Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пространственная структура и динамика трансмембранных доменов эфриновых рецепторов EPHA1 и EPHA2 по данным спектроскопии ЯМР

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Пространственная структура и динамика трансмембранных доменов эфриновых рецепторов EPHA1 и EPHA2 по данным спектроскопии ЯМР"

на правах рукописи

Майзсль Максим Львович

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ТРАНСМЕМБРАННЫХ ДОМЕНОВ ЭФРИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ ЕРНА1 И ЕРНА2 ПО ДАННЫМ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР

03.00.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

003454074

Москва-2008

003454074

Диссертация выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, на кафедре физико-химической биологии и биотехнологии МФТИ (ГУ).

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Арсеньев Александр Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, Польшаков Владимир Иванович

профессор

доктор физико-математических наук, Шайтан Константин Вольдемарович

профессор

. - Российский кардиологический научно-Ведущая организация: производственный комплекс

ФГУРКНПК РосМедТехнологий

Защита состоится 11 декабря 2008 г. в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 по адресу: 119991, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, «Новая» аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Автореферат разослан 10 ноября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Т.Е. Кренделева

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Уникальные свойства мембранных белков во многом определяют пространственная структура и функциональная подвижность их трансмембранных доменов. Характерным структурным элементом мембранных доменов белков является а-спираль. Существует множество функциональных классов мембранных белков (ионные каналы, рецепторы и т.д.), для которых предполагается структурная организация в виде «пучков», состоящих из а-спиральных сегментов, а функционирование непосредственно обеспечивается взаимодействиями между ними. Более того, для многих мембранных белков необходимым условием функционирования является их димеризация (или олигомеризация). В связи с этим, большой интерес представляет понимание механизмов межмолекулярных взаимодействий в гетерогенной среде, которой является липидный бислой биологической мембраны. В данной работе исследована довольно простая, но вместе с тем широко распространенная в природе, и мало изученная модель - гомодимер трансмембранных а-спиралей.

Интерес представляет и сам объект исследования - белки ЕрЬА1 и ЕрЬА2. ЕрЬ рецепторы участвуют во многих процессах развития тканей: координируют рост, дифференцировку и формирование практически всех органов и тканей, в частности, нервной, сердечнососудистой, иммунной систем, костной и эпителиальной тканей. Двунаправленные взаимодействия эфриновых рецепторов и их лигандов могут вызывать различные клеточные ответы, например, изменение подвижности, адгезию, отталкивание, в частности, нейрональных и эндотелиальных клеток. Нарушения в функционировании ЕрЬ рецепторов и их лигандов наблюдаются в процессах опухолеобразования и метастазирования.

Цель и задачи исследования

Целью данной диссертационной работы является определение структурно-динамических свойств димеров трансмембранных доменов (ТМ) ЕрЬА1 и ЕрЬА2 рецепторов и изучение их связи с биологической функцией. Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи: а) определение и сравнение пространственных структур димеров исследуемых доменов в мембрано-подобном окружении, анализ аминокислотных последовательностей ТМ доменов остальных представителей семейства ЕрЬА; б) изучение динамических характеристик полученных структур; в) изучение влияния локального окружения рецептора на его димеризационную способность.

Методы исследования

В работе использовался комплексный подход, сочетающий в себе экспериментальный метод (оптическая спектроскопия, спектроскопия ЯМР высокого разрешения) и теоретический - метод молекулярной динамики.

В качестве объекта исследования были выбраны фрагменты (остатки 536-573 и 523-563) человеческих рецепторов EphAl и EphA2, включающие в себя ТМ домены (остатки 544-569, 534-558).

Научная новизна и практическая значимость работы

На сегодняшний день экспериментальны получены и представлены в банке белковых структур (PDB) только три пространственных структуры высокого разрешения нековалентных димеров ТМ a-спиралей (ТМ домены белков гликофорин A, Bnip3, ErbB2). В представленной диссертационной работе методом гетероядерной спектроскопии ЯМР получены пространственные структуры ТМ фрагментов рецепторов одного семейства EphAl и EphA2, встроенных в липидные бицеллы. Структуры депонированы в PDB.

Впервые показано, что, даже для рецепторов одного семейства, структуры димерных комплексов ТМ доменов могут отличаться как геометрией упаковки, так и мотивом димеризации. На примере EphA2 впервые изучен семичленный димеризационный мотив в мембранных белках. Полученные данные открывают новые возможности для моделирования пептидов, селективно взаимодействующих с ТМ доменами мембранных белков.

Для димера EphAl в процессе работы была выявлена и детально исследована зависимость структуры и динамики димера от ионогенного состояния Glu547, это позволило сделать предположение об особенностях механизма передачи сигнала рецептором внутрь клетки. Полученные данные указывают на уникальную роль EphAl рецептора в качестве сенсора локального клеточного окружения.

Впервые показана димеризация ТМ доменов EphA рецепторов по двум альтернативным мотивам с различной относительной упаковкой субъединиц, что является аргументом в пользу "вращательно-сцепленного" механизма активации рецепторных: тирозинкиназ.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях, посвященных спектроскопии ЯМР (Санкт Петербург, 2007, 2008); VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006); III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007); научных семинарах отдела структурной биологии ИБХ РАН (Москва, 2006-2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 работ, из них в рецензируемых журналах - 2; в российских и иностранных журналах, входящих в перечень ВАК - 2; тезисов докладов на международных конференциях и семинарах - 2; тезисов докладов на российских научных конференциях - 2.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы и заключения. Общий объем работы составляет 102 страницы текста, включая 29 рисунков, 7 таблиц и список литературы, содержащий 110 наименований.

Содержание работы

Введение

Во введении обоснована актуальность проводимого исследования, обозначены цели и сформулированы задачи работы: определение пространственных структур трансмембранных доменов (ТМ) белков EphAl и EphA2; изучение их динамических свойств; предсказание и сравнение димеризационных мотивов остальных представителей семейства Eph рецепторов.

Обзор литературы

Первый раздел литературного обзора посвящен описанию белков семейства рецепторных тирозинкиназ (РТК) и, в частности, белков подсемейства Eph рецепторов - основных свойств, механизма активации и передачи сигнала. Во втором разделе литературного обзора представлены современные данные об особенностях структуры ТМ a-спиральных доменов и их взаимодействии.

Материалы и методы

Во второй главе приведены сведения об использованных в работе оборудовании, веществах, методике приготовления и контроля качества образцов, методах получения и обработки ЯМР-спектров, а также условиях, при которых проводились теоретические расчеты методом молекулярной динамики.

Объекты исследования - фрагменты EphAltm (остатки 536-573) и EphA2tm (остатки 523-563), включающие в себя ТМ домены рецепторных тирозинкиназ EphAl и EphA2, соответственно, как немеченые, так и 15N-, 15М-13С-меченые, были получены и любезно предоставлены сотрудниками лаборатории инженерии белка института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (М.В. Гончарук, E.H. Ткач, Я.С. Ермолюк и A.A. Шульга).

ЯМР-эксперименты проводились на спектрометрах Varian Unity 600 и Bruker Avance III 600 с рабочей частотой на протонах 600 МГц. В качестве среды, моделирующей мембранное окружение, использовались незаряженные билипидные мицеллы (бицеллы), состоящие из димиристоилфосфатидилхолина (ДМФХ) и дигексаноилфосфатидилхолина (ДГФХ) с дейтерированными ацильными цепями ([ДМФХ]/[ДГФХ]=1/4; [EphAltm или ЕрЬА2йп]/[ДМФХ+ДГФХ]=1/40) в ЮмМ ацетатном буфере. Для исследования влияния липидного состава на структуру и динамику димеров исследуемых белков использовались бицеллы с добавлением 10%

димиристоилфосфатидилглицерола (ДМФГ) (соотношение липидов [ДМФХ]/[ДГФХ]/[ДМФГ] = 1/8/1). Эксперименты проводились при температуре 40°С и различных значениях рН от 4 2 до 6.7. Обработка спектров осуществлялась с помощью программ VNMR и NMRPipe.

Отнесение сигналов проводилось на основании гетероядерных спектров 15N-HSQC, "N-NOESY-HSQC, 15N/13C-HNCA,13C-HCCH-TOCSY, 13C-HSQC в программе CARA; для расчета структуры использовались I5N- и 13C-NOESY-HSQC спектры. Для изучения динамических характеристик были измерены параметры 15>1-релаксации (скорости продольной Т1 и поперечной Т2 релаксаций и гетероядерное ЯЭО ,5N{'Н}ЯЭО) для амидных групп основной цепи белков. Анализ релаксационных данных проводился с помощью программы DASHA. Межмономерные контакты были получены из ЯМР-спектров «гетеродимера» (эквимолярная смесь немеченого и 15N-13С-меченого образца) 2D 15N/13C-Fl-filt./F3-separ.-NOESY-HSQC и 3D 13C-Fl-filt./F3-separ.-NOESY-HSQC. Доступность трансмембранного домена растворителю и взаимодействие с молекулами воды исследовались с помощью экспериментов по измерению скорости обмена амидного протона на дейтерий растворителя (ряд спектров 15N-HSQC). Константы спин-спинового взаимодействия гомоядерная 3Jhncoh и гетероядерная 3JNCpH оценивались по гетероядерным спектрам 15N-HNHA и 1SN-HNHB. Если подобным образом константу измерить не удавалось, ограничение на соответствующий двугранный угол рассчитывалось исходя из анализа химических сдвигов N, Са, На и Ср атомов в программе TALOS. Расчет пространственной структуры трансмембранного доменов рецепторных тирозинкиназ EphAl и EphA2 проводился в программе CYANA 2.1 с использованием ряда стандартных модулей, таких как ANNEAL, HABAS, GLOMSA.

Энергетическая минимизация экспериментальных ЯМР-структур проводилась в явно заданном гидратированном мембранном бислое в программе GROMACS 3.3.1.

Результаты и обсуждение

Глава посвящена результатам, полученным в ходе выполнения данной диссертационной работы, а также их обсуждению.

Предварительные данные о пространственной структуре EphAlím и EphA2tm.

Для исследования мембранных белков применяются различные мембрано-подобные среды: липосомы, билипидные мицеллы (бицеллы), мицеллы детергента, органические растворители и др. Средой, наиболее близкой к клеточной мембране являются липосомы, однако из-за своего большого размера они не пригодны для исследования белков методом спектроскопии ЯМР. Органические растворители и детергентные мицеллы часто используются для исследования мембранных белков методом спектроскопии ЯМР, но в силу своих особенностей они плохо подходят для изучения белок-белкового взаимодействия. В данной работе в качестве мембрано-подобного окружения были выбраны липидные бицеллы.

Одной из основных проблем при работе с трансмембранными пептидами является их высокая гидрофобность и сложность встраивания в мембрано-подобные системы. Поскольку в работе использовались достаточно дорогие, трудоемкие в получении 15Ы, |5№с изотопно-меченые образцы, перед началом исследования методом спектроскопии ЯМР на немеченых образцах была подобрана методика, позволяющая эффективно встраивать исследуемые белки в дискоидальные липидные бицеллы. Оценка встраивания белков в бицеллы была проведена с помощью спектроскопии кругового дихроизма, полученные величины спиральности образца составили ~60 - 65%, что соответствует теоретическим и полученным для белков, встроенных в липосомы, значениям (рис. 1А, Б). Измерения размеров частиц с помощью динамического светорассеяния дали значения гидродинамического радиуса 24±2 А с малой полидисперсностью 4 - 6%, что указывает на однородность приготовленных образцов (рис. 1В, Г). Таким образом, нам удалось встроить исследуемые белки в бицеллы; гомогенность образцов и размер белок-липидных комплексов позволяют применить методы спектроскопии ЯМР для исследования белков.

01 1 10 100 0 1 1 10 100 R, нм R, нм

Рнсунок 1 Контроль качества образцов. КД спектры ТМ сегментов тирозинкиназ EphAl (А) и EphA2 (Б), встроенных в бицеллы ДГФХ/ДМФХ (сплошная линия) и моноламелярные липосомы ДМФХ (пунктир). Распределения частиц по размеру, данные 40 измерений эффективного гидродинамического радиуса методом динамического светорассеяния для ТМ сегментов тирозинкиназ EphAl (В) и EphA2 (Г)

Без предварительных расчетов вторичную структуру белка можно определить исходя из анализа системы контактов ЯЭО, полученных из экспериментов >ТОЕ8У-ШОС, констант спин-спинового взаимодействия ^щчсан, скоростей обмена амидных протонов с растворителем, анализа вторичного химического сдвига (разница химических сдвигов каждого аминокислотного остатка от табличного значения для данного остатка в конформации «неупорядоченный клубок») и данных ,5Ы релаксации. Вышеперечисленные данные позволили однозначно заключить, что участки 544-569 ЕрЬАИгп и 535-558 ЕрЬА2Ш1 соответствуют относительно стабильными ТМ а-спиральным доменам, при этом экспонированные в воду К- и С-концевые участки подвижны. Кроме того, наблюдаются контакты ЯЭО между частью остатков, расположенных на К- и С-концах а-спиралей обоих белков (участки 542549 и 564-571 БрИАНт и 527-538 и 554-562 Ер|1А21т), и липидными головками, что подтверждает, что ТМ участки обоих белков пересекает гидрофобное ядро бицелл.

Рисунок 2. Пространственные структуры ЕрЬАКт и ЕрЬА21т. Совмещенные по атомам основной цепи остатков 548-568 ЕрЬАИт (А) и 536-558 ЕрЬА2Пп (Б) двенадцать лучших ЯМР структур димеров белков. Ленточное представление релаксированных методом МД структур димеров ЕрЬАИт (В) и ЕрЬА2Ьт (Г) в явно заданном липидном бислое ДМФХ (В) и ДПФХ (Г).

Пространственная структура и динамика ТМ доменов эфриновых рецепторов EphAl и EphA2

Основная конформация димеров белков в липидных бицеллах Эксперименты ЯМР для EphAltm были проведены при значениях рН равных 4.3 и 6.3, чтобы перекрыть значение рКа карбоксильной группы Glu547 и проверить влияние ионизационного состояния этой группы на структурно-динамические свойства EphAl tm. Эксперименты ЯМР для EphA2tm были проведены при рН 5. Однозначные наборы внутри- и межмолекулярных контактов ЯЭО, определенные для обоих белков EphAltm (при обоих значениях рН) и EphA2tm, свидетельствуют, что ТМ фрагменты образуют димеры параллельных а-спиральных субъединиц, симметричные в шкале времен ЯМР (по крайней мере, в миллисекундном диапазоне). Вследствие этого, полученные методом ЯМР ограничения на двухгранные углы и на внутри- и межмолекулярные расстояния были установлены для каждой из субъединиц димеров белков, что привело к симметричности ансамбля расчетных молекул димеров (рис. 2

EphAltm EphA2tm

рН 4.3 рН 6.3 рН 5 0

Использованные ограничения

Всего контактов ЯЭО 998 914 716

Внутриосгаточные 568 508 384

Последовательные (|1-Л=1) 212 214 164

Среднего диапазона (1<|1-Л<4) 174 164 120

Дальнего диапазона (|1-Л>4) 0 0 0

Межмономерные 44 28 48

Водородные связи (верхние/нижние) 134/134 120/120 120/120

Ограничения на двугранные углы 102 102 118

<р/у 40/34 40/34 34/32

х1 28 28 52

Статистика по расчетным структурам

Штрафная функция СУАЫА (А'1) 1.39±0.13 0 97±0.33 0.97±0.18

ГШЯЕ) (А) а-спирального участка 551-569 551-569 535-558

Тяжелые атомы основной цепи 0.50±0.14 0 42±0.15 0.46±0.09

Все тяжелые атомы 0.88±0.14 0.64±0.19 0.96±0.14

Анализ статистики Рамачандрана

% остатков в наиболее благоприятной 80.8 82.3 78.4

зоне

% остатков в разрешенных зонах 18.3 17.4 21.1

% остатки в запрещенной зоне 0.9 0.3 0.5

Спираль-спиральное взаимодействие

Площадь контактной поверхности (А2) 546±10 476±10 511±14

Угол 0 (град.) между осями спирали -39±2 -48±2 +14±2

Расстояние (1 (А) между осями спирали 7.1 ±0.1 7.3±0.1 7 9±0.1

Таблица 1. Статистика ансамбля 12 лучших расчетных структур ЯМР димера ЕрИАНш и 15 лучших структур димера Ер1]Л21т. Замечания * Анализ статистики Рамачандрана проведен в программе СУЛЫА, Остатки из неструктурированных и подвижных участков

А, Б). Координаты атомов и список экспериментальных ограничений депонированы в банке белковых структур PDB (коды доступа 2klk и 2kll для EphAltm и 2к9у для EphA2tm). Энергетическая минимизации методом МД в явно заданном гидратированном бислое ДМФХ (EphAltm) и ДПФХ (EphA2tm) лучших ЯМР структур обоих димеров позволила уточнить структуры димеров и определить их ориентацию относительно липидного бислоя. Расчет 3 не МД траектории без ЯМР-ограничений не привел ни к существенному изменению структур димеров, ни к выходу структур из «пространства» экспериментальных ограничений, указывая на относительную стабильность полученных структур в мембране. В таблице 1 представлена статистика финальных ансамблей 12 ЯМР структур EphAltm и 15 структур EphA2tm и репрезентативных структур димеров, подвергнутых энергетической минимизации в явно заданном липидном бислое. Полученные после энергетической минимизации ТМ a-спирали EphAltm пересекаются под углом 0 ~ - 49° с расстоянием между осями a-спиралей d = 7 А, образуя правозакрученный параллельный димер, слегка наклоненный к нормали мембраны (рис. 2 В). ТМ а-спирали EphA2tm пересекаются под углом 0 ~ +15° с расстоянием между осями а-спиралей d = 8 А, образуя левозакрученный параллельный димер, сильно наклоненный к нормали мембраны (рис. 2 Г) Подвижные N- и С-концы EphAltm и EphA2tm не структурированы и экспонированы в воду.

Различия в димеризационных интерфейсах EphAltm и EphA2tm. В основной конформации EphAltm димеризуется посредством сдвоенного аналога гликофоринового мотива GG4 A55SX3G554X3G558, в котором остатки с малой боковой цепью расположены на одной стороне спирали, что позволяет спиралям сближаться и образовывать плотную упаковку в липидном бислое. Слабо полярный димеризационный интерфейс, расположенный на N-концевых участках ТМ а-спиралей, экранирован от ацильных цепей липидов боковыми группами Val549, Val55', Phe , Leu , Leu557, Ala559, Leu562 и Leu563 (рис. 3 А). Как видно из рисунка ЗА слабо полярная область взаимодействия продолжается остатками Ala559 и Ala560, которые, видимо, являются причиной конформационной подвижности взаимодействующих ТМ спиралей. В самом деле, резонансные сигналы этих остатков являются наиболее уширенными для всех значений рН, что свидетельствует о микро-миллисекундных движениях (средние во временной шкале ЯМР) в центральной части ТМ спирали вокруг остатков Gly558, Ala559 и Ala560. Наиболее вероятно, движения представляют собой минорные перегруппировки в упаковке спиралей димера EphAltm, сопровождаемые некоторым изгибанием спиралей (см. далее)

Поверхность взаимодействия между ТМ спиралями димера EphA2tm включает остатки Leub, Ala536, lie"8, Gly539, Ala542, Val543, Val545, Val546, Leu5Í9, Val550, Phe556 и Phe557, расположенные вдоль всей спирали (рис. ЗВ). Тесное взаимодействие спиралей димера EphA2tm на N-конце димеризационного интерфейса достигается за счет наличия слабо полярной области, образованной остатками с малой боковой цепью - Gly и Ala542. В центре ТМ домена димер EphA2tm стабилизирован межмономерными контактами боковых групп остатков Val543, Val545, Val546, Leu549 и Val550, формирующих гидрофобный кластер, фланкированный ароматическими кольцами остатков Phe556 и Phe557, участвующих в межмолекулярном стэкинг взаимодействии (рис. 3 В), которое, по-видимому, является существенным для правильного взаимодействия спиралей. Таким образом, будучи встроенными в бицеллы ДЕФХ/ДМФХ, спирали EphA2tm взаимодействуют посредством длинного

димеризационного мотива L535X3G53'X2A542X3V546X2L54<)X7FF557, приводя к левой сверхспирализации рецептора. Этот мотив является аналогом широко распространенного семичленного лейцинового «зиппера» (от англ. zipper) - мотива димеризации водорастворимых белков, и также называется семичленным.

Оба варианта димеризации рецепторов являются типичными для спираль-спиральных взаимодействий в белках, поскольку угол и расстояние между спиралями димеров EphAltm и EphA2tm характерны для двух самых больших семейств параллельных спираль-спиральных взаимодействий (Walters RF., DeGrado WF.,2006).

Помимо исследованных в работе основных димеризационных мотивов существуют еще и дополнительные, потенциальные мотивы. Так, помимо задействованного сдвоенного N-концевого GG4 димеризационного мотива A550X3GSS4X3G558, два потенциальных димеризационных мотива расположены на поверхности EphAl tm, экспонированной в липидный бислой: это С-концевой GG4-подобный мотив A560X3G564 (данные о димеризации EphAl tm посредством этого мотива представлены далее) и семичленный мотив IV549X5LL556X5LL563 (рис. 2В, ЗА, Б). Для EphA2tm помимо исследованного в работе семичленного мотива, ответственного за левую сверхспирализацию. существует, по крайней мере, один характерный димеризациоппый ОС4-схожий мотив А536ХзО540ХзО544, который расположен на обращенной в сторону липидов поверхности димера (рис. 2Г, ЗВ). Схожий мотив участвует в димеризации ТМ домена EphAl tm, приводя к правой сверхспирализации последнего.

Наличие нескольких димеризационных мотивов указывает на возможность существования дополнительных спираль-спиральных взаимодействий между ТМ доменами EphAl и EphA2 или взаимодействий с другими партнерами (т.е.

Угол вращения вокруг оси

Угол вращения вокруг оси

100 200 300 Угол вращения вокруг оси

Рисунок 3. Изопотенцналыные двумерные карты молекулярного гидрофобного потенциала (МГП) на поверхностях ТМ а-спиральных участков белков ЕрЬАИт и ЕрЬА21т. Контурными изолиниями показаны гидрофобные области поверхности с МГП > 0.07. Значения по оси X соответствуют углу вращения относительно оси спирали (в град.). Значения по оси У показывают смещение вдоль оси спирали. Позиции остатков подписаны. Исследованный димеризацонный интерфейс показан красными точками, дополнительные возможные интерфейсы выделены пунктирными овалами.

рН 4.3

рН 6.3

гетеродимеризация или олигомеризация). Помимо этого, существует возможность переключения димеризационного интерфейса между двумя мотивами, что может быть аргументом в пользу "вращательно-сцепленного" механизма активации рецспторных тирозинкиназ - механизма, включающего конформационный переход рецептора из неактивной в активную форму посредством изменения конформации димера ТМ доменов Эти предположения соответствуют данными о том, что Eph рецепторы предварительно сгруппированы в липидных рафтах в виде слабо аффинных димсров, их взаимодействие с эфринами приводит к конформационным перестройкам, перегруппировке и агрегации рецепторов в большие лиганд-рецепторные кластеры в клеточной мембране.

Хотя ТМ домены эфриновых рецепторов обладают достаточно низкой гомологией, все они имеют, по крайней мере, один GG4 схожий мотив (таблица 2). Таким образом, полученные данные указывают, что ТМ домены Eph рецепторов играют не пассивную роль, но являются важным структурным элементом, участвующим в процессе передачи конформационных изменений и обеспечивающим дополнительную специфичность процессов димеризации, кластеризации и активации рецептора Поскольку нарушения функционирования Eph рецепторов связаны со многими типами рака, полученные структурные данные могут способствовать разработке ингибиторов процесса передачи сигнала, способных специфично узнавать ТМ домены Eph рецепторов и препятствовать их латеральной ассоциации в клеточной мембране, являясь, таким образом, новой формой терапии рака.

Конформационный обмен и изменение локальной структуры и динамики основной конформации димера EphAltm при депротонировании карбоксильной группы Glu547. Единственной ионогенной группой EphAltm является глутаминовая кислота Glu547. Однако титрование Glu547 вызывает изменение химических сдвигов многих остатков ТМ домена (рис. 4А); причем, если для пространственно сближенных амидных протонов этот эффект очевиден, то для остатков удаленных от ионогенной группы он требует объяснения. Полученное значение рКа для карбоксильной группы Glu

ерна1 pvsrglTGGEIVAVIFGLLLGAALLLGILVFrsrraqrq

ЕРНА2 pegsgnLAVIGGVAVGWLLLVLAGVGFFIhrrrkn

ерназ sgessqWMIAISAAVAIILLTWIYVLIGrfcgyks

ЕРНА4 dganstVLLVSVSGSWLWILIAAFVIsrrrs

EPHA5 dqsqipVIAVSVTVGVILLAWIGVLLsgscce

EPHA6 aaeqgqILVIATAAVGGFTLLVILTLFFLItgrcq

E PH A7 s seqnpvi11AWAVAGTIILVFMVFGFII grrhcgys

EPH A 8 rydtrtIVWICLTLITGLWLLLLLIckkrhcgy

ephb1 selreqLPL IAG S AAAGWFWS LVAISI Vcs rkrays

EPHB2 tsiqekLPLIIGSSAAGLVFLIAVWIAIVcnrrgf

ephb3 qqlqeqLPLIVGSATAGLVFWAVWIAIVclrkqrhgsd

EPHB4 egwreqLALIAGTAWGWLVLWIWAVLclrkqsngr

Таблица 2. Аминокислотные последовательности ТМ доменов белков семейства Eph.

Жирным шрифтом выделены предполагаемые остатки ТМ домена, красным выделен N-концевой GG4 мотив, синим - дополнительный GG4 мотив

составило 5.1 ±0.1 (рис. 4А), что на единицу выше, чем рКа этой группы в воде. Столь значительная разница рКа объясняется заглубленпостыо карбоксильной группы Glu547 от воды в интерфейсе липидного бислоя. Значения рКа, вычисленные из анализа химических сдвигов амидных протонов различных титрующихся остатков совпадают, что свидетельствует о титровании только одной ионогенной группы. Помимо высокого значения рКа оказалось, что кооперативность титрования является положительной с коэффициентом Хилла равным 1.5 (рис. 4А). Отрицательную кооперативность можно было бы ожидать в случае титрования двух пространственно сближенных ионогенных групп. Полученную положительную кооперативность можно объяснить только тем, что депротонирование одной карбоксильной группы приводит к таким конформационным изменениям димера, в результате которых увеличивается доступность воды ко второй ионогенной группе.

На самом деле, анализ спектров ЯМР при обоих значениях рН. анализ данных

Т544

DMPC/DHPC

бицеллы ?/

V / /

* DMPC/DHPC/DMPG

бицеллы

I | i - 5 РН б

LU^lL^I__

540 550 560 570

SPPVSRGLTGGEIVAVIFGLLLGAALLLGILVFRSRRA

рН 4.3 ¿ , /'< ¡ I , illi'i A i г'Ч, ,

V л уЧШк А Ш'п I V \i/V \] у \¡ Ч1А V / т V! Щ/ Т\ \ i 1 I \ * 1 \

il г1 / ' //

/ / < рН 6.3 \

540 550 560 570

SPPVSRGLTGGEIVAVIFGLLLGAALLLGILVFRSRRA

Рисунок 4. Изменение локальной структуры и динамики EphAltm, вызванные депротонированием Glu547. А, Изменение химического сдвига резонансов HN основной формы димера EphAltm, встроенного в бицеллы ДГФХ/ДМФХ, при изменении рН с 6.3 до 4.3. На вставке показана кривая титрования Thr44 в нейтральных (красная) и заряженных бииеллах (синяя), соответствующие теоретические линии с коэффициентом Хилла, равным 1, показаны пунктирной и сплошной черными линиями. Б, Локальное эффективное время вращательной корреляции tr амидных групп димера EphAltm, встроенного в бицеллы ДГФХ/ДМФХ при рН 4.3 (пунктирная линия) и рН 6.3 (сплошная линия). В, Г Конфигурация «кэппирующих» водородных связей при рН 4.3 (В) и рН 6.3 (Г).

'^-релаксации (рис. 4Б), расчет структуры и последующая энергетическая минимизация методом молекулярной динамики (МД) в явно заданном липидном бислое ДМФХ позволили выявить сложную динамическую картину локального частичного «расплавления» участка спирали 547-550 (вероятно переход а-Зю-клубок), вызванного электростатическим отталкиванием двух пространственно сближенных отрицательно заряженных карбоксильных групп остатков Glu547. Деформация спиралей сопровождается повышением проникновения воды в димеризационный интерфейс EphAltm с Ile548 до Ala550, изгибанием ТМ спиралей димера в районе димеризационного мотива (рис. 6А). Характер времен этих движений средний, в шкале ЯМР, т.е. микро-миллисекундный, что также следует из уширения сигналов ТМ участка EphAltm в спектрах "N-HSQC, наблюдаемого при всех значениях рН (рис. 5А).

Расчет структуры димера EphAltm и анализ локальных контактов ЯЭО позволил установить конфигурацию водородных связей N-конца спирали. Оказалось, что при обоих значениях рН первый виток спирали стабилизирован за счет классических «кэппирующих» (от англ. capping) водородных связей. Для протонированного состояния гидроксильной группы Glu547 наблюдаются водородные связи 1Г Thr544 С5ООН Glu547 и HN Glu547 СрОН Thr544; для депротонированого -HN Glv546 СрОН Thr544 и бифуркационные водородные связи между HN Gly545, Gly546 и Glu и С800- Glu547 (рис. 4В, Г). Именно сеть этих бифуркационных водородных связей приводит к локальным конформационным изменениям основной цепи вследствие попеременного разрыва водородных связей, стабилизирующих спираль на участке 548-550. Поскольку в спектрах ЯМР как для каждой амидной группы, так и для сигналов боковой цепи Glu547 виден только один усредненный между различными конформациями резонанс, то эти водородные связи возникают и разрываются быстро, со временем жизни не длиннее миллисекунд. Эта перегруппировка объясняет повышенную подвижность основной цепи, наблюдаемую на основе данных релаксации при рН 6.3, в соответствии с которыми на участке 547-550 наблюдаются внутренние движения в пико-наносекундном временном диапазоне (рис. 4Б).

Дополнительный медленный обмен, вызванный цис-транс изомеризацией пептидных связей

Ser536-Pro537 и Pro -Pro , наблюдается для части N-концевых остатков. Таким образом, EphAltm в липидных бицеллах испытывает несколько типов внутренних движений, каждое из которых имеет различный временной диапазон и, по крайней мере, некоторые зависят от ионизационного состояния Glu547.

Минорная форма димера EphAltm. вызванная депротонированием Glu547. Помимо изменения структуры димера, депротонирование Glu47 вызывает появление минорной компоненты некоторых резонансов в 15N-HSQC спектре, достигающей 1520% интенсивности основного пика при рН 6.3 (рис. 5Б, В). Интересно, что двоение резонансных пиков затрагивает не только N-концевой сдвоенный GG4 мотив A550X3G554X3G558, но явно выражено также на С-концевом GG4-iioto6iiom димеризационном мотиве A560X3G564 , не вовлеченном в формирование основной формы димера. Поскольку населенность минорной формы практически не зависит от соотношения липид/белок в диапазоне от 2 до 1.5 субъединиц EphAltm на бицеллу, можно предположить, что депротонирование карбоксильной группы Glu547 вызывает частичную димеризацию посредством С-концевого димеризационного мотива, а наблюдаемое двоение является медленным обменом между двумя формами димера. К

сожалению, относительно слабая населенность и, следовательно, низкая интенсивность сигналов ЯМР не позволяют накопить структурную информацию о минорном состоянии димера. Тем не менее, второй димеризационпый интерфейс может быть косвенно определен на основе разницы химических сдвигов между основным и минорным состоянием димера (рис. 6Б).

Возможный С-концевой димеризационный интерфейс включает остатки Leu557, Л1а560, Gly564 и Val567 и приводит к левой сверхспирализации ТМ спиралей с углом порядка 30° (рис. ЗБ), причем в данной конформации Glu547 пространственно удалены друг от друга, что объясняет отсутствие рН зависимости химического сдвига минорной компоненты сигналов. Важно заметить, что в соответствии с молекулярным гидрофобным потенциалом, поверхности димеризации N- и С-концевых димеризационных мотивов пространственно разделены (рис. ЗА).

106-

G554

ОббЛ

G558

а> G546 :

G545

110-

15N

м.д. 114-

Т544

118-

F553

S®>) L562

- - Lxef+J

F568"-- V«»

LÍ43

I565,

Е547

122-

S)

L555

ф

"ai

ЩВр R572

ао

■Пил

41, м.д.

Рисунок 5. ЯМР спектры димера ЕрЬАИт при различных значениях рН и различном составе бицелл. А, спектр Ы-ШС)С 1гаМ 15Ы-меченного ПрЬЛИт в бицеллах ДМФХ/ДМФХ при рН 4 9, Т=40°С, показано отнесение резонансов основной цепи Б и В, фрагмент |5Ы-1№С*С в бицеллах ДМФХ/ДМФХ при рН 4 3 и рН 6 3, соответственно ГиД, фрагмент 15Ы-Н50>С в бицеллах ДМФХ/ДМФХ/ДМФГ при рН 4 5 и рН 6 7, соответственно Соответствующий фрагменту регион показан на спектре А пунктирной линией

Минимизация конформационной энергии основной формы димера EphAltm, полученной для депротонированого состояния Glu547, приводит к некоторой перестройке боковых групп остатков Leu557. Leu561 и Leu562, которые расположены рядом с центральной частью N-концевого димеризационного интерфейса (рис ЗБ). Эта перегруппировка открывает слабополярную «щель», связывающую N- и С-концевые димсризационные мотивы и. таким образом, может обеспечивать обмел между двумя состояниями димера. Таким образом, можно предположить, что слабополярный участок, составленный остатками Gly558, Ala 59 и Ala560 в центральной части ТМ спирали, служить точкой поворота, делающей возможным переход из одной димерной формы в другую.

Известно, что процесс передачи сигнала эфриновой системой инициируется в специальных липидных микродоменах плазматической мембраны, свидетельствуя о том, что липидпый состав мембраны влияет на функционирование эфриновых рецепторов и их лигандов (Pasquale ЕВ., 2005; Gauthier LR., Robbins SM., 2003). Применение бицелл, включающих в свой состав заряженные фосфолипиды, является биологически важной и, вместе с тем доступной для исследования методами спектроскопии ЯМР, системой. Для моделирования влияния заряда липидного окружения на свойства димера эфриновых рецепторов были проведены эксперименты по титрованию рН образца l5N меченого EphAltm в бицеллах ДГФХ/ДМФХ/ДМФГ

\ и и

С ¿ С с

Рисунок 6. Изменение химического сдвига и структуры димера EphAltm при депротонировании карбоксильной группы Glu547. А, Положительные (красный) и отрицательные (зеленый) изменения химического сдвига HN, вызванные депротонированием карбоксильной группы Glu547 в бицеллах ДГФХ/ДМФХ (рис. 4А), нанесены на ленточное представление структуры димера EphAltm. Б Положительные (голубой) и отрицательные {красный) изменения химического сдвига HN между основной и минорной формами димера EphAltm, встроенного в бицеллы ДГФХ/ДМФХ. Эти изменения можно трактовать, как периодические укорачивания (красный) и удлинения (зеленый и голубой) водородных связей основной цепи, приводящие к изгибу спирали.

(8/1/1). Добавление 10% отрицательно заряженного липида ДМФГ привело к повышению рКа карбоксильной группы Glu547 с 5.1 до 5.7, коэффициент Хилла при этом не изменился (рис. 4А). Кроме того, наличие отрицательно заряженных липидов, вызвало изменение в наблюдаемом медленном обмене: небольшое увеличение минорной фракции димера EphAltm и появлением дополнительной второй минорной компоненты сигналов, явно заметной для ТМ остатков Gly в спектрах 15N-HSQC во всем исследованном диапазоне рН (рис 5Г, Д). Интенсивность второй компоненты сравнима с интенсивностью первой и достигает ~20% от основной формы при рН 6.7.

Поскольку депротонирование Glu547 приводит к увеличению полярности димеризационного интерфейса основной формы и формированию участка высокой локальной электроотрицательности, отрицательный заряд полярных головок ДМФГ может создать дополнительное отталкивание между субъединицами димера, сдвигая равновесие димер-мономер и/или активизируя переключение в другую димерную конформацию. Таким образом, димер EphAltm наиболее вероятно вовлечен в различные типы ассоциации и внутренних движений (движений разной амплитуды и разного временного диапазона) в зависимости от локального значения рН и мембранного состава.

В нашей модельной системе значение рКа карбоксильной группы Glu547 находится в диапазоне рН, редко достижимом при физиологических условиях. Однако, как показано, добавление даже небольшого количества анионных липидов в модельную систему значительно повышает значение рКа Glu547. Мембранный потенциал, липидный состав клеточной мембраны, концентрация ионов и, возможно, конформация внеклеточного домена могут влиять на значение рКа Glu547 в клетке. Таким образом, свойства рецептора EphAl и его биологический ответ на присоединение лиганда должны быть чувствительны даже к незначительным изменениям в локальном окружении рецептора, то есть остаток Glu547 может служить сенсором окружающей EphAl рецептор среды и его депротонирование может частично нарушать связь между внеклеточной и внутриклеточной частями рецептора. Наличие ионогенного остатка, заклубленного в мембранный интерфейс, способного протонироваться/депротонироваться при физиологических значениях рН, делает EphAl рецептор уникальным представителем семейства Eph рецепторов (табл. 2).

Как сообщалось в обзоре литературы, EphAl рецептор экспрессируется преимущественно в эпителиальных тканях, включая кожу, где поверхностное значение рН составляет 4-6 (так называемый кислотный покров кожи). Такое низкое значение рН поддерживается только на поверхности кожи, быстро поднимаясь до нормальной величины на глубине порядка 100 микрон. Эти данные позволяют предположить, что уникальная особенность EphAl рецептора проводить индуцируемый лигандом сигнал при низких значениях внеклеточного рН, когда спираль ТМ домена жесткая, ответственно за регуляцию межклеточного взаимодействия в эпидермисе. Поскольку прочное взаимодействие между внеклеточным и цитоплазматическим доменами необходимо для лиганд зависимой активации рецептора, это предположение указывает, что основная конформация димера EphAltm (которую мы наблюдаем при низких значениях рН в нашей модельной системе) соответствует активному состоянию рецептора.

Помимо эпителиальных тканей EphAl широко экспрессируется в малых количествах в эмбриональных, а также и во взрослых тканях, и может быть сверх активирован в различных физиологических процессах, связанных с локальным подкислением, например, закисление синаптической щели во время передачи нервного импульса; локальной, ангиогенез-индуцированной гипоксией; ацидозом, связанным с воспалением, ростом и инвазией раковой опухоли. Действительно, существуют прямые доказательства участия EphAl рецептора как минимум в ангиогенезе, воспалении и онкогенезе (Masuda J. et al., 2008; Ivanov AI., Romanovsky AA„ 2006; Hafner C. et al., 2006).

Конформационный обмен и стабилизация третичной и четвертичной структуры ТМ домена EphA2. Анализ данных ЯМР, а именно уширение сигналов Phe556 и Phe557 Не558 EphA2tm в спектре N-HSQC (рис. 7А), указывает на конформационный обмен (средний в шкале времен ЯМР) этого участка. Наличие слабых резонансов в

w

m

f<4

р F"

'Щт

Fil-

8.0 7.5

'Н, м.д.

Рисунок 7. Конформационный обмен и межмолекулярное стэкинг взаимодействие ароматических колец. Phe556 и Phe557. А, Спектр 15N-HSQC EphA2tm, встроенного в

конформационном обмене этих групп. Б и В Стэкинг и я-катионное взаимодействие разной геометрии между боковыми группами Phe,S6. Phe1", Arg560.

гетероядерном спектре HNHB и частичная вырожденность химических сдвигов Hß протонов остатков Phe не позволила однозначно определить конформацию боковых цепей этих остатков. Однако, для Phe556, детальный анализ контактов ЯЭО, полученных как для гомо-, так и для «гетеродимера», и последующий расчет структуры выявил наличие одного ротамера с двугранным углом у\ = 180°. Для боковой цепи остатка Phe557 наблюдается два противоречащих друг другу набора контактов ЯЭО: вперед вдоль аминокислотной последовательности, на остатки Не558, Arg560, и назад, на остатки Gly553, Val554, Phe556. Эти данные свидетельствуют, что боковая цепь Phe557 существует в двух конформациях: Phe557, (7J = 180°) и Phe557g+ ("/1 = -60°). Наличие двух наборов сигналов в спектре 15N-NOESY-HSQC с временем смешивания тМ1Х = 80 мс означает, что скорость обмена между двумя конформациями меньше или порядка 10 Гц. К сожалению, из анализа интенсивностей контактов ЯЭО мы не можем судить о степени заселенности этих конформаций как из-за различных релаксационных характеристик участвующих во взаимодействии атомов, а также из-за обратной зависимости интенсивности контакта ЯЭО от шестой степени расстояния между взаимодействующими группами.

Последовательное расположение двух остатков фенилаланина в EphA2tm, и, более того, их расположение на интерфейсе димеризации, друг напротив друга, наводит на мысль о возможном стэкинг взаимодействии ароматических колец Phe556 и Phe557. Действительно, сильный (около 0.5 м.д.) сдвиг ароматических протонов в слабое поле, наблюдаемый в 13C-HSQC, свидетельствует о взаимодействие этих ароматических групп. Помимо этого, для отдельно стоящего резонанса HZ Phe557 выявлено наличие минорной компоненты сигнала с расстоянием между пиками порядка 20 Гц, что указывает на наличие конформационного обмена ароматического кольца в миллисекундном диапазоне. Анализ расчетных структур выявил наличие внутри- и межмолекулярного стэкинг взаимодействия разной геометрии между ароматическими кольцами Phe556 и Phe557, а также л-катионное взаимодействие с гуанидиновой группой Arg560. Межмолекулярное стэкинг взаимодействие наблюдается между ароматическими кольцами Phe557, параллельное я-л-взаимодействие наблюдается для колец находящимися в одинаковых конфигурациях угла у\ (рис. 7Б), перпендикулярное стэкинг взаимодействие наблюдается между Phe557t и Phe557g+ (рис. 7В); внутримолекулярное стэкинг взаимодействие возможно между ароматическими кольцами Phe556 и Phe557,. Подвижная боковая группа Arg560, формируя л-катионное взаимодействие с ароматическим кольцом Phe556, принимает участие в стабилизации пространственной структуры мономера, а взаимодействие с боковой цепью Phe557 вносит вклад в стабильность структуры димера. Хотя энергии этих взаимодействий малы и составляют от -1 до -2 ккал/моль, одновременный вклад нескольких типов взаимодействий способен значительно стабилизировать как локальную структуру a-спирали, так и четвертичную структуру димера.

Поскольку остатки, вовлеченные в стэкинг и л-катионное взаимодействия, являются высоко консервативными, а, на примере рецепторов EphA семейства, шесть из восьми представителей имеют ароматические и положительно заряженные остатки на С-конце ТМ доменов (табл. 2), полученные в работе данные о стабилизации структуры димера a-спиралей EphA2 рецептора с помощью стэкинг и л-катионного взаимодействий могут свидетельствовать о существенной роли взаимодействий этого типа в процессе передачи сигнала. Это предположение косвенно подтверждается существованием заболеваний, связанных с точечными мутациями остатков,

расположенных па концах ТМ доменов мембранных белков и приводящих к нарушению или возникновению я-катионного взаимодействия. Например, мутации положительно заряженных или ароматических остатков (К276Е, У279С, Я271Ь, Я СО на конце ТМ домена ТМ2 глицинового рецептора СЬЯА1 приводят к врожденной патологически усиленной реакции испуга (Ваккег МТ е1 а1., 2006).

Также важным вопросом, слабо изученным до сих пор, является структурная связь между ТМ и околомембранным доменами, очевидно, что взаимодействия между аминокислотными остатками, расположенными на мембранном интерфейсе, на границе двух доменов, обеспечивают эту связь. Известно, что в несвязанном с лигандом состоянии рецептора, околомембранный участок РТК автоингибирует каталитический домен и присоединение лиганда приводит первоначально к фосфорилированию остатков тирозинов именно на этом участке, результатом чего является активация каталитических доменов. Таким образом, нарушения функциональной связи между ТМ и околомембранным доменами, вызываемые мутациями ароматических или основных остатков на границе доменов, могут приводить к нарушению каталитической активности рецептора.

пространственные структуры и описана внутримолекулярная динамика трансмембранных доменов белков рецепторов EphAl и EphA2 в липидных бицеллах. Показано, что белки образуют параллельные симметричные димеры. Прямыми методами спектроскопии ЯМР исследованы интерфейсы димеризации. В липидных бицеллах правозакрученная димеризация ТМ домена EphAltm происходит посредством сдвоенного аналога гликофоринового мотива GG4, а левозакрученная димеризация ТМ домена EphA2tm - посредством семичленного мотива.

2. Показана возможность димеризации ТМ доменов Eph рецепторов по нескольким альтернативным мотивам с различной относительной упаковкой субъединиц. Для ТМ домена EphAl экспериментально зарегистрировано переключение с N-концевого на С-концевой димеризационный мотив. Эти данные являются аргументом в пользу "вращательно-сцепленного" механизма активации рецепторных тирозинкиназ.

3. Для димера EphAl выявлена и исследована зависимость структуры и динамики димера от ионогенного состояния Glu547, что позволяет сделать предположение об особенностях механизма передачи сигнала рецептором внутрь клетки. Полученные данные указывают на уникальную роль EphAl рецептора в качестве сенсора локального клеточного окружения.

4. Выявлено и исследовано слабое взаимодействие между ароматическими и основными остатками, стабилизирующее третичную и четвертичную структуры димера рецептора EphA2. Полученные данные свидетельствуют о функциональной значимости слабых ароматических взаимодействий в процессе передачи сигнала мембранными белками.

Выводы

1. Методом спектроскопии ЯМР высокого разрешения определены

Заключение

Автор выражает благодарность всем сотрудникам лаборатории биомолекулярной ЯМР спектроскопии и отделу структурной биологии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Материалы диссертации изложены в следующих работах:

1. Mayzel М L., Mineeva E.Np, Goncharuk M.V., Tkach E.N., Ermolyuk Y.S., Balashova T.A., Bocharov E.V., and Arseniev A.S. NMR study of transmembrane domain of ephrin receptor ErbAl in lipid bicelles. Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter, IV Meeting NMR in Heterogeneous Systems, St. Petersburg, 9-13 july 2007, Сборник докладов стр. 93.

2. Майзель M.JI., Бочаров Э.В., Минеев К.С., Минеева E.H., Ермолюк Я.С., Кирпичников М.П., Арсеньев A.C. Изучение структуры и динамики фрагментов EphAl и EphA2 рецепторов. VIII чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова, Москва, 25-27 октября 2006, Сборник докладов стр. 81

3. Арсеньев A.C., Бочаров Э.В., Волынский П.Е., Минеев К.С., Майзель М.Л., Пустовалова Ю.Е., Артеменко Е.О., Ефремов Р.Г., Феофанов A.B. Структурная биология трансмембранных спираль-спиральных взаимодействий: молекулярное моделирование, оптическая и ЯМР спектроскопия. Тезисы докладов III Российского симпозиума «Белки и пептиды» г. Пущино, 2007, С. 25

4. Arseniev A.S., Bocharov E.V., Volinskiy P.E., Mayzel M.L., Pustovalova Yu.E., Mineev K.S., Schulga A.A., Feofanov A.V., Efremov R.G. Comprehensive study of helix-helix interactions in transmembrane protein dimers. EUROMAR 2008, St.Petersburg, 6-11 july 2008, Сборник докладов стр. 6.

5. Bocharov E.V., Mayzel M.L., Volynsky P.E., Goncharuk M.V., Ermolyuk Ya.S., Schulga A.A., Artemenko E O., Efremov R.G., Arseniev A.S. Spatial structure and pH-dependent conformational diversity of dimeric transmembrane domain of the receptor tyrosine kinase EphAl. Journal of Biological Chemistry, Aug 2008; doi:10.1074/jbc.M803089200.

6. Volynsky P.E., Bocharov E.V., Nolde D.E., Vereschaga Ya.A, Mayzel M.L., Mineev K.S., Mineeva E.A., Pustovalova Yu.E., Gagnidze I.A., Efremov R.G. and Arseniev A.S. (2006) Solution of the spatial structure of

dimeric transmembrane domains of proteins by heteronuclear NMR spectroscopy and molecular modeling. Biophysics, v. 51, pp. 23-27.

Список литературы:

1. Bakker MJ, van Dijk JG, van den Maagdenberg AM, Tijssen MA. Startle syndromes. Lancet Neurol. 2006, 5, 513-524.

2. Gauthier LR, Robbins SM. Ephrin signaling: One raft to rule them all? One raft to sort them? One raft to spread their call and in signaling bind them? Life Sci. 2003, 74, 207-216.

3. Hafner C, Becker B, Landthaler M, Vogt T. Expression profile of Eph receptors and ephrin ligands in human skin and downregulation of EphAl in nonmelanoma skin cancer. Mod Pathol. 2006,13, 69-77.

4. Ivanov AI, Romanovsky AA. Putative dual role of ephrin-Eph receptor interactions in inflammation. IUBMB Life. 2006, 58, 389-394.

5. Masuda J, Usui R, Maru Y. Fibronectin type I repeat is a nonactivating ligand for EphAl and inhibits ATF3-dependent angiogenesis. J Biol Chem. 2008, 283, 13148-13155

6. Pasquale EB. Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005, 6, 462-475.

7. Walters RF, DeGrado WF. Helix-packing motifs in membrane proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 2006, 103, 13658-13663

Принято к исполнению: 0711.2008 г. Исполнено: 0711 2008 г

Тираж: 100 экз. Заказ № 191

Копицентр ФМБФ МФТИ

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Майзель, Максим Львович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Белки семейства рецепторных тирозинкиназ.

2.1.1. Белки, представители семейства РТК.

2.1.2. Эфриновые рецепторы тирозинкиназ.

2.1.3. Структурные особенности активации РТК.

2.2. Общие принципы организации а-спиральных доменов в липидном окружении.

2.2.1. Структура а-спирали.

2.2.2. Трансмембранные а-спиральпые домены белков.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Объект исследования.

3.2. Приготовление образца.

3.3 Оптические методы исследования.

3.3.1. Динамическое светорассеяние.

3.3.2. КД-спектроскопия.

3.4. Спектроскопия ЯМР.

3.5. Отнесение сигналов в спектрах ЯМР.

3.6. Измерение рН-зависимостей химических сдвигов сигналов в спектрах ЯМР.

3.7. Расчет пространственной структуры и внутримолекулярной динамики.

3.8. МД-релаксация.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Предварительные данные о пространственной структуре EphA 1 тм и ЕРНА2ТМ.

4.1.1. Оптические методы.5S

4.1.2. Элементы вторичной структуры.

4.2. Пространственная структура, динамика и коформационная подвижность ТМ доменов эфринового рецептора EphAI.

4.2.1. Коиформационный обмен EphAItm.

4.2.2. Основная конформация EphAI tm в липидных бицеллах.

4.2.3. Изменение локальной структуры и динамики основной конформации димера EphAI tm при депротонировании карбоксильной группы Glu547.

4.2.4. Минорная форма димера EphAltm, вызванная депротонированием Glu 47.

4.2.5. Влияние поверхностного заряда мембраны на конформационное разнообразие димера EphAltm.!.

4.2.6. Вероятная физиологическая роль рецептора EphAI как «внеклеточного рН сенсора».

4.3. Пространственная структура и динамика ТМ домена эфринового рецептора ЕрнА2.

4.3.1. Основная конформация EphA2tm в липидных бицеллах.

4.3.2. Коиформационный обмен и стабилизация локальной и четвертичной структуры ТМ домена EphA2.

4.3.3. Анализ рН-зависимостей химических сдвигов сигналов ядер if ТМ домена EphA2tm.

4.3.4. Интерфейсы димеризаг/ии белков семейства эфриновых рецепторов.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пространственная структура и динамика трансмембранных доменов эфриновых рецепторов EPHA1 и EPHA2 по данным спектроскопии ЯМР"

Рецепторные тирозинкиназы (РТК) являются мембранными белками и занимают центральное место в регуляции роста, пролиферации, дифференцировки и продолжительности жизни клеток организма, а также в управлении апоптозом и подвижностью клеток. РТК-системы принимают непосредственное участие в управлении развитием и гомеостазом всех тканей человеческого организма. Нарушения функционирования сигнальных РТК-систем ведут к таким заболеваниям, как: онкологические заболевания, остеопороз, гипертония, атеросклероз, диабет, нарушения иммунитета, воспалительные процессы, фиброзы почек, печени и легких, различные нейродегенеративные патологии.

Разработка новых соединений, модулирующих активность биологически-значимых белков, является важной составляющей современной медицины. В настоящий момент крупные международные фармацевтические компании, активно использующие геномные и постгеномные технологии, в качестве одного из своих стратегических направлений развития выбрали создание лекарственных препаратов, селективно действующих на РТК (1). На сегодняшний день получено множество пространственных структур внеклеточных и цитоплазматических доменов различных представителей РТК, однако нет практически никаких данных о структуре трансмембранных (ТМ) доменов, более того, об их взаимодействии в мембране. Важность последнего подтверждается тем, что необходимым условием функционирования РТК является димеризация и олигомеризация в клеточной мембране. В связи с этим, большой интерес представляет понимание механизмов межмолекулярных взаимодействий в гетерогенной среде, которой является липидный бислой биологической мембраны.

В данной работе исследованы структурно-динамические свойства димеров ТМ доменов двух РТК — человеческих белков EphAl и EphA2 и изучена их связь с биологической функцией. Приведенные данные являюттся важными как в фундаментальном смысле — для понимания факторов, контролирующих белок-белковое взаимодействие в мембране клетки, так и в прикладном — могут свидетельствовать об уникальной роли ТМ домена Eph рецепторов, как мишени для селективного воздействия лекарственных препаратов.

Изученные белки являются представителями семейства эфриновых рецепторов, или Eph (от англ. Erythropoietin-producing hepatocellular), самого большого семейства РТК (2). Eph рецепторы участвуют во многих процессах развития тканей: координируют рост, дифференцировку и формирование практически всех органов и тканей, в частности, нервной, сердечнососудистой, иммунной систем, костной, и эпителиальной тканей. Взаимодействия эфриновых рецепторов и их лигандов могут вызывать различные клеточные ответы, например, изменение подвижности, адгезию, отталкивание, особенно для нейрональных и эндотелиальных клеток. Нарушения в функционировании Eph рецепторов и их лигандов характерны для процессов опухолеобразования и метастазирования.

2. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Майзель, Максим Львович

5. Выводы

1. Методом спектроскопии ЯМР высокого разрешения определены пространственные структуры и описана внутримолекулярная динамика трансмембранных доменов белков рецепторов EphAl и EphA2 в липидных бицеллах. Показано, что белки образуют параллельные симметричные димеры. Прямыми методами спектроскопии ЯМР исследованы интерфейсы димеризации. В липидных бицеллах правозакрученная димеризация ТМ домена EphAltm происходит посредством сдвоенного аналога гликофоринового мотива GG4, а левозакрученная димеризация ТМ домена EphA2tm - посредством семичленного мотива.

2. Показана возможность димеризации ТМ доменов Eph рецепторов по нескольким альтернативным мотивам с различной относительной упаковкой субъединиц. Для ТМ домена EphAl экспериментально зарегистрировано переключение с N-концевого на С-концевой димеризационный мотив. Эти данные являются аргументом в пользу "вращательно-сцепленного" механизма активации рецепторных тирозинкиназ.

3. Для димера EphAl выявлена и исследована зависимость структуры и динамики димера от ионогенного состояния Glu547, что позволяет сделать предположение об особенностях механизма передачи сигнала рецептором внутрь клетки. Полученные данные указывают на уникальную роль EphAl рецептора в качестве сенсора локального клеточного окружения.

4. Выявлено и исследовано слабое взаимодействие между ароматическими и основными остатками, стабилизирующее третичную и четвертичную структуры димера рецептора EpliA2. Полученные данные свидетельствуют о функциональной значимости слабых ароматических взаимодействий в процессе передачи сигнала мембранными белками.

Заключение

Мне хотелось бы выразить глубокую благодарность и признательность моему научному руководителю, профессору, д.х.н. Александру Сергеевичу Арсеньеву, который обеспечил возможность выполнения настоящей диссертационной работы, оказывал своевременную помощь и поддержку и проявлял неустанное благожелательное внимание на протяжении всего времени моей работы в лаборатории.

Хочу поблагодарить весь коллектив нашей лаборатории за помощь в выполнении экспериментальной работы и плодотворные обсуждения. Особую признательность хочу выразить сотрудникам лаборатории Э.В. Бочарову, В.В. Чупину и И.В. Масленникову.

Благодарю весь коллектив отдела структурных методов исследования ИБХ РАН и особенно Р.Г. Ефремова, П.Е. Волынского и Е.О. Артеменко за значительный вклад проделанную нами в работу.

Приношу свою глубокую благодарность сотрудникам Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН М.В. Гончарук, Е. Н. Ткач и Я.С. Ермолюку за предоставление белка для исследований.

Работа финансировалась грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований и министерства Образования и Науки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Майзель, Максим Львович, Москва

1. М. Cohenuram, M.W. Saif, Epidermal growth factor receptor inhibition strategies in pancreatic cancer: past, present and the future, JOP, 8 (2007), 415.

2. J.P. Himanen, D.B. Nikolov, Eph receptors and ephrins, Int J Biochem Cell Biol, 35 (2003), 130-134.

3. J. Schlessinger, Cell signaling by receptor tyrosine kinases, Cell, 103 (2000), 211-225.

4. D.R. Robinson, Y.M. Wu, S.F. Lin, The protein tyrosine kinase family of the human genome, Oncogene, 19 (2000), 5548-5557.

5. E. Li, K. Hristova, Role of receptor tyrosine kinase transmembrane domains in cell signaling and human pathologies, Biochemistry, 45 (2006), 6241-6251.

6. A. Ullrich, J. Schlessinger, Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity, Cell, 61 (1990), 203-212.

7. C.H. Heldin, Dimerization of cell surface receptors in signal transduction, Cell, 80 (1995), 213-223.

8. T. Pawson, Protein modules and signalling networks, Nature, 373 (1995), 573580.

9. A. Gschwind, E. Zwick, N. Prenzel, M. Leserer, A. Ullrich, Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission, Oncogene, 20 (2001), 1594-1600.

10. E.M. Bublil, Y. Yarden, The EGF receptor family: spearheading a merger of signaling and therapeutics, Curr Opin Cell Biol, 19 (2007), 124-134.

11. T. Holbro, G. Civenni, N.E. Hynes. The ErbB receptors and their role in cancer progression, Exp Cell Res, 284 (2003), 99-110.

12. A.O. Wilkie, G.M. Morriss-Kay, E.Y. Jones, J.K. Heath, Functions of fibroblast growth factors and their receptors, Curr Biol, 5 (1995), 500-507.

13. G.J. Chen, R. Forough, Fibroblast growth factors, fibroblast growth factor receptors, diseases, and drugs, Recent Patents Cardiovasc Drug Discov, 1 (2006), 211-224.

14. M. Perz, T. Torlinska, Insulin receptor—structural and functional characteristics, Med Sci Mo nit, 7 (2001), 169-177.

15. H. Surawska, P.C. Ma, R. Salgia, The role of ephrins and Eph receptors in cancer, Cytokine Growth Factor Rev, 15 (2004), 419-433.

16. J.P. Himanen, D.B. Nikoloy, Eph signaling: a structural view, Trends Neurosci, 26 (2003); 46-51.

17. C.J. Vearing, M. Lackmann, "Eph receptor signalling; dimerisation just isn't enough", Growth Factors, 23 (2005), 67-76.19