Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гомо- и гетеродимеризация трансмембранных сегментов рецепторов семейства ERBB

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Гомо- и гетеродимеризация трансмембранных сегментов рецепторов семейства ERBB"

89

4603789

на правах рукописи

У?

'-"'YJ

Минеев Константин Сергеевич

ГОМО- И ГЕТЕРОДИМЕРИЗАЦИЯ ТРАНСМЕМБРАННЫХ СЕГМЕНТОВ РЕЦЕПТОРОВ СЕМЕЙСТВА ERBB

03.01.02 -Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 О К юн 2010

Москва-2010

004603789

Диссертация выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Арсеньев Александр Сергеевич Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, Шайтан Константин Вольдемарович профессор

Защита состоится 10 июня 2010 г. в 14 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, «Новая» аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Автореферат разослан 7 мая 2010 г.

Христофоров Владимир Сергеевич

кандидат физико-математических наук

Ведущая организация:

Российский кардиологический научно-производственный комплекс ФГУРКНПК РосМедТехнологий

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

М.Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Клетки используют мембраны для разделения двух биологически различных сред. Транспорт вещества, передачу сигналов и энергии через эти барьеры, а также ряд других клеточных функций осуществляют мембранные белки (МБ). Приблизительно треть от всех структурных генов кодируют именно такие белки. Однако, лишь одна из каждых пятисот расшифрованных структур высокого разрешения принадлежит белкам этого класса. Значительная роль МБ (таких как рецепторы, ионные каналы и др.) в процессах функционирования клетки объясняет важность создания новых медицинских препаратов, направленно действующих на МБ, для чего, в первую очередь, необходимо понять принципы их пространственной организации и механизмы работы. В этой связи, необходимо знать, каким образом белок взаимодействует с мембраной, как изменяется его конформация при функционировании, насколько велика роль трансмембранного домена для его работы.

Одной из наиболее часто встречающихся вторичных структур МБ являются полиспиральные участки, где две или несколько а-спиралей образуют домены, взаимодействующие как с мембраной, так и между собой. На настоящий момент, доказано, что специфические взаимодействия между спиралями участвуют в работе МБ, обеспечивая переход рецепторов из активного в неактивное состояние. Наиболее удобным объектом для исследования а-спиральных мембранных белков являются рецепторные тирозин киназы (РТК), имеющие всего один трансмембранный сегмент, и активные в форме димера. Важным семейством РТК являются рецепторы ЕгЬВ, участвующие в регуляции широкого спектра клеточных процессов: пролиферация, дифференцировка, клеточная подвижность и др., и вовлеченные в развитие ряда заболеваний, в том числе раковых опухолей. В настоящей работе методом ЯМР исследованы комплексы, образованные спиральными трапсмембранными сегментами рецепторов семейства ЕгЬВ в средах, имитирующих мембранное окружение.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось определение структурных и динамических характеристик трансмембранных (ТМ) доменов трех рецепторов семейства, ЕгЬВ: ЕгЬВ2, ЕгЬВ4, ЕСР11/ЕгЬВ2 в средах, имитирующих мембранное окружение методами спектроскопии ЯМР и изучение их связи с биологической функцией. Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Отнесение сигналов в гетероядерных ЯМР спектрах ТМ доменов в мембраноподобном окружении.

2. Определение и сравнение пространственных структур димеров ТМ доменов.

3. Анализ зависимости энергии спираль-спирального взаимодействия от характеристик поверхности трансмембранных а-спиралей.

4. Изучение динамических характеристик димеров ТМ доменов.

5. Анализ влияния известных патогенных мутаций на пространственную структуру мембранных доменов.

Научная новизна и практическая значимость работы. Следующие результаты, изложенные в представленной диссертационной работе, получены впервые:

1. Методами спектроскопии ЯМР высокого разрешения получены три пространственные структуры а-спиральных МБ (на момент начала работы таких структур было получено всего 3).

2. Предложена оригинальная методика расчета пространственной структуры гомодимеров из данных спектроскопии ядерного эффекта Оверхаузера.

3. Показана зависимость свободной энергии взаимодействия а-спиралей от количества и силы стабилизирующих структуру межспиральных водородных связей боковых цепей белка, а также неканонических водородных связей типа СН-' 'О.

4. Доказано соответствие определенных в настоящей работе пространственных структур активному состоянию рецептора.

5. На примере полученных структур объяснен механизм активации опухолевой трансформации известными мутациями в трансмембранных доменах белков семейства ЕгЬВ.

6. Детально описаны процессы медленного конформационного обмена, происходящие при взаимодействии пары а-спиралей.

Полученные пространственные структуры, а также данные о природе спираль-спиральных взаимодействий могут послужить отправной точкой при рациональном моделировании новых типов лекарственных препаратов, направленно действующих на а-спиральные ТМ домены ряда МБ.

Полученные пространственные структуры вместе с данными о патогенных мутациях являются подтверждением предложенной ранее (МопК е1 а1., 2001) модели активации рецепторов семейства ЕгЬВ.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на 49 и 50 научных конференциях МФТИ (Москва, 2006, 2007), на 4-м международном симпозиуме «ЯМР в конденсированных средах» (Санкт-Петербург, 2007), VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А, Овчинникова (Москва, 2006), международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии м бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю. А. Овчинникова (Москва, 2009), международной практической школе европейского молекулярно-биологического общества «Многомерный ЯМР в структурной биологии» (Иль Чокко, Италия 2008), на международных конгрессах Е1ЛЮМАК-2008 (Санкт-Петербург, 2008) и ЕШОМАЯ-2009 (Гётеборг, Швеция, 2009), а также на международной конференции по магнитному резонансу в биологических системах (Гетгинген, 2006). Работа неоднократно докладывалась на семинарах лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН.

Часть работы является победителем конкурса научно-исследовательских работ студентов и аспирантов на 50 конференции МФТИ (Москва, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 3 работы в реферируемых научных журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав (обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения), а также заключения и выводов. Работа

проиллюстрирована 30 рисунками, содержит 11 таблиц. Библиографический указатель содержит 179 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и основные задачи работы, отражены научная новизна и практическая значимость работы.

В Главе 1 представлен литературный обзор, в котором дано описание свойств различных сред, моделирующих мембранное окружение, обсуждены современные подходы к выбору мембраноподобной среды, представлены различные методы исследования массивных объектов при помощи спектроскопии ЯМР, изложены современные представления о механизмах функционирования рецепторных тирозин киназ семейства ErbB.

В Главе 2 изложены основные экспериментальные методики, используемые в работе. Наработка (в E.Coli) и выделение ТМ сегментов рецепторов ErbBl, ErbB2 и ErbB4, а также их изотопно-меченых производных были проведены совместно с инженером лаборатории инженерии белка ИБХ РАН, E.H. Ткач (ЕгЬВ2, ЕгЬВ4) и с м.н.с. лаборатории биомолекулярной ЯМР спектроскопии ИБХ РАН к.ф.-м.н. Ю.Е. Пустоваловой. Дейтерированные липиды были предоставлены в.н.с. лаборатории биомолекулярной ЯМР спектроскопии ИБХ РАН д.х.н. Чупиным В.В.

В Главе 3 изложены результаты, полученные в работе.

Аминокислотные последовательности пептидов, исследованных в настоящей работе приведены на рис. 1.

ErbBltm EGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKR

ErbB2tm GCPAEQRAS PLTSI1SAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRK

ErbB4tm STLPQHARTPLIAAGVIGGL FILVIVGLT FAVYVRRKSIKKKRA

Рис. 1: Аминокислотные последовательности исследованных пептидов. Серым выделены мотивы спираль-спирального взаимодействия

Гидрофобная природа и спиральная конформация ТМ домена накладывает ряд ограничений на возможные методики его исследования. Для моделирования мембранного окружения в работе были использованы бицеллы - смешанные агрегаты двух типов фосфолипидов ДМФХ и ДГФХ, имеющие дисковидную форму. Необходимость использования липидных бицелл приводит к увеличению размера объекта и, следовательно, к уширению линий. Также в спектрах ЯМР симметричных гомодимеров ТМ сегментов невозможно отличить межмолекулярные взаимодействия (кросс-пики ЯЭО) от внутримолекулярных. Для преодоления описанных трудностей были использованы методы многомерной гетероядерной ЯМР спектроскопии и изотопная фильтрация для детектирования межмолекулярных взаимодействий.

Комбинация трех- и двумерных гетероядерных ЯМР-экспериментов с применением градиентов магнитного поля позволила получить практически полное отнесение сигналов ядер

15N, 13C и протонов. С помощью гетероядерной спектроскопии была изучена кинетика обмена амидных протонов на дейтерий растворителя, измерены константы спин-спинового взаимодействия (КССВ) гомоядерные 3JmcaJi и гетероядерные 3J\c/:ir, изучена подвижность NH групп основной цепи на основании времен 15N релаксации Ть Тг и 'H-15N NOE. Интерфейс димеризации был изучен прямыми методами - с помощью ЯМР-экспериментов с «изотопным гетеродимером» (эквимолярная смесь I5N,i3C -меченого и немеченого белка).

Отнесение сигналов в спектрахЯМР

Отнесение сигналов в ЯМР спектрах ТМ сегментов в комплексе с липидной бицеллой проведено с использованием гетероядерных спектров 15n-, 13C-HSQC, HNCA, HN(CO)CA, 15n-NOESY-HSQC и 13C-HCCH-TOCSY. Сначала в спектре 15N-HSQC были идентифицированы все возможные кросс-пики Hn/15N, соответствующие сигналам от NH и NH2 групп пептида (рис. 2). Далее в спектре HNCA нашли цепочку контактов Cafi-l)-HN(i)-Cafi). Последовательное отнесение сигналов ТМ участков было продолжено на основании предположения об их а-спиральной структуре. В спектрах NOESY-HSQC для 15М-меченного образца, релаксация в котором медленнее и соответственно менее широкие сигналы, присутствуют характерные интенсивные кросс-пики между пространственно сближенными протонами, такими как HN(/)-HN(/+/), Hu(;)-IIN(/+/), Ha(/)-HN(/+3) и Hp(/)-HN(/+/), если белок находится в a-спиральной конформации. При помощи данного подхода оказалось возможным полное отнесение сигналов от протонов, а также от ядер 15N и 13С основной цепи пептида (Рис.2).

Отнесение боковых цепей проводилось по спектрам 13C-HCCH-TOCSY и 13C-NOESY 60 мс в D2O и 13C-NOESY 60 мс в Н2О. Срезы Н-Н-(Са) делались для всех кросс-пиков существующих в nC-HSQC спектре. После этого на частоте каждого сигнала в срезе исследовалась плоскость 'H,13C-HSQC, находился химический сдвиг сигнала соответствующего |3С ядра и т.д. Отнесение сигналов от ароматических колец остатков Phe, Туг, His было сделано по спектрам 13C-HSQC и двумерным гомоядерным TOCSY и NOESY спектрам.

Полные таблицы химических сдвигов сигналов были помещены в базу данных BMRB (http://www.mol.bmrb.ethz.edu) под идентификационными номерами 7205 (ЕгЬВ4), 15231 (ЕАВ2) и 16658 (ЕгЬВ1/ЕгЬВ2)

Рис. 2. Ю Н, И-ШОС спектры образцов

ЕгЬВ Ит/ЕгЬЬ2(т[ 5,^, ¡зс (А) и ЕгЬВИтннпзс/ЕгЬВ^т (В),

гомодимера ЕгЬВ2йп (С) и гомодимера ЕгЬВ41т (I)) с отнесением сигналов. Спектры снимались в растворе бицелл ДМФХ/ДГФХ 1:4 при рН 5.0, 40°С, на спектрометрах с рабочей частотой по протонам 800 МГц (А,В) и 600 МГц(С,Б)

Динамические характеристики объектов исследования

Необходимым этапом исследования было измерение динамических характеристик пептид-липидных агрегатов и отдельных участков полипептидной цепи ТМ доменов. Для этого были получены данные динамического светорассеяния о размерах бицелл и из экспериментов ЯМР рассчитаны времена продольной и поперечной релаксации, а также величина ЯЭО для 15N ядер всех остатков, кросс-пики от NH-групп которых могут быть отдельно проинтегрированы в спектрах lsN-HSQC. Исходя из полученных параметров ЯМР-релаксации, были рассчитаны времена вращательной корреляции для большинства N-H векторов ТМ доменов (tr), а также в программе TENSOR было определено время вращательной корреляции движения частиц как целого (то).

Эксперименты со светорассеяниям показали, что все три объекта представляют из себя монодисперсный раствор пептид-липидных частиц с гидродинамическим радиусом агрегатов 2.4±0.2 нм у образцов ErbB2tm, 2.8±0.3 нм у ErbBltm/ErbB2tm и 2.6±0.2 нм у ErbB4tm, что близко к гидродинамическому радиусу 2.6 нм для "пустой" бицеллы ДМФХ/ДГФХ 1:4.

Для исследуемых объектов то составило 15 не у ErbB4tm, 17 не у ErbB2tm и 17 не у ErbBltm/ErbB2tm; глобулярный водорастворимый белок с такими характеристиками имел бы массу 38, 42 и 42 кДа соответственно, что согласуется с предполагаемой массой бицеллы, состоящей из 60-75 молекул липидов и димера ТМ сегмента (рис. 3).

5

Следует отметить, что в случае анизотропного вращения бицеллы то будет зависеть не только от ее массы, но и от ориентации N11 векторов (в случае а-спиралей это соответствует ориентации всей спирали) относительно главных осей эллипсоида инерции бицеллы. Если для гомодимеров на основании данных ЯМР релаксации мы не можем говорить о топологии ТМ сегментов в фосфолипидной частице, то в случае гетеродимера ЕгЬВЦт/ЕгЬЕШт ТМ сегменты будут иметь различное положение в диске бицеллы, что следует из статистически различных значений ю для двух спиралей: 16 и 17 не. ТМ спираль ЕгЬВ1 менее наклонена по отношению к нормали диска, в то время как угол между осью спирали ЕгЬВ2 и осью самого быстрого вращения бицеллы меньше. Это согласуется с различной длинной ТМ а-спиралей ЕгЬВИт и ЕгЬВ2Цп. Более короткий спиральный участок ЕгЬВИш вынужден ориентироваться вдоль нормали к поверхности диска бицеллы, чтобы свести к минимуму энергетически неблагоприятное заглубление полярных остатков в гидрофобную область.

ЕгЪВ1/ЕгЬ82/В1 ЕгЬВ1 /ЕгЬВ2/В2

ЕгЬВ4 ЕгЬВ2

Рис. 3. Зависимость времени корреляции N-11 векторов от номера остатка в аминокислотной последовательности ЕгЬВНт (вверху слева) и ЕгЬВ2йп (вверху справа) в составе гетеродимера ЕгЬВИт/ЕгЬВ2(т, а также ЕгЬВ^Ят (внизу слева) и ЕгЬВ2Цп (внизу справа) в составе гомодимеров, встроенных в бицеллу ДМФХ/ДГФХ 1:4. Времена вращательной корреляции рассчитаны из соотношения времен продольной и поперечной релаксации, измеренных по серии 'Н,15№Н8(ЗС спектров, с варьируемой задержкой на релаксацию._

Данные релаксации также позволяют сделать вывод о локальной подвижности и предположения о вторичной структуре ТМ доменов. Значения 15^'Н} NOE, 15К Ть Т2 и тя довольно сильно зависят от расположения остатка в аминокислотной последовательности (рис. 3). Участки с ограниченной подвижностью (большое Тк) соответствуют встроенным в

бицеллу ТМ спиралям, в то время как более подвижные остатки соответствуют неструктурированным примембранным участкам белка. Согласно динамическим характеристикам a-спиралям соответствуют участки 650-677 у ErbB4tm, 652-678 у ErbB2tm как в гомо-, так и в гетеродимере, и 647-670 у ErbBltm. Меньшая длина ТМ сегмента ErbBl по сравнению с ЕгЬВ2 также свидетельствует о несимметричной ориентации спиралей гетеродимера в фосфолипидных бицеллах. Измеренные параметры ЯМР релаксации продемонстрировали во всех трех случаях наличие движений в пикосекундном диапазоне в примембранных фрагментах и не выявили медленных движений в микро- и миллисекундном диапазоне. Интересной выглядит уменьшенная по сравнению с другими примембранными остатками подвижность остатка M1I ErbBl, который находится вне ТМ спирали, но, судя по всему, взаимодействует с поверхностью бицеллы.

Элементы вторичной структуры

Без предварительных расчетов вторичную структуру белка можно определить исходя из анализа системы контактов ЯЭО (рис. 15), полученных из экспериментов NOESY-HSQC, КССВ 3J/ívg<// и скоростей обмена амидных протонов с растворителем. Так, участки полипептидной цепи с малыми значениями КССВ (*Jimcaii< 6 Гц), для которых наблюдаются интенсивные кросс-пики ЯЭО NH(i)/NH(i+1) и менее интенсивные CaH(i)/HN(i+1), CaH(i)/NH(i+3) и CaH(i)/NH(i+4), а также те, чьи амидные группы демонстрируют замедленный обмен с растворителем, представляют собой а-спирали.

Отличия химических сдвигов сигналов каждого аминокислотного остатка от табличного значения для данного остатка в конформации «неупорядоченный клубок» (так называемый вторичный химический сдвиг, Д5=8белок-8"клубок") также характеризует тип вторичной структуры полипептидной цепи. Д8 для сигналов протонов СаН как правило имеет положительно значение для остатка в развернутом участке полипептидной цепи (Р-тяж) и отрицательное - в спиральной конформации. На рис. 4 представлены распределения внутримолекулярных ЯЭО контактов, контактов с атомами головных групп липидов, а также значений КССВ и скоростей обмена амидных протонов на дейтерий растворителя для всех трех исследованных объектов. Из рис. 4 следует, что ТМ сегменты, за исключением N- и С-концевой части, имеют конформацию a-спирали. Вторичные химические сдвиги для атомов: N, СПН, Са, СО и Ср также являются чувствительными в основном к вторичной структуре белка и их значения были использованы для предсказаний значений торсионных углов основной цепи в программе TALOS. Точность таких предсказаний в применении к а-спиральным белкам составляет более 95%. Эта процедура оказалось более надежной, чем использование КССВ, рассчитанных из соотношения интенсивностей кросс-пика и диагонального пика в спектре HNCA. Это связано с тем, что ошибка измерения КССВ растет с увеличением размера объектов. Более того, для объектов с быстрой поперечной релаксацией и преимущественно малыми КССВ (3Jhncuh в a-спиралях равно ~4Гц), к которым относятся исследуемые пептиды, возможна только верхняя оценка константы 3JhncqH. Полученные из вторичных химических сдвигов значения торсионных углов использовались при расчете пространственной структуры ТМ доменов.

л

651 661 671 681

вСРАЕ(2КАЗР1.Т3113АУУС11.1,УУУ1,вУУЕв11.1К1*Н0{1К1ЯК

«МЧ-И) <ЫЧ+Ч

<М'.М>

имчт

№вх

ЫОЕИр

В

••««• О

• • • •

□□I

00*1

651 661 671 661

ЗТЬРОНА11ТР1.1АА6У10еЬГ11.У1Ув1.ТЕАУУУНКК31ККККА

<ЫЧ+3>

О-ех /й» ТОЕИр

• ММ«

••• •••

□□□□□I

• • ••••«•(

• •••

641 651 661 671

ЕгсРТНбРК1Р31АТгМУСА1.ЬЬЬЬУУАЬб1СЬЕМЯККВ1УККК

«.1+4 <Ыи+1)

^N(1.1+1)

<Ыи+з>

4хы(и+4) О-ех чч-ех МОЕИр

□ □I

• • (М • •

• II

• •

651 661 671 661

ССЕАЕ(2КАЗР1.Т3113АУУв11.1,УУУ1.СУУЕО1ЫКН1100 К1НК

«.¡+1) ■иСи+1)

<Ыи+з) И,в«,|+з) <Ы»+Ч

□-ех 1/У-ех ЧОЕПр

О

□ □I

00*1

Рис. 4. Распределение контактов ЯЭО, скорости обмена амидных протонов с водой (\У-ех), измеренные по интенсивности обменных пиков на воду в спектрах ЫОЕ5У, и с дейтерием растворителя (О-ех), а также контакты ЯЭО на головные группы липидов (ЫОЕНр) ЕгЬВ2 (А), ЕгЬВ4 (В), ЕгЬВ 1 в гетеродимере с ЕгЬВ2 (С) и ЕгЬВ2 в гетеродимере с ЕгЬВ1 (О). О-ех - время полуобмена ( тщ ) амидного протона на дейтерий растворителя. Заполненными квадратами обозначены остатки с Т|/2 > 2 часов, пустыми - с 1< х\а < 2, для остальных остатков время полуобмена амидного протона на дейтерий было меньше часа. Кругами отмечены остатки, для которых в спектрах ЯЭО наблюдались обменные пики на воду, то есть чьи N1-1 группы обмениваются с водой быстрее, чем за 50 мс. Крестами обозначены остатки, с боковых цепей которых были обнаружены ЯЭО контакты на головные группы липидов. с1 - последовательные и среднего диапазона контакты ЯЭО, характеризующие вторичную структуру ТМ сегментов. Контакты обозначены как ёдв(У) и соответствуют интенсивностям кросс-пиков ЯЭО между протонами А и В остатков 1 и N. а и р обозначают протоны N1-1, СаН и СрН соответственно. Более толстые линии соответствуют более интенсивным кросс-пикам в спектрах 15М^ОЕ8У-Н80С или 13С-НОЕ5У-Н50С с тт =50 мс._

Локализованные при помощи анализа контактов ЯЭО и химических сдвигов а-спирали для всех объектов соответствовали менее подвижным регионам, полученным исходя из данных ЯМР релаксации.

Соответствие вторичной структуры мембранных доменов, встроенных в бицеллы ДМФХ/ДГФХ, структуре тех же объектов в липосомах ДМФХ проверено при помощи КД спектроскопии (пример приведен на рис. 4). Полученные для всех трех димеров данные продемонстрировали практически полную идентичность вторичной структуры в обеих средах, спиральность для всех образцов составила ~70%.

Расчет пространственной структуры

Расчет пространственной структуры ТМ димеров по данным ЯМР-спектроскопии включал в себя четыре этапа: (1) анализ локальной структуры с помощью модулей HABAS и GRIDSEARCH программы CYANA, (2) расчет пространственной структуры мономера белка и отбор в спектрах ЯЭО контактов, не соответствующих структуре мономера, такие контакты могут являться суммой внутримономерных и межмолекулярных кросс-пиков ЯЭО, (3) прямой поиск межмономерных контактов и (4) окончательный расчет пространственной структуры димера.

Локальная структура ТМ сегментов получена на основании отнесений кросс-пиков ЯЭО в спектрах 15N-NOESY-HSQC (тт=60 мс) и ограничений на углы ф, *|/ и х'> которые рассчитывались при анализе пространственной структуры с учетом стерически разрешенных величин этих углов, КССВ íJhsc<üi и 3Jncí¡h, а также результатов программ TALOS. На этом этапе было сделано стереоспецифическое отнесение нр-протонов, и, где возможно, метальных групп валинов и лейцинов. Затем было рассчитано 100 пространственных структур, из которых для дальнейшего анализа выбиралось 10 с наилучшей штрафной функцией. Полученные структуры подавались на вход модуля GLOMSA для поиска стереоспецифического отнесения сигналов СНг-групп боковых цепей. В случае нарушения ограничений на расстояния, производили поиск ошибок в отнесении кросс-пиков ЯЭО. После нескольких итераций расчетов и анализа полученных структур вводились ограничения на водородные связи. Ряд ограничений на межпротонные расстояния на интерфейсе димеризации нарушался во всех расчетах, что говорит о наличии межмономерной составляющей в соответствующих кросс-пиках. Такие контакты были убраны из внутримономерных ограничений и добавлены в межмономерные с увеличенной погрешностью.

Наличие в ЯМР спектрах гомодимеров только одного основного (см. ниже) набора кросс-пиков и отсутствие в ТМ регионе дальних контактов (между протонами удаленных более на чем на 4 остатка в аминокислотной последовательности) позволяет сделать вывод, что димеры параллельны и симметричны в шкале времени ЯМР. Поэтому для расчета пространственной структуры димера к С-концу аминокислотной последовательности одного мономера была добавлена такая же последовательность, связанная с первой цепью из 10 подвижных псевдо-остатков с длинной основной цепью (5 А на остаток). Аминокислотные остатки второго мономера получили порядковые номера i+¡00, для них были продублированы все ограничения на межпротонные расстояния (из ЯЭО контактов), водородные связи и двугранные углы. Ограничения на межмономерные контакты также были симметризованы.

Ограничения на межмономерные контакты были получены из ЯМР-экспериментов с образцом изотопного «гетеродимера» (рис.5). Введенные в расчет межмономерные контакты не изменили конформацию мономера. Всего при расчете структур ЕгЬВ2, ЕгЬВ4 и ЕгЬВ1/ЕгЬВ2 было наложено 20, 12 и 13 межмолекулярных ограничений на расстояния соответственно. Межмономерные кросс-пики в основном обнаружены в фильтрованных ЯЭО экспериментах, однако в нефильтрованных спектрах гомодимера ЕгЪВ21ш дополнительно идентифицировано 4 кросс-пика, которые никак не могли удовлетворяться в отсутствие спираль-спирального взаимодействия.

Из-за быстрой релаксации, приводящей к потере чувствительности, в спектрах ЯМР больших объектов большинство обнаруженных контактов ЯЭО соответствуют взаимодействиям метальных групп, так как они релаксируют наиболее медленно. По этой причине, чтобы избежать неправильной интерпретации данных, в программе СУАЫА был проведен обратный расчет кросс-пиков в спектрах ЯЭО исходя из структуры, в предположении, что все межпротонные расстояния менее 3.0 А должны соответствовать кросс-пикам в спектре. В случае отсутствия предсказанного пика вводились нижние ограничения на расстояния.

Окончательный расчет пространственных структур ТМ доменов ЕгЬВ проводился с учетом всех полученных данных. Из 100 рассчитанных структур для дальнейшего анализа было взято 10 (таблица 1) с наилучшей штрафной функцией. Анализ результатов был проведен в программе МОЬМОЬ. По данным ЯМР-спектроскопии пространственная структура ТМ домена ЕгЬВ4 представляет собой стабильную а-спираль на участке 652-679, ЕгЬВ2 - на участке 651-678, ЕгЬВ1 на участке 648-671. Оси ТМ а-спиралей ЕгЬВ4№1, ЕгЬВ2йп и ЕгЬВИт/ЕгЬЕШт пересекаются под углом 0 = -45±Г, -42±2° и -43±Г (правая закрутка) соответственно и образуют параллельные димеры, симметричные в первых двух случаях (рис. 6). Расстояние между осями а-спиралей в димерах составило (1 = 7.0±0.4, 7.3±0.3 и 7.3±0.4 А. Параметры полученных наборов структур приведены в таблице 2.

Таблица 1 Параметры рассчитанных из данных ЯМР спектроскопии наборов пространственных структур гомодимеров ТМ сегментов ЕгЬВ2, ЕгЬВ4 и гетеродимера ЕгЬВ1/ЕгЬВ2. Участок стабильной структуры - остатки, демонстрирующие замедленную подвижность (рис. 3) и входящие в а-спирали.

ЕгЬВ2 ЕгЬВ4 ЕгЬВ1/ЕгЬВ2

Участок стабильной структуры 651-677 652-676 651-677,648-671

Среднеквадратичные отклонения координат атомов по набору структур,А

атомы основной цепи 0.30±0.09 0.32±0.10 0.59±0.19

все тяжелые атомы 0.93±0.18 0.87±0.16 1.37±0.22

Расстояние между спиралями </, А 7.3±0.3 7.0±0.4 7.3±0.4

Угол между спиралями 0, град. -43±1 -45±1 -42±2

Поверхность взаимодействия, Аг 720±10 660±10 720±10

в

нргьббз нрз ЬббЗ 2

■неоднотачн.

-На У664 -ОР 5656

.НаЛ656 4 "НОА657

1.09 "И, м.д.

'н

м.д.

А657 1эСрНз (16.2 мл.)

'Н 3 мл.

глицерин гя/СНг глицерин

1.62 'Н, мд

<зь

1.30

■н, мд.

Т652 (ЗОЛ м.л.)

-На С649 пЗ-СНг

глицерин т1-СШ глицерин РО-СШ холин

.tn2-C.il

глицерин

и? 'Н, мл-

1

. ___--¿и

\ [ ^'.и

А653

«ерш

(15.7 мл)

-1—

1.55 Н, м.д.

Н5, ЬббЗ Ну, У659 Ну, У659

•НР У659

■Н

мл-3

»■¿-СШ

шцерин 4 ■На 8656 ™/-СН!

шцерин неодн.

'Н 3 м.д.

|55

|Нз мл.)

15, 1.652 5, 1.652 1

'Н 3 мл-

На в65|

■неодн.

1.62 'Н, мл.

М650 "С«Нз-(14.7 м.д.)

Ну, 1655 ■Ну, У659

?.-СН2

'холин

лмМН.'

'глицерин

М1-С Н2

глицерин

*п2-СН2

глицерин

2.07 Н. мл.

н

;л.?-СН2 глицерин *пГ-СН1

глицерин РО-СН2

холин

138

'Н, мл.

Рис. 5. Двумерные срезы 13С-фильтрованных/|;,С-разделенных спектров ЯЭО ЕгЬВ21:т (А, В), ЕгЬВ 1Ш1 15н.пс/ЕгЬВ21ш (С. Э), ЕгЬВит/ЕгЬЬгпп,™.,^ (Е, Р) и ЕгЬВ4йТ1(0. Н), соответствующие сигналам от метальных групп различных остатков.

в

Сэсг"

Рис. 6. Совмещенные по атомам основной цепи трансмембранных а-спиралей пространственные структуры ТМ доменов гетеродимера ЕгЬВ1/ЕгЬВ2 (А) и гомодимеров ЕгЬВ2 (В) и ЕгЬВ4(С). Боковые цепи отображены только для аминокислотных остатков, принимающих участие в спираль-спиральном взаимодействии.

Гидрофобные свойства взаимодействующих поверхностей.

В аминокислотной последовательности каждого из трех исследованных ТМ сегментов присутствуют два мотива спираль-спирального взаимодействия мембранных белков (рис. 1), называемые вС4 или ОхххО. Такой мотив был впервые обнаружен в гликофорине А и, как было показано, отвечает за плотную упаковку по принципу «гребень в желоб». Мотив представляет из себя последовательность из нескольких остатков с малой боковой цепью, сравнительно гидрофильных по своим свойствам, как то: глицин, аланин, серин и треонин; разделенных тремя другими остатками. Боковые цепи объемных остатков упаковываются в желоба на поверхности другой спирали, образуемые остатками с малой боковой цепью. Остатки серинов и треонинов также могут образовывать межмолекулярные водородные связи, однако, как было показано на примерах гликофорина А и ВшРЗ такие водородные связи могут не вносить существенного вклада в свободную энергии взаимодействия спиралей. Взаимодействие по Ов4 мотиву соответствует углу между осями параллельных спиралей порядка -40 градусов. Наличие двух мотивов в ТМ сегменте не позволяет заранее определить, по какому из них будет происходить взаимодействие. Более того, вероятно, что оба мотива используются при осуществлении белком своей функции - при переключении между активным и неактивным состояниями.

I ||.|рофк.|Ы1ММ 11Мроф|НЖМН

90 180 270 360 Угол вращения, град.

, 25 50 (онтактная

поверхность, отн. ед.

Рис. 7. Свойства поверхности взаимодействия а-спиралей в гомодимере ТМ сегментов ЕгЬВ2. А: Поверхность трансмембранной спирали ЕгЬВ2, окрашенная в соответствии с молекулярным гидрофобным потенциалом от зеленого к желтому. Основная и боковые цепи второй спирали показаны цилиндрами. В: Карта поверхности ТМ сегмента ЕгЬВ2. «Возвышенности» соответствуют гидрофобным областям, «низины» - относительно гидрофильным. Точками обозначен интерфейс взаимодействия. С: Доля поверхности аминокислотного остатка участвующая во взаимодействии между спиралями._

Расчет пространственной структуры на основе данных ЯМР спектроскопии показал, что все три исследованных ТМ сегмента взаимодействуют по Ы-концевым мотивам димеризации а-спиралей. В случае ЕгЬВ4пп гомодимер образовывался по сдвоенному мотиву 6ЯЬххАСххССхх1Ь, а в гомодимере ЕгЬВ2т1 контакт происходит по остаткам ^ТхххЗАхУвххЬУ, соответствующих Ы-концевому тандемному мотиву спираль-спирального взаимодействия. В гетеродимере ЕгЬВИт и ЕгЬВ2пп во взаимодействии принимают участие такой же, как и в гомодимере участок поверхности ЕгЬВ2№1 и сдвоенный Ы-концевой мотив 64!<ТОххОАххЬЬ ЕгЬВИт. Остатки с объемными боковыми цепями, окружающие мотивы, обеспечивают плотную упаковку.

Для всех рассчитанных структур был проведен анализ гидрофобных свойств поверхностей ТМ спиралей с использованием теории молекулярного гидрофобного потенциала (МГП), эмпирического потенциала, описывающего свободную энергию переноса из гидрофобной среды в гидрофильную участка поверхности боковой цепи аминокислоты в составе а-спирали. Как и предполагалось, во взаимодействии участвует наиболее гидрофильная область трансмембранных сегментов (рис. 7). Это согласуется с рядом известных гипотез о принципах упаковки трансмембранных спиралей. Однако, анализ гидрофобных свойств поверхностей также показывает, что на поверхности мономеров

присутствует вторая гидрофильная область, возможно отвечающая за переключение между активным и неактивным состояниями рецептора.

Специфические взаимодействия па интерфейсе димеризации.

Из имеющихся в литературе данных следует, что СаН связи во многих аминокислотных остатках МБ оказываются поляризованными. Это приводит к существенной энергии взаимодействия между СаН водородами и кислородами карбонильных групп при спираль-спиральных контактах. Контакты такого типа были обнаружены в большинстве структур спиральных МБ. Согласно квантовохимических расчетов энергия таких взаимодействий составляет порядка 2,5 ккал/моль для остатка глицина, при расстоянии Я(Са...О) 3.4 А, что сопоставимо с энергией стандартной водородной связи. Более того, напрямую были измерены КССВ ^сас через Са-Н...О=С контакт, что также говорит о том, что эти взаимодействия можно представить как водородные связи. Однако, во многих публикациях высказываются предположения, что, несмотря на то, что вклад водородных связей и СаН...О=С взаимодействий в ассоциацию трансмембранных спиралей является существенным, он не является основным, уступая по суммарной свободной энергии взаимодействиям Ван-дер-Ваальса.

По литературным данным три исследованных нами объекта имеют в мицеллах ЛДАО существенно разные свободные энергии димеризации спиралей: наименьшая наблюдается для гетеродимера ЕгЬВ1/ЕгЬВ2, а наибольшая - ЕгЬВ4 (таблица 2). При этом площадь контактной поверхности спиралей, которая, как известно, хорошо коррелирует с вкладом взаимодействий Ван-дер-ваальса, для всех трех объектов оказалась примерно одинаковы, что свидетельствует о критической роли водородных связей разного типа в стабилизации структуры димеров.

Спектроскопия ЯМР не позволяет напрямую детектировать расстояния между ядрами водорода и кислорода, характеризующие водородные связи в МБ. Тем не менее, полученные структуры, основанные на расстояниях между ядрами водорода, показывают сближенные пары донор-акцептор, соответствующие потенциальным водородным связям. В каждой из полученных пространственных структур были обнаружены специфические контакты подобного типа. Используя приближение об электростатической природе водородных связей, можно грубо оценить энергию таких межмолекулярных контактов. При определении энергетических параметров димеризации принималось, что энергия водородных связей

убывает с расстоянием как, а также, что водородные связи СН...0 имеют энергию -3 ккал/моль при расстоянии НО 2,0 А, а связи СН...0 - -2,0 ккал/моль при расстоянии НО 2.5 А. Также были учтены неблагоприятные контакты О и N. Полученные таким образом суммарные энергетические параметры парных контактов обобщены в таблице 3.

Таблица 2 Энергетические свойства димеров а-спиралей: оценка энергии межмолекулярных водородных связей, площадь поверхности взаимодействия и свободная энергия димеризации, измеренная в мицеллах ЛДАО.

Трансмембранный домен ЕгЬВ4 ЕгЬВ2 ErbBl/ErbB2

Энергия водородных связей, ккал/моль -5.8 -6.2 -10.1

Площадь поверхности контакта 660 720 720

Свободная энергия димеризации, ккал/моль -11.4 -15.4 -18.4

Все три структуры оказались стабилизированы нестандартными водородными связями и водородными связями боковых цепей остатков Ser и Thr. Наличие большого количество контактов, стабилизирующих структуру димера ErbBl/ErbB2, возможно благодаря устройству интерфейса взаимодействия. В то время, как в структурах гомодимеров присутствуют 6 межмономерных водородных связей, гетеродимер ErbBl/ErbB2 поддерживается 7 такими взаимодействиями, 1 из которых - сильная водородная связь (рис. 8). Таким образом, можно заключить, что свободная энергия ассоциации ТМ спиралей существенно зависит от вклада межмономерных водородных связей (таблица 2). В случае ErbB4tm вклады от полярных CH...0 взаимодействий не позволяют объяснить пониженную энергию ассоциации ТМ сегментов по сравнению с ErbB2tm и ErbBltm/ErbB2tm (см. таблицу 2), что может быть объяснено рядом причин, как то: а) близкое расположение интерфейса димеризации к водной фазе, б) необходимость в изменении структуры мономера для осуществления димеризации и в) неполной адекватности мицелл ЛДАО в качестве имитатора липидного окружения для ЕгЬВ4.

Особенностью GG4 мотивов спираль-спиральной упаковки является их способность обеспечивать максимальное количество межспиральных контактов по типу водородных связей, а следовательно и наиболее сильное взаимодействие. Возможно, именно поэтому мотивы GG4 являются самыми распространенными в известных структурах мембранных белков. Суммируя, можно выделить три условия сильного взаимодействия между трансмембранными a-спиралями по «гликофориновым» мотивам:

• Поверхность спирали должна иметь «желоб», сформированный аминокислотами с малыми боковыми цепями.

• Поверхность желоба должна быть слабополярной.

• Геометрия возможной упаковки димера должна способствовать образованию максимально большого количества межспиральных водородных связей, (в случае классического гликофоринового мотива, такой геометрии соответствует угол -40-45' между осями спиралей, оптимальный для образования СН...О контактов остатками глицина)

Рис. 8. Специфические

взаимодействия в гетеродимере ТМ сегментов ЕгЬВ1 (слева) и ЕгЬВ2. Серыми пунктирными линиями обозначены нестандартные (слабые) Са-Н...О=С контакты, черной линией показана классическая водородная связь.

Взаимодействия с головными группами липидов: топология белка в бицеллах.

Использованная в работе методика детектирования межмолекулярных взаимодействий позволила не только определить пространственные структуры ТМ доменов исследованных объектов, но и локализовать боковые цепи, взаимодействующие с головными группами липидов. Из-за того, что цепи жирных кислот липидов в приготовленных образцах были дейтерированы, в |3С-фильтрованных ЯМР спектрах были видны контакты ЯЭО только с протонов головных групп липидов на протоны боковых цепей ТМ сегментов (рис. 4). Анализ ЯМР спектров показал, что с головными группами взаимодействуют только боковые цепи аминокислотных остатков, расположенных на Ы- и С-концах ТМ а-спиралей, в то время как центральные части ТМ сегментов в таких взаимодействиях не участвуют. Таким образом, это напрямую доказывает "трансмембранную" ориентацию а-спиралей димеров в бицеллах ДМФГ/ДГФХ. Помимо остатков, находящихся в относительно жестких спиральных регионах, с головными группами липидов также контактировали и несколько неполярных аминокислот из подвижных внемембранных участков, которые, по-видимому, часть времени погружены в липидное окружение (например, 64311е из ЕгЬВИш).

Процессы медленного конформационного обмена в трансмембранных доменах.

В современных работах, посвященных пространственным структурам а-спирапьных МБ, господствует представление о ТМ доменах как о наборе жестких а-спиралей, взаимодействующих между собой. Большинство существующих быстрых методов предсказания пространственной структуры трансмембранных доменов пытаются расположить жесткие ТМ а-спирапи друг относительно друга таким образом, чтобы обеспечить плотную упаковку и оптимальное соответствие полярных и электростатических свойств взаимодействующих поверхностей, косвенно полагаясь на изложенный принцип. Тем не менее, как показывает настоящая работа на примере гомодимера ЕгЬВ41т, иногда этот

принцип не работает и структура отдельных а-спиралей может меняться при сборке ТМ домена.

В i5N-HSQC спектрах ErbB4tm были найдены несколько сигналов, имеющих минорную компоненту (рис.8). При уменьшении температуры до 30°С расстояния между двумя компонентами увеличивались, а при нагреве до 50°С два пика сливались в один, что свидетельствует о том, что белок участвует в процессах медленного (в шкале мс-с) обмена между двумя состояниями. Отнесение сигналов показало, что раздваиваются сигналы от остатков 656, 659, 660, 661, 662 и 663. При изменении соотношения липид/белок, m (за счет добавления к раствору белка в бицеллах раствора пустых бицелл) изменялась и заселенность двух состояний, вплоть до исчезновения одной из двух компонент. Это говорит о том, что наблюдаемый процесс соответствует переходу между двумя олигомерными состояниями пептида. ЯМР спектры показали, что для образца с наибольшим соотношением m (80) контакты между мономерами ErbB4tm отсутствуют, в то время как при малых m (25-35) наблюдается межмолекулярные контакты, то есть, по-видимому, мы имеем дело с переходом мономер-димер.

N. м.д.

m=80 G65611

G659

ЕШ

G668

aG660

т=40 G656

G168

s,G660

т=25 G656£ G659

G668

о

kG660

6.6 8.4

Н, м.д.

.8 8.6 8.4

Н, м.д.

В. В 8.6

'Н, м.д.

Рис.9. Фрагменты Ы-НБОС спектров ЕгЬВ4ип, снятых при разном соотношении липид/белок т. Стрелками показано направление перемещения кросс-пиков от амидных протонов пептида при переходе мономер-димер.

Двоение сигналов (рис.9) от пяти остатков, расположенных в аминокислотной последовательности подряд, не может быть объяснено отличием молекулярного окружения ЫН протонов, возникающим из-за того, что в димере напротив них упакованы боковые цепи аминокислотных остатков второго мономера, поскольку такой эффект проявлялся бы только с одной стороны а-спирапи. Это означает, что при димеризации происходит локальное изменение пространственной структуры мономера. Подтверждением этому служит характерное взаимное расположение сигналов, соответствующих димерному и мономерному состояниям для разных остатков. У некоторых (656, 659, 660, 663) при димеризации сигнал

протона ЫН смещается в область сильного поля, в то время как у других (661, 662) - в область слабого (рис. 9 и 10). Такая картина может реализовываться при локальном изменении изгиба спирали, когда часть водородных связей укорачивается, а часть - удлиняется (рис. 10), поскольку химический сдвиг сигналов протонов N1-1 сильно зависит от длин водородных связей, в которых они участвуют. Величина смещения зависит от положения в аминокислотной последовательности и не превышает 0.1 м.д. Используя параметризацию Дс>м = 19.2ё_3-2.3, где Д<5К - вторичный химический сдвиг N1-1 протонов, а (1 - длина

дд^-а4

водородной связи, можем рассчитать изменение длины водородных связей Да я---у-— ,

равное 0.02 А при ДД<У1Ч= 0.1 м.д., что практически невозможно детектировать при расчете пространственной структуры по данным ЯЭО. Тем не менее, наблюдаемые изменения химических сдвигов сигналов протона N1-1 служат надежной индикацией таких изменений.

Рис. 10. Интерфейс димеризации ЕгЬВ4пп.

Красным обозначены N11 группы, сигналы протонов которых при димеризации сдвигаются в сильное поле (вправо на рис.9); синим - в 0659 слабое поле (то есть, влево, на рис.9), желтым выделены N1-1 группы, сигналы от которых находятся в зоне перекрытия с сигналами других остатков, черным выделена НЫ связь 65901у, чей сигнал при димеризации смещается

незначительно.

вббб

вббО

1.663

Необходимость в изменении изгиба спирали при димеризации может частично объяснить повышенную свободную энергию ассоциации ТМ сегментов ЕгЬВ4. В то время как вклад от межспиральных водородных связей может дать разницу в 0.5 ккал/моль между энергией ассоциации гомодимеров ЕгЬВ21:т и ЕгЬВ4пп (см. таблицу 2), остается еще 3.5 ккал/моль, которые могут быть объяснены эффектом от взаимодействий других типов, в том числе связанными с изменением изгиба спирали при переходе мономер-димер. Изменение длины водородной связи на 0.02 А от равновесного значения соответствует увеличению энергии водородной связи на 0.2-0.3 ккал/моль. Таким образом, удлинение-укорачивание 10-

12 водородных связей даст положительный вклад до 2-3 ккап/моль в свободную энергию димеризации двух спиралей. При изгибе спирали меняются также и торсионные углы основной цепи, и контакты между атомами боковых цепей аминокислотных остатков, что также может внести неблагоприятный вклад и объяснить относительно низкую константу димеризации ErbB4tm. Для более корректной оценки необходимо получить пространственные структуры высокого разрешения ErbB4tm в обоих состояниях.

На данном примере видно, что использование представления о жесткости а-спиральных тяжей при исследовании пространственной структуры МБ (т.е. пренебрежение возможными локальными изменениями пространственной структуры ТМ сегментов) может внести существенную ошибку в расчеты энергетических параметров взаимодействия между отдельными а-спиралями, вплоть до нескольких ккал/моль. Движения по описанному выше типу, происходящие в мембранных белках, очевидно, имеют значение для выполнения белком своей функции, для достижения правильных параметров термодинамического равновесия между различными формами белка на клеточной мембране, которые определяют интенсивность клеточного ответа на сигналы разного типа, передаваемые рецептором.

Помимо изменения пространственной структуры при переходе димер-мономер, для всех объектов наблюдались другие обменные процессы. Так, у всех трех пептидов в подвижных концевых участках находятся 1-2 остатка пролина, что приводит к двоению сигналов от NH групп соседних остатков из-за cis-trans изомерии пептидной связи Х-Pro). Интересно отметить, что в случае гетеродимера ЕгЬВ1/ЕгЬВ2 двоение сигналов наблюдается не только в N-концевой области а-спиралей, где расположены остатки пролина, но и в С-концевой области, где остатки пролина отсутствуют. При этом отношение заселенностей двух состояний на N- и С-концах спиралей одинаково, что может говорить о корреляции процессов, происходящих на разных сторонах мембраны.

Из-за низкой интенсивности сигналов минорной компоненты не представляется возможным рассчитать её точную пространственную структуру. Тем не менее, сравнительный анализ контактов ЯЭО ErbBltm и ErbB2tm в минорной и основной конформации показал, что наблюдаемый процесс связан с изомеризацией пептидной связи ^Ие-^Рго расположенного в N-концевой области ТМ сегмента ErbBl. Боковая цепь ^Ile в силу своей гидрофобности периодически погружена в неполярное окружение. Она играет роль точки опоры, и при cis-trans переходе пептидной связи He-Pro из-за ограниченной возможности толщины бислоя DMPC к деформации ТМ спирали могут погружаться с одной и выныривать с другой стороны бицеллы. Таким образом, помимо изгиба а-спиралей, связанных с ассоциацией и диссоциацией димерного комплекса, наблюдаются медленные в шкале времени ЯМР движения димера как целого относительно поверхности фосфолипидной частицы.

Описанный процесс очевидно вызван несоответствием между гидрофобной длиной ТМ сегментов и толщиной гидрофобного слоя бицеллы. В полноразмерном МБ такое переключение может иметь функциональное значение и способствовать ответу мембранного домена на движения примембранных участков, вызываемые взаимодействиями между внеклеточными и внутриклеточными доменами.

Соответствие полученных структур активному состоянию рецептора: вклад в понимание процессов активации.

На настоящей момент наиболее широко принята модель активации рецепторных тирозин киназ семейства ЕгЬВ, названная моделью «сцепленного вращения». Согласно этой модели, в несвязанном с лигандом состоянии рецепторы существуют на поверхности клеток как пред-димеры, в которых взаимодействуют только ТМ и цитоплазматические «киназные» домены. При связывании лиганда изменяется структура внеклеточного домена, на поверхности оказывается так называемая «димеризационная петля». Этот участок отвечает за специфическое взаимодействие внеклеточных доменов и в несвязанном с лигандом состоянии рецептора располагается внутри глобулы. При димеризации внеклеточных доменов изменяется взаимная ориентация ТМ а-спиралей, что, в свою очередь приводит к образованию активной формы цитоплазматических доменов, происходит аутофосфорилирование и запускается каскад передачи сигнала в ядро клетки.

Как следует из данных о существовании на клеточной мембране фракции неактивных (в отсутствие лиганда) димеров рецепторов ЕгЬВ, димеризация является необходимым, но не достаточным условием активации киназных доменов. Т.е. димеры рецепторов ЕгЬВ могут находиться на поверхности клетки по крайней в двух состояниях: активном и неактивном. Согласно литературным данным, в отсутствие лиганда взаимодействия внеклеточных доменов, не обязательно специфические, не позволяют трансмембранному, примембранному и киназному доменам принять активную конформацию. Наличие в трансмембранных доменах двух мотивов димеризации (рис.1) позволяет предположить, что взаимодействие по одному мотиву соответствует активной форме рецептора, в то время как взаимодействие по второму -неактивной. Структура димера лиганд-связывающих доменов ЕгЬВ1, полученная в присутствие лиганда характеризуется близким расположением С-концевых внеклеточных областей доменов, что соответствует взаимодействию ТМ сегментов по И-концевому мотиву димеризации. Более того, модель пространственной структуры примембранных цитоплазматических областей, соответствующей активному состоянию киназного домена, построенная по данным мутагенеза и представляющая собой антипараллельный димер, характеризуется расстоянием между >)-концами порядка 20 А. Это расстояние совпадает с расстоянием между С-концами а-спиралей определенных в рамках настоящей работе пространственных структурах димеров ТМ сегментов ЕгЬВ2, ЕгЬВ4 и ЕгЬВ1/ЕгЬВ2. Сказанное выше позволяет заключить, что все три полученные пространственные структуры трансмембранных доменов соответствуют активному состоянию этих рецепторов.

Ряд работ, посвященных моделированию пространственной структуры димеров ТМ сегментов различных белков, проведенный методом конформационного поиска Монте-Карло в неявно заданном бислое, показывают, что ТМ сегменты могут образовывать димеры по различным мотивам спираль-спирального взаимодействия. Разница между энергиями различных конформаций при этом оказывается сравнительно небольшой (1-3 ккал/моль). Таким образом, можем заключить, что различие в свободной энергии активного и неактивного состояния ТМ димера на порядок ниже свободной энергии его димеризации. Это свидетельствует о том, что ТМ домен не оказывает существенного влияния на выбор между

активной и неактивной конформациями полноразмерного рецептора, а, скорее, обеспечивает за счет димеризации и наличия альтернативных поверхностей взаимодействия возможность быстрого переключения между двумя состояниями. Трансмембранный домен связывает состояние внеклеточного и киназного домена между собой, являясь, по сути, проводником сигнала. Таким образом, в случае рецепторных тирозин-киназ семейства ЕгЬВ, роль трансмембранного домена сводится к функции переключателя состояния киназного домена, ! управляемого пространственной структурой внеклеточной части белка. Мотивы димеризации на поверхности ТМ спиралей определяют два положения такого переключателя.

Соответствие полученных структур активному состоянию рецептора дополнительно подтверждается известными мутациями в трансмембранных доменах рецепторов семейства ЕгЬВ человека и их гомологов из мыши, вызывающих раковую трансформацию клеток. Известно, что точечные замены конкретного остатка валина в ТМ сегментах ErbBl и гомолога ЕАВ2 из крысы, приводят к онкогенной трансформации клеток, которые продолжают I пролиферировать в отсутствие лиганда. В случае ErbBl это замена Val651Glu, гомологичная мутация в трансмембранном сегменте ErbB2 - Val659Glu. Для ErbBl в отсутствие фактора роста спонтанная активация мутантного рецептора достигает 20% от активности в присутствие EGF. В обоих случаях заменяемый остаток валина расположен вблизи от N-концевого мотива спираль-спирального взаимодействия.

Данные молекулярного моделирования, проведенного на основе полученной в работе структуры показали, что введение остатка Glu в ТМ сегмент ЕгЬВ2 вместо Val659 вызывает дополнительную стабилизацию димера за счет образования полярной боковой цепью Glu659 сети сильных межспиральных водородных связей с боковой цепью Ser656 и с основной цепью белка (рис.11). Таким образом, мутация Val659Glu вызывает стабилизацию активной конформации ТМ домена, что в свою очередь увеличивает вероятность спонтанной активации полноразмерного рецептора.

1Ь51/ То«'

Рис. 11.

Полученная методом Монте-Карло поиска пространственная структура димера ТМ сегментов Уа1659С1и мутанта ЕгЬВЦп.

Показаны возможные варианты замыкания водородных связей с участием боковой цепи 01и659.

Таким образом на основании всех имеющихся на настоящий момент литературных и полученных в настоящей работе данных можно заключить, что полученные по данным ЯМР спектроскопии пространственные структуры трансмембранных доменов трех киназ семейства ЕгЬВ соответствуют активному состоянию рецептора и объясняют онкогенный эффект известных мутаций в трансмембранных сегментах исследуемых белков.

21

Заключение.

В рамках настоящей работы определены пространственные структуры ТМ доменов трех рецепторов семейства ErbB. Продемонстрирована важность специфических контактов по типу водородных связей на интерфейсе взаимодействия a-спиралей и пластичности ТМ а-спиралей для их димеризации. Перечисленные факторы необходимо учитывать при предсказании термодинамических параметров взаимодействий между ТМ сегментами в мембранных белках. Полученные данные позволят разработать более точные модели, описывающие взаимодействия между ТМ спиралями, необходимые для предсказания свойств мембранных белков исходя из их аминокислотных последовательностей.

Основываясь на полученных в работе пространственных структурах с учетом упомянутых принципов спираль-спирального взаимодействия в мембранных белках возможно рационально разработать новые типы лекарственных препаратов, имеющих в качестве мишеней не внеклеточные, а ТМ домены рецепторов, каналов и пр. Подобные попытки уже предпринимались, в том числе для рецептора EGFR были продемонстрированы ингибирующие свойства изолированных ТМ сегментов. Основной проблемой, препятствующей созданию препаратов такого типа является отсутствие методов рационального проектирования аминокислотной последовательности подобных пептидов. Определение принципов, лежащих в основе спираль-спиральных взаимодействий в мембранных белках, позволит преодолеть это препятствие и представленная работа также может внести в это свой вклад.

Выводы

1) Методом гетероядерной спектроскопии ЯМР впервые определена пространственная структура трех представителей семейства ErbB. Полученные пространственные структуры представляют собой параллельные правозакрученные димеры а-спиралей с расстояниями ~7А и углом 40-45 между осями спиралей .

2) Плотная упаковка ТМ a-спиралей ErbB рецепторов обусловлена остатками с небольшими боковыми цепями Ala, Ser и Gly, входящими в N-концевой мотив димеризации. Анализ полученных пространственных структуры продемонстрировал важную роль межспиральных водородных связей, образуемых боковыми цепями Ser и Thr, а также нестандартных слабых водородных связей СН...О=С остатков Gly, Ser и Ala.

3) Полученные структуры ТМ доменов соответствуют активному состоянию рецепторов, что подтверждается литературными данными о мутациях, приводящими к раковой трансформации клеток, а также о структурах лиганд-связывающего и киназного доменов и примембранного цитоплазматического участка. Структуры димеров ТМ доменов, определенные в рамках диссертационной работы, хорошо согласуются с моделью «сцепленного вращения» активации рецепторных тирозин киназ и объясняют роль ТМ доменов в .передаче сигнала.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. P. Е. Volynsky Е. V. Bocharov, D. Е. Nolde, Ya. A. Vereschaga, М. L. Mayzel,

К. S. Mineev. Е. A. Mineeva, Yu. Е. Pustovalova, I. A. Gagnidze, R. G. Efremov and A. S. Arseniev Solution of the spatial structure of dimeric transmembrane domains of proteins by heteronuclear NMR spectroscopy and molecular modeling, Biophysics, 51, S1, (2006), 23-27.

2. Bocharov E. V., Mineev K.S.. Volynsky P.E., Ermolyuk Ya.S., Tkach E.N., Sobol A.G., Chupin V.V., Kirpichnikov M.P., Efremov R.G., Arseniev A.S. Spatial structure of dimeric transmembrane domain of growth factor receptor ErbB2. J. Biol. Chem., 283, (2008), 69506956.

3. Bocharov E. V., Mayzel M.L., Volynsky P.E., Mineev K.S., Tkach E.N., Ermolyuk Ya.S., SchulgaA.A., Efremov R.G., Arseniev A.S. Left-Handed Dimeric Structure of Transmembrane Domain of the Human Receptor Tyrosine Kinase EphA2 via a Heptad Repeat Motif. Biophys. J., 98, (5), (2010), 881-889.

Тезисы докладов:

1. Минеев K.C., Бочаров Э.В., Волынский П.Е., Арсеньев А.С. Конформационный переход димер-мономер для трансмембранного сегмента сигнальной киназы ЕгЬВ4, 49 научная конференция МФТИ, секция «Физико-химическая биология и биотехнология», устный доклад, опубликовано в интеренете,2006 (http://bio.fizteh.ru/student/mipt conference/conf pronramm/conf ргоц biochem.html).

2. A.S. Arseniev, E.V. Bocharov, Y.E. Pustovalova, K.S. Mineev. P.E. Volynsky, R.G. Efremov, Y.S. Ermolyuk, M.P Kirpichnikov "Combined use of NMR spectroscopy and molecular modeling techniques to study helix-helix interactions in transmembrane protein dimers" XXIInd International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems "ICMRBS 2006" Gottingen, Germany, 2006, Сборник докладов стр. 85.

3. А.С. Арсеньев, Э.В. Бочаров, Ю.Е. Пустовапова, К.С. Минеев. П.Е. Волынский, Я.С. Ермолюк, Р.Г. Ефремов, А.В. Феофанов, М.П. Кирпичников. Структурная биология трансмембранных спираль-спиральных взаимодействий в норме и патологии: комбинированный подход на основе методов молекулярного моделирования, оптической и ЯМР спектроскопии // VIII чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова, Москва 2006. Тезисы докладов, стр. 16.

4. К.С. Минеев. Э.В. Бочаров, Е.Н. Ткач, Я.С. Ермолюк, М.П. Кирпичников, А.С. Арсеньев "Димериза!1ия трансмембранных сегментов сигнальной киназы ErbB4" VIII чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова, Москва, 2006, Сборник докладов стр. 84.

5. Mineev K.S.. Bocharov E.V. Balashova T.A. Tkach E.N. Volynsky P.E. Arseniev A.S. Dimer-monomer transition in membrane domain of ErbB4 recepor protein kinase, Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter, IV Meeting NMR in Heterogeneous Systems St. Petersburg, 9-13 july 2007, стр 95.

6. Минеев K.C.. Бочаров Э.В. Ткач Е.Н. Балашова Т.А. Арсеньев А.С., Пространственная структура мембранного домена рецептора ЕгЬВ2, 50-я юбилейная научная конференция Московского физико-технического института, Москва, 23-27 ноября 2007, Сборник докладов, стр. 143

7. Минеев К.С., Бочаров Э.В. Волынский П.Е. Балашова Т.А. Ткач Е.Н. Арсеньев А.С., Стабилизация димерной структуры трансмембранного домена рецепторной тирозинкиназы ЕгЬВ2 онкогенными мутациями, XX Зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" Москва, 11-15 февраля 2008 г. Сборник докладов, стр 48

8. Бочаров Э.В., Волынский П.Е. Минеев К.С. Майзель M.JI. Пустовапова Ю.Е. Надеждин К.Д. Артеменко Е.О. Гончарук М.В. Бочарова О.В. Ермолюк Я.С. Шульга

A.A. Соболь А.Г. Ефремов Р.Г. Арсеньев A.C., Структурная биология спираль-спиральных взаимодействий трансмембранных доменов белков методом спектроскопии ЯМР, IX Международный Семинар по Магнитному Резонансу (Спектроскопия, Томография и Экология), Россия, Ростов-на-Дону, 15-20 сентября 2008 Сборник докладов, стр. 48

9. Arseniev A.S., Bocharov E.V., Volynsky P.E., Mayzel M.L., Pustovalova Yu.E., Mineev K.S.. Shulga A.A., Feofanov A.V., Efremov R.G., Comprehensive study of helix-helix interactions in transmembrane protein dimers, NMRCM 2008 Summer School, EUROMAR 2008 (Magnetic Resonance for the future), Санкт-Петербург, сборник догладов, стр 6

10. K.S. Mineev. E.V. Bocharov, P.E. Volynsky, E.N. Tkach., A.S. Arseniev Spatial structures of transmembrane dimers by NMR spectroscopy, EMBO Practical Course "Multidimensional NMR in structural Biology", II Ciocco, 2008, p22

11. Bocharov Eduard, Volynsky Pavel, Mineev Konstantin, Nadezhdin Kirill, Pustovalova Yulia, Mayzel Maxim, Goncharuk Marina, Bocharova Olga, Polyansky Anton, Efremov Roman, Arseniev Alexander, Diverse helix-helix interactions in dimeric single-span transmembrane proteins studied by combined use of NMR spectroscopy and molecular modeling, Euromar 2009,2009, Goteborg, Abstract Book, 81

12. Mineev Konstantin, Pustovalova Yulia, Bocharov Eduard, Volynsky Pavel, Tkach Elena, Arseniev Alexander, Spatial structures of membrane domains of ErbB receptor kinases, Euromar 2009 ,2009,Goteborg, Abstract Book, 44

13. Гончарук M.B., Ермолюк Я.С. Шульга A.A. Гончарук С.А. Ткач E.H. Пустовалова Ю.Е. Майзель M.JI. Минеев К.С. Бочаров Э.В. Аретеменко Е.О. Соболь А.Г. Арсеньев A.C. Кирпичников М.П. Структурная биология трансмембранных фрагментов рецепторных тирозинкиназ: новый взгляд на молекулярные основы функционирования мембранных белков, Международная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинников, Москва, 2009., Сборник докладов, 49-54

14. Минеев К.С.. Пустовалова Ю.Е. Бочаров Э.В. Ткач E.H. Ефремов Р.Г. Арсеньев А.С, Рецепторные киназы ErbB: архитектура мембранных доменов, Международная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинников, Москва, 28-сентября-2октября 2009г., Сборник докладов 145-148

15. Арсеньев A.C., Шенкарев З.О., Бочаров Э.В., Парамонов A.C., Минеев К.С.. Пустовалова Ю.А., Шульга A.A., Кирпичников М.П., Ефремов Р.Г., Феофанов A.B., Вклад современной ЯМР спектроскопии в исследование взаимосвязи пространственной структуры и функции мембранных белков, IV Российский Симпозиум "Белки и Пептиды", Казань, 2009, Сборник докладов, стр 8

Принято к исполнению 04/05/2010 Заказ № 1169

Исполнено 06/05/2010 Тираж 100 экз.

ООО «5МСА» ИНН 7725533680 Москва, 2-й Кожевнический пер., 12 +7 (495) 604-41-54 www.cherTypie.ru

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Минеев, Константин Сергеевич

Введение.

Глава 1. Обзор Литературы.

1.1 .Среды, имитирующие мембранное окружение.

1.1.1. Органические растворители.•.

1.1.2. Анизотропные среды.

1.1.3. Мицеллы.

1.1.4 Бицеллы.

1.1.5. «Нанодиски».

1.1.6. Липосомы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гомо- и гетеродимеризация трансмембранных сегментов рецепторов семейства ERBB"

Клетки используют мембраны как барьер для разделения двух биологически различных сред. Транспорт вещества, передачу сигналов и энергии через эти барьеры, а также ряд других клеточных функций осуществляют мембранные белки [1]. Приблизительно треть от всех структурных генов кодируют именно такие белки [2]. Однако лишь одна из каждых пятисот расшифрованных пространственных структур высокого разрешения принадлежит белкам этого класса [2]. Значительная роль мембранных белков (таких как рецепторы, ионные каналы и др.) в процессах функционирования клетки объясняет важность создания новых медицинских препаратов, направленно действующих на мембранные белки, для чего, в первую очередь, необходимо понять принципы их пространственной организации и механизмы работы. Одним из наиболее важных шагов в этом направлении является получение пространственной структуры мембранных белков. Кроме того, необходимо знать, каким образом белок взаимодействует с мембраной, как изменяется его конформация при функционировании, насколько велика роль трансмембранного домена для его работы.

Основные методы получения пространственных структур высокого разрешения: рентгеноструктурный анализ и ЯМР-спектроскопия в растворе, -дают прекрасные результаты в применении к глобулярным водорастворимым белкам. В то же время, практически все мембранные белки нерастворимы в воде или же изменяют в водном растворе конформацию, а кристаллы таких белков, пригодных для изучения методом рентгеноструктурного анализа сложно вырастить. Множество проблем в получении образцов мембранных белков, пригодных для структурных исследований, кроется в необходимости воспроизвести воздействие, обычно оказываемое их природным сложным и анизотропным окружением. Структурные исследования методом ЯМР требуют создания условий, при которых белок растворим в высоких (порядка 1 мМ) концентрациях, монодисперсен, конформационно однороден и стабилен в течение дней или даже недель. Для решения этой проблемы необходимо создание новых анизотропных сред, по своим свойствам напоминающих клеточные мембраны, а также адаптация подобных систем, уже использующихся в других методах, к требованиям спектроскопии ЯМР в растворе.

Известно, что одной из наиболее часто встречающихся вторичных структур белков внутри мембраны являются полиспиральные участки, где две или несколько а-спиралей образуют трансмембранные домены, взаимодействующие как с мембраной, так и между собой [3]. На настоящий момент, доказано, что взаимодействия между спиралями непосредственно участвуют в работе мембранного белка, опосредуя переход некоторых рецепторов из активного в неактивное состояние [4,5]. Одним из наиболее удобных объектов для исследования среди а-спиральных мембранных белков являются рецепторные тирозин киназы (РТК), имеющие всего один трансмембранный сегмент, и активные в форме димера. Важным семейством РТК являются рецепторы ErbB, участвующие в регуляции широкого спектра клеточных процессов, как то: пролиферация, дифференцировка, клеточная подвижность и др. и вовлеченные в развития ряда заболеваний, в том числе раковых опухолей [6-10]. В настоящей работе методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) исследованы комплексы, образованные спиральными трансмембранными сегментами рецепторов семейства ErbB в средах, имитирующих мембранное окружение.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Минеев, Константин Сергеевич

Выводы

1) Методом гетероядерной спектроскопии ЯМР впервые определена пространственная структура трех представителей семейства ErbB. Полученные пространственные структуры представляют собой параллельные правозакрученные димеры а-спиралей с углом между осями спиралей 40-45°.

2) В определенных пространственных структурах плотная упаковка трансмембранных а-спиралей обусловлена остатками с небольшими боковыми цепями Ala, Ser и Gly, входящими в один из двух потенциальных мотивов димеризации, расположенный на N-конце спиралей. Полученные данные указывают на важную роль межспиральных водородных связей, образуемых боковыми цепями Ser и Thr, а также нестандартных слабых водородных связей СН-О, остатков Gly, Ser и Ala в спираль-спиральных взаимодействиях по GG4 мотивам.

3) Полученные структуры соответствуют активному, «связанному» состоянию рецепторов, что согласуется с известными мутациями, приводящими к раковой трансформации клеток, а также известными структурами лиганд-связывающего, киназного доменов и примембранного цитоплазматического участка. Структуры димеров ТМ доменов, определенные в рамках представленной работе точно вписываются в модель «сцепленного вращения», принятую для описания процессов активации РТК, а также объясняют роль ТМ сегментов в передаче сигнала.

Заключение

В рамках настоящей работы были определены пространственные структуры трансмембранных доменов трех рецепторов семейства ErbB. На примере полученных структур была продемонстрирована важность специфических контактов по типу водородных связей на интерфейсе взаимодействия а-спиралей и пластичность ТМ а-спиралей при их димеризации. Перечисленные факторы необходимо учитывать при предсказании термодинамических параметров взаимодействий между ТМ сегментами в мембранных белках. Полученные данные могут служить основой для разработки более точных методов, описывающих взаимодействия между спиралями в мембранных белках, и, соотвественно, для построения более реалистичных структурных моделей, необходимых для предсказания свойств мембранных белков исходя из их аминокислотных последовательностей.

Основываясь на полученных в работе пространственных структурах с учетом упомянутых принципов спираль-спирального взаимодействия в мембранных белках возможно рационально разработать новые типы лекарственных препаратов, имеющих в качестве мишеней не внеклеточные, а трансмембранные домены рецепторов, каналов и пр. Подобные попытки уже предпринимались, в том числе для рецептора EGFR были продемонстрированы ингибирующие свойства изолированных трансмембранных сегментов [104]. Также была показана иммуномодулирующая активность трансмембранных пептидов Т-клеточных рецепторов [179]. Основной проблемой, препятствующей созданию препаратов такого типа, является отсутствие методов рационального проектирования подходящей аминокислотной последовательности подобных пептидов. Определение принципов, лежащих в основе спираль-спиральных взаимодействий в мембранных белках, позволит преодолеть это препятствие и представленная работа также может внести в это свой вклад.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Минеев, Константин Сергеевич, Москва

1. Tetsch L, Jung К. How are signals transduced across the cytoplasmic membrane? Transport proteins as transmitter of information. Amino Acids. 37(3) (2009) 467-77.

2. Sanders CR, Sonnichsen F. Solution NMR of membrane proteins: practice and challenges. Magn Reson Chem. 44 (2006)

3. Engel A, Gaub HE. Structure and mechanics of membrane proteins. Annu Rev Biochetn.77 (2008) 127-48.

4. Moriki T, Maruyama Д Muruyama IN. Activation of preformed EGF receptor dimers by ligand-induced rotation of the transmembrane domain. J Mol Biol. 311(5) (2001) 1011-26.

5. DeCoursey ТЕ. Voltage-gated proton channels. Cell Mol Life Sci. 65(16) (2008) 2554-73.

6. Warren CM, Landgraf R. Signaling through ERBB receptors: multiple layers of diversity and control. Cell Signal. 18(7) (2006) 923-33.

7. Iwamoto R, Mekada E. ErbB and HB-EGF signaling in heart development and function. Cell Struct Funct.;31(1) (2006) 1-14.

8. Roskoski R Jr. The ErbB/HER receptor protein-tyrosine kinases and cancer. Biochem Biophys Res Commun. 319(1) (2004) 1-11.

9. Hynes NE, MacDonald G. ErbB receptors and signaling pathways in cancer. Curr Opin Cell Biol. 21(2) (2009) 177-84.

10. Olayioye MA, Neve RM, Lane HA, Hynes NE. The ErbB signaling network: receptor heterodimerization in development and cancer. EMBO J. 19(13) (2000) 3159-67.

11. Arseniev AS, Barsukov IL, Bystrov VF, Lomize AL, Ovchinnikov YuA. 1H-NMR study of gramicidin A transmembrane ion channel. Head-to-head right-handed, single-stranded helices. FEBS Lett. 186(2) (1985) 168-74.

12. Marion D, ZasloffM, Box A. A two-dimensional NMR study of the antimicrobial peptide magainin 2. FEBS Lett. 227(1) (1988) 21-6.

13. Sobol AG, Arseniev AS, Abdulaeva GV, Musina LYu, Bystrov VF. Sequence-specific resonance assignment and secondary structure of (1-71) bacterioopsin. J Biomol NMR. 2(2) (1992) 161-71.

14. Barsukov IL, Nolde DE, Lomize AL, Arseniev AS. Three-dimensional structure of proteolytic fragment 163-231 of bacterioopsin determined from nuclear magnetic resonance data in solution. Eur J Biochem.206(3): (1992) 665-72.

15. Fillingame RH, Dmitriev OY. Structural model of the transmembrane Fo rotary sector of H+-transporting ATP synthase derived by solution NMR and intersubunit cross-linking in situ. Biochim. Biophys. Acta; 1565 (2002) 232-245.

16. Girvin ME, Rastogi VK, Abildgaard F, Markley JL, FillingameRH. Solution structure of the transmembrane H+-transporting subunit с of the FIFO ATP synthase. Biochemistry; 37 (1998) 8817-8824И

17. Vinogradova O, Budola P, Czerski L, Sonnichsen FD, SandersCR. Escherichia coli diacylglycerol kinase: a case study in the application of solution NMR methods to an integral membrane protein. Biophys. J.; 72 (1997) 2688.

18. Ozawa K, Wu PS, Dixon NE, Otting G. TV-Labelled proteins by cell-free protein synthesis. Strategies for high-throughput NMR studies of proteins and protein-ligand complexes. FEBS J. 273(18) (2006) 4154-9.

19. Goto NK, Kay LE. New developments in isotope labeling strategies for protein solution NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 10(5) (2000) 585-92.

20. Kainosho M. Isotope labelling of macromolecules for structural determinations. Nat Struct Biol. 4 Suppl (1997) 858-61.

21. Englander J, Cohen L, Arshava B, Estephan R, Becker JM, Naider F. Selective labeling of a membrane peptide with 15N-amino acids using cells grown in rich medium. Biopolymers.;84(5) (2006) 508-18.

22. Tugarinov V, Kay LE. An isotope labeling strategy for methyl TROSY spectroscopy. J Biomol NMR. 28(2) (2004) 165-72.

23. Krueger-Koplin RD, Sorgen PL, Krueger-Koplin ST, Rivera-Torres IO, Cahill SM, Hicks DB, Grinius L, Kruhvich ТА, Girvin ME. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. J Biomol NMR. 28(1) (2004) 43-57.

24. Fernandez C, Hilty C, Wider G, Gilntert P, Wiithrich K. NMR structure of the integral membrane protein OmpX. J Mol Biol. 336(5) (2004)1211-21.

25. Hwang PM, Choy WY, Lo EI, Chen L, Forman-Kay JD, Raetz CR, Prive GG, Bishop RE, Kay LE. Solution structure and dynamics of the outer membrane enzyme PagP by NMR. Proc Natl Acad Sci USA. 99(21) (2002) 13560-5.

26. Arora A, Abildgaard F, Bushweller JH, Tamm LK: Structure of outer membrane protein A transmembrane domain by NMR spectroscopy. Nat Struct Biol 8 (2001) 334-338.

27. Liang B, Tamm LK: Structure of outer membrane protein G by solution NMR spectroscopy. Proc Natl Acad Sci, 104 (2007) 16140-16145.

28. Hiller S, Garces RG, Malia TJ, Orekhov VY, Colotnbini M, Wagner G. Solution structure of the integral human membrane protein VDAC-1 in detergent micelles. Science. 321(5893) (2008) 1206-10.

29. Hiller S, Wagner G. The role of solution NMR in the structure determinations of VDAC-1 and other membrane proteins. Curr Opin Struct Biol 19(4) (2009) 396-401.

30. Bayrhuber M, Meins T, Habeck M, Becker S, Giller K, Villinger S, Vonrhein C, Griesinger C, ZwecLstetter M, Zeth K. Structure of the human voltage-dependent anion channel. Proc Natl Acad Sci USA. 105(40) (2008) 15370-5.

31. MacKenzie KR, Prestegard JH, Engelman DM. A transmembrane helix dimer: structure and implications. Science. 276(5309) (1997) 131-3

32. Call ME, Schnell JR, Xu C, Lutz RA, ChouJJ, Wucherpfennig KW. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127(2) (2006) 355-68

33. Schnell JR, Chou JJ: Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature 451 (2008) 591-595

34. Oxenoid K, Chou JJ The structure of phospholamban pentamer reveals a channel-like architecture in membranes. Proc Natl Acad Sci 102 (2005) 10870-10875.

35. Roosild TP, Greemvald J, Vega M, Castronovo S, Riek R, Choe S. NMR structure of Mistic, a membrane-integrating protein for membrane protein expression. Science. 307(5713) (2005) 1317-21.

36. Chill JH, Louis JM, Miller C, Box A. NMR study of the tetrameric KcsA potassium channel in detergent micelles. Protein Sci. 15(4) (2006) 684-98.

37. Gautier A, Kirkpatrick JP, Nietlispach D. Solution-state NMR spectroscopy of a seven-helix transmembrane protein receptor: backbone assignment, secondary structure, and dynamics. Angew Chem Int Ed Engl. 47(38) (2008) 7297-300.

38. Van Horn WD, Kim HJ, Ellis CD, Hadziselimovic A, Sulistijo ES, Karra MD, Tian C, Sonnichsen FD, Sanders CR. Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase. Science. 324(5935) (2009) 1726-9.

39. Columbus L, Lipfert J, Jambimathan K, Fox DA, Sim AY, Doniach S, Lesley SA. Mixing and matching detergents for membrane protein NMR structure determination. J Am Chem Soc. 131(21) (2009) 7320-6.

40. Sulistijo ES, Mackenzie KR. Structural basis for dimerization of the BNIP3 transmembrane domain. Biochemistry. 48(23) (2009) 5106-20.

41. L i\1, Biverstahl H, G A, Mciler L. Structure and positioning comparison of two variants of penetratin in two different membrane mimicking systems by NMR. Eur J Biochem. 270(14) (2003) 3055-63.

42. Chou G.J., Kaufman J.D., Stahl S.J., Wingfield P.T., BaxA., Micelle-induced Curvature in Water-Insoluble HIV-1 Env Peptide, Revealed by NMR Dipolar Coupling Measurement in Stretched polyacrilamide. JACS, 124(11) (2002), 2450-2451.

43. Paget SF, Girvin ME. Solution NMR of membrane proteins in bilayer mimics: small is beautiful, but sometimes bigger is better. Biochim Biophys Acta. 1768(12) (2007) 3098106.

44. Fernandez C, Wuthrich K: NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Lett 555 (2003) 144-150.

45. Void R.R Prosser R.S., Deese. A.J. Isotropic Solutions of phospholipid micelles: A new membrane mimetic for high-resolution NMR studies of polypeptides. J. Biomol. NMR, 9 (1997) 329-335.

46. Luchette PA, Vetman TN, Prosser RS, Hancock RE, Nieh MP, Glinka CJ, Krneger S, Katsaras J. Morphology of fast-tumbling bicelles: a small angle neutron scattering and NMR study. Biochim. Biophys. Acta 1513 (2001) 83-94.

47. Howard, K. P., Opella, S. J. High-resolution solid-state NMR spectra of integral membrane proteins reconstituted into magnetically oriented phospholipid bilayers. J. Magn. Reson. В 112 (1996) 91-94.

48. J. Bian, M.F. Roberts, Phase separation in short-chain lecithin/gelstate long-chain lecithin aggregates, Biochemistry 29 (1990) 7928-7935.

49. R.R. Void, R.S. Prosser, Magnetically oriented phospholipid bilayered micelles for structural studies of polypeptides. Does the ideal bicelle exist? J. Magn. Reson., В 113 (1996) 267-271.

50. J.F. Nagle, S. Tristam-Nagle, Structure of lipid bilayers, Biochim. Biophys. Acta 1469 (2000) 159- 195.

51. T.-L. Lin, S.-H. Chen, N.E. Gabriel, M.F. Roberts, Use of small-angle neutron scattering to determine the structure of dihexanoylphosphatidylcholine micelles, J. Am. Chem. Soc. 108 (1986)3499-3507.

52. Glover KJ, Whiles JA, Wu G, Yu N, Deems R, Struppe JO, Stark RE, Komives EA, Void RR. Structural evaluation of phospholipid bicelles for solution-state studies of membrane-associated biotnolecules. Biophys J. 81(4) (2001) 2163-71.

53. Lee D, Walter KF, Bruckner AK, Hilty C, Becker S, Griesinger C. Bilayer in small bicelles revealed by lipid-protein interactions using NMR spectroscopy. J Am Chem Soc. 130(42) (2008) 13822-3.

54. Poget SF, Cahill SM, Girvin ME. Isotropic bicelles stabilize the functional form of a small multidrug-resistance pump for NMR structural studies. J Am Chem Soc. 129(9) (2007) 2432-3.

55. Lind J, Nordin J, Maler L. Lipid dynamics in fast-tumbling bicelles with varying bilayer thickness: effect of model transmembrane peptides. Biochim Biophys Acta. 1778(11) (2008) 2526-34.

56. Ren, J.; Lew, S.; Wang, J.; London, E., Control of the transmembrane orientation and interhelical interactions within membranes by hydrophobic helix length. Biochemistry 38 (1999) 5905.

57. Whiles J.A., Glover KJ, Melacini G, Komives EA, Void. RR, Orientation and effects of Mastoparan X on Phospholipid Bicelles. Biophysical Journal, 80 (2001) 280-293.

58. Struppe J, Whiles J A, Void RR. Acidic phospholipid bicelles: a versatile model membrane system. Biophys J. 78(1) (2000) 281-9.

59. Cevc, G., Marsh D. Bilayers: Phospholipid Physical Principles and Models. Wiley-Interscience, New York. (1987)

60. Valiyaveetil FI, Zhou Y, MacKinnon. R, Lipids in the Structure, Folding and function of KcsA K+ channel. Biochemistry 41, (2002) 10771-10777.

61. Glover KJ, Whiles JA, Void RR, Melacini. G., Position of residues in transmembrane peptides with respect to the lipid bilayer: A combined lipid NOEs and water chemical exchange approach in phospholipid bicelles. J. Biomol. NMR, 22 (2002): 57-64.