infectoria.

4.2 Заражённость семян злаков видами Alternaría. Процент семян злаков, заражённых Alternaría spp. варьировал в широких пределах (0-78%). В большинстве случаев в зерне преобладал вид A tenuissima В целом по России он был обнаружен в 93% образцов, причём частоты его встречаемости в Европейской части страны и на Дальнем Востоке отличались незначительно Изоляты A alternata были выделены из 13% образцов зерна, вероятность обнаружения вида также не зависела от географического фактора. Виды комплекса A infectoria не были найдены ни в одной из 13 партий зерна, выра-

щенного на Дальнем Востоке (Приморский край). Однако в Европейской части России этими вилами было заражено 78% образцов семян зерновых культур.

Таблица 1 Встречаемость мелкоспоровых видов рода Alternaría, в различных регио-

нах России и некото рых зарубежных странах

Происхождение Количество образцов растений /изолятов Доля разных видов среди всех изолятов рода Лкегпагш, %

штаммов A alternata A tenuissima Комплекс A infectoria

Западная Европа 17/158 1,9 22,8 75,3

Калининградская область 2/160 0,0 29,3 70,7

Северо-Запад 78 / 675 2,1 70,1 27,9

Центральный 16/251 0,4 71,3 28,3

Волго-Вятский 5/127 0,0 61,4 38,4

ЦЧП 16/46 0,0 76,1 23,9

Поволжье 22/58 0,0 86,2 13,8

Северный Кавказ 61 /744 0.3 67,:3 32,4

Урал 2/20 5,0 80.0 15,0

Западная Сибирь 21 /273 0.4 83,9 15.8

Дальний Восток 16/422 0,2 99.8 0.0

Китай (Харбин) 4/32 0,0 100,0 0.0

Таблица 2. Заражённость семян зерновых культур видами рода Alternaría в

различных регионах России и некоторых зарубежных странах

Происхождение штаммов Количество образцов Средняя заражённость видами Alternaría, %

Все A alternata + Комплекс

виды A tenuissima A infectoria

Норвегия 4 0.8 0.5 0,3

Финляндия 4 25,5 4,0 21,5

Калининградская область 2 34,5 11,0 23,5

Северо-Запад 16 17,1 12,6 4,5

Центральный 5 32,0 21.8 10,2

Волго-Вятский 5 29.4 19,6 9,8

Северный Кавказ 11 19,8 13,7 6,1

Западная Сибирь 13 14.6 11.6 3,0

Дальний Восток 13 23.7 23,7 0,0

Заражённость семян видами Alternaría (табл. 2) коррелировала с показателем встречаемости этих видов (ср. табл. 1). Будучи более низкой, в самых западных из исследованных районов (11%), средняя суммарная заражённость 1ерна двумя близкородственными видами A alternata и A tenuissima незначи-

тельно возрастала при продвижении на восток (рис 4) Заражённость семян видами комплекса A infectoria, наоборот, максимума достигала в западных областях (в среднем - 22%), и была очень низкой в Западной Сибири.

Сходными были результаты подсчёта заражённости зерна токсигенны-ми видами (A alternata + A tenuissima) Причём дисперсионный анализ выявил существенность влияния вида растения на заражённость. Сравнение заражённости зерна разных злаков видами комплекса A mfectoria показало почти те же тенденции, однако различия между средними оказались не существенными.

30 25

¡5 20

í 15

2 10 о.

то

Калининградская Европейская

область + юго- часть РФ

запад ----- ----

Финляндии В A tenuissima

Западная Сибирь

Дальний Восток

□ комплекс видов Л infectoria

Рис 4 Средняя заражённость зерна видами Alternaría в различных регионах.

4 3. Специализация и патогенность мелкоспоровых видов Alternaría.

Изоляты A tenuissima были выделены из 43 видов растений, относящихся к 16 семействам. В качестве хозяев вида A. alternata было отмечено 8 видов растений из 4-х семейств. Это указывает на отсутствие субстратной специализации у вышеозначенных видов Alternaría.

Виды комплекса A. infectoria также были выявлены на целом ряде различных растений. Однако в виду того, что данный комплекс, вероятно, представляет собой группу разнообразных видов, утверждать о наличии широкой специализации у каждого из них не представляется возможным. «Короткоце-почечные» изоляты были обнаружены на восьми видах злаков и одном растении из семейства аралиевые.

Очень часто разные виды Alternaría выделялись из семян и листьев пшеницы и других зерновых культур. Семена, заражённые разными видами Alternaría, прорастали без внешних аномалий и симптомов заболеваний, а проростки заражённых семян по размерам не отличались от проростков здоровых зерновок.

Инокуляция листьев пшеницы и ячменя спорами 68 штаммов разных видов феодиктиоспоровых гифомицетов во всех случаях не привела к заражению. Таким образом, несмотря на относительно высокую споровую нагрузку, все протестированные штаммы видов АИетапа, ЕтЬеИта, Я(ет-рку1\ит и \Jlocladium оказались не патогенными для молодых листьев разных сортов пшеницы и ячменя при заражении в условиях лаборатории.

4.4. Токсигенность мелокоспоровых видов АИегпаг1а. Наиболее токсигенными оказались виды А. аНегпсИа и А юашъз'та (табл. 3). Культуральная жидкость штаммов этих видов в среднем сильнее других снижали всхожесть и подавляли рост корней и проростков пшеницы. Почти все штаммы А акегпаш были высоко токсигенными (КЖ снижала скорость роста корешков на 70% и более). Протестированный набор изолятов А. ¡епиизюнз наполовину состоял из высокотоксигенных образцов, остальные обладали умеренной токсигенностью (подавление роста корешков на 4070%).

Культуральная жидкость лишь половины штаммов комплекса видов А. т/есГог1а обладала фитотоксичностью, причём среди них было обнаружено всего два высокотоксигенных штамма. Среди девяти протестированных «короткоцепочечных» штаммов шесть были умеренно токсигенными, а три -нетоксигенными.

Таблица 3. Фитотоксичность культуральной жидкости штаммов разных видов _грибов для семян пшеницы_______

Длины частей Доля

проростка, токсигенных

% к контролю штаммов, %

Виды Количество Всхожесть, S а

штаммов % к контролю Kopemoi к í- Е О и о Всего о 5 m В — 5 " о н о ¡a Р

Alternaría alternata 11 55,2 19,3 42,5 100,0 90,9

A tenuissima 96 63,2 29,7 48,0 96,9 50,0

Комплекс видов A infectoria 32 80,3 58.0 78.3 53,1 6,3

A photistica -+ Lewia avenicola 3 83,7 65,3 72,5 33,3 0.0

Embellisia chlamydospora 1 66,1 37,2 42,1 (100,0) (0,0)

Slemphyhum spp 4 79,7 51,7 58,1 50,0 25,0

l'locSadium spp 5 57,0 38.4 50,6 100,0 20.0

Глава 5. Структура географических популяций A. tenuissima

5.1. Сравнение популяций по фенотипическим признакам. Разные популяции A tenuissima отличались друг от друга по распространению в них изолятов того или иного КМТ. Нестабильность культуральных свойств не позволила провести расчёт показателей разнообразия и коэффициентов сходства популяций Данные позволяют лишь констатировать наличие разницы между дальневосточной и европейской популяциями вида.

Исследование набора изолятов A. tenuissima по признаку токсигенности (фитотоксичности культуральной жидкости) не выявило существенной разницы между популяциями.

5.2. Изучение структуры популяций по генетическим маркерам. В результате амплификации рестрикционных фрагментов (AFLP) было учтено 130 ПЦР-прояуктов (локусов), присутствовавших у штаммов A. tenuissima, из которых 117 (90%) оказались полиморфными. Три группы по 2-3 штамма имели абсолютно идентичные AFLP-паттерны.

Подсчёт индекса Райта (Fst) показал наличие достоверных (^=0,05) генетических различий между всеми тремя популяциями. Однако разница между Ленинградской и Краснодарской популяциями, была очень низкой (Fst =0,061). Значение индекса Райта, подсчитанное для сравнения группы изолятов с ячменя из Ленинградской области с ленинградской и краснодарской пшеничными популяциями, также отказалось близким к нулю. Степень генетических различий между дальневосточной и европейской группами популяций оказалась значительно более существенной (Fst=0,272). Таким образом, можно говорить о крайне слабой изоляции между субпопуляциями A. tenuissima внутри Европейской части России и о высоком уровне изолированности европейской популяции от дальневосточной Это видимо, напрямую связано с географической удалённостью регионов друг от друга и особенностями хозяйственной деятельности человека.

Кластерный анализ комбинированной матрицы данных объединил штаммы A. tenuissima в группы, соответствующие исключительно их географическому происхождению. Первая группа включала 63 штамма из Краснодарского края, Ленинградской области и других районов Европейской части России и содержала лишь два дальневосточных штамма. Второй кластер состоял из 34-х штаммов из Приморского края, Китая и одного штамма из Ленинградской области.

Двумерное распределение штаммов A tenuissima, полученное в результате координатного анализа (рис. 5), находилось в согласие с результатами кластеризации. Краснодарская и ленинградская популяции занимали несколько разные позиции, хотя частично и перекрывающиеся. Приморская популяция оказалась чётко отделена от европейских.

Было обнаружено несколько примеров, в которых штаммы из разных регионов Европейской части РФ имели идентичные или очень сходные AFLP-

■ ■ Л Ж

гч * • «

Е ■ - „

I о ■ ♦

I * ♦ 4 / {

& * л

О их ♦♦ « ♦ »

Ье£ л i * # ♦ /

■ л Ф *

xg л Популяции:

Приморская л Краснодарская ■ Ленинградская Координата 1 * Ленинградская, ячмень

Рис 5 Двумерное отражение результатов координатного анализа генетических дистанций между популяциями A tenuissima Данные получены методом AFLP.

профили. Эти факты говорят о возможном существовании миграции между регионами Европейской России.

Все исследованные популяции A. tenuissima имели относительно высокий показатель разнообразия генотипов. Большинство штаммов (94 из 101) имели уникальные AFLP профили. Только семь штаммов имели повторяющиеся гаплотипы (три гаплотипа). Вероятно, такое высокое генотипическое разнообразие является отчасти мнимым из-за большого количества исследованных локусов либо указывает на наличие рекомбинации, хотя половая стадия у данного вида не известна.

Была показана несущественная степень случайности ассоциации аллелей несцепленных генов для всего набора изолятов A. tenuissima (/д=1,53), равно как и для двух популяций (европейской и дальневосточной). Такое значение индекса ассоциации указывает на превалирование клонального типа репродукции A tenuissima, однако оно не настолько высоко, чтобы отрицать наличие рекомбинационных событий.

На наш взгляд лопуляционная структура A. tenuissima клональная, но ощущает воздействие некоторых процессов, заменяющих половую рекомбинацию и поддерживающих высокое генотипическое разнообразие. Такими процессами могут являться высокий уровень мутаций, митотическая рекомбинация и поток генов (Burdon, Silk, 1997). Однако гетерокариотическая стадия, необходимая для диплоидизации ядер и митотической рекомбинации, у видов Alternaría пока нб изучена (Воск et al., 2002), хотя её наличие вполне вероятно Ещё одним объяснением высокого генотипического разнообразия A tenuissima может являться широта занимаемой видом трофической ниши. Считается, что виды, приуроченные к разным местообитаниям, испытывают действие отбора в нескольких направлениях, что способствует сохранению разных генотипов (Дьяков, 2004).

Выводы

1. Среди представителей рода Alternaría, консортивно связанных со злаками, в микобиоте России преобладают широко специализированные мелкоспоровые виды A tenuissima, A alternata и комплекс видов A infectoria Впервые в России в семенах овса из Ленинградской области обнаружен вид A photistica.

2. На злаках выявлены близкие роду Alternaría виды: Embellisia chlamydospora (корни пшеницы, Краснодарский край), Stemphylium botryosum (листья и семена пшеницы, Европейская часть РФ, включая Кавказ), S vesi-carium (семена пшеницы, Северная Осетия и семена колосняка, Карелия), Ulocladium atrum (семена пшеницы, Ленинградская область и кукуруза, Украина) и U botrytis (семена костреца, Омская область; лисгья пшеницы и семена ячменя, Ленинградская область). Вид Е. chlamydospora обнаружен в России впервые.

3. Вид A tenuissima распространён повсеместно и выделяется из зерна с высокой частотой (93% образцов). Представители комплекса видов А infectoria широко распространены в Европейской части РФ (78% образцов зерна) и Западной Сибири (69%), но на Дальнем Востоке не выявлены. С невысокой частотой в разных регионах России встречается вид A. alternata (13%). Семена пшеницы, заражённые A. tenuissima и видами комплекса А infectoria, прорастают без видимых патологий.

4. Морфологические и молекулярно-генетические исследования показали, что обнаруженные на злаках мелкоспоровые виды Alternaría представляют три филогенетические ветви: комплекс A infectoria, вид A photistica и группу, включающую близкородственные виды A alternata, A tenuissima и A arborescens. Комплекс видов A. infectoria характеризуется наиболее архаичными морфологическими признаками и обладает наибольшим генетическим разнообразием.

5. Усовершенствован метод ПЦР-идентификации видов Alternaría, заражающих семена зерновых культур. Уточнена специфичность праймеров AAF2/AAR3 и установлено, что они амплифицируют ДНК видов A alternata, A tenuissima и A arborescens Сконструированы праймеры Ain3F/Ain4R, которые специфичны для комплекса видов A. infectoria.

6. Анализ фитотоксичности культуральной жидкости показал, что среди мелкоспоровых видов Alternaría наиболее токсигенными являются виды A tenuissima и A alternata. Около половины изолятов комплекса видов А infectoria обладают умеренной токсигенностью, 6% изолятов - высоко токси-генны, остальные - нетоксигенны. Выявлены высоко токсигенные изоляты среди видов S vesicarium и U atrum. Все исследованные изоляты видов А alternata, A photistica, A. tenuissima, Е. chlamydospora, U atrum, U botrytis и комплекса A. infectoria оказались не патогенны при инокуляции листьев 10-дневных растений пшеницы и ячменя в контролируемых условиях.

7. На основании АРЬР-анализа показано, что популяции А гепи^та с Дальнего Востока и из Европейской части РФ изолированы друг от друга в значительной степени ^т~0,272). В то же время, уровень генетических различий между краснодарской и ленинградской популяциями очень низкий (/Гьг~0,061) Величины генотипического разнообразия и индекса ассоциации (/д-1,53) соответствуют виду, размножающемуся преимущественно клональ-но, но испытывающему влияние рекомбинационных процессов.

Практические рекомендации

Для выявления и идентификации комплекса видов А. ш/е&опа рекомендуется использовать ПЦР с праймерами АтЗР/Ат411; для группы токси-генных видов А аИегпМа, А ¡епшязта и А агЬогечсет - праймеры ААР2/ААКЗ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ганнибал, Ф. Б. Виды рода Alternaría Nees в России / Ф. Б Ганнибал // Современная микология в России. Первый съезд микологов России. Тезисы докладов. - М. - 2002. - С. 32—33.

2. Gannibal, Ph. В. Russian species of the genus Alternaría Nees / Ph. B. Gannibal // The 7th International Mycological Congress. Book of Abstracts. - Oslo. - 2002. - P. 152.

3. Ганнибал, Ф. Б. Токсигенность, аллергенность и таксономия грибов рода Alternaría / Ф. Б. Ганнибал // Успехи медицинской микологии. Материалы Первого всероссийского конгресса по медицинской микологии. - М.: Национальная академия микологии.-2003.-Т. 1.-С. 189—190.

4. Ганнибал, Ф. Б. Дифференциация мелкоспоровых видов грибов рода Alternaría со злаков / Ф. Б. Ганнибал // Микология и альгология - 2004. Материалы юбилейной конференции, посвященной 85-летию кафедры микологии и альгологии МГУ им. М. В. Ломоносова. - М.: Прометей. - 2004. - С. 41.

5. Ганнибал, Ф. Б. Мелкоспоровые виды рода Alternaría на злаках / Ф. Б. Ганнибал // Микология и фитопатология. - 2004. - Т. 38, вып. 3. - С. 19— 28.

6. Ганнибал, Ф. Б. Комплекс видов Alternaría ínfectoría - незамеченная самобытность / Ф. Б. Ганнибал // Грибы в природных и антропогенных экосистемах Материалы международной конференции, посвящённой столетию с начала работы профессора А. С. Бондарцева в Ботаническом институте им В Л. Комарова РАН (24-28 апреля 2005, Санкт-Петербург). - С.Петербург. - 2005. - Т. 1. - С. 136—140.

7. Ганнибал, Ф. Б. Альтернариозы зерновых культур на Северо-западе России и в Северной Европе / Ф. Б. Ганнибал // Конференция по защите растений Вопросы менеджмента в защите растений и устойчивом земледелии, исследования, развитие и информационные системы. Тезисы докладов. - С.Петербург - Пушкин. - 2005. - С. 25—26.

8. Gannibal, Ph. В. Cultural and molecular differentiation of small-spored Alternaría species associated with Poaceae / Ph. B. Gannibal, T. Yli-Mattila // Микология и фитопатология. - 2005. - Т. 39, вып. 4. - С. 13—23.

9. Гагкаева, Т. Ю. Выявление и идентификация токсигенных видов грибов из родов Fusaríum и Alternaría с использованием полимеразной цепной реакции / Т Ю Гагкаева, Ф. Б. Ганнибал, М. М. Левитин, Т. Yli-Mattila // Второй всероссийский съезд по защите растений. Фитосанитарное оздоровление экосистем. Материалы съезда. - С.-Петербург - Пушкин. - 2005. - Т. 1. -С. 150—151.

Phiiipp B. GANNIBAL

The fungi of the genus Alternaría on grasses: species composition and intraspecific diversity

Abstract of Ph.D. thesis. Scientific supervisor - Prof. Dr Mark Levitin

The aims of this work were to revise Alternaría species composition associated with the family Poaceae, and to analyse the taxonomy, phylogeny and intraspecific diversity of Alternaría species.

The genus Alternaría on grasses in Russia is represented by non-specialised small-spored species, mainly by A tenuissima, A alternata and members of the A infectoria complex. In addition, A. photistica was found for the first time in Russia in oat seeds from the Leningrad region Also several species of phaeodictyosporic hyphomycetes (related to Alternaría) were found: Embellisia chlamydospora (Tri-ticum, Krasnodar region), Stemphylium botryosum (Triticum, European part of Russia), S vesicarium (Triticum and Leymus, European part), Ulocladium atrum (Triticum, European part), U botrytis (Bromopsis, Siberia and Hordeum, St. Petersburg).

A tenuissima was found to be very widespread in Russia. Its prevalence in cereal grain was high (93% of samples) Species of the A infectoria species-complex are common in the European part of Russia (78% of grain samples) and in Siberia, but they were not found at all in the Far East region. A alternata appears in different parts of country but it has low prevalence (13%).

Results of research using molecular methods support the conclusion that Alternaría species from grasses represent three phylogenetic clades: the A infectoria complex; A photistica; and a group of allied species including A alternata, A. tenuissima and A arborescens. Species of the A. infectoria complex have more archaic morphological features and greater polymorphism than the other groups, probably due to the presence of sexual states in the A infectoria group.

It was found that the PCR primers AAF2/AAR3 (Konstantinova et al., 2002), which seemed to be specific for A alternata, actually also can amplify DNA of allied toxigenic fungi such as A tenuissima and A. arborescens. Also we designed a primer set specific for species of the A. infectoria complex.

Culture filtrates of many A tenuissima and A. alternata isolates were toxic for wheat seeds, but isolates from members of the A infectoria complex had low toxicity or none at all. All isolates of different species tested had low aggressiveness for wheat leaves Seeds infected by A tenuissima or species of the A infecto- -ría complex germinated without conspicuous anomaly.

A sufficient genetic distance between populations of A tenuissima from the European part of Russia and the Far East (/rst=0,272) was revealed by AFLP. At the same time the difference between populations from the north and south of European Russia was very low (Fst=0,061), which can reflect a low level of isolation between regions The index of association was significantly higher than zero (/ a=1,53).

The main part of this work has been done in the All-Russian Institute of Plant Protection (St. Petersburg). Some parts of the research were carried out in collaboration with Dr. T. Yli-Mattila in University of Turku (Finland) and together with Dr. S. Klemsdal in Norwegian Crop Research Institute (As, Norway). The author is grateful to them for assistance and support and also I wish to thank Dr. E. G. Simmons (USA) for providing cultures.

Rights of manuscript.

Научное издание. Я120-печать ООО «ИННОВАЦИОННЫЙ ЦЕНТР ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ» Лицензия ПЛД Ха 69-253. Подписано к печати 26 декабря 2005 г., тир 100 экз

¿rj?

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ганнибал, Филипп Борисович

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Таксономия рода Alternarla.

1.1.1. Современное состояние и проблемы таксономии рода Alternaria.

1.1.2. Виды Alternaria в микобиоте злаков и их таксономический статус.

1.2. Филогения видов Alternaria.

1.3. Внутривидовое разнообразие и структура популяций видов Alternaria.

1.4. Паразитические свойства грибов рода Alternaria.

1.4.1. Альтернариозы злаков.

1.4.2. Патогенность.

1.4.3. Токсины.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Сбор растительного материала и изоляция грибов в чистую культуру.

2.2. Идентификация видов на основе изучения морфолого-культуральных свойств.

2.3. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

2.3.1. Общие методические подходы.

2.3.2. Экстракция ДНК.

2.3.3. RAPD и УП-ПЦР.

2.3.4. AFLP.

2.3.5. Конструирование специфичных праймеров.

2.3.6. ПЦР со специфичными праймерами.

2.3.7. Секвенирование рДНК.

2.4. Исследование физиологических свойств видов Alternaria.

2.4.1. Патогенность.

2.4.2. Токсигенность.

2.5. Обработка и анализ данных.

Глава 3. ВИДОВОЙ СОСТАВ ГРИБОВ РОДА ALTERNARIA НА ЗЛАКАХ.

3.1. Идентификация видов.

3.1.1. Идентификация по морфологическим признакам и культуральным свойствам.

3.1.2. ПЦР-диагностика.

3.2. Уточнение таксономического положения видов и их филогении.

3.2.1. Уточнение таксономии мелкоспоровых видов Alternaria.

3.2.2. Дифференциация видов комплекса A infectoria.

3.2.3. Филогения мелкоспоровых видов Alternaria.

Глава 4. РАСПРОСТРАНЕНИЕ ВИДОВ ALTERNARIA НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ, ИХ ПАТОГЕННОСТЬ И ТОКСИГЕННОСТЬ.

4.1. Распространение видов.

4.2. Заражённость семян злаков видами Alternaria.

4.3. Патогенность мелкоспоровых видов Alternaria.

4.4. Токсигенность мелокоспоровых видов Alternaria.

Глава 5. СТРУКТУРА ГЕОГРАФИЧЕСКИХ ПОПУЛЯЦИЙ А. TENUISSIMA.

5.1. Сравнение популяций по фенотипическим признакам.

5.2. Изучение структуры популяций по генетическим маркерам

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Грибы рода Alternaria Nees на злаках: видовой состав и внутривидовое разнообразие"

Актуальность темы. Род Alternaria представляет собой большую и разнообразную по биологическим характеристикам группу микромицетов, многие из которых распространены очень широко. Среди представителей этого рода известны виды с разной степенью паразитизма (от сапротрофов до био-трофов), уровнем специализации и своеобразными взаимоотношениями с растениями-хозяевами и другими организмами. Виды рода Alternaria часто обнаруживаются на злаках и считаются возбудителями чёрного зародыша и листовой пятнистости зерновых культур во многих странах мира. Они способны «загрязнять» зерно своими метаболитами, токсичными не только для растений, но и для человека и животных (Тутельян, Кравченко, 1985). Однако слабая изученность и запутанность таксономии рода служит серьёзным препятствием для его изучения.

За последние 20 лет, благодаря работам американского миколога Э. Симмонса (Simmons, 1986, 1990, 1992, 1993, 2002), систематика рода Alternaria значительно продвинулась вперёд. Тем не менее, до сих пор распространены ошибки при идентификации видов, что отражается на представлении об их ареалах, субстратной приуроченности и других экологических характеристиках (Лёвкина, 2003). Поэтому крайне актуальным в настоящее время является уточнение видовой принадлежности представителей рода Alternaria, в частности приуроченных к злакам. Решение этой задачи облегчают современные молекулярно-генетические методы исследований, успешно применяемые в систематике и популяционной биологии грибов (Taylor et al., 1999; Мироненко, 2004).

Цель исследований. Провести инвентаризацию видового состава грибов рода Alternaria, распространённых на растениях семейства злаковых (Роасеае) в разных регионах России, установить их таксономическое положение, филогенетические связи и внутривидовое разнообразие.

Задачи исследований. 1. Оценить распространение грибов рода Alternaria на зерновых культурах в различных регионах России.

2. Создать коллекцию чистых культур видов рода Alternaria.

3. Идентифицировать виды с использованием традиционных и современных молекулярно-генетических методов.

5. Выявить доминирующие на злаках виды рода Alternaria и определить их ареалы.

7. Провести анализ генетических различий пространственно отдаленных популяций доминирующих видов.

Научная новизна работы. Впервые в России целенаправленно исследованы распространённые на злаках виды рода Alternaria и виды других фео-диктиоспоровых гифомицетов. Проведена идентификация видов, основанная на современных работах по систематике этой группы грибов. Из девяти обнаруженных нами таксонов (8 видов и один комплекс видов) идентифицированы два новых для России вида: A. photistica Е. G. Simmons и Embellisia chlamydospora [Hoes et al.] E. G. Simmons. Для доминирующих видов впервые установлены границы ареалов в пределах России.

При инвентаризации видового состава грибов рода Alternaria, консор-тивно связанных со злаками, впервые использованы молекулярно-генетические методы, что позволило уточнить таксономический статус видов и их филогению.

Впервые исследована и охарактеризована структура популяций А. tenuissima [Fries] Wiltshire. Определены генетические дистанции между тремя географически разобщенными популяциями этого вида, установлена степень изоляции, генное и генотипическое разнообразие.

Практическая значимость. Впервые сконструированы праймеры для идентификации комплекса видов A. infectoria с использованием полимераз-ной цепной реакции (ПЦР), установлена специфичность некоторых существующих праймеров. Усовершенствованные методы идентификации позволят * эффективнее проводить мониторинг видового состава грибов и оценивать степень заражённости семян зерновых культур видами рода Alternaria.

Апробация работы. Результаты исследований обсуждались на заседаниях Лаборатории микологии и фитопатологии ВИЗР и группы биотехнологии Центра защиты растений Норвежского института исследования сельскохозяйственных культур (Norwegian Crop Research Institute), а также были представлены на 9-и съездах, конференциях и семинарах: Первом съезде микологов России (Москва, 2002); Международном микологическом конгрессе (Осло, 2002); Первом всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2003); Всероссийском координационном совещании «Разработка биотически управляемых, устойчиво развивающихся агроэкосистем на основе защиты сельскохозяйственных культур» (Санкт-Петербург, 2003); Конференции молодых учёных «Микология и альгология — 2004» (Москва, 2004); Международном семинаре «New emerging mycotoxins and toxigenic fungi in Northern Europe» (Санкт-Петербург, 2004); Международной конференции, посвящённой столетию с начала работы профессора А. С. Бондарцева в Ботаническом институте им. В. JI. Комарова РАН (Санкт Петербург, 2005); Конференции по защите растений «Вопросы менеджмента в защите растений и устойчивом земледелии: исследования, развитие и информационные системы» (Санкт-Петербург, 2005); Втором всероссийском съезде по защите растений (Санкт-Петербург, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Место проведения исследований. Большая часть исследований проведена в Лаборатории микологии и фитопатологии Всероссийского НИИ защиты растений. Некоторые разделы экспериментальных исследований были выполнены в Лаборатории физиологии растений и молекулярной биологии Университета г. Турку (Финляндия) и в группе биотехнологии Центра защиты растений Норвежского института исследования сельскохозяйственных культур.

Работа выполнена при поддержке Российской академии сельскохозяйственных наук, Министерства науки Норвегии (персональный грант № Rus03/04-89), Финского научного фонда CIMO (персональный грант № ТМ-04-2097) и международного научного фонда NordForsk (Nordic) (гранты №№ FIN 11 и 040291).

Заключение Диссертация по теме "Микология", Ганнибал, Филипп Борисович

выводы

1. Среди представителей рода Alternaria, консортивно связанных со злаками, в микобиоте России преобладают широко специализированные мелкоспоровые виды A. tenuissima, A. alternata и комплекс видов A. infectoria. Впервые в России в семенах овса из Ленинградской области обнаружен вид A. photistica.

•> 2. На злаках выявлены близкие роду Alternaria виды: Embellisia chlamydospora (корни пшеницы, Краснодарский край), Stemphylium botryosum (листья и семена пшеницы, Европейская часть РФ, включая Кавказ), S. vesicarium (семена пшеницы, Северная Осетия и семена колосняка, Карелия), Ulocladium atrum (семена пшеницы, Ленинградская область и кукуруза, Украина) и U. botrytis (семена костреца, Омская область; листья пшеницы и семена ячменя, Ленинградская область). Вид Е. chlamydospora обнаружен в России впервые.

3. Вид A. tenuissima распространён повсеместно и выделяется из зерна с высокой частотой (93% образцов). Представители комплекса видов А. infectoria широко распространены в Европейской части РФ (78% образцов зерна) и Западной Сибири (69%), но на Дальнем Востоке не выявлены. С невысокой частотой в разных регионах России встречается вид A. alternata (13%). Семена пшеницы, заражённые A. tenuissima и видами комплекса А. infectoria, прорастают без видимых патологий.

4. Морфологические и молекулярно-генетические исследования покажу зали, что обнаруженные на злаках мелкоспоровые виды Alternaria представляют три филогенетические ветви: комплекс A. infectoria, вид A. photistica и группу, включающую близкородственные виды A. alternata, A. tenuissima и А. arborescens. Комплекс видов A. infectoria характеризуется наиболее архаичными морфологическими признаками и обладает наибольшим генетическим разнообразием.

5. Усовершенствован метод ПЦР-идентификации видов Alternaria, заражающих семена зерновых культур. Уточнена специфичность праймеров AAF2/AAR3 и установлено, что они амплифицируют ДНК видов A. alternata, A. tenuissima и A. arborescens. Сконструированы праймеры Ain3F/Ain4R, которые специфичны для комплекса видов A. infectoria.

6. Анализ фитотоксичности культуральной жидкости показал, что среди мелкоспоровых видов Alternaria наиболее токсигенными являются виды A. tenuissima и A. alternata. Около половины изолятов комплекса видов А. infectoria обладают умеренной токсигенностью, 6% изолятов - высоко токси-генны, остальные - нетоксигенны. Выявлены высоко токсигенные изоляты среди видов S. vesicarium и U. atrum. Все исследованные изоляты видов А. alternata, A. photistica, A. tenuissima, Е. chlamydospora, U. atrum, U. botrytis и комплекса A infectoria оказались не патогенны при инокуляции листьев 10-дневных растений пшеницы и ячменя в контролируемых условиях.

7. На основании AFLP-анализа показано, что популяции A. tenuissima с Дальнего Востока и из Европейской части РФ изолированы друг от друга в значительной степени (Fst=0,272). В то же время, уровень генетических различий между краснодарской и ленинградской популяциями очень низкий (Fst=0,061). Величины генотипического разнообразия и индекса ассоциации (/а=1,53) соответствуют виду, размножающемуся преимущественно кло-нально, но испытывающему влияние рекомбинационных процессов.

Практические рекомендации

Для выявления и идентификации комплекса видов A. infectoria рекомендуется использовать ПЦР с праймерами Ain3F/Ain4R; для группы токси-генных видов A. alternata, A. tenuissima и A. arborescens - праймеры AAF2/AAR3.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ганнибал, Филипп Борисович, Санкт-Петербург

1. Азбукина, 3. М. Возбудители грибных болезней зерновых / 3. М. Азбу-кина, Е. А. Барбаянова, В. П. Лукьянчиков, А. В. Зайцева // Возбудители болезней сельскохозяйственных растений Дальнего Востока. — М. — 1980.-С. 84—225.

2. Барбаянова, Т. А. Видовой состав возбудителей и вредоносность чёрного зародыша семян злаков в Московской области / Т. А. Барбаянова, Ф. Л. Радун // Защита растений при интенсивной технологии. Межвузовский сборник научных трудов. М. -1989. - С. 78—85.

3. Белякова, Г. А. Токсические метаболиты грибов рода Alternaria. I. Специфические токсины / Г. А. Белякова, Л. М. Лёвкина // Микология и фитопатология. -1990. Т. 24, № 2. - С. 128—136.

4. Белякова, Г. А. Токсические метаболиты грибов рода Alternaria. II. Неспецифические токсины / Г. А. Белякова // Микология и фитопатология. -1992. Т. 26, № 3. - С. 183—188.

5. Берестецкий, О. А. Изучение фитотоксических свойств микроскопических грибов / О. А. Берестецкий // Методы экспериментальной микологии. Справочник. Под. ред. В. И. Билай. Киев: Наукова думка. - 1982. — С. 321—333.

6. Болезни злаковых трав в Северо-Западной зоне РСФСР. Методические указания по инвентаризации болезней. Сост.: В. И. Кривченко, Н. Л. Полозова, Т. М. Хохрякова. Л. -1973. - 192 с.

7. Бондарцева, А. С. Растительные паразиты культурных и дикорастущих растений, собранные в Курской губернии летом 1901, 1903-1905 годов / А. С. Бондарцева. -СПб. -1906. 52 с.

8. Булат, С. А. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для изучения геномов / С. А. Булат, О. К. Кабоев, Н. В. Мироненко, Ф. М. Ибатуллин, Л. А. Лучкина, А. В. Суслов // Генетика. 1992. - Т. 28, №5.-С. 19—28.

9. Бурякова, Э. И. Чёрная плесень колосьев озимой пшеницы / Э. И. Буря-кова // Сборник научных работ Рязанского СХИ. Рязань. -1969. - Вып. 19.-С. 187—191.

10. Бурякова, Э. И. Влияние токсинов грибов рода Альтернария на посевные качества семян озимой пшеницы / Э. И. Бурякова // Защита сельскохозяйственных культур от вредителей и болезней. Труды Горьковского СХИ. Горький. -1976. - Т. 93. - С. 13—16.

11. Высоцкая, М. А. Выявление внутренней микофлоры семян / М. А. Высоцкая // Защита растений. -1979. № 10. - С. 27.

12. Гешеле, Э. Э. Методическое руководство по фитопатологической оценке зерновых культур / Э. Э. Гешеле. Одесса. -1971. - 180 с.

13. Горденко, В. И. Политомический определитель грибов рода Macrosporium Fries (Методическое руководство) / В. И. Горденко. Под ред. М. К. Хохрякова. Л. - 1970а. - 12 с.

14. Горденко, В. И. Специализация грибов рода Macrosporium Fr. / В. И. Горденко // Микология и фитопатология. 19706. - Т. 4, № 4. С. - 297— 300.

15. Горденко, В. И. О таксономии рода Macrosporium и некоторых его видов / В. И. Горденко // Материалы VI симпозиума микологов и лихено-логов Прибалтийских республик. Рига. -1971. - Т. 1. - С. 154—157.

16. Горленко, М. В. Болезни пшеницы / М. В. Горленко. М.: Сельхозгиз. -1951.-254 с.

17. Городилова, Л. М. Почернение зародыша — заболевание зерна пшеницы на Севере Казахстана / Л. М. Городилова, Н. С. Шумилова // Материалы X научной конференции по вопросам сельскохозяйственного производства. Целиноград. -1969. - Ч. 1. - С. 200—203.

18. Городилова, Л. М. Изменение окраски зерна пшеницы под влиянием гриба рода Альтернария на Севере Казахстана / Л. М. Городилова // Влияние микроорганизмов и протравителей на семена. М: Колос. — 1972.-С. 41—43.

19. Горьковенко, В. С. Возбудители пятнистостей озимой пшеницы / В. С. Горьковенко // Защита и карантин растений. — 2001. — № 5. С. 33.

20. Диагностика грибных болезней семян хлебных и крупяных злаков. Методические указания. Сост.: А. Я. Семёнов, В. И. Потлайчук, М. К. Хохряков. М. -1979. - 42 с.

21. Дорофеева, Л. Л. Грибные болезни риса / Л. Л. Дорофеева, А. А. Кодя-кова, В. П. Кратенко, В. Б. Лебедев, А. А. Мотовилин, Н. А. Тихонова. -Ташкент: Фан. -1992. 95 с.

22. Дьяков, Ю. Т. Популяционная биология и эволюция грибов / Ю. Т. Дьяков // Бюллетень Московского общества испытателей природы. Отд. Биологическое. 2004. - Т. 109, № 6. - С. 106—111.

23. Егорова, Л. Н. Род Alternaria и близкие к нему гифомицеты с Дальнего Востока России / Л. Н. Егорова // Микология и фитопатология. 1999. -Т. 33, № 1.-С. 13—18.

24. Жукова, М. В. Микроскопические грибы, развивающиеся на семенах пшеницы и кукурузы в период хранения / М. В. Жукова // Автореферат . к. б. н.-Д.-1985.-21 с.

25. Зазимко, М. И. Патогенный комплекс на озимой пшенице / М. И. За-зимко, Э. И. Монастырная, В. С. Горьковенко // Защита и карантин растений. 2003. - № 4. - С. 18—20.

26. Зилинг, М. К. Чёрный зародыш пшеницы / М. К. Зилинг // Болезни зерновых культур. Омск. -1932. - С. 15—39.

27. Колошина, JI. М. Поражаемость сортов озимой пшеницы чёрной плесенью колосьев / JT. М. Колошина, Э. И. Бурякова // Сборник научных работ. Рязань: Московский рабочий. -1971. - Т. 27, № 1-3. - С. 131—137.

28. Корниенко, В. Ю. К вопросу о микофлоре корневой гнили озимой пшеницы в условиях орошения на юге УССР / В. Ю. Корниенко // Материалы I конференции по споровым растениям Украины. Киев: Наука. — 1971.-С. 178—179.

29. Коршунова, А. Ф. Альтернариоз семян яровой пшеницы / А. Ф. Коршунова // Влияние микроорганизмов и протравителей на семена. М.: Колос. -1972. - С. 35—40.

30. Крутова, Н. П. Состав и роль отдельной патогенной микофлоры семян зерновых культур в Воронежской области / Н. П. Крутова // Материалы в помощь с.-х. производству. Воронеж: Ц-Ч книжное издательство. -1978.-Т. 5,№5.-с. 18—21.

31. Лёвкина, Л. М. Таксономия рода Alternaria / Л. М. Лёвкина // Микология и фитопатология. -1984. Т. 18, № 1. — С. 80—86.

32. Лёвкина, Л. М. Изучение популяций Alternaria macrospora Zimm. по признаку вирулентности / Л. М. Лёвкина // Вестник Московского университета. Сер. 16, биология. 1997. -№ 4. - С. 45—47.

33. Лёвкина, Л. М. Род Alternaria Nees / Л. М. Лёвкина // Новое в систематике и номенклатуре грибов. Под ред. Ю. Т. Дьякова, Ю. В. Сергеева. — М.: Национальная академия микологии; Микология для всех. — 2003. С. 276—303.

34. Манжула, Л. А. Патогенность изолятов Alternaria alternata возбудителя чёрного зародыша ячменя / Л. А. Манжула // Защита растений. - Киев: Урожай. -1988. - № 35. - С. 25—26.

35. Манжула, Л. А. Альтернариоз ярового ячменя в юго-восточной степи Украины и его роль в снижении жизнеспособности семян / Л. А. Манжула // Экологические проблемы защиты растений. Тезисы докладов. — Л. — 1990.-С. 92—93.

36. Мархасьова, В. А. Чорний зародок пшенищ та заходи боротьби з ним / В. А. Мархасьова. Кшв: Видавництво АН УРСР. -1957. - 81 с.

37. Матвеева, Т. С. Материалы к систематике и биологии рода Alternaria Nees / Т. С. Матвеева. Дисс. к. б. н. - Л. -1941. - 402 с.

38. Матвеева, Т. С. Новая характеристика рода Alternaria Nees / Т. С. Матвеева // Ботанические материалы отдела споровых растений БИН им. В. Л. Комарова АН СССР. М.-Л.: Изд-во АН СССР. - 1951. - Т. 7. - С. 124—129.

39. Методические указания по определению заражённости семян и проростков злаковых культур грибными болезнями. Сост. В. И. Потлайчук, А. Я. Семёнов Под ред. М. К. Хохрякова, Н. Г. Хорошайлова. Л. - 1976. -59 с.

40. Мироненко, Н. В. Современные достижения в изучении генетической структуры популяций фитопатогенных грибов / Н. В. Мироненко // Успехи современной биологии. 2004. - Т. 124, № 3. - С. 234—245.

41. Михайлова, JI. А. Лабораторные методы культивирования возбудителя ржавчины пшеницы Puccinia recondita f. sp. tritici Rob. ex Desm. / Л. A. Михайлова, К. В. Квитко // Микология и фитопатология. 1970. — Т. 4, № 3. - С. 269—273.

42. Михайлова, Л. А. Взаимодействие штаммов Bipolaris sorokiniana и образцов пшеницы / Л. А. Михайлова, С. Г. Гоголева, Е. И. Гультяева // Микология и фитопатология. 2002. - Т. 36, № 2. - С. 63—66.

43. Михайлова, Л. А. Генетика устойчивости линий яровой пшеницы 18156 Vicam "S" 70, 292 к возбудителю жёлтой пятнистости / Л. А. Михайлова, Н. М. Кокорина, Д. Копаньке // Доклады РАСХН. 2003. - № 1. -С. 20—22.

44. Монастырский, О. А. Заражённость семян токсинообразующими грибами / О. А. Монастырский // ArpoXXI. 2000. - № 4. - С. 6—7.

45. Назарова, Л. Н. Прогрессирующие болезни зерновых культур / Л. Н. Назарова, Е. А. Соколова // Агро XXI. 2002. - № 4. - С. 2—3.

46. Немлиенко, Ф. Е. Болезни кукурузы / Ф. Е.Немлиенко. М.: Сельхоз-гиз. -1957. - 230 с.

47. Павлова, Т. В. Роль миграции спор Puccinia recondita Rob. ex Desm./ sp. tritici в формировании популяций и развитии эпифитотий / Т. В. Павлова, Л. А. Михайлова // Микология и фитопатология. 1997. - Т. 31, № 5. - С. 60—66.

48. Пересыпкин, В. Ф. Болезни зерновых культур / В. Ф. Пересыпкин. М.: Колос.-1979.-279 с.

49. Потлайчук, В. И. Микофлора семян яровой пшеницы и риса в различных условиях выращивания / В. И. Потлайчук, А. Я. Семёнов // Бюллетень ВНИИЗР. 1977. - Т. 40. - С. 40—44.

50. Рудаков, О. Л. Токсигенная активность микромицетов филлопланы риса / О. Л. Рудаков, Г. К. Шмелёва // Микология и фитопатология. 1988. -Т. 22,№6.-С. 570—573.

51. Рябчикова, В. В. К вопросу о роли Alternaria alternata (Fr.) Kissler вэтиологии корневых гнилей зерновых культур / В. В. Рябчикова // Воспроизводство плодородия черноземов в Центрально-чернозёмной зоне. — Воронеж. 1992. - С. 69—77.

52. Светов, В. Г. Влияние агроэкологических факторов на распространённость .чёрного зародыша пшеницы / В. Г. Светов // Микология и фитопатология. 1989. - Т. 23, № 5. - С. 471—473.

53. Семёнов, А. Я. Видовой состав микроскопических грибов на семенах озимой ржи в Горьковской области / А. Я. Семёнов, М. Ю. Мухина, В. И. Горденко // Бюллетень Всесоюзного научно-исследовательского института защиты растений. -1988. № 70. — С. 84.

54. Титова, К. Д. Микофлора семян пшеницы как источник развития заболеваний растений / К. Д. Титова, О. JI. Рудаков // Проблемы идентификации микроскопических грибов и других микроорганизмов. Вильнюс. -1987.-С. 104—105.

55. Тутельян, В. А. Микотоксины / В. А. Тутельян, JI. В. Кравченко. М.: Медицина. -1985. - 319 с.

56. Указатель возбудителей болезней сельскохозяйственных растений. Под ред. М. К. Хохрякова. — JI. 1966. - 63 с.

57. Указатель возбудителей болезней сельскохозяйственных растений. Выпуск 4 (по злаковым и бобовым травам). Под ред. М. К. Хохрякова. JI. -1976.-89 с.

58. Фёдорова, Р. Н. Крупность семян и выживаемость фитопатогенных грибов / Р. Н. Фёдорова, Т. Н. Филиппова, А. Я. Семёнов, В. А. Волкова // Защита растений. -1984. № 9. - С. 29—30.

59. Хасанов, Б. А. Патогенные к злакам гифомицеты в нижних слоях тропосферы Средней Азии и Казахстана / Б. А. Хасанов, А. А. Выприцкая, Д.

60. B. Терентьев // Узбекский микробиологический журнал. 1990. - № 6.1. C. 12—15.

61. Хохряков, М. К. Морфолого-биологическое обоснование систематики грибов рода Helminthosporium (sensu lato) на злаках / М. К. Хохряков // Дисс. д. б. н. JI. -1953. - 398 с.

62. Хохряков, М. К. Уточнение таксономического положения грибов на основе экспериментального изучения их изменчивости / М. К. Хохряков // Материалы I Координационного совещания микологов Средней Азии и Казахстана. Фрунзе. -1960. - С. 61—67.

63. Хрипунова, Э. Ф. К видовому составу микофлоры при корневых гнилях озимой пшеницы в фазу кущения / Э. Ф. Хрипунова, Ш. М. Гринберг // Известия АН Молдавской ССР. Серия биологических и химических наук. 1979. -№ 1. - С. 39—42.

64. Чулкина, В. А. Корневые гнили ячменя Горного Алтая / В. А. Чулкина // Корневые гнили хлебных злаков и меры борьбы с ними. М.: Колос. — 1970.-С. 76—80.

65. Шпокаускене, О. Ю. Корневые гнили зерновых в Литовской ССР (5. Микофлора гниющих корней и оснований стеблей ячменя) / О. Ю. Шпокаускене // Труды АН ЛитССР. Серия В. Биологические науки. 1984. -Т. 4, №88.-С. 53—59.

66. Adachi, Y. Relationship between genetic polymorphisms and fungicide resistance within Alternaria alternata / Y. Adachi, H. Watanabe, T. Tsuge // Phytopathology.-1996.-Vol. 86,№ Ц.-Р. 1248—1254.

67. Adlakha, К. L. Black point of wheat / K. L. Adlakha, L. M. Joshi // Indian Phytopathology. -1974. Vol. 27, № 1. - P. 41^4.

68. Agapow, P. M. Indices of multilocus linkage disequilibrium / P. M. Agapow, A. Burt // Molecular Ecology Notes. 2001. - Vol. 1. - P. 101—102.

69. Altschul, S. F. Basic local alignment search tool / S. F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers, D. J. Lipman // Journal of Molecular Biology. 1990. -Vol. 215.-P. 403—410.

70. Andersen, B. Metabolite profiles of common Stemphylium species / B. Andersen, M. Solfrizzo, A. Visconti // Mycological Research. 1995. - Vol. 99, №6.-P. 672—676.

71. Andersen, B. Differentiation of Alternaria infectoria and Alternaria alternata based on morphology, metabolite profiles, and cultural characteristics / B. Andersen, U. Thrane // Canadian Journal of Microbiology. 1996. - Vol. 42. -P. 685—689.

72. Andersen, B. Associated field mycobiota on malt barley / B. Andersen, U. Thrane, A. Svendsen, I. A. Rasmussen // Canadian Journal of Botany. 1996. - Vol. 74, № 6. - P. 854—858.

73. Andersen, B. Chemical and morphological segregation of Alternaria alternata, A. gaisen and A. longipes / B. Andersen, E. Kroger, R. G. Roberts // Mycological Research. 2001. - 105, № 3. - P. 291—299.

74. Andersen, B. Chemical and morphological segregation of Alternaria arborescens, A. infectoria and A. tenuissima species-group / B. Andersen, E. Kroger, R. G. Roberts // Mycological Research. 2002. - Vol. 106, № 2. - P. 170—182.

75. Aradhya, M. K. Genetic variability in the pistachio late blight fungus, Alternaria alternata / M. K. Aradhya, H. M. Chan, D. E. Parfitt // Mycological Research. 2001. - Vol. 105, № 3. - P. 300—306.

76. Bandyopadhyay, R. Occurrence of airborne spores of fungi casing grain mould over a sorghum crop / R. Bandyopadhyay, L. K. Mughogho, M. V.

77. Satyanarayana // Mycological Research. -1991. Vol. 95, № 11.- P. 1315— 1320.

78. Bashan, Y. Transfer of Alternaria macrospora from cotton seed to seedling: light and scanning microscopy of colonization / Y. Bashan, H. Levanony // Journal of Phytopathology. -1987. Vol. 120, № 1. - P. 60—68.

79. Bateman, G. L. Effects of number of winter wheat crops grown successively on fungal communities on wheat roots / G. L. Bateman, H. Kwasna // Applied Soil Ecology. -1999. Vol. 13. - P. 271—282.

80. Belisario, A. First report of Alternaria species groups involved in disease complexes of hazelnut and walnut fruits / A. Belisario, M. Maccaroni, A. Coramusi, L. Corazza // Plant Disease. 2004. - Vol. 88, № 4. - P. 426.

81. Bhowmik, T. P. Alternaria seed infection of wheat / T. P. Bhowmik // Plant disease reporter. -1969. Vol. 53, № 1. - P. 77—80.

82. Bilgrami, K. S. Widespread occurrence of toxigenic Alternarias in cereals and oilseeds / K. S. Bilgrami, К. K. Sinha, A. A. Ansari, M. F. Rahman // Indian Phytopathology. -1995. Vol. 48, № 2. - P. 150—153.

83. Birnboim, H. C. A rapid alcaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA / H. C. Birnboim, J. Doly // Nucleic Acids Research.-1979.-Vol. 7.-P. 1513—1523.

84. Воск, С. H. Detection of genetic variation in Alternaria brassicicola using AFLP fingerprinting / С. H. Bock, P. H. Thrall, C. L. Brubaker, J. J. Burdon // Mycological Research. 2002. - Vol. 106, № 4. - P. 428-^34.

85. Воск, С. H. Genetic structure of populations of Alternaria brassicicola suggests the occurrence of sexual recombination / С. H. Bock, P. H. Thrall, J. J. Burdon // Mycological Research. 2005. - Vol. 109, № 2. - P. 227—236.

86. Bonants, P. J. M. Molecular characterization of natural hybrids of Phytophthora nicotianae and P. cactorum / P. J. M. Bonants, M. Hagenaar-de Weerdt, W. A. Man in't Veld, R. P. Baayen // Phytopathology. 2000. - Vol. 90.-P. 867—874.

87. Bulat, S. A. UP-PCR analysi and ITS1 ribotyping of strains of Trichoderma and Gliocladium / S. A. Bulat, M. Ltibeck, N. V. Mironenko, D. F. Jensen, P. S. Ltibeck // Mycological Research. -1998. Vol. 102, № 8. - P. 933—943.

88. Burdon, J. J. Sources and patterns of diversity in plant-pathogenic fungi / J. J. Burdon, J. Silk // Phytopathology. -1997. Vol. 87, № 7. p. 664—669.

89. Burroughs, R. Growth of fungi in sorghum grain stored at high moisture contents / R. Burroughs, D. B. Sauer // Phytopathology. 1971. - Vol. 61, № 7.-P. 767—772.

90. Chou, H.-H. Phylogenetic analysis of internal transcribed spacer regions of the genus Alternaria, and the significance of filament-beaked conidia / H.-H. Chou, W.-S. Wu // Mycological Research. 2002. - Vol. 106, № 2. - P. 164—169.

91. Conner, R. L. Influence of irrigation timing on black point incidence of soft white spring wheat / R. L. Conner // Canadian Journal of Plant Pathology. -1987. Vol. 9. - P. 301—306.

92. Conner, R. L. Black point incidence in soft white spring wheat in southern Alberta and Saskatchewan between 1982 and 1987 / R. L. Conner, A. D. Kuzyk // Canadian Plant Disease Survey. 1988. - Vol. 68, № 1. - P. 27— 31.

93. Coulombe, R. A. Alternaria toxins / R. A. Coulombe // Mycotoxins and phytoalexins. Eds. R. P. Sharma, D. K. Salunkhe. Boca Raton: CPC Press. -1991.-P. 425—433.

94. Dash, S. K. Seed transmission of Alternaria triticina in wheat in Orissa / S. K. Dash, A. Narain // Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. -1989.-Vol. 19, №2.-P. 157—160.

95. Diener, U. L. Toxigenicity of fungi from grain sorghum / U. L. Diener, G. Morgan-Jones, R. E. Wagener, N. D. Davis // Mycopathologia. 1981. - Vol. 75.-P. 23—26.

96. Dugan, F. M. Filamentous fungi quiescent in seeds and culm nodes of weedy and forage grass species endemic to the Palouse Region of Washington and Idaho / F. M. Dugan, S. L. Lupien // Mycopathologia. 2002. - Vol. 156. - P. 31—40.

97. Dugan, F. M. Morphological and cultural differentiation of described species of Alternaria from Poaceae / F. M. Dugan, T. L. Peever // Mycotaxon. -2002. Vol. 83. - P. 229—264.

98. E1-Helaly, A. F. The black-point disease of wheat / A. F. El-Helaly // Phytopathology. -1947. Vol. 37, № 11. - P. 773—780.

99. Elliott, J. A. Taxonomic characters of the genera Alternaria and Macrosporium / J. A. Elliott // American Journal of Botany. 1917. - Vol. 4, №8.-P. 439—478.

100. Ellis, M. B. Dematiaceous Hyphomycetes / M. B. Ellis // CAB International Mycological Institute. Kew, Surrey, UK. -1971. 608 pp.

101. Ellis, M. B. More dematiaceous Hyphomycetes / M. B. Ellis // CAB International Mycological Institute. Kew, Surrey, UK. -1976. 507 pp.

102. Ellis, S. A. Factors influencing the relative susceptibility of wheat cultivars (Triticum aestivum L.) to blackpoint / S. A. Ellis, M. J. Gooding, A. J. Thompson // Crop Protection. -1996. Vol. 15, № 1. - P. 69—76.

103. Fernandez, M. R. Black point and red smudge in irrigated durum wheat in southern Saskatchewan in 1990-1992 / M. R. Fernandez, J. M. Clarke, R. M. DePauw, R. B. Irvine, R. E. Knox // Canadian Journal of Plant Pathology. — 1994.-Vol. 16.-P. 221—227.

104. Fernandez, M. R. Black point reaction of durum and common wheat cultivars grown under irrigation in southern Saskatchewan / M. R. Fernandez, J. M. Clarke, R. M. DePauw // Plant Disease. 2000. - Vol. 84. - P. 892— 894.

105. Fouly, H. M. Wheat root rotting fungi in the "old" and "new" agricultural lands of Egypt / H. M. Fouly, W. L. Pedersen, H. T. Wilkinson, M. M. Abd El-Kader // Plant Disease. -1996. Vol. 80, № 11. - P. 1298—1300.

106. Frisullo, S. Parassiti fimgini delle piante nellTtalia meridionale. 1. Alternaria triticina Pras. et Prab. su Frumento duro / S. Frisullo I I Phytopathologia mediterranea. -1982. № 21. - P. 113—115.

107. Guillemette, Т. Conventional and real-time PCR-based assay for detecting pathogenic Alternaria brassicae in cruciferous seed / T. Guillemette, B. Iacomi-Vasilescu, P. Simoneau // Plant Disease. 2004. - Vol. 88, № 5. - P. 490—496.

108. Hansen, M. E. Automated and unbiased classification of chemical profiles from fungi using high performance liquid chromatography / M. E. Hansen, B. Andersen, J. Smedsgaard // Journal of Microbiological Methods. 2005. -Vol. 61.-P. 295—304.

109. Hawksworth, D. L. Fungal genera in urgent need of taxonomical work / D. L. Hawksworth // Microbiological Sciences. -1986. Vol. 3. - P. 58.

110. Heiny, D. K. Synthesis and biological activity of stemtoxin by Stemphylium botryosum and related fungi / D. K. Heiny, D. G. Gilchrist // Mycological Research. -1991. Vol. 95, № 5. - P. 566—570.

111. Gelfand, J. J. Sninsky, T. J. White. -San Diego: Academic Press. 1990. - P. 3—12.

112. Jasalavich, C. A. Comparison of nuclear ribosomal DNA sequence from Alternaria species pathogenic to crucifers / C. A. Jasalavich, V. M. Morales, L. E. Pelcher, G. Seguin-Swartz // Mycological Research. 1995. - Vol. 99, №5.-P. 604—614.

113. Joffe, A. Z. Biological properties of some toxic fungi isolated from overwintered cereals / A. Z. Joffe // Mycopathologia et Mycologia Applicata. 1962. - Vol. 16, № 3. - P. 201—221.

114. Joly, P. Le genre Alternaria / Joly P. Paris. - 1964. - 250 pp.

115. Kapkoti, N. Effect of fungicides on the seed mycoflora of rice, maize and wheat in Kumaun Hills / N. Kapkoti, K. N. Pandey // Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. -1990. Vol. 20, № 2. - P. 149—150.

116. Karwasra, S. S. Occurrence, cultivar reaction and yield losses due to leaf blight of wheat / S. S. Karwasra, M. S. Beniwal, R. Singh // Indian Phytopathology. -1998. Vol. 51, № 4. - P. 363—364.

117. Kosiak, B. Alternaria and Fusarium in Norwegian grains of reduced quality —e?a matched pair sample study / B. Kosiak, M. Torp, E. Skjerve, B. Andersen // International Journal of Food Microbiology. 2004. - Vol. 93. - P. 51—62.

118. Kumar, C. S. К. V. Production of phytotoxic substances by Alternaria triticina / C. S. К. V. Kumar, A. S. Rao // Canadian Journal of Botany. — 1979.-Vol. 57,№ 11.-P. 1255—1258.

119. Kumar, V. R. Studies on transmission of Alternaria triticina of wheat using in vitro technique / V. R. Kumar, S. Parveen // Journal of Mycology and Plant Pathology. 2002. - Vol. 32, № 2. - P. 181—183.

120. Kusaba, M. Nuclear ribosomal DNA variation and pathogenic specialization in Alternaria fungi known to produce host-specific toxins / M. Kusaba, T. Tsuge // Applied and Environmental Microbiology. 1994. - Vol. 60, № 9.9 P. 3055—3062.

121. Kusaba, M. Mitochondrial DNA variation in host-specific toxin producing pathogens in the genus Alternaria / M. Kusaba, T. Tsuge // Annals of the phytopathological society of Japan. -1997. Vol. 63, № 6. - P. 463—469.

122. Kwasna, H. Lewia teleomorph of Alternaria triticicola from oat grain in Norway is now described / H. Kwasna, B. Kosiak I I The 7th International Mycological Congress. Book of abstracts. 2002. - P. 215.

123. Kwasna, H. Lewia awenicola sp. nov. and its Alternaria anamorph from oat grain, with key to the species of Lewia / H. Kwasna, B. Kosiak // Mycological Research. 2003. Vol. 107, № 3. - P. 371—376.

124. Larsen, Т. O. Infectopyrone, a potential mycotoxin from Alternaria infectoria / Т. O. Larsen, N. B. Perry, B. Andersen // Tetrahedron Letters. -2003. Vol. 44. - P. 4511—4513.

125. Lee, H. B. First report of strawberry fruit rot caused by Alternaria tenuissima in Korea / H. B. Lee, C.-J. Kim // Plant Disease. 2001. - Vol. 85, № 5. - P. 563.

126. Liebermann, B. A new phytotoxic activity of the cyclic peptides tentoxin and dihydrotentoxin / B. Liebermann, R. Kolblin // Journal of Phytopathology. -1992. Vol. 135. - P. 245—250

127. Liebermann, B. Tricycloalternarenes produced by Alternaria alternata related to ACTG-toxins / B. Liebermann, R. Ellinger, W. Gtinther, W. Ihn, H. Gallander // Phytochemistry. -1997. Vol. 46, № 2. - P. 297—303.

128. Liebermann, B. Bicycloalternarenes produced by the phytopathogenic fungus Alternaria alternata / B. Liebermann, R.-P. Nussbaum, W. Gtinther // Phytochemistry. 2000. - Vol. 50, № 5. - P. 987—992.

129. Logrieco, A. Natural occurrence of Alternaria mycotoxins in some plant products / A. Logrieco, A. Botallico, A. Visconti, M. Vurro // Microbiologie, Aliments, Nutrition. -1988. Vol. 6. - P. 13—17.

130. Logrieco, A. Incidence of Alternaria species in grains from Mediterranean countries and their ability to produce mycotoxins / A. Logrieco, A. Bottalico, M. Solfrizzo, G. Mule // Mycologia. 1990a. - Vol. 82, № 4. p. 501—505.

131. Logrieco, A. Mandarin fruit rot caused by Alternaria alternata and associated mycotoxins / A. Logrieco, A. Visconti, A. Bottalico // Plant Disease. 1990b. -Vol. 74, № 6.-P. 415—417.

132. Logrieco, A. Epidemiology of toxigenic fungi and their associated mycotoxins for some Mediterranean crops / A., Logrieco, A. Bottalico, G.

133. Mule, A. Moretti, G. Perrone // European Journal of Plant Pathology. 2003. - Vol. 109, № 7. - P. 645—667.

134. Lorenz, K. Effects of blackpoint on grain composition and baking quality of New Zealand wheat / K. Lorenz // New Zealand Journal of Agricultural Research. 1986. - Vol. 29. - P. 711—718.

135. Ma, Z. Resistance to azoxystrobin in Alternaria isolates from pistachio in California / Z. Ma, D. Felts, T. J. // Michailides Pesticide Biochemistry and Physiology. 2003. - Vol. 77. - P. 66—74.

136. Maynard Smith, J. How clonal are bacteria? / J. Maynard Smith, N. H. Smith, M. O'Rourke, B.G. Spratt // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1993. - Vol. 90. - P. 4384-4388.

137. McDonald, B. A. Genetic structure of Rhynchosporium secalis in Australia / B. A. McDonald, J. Zhan, J. J. Burdon // Phytopathology. 1999. - Vol. 89, №6.-P. 639—645.

138. McKay, G. J. Molecular characterisation of Alternaria linicola and its detection in linseed / G. J. McKay, A. E. Brown, A. J. Bjourson, P. C. Mercer // European Journal of Plant Pathology. 1999. - Vol. 105, № 1. - P. 15— 166.

139. Mironenko, N. V. Intraspecific variation in gamma-radiation resistance and genomic structure in the filamentous fungus Alternaria alternata: a case study of strains inhabiting Chernobyl reactor No. 4 / N. V. Mironenko, I. A.

140. Alekhina, N. N. Zhdanova, S. A. Bulat // Ecotoxicology and environment safety. 2000. - Vol. 45. - P. 177—187.

141. Mishra, A. B. Studies on Alternaria blight of wheat in Madhya Pradesh / A. B. Mishra, S. P. Singh // Mycopathologia et Mycologia applicata. 1971. -Vol. 44, №4.-P. 369—371.

142. Mitina, G. V. RAPD-PCR, UP-PCR and rDNA sequence analyses of entomopathogenic Verticillium lecanii and Beauveria bassiana strains / G. V. Mitina, T. Yli-Mattila // Journal of Russian Phytopathological Society. -2002.-Vol.3.-P. 7—17.

143. Morey, D. D. The effect of storage conditions and containers on the viability of rye, wheat and oat seed / D. D. Morey // Seed Science and Technology. -1976. Vol. 4. - P. 313—323.

144. Morris, P. F. Genetic diversity of Alternaria alternata isolated from tomato in California assessed using RAPDs / P. F. Morris, M. S. Connolly, D. S. St Clair // Mycological Research. 2000. - Vol. 104, № 3. - P. 286—292.

145. Moubasher, A. H. Studies on the fungus flora of three grains in Egypt / A. H. Moubasher, M. A. Elnaghy, S. I. Abdel-Hafez // Mycopathologia et Mycolia Applicata. -1972. Vol. 47, № 3. - P. 261—274.

146. Neergaard, P. Danish species of Alternaria and Stemphylium. Taxonomy, parasitism, economical significance / P. Neergaard // Copenhagen: E. Munksgaard. -1945. 560 + 2 pp.

147. Nei, M. Analysis of gene diversity in subdivided populations / M. Nei // Proceedings of the National Academy of Science USA. -1973. Vol. 70. - P. 3321—3323.

148. Nei, M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals / M. Nei // Genetics. 1978. - Vol. 89. - P. 583—590.

149. Nei, M. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases / M. Nei, W.-H. Li // Proceedings of the National Academy of Science USA. -1979. Vol. 76. - P. 5269—5273.

150. Newsham, К. К. Root pathogenic and arbuscular mycorrhizal fungi determine fecundity of asymptomatic plants in the field / К. K. Newsham, A. H. Fitter, A. R. Watkinson // Journal of Ecology. 1994. - Vol. 82. - P. 805—814.

151. Nishimura, S. Host-specific toxins and chemical structures from Alternaria species / S. Nishimura, K. Kohmoto // Annual Review Phytopathology. — 1983.-Vol. 21. — P. 87—116.

152. Noble, M. An annotated list of seed-borne diseases / M. Noble, M. J. Richardson. Commonwealth Mycological Institute. Kew: Surrey. - 1968. — 191 p.

153. Nussbaum, R.-P. New tricycloalternarenes produced by the phytopathogenic fungus Alternaria alternata / R.-P. Nussbaum, W. Giinther, S. Heinze, B. Liebermann // Phytochemistry. -1999. Vol. 52, № 4. - P. 593—599.

154. Paavanen-Huhtala, S. Development of strain-specific primers for a strain of Gliocladium catenulatum used in biological control / S. Paavanen-Huhtala, H. Avikainen, T. Yli-Mattila // European Journal of Plant Pathology. 2000. -Vol. 106.-P. 187—198.

155. Peakall, R. GenAlEx V5: Genetic Analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research / R. Peakall, P. E. Smouse. Australian National University, Canberra. -2001.

156. Pearson, W. R. Improved tools for biological sequence comparison / W. R. Pearson, D. J. Lipman // Proceedings of the National Academy of Science USA. -1988. Vol. 85. - P. 2444—2448.

157. Peever, T. L. Molecular systematics of citrus-associated Alternaria species / T. L. Peever, G. Su, L. Carpenter-Boggs, L. W. Timmer // Mycologia. 2004. -Vol. 96, № l.-P. 119—134.

158. Perello, A. A scale for appraising the leaf blight of wheat caused by Alternaria triticimaculans / A. Perello, M. N. Sisterna, P. Cortese // Cereal Research Community. -1998. Vol. 26, № 2. - P. 189—194.

159. Perello, A. Interactions between foliar pathogens and saprophytic mycoflora of the wheat (Triticum aestivum L.) phylloplane / A. Perello, M. R. Simon, A. M. Arambarri // Journal of Phytopathology. 2002. - Vol. 150. - P. 232— 243.

160. Petrunak, D. M. Isozyme variability in Alternaria solani and A. alternata / D. M. Petrunak, B. J. Christ // Phytopathology. 1992. - Vol. 82, № 12. - P. 1343—1347.

161. Pryor, В. M. Molecular phylogenetic relationships amongst Alternaria species and related fungi based upon analysis of nuclear ITS and mt SSU rDNA sequences / В. M. Pryor, R. L. Gilbertson // Mycological Research. -2000. Vol. 104,№ 11.-p. 1312—1321.

162. Pryor, В. M. A PCR-based assay for detection of Alternaria radicina on carrot seed / Pryor В. M., R. L. Gilbertson // Plant Disease. 2001. - Vol. 85, № 1. - P. 18—23.

163. Pryor, В. M. Morphological, pathogenic, and molecular characterization of Alternaria isolates associated with Alternaria late blight of pistachio / В. M.

164. Pryor, Т. J. Michailides // Phytopathology. 2002. - Vol. 92, № 4. - P. 406— 416.

165. Pryor, В. M. Molecular characterization of Embellisia and Nimbya species and their relationship to Alternaria, Ulocladium and Stemphylium / В. M. Pryor, D. M. Bigelow // Mycologia. 2003. - Vol. 95, № 6. - P. 1141—1154.

166. Rabie, C. J. Enumeration of fungi in barley / C. J. Rabie, A. Liibben, G. J. Marais, H. Jansen van Vuuren // International Journal of Food Microbiology. -1997.-Vol. 35.-P. 117—127.

167. Ram, B. Effect of artificial inoculation of Alternaria triticina on yield components of wheat / B. Ram, L. M. Joshi // Zeitschrift fur Pflanzenkrankhaiten und Pflanzenschutz. 1979. - Bd. 86, № 12. - S. 741— 744.

168. Ram, B. Effect of nitrogen on leaf blight of wheat and losses in yield compounds / B. Ram, L. M. Joshi // Zeitschrift fur Pflanzenkrankhaiten und Pflanzenschutz. -1981. Bd. 88, № № 12. - S. 744—747.

169. Rao, P. H. V. Fungal succession on Sorghum seed harvested at different stages of maturity / P. H. V. Rao, P. Giridhar, S. M. Reddy // Indian Phytopathology.-2000.-Vol. 53,№ l.-P. 102—104.

170. Rotem, J. The genus Alternaria. Biology, epidemiology and pathogenicity / J. Rotem. St. Paul: APS Press. -1994. - 326 pp.

171. Rozen, S. Primer3 / S. Rozen, H. J. Skaletsky // http://www-genome.wi.mit.edu/genome software/other/primer3 .html. -1998.

172. Rybicki, E. PCR primer design and reaction optimisation / E. Rybicki // A manual of online molecular biology techniques. 3rd edition. Eds. V. E. Coyne, M. D. James, S. J. Reid, E. P. Rybicki. -http://www.mcb.uct.ac.za/manual/MolBiolManual.htm. — 2005.

173. Sambrook, J. Molecular cloning. A laboratory manual. 3rd edition. Vol. 2 / J. Sambrook, D. W. Russell. Cold Spring Harbour - New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press. - 2001.

174. Samson, R. A. Introduction to food- and airborne fungi. 6 edition / R. A. Samson, E. S. Hoekstra, J. C. Frisvad, O. Filtenborg // Utrecht: Centraalbureau voor schimmelcultures. 2000. - 389 pp.

175. Schneider, S. Arlequin ver. 2.000. A Software for Population Genetic Data Analysis / S. Schneider, D. Roessli, L. Excoffier. Genetics and Biometry Laboratory, University of Geneva, Geneva. - 2000.

176. Seitz, L. M. Weathered grain sorghum: natural occurrence of alternariols and storability of the grains / L. M. Seitz, D. B. Sauer, H. E. Mohr, R. Burroughs // Phytopathology. -1975. Vol. 65, № 11. - P. 1259—1263.

177. Serdani, M. Characterisation of Alternaria species-groups associated with core rot of apples in South Africa / M. Serdani, J.-Ch. Kang, B. Andersen, P. W. Crous // Mycological Research. 2002. - Vol. 106, № 5. - P. 561—569.

178. Sidhu, O. P. Blossom Blight of Guayule Caused by Alternaria infectoria / O. P. Sidhu, H. M. Behl // Plant Disease. -1991. Vol. 75, № 7. - P. 748—749.

179. Singh, V. K. PCR primer design / V. K. Singh, A. Kumar // Molecular Biology Today. 2001. - Vol. 2, № 2. - P. 27—32.

180. Simmons, E. G. Typification of Alternaria, Stemphylium, and Ulocladium / E. G. Simmons // Mycologia. -1967. Vol. 59. - P. 67—92.

181. Simmons, E. G. Helminthosporium allii as type of a new genus / E. G. Simmons // Mycologia. -1971. Vol. 63, № 2. - P. 380—386.

182. Simmons, E. G. Alternaria themes and variations (22-26) / E. G. Simmons // Mycotaxon. -1986. Vol. 25, № 1. - P. 287-308.

183. Simmons, E. G. Macrospora Fuckel (Pleosporaceae) and related anamorphs / E. G. Simmons // Sydowia. -1989. Vol. 41. - P. 314—329.

184. Simmons, E. G. Alternaria themes and variations (27-53) / E. G. Simmons // Mycotaxon. -1990. Vol. 37. - P. 79—119.

185. Simmons, E. G. Alternaria taxonomy: current status, viewpoint, challenge / E. G. Simmons // Alternaria. Biology, plant diseases and metabolites. Eds. J. Chelkowski, A. Visconti. Amsterdam: Elsevier. - 1992. - P. 1—36.

186. Simmons, E. G. Alternaria themes and variations (63-72) / E. G. Simmons // Mycotaxon. -1993. Vol. 48. - P. 91—107.

187. Simmons, E. G. Alternaria themes and variations (73) / E. G. Simmons, R. G. Roberts // Mycotaxon. 1993. - Vol. 58. - P. 109—140.

188. Simmons, E. G. Alternaria themes and variations (106-111) / E. G. Simmons // Mycotaxon. -1994. Vol. 50. - P. 409—427.

189. Simmons, E. G. Alternaria chronology and catalogue raisonne. Part I: 17961871 / E. G. Simmons // Mycotaxon. 1995a. - Vol. 55. - P. 1—53.

190. Simmons, E. G. Alternaria themes and variations (112-144) / E. G. Simmons // Mycotaxon. 1995b. - Vol. 55. - P. 55— 163.

191. Simmons, E. G. Alternaria themes and variations (145-149) / E. G. Simmons // Mycotaxon. -1996. Vol. 57. - P. 391—409.

192. Simmons, E. G. Alternaria themes and variations (236-243). Host-specific toxin producers / E. G. Simmons // Mycotaxon. 1999. - Vol. 83. - P. 127— 145.

193. Simmons, E. G. Alternaria themes and variations (305-309). Lewia/Alternaria revisited / E. G. Simmons // Mycotaxon. 2002. - Vol. 70. -P. 325—369.

194. Singh, M. Varietal reaction of wheat to leaf blight in Haryana / M. Singh, P. D. Tyagi // Indian Phytopathology. -1979. Vol. 32, № 4. - P. 635.

195. Singh, V. K. PCR primer design / V. K. Singh, A. Kumar // Molecular Biology Today. 2001. - Vol. 2, № 2. - P. 27-32.

196. Sokhi, S. S. Alternaria blight on wheat in India / S. S. Sokhi // Proceedings of the National Academy of Science USA. -1974. Vol. 20, № 1. - P. 55—56.

197. Sokhi, S. S. Estimation of losses in yield due to leaf blight disease of wheat caused by Alternaria triticina / S. S. Sokhi, L. M. Joshi // Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. -1974. Vol. 4, № 1. - P. 29—33.

198. Stack, M. E. Mutagenicity of the Alternaria Metabolites Altertoxins I, II, and III / M. E. Stack, M. J. Prival // Applied and Environmental Microbiology. -1986. Vol. 52, № 4. - P. 718—722.

199. StatSoft, Inc. Electronic Statistics Textbook. Tulsa, OK, USA: StatSoft. http://www.statsoft.com/textbook/stathome.html. - 2004.

200. Stinson, E. E. Mycotoxin production in whole tomatoes, apples, oranges, and lemons / E. E.Stinson, S. F. Osman, E. G. Heisler, J. Siciliano, D. D. Bills // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1981. - Vol. 29, № 4. - P. 790—792.

201. Taylor, J. W. The evolutionary biology and population genetics underlying fungal strain typing / J. W. Taylor, D. M. Geiser, A. Burt, V. Koufopanou // Clinical Microbiology Reviews. 1999. - Vol. 12, № 1. - P. 126—146.

202. Tweedy, В. G. The taxonomy of Alternaria and species of this genus reported on apples / B. G. Tweedy, D. Powell // The botanical review. 1963. - Vol. 29, №3.-P. 405—412.

203. Van de Peer, Y. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment / Y. Van de Peer, R. De Wachter // Computer Applications in Bioscience. -1994. Vol. 10. - P. 569—570.

204. Verma, V. S. Fungi associated with sorghum seeds / V. S. Verma, A. M. Khan // Mycopathologia et Mycologia Applicata. 1965. - Vol. 27, № 3-4. -P. 314—320.

205. Visconti, A. Alternaria toxins / A. Visconti, A. Sibilia // Mycotoxins in grains, compounds other than aflatoxins. Eds. J. D. Miller, H. L. Trenholm. -St. Paul, MN: Eagan Press. 1994. - P. 315—336.

206. Vos, P. AFLP a new technique for DNA-fingerprinting / P. Vos, R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. Vandelee, M. Homes, A. Frijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper, M. Zabeau // Nucleic Acids Research. -1995. - Vol. 23. -P. 4407—4414.

207. Waldron, L. R. Increase of kernel weight in common wheat due to black point disease / L. R. Waldron // Journal of Agricultural Research. 1934. -Vol. 48, № 11.-P. 1017—1024.

208. Webley, D. J. Mycotoxins in cereals a comparison between North America, Europe and Australia / D. J. Webley, K. L. Jackson // Australian Postharvest Technical Conference. -1998. - P. 63—66.

209. Weir, T. L. RAPD-PCR analysis of genetic variation among isolates of Alternaria solani and Alternaria alternata from potato and tomato // T. L.

210. Weir, D. R. Huff, B. J. Christ, C. P. Romaine // Mycologia. 1998. - Vol. 90, №5.-P. 813—821.

211. Williams, J. G. K. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J. G. K. Williams, A. R. Kubelik, J. Livak, J. A. Rafalski, S. V. Tingey // Nucleic Acids Research. 1990. - Vol. 18. - P. 6531—6535.

212. Williamson, P. Black point of wheat: in vitro symptoms, enzymes involved and association with Alternaria alternata / P. Williamson // Australian Journal of Agricultural Research. -1997. Vol. 48. - P. 13—19.

213. Wiltshire, S. P. The foundation species of Alternaria and Macrosporium / S. P. Wiltshire // Transactions of British Mycological Society. 1933. - Vol. 18. -P. 135—160.

214. Yang, S.-M. A new pathogen of Plantain / S.-M. Yang, S. C. Jong, F. M. Dugan // Plant Disease. -1996. Vol. 80, № 12. - P. 1429.

215. Yeh, F. C. Popgene Version 1.31. Microsoft Windows-based Freeware for population Genetic Analisys / F. C. Yeh, R. Yang, T. Boyle. University of Alberta, Canada. -1999.

216. Yekeler, H. Analysis of toxic effects of Alternaria toxins on esophagus of mice by light and electron microscopy / H. Yekeler, K. Bitmis, N. Ozcelik, M. Z. Doymaz, M. Calta // Toxicologic Pathology. 2001. - Vol. 29. - P. 492— 497.

217. Yli-Mattila, T. Isozyme and RAPD-PCR analyses of Fusarium avenaceum strains from Finland / T. Yli-Mattila, S. Paavanen, A. Hannukkala, P. Parikka, R. Tahvonen, R. Karjalainen // Plant Pathology. -1996. Vol. 45. - P. 126— 134.

218. Yu, S. H. Korean species of Alternaria and Stemphylium / S. H. Yu // Suwon: National Institute of Agricultural Science and Technology. 2001. - 212 pp.

219. Yung-nien, Y. A preliminary study of seed-inhabiting fungi of rice / Y. Yung-nien // Acta agriculturae Sinica. -1953. Vol. 4, № 2. - P. 139—153.

220. Zhang, T. A.-Y. Taxonomic studies of Alternaria from China. VIII. New species and new records on Gramineae, Iridaceae, and Liliaceae / T. A.-Y. Zhang // Mycotaxon. -1999. Vol. 72. - P. 443—453.

Информация о работе

Ганнибал, Филипп Борисович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2006
ВАК 03.00.24

Диссертация

Грибы рода Alternaria Nees на злаках: видовой состав и внутривидовое разнообразие - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно